KR102579727B1 - 알츠하이머병의 진단 또는 예측, 또는 파킨슨병의 진단을 위한 락토페린 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머병(AD)의 진단 또는 예후에 사용하기 위한, 락토페린의 단백질, 또는 그의 코드화 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 피검자의 타액 또는 타액 샘플 중 락토페린의 농도를 평가하고, 상기 농도가 7.43μg/ml의 값보다 높거나 낮은지를 결정하고, 여기서 7.43μg/ml보다 낮은 값이 AD의 지표이거나, AD의 예측에 대한 지표인 것을 포함하는, 피검자에서의 AD의 진단 또는 예후 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점은 피검자의 타액 샘플에서 파킨슨병(PD)의 진단에 사용하기 위한, 락토페린의 단백질, 또는 그의 코드화 핵산이다.

Description

알츠하이머병의 진단 또는 예측, 또는 파킨슨병의 진단을 위한 락토페린

본 발명은 의학, 특히 알츠하이머병 및 파킨슨병의 진단에서의 적용에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)은 치매의 대부분의 원인이 된다. 이 질환은 전적으로 발병하는데 수십 년이 걸리고, 제1 임상이 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)로서 나타나는 다른 퇴행성 치매들과 많은 사전 동기 효과를 공유한다. AD의 제1 증세는 종종 노화 또는 스트레스의 탓으로 잘못 여겨진다.

AD는 현재 개인의 병력, 친족의 병력 및 행동 관찰을 바탕으로 진단된다. 상세한 신경심리검사는 어떤 사람이 AD의 진단에 대한 임상 기준을 충족하기 수년 전에 경도 인지 장애를 밝혀낼 수 있다. 의미 기억에서 장애 또는 추상적 사고, 유연성, 계획, 및 주의력의 실행 기능과 관련된 미묘한 문제도 징후가 될 수 있다. 기억 검사를 비롯한 지적 기능의 평가는 상기 질환의 상태를 더 결정할 수 있다.

이들 파라미터에 따라, 의사가 진단 과정을 용이하게 하고 표준화하는 것을 가능하게 할 수도 있는 진단 기준을 구축하기 위한 모든 시도가 이루어진다. 현재, 결정적인 AD 진단은 뇌 조직의 현미경 검사를 포함한 조직병리학적 확증을 필요로 한다.

AD의 현재 정의 또는 진단은 임상이다. 이 임상 진단에는 대부분의 경우에, 생물학적 마커가 없다. 친숙한 AD의 단일 기원의 경우만이 유전적 마커를 가지며, 이들은 상기 질환의 모든 경우의 2% 미만을 차지한다. ApoE4 대립유전자가 알츠하이머형 치매의 위험을 증가시키고 발병 연령에 영향을 미치는 위험 인자라는 케인(Kane)에 의한 발견은 임상 중요성보다 더 과학적이었고, 진단 능력은 거의 나타내지 않는다(Kane RA, Kane RL. "Effect of genetic testing for risk of Alzheimer's disease". N. Engl. J. Med. 2009, 361(3), 298-299).

AD의 가장 강력한 바이오마커의 후보에는, 자기 공명 영상 또는 양전자 방사 단층 촬영에서의 뇌 영상 연구, 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid , CSF) 중 베타아밀로이드 및 타우(tau)와 같은 단백질이 포함된다. AD 연구는 증세가 시작되기 전 상태의 진단에 역점을 두었다. AD 조기 발견을 가능하게 하기 위해 다수의 바이오마커 및 생화학적 검사가 사용되고 개발되었다.

단백질 기반 검사 이용에 있어서 가장 큰 단점 중 일부에는 비용 상승, 침습적 절차의 필요성 및 결과 해석으로 인해 발생하는 복잡성이 포함되며, 이들로 인해 장기적인 사용이 불가능해진다. 예를 들어, 피질 아밀로이드 부하 및 뇌의 체적 변화의 신경 영상 및 CSF 중 단백질 농도의 평가는 널리 이용할 수 없는 진단 도구이다.

혈중 자가라이소솜 단백질 농도는 또한 진단 받기 전 1 내지 10년간, 대조군과 유해 개체군 사이의 차이를 가능하게 한다 (Goetzl et al., "Altered lysosomal proteins in neural-derived plasma exosomes in preclinical Alzheimer's disease", Neurology 2015, Jul 7;85(1):40-7). 또 다른 최근의 연구는 전조 증상 단계로부터 치매로의 전환을 예측 가능한 전술한 몇몇의 혈장 바이오마커를 확인했다(Hye et al., "Plasma proteins predict conversion to dementia from prodromal disease". Alzheimer´s & Dementia 2014, 10, 799-807). 그러나 이들 연구는 모두 단백질, 지질 또는 다른 대사산물을 포함한, 바이오마커의 셋트나 패널에 초점을 맞추고 있다. 일반적으로, 바이오마커는 베타-아밀로이드 및 타우에서 유도된 분자 중에서 구성된다. 이들 잠재적인 바이오마커는 이미 시작된 질환의 지표로서 제공하며, 실제의 조기 발견 또는 예측의 가능성을 배제한다. 이러한 관점에서, 본 발명은 AD의 치매 발병 전 단계에서의 진단에 대한 필요성에서 과학적인 합의와 잘 맞는다.

혈장 중 인지질 농도의 감소와 같은, 치매 초기 증세의 출현 전에 검출 가능한 분자 또는 생화학적 변화를 기술하는 몇몇 연구들이 최근 발표되었다 (Mapstone et al, "Plasma phospholipids identify antecedent memory impairment in older adults". Nat. Med. 2014, 20(4) 415-420). 이 연구는 말초 혈액으로부터 10개의 지질의 패널을 이용하여 2~3년의 기간 내에 MCI 또는 AD를 예측할 수 있었다. 시간의 제한은 중요하다. 주로 CSF 중에서 엄격한 임상 기준, 신경 촬영 검사 및 생물학적 데이터를 바탕으로 한 AD 치매 발병 전의 진단을 확립하기 위한 두보이스(Dubois)의 최근 시도는, 질환의 근본(disease-modifying) 치료 또는 예방 치료를 위해 바이오마커를 진단 과정에 통합하고자 잘 정의된 임상 표현형(phenotype)을 구하는 데 관심이 있다(Dubois et al. "Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease" Lancet Neurol. 2014 Jun;13(6):614-29). 그러나 현재 바이오마커는 이들이 CSF 중의 결정 농도 또는 구조적 및 기능적 자기 공명 영상을 포함하여, 침습성이거나, 시간이 많이 걸리거나 또는 비용이 많이 들기 때문에 만족스럽지 못하다.

미국 출원 제20140602046　A1호에는 타우 단백질에서 유도된 펩타이드에 대한 특정 항체의 투여를 포함하는 AD의 처리가 개시되어 있다. 이 출원은 상기 질환이 서서히 진행되는 것과 무증후성 대상에 의한 예방을 언급한다. 10세 이상의 전 인구에게 예방적 투여가 권장된다. 상술한 바와 같이, 일단 상기 질환이 발병되면, 검출될 타우 이성질체는 체내에서 생산될 가능성이 매우 높으며, 예측은 무시한다.

US 20110236917　A1호에는 피검자의 혈청 샘플에서 47 바이오마커 단백질의 패널을 검출하는 것을 포함하는 피검자에서의 AD 진단 방법이 기술되어 있다. 상기 패널의 마커 중에서 트랜스페린 I 및 II가 기술되어 있다. 이들 교지의 제1 결점은 혈청 샘플을 필요로 하는 점이며, 그의 추출을 위해 전문 의사가 요구된다. 게다가, 더욱 정확한 정보로 기여하기 위해 다른 것들 중에서 특별히 상기 세트의 단백질이 제안되지 않는다. 이 문서의 교지에 기초하여, 전문가는 피검자에서 AD의 진단을 위해 그 자체로 관련 있는 어떠한 단백질이라도 찾도록 제안하지 않았을 것이다. 실제로, AD의 조기 발견 또는 예측을 가능하게 하는 이상적인 단일 바이오마커는 아직 밝혀지지 않았다.

몇몇 연구팀에서는 뇌의 염증과 구강 건강 간에 가능한 상관 관계가 있다고 밝혔다. 최근에, 타액의 단백체학(proteomic)에 관련된 간행물의 수는 진단을 위한 생물학적 유체로서 사람의 타액을 제안함으로써 현저히 증가되었다. 타액은 낮은 침습성, 최소 비용 및 손쉬운 수집 및 처리 면에서 많은 이점이 있다. 사람의 타액 중의 단백질 A 및 타우의 존재가 기술되어 있고, AD의 잠재적인 바이오마커로서 그들의 유용성을 시사하고 있다(Shi et al., "Salivary tau species are potential biomarkers of Alzheimer's disease". J Alzheimer's Dis. 2011;27(2):299-305). AD의 발병 및 염증성 반응과 연관된 것들을 포함하여, 타액 샘플 중의 다른 단백질들이 기술되어 있다(Ciregia et al., "A multidisciplinary approach to study a couple of monozygotic twins discordant for the chronic fatigue syndrome: a focus on potential salivary biomarkers." J Transl Med. 2013 Oct 2;11:243).

이 점에서, WO2013/153461　A2에는 타액에 존재하는 일련의 분자들 중에서 2개의 바이오마커를 선택한 후 AD의 진단에 대해 기술되어 있다. 또한, 상기 언급된 단백질들은 오히려 이미 시작된 질환의 징후이므로, 수득된 결과를 상기 질환의 예측에 사용할 수 없다.

락토페린은 트란스페린류의 철 결합성 당단백질이며, 이는 염증성 질환의 진단에 집중적으로 사용되고 있다. 이 분자는 염증성 사이토카인의 생산을 억제하여, 산화적인 스트레스를 조절한다. 이것은 또한 파킨슨병(PD)을 포함하여, 다른 퇴행성 신경 질환에서 산화적인 손상으로부터 뇌 조직을 보호하는 것과도 관련이 있으며, 신경세포사에 따라 AD에서 주된 조직병리적 특질인, 타우 단백질 신경원섬유 농축제(neurofibrillary tangles) 및 아밀로이드 베타(Aβ) 노인반(senile plaques)에서 검출되었다(Wang et al., "Deposition of lactoferrin in fibrillar-type senile plaques in the brains of transgenic mouse models of Alzheimer's disease". Neurosci Lett 2010; 481: 164-7). 상기 단백질은 감염/염증 부위에서 외분비선 및 호중구에 의해 합성된 인체 분비물의 한 성분이다. 타액 단백질들 중에서, 그것은 자연 면역의 가장 중요한 요소로서, 타액에서 세균 상해에 대한 중요한 방어 요소를 나타낸다.

웰링(Welling)은 혈액 뇌 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)에 침투 가능한 일종의 항미생물 펩타이드(AMPs)를 기술하고 있다(Welling m. et al. "Potential role of antimicrobial peptides in the early onset of Alzheimer's disease", Alzheimer & Dementia, 11, p.51-57, 2015). 이 간행물은 환자에게 투여되거나, 또는 감염 과정 중에 상방 제어(upregulated)를 바꿀 때, BBB를 가로지르는 락토페린의 능력을 강조한다. 게다가, 그것은 생체 내 뇌 감염의 검출에 있어서 AMPs의 사용 가능성을 제안한다. 그러나 감염 과정에서 그의 상방 제어의 경고와 AD 진단에서의 효과적인 사용 간에 어떠한 관계가 성립될 수 있음이 추측된다.

그러나 락토페린은 US　2003/0096736　A1에 의해, 퇴행성 신경 질환을 포함하여 여러 질환의 치료에 있어서, 특히 AD의 치료에 유용한 것으로 교지되었다. 다른 퇴행성 신경 질환, 특히 AD의 진단 또는 예측에 사용되고 있는 분자에 대해서는 아무런 연관성도 없거나 암시도 되어 있지 않다.

이 기술은 AD의 진단 및/또는 예측에서 사용하기 위한 락토페린에 대해 기술하지 않았다.

WO　2009074331　A3은 본 발명에 가장 가까운 선행 기술로 여겨진다. 이 문서의 목적은 어느 피검자의 생물학적 샘플에서 다수의 유전자의 단백질 산물을 검출하는 것을 포함하는 AD 조기 진단 방법을 기술하는 것이다. 이 트랜스페린(TF) 유전자의 산물은 이들 바이오마커뿐만 아니라, IGF-1R 또는 HISTIH3E와 같은 다른 유전자의 산물 중에 포함된다. 제안된 유전자들은 어떠한 생물학적 장소 후의 그것들 중에서 아무런 관계가 없으며, 모두 상기 방법에서 사용되는 유사한 예측값을 나타낸다. 특히, 락토페린뿐 아니라, 다른 것들 중에서, 사용이 권장된 TF-유전자 산물도 없다. 유전자 산물의 관점에서 상기 출원의 결과적인 범위는 받아들일 수 없으며, 전문가가 상기 질환의 진단을 위해 테스트를 하기 위한 과도한 양의 작업으로서 남겨진다. 그래도 생물학적 샘플이 타액으로 구성되어 있음을 나타내고, 그 실예들은 혈액 샘플로 실행된다. 상기 문서는 이미 동일한 증상을 겪고 있는 환자에 있어 그 질환을 검출할 수만 있고, 이로써 예측 및 가능한 예방 작용을 수립할 수 없는 기술의 진단 방법의 주된 문제점을 확인하고 있다. 그러나 저자들의 예상에도 불구하고, 상기 문제는 아직 해결되지 않았다. 환자들의 검사된 개체에 대해, 검사된 유전자 HIST3H3E 및 CNR2는 질환의 존재를 실제로 보여줄 수 있음을 드러내지만, 어떤 경우도 예측에는 유용하지 않다. 또한, 이들 중 어느 것도 락토페린과 관련이 없다.

상기 기술의 문제는 여전히 알츠하이머병의 진단 또는 예측을 위한 단일 바이오마커의 발견으로서 공식화되어 있다. 본 발명에 의해 제안된 해결은 어떤 피검자에 있어서 락토페린의 농도를 검출하는 방법이다.

PD와 관련하여, 상기 환자들의 뇌에서 락토페린의 신경세포 상방 제어(neuronal upregulation)는 본 분야에 잘 알려져 있다(Faucheux, B.A., et al. "Expression of lactoferrin receptors is increased in the mesencephalon of patients with Parkinson disease." Proc Natl Acad Sci USA 92, 9603-9607, 1995; Leveugle, B., et al. "Cellular distribution of the iron-binding protein lactotransferrin in the mesencephalon of Parkinson's disease cases". Acta Neuropathol 91, 566-5726, 1996). 그러나 본 발명자들의 지식 범위 내에서, 상기 기술은 타액 중의 단백질 제어에 대해서 교지하거나 제안하지 않았다. 이전에, 각 생물학적 유체 중에서 대사산물의 존재에 대해서는 직접적인 연관성이 없다.

PD와 관련된 문제는 상기 질환의 진단을 위한 단일 바이오마커의 발견에 있을 수 있다. 본 발명에 의해 제안된 해결책은 타액 중의 락토페린 농도(level)를 검출하는 방법이다.

본 발명은 AD의 진단 또는 예측에서 사용하기 위한 락토페린, 또는 락토페린 코드화 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 상기 진단 또는 예측은 점막 조직, 바람직하게는 구강 점막 조직, 및 타액 중에서 선택된 피검자의 생물학적 샘플에서 실시된다. 대안적으로, 본 발명은 피검자의 타액 또는 타액 샘플에서 AD의 진단 또는 예측에서의 락토페린의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 범주에서, 용어 "진단"에는 환자들에 있어서 AD인지, 또는 그의 어떠한 단계에서 MCI의 최초 증세인지의 여부가 측정될 수 있는 질병 진행 과정의 특정 등급이 포함한다.

본 발명의 범주에서, 용어 "예측(prognosis)"은 건강한 피검자에서 증상으로의 표현 형질 전환(phenoconversion)을 아직 검출할 수 없을 때 AD를 예측하는 것으로서 이해된다.

진단 훈련 연구에서 확인된 락토페린 단백질에 대해 단백질 컷오프 값(protein cut-off values)이 유도되었다. MCI/AD에 대한 표현 형질 전환의 예측값은 < 7.43μg/ml였다. 이것은 MCI 또는 AD 진단을 받은 모든 피검자들이 7.43μg/ml보다 더 낮은 타액 락토페린 값을 나타내었고, 모든 건강한 대조군 피검자들은 7.43μg/ml보다 더 높은 타액 락토페린 값을 나타내었음을 의미한다.

이를 바탕으로, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 피검자의 타액 또는 타액 샘플 중 락토페린의 농도를 평가하고, 상기 농도가 7.43μg/ml보다 높거나 낮은지를 결정하고, 여기서 7.43μg/ml보다 낮은 값이 알츠하이머병의 지표인 것을 포함하는, 피검자에서의 AD의 진단 방법이 제공된다. 락토페린의 농도가 7.43μg/ml보다 낮고, 상기 피검자가 신경계 질환의 표현 형질 전환을 나타내면, 상기 방법은 AD의 지표이다.

본 발명의 다른 바람직한 측면에 따르면, 피검자의 타액 또는 타액 샘플 중 락토페린의 농도를 평가하고, 상기 농도가 7.43μg/ml보다 높거나 낮은지를 결정하고, 여기서 7.43μg/ml보다 낮은 값이 AD의 예측에 대한 지표인 것을 포함하는, 상기 피검자에서의 AD의 예측 방법이 제공된다. 락토페린의 농도가 7.43μg/ml보다 낮고, 상기 피검자가 신경계 질환의 표현 형질 전환을 나타내지 않으면, 상기 방법은 AD의 예측에 대한 지표이다.

본 출원은 동일 연령의 대조군과 비교하여 MCI 및 AD 환자들로부터 얻은 사람의 타액 중 락토페린 농도가 더 낮은 것을 보여주며, 이 단백질이 AD의 초기 단계에 연루될 수도 있음을 제시한다. 타액 중 락토페린의 감소된 농도의 측정은 AD 병리학의 특성임을 가정한다.

본 발명의 범주에서, 타액 중 락토페린의 존재의 결정은 이 결정이 생체외 또는 생체내에서 실시되는지에 관계 없이, 상기 피검자의 건강에 상당한 위험을 초래할 수 있는 어떠한 침습적 또는 외과적 단계를 포함하지 않는다.

본 출원은 타액 중 락토페린 농도가 5년 이내에 MCI 또는 AD로 진행하게 될 인지적으로 정상인 피검자들을, 미래에 인식적으로 정상으로 남게 될 운명인 피검자들과 명백히 구별할 수 있음을 보여준다. 우리가 알기로는, 이것은 100% 정확도로 5년의 기간 이내에 표현 형질 전환을 예측할 수 있는 기술된 제1 단일 바이오마커이다. 본 발명은 심지어 9년 이내에 건강한 상태로부터 표현 형질 전환 MCI 및/또는 AD를 예측할 수 있다.

타액 샘플 수집 시에 연령 및 타액 락토페린 농도의 조합을 사용한 논리적 회귀 분석에서는 피검자들을 젊은 그룹 또는 노령 그룹으로서 정확하게 분류하고(도 5A), 노령 그룹 내에서, MCI/AD로의 표현 형질 전환자 및 비 표현 형질 전환자로 분류하였다(도 5B).

표현 형질 전환 발병에 따라 타액 중 락토페린 농도의 소모 간의 상관관계를 이용하여, 선형 회귀 분석을 통해 표현 형질 전환 시간을 결정하였다. 이 모델에서 보다 낮은 락토페린 농도는 AD의 표현 형질 전환의 위험성 증가와 연관되어 있다(도 6). 타액 락토페린 농도는 표현 형질 전환의 발병 시간에서의 변화와 관련된 것이다.

이와 관련하여, 상기 회귀 분석에서, 발병 시간(년)과 타액 락토페린 농도 간의 관계를 나타내는 식, y = 0.6289x + 1.6954가 산출된다. 이 식에서, "y"는 타액 락토페린 농도이고, "x"는 표현 형질 전환 시간(년)이다. 이 식을 타액 락토페린 농도가 컷오프 값, 예컨대, 7.43μg/ml보다 낮다고 가정한 경우에 적용하면, 결과적인 기간은 MCI/AD로의 표현 형질 전환의 9년 이상이다.

그러므로, 또 다른 바람직한 측면에서, 피검자자 AD의 표현 형질 전환을 보이기 전에, 상기 예측은 9년의 기간까지이며, 더욱 바람직하게는 8년, 7년, 6년 또는 5년까지이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 측면에서, 피검자는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람이다.

타액에서와 같이, 눈물 및 구강 점막 펠릿에서 수득된 유사한 결과는 말초 비침습성 신체 샘플로부터 락토페린 농도가 AD 진단 도구로서 사용되어야 하는 것을 나타낸다. 뇌 병리학 및/또는 임상적 변화가 감지되기 전에도 타액 락토페린이 첫번째 방어 라인을 나타낼 수 있으며, MCI 피검자에서 그의 감소는 초기 AD 바이오마커로 고려될 수 있다.

실제로, 타액 중 락토페린 농도의 유사한 감소가 또한 연령 및 성별로 짝을 이룬 AD 그룹 및 건강한 그룹의 두 그룹을 사용한 파일럿 연구에서 얻은 구강 점막에서도 발견할 수 있다. AD 환자들에서 락토페린 농도는 건강한 대조 피검자들에 비해, 현저히 감소하였으며, 이는 10.78 ± 1.9μg/ml에 대해 AD에서 4.35 ± 0.88μg/ml이다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시된다.

본 발명에 사용된 모델은 MCI/AD 대 건강한 대조 분류군의 경우, 95% 신뢰 간격(CI)(1-1)으로 AUC 1로써 질병 그룹(MCI/AD) 및 건강한 대조 피검자들로 분류했다(도 4B). 그러나 이들 데이터는 CSF 또는 혈액 샘플에서 재현 불가능하다.

이들 결과를 기본으로 하여, AD의 잠재적 마커인 트랜스페린류의 철 결합 당단백질을 고려하는 것이 제안된다.

또 다른 바람직한 측면에 따르면, 피검자의 타액 또는 타액 샘플 중 락토페린의 정량을 위한 시약 적어도 하나를 포함하고, 상기 정량을 미리 정해진 컷오프 값, 바람직하게는 7.43μg/ml와의 비교를 가능하게 하는, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 더욱 바람직한 측면에 있어서, 상기 시약은 락토페린에 특이적인 항체이다.

본 발명의 범주에서는 락토페린에 특이적인 항체가 락토페린을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 의미한다.

또 다른 바람직한 측면에 따르면, 피검자의 타액 또는 타액 샘플 중 락토페린의 정량을 위한 특정 약제를 함유하는 적어도 하나의 용기, 상기 약제의 사용을 위한 지시서 및 락토페린의 정량 결과가, 상기 피검자에서 AD를 나타내거나, AD를 유발할 위험성을 나타내는 미리 정해진 컷오프 값, 바람직하게는 7.43μg/ml보다 높거나 또는 낮은지를 결정하기 위한 단서를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명은 생물학적 샘플이 수득되는 곳보다 다른 센터에 있는 다수의 환자들의 진단 또는 예측을 의미하는 가능성을 제공한다. 이러한 관점에서, 본 발명의 추가의 측면은 데이터 처리 수단을 포함하는 AD 환자의 진행 과정 예측 시스템으로서, 상기 데이터 처리 수단은 타액 샘플에서 락토페린 또는 락토페린 코드화 핵산 분자의 농도를 평가하고, 상기 락토페린 농도가 예정된 컷오프 값, 바람직하게는 7.43μg/ml보다 낮은지를 결정하고, 이전 결정의 결과를 평가하여 상기 환자에 있어서 AD의 기능적 결과를 예측하도록 구성된 시스템이다.

그와는 반대로, 파킨슨병(PD) 환자들의 타액 중 락토페린 농도는 건강한 대조군에서 관찰된 농도보다 현저히 높은 농도를 나타낸다(도 2B). PD와 건강한 대조군 간의 쌍대 비교는 현저한 변화, 건강한 대조군에서 10.78±1.0μg/ml에 대해 PD에서 12.61±3.31μg/ml를 나타내었다. 이들 발견은 이전에 보고한 바와 같이, PD 환자들에서 락토페린의 신경계 상부 제어와 일치한다.

락토페린의 측정은 또한 PD 환자들에서 대응하는 것을 발견했다. 실제로, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 피검자의 타액 또는 타액 샘플에서 파킨슨병의 진단에 사용하기 위한, 락토페린, 또는 락토페린 코드화 핵산 분자가 제공된다. 바람직한 측면에서, 상기 대상자는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람이다.

도 1은 모든 샘플 중에 존재하는 SDS-PAGE 분획 후의 75kDa 락토페린 밴드를 나타낸다. MCI, AD 및 건강한 대조군에서 얻은 사람의 타액 중 락토페린의 확인. 혼합 타액에 해당하는 PAGE-SDS 겔의 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining). 1열, 대조군; 2열 MCI 그룹; 3열 및 4열, AD 그룹. 약 75kDa에 해당하는 밴드는 화살표로 표시됨.
도 2A는 사람의 ELISA 키트에 의해 측정된 타액 중 락토페린 농도가 대조군에 비해, MCI 및 AD 환자들에 있어서 감소했음을 나타낸다.
도 2B는 사람의 ELISA 키트에 의해 측정된 타액 중 락토페린 농도가 대조군에 비해, PD에 있어서 증가했음을 나타낸다.
도 3A는 MCI 및 AD 그룹에서 타액 중 락토페린 농도와 인지 감퇴 간의 상관관계를 나타낸다. 이 관계는 질환 단계와 락토페린 농도 간의 유의적인 음성 연관성에 의해 주도되었다((R= -0.74; p<0.001).
도 3B는 MCI 및 AD 환자에서 이용할 수 있는 인지 측정인 MMSE 점수와 타액 중 락토페린 농도 간의 상관관계를 나타낸다(R= 0.73; p<0.001).
도 3C는 완전 대조군 및 MCI/AD 그룹에서 타액 락토페린 농도 테스트에 대해 얻어진 ROC 곡선을 도시한다. 이 ROC 플롯은 민감도(참 양성 비율) 대 1-특이성(거짓 양성 비율)을 나타낸다. 상기 ROC 곡선 하의 면적 AUC=1(95% CI 1-1).
도 4A는 완전 대조군 및 전환자 그룹으로부터 타액 락토페린 농도 테스트에 대해 얻어진 수신자 작동 특징(ROC) 곡선을 도시한다. 상기 ROC 플롯은 민감도(또는 참 양성 비율) 대 1-특이성(또는 거짓 양성 비율)을 나타낸다. 이 2진 분류기 시스템(ROC 곡선)은 확고 부동한 AUC(area under the curve)=0.984(95% CI 0.932-1)를 산출했다. AUC는 파라미터가 0.93 내지 1 사이에서 95% 신뢰 간격(CI)으로, 2개의 진단 그룹 간에 얼마나 잘 식별할 수 있는 지를 나타내는 척도이다.
도 4B는 타액 락토페린 농도로 예측되는 바와 같은 aMCI 또는 AD로의 전환을 나타낸다. 이 이미지는 최소 콕스 비례 하자드 모델(minimal Cox proportional hazards model)을 기준으로, 비정상적으로 감소된(양성) 또는 정상/높은(음성) 락토페린 농도에 따라, aMCI 또는 AD로의 표현 형질 전환에 걸리는 평균 시간을 나타낸다. 파선은 음성이다. 실선은 양성이다.
도 4C는 락토페린 발현 값 및 발병 또는 표현 형질 전환의 시간(년)을 사용한 논리적 회귀 분석을 보여준다. 회귀 분석에 의해 만들어진 식은 y = 0.6289x + 1,6954이다.
도 5A는 젊은 건강한 그룹과 노령의 건강한 그룹 모두를 분류하기 위한 정확한 측정으로서 연령 및 타액 락토페린 값을 사용한 회귀 분석을 보여준다. ○ 젊은 비치매, □ 노인 비치매.
도 5B는 노령 그룹(비 표현 형질 전환자) 및 MCI 및 AD로의 표현 형질 전환자 모두를 분류하기 위한 정확한 측정으로서 연령 및 타액 락토페린 발현값을 사용한 회귀 분석을 보여준다. ○ 표현 형질 전환자, □ 노인 비 치매.

실시예

본 발명을 설명하기 위한 목적으로 이하의 실시예를 제공하지만, 이에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1. 타액 샘플의 추출

도세 데 옥뚜브레 대학 병원(Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid, Spain) 신경과에서 274명의 참가자들을 모집하여 AD 진단 훈련 연구를 수행하였다. 그들의 인지 상태에 따라 동일 연령 피검자의 4 그룹을 정하였다: aMCI, AD, 파킨슨병(PD) 및 인지적으로 건강한 대조군(표 1). AD 환자의 경우, NINDS-ADRDA(National Institute on Neurological Disorders and Stroke, and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association) 가이드라인에 따라 진단을 하였다(McKhann et al., "The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease". Alzheimer's Dement. 2011; 7: 263-9). PD 환자들은 의심 증상(probale) PD의 기준 하에 진단하였다(Gelb et al., "Diagnostic criteria for Parkinson disease". Arch Neurol. 1999 Jan;56(1):33-9). 치매 기준을 충족하지 않은 인지 장애가 있는 환자들 다음으로 MCI 환자들 그룹도 추가했다(Pedersen, "Mild cognitive impairment as a diagnostic entity". J Intern Med 2004; 256: 183-94). 간이 정신상태 검사(Mini-Mental State Examination, MMSE) 점수를 사용하여 질환 중증도를 평가하였다. 피검자 동의는 헬싱키 선언에 따라 받았으며, 도데 옥뚜브레 병원의 연구 윤리 위원회로부터 승인을 받았다. Bermejo-Pareja에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 2% 나트륨 아지드 용액으로 예비 코팅한 멸균 플라스틱 용기에 비자극 전체 타액을 수집하였다(Bermejo-Pareja et al., "Saliva levels of Abeta1-42 as potential biomarker of Alzheimer's disease: a pilot study". BMC Neurol 2010; 10: 108). 수집한 샘플을 즉시 얼음 위에 놓고 4℃에서 10분간 600x g의 저속 회전에 의해 예비 클리어 했다. 분취한 0.5ml 샘플을 프로테아제 억제제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail, Roche사 제조)로 처리한 후에 -80℃에서 저장하였다. 단백질 평가는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 분석하였다.

제1 훈련 연구로부터 피검자들의 인구 통계학적 및 임상적 특징

변수	대조	aMCI	AD	PD	p 값
n (F/M)	91 (59/32)	44 (25/19)	80 (49/31)	59 (32/27)	ns
연령 (세)	73.7 ± 6.88	75.16 ± 5.13	76.2 ± 5.33**	69.5± 8.6**	p<0.01
MMSE 점수	29 ± 0.8	26.8 ± 1.16***	19.25± 1.76***	NA	p<0.001
APOE ε4 보유자	12.9%	42.1%**	45.9%**	NA	p<0.01

M=남성; F=여성; aMCl= 건망증 경도 인지 장애; AD=알츠하이머병; PD=파킨슨병; MMSE=간이 정신상태 검사 점수; NA=적용 불가; ns=의미 없음. 데이터는 평균±S.D.로서 표현한다. **p<0.01 대조군 대비, ***p<0.001 대조군 대비.

실시예 2: 타액 샘플 중 락토페린의 측정

MCI 도너 및 대조 피검자와 비교하여, AD 환자에서 얻은 혼합(pooled) 샘플에서 타액 중 SEQ.ID.NO.:1 발현 농도에 따른 사람의 락토페린을 검출하였다. 각 그룹(MCI, AD 및 노인 비치매 대조군)에서 4명의 남성 피검자들로부터의 타액 샘플을 동량으로 혼합하여 풀링하였다. 각 풀(pool) 50μg을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. SDS-PAGE 분획 후에, 질량 분광계 분석에 의해 확인된 바와 같이 락토페린 분자량과 일치하는 모든 샘플 중에서 75kDa밴드를 검출하였다(31% coverage). ImageQuant software(GE Healthcare사제)를 사용하여 단백질 발현의 차이를 평가하였다. 동일한 양의 단백질을 로드하면, 밴드 강도 분석은 건강한 대조군에 비해 MCI(14%) 및 AD(51% 및 58%)에서 락토페린 농도의 감소를 나타냈다(도 1). 사람의 타액 중 락토페린의 존재를 입증하기 위해서, 트립신 및 엔도펩티다제 Asp-N(Thermo Fisher Scientific사 제조)으로 인 겔 소화(in-gel digestion) 후에, MALDI-TOF/TOF mass spectrometer 4800 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems사 제조, Framingham, MA) 및 4000 시리즈 ExplorerTM 소프트웨어(Applied Biosystems사 제조)에 의해 그 단백질을 동정하였다. 락토페린의 아미노산 커버리지(coverage)는 31%였다.

시판의 락토페린 사람 ELISA 키트(Abcam사 제조)에 의해 제조업자의 지시에 따라 락토페린 발현 농도의 평균을 내어 상기 차이의 추가 확인을 하였다. 튜키-크레이머 테스트(Tuckey-Kramer test)에 따라 ANOVA를 사용한 3그룹간의 쌍 비교(Pair-wise comparisons)는, 건강한 대조군에 대해 MCI 및 AD 환자 그룹에서 락토페린 농도의 현저한 감소를 나타내었다(p<0.05; 도 2A를 참조). PD 타액 중의 락토페린 농도는 건강한 대조군에서 관찰된 농도보다 현저히 더 높게 나타났다(도 2B를 참조).

실시예 3. 진단 도구로서의 타액 중 락토페린 함량

치매 진행 과정에 걸쳐 타액 중 락토페린 농도를 평가하였다. MCI 및 AD 그룹에서 타액 중 락토페린 농도 및 인지력 감퇴 간의 상관관계가 분명해 보인다. 이러한 관계는 질환 단계와 락토페린 농도 간의 유의적인 음의 연관성에 의해 주도된다(R= -0.742; p<0.001) (도 3A를 참조). 치매 진행의 추적에 MMSE 점수를 사용하였다. 타액 중 락토페린 농도는 또한 건강한 사람들에서 15 및 10μg/ml이고, MCI 및 AD를 포함한 치매 환자에서 7.43μg/ml 미만으로 매우 유의적인 상관관계(R= 0.731; p<0.001)(Fig. 3B) 후에, MCI 및 AD 환자들에 있어서 MMSE 점수와 상관관계가 있을 수 있다. 상관관계 분석에는 켄달 타우(Kendall's tau) 및 스페어맨 랭크(Spearman rank) 상관관계를 각각 사용하였다.

선형 회귀 분석을 사용하여, AD 및 aMCI를 겪고 있는 환자들이 인지적으로 건강한 참가자들보다 각각 ml당 타액 락토페린 6.432μg(95% CI:6.850-6.014; p<0.001) 및 5.310μg(95% CI: 5.810-4.810; p<0.001) 미만인 것을 발견하였다. 락토페린 분석으로부터 이들 결과를 사용하여, aMCI/AD 그룹을 대조군과 구별할 수 있는 별도의 선형 분류기 모델을 구축하고, 그룹 분류를 위한 분류기 모델의 성능을 평가하기 위해 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 분석을 하였다. 타액 분석에서 발견된 락토페린 농도를 사용한 분류기 모델은 곡선하 면적(an area under the curve, AUC) 1(95% CI 1-1)을 얻었으며, 이는 aMCI/AD 및 건강한 대조군 분류에서 민감도 100%(95% CI 96.90%-100%) 및 특이성 100%(95% CI 95.95%-100%)이다(도 3C를 참조). 컷오프 값(cut-off value)은 7.43μg/ml(유덴 지수: 1)였다.

실시예 4. 진단 도구로서의 타액 락토페린의 확인

다음에는, 91명의 추가 대상자들을 모집하여, 이전의 연구에서 사용된 동일한 표준화된 임상 평가로 2개의 새로운 은폐 및 독립 코호트(blinded and independant cohorts)에서 타액 락토페린의 컷오프 값을 확인하였다. 2개의 단체: 스페인 마드리드 소재의 퀸 소피아 재단 알츠하이머 센터(Queen Sofia Foundation Alzheimer Center), CIEN 재단, 알츠하이머병 연구소 및 스페인 세빌라(Sevilla)의 파블로 드 올라비데 유니버시티(Pable de Olavide Universiy)에서 모집된 대상자들의 인구 통계적 특징은 하기 표 2에 나타내었다.

확인 연구로부터 피검자들의 인구 통계적 특징

변수	대조	aMCI	AD	p 값
n (F/M)	40 (25/15)	15 (5/10)	36 (23/13)	ns
연령 (세)	66.78 ± 7.33	68.93 ± 6.12	80.67 ± 8.76***	p<0.001

F=여성; M=남성; aMCl= 건망증 경도 인지 장애; AD=알츠하이머병; ns=의미 없음. 데이터는 평균±S.D.로서 표현한다. ***p<0.001 대조군 대비.

상기 결과들은 모든 환자들((MCI/AD; n=51) 및 모든 인지적으로 건강한 피검자들(n=40)을 올바르게 분류한 타액 락토페린의 컷오프 값(7.43 μg/ml)을 나타내었다.

실시예 5. 예측 도구로서의 타액 락토페린 함량

타액 중의 락토페린 농도의 예측 가능성을 조사하기 위해서, 기억 장애 없이 인지적으로 건강한 대조 참가자들이 이 그룹에 통합되었다(표 3).

피검자들의 인구 통계적 특징

피검자	No.	M/F	연령 (평균 ± SEM)
대조(비치매성)	116	45/71	68.06 ± 1.12

M= 남성, F= 여성

비자극 전체 타액을 멸균 플라스틱 용기에 수집하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 락토페린 농도를 측정하였다. 8명의 피검자들은 건강한 대조군에 비하여, 타액 중 락토페린 농도가 현저히 감소한 것을 나타내었다(3.47 ± 0.41μg/ml 대 10.54 ± 1.58μg/ml; p<0.05). MCI 또는 AD로의 표현 형질 전환의 평균 시간은 3.25년(1~5년 범위)이었다. 표 4는 표현 형질 전환(발병) 시간과 연령 간의 연관성의 존재를 나타내며, 노인 피검자들이 더 짧아진다.

전환자들의 인구통계학적 특징

피검자	성별	연령	발병	Lt 농도 (μg/ml)	신경학적 진단	다른 임상 진단
1	M	82	2	3.01	MCI	HT, DM
2	F	70	4	3.17	MCI
3	F	71	5	3.69	MCI	HT, HC
4	F	68	5	5.10	MCI/AD
5	F	81	1	1.65	MCI/AD
6	F	77	2	1.89	MCI	HT
7	M	83	3	6.18	MCI/AD	HT, DM, HD
8	M	88	4	4.45	MCI	HT

Lt=락토페린; AD=알츠하이머병; MCI=경도 인지 장애; M=남성, F=여성; HT=고혈합, DM=진성 당뇨병; HD=심장 질환; HC=고지혈증.

실시예 6. 점막 락토페린 함량

아가드(Aagaard)에 따라 멸균 플라스틱 용기에 경구 점막을 수집하였다(Aagaard et al., "The Human Microbiome Project strategy for comprehensive sampling of the human microbiome and why it matters". FASEB J. 2013 Mar; 27(3):1012-22). 간략하게는, 표 5에 기재된 참가자들을 대상으로, 입안에서 1분 이상 타액을 모으게 한 후, 50ml 수집 튜브에 흘려넣고, 4℃에서 10분간 6000x g로 원심분리하여, 펠릿을 -80℃에서 보관했다.

피검자들의 인구통계학적 특징

피검자	No.	M/F	연령 (평균 ± SEM)
대조군(비치매성)	190	110/80	62± 1.23

M=남성, F=여성.

락토페린 농도는 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 6명의 피검자들은 건강한 대조군에 비해, 락토페린 농도의 현저한 감소를 나타내었다(AD에서의 4.28 ± 0.50μg/ml 대 9.05 ± 1.47μg/ml; p<0.05; 표 6). MCI 또는 AD로의 표현 형질 전환의 평균 시간은 3.83년(4~3년 범위)이었다. 기억 장애 없이 인지적으로 건강한 대조 참가자들을 표 5에 나타낸 그룹에 통합했다.

전환자들의 인구통계학적 특징

피검자	성별	연령	발병	Lt 농도 (μg/ml)	신경학적 진단
1	F	96	4	5.02	AD
2	M	66	4	3.66	MCI
3	M	82	4	2.51	AD
4	M	67	4	5.92	MCI
5	M	84	4	4.17	AD
6	M	85	3	4.13	MCI/AD

Lt=락토페린; AD=알츠하이머병; MCI=경도 인지 장애; M=남성, F=여성

실시예 7. MCI/AD로의 표현 형질 전환의 예측 모델의 구축

상기 실시예들에서 보여준 락토페린 ELISA 분석의 데이터를 사용하여, AD 병적 상태 또는 비 병적 상태 간에 구별이 가능한 독립 선형 분류기 모델을 구축하였다. 수신자 동작 특성(ROC) 분석은 그룹 분류를 위한 분류기 모델의 성능을 가늠한다. 타액 분석에서 발견된 락토페린 농도를 사용한 분류기 모델은 곡선하 면적(AUC)이 0.98로서, 95%(0.93-1) 신뢰 간격(CI; 도 4A)으로, 전환자들과 건강한 대조군을 효과적으로 분류했다. 이 모델은 전환자들과 건강한 대조군을 분류하기 위한, 100%의 민감도 및 98.6%의 특이성을 나타내었다(도 4A). 진단 테스트 평가의 기본 도구인 상기 ROC 곡선은 정상 경우와 질병이 있는 경우를 구별하기 위한 테스트의 정확성을 평가했다. 상기 ROC는 참 음성 샘플을 잘못 분류하는 비율에 대해 양성 샘플을 바르게 분류할 확률의 플롯으로서 이해할 수 있다. 그래서 상기 ROC 플롯의 AUC 측정은 예측 정확도의 척도이다.

콕스 비례 하자드 모델(Cox proportional hazards model)을 사용하여, 비정상적으로 감소되거나 또는 정상/높은 락토페린 농도에 의존하는 aMCI 또는 AD로의 표현 형질 전환에 대한 평균 시간을 측정하는 확률을 결정하였다(도 4B). 이들 결과는 타액 락토페린이 AD의 발생 확률을 예측하는 독립적 예측 인자임을 나타내고, HR: 0.428(95% CI 0.324-0.567; p<0.0001)이다.

본 연구에서, AUC=0.98은 강력한 식별력을 나타내며, 1은 완전한 식별력이다. 회귀 분석에서는 타액 락토페린 농도와 표현 형질 전환(발병) 시간(년) 간의 관계를 나타내는 식, y = 0.6289x + 1.6954(여기서, "y"는 타액 락토페린 농도이고, "x"는 표현 형질 전환 시간(년)이다)이 만들어진다(도 4C).

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Claims (16)

1. 삭제
2. 락토페린을 포함하는 알츠하이머병의 진단 또는 예측에 사용되기 위한 키트로서, 진단 또는 예측이 피검자로부터 수득한 타액 샘플 내에서 수행되는 것으로, 상기 타액 샘플 내에 적어도 하나의 락토페린을 정량하기 위한 시약을 포함하고, 상기 정량을 예정된 컷오프 값과 비교할 수 있는 것인, 키트.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 시약은 락토페린에 특이적인 항체인 것인, 키트.
   
4. 피검자로부터 수득한 타액 샘플 내에 락토페린의 정량을 위한 특정 약제를 함유하는 적어도 하나의 용기, 상기 약제의 사용을 위한 지시서 및 락토페린의 정량의 결과가 상기 피검자에 있어서 알츠하이머병을 가리키거나 또는 알츠하이머병의 발병 위험을 가리키는 예정된 컷오프 값보다 높거나 낮은지를 결정하기 위한 단서(dispositive)를 포함하는 키트.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제