CN108431608B - 用于诊断或预后阿尔茨海默病或用于诊断帕金森病的乳铁蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明是用于诊断或预后阿尔茨海默病(AD)的乳铁蛋白的蛋白质或其编码核酸。本发明是诊断或预后受试者中的AD的方法，包括评估所述受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白水平，并确定所述水平是否高于或低于7.43μg/ml的值，其中低于7.43μg/ml的值指示AD或AD的预后。另一方面是用于在受试者唾液样品中诊断帕金森病(PD)的乳铁蛋白的蛋白质或其编码核酸。

Description

用于诊断或预后阿尔茨海默病或用于诊断帕金森病的乳铁 蛋白

发明领域

本发明涉及在医学科学，特别是阿尔茨海默病和帕金森病的诊断中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)导致大多数痴呆病例。该疾病需要几十年才能完全发展，与其他第一次临床表现为轻度认知功能障碍(MCI)的退行性痴呆症有共同的许多症状前影响。AD的首要症状往往被错误地归因于衰老或压力。

目前，AD根据患者的病史、亲属的病史和行为观察来诊断。详细的神经心理学测试可以揭示在一个人满足诊断AD的临床标准之前数年的轻度认知困难。注意力、计划、灵活性和抽象思维的执行功能中的细微问题或语义记忆的损伤也可能是有症状的。包括记忆测试在内的智力功能评估可以进一步确定疾病的状态。

执业医师制定可以能够促进和标准化诊断过程的诊断标准的所有尝试都遵循这些参数。目前，明确的AD诊断需要组织病理学证实，包括脑组织的显微镜检查。

目前AD的定义或诊断是临床上的。在大多数情况下，临床诊断缺乏生物学标记。只有熟悉AD的单基因个体拥有遗传标记，并且这些不到所有病例的2％。Kane发现ApoE4等位基因是阿尔茨海默病型痴呆的风险因素，可增加患病风险并影响发病年龄，这一发现更具科学性而非临床重要性，且显示出很小的诊断能力(Kane RA,Kane RL.“Effect ofgenetic testing for risk of Alzheimer’s disease”.N.Engl.J.Med.2009,361(3),298–299)。

AD的最强生物标记候选物包括磁共振成像或正电子发射断层扫描的脑成像研究，以及脑脊液(CSF)中的蛋白质例如β-淀粉样蛋白和tau。AD研究的重点放在了症状开始前诊断病情上。已经使用和开发了许多生物标记和生物化学测试以允许AD早期检测。

使用基于蛋白质的测试的一些重大缺陷包括成本增加，侵入性程序的需要以及由结果解释引起的复杂化，这使得它们无法扩展应用。例如，脑中的脑皮质淀粉样蛋白负荷和体积变化的神经成像以及CSF中蛋白质浓度的评估是不能广泛获得的诊断工具。

在诊断之前，血液水平的自体溶酶体蛋白质也能够在1到10年之间的对照和疾病人群之间存在差异(Goetzl等人，“Altered lysosomal proteins in neural-derivedplasma exosomes in preclinical Alzheimer'sdisease”，Neurology 2015，Jul 7；85(1)：40-7)。最近的另一项研究验证了一些先前描述的能够预测从前体阶段转化为痴呆的血浆生物标记(Hye等，“Plasma proteins predict conversion to dementia fromprodromal disease”.Alzheimer′s&Dementia 2014,10,799-807)。然而，所有这些研究都集中在一个集合或一组生物标记上，包括蛋白质，脂质或其他代谢物。一般而言，生物标记包含在β-淀粉样蛋白和tau衍生的分子中。这些潜在的生物标记作为已经开始的疾病的指标，撤回了真正的早期检测或预后的可能性。从这个意义上说，本发明与需要在AD的痴呆前阶段进行诊断的科学共识相符合。

最近发表了几项研究，描述了在出现痴呆的早期症状之前可检测到的分子或生物化学改变，例如血浆中磷脂水平的降低(Mapstone等人，“Plasma phospholipids identifyantecedent memory impairment in older adults”.Nat.Med.2014,20(4)415-420)。该研究能够使用来自外周血的10种脂质小组在2-3年的时间范围内预测MCI或AD。时间的限制是很重要的。

Dubois最近尝试基于严格的临床标准、神经影像学检查和主要在CSF中的生物学数据建立AD的痴呆前的诊断，试图寻找更好定义的临床表型以便将生物标记整合到诊断过程中以得到疾病修改或预防性治疗(Dubois等人，“Advancing research diagnosticcriteria for Alzheimer’s disease”Lancet Neurol.2014Jun；13(6):614-29)。然而，目前的生物标记物不能令人满意，因为它们是侵入性的、费时的或昂贵的，包括CSF中的测定水平或结构和功能性磁共振成像。

申请US20140602046A1描述了AD的治疗，其包括施用抗来自tau蛋白的肽的特异性抗体。该文件提到疾病的缓慢进展和无症状受试者的预防。向10岁以上的全体人群推荐预防性用药。如上所述，一旦疾病发展，将被检测的tau异构体很可能在体内产生，从而丢弃预后。

US 20110236917 A1描述了诊断受试者中AD的方法，包括检测受试者血清样品中的一组47个生物标记蛋白质。转铁蛋白I和II在小组的标记中公开。这些教导的第一个缺点是需要血清样品，需要专业医师进行提取。此外，在集合中没有蛋白质被特别建议用于提供更准确的信息。基于该文献的教导，专家将不会被建议自行搜索任何相关的蛋白质来诊断受试者中的AD。事实上，能够预测或早期检测AD的理想单一生物标记尚未确定。

几条研究线表明大脑炎症与口腔健康之间可能存在相关性。最近，与唾液蛋白质组学有关的出版物数量显著增加，提出将人唾液作为诊断用生物液体。唾液在低侵入性、最低成本和容易收集和处理方面具有许多优点。已经描述了人类唾液中存在蛋白质A和tau，表明它们作为AD的潜在生物标记的用途(Shi等人，Salivary tau species are potentialbiomarkers of Alzheimer’s disease”.J Alzheimer’s Dis.2011；27(2):299-305)。在唾液样品中已经描述了其他蛋白质，包括与AD的炎症反应和发病机理相关的那些蛋白质(Ciregia等人，“Amultidisciplinary approach to study a couple of monozygotictwins discordant for the chronic fatigue syndrome:a focus on potentialsalivary biomarkers.”J Transl Med.2013Oct 2；11:243)。

在这方面，WO2013/153461A2描述了在存在于唾液中的一组分子中选择两种生物标志之后对AD的诊断。再次，所提到的蛋白质指示已经开始的疾病，因此所获得的结果不能用于疾病的预后。

乳铁蛋白是转铁蛋白家族的铁结合糖蛋白，已广泛用于炎症性疾病的诊断。该分子抑制炎性细胞因子的产生并调节氧化应激。它还与保护脑组织免受其他神经退行性疾病(包括帕金森氏病(PD))的氧化损伤有关，并且已经在tau蛋白质神经原纤维缠结和淀粉样蛋白β(Aβ)老年斑(其是AD中沿着神经元死亡的主要组织病理学标志)中被检测到(Wang等人，“Deposition of lactoferrin in fibrillar-type senile plaques in the brainsof transgenic mouse models of Alzheimer'sdisease”，Neurosci Lett 2010；481：164-7)。该蛋白质是由感染/炎症部位的外分泌腺和嗜中性粒细胞合成的人分泌物的一个组分。在唾液蛋白中，它是天然免疫的最重要因素，它代表了唾液中防止细菌损伤的重要防御因素。

Welling公开了可渗透血脑屏障(BBB)的一些抗微生物肽(AMP)(Welling等人，“Potential role of antimicrobial peptides in the early onset of Alzheimer’sdisease”,Alzheimer&Dementia,11,p.51-57,2015)。该出版物突出强调了乳铁蛋白在给予患者时穿过血脑屏障的能力，或在感染过程中被上调。此外，它提出可能使用AMP体内检测脑部感染。然而，其在感染过程中的上调与AD的诊断中的有效使用之间可能建立的任何关系使得是推测性的。

然而，US2003/0096736A1教导乳铁蛋白可用于治疗包括神经退行性疾病，特别是AD的几种疾病。对于该分子用于诊断或预测任何其他神经退行性疾病，特别是AD没有提供任何关联或暗示。

本领域尚未公开乳铁蛋白用于AD的诊断和/或预后。

WO2009074331A3被认为是与本发明最接近的现有技术。该文件的目的是描述AD早期诊断方法，其包括检测受试者的生物样品中的几种基因的蛋白质产物。转铁蛋白(TF)基因的产物包含在这些生物标记中，以及其他基因如IGF-1R或HISTIH3E。所提出的基因在任何生物学基础上在它们之间没有任何关系，所有这些基因都显示出在该方法中使用的相似的预测值。特别是，没有TF-基因产物被建议用于任何其他，以及没有乳铁蛋白。在基因产物上的应用范围是不可行的，并且为专家测试疾病的诊断提供了过多的工作量。虽然规定生物样品包含唾液，但实施例在血液样品中进行。该文件确定了本领域诊断方法的主要问题，只能在已经患有该疾病的患者中检测到疾病，从而不能确定预后和可能的预防措施。然而，尽管作者的期望，但必须说的是问题仍未解决。在测试的患者群体中，所测试的基因HIST3H3E和CNR2显示能够确实显示疾病的存在，然而在任何情况下都不能用于预后。另外，它们都不涉及乳铁蛋白。

本领域的问题仍然被制定为发现用于阿尔茨海默病的诊断或预后的单个生物标记。本发明提出的解决方案是检测受试者乳铁蛋白水平的方法。

关于PD，本领域已知患者脑中乳铁蛋白的神经元上调(Faucheux，BA等，“Expression of lactoferrin receptors is increased in the mesencephalon ofpatients with Parkinson disease.”Proc Natl Acad Sci USA 92,9603-9607,1995；Leveugle，B等人，“Cellular distribution of the iron-binding proteinlactotransferrin in the mesencephalon of Parkinson’s disease cases”.ActaNeuropathol 91,566-5726,1996)。然而，就发明人的知识程度而言，本领域并未教导或提示唾液中蛋白质的调节。事先每种生物液体中代谢物的存在没有直接联系。

关于PD的问题可以设定为用于诊断疾病的单个生物标记的发现。本发明提出的解决方案是检测唾液中乳铁蛋白水平的方法。

发明描述

本发明是用于AD的诊断或预后的乳铁蛋白或编码它的核酸分子。在优选的方面，所述诊断或预后在选自粘膜组织、优选口腔粘膜组织和唾液的受试者的生物样品中进行。或者，本发明是乳铁蛋白在受试者的唾液或唾液样品中诊断或预后AD中的用途。

在本发明的范围内，术语“诊断”包括可以在患者中测量的疾病的一定程度的进展，无论该陈述是AD还是MCI在其任何阶段的首个症状。

在本发明的范围内，术语“预后”被理解为当在健康受试者中尚未检测到症状的表型转化(phenoconversion)时预测AD。

针对在诊断性训练研究中鉴定的乳铁蛋白蛋白质导出蛋白质截断值。表型转化为MCI/AD的预测值<7.43μg/ml。这意味着所有具有MCI或AD诊断的受试者表现出低于7.43μg/ml的唾液乳铁蛋白值，并且所有健康对照者显示高于7.43μg/ml的唾液乳铁蛋白值。

基于此，本发明的另一方面是诊断受试者中的AD的方法，包括评估所述受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白水平，并确定所述水平是否高于或低于7.43μg/ml，其中低于7.43μg/ml的值指示AD。如果乳铁蛋白的水平低于7.43μg/ml并且受试者显示神经疾病的表型转化，则该方法指示AD。

本发明的另一个优选方面是预后受试者中AD的方法，包括评估所述受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白水平，并确定所述水平是否高于或低于7.43μg/ml，其中低于7.43μg/ml的值指示AD的预后。如果乳铁蛋白的水平低于7.43μg/ml并且受试者没有表现出神经疾病的表型转化，则该方法表示AD的预后。

本申请显示与年龄匹配的对照相比，来自MCI和AD患者的人唾液中乳铁蛋白的水平较低，表明该蛋白可能参与AD的早期阶段。据推测，乳铁蛋白唾液水平降低的测量是AD病理特异性的。

在本发明的范围内，确定乳铁蛋白在唾液中的存在不包括可能涉及受试者健康的实质风险的任何侵入或手术步骤，而不管所述测定是否离体或体内进行。

本申请表明，唾液乳铁蛋白水平能够明确区分认知上正常的受试者，与那些注定将在未来保持认知正常的受试者中相比较，其将在5年内进展为MCI或AD。据我们所知，这是第一个被描述的单一生物标记，能够以100％的精确度预测5年的时间范围内的表型转化。本发明甚至能够预测在9年的时间范围内从健康状态的MCI和/或AD表型转化。

采用唾液乳铁蛋白水平和唾液样品采集时年龄的组合的Logistic回归分析将受试者精确分类为年轻或老年组(图5A)，并在老年组内，MCI/AD表型转化者，和非表型转化者(图5B)。

通过线性回归分析确定表型转化时间，使用唾液中乳铁蛋白水平的消耗与表型转化开始之间的相关性。在这个模型中，较低的乳铁蛋白水平与AD的表型转化的风险增加有关。唾液乳铁蛋白水平与表型转化开始时间的变化有关。

在这方面，回归分析产生了方程

y＝0.6289x+1.6954

其描述了唾液乳铁蛋白水平与发病年龄的关系。在这个公式中，“y”是唾液乳铁蛋白水平，“x”是表型转化年数的时间。将该方程应用于唾液乳铁蛋白水平低于截断值(例如7.43μg/ml)的受试者的假设情况下，由此产生的时间表为向MCI/AD的表型转化的超过9年的时间。

因此，在另一个优选的方面，所述预后达到受试者显示AD表型转化前9年的时间范围，更优选达8年，7年，6年或5年。

在本发明的另一个优选方面，所述受试者是哺乳动物，更优选人。

根据唾液中的结果，泪液和口腔粘膜沉淀获得的类似结果表明，来自外周非侵入性身体样品的乳铁蛋白水平可用作AD的诊断工具。即使在检测到脑病理学和/或临床改变之前，唾液乳铁蛋白可能代表第一道防线，并且其在MCI受试者中的减少可被认为是早期AD生物标记。

实际上，使用两组(年龄和性别配对的健康对照和AD组)的初步研究获得的口腔粘膜中也可检测到唾液中乳铁蛋白水平的类似降低。与健康对照组相比，AD患者乳铁蛋白水平显著降低，AD为4.35±0.88μg/ml vs 10.78±1.9μg/ml。数据以平均值±标准偏差(SD)表示。

对于MCI/AD相对健康对照分类，本发明中使用的模型以1的AUC和95％置信区间(CI)(1-1)将患病组(MCI/AD)和健康对照受试者分类(4B)。然而，这些数据无论在血液样本还是CSF中都不可重现。

在这些结果的基础上，提出了考虑转铁蛋白家族的任何铁结合糖蛋白作为AD的潜在标记。

另一个优选的方面是用于执行本发明的方法的试剂盒，其包含至少一种用于定量受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白的试剂，并且能够将所述定量与预定截断值优选7.43μg/ml进行比较。在更优选的方面，所述试剂是乳铁蛋白特异性的抗体。

在本发明的范围内，特异于乳铁蛋白的抗体是指能够特异性识别乳铁蛋白的抗体。

又一个优选的方面是包括至少一个容器的试剂盒，所述容器包含用于定量受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白的特异性药物制剂，使用所述制剂的说明书以及确定乳铁蛋白定量结果是否高于或低于指示所述受试者中的阿尔茨海默病或发展阿尔茨海默病的风险的预定截断值优选7.43μg/ml的决定性措置。

本发明提供了管理获得生物样品的那些中心以外的其他中心的大量患者的诊断或预后的可能性。在这个意义上，本发明的另一个方面是一种用于预测受试者发展AD的系统，包括数据处理装置，所述数据处理装置被配置为在唾液样品中评估乳铁蛋白或编码其的核酸分子的水平，确定所述乳铁蛋白的水平是否低于预定的截断值，优选7.43μg/ml，和预测受试者中AD的功能结果，其评估先前测定的结果。

相反，帕金森病(PD)患者唾液中的乳铁蛋白水平显示出显著高于对照健康组中观察到的水平(图2B)。PD组和对照健康组之间的成对比较显示出显著改变，PD为12.61±3.31μg/ml，健康对照组为10.78±1.0μg/ml。数据以平均值±SD表示。这些发现与如先前报道的PD患者中乳铁蛋白的神经元上调一致。

乳铁蛋白的量度也发现在PD患者中的一致性。事实上，本发明的另一方面涉及用于在受试者的唾液或唾液样品中诊断帕金森病的乳铁蛋白或编码其的核酸分子。在优选的方面，所述受试者是哺乳动物，更优选人。

附图简述

图1A显示所有样品中存在SDS-PAGE分级分离后的75kDa乳铁蛋白条带。鉴定来自MCI，AD和健康对照的人唾液中的乳铁蛋白。考马斯蓝染色PAGE-SDS凝胶对应于唾液库。泳道1，对照组；泳道2，MCI组；泳道3和，4AD组。对应于约75kDa的条带用箭头标记。

图2A显示与对照组相比，MCI和AD患者中通过人ELISA试剂盒测量的乳铁蛋白的唾液水平降低。

图2B显示与对照组相比，PD中由人ELISA试剂盒测量的乳铁蛋白唾液水平增加。

图3A显示了MCI和AD组中乳铁蛋白的唾液水平与认知下降之间的相关性。这种关系主要由疾病阶段和乳铁蛋白水平之间显著的负相关性所驱动(R＝-0.74；p<0.001)。

图3B显示了乳铁蛋白的唾液水平与MMSE评分之间的相关性，MMSE评分是MCI和AD患者中可用的认知度的量度(R＝0.73；p<0.001)。

图3C显示了从完全对照组和MCI/AD组测试唾液乳铁蛋白水平获得的ROC曲线。ROC图代表灵敏度(真阳性率)相对1-特异度(假阳性率)。ROC曲线下面积AUC＝1(95％CI 1-1)。

图4A显示了来自完全对照组和转化者组的唾液乳铁蛋白水平测试获得的接受者操作特征(ROC)曲线。ROC图代表灵敏度(或真阳性率)相对1-特异度(或假阳性率)。该二元分类系统(ROC曲线)产生稳健曲线下面积AUC＝0.984(95％CI 0.932-1)。AUC是参数能够区分两个诊断组的程度的度量，具有从0.93到1的95％置信区间(CI)。

图4B显示了如唾液乳铁蛋白水平所预测的向aMCI或AD的转化。基于最小Cox比例风险模型，图像显示取决于异常降低(阳性)或正常/高(阴性)乳铁蛋白水平的转化为aMCI或AD的平均时间。虚线是阴性。连续线是阳性。

图4C显示了使用乳铁蛋白表达值和发病或表型转化的年数时间的logistical回归分析。通过回归分析产生的等式为y＝0.6289x+1,6954。

图5A显示了使用唾液乳铁蛋白值和年龄作为精确测量以分类年轻和老年健康组的回归分析。○年轻的非痴呆者；□年老的非痴呆者。

图5B显示了使用唾液乳铁蛋白表达值和年龄作为精确测量以分类老年组(非表型转化者)和向MCI和AD的表型转化者的回归分析。○转化者；□年老的非痴呆者。

实施例

提供以下实施例是为了以举例说明性而非限制性的方式示出本发明。

实施例1.唾液样品的提取

AD诊断训练研究在Hospital Universitario 12de Octubre(Madrid,Spain)的神经病学服务处招收了274名参与者。根据他们的认知状态定义四(4)组年龄相匹配的受试者：aMCI，AD，帕金森病(PD)和认知健康对照组(表1)。对于AD患者，根据国家神经疾病和中风研究所以及阿尔茨海默病和相关疾病协会(NINDS-ADRDA)指南(McKhann等，“Thediagnosis of dementia due to Alzheimer'sdisease:recommendations from theNational Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnosticguidelines for Alzheimer's disease”.Alzheimer’s Dement.2011；7:263-9)建立诊断。根据可能的PD的标准诊断PD患者(Gelb等人，“Diagnostic criteria for Parkinsondisease”.Arch Neurol.1999Jan；56(1):33-9)。在不符合痴呆标准的患有认知障碍的患者之后，还定义了一组MCI患者(Pedersen,“Mild cognitive impairment as a diagnosticentity”.JIntern Med 2004；256:183-94)。使用简易精神状态检查(MMSE)评分评估疾病严重度。根据赫尔辛基宣言获得了受试者的同意，并获得了Research Ethic Committee ofHospital 12de Octubre的批准。如先前由Bermejo-Pareja描述的(Bermejo-Pareja等人，“Saliva levels of Abeta1-42 as potential biomarker of Alzheimer's disease:apilot study”.BMC Neurol 2010；10:108)，将未刺激的全唾液收集到预涂布有2％叠氮钠溶液的无菌塑料容器中study“，BMC Neurol 2010；10：108)。立即将收集的样品置于冰上并在4℃下以600×g的低速旋转预清除10分钟。在用蛋白酶抑制剂混合物(Roche)处理后，将等分的0.5ml样品储存在80℃。根据制造商的说明使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)分析蛋白质估计。

表1.来自第一次训练研究的受试者的人口统计学和临床特征。

M＝男性；F＝女性；aMCI＝遗忘轻度认知障碍；AD＝阿尔茨海默病；PD＝帕金森病；MMSE＝简易精神状态检查分数；NA＝不适用；ns＝不显著。数据表示为平均值±S.D.**与对照组相比p<0.01；***与对照组相比p<0.001。

实施例2：测量唾液样品中的乳铁蛋白

与MCI供体和对照受试者相比，在来自AD患者的合并样品中检测到人乳铁蛋白的唾液表达水平。将每组(MCI，AD和老年非痴呆对照)的4名男性受试者的唾液样品通过等量混合合并。将50μg各合并库装载在SDS-PAGE凝胶上。经SDS-PAGE分级分离后，在所有样品中检测到与乳铁蛋白分子量相匹配的75kDa条带，如质谱分析证实的(覆盖率为31％)。使用ImageQuant软件(GE Healthcare)评估蛋白质表达的差异。在等量的蛋白质加载后，谱带强度分析显示与健康对照组相比，MCI(14％)和AD(51％和58％)中的乳铁蛋白水平降低(图1A)。为了验证人唾液中乳铁蛋白的存在，在用胰蛋白酶和内肽酶Asp-N(Thermo FisherScientific)凝胶消化后，通过MALDI-TOF/TOF质谱仪4800蛋白质组学分析仪(AppliedBiosystems，Framingham，MA)和4000系列ExplorerTM软件(Applied Biosystems)鉴定该蛋白质。对于乳铁蛋白的氨基酸覆盖率为31％。

根据制造商的说明书，通过商业乳铁蛋白人ELISA试剂盒(Abcam)平均乳铁蛋白表达水平获得这些差异的进一步证实。使用ANOVA和随后Tuckey-Kramer检验，三组之间的成对比较显示MCI和AD患者组相对于健康对照组乳铁蛋白水平显著降低(p<0.05；图2A)。PD唾液中的乳铁蛋白水平显示出显著高于对照健康组中观察到的水平的水平(图2B)。

实施例3.唾液乳铁蛋白含量作为诊断工具

在整个痴呆进展过程中评估乳铁蛋白的唾液水平。MCI和AD组唾液乳铁蛋白水平与认知功能下降之间的相关性似乎很明显。这种关系主要由疾病阶段和乳铁蛋白水平之间显著的负相关性所驱动(R＝-0.742；p<0.001)(图3A)。MMSE评分被用于跟踪痴呆的进展。在高度显著相关(R＝0.731；p<0.001)(图3B)至健康人中的15和10μg/ml，和包括MCI和AD在内的痴呆人中的低于7.43μg/ml之后，唾液乳铁蛋白浓度在MCI和AD患者中也可能与MMSE评分相关。Kendall的tau和Spearman秩相关分别用于相关性分析。

使用线性回归分析，我们发现患有AD和aMCI的患者具有分别低于认知健康的参与者6.432μg(95％CI：6.850-6.014；p<0.001)和5.310μg(95％CI：5.810-4.810；p<0.001)的唾液乳铁蛋白/ml。我们使用这些来自乳铁蛋白分析的结果来构建将区分aMCI/AD组与对照组的独立线性分类器模型，并且我们进行了接受者操作特征(ROC)分析以评估用于组分类的分类器模型的性能。对于aMCI/AD和健康对照组分类，使用从唾液分析中发现的乳铁蛋白水平的分类器模型产生1的曲线下面积(AUC)(95％CI 1-1)，灵敏度为100％(95％CI96.90％-100％)，特异性度100％(95％CI 95.95％-100％)(图3C)。截断值为7.43μg/ml(Youden指数：1)。

实施例4.验证唾液乳铁蛋白作为诊断工具

唾液乳铁蛋白的截断值然后在两项新的不知情和独立的队列中得到验证，这些队列招募了91名额外的参与者，并使用与之前研究中使用的相同的标准化临床评估。表2列出了两个实体招募的参与者的人口学特征：阿尔茨海默病研究单位，CIEN基金会，索非亚女王基金会阿尔茨海默中心(Madrid,Spain)和西班牙塞维利亚帕布洛德奥拉维德大学。

表2.来自验证研究的受试者的人口统计学特征。

F＝女性；M＝男性；aMCI＝遗忘轻度认知障碍；AD＝阿尔茨海默病；ns＝不显著。数据表示为平均值±S.D.。***与对照组相比p<0.001。

结果显示，所有患者(MCI/AD；n＝51)和所有认知健康受试者(n＝40)的唾液乳铁蛋白截断值(7.43μg/ml)均正确分类。

实施例5.唾液乳铁蛋白含量作为预测工具

为了研究唾液中乳铁蛋白水平的预测潜力，没有记忆障碍的认知健康对照参与者整合到该组(表3)。

表3.受试者的人口统计学特征。

M＝男性，F＝女性。

将未受刺激的全唾液收集到无菌塑料容器中，并且如实施例1中所述测定乳铁蛋白水平。与健康对照组相比，八(8)位受试者显示唾液中乳铁蛋白的水平显著降低(3.47±0.41μg/ml相对10.54±1.58μg/ml；p<0.05)。表型转化为MCI或AD的平均时间为3.25年(范围为1-5年)。表4显示了表型转化时间(发病)与年龄之间存在关联，与年长受试者相比较短。

表4.转化者的人口统计学特征。

LT＝乳铁蛋白；AD＝阿尔茨海默病；MCI＝轻度认知障碍；M＝男性，F＝女性；HD＝高血压，DM＝糖尿病；HD＝听力疾病；HC＝高胆固醇。

实施例6.粘膜乳铁蛋白含量

根据Aagaard(Aagaard等人，"The Human Microbiome Project strategy forcomprehensive sampling of the human microbiome and why it matters”.FASEBJ.2013Mar；27(3):1012-22)将口腔粘膜收集到无菌塑料容器中。简言之，表5中描述的参与者在允许唾液在口中收集≥1分钟后，流口水至50ml收集管中，在4℃下以6000×g离心10分钟，并且将沉淀储存在80℃。

表5.受试者的人口统计学特征。

M＝男性，F＝女性。

乳铁蛋白水平如实施例1所述进行测定。与健康对照组相比，六(6)名受试者显示乳铁蛋白水平显著降低(AD中4.28±0.50μg/ml相对9.05±1.47μg/ml；p<0.05；表6)。表型转化至MCI或AD的平均时间为3.83年(范围为4-3年)。没有记忆障碍的认知健康对照参与者整合到表5中所示的组。

表6.转化者的人口统计学特征。

LT＝乳铁蛋白；AD＝阿尔茨海默病；MCI＝轻度认知障碍；M＝男性，N＝女性。

实施例7.建立向MCI/AD表型转化的预测模型

在乳铁蛋白Elisa分析的前述实施例中显示的数据用于构建能够区分AD病理或非病理状态的单独的线性分类器模型。接受者操作特征(ROC)分析评估分类器模型用于组分类的性能。使用从唾液分析中发现的乳铁蛋白水平的分类器模型以0.98的曲线下面积(AUC)和95％(0.93-1)的置信区间(CI；图4A)有效地分类转化者和健康对照组。该模型对转化者和健康对照组进行分类的灵敏度为100％，特异度为98.6％(图4A)。该ROC曲线是诊断试验评估的基本工具，评估了用于区分患病病例与正常病例的测试的准确性。ROC可以理解为正确分类阳性样本相对于真正阴性样本的错误分类率的概率图。因此，ROC图的AUC测量是预测准确度的量度。

使用Cox比例风险模型确定依赖于异常降低或正常/高的乳铁蛋白水平估计表型转化至aMCI或AD的平均时间的可能性(图4B)。我们的研究结果表明，唾液乳铁蛋白是预测AD发生概率的独立预后因子，HR：0.428(95％CI 0.324-0.567；p<0.0001)。

在本研究中，AUC＝0.98表明强大的区分能力，其中1是完美的区分。回归分析产生了描述唾液乳铁蛋白水平与表型转化(发作)时间(年)之间关系的等式，y＝0.6289x+1.6954，其中“y”为唾液乳铁蛋白水平，“x”为表型转化的年数时间(图4C)。

Claims (8)

1.用于定量受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白的药物制剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断所述受试者的阿尔茨海默病或当在所述受试者中尚未检测到症状的表型转化时预测阿尔茨海默病。

2.用于定量显示神经疾病的表型转化的受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白的药物制剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断所述受试者的阿尔茨海默病的方法，其中所述方法包括：

-评估所述受试者的唾液或唾液样品中乳铁蛋白的水平，以及

-确定所述水平是否高于或低于7.43μg/ml的值，其中低于7.43μg/ml的值指示阿尔茨海默病。

3.用于定量未显示神经疾病的表型转化的受试者的唾液或唾液样品中的乳铁蛋白的药物制剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于当在所述受试者中尚未检测到症状的表型转化时预测阿尔茨海默病的方法，其中所述方法包括：

-评估所述受试者的唾液或唾液样品中乳铁蛋白的水平，以及

-确定所述水平是否高于或低于7.43μg/ml的值，其中低于7.43μg/ml的值指示阿尔茨海默病的预测。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述预测达到在所述受试者显示阿尔茨海默病的表型转化之前九年的时间范围。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述时间范围为五年。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

8.用于预测受试者发展阿尔茨海默病的系统，包括数据处理装置，所述数据处理装置被配置为：

-在唾液样品中评估乳铁蛋白或编码其的核酸分子的水平；

-确定所述乳铁蛋白的水平是否低于预定的截断值；和

-预测受试者中阿尔茨海默病的功能结果，其评估先前测定的结果。

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