KR20230010687A

KR20230010687A - 알츠하이머 병 평가용 단백질 마커

Info

Publication number: KR20230010687A
Application number: KR1020227043421A
Authority: KR
Inventors: 낸시 육유 이프; 키트 유 푸; 유안빙 지앙; 시아오푸 조우; 파니 추이-펀 이프
Original assignee: 더 홍콩 유니버시티 오브 사이언스 앤드 테크놀러지
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2023-01-19
Also published as: IL298100A; EP4150120A1; CN115461474A; AU2021273299A1; JP2023525859A; US20230213535A1; WO2021228125A1

Abstract

본 발명은 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD)과 관련된 사람의 혈액 샘플(예: 혈장, 혈청 또는 전혈 샘플)에 존재하는 단백질 마커, AD의 진단 및 치료 방법, 및 AD 진단용 키트를 제공한다.

Description

알츠하이머 병 평가용 단백질 마커

관련 출원

본 출원은 2020년 5월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 No. 63/024,940의 우선권을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 전문이 참조로 본원에 포함된다.

신경퇴행성 질환 및 신경염증성 장애와 같은 뇌 질환은 인구의 많은 부분집합에 영향을 미치는 파괴적인 상태이다. 대부분은 치료가 불가능하고, 매우 쇠약하며, 종종 시간이 지남에 따라 뇌 구조 및 기능의 진행성(progressive) 저하를 초래한다. 또한 전 세계적으로 고령화 인구가 증가함에 따라 질환 발병률도 급속도로 증가하고 있으며, 이는 노인들은 이러한 상태가 발병할 위험이 높기 때문이다. 현재 많은 신경퇴행성 질환 및 신경염증성 장애는 이들 질환의 병리생리학에 대한 제한된 이해로 인해 진단하기 어렵다. 한편, 현재의 치료법은 효과가 없으며 시장 수요를 충족시키지 못하며; 인구 고령화로 인해 매년 그 수요는 현저히 증가한다. 예를 들어, 알츠하이머병(AD)은 학습 및 기억력의 점진적이지만 진행성인 저하를 특징으로 하며 노인 사망의 주요 원인이다. AD의 발병률 증가는 더 나은 진단에 대한 필요성과 요구를 추진한다. Alzheimer's Disease International에 따르면 이 질병은 현재 전 세계적으로 4,680만 명의 사람들에게 영향을 미치고 있지만 앞으로 30년 동안 사례 수가 세 배로 증가할 것으로 예상된다. 노인 인구 증가율이 가장 빠른 나라 중 하나는 중국이다. 인구 예측에 따르면, 2030년까지 개인 4명 중 1명이 60세 이상일 것이며, 이로 인해 상당한 비율이 AD 발병 위험에 놓이게 될 것이다. 실제로 중국의 AD 사례 수는 1990-2010년 사이에 370만 건에서 920만 건으로 두 배 증가했으며, 2050년에는 2,250만 건에 이를 것으로 예상된다. 홍콩 인구도 빠르게 고령화되고 있다. 65세+의 고령자는 2025년에는 전체 인구의 24%, 2050년에는 39.3%가 될 것으로 추정된다. AD 사례의 수는 2039년까지 332,688건으로 증가할 것으로 예상된다.

더 걱정스러운 것은 알츠하이머병 발병률의 증가에도 불구하고 많은 사람들이 정확한 알츠하이머 진단을 받지 못하고 있다는 점이다. Alzheimer's Disease International의 2015년 World Alzheimer' Report에 따르면 고-소득 국가에서는 치매 사례의 20-50%만이 1차 의료(primary care)에 기록되어 있다. 나머지는 진단되지 않거나 잘못 진단된 상태로 유지된다. 이 '치료 격차(treatment gap)'는 저-소득 및 중간-소득 국가에서 훨씬 더 현저하다. 공식적인 진단이 없으면 환자는 필요한 치료와 관리를 받지 못하며 환자나 간병인도 중요한 지원 프로그램을 받을 자격이 없다. 조기 진단 및 조기 개입은 이러한 치료 격차를 좁히는 두 가지 중요한 수단이다. 따라서, 질병 위험을 신속하고 정확하게 결정할 수 있는 조기 진단 도구는 여러 수준에서 상당한 치료적 가치가 있다. 연구에 따르면 AD는 기억 상실 또는 인지 저하의 실제 증상이 실제로 나타나기 오래 전에 뇌에 영향을 미친다는 사실이 확인되었다. 그러나 현재까지 조기 발견을 위한 진단 도구는 없으며; 지금까지 환자는 주관적인 임상 평가를 포함하는 현재 이용 가능한 방법을 사용하여 AD로 진단되었으며 종종 병리학적 증상은 이미 진행된 상태이다. 이와 같이, AD 치료 및 장기 관리의 개선을 위해, AD를 조기에 진단하거나 이후 환자의 AD 발병 위험 증가를 검출하기 위한 새롭고 효과적인 방법을 개발할 시급한 필요가 존재한다. 본 발명은 알츠하이머병(AD) 발병의 개인 위험성을 평가하기 위해, 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질 마커 또는 이들의 조합의 사용과 관련된 신규한 방법 및 키트를 개시함으로써 이러한 요구 및 기타 관련 요구를 다룬다.

본 발명은 알츠하이머병(AD)과 관련된 신규한 혈장 단백질 마커의 발견에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 AD의 진단뿐만 아니라 AD 치료를 위한 활성제의 치료 효능을 나타내는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.

이와 같이, 제1 양상에서, 본 발명은 개체의 이후 AD 발병 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (1) 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 표 1-4로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 수준 또는 농도를 AD를 앓지 않거나 AD의 증가된 위험성이 없는 평균적인 건강한 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서 발견되는 동일한 단백질의 표준 대조군 수준과 각각 비교하는 단계; (2) 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질(표 1, 2, 3, 또는 4에서 양의 β 값을 가짐) 수준이 표준 대조군 수준보다 높은 것 또는 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질(표 1, 2, 3, 또는 4에서 음의 β 값을 가짐) 수준이 표준 대조군 수준보다 낮은 것을 검출하는 단계; 및 (3) 상기 개체가 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정하는 단계. 표 2에서 식별된 429개의 단백질 중 어느 하나가 이 방법에 사용하기에 적합하지만, 어떤 경우에는 단백질이 표 1에 제시된 74개 단백질, 또는 표 4에 제시된 19개 단백질 또는 표 3에 제시된 12개 단백질로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 또한 상기 단계 (1) 전에, 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 (1) 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단계 (3)에서 개체가 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정되는 경우, 상기 개체는 본 개시에 기술된 증가된 후속(follow-up) 모니터링(예를 들어, 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 의료 전문가에 의해 처방된 일상적인 모니터링과 비교하여 증가된 빈도의 테스트 모니터링) 또는 치료를 제공받는다.

제2 양상에서, 본 발명은 2명의 개체 간 알츠하이머병(AD)에 대한 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 단계를 포함한다: (i) 제 1 개체의 표 1-4로부터 선택되는 어느 하나의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 수준을 제 2 개체의 동일한 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준과 각각 비교하는 단계; (ii) 제2 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준이 각각 제1 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질(표 1, 2, 3 또는 4에서 양의 β 값을 가짐) 수준보다 더 높은 것 또는 제2 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준이 각각 제1 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질(표 1, 2, 3 또는 4에서 음의 β 값을 가짐) 수준보다 더 낮은 것을 검출하는 단계; 및 (iii) 제2 개체가 제1 개체보다 AD에 대한 이후 발병 위험성이 더 높은 것으로 결정하는 단계. 표 2에서 식별된 429개의 단백질 중 어느 하나가 이 방법에 사용하기에 적합하지만, 일부 구체예에서 단백질은 표 1에 제시된 74개 단백질, 또는 표 4에 제시된 19개 단백질 또는 표 3에 제시된 12개 단백질로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 (1) 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단계 (iii)에서 개체가 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정되는 경우, 상기 개체는 본 개시에 기술된 증가된 후속 모니터링(예를 들어, 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 전문 의료진에 의해 처방된 일상적인 모니터링과 비교하여 증가된 빈도의 테스트 모니터링) 또는 치료를 제공받는 반면, AD에 대해 더 낮은 위험성을 갖는 것으로 여겨지는 다른 개체는 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 전문 의료진에 의해 처방되는 일상적인 모니터링을 받는다.

제3 양상에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병(AD)에 대한 위험성을 평가하거나 AD에 대한 치료 요법의 치료 효능을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 2에 제시된 429개의 단백질로부터 독립적으로 선택되는 어느 5, 10, 15 또는 20개의 단백질 각각의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준 또는 농도를 결정할 수 있는 적어도 하나의 시약을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 표 1에 제시된 74종의 단백질, 또는 표 4에 제시된 19종의 단백질, 또는 표 3에 제시된 12종의 단백질로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 아밀로이드 β 단백질 42, 아밀로이드 β 단백질 40, 및 뉴로필라멘트 라이트 폴리펩티드(neurofilament light polypeptide, NfL) 각각의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준 또는 농도를 결정할 수 있는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 AD를 앓지 않거나 AD에 대한 증가된 위험성이 없는 평균적인 건강한 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서 발견되는 동일한 단백질의 수준/농도를 반영하는 각각의 단백질에 대한 표준 대조군을 추가로 포함할 수 있다.

제4 양상에서, 본 발명은 개체에서 AD 대한 위험성을 평가하거나 AD에 대한 치료 요법의 치료 효능을 평가하기 위한 검출 칩을 제공한다. 상기 칩은 고체 기질 및 표 2에 제시된 429개의 단백질 중에서 독립적으로 선택된 5, 10, 15 또는 20개의 단백질 각각의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 결정할 수 있는 시약을 포함하며, 상기 각 시약은 상기 기질의 확인 가능한(addressable) 위치에 고정되어 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 표 1에 제시된 74종의 단백질, 또는 표 4에 제시된 19종의 단백질, 또는 표 3에 제시된 12종의 단백질로부터 독립적으로 선택된다.

제5 양상에서, 본 발명은 2명의 개체에서 알츠하이머병(AD)에 대한 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 단계를 포함한다: (1) 일 세트의 값을 다음 공식에 넣어 예측 점수를 계산하는 단계:

및 (2) 0 내지 0.25 ± 0.05의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 낮은 것으로 결정하고, 0.25 ± 0.05 초과 내지 0.80 ± 0.01의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 중등도(moderate)인 것으로 결정하고, 및 0.80 ± 0.01 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 높은 것으로 결정하는 단계. 이 방법에서 상기 일 세트의 값은 상기 표 3에 제시된 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하고, 상기 단백질의 가중 계수(weighted coefficient, β _i ) 및 절편(ε)은 표 5-8에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 표 3의 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되고, 상기 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 5에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.25의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험을 갖고; 0.25 초과 내지 0.79의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험을 갖고; 0.79 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험을 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 표 4의 19개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되고, 상기 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 6에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.21의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험을 갖고; 0.21 초과 내지 0.8의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험을 갖고; 0.8 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험을 갖는다.

일부 구체예에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 3의 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 7에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.20의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험을 갖고; 0.20 초과 내지 0.80의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험을 갖고; 0.80 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험을 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 4의 19개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 8에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.30의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험을 갖고; 0.30 초과 내지 0.80의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험을 갖고; 0.80 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험을 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 (1) 전에, 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 측정 단계 이전에 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 또 다른 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단계 (2)에서 개체가 AD에 대한 높은 위험을 갖는 것으로 결정되는 경우, 상기 개체는 본 개시에 기술된 증가된 후속(follow-up) 모니터링(예를 들어, 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 의료 전문가에 의해 처방된 일상적인 모니터링과 비교하여 증가된 빈도의 테스트 모니터링) 및 치료가 주어진다. 상기 단계 (2)에서 개체가 AD에 대한 중등도의 위험을 갖는 것으로 결정되는 경우, 그는 이후 본 개시에 기술된 증가된 후속 모니터링(예를 들어, 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 의료 전문가에 의해 처방된 일상적인 모니터링과 비교하여 증가된 빈도의 테스트 모니터링)이 주어진다. 개체가 AD에 대한 위험이 낮은 것으로 결정되는 경우, 그는 AD에 대한 위험이 없거나 낮은 사람에게 의사가 일반적으로 처방하는 일상적인 모니터링이 주어진다.

제6 양상에서, 본 발명은 2명의 개체에서 알츠하이머병(AD)에 대한 상대적인 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 단계를 포함한다: (i) 일 세트의 값을 다음 공식에 넣어 두 개체에 대한 예측 점수를 계산하는 단계:

및 (ii) 더 높은 점수를 갖는 개체를 다른 개체보다 AD에 대한 위험도가 더 높은 것으로 결정하는 단계. 이 방법에서 사용된 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 2에 제시된 단백질 중 적어도 하나의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 2, 3, 4, 및 9에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 2에 제시된 단백질의 임의의 조합의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 2, 3, 4 및 9에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4에 제시된 적어도 하나의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4로부터 독립적으로 선택되는 적어도 5개의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4로부터 독립적으로 선택되는 적어도 10개의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 (i) 전에, 각 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 측정 단계 이전에 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 일 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단계 (iii)에서 개체가 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정되는 경우, 상기 개체는 본 개시에 기술된 증가된 후속 모니터링(예를 들어, AD에 대한 위험성이 없거나 위험성이 낮은 사람에게 전문 의료진에 의해 처방된 일상적인 모니터링과 비교하여 증가된 빈도의 테스트 모니터링) 또는 치료를 제공받는 반면, AD에 대해 더 낮은 위험성을 갖는 것으로 여겨지는 다른 개체는 위험성이 없거나 위험성이 낮은 유사한 연령 및 의학적 배경을 갖는 사람에게 전문 의료진에 의해 처방되는 일상적인 모니터링을 받는다.

제7 양상에서, 본 발명은 AD로 진단된 개체에서 알츠하이머병(AD)을 치료하기 위한 치료제의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 단계를 포함한다: (1) 치료제 투여 전 표 1-4로부터 선택되는 어느 하나의 단백질의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 치료제 투여 후 개체의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준과 비교하는 단계; (2) 치료제 투여 후에 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질 수준(표 1, 2, 3 또는 4에서 양의 β 값을 가짐)의 감소 또는 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준(표 1, 2, 3 또는 4에서 음의 β 값을 가짐)의 증가를 검출하는 단계; 및 (3) AD 치료에 효과적인 치료제를 결정하는 단계. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 표 1로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 표 3으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 표 4로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 (1) 전에, 투여 전 및 후의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 측정하는 일 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 투여 전 및 후에 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 또한 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 치료제가 단계 (3)에서 AD 치료에 효과적인 것으로 여겨지는 경우, 개체는 치료제의 투여에 의한 그의 치료를 계속할 것이고; 상기 치료제가 상기 단계 (3)에서 AD 치료에 효과적이지 않은 것으로 여겨되는 경우, 개체는 치료제의 투여에 의한 치료를 중단하고; 오히려, 개체는 다른 치료제의 투여에 의해 AD 치료를 개시할 것이다.

도 1. 12개 혈장 단백질을 활용한 모델 기반의 AD 위험성 예측. (a) HK Chinese AD 코호트에서 12개 단백질 (표 3 에 나열됨)의 혈장 수준을 기반으로 한 AD 예측 모델의 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic, ROC) 곡선. (b) 표현형별로 계층화된 AD 예측 점수의 분포(HK Chinese AD 코호트의 NC 및 AD 환자에 대해 각각 n = 71 및 101). 예측된 AD 위험 단계는 AD 예측 점수의 분포에 의해 정의된다(낮음: 0-0.25; 중등도: 0.25-0.79; 높음: 0.79-1.0).
도 2. 19개 혈장 단백질을 활용한 모델 기반의 AD 위험성 예측. (a) HK Chinese AD 코호트에서 19개 단백질 (표 4 에 나열됨)의 혈장 수준을 기반으로 한 AD 예측 모델의 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic, ROC) 곡선. (b) 표현형별로 계층화된 AD 예측 점수의 분포(HK Chinese AD 코호트의 NC 및 AD 환자에 대해 각각 n = 71 및 101). 예측된 AD 위험 단계는 AD 예측 점수의 분포에 의해 정의된다(낮음: 0-0.21; 중등도: 0.21-0.8; 높음: 0.8-1.0).
도 3. 혈장 Aβ _42/40 비율, 혈장 NfL 및 12개 혈장 단백질을 활용한 모델을 기반으로 한 AD 위험성 예측. (a) HK Chinese AD 코호트에서 혈장 Aβ_42/40 비율, 혈장 NfL 수준 및 12개 혈장 단백질(표 3 에 나열됨)의 혈장 수준을 기반으로 한 AD 예측 모델의 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic, ROC) 곡선. (b) 표현형별로 계층화된 AD 예측 점수의 분포(HK Chinese AD 코호트의 NC 및 AD 환자에 대해 각각 n = 71 및 101). 예측된 AD 위험 단계는 AD 예측 점수의 분포에 의해 정의된다(낮음: 0-0.2; 중등도: 0.2-0.8; 높음: 0.8-1.0).
도 4. 혈장 Aβ _42/40 비율, 혈장 NfL 및 19개 혈장 단백질을 활용한 모델을 기반으로 한 AD 위험성 예측. (a) HK Chinese AD 코호트에서 혈장 Aβ_42/40 비율, 혈장 NfL 수준 및 19개 혈장 단백질(표 4 에 나열됨)의 혈장 수준을 기반으로 한 AD 예측 모델의 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic, ROC) 곡선. (b) 표현형별로 계층화된 AD 예측 점수의 분포(HK Chinese AD 코호트의 NC 및 AD 환자에 대해 각각 n = 71 및 101). 예측된 AD 위험 단계는 AD 예측 점수의 분포에 의해 정의된다(낮음: 0-0.3; 중등도: 0.3-0.8; 높음: 0.8-1.0).

정의

"폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 세 가지 용어 모두 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.

본 개시에서 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 생검 및 부검 샘플과 같은 조직 절편, 조직학적 목적을 위해 취한 동결 절편, 또는 이러한 샘플의 가공된 형태를 포함한다. 생물학적 샘플에는 혈액 및 혈액 분획 또는 생성물(예: 전혈, 혈액의 무세포 분획(혈청, 혈장) 및 혈액 세포), 가래 또는 타액, 림프 및 혀 조직, 배양 세포, 예를 들어, 1차 배양, 외식편(explant) 및 형질전환된 세포, 대변, 소변, 위 생검 조직 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 전형적으로 진핵 유기체로부터 얻어지며, 이는 포유동물일 수 있고, 영장류일 수 있으며 인간 개체일 수 있다.

용어 "면역글로불린" 또는 "항체"(본원에서 상호 교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 기본 4-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 항원-결합 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 이황화 결합에 의해 안정화되고, 이는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 중쇄와 경쇄는 모두 영역(domain) 내로 접혀 있다.

용어 "항체"는 또한 항체의 항원- 및 에피토프-결합 단편, 예를 들어 면역학적 친화도 분석(immunological affinity assay)에 사용될 수 있는 Fab 단편을 지칭한다. 특성이 잘 규명된 다수의 항체 단편이 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역의 이황화 결합에 대한 항체의 C-말단을 분해하여, 이황화 결합에 의해 경쇄가 V_H-C_H1에 연결된 Fab의 이합체인 F(ab)'₂를생성한다. F(ab)'₂는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단하여 (Fab')₂ 이합체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(예를 들어, 다른 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명에 대해서는 Fundamental Immunology, Paul, ed., Raven Press, NY(1993) 참조). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해 측면에서 정의되지만, 당업자는 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 de novo 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 항체라는 용어는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 재조합 DNA 방법론을 사용하여 합성된 항체 단편을 포함한다.

단백질 또는 펩티드에 대한 특정 분자의 결합 관계를 설명하는 맥락에서 사용되는 경우 "특이적으로 결합하는" 이라는 어구는 단백질의 및 기타 생물제제(biologics)의 이종 집단에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 결합 분석 조건 하에서, 특정 결합제(예: 항체)는 배경보다 적어도 2배 이상 특정 단백질에 결합하고 샘플 내 존재하는 다른 단백질에 상당한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체의 특이적 결합은 특정 단백질 또는 단백질에 대한 특이성이 있지만 유사한 "자매(sister)" 단백질에 대해서는 선택성이 없도록 선택되는 항체를 필요로 한다. 특정 단백질 또는 특정 형태에 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 다양한 면역분석 형식을 사용할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석법은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다 (예를 들어, 면역분석 형식 및 특이적 면역반응성 결정에 사용될 수 있는 조건에 대한 설명은 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988) 참조). 전형적으로 특이적 또는 선택적 결합 반응은 적어도 배경 신호 또는 노이즈의 2배, 보다 전형적으로는 배경의 10 내지 100배 이상일 것이다. 한편, 또 다른 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 이중 가닥 복합체를 형성하는 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 맥락에서 사용될 때 용어 "특이적으로 결합하는"은 용어 "폴리뉴클레오티드 혼성화 방법"에 대한 정의에서 제공된 바와 같은 왓슨-크릭 염기-쌍 형성에 기초한 "폴리뉴클레오티드 혼성화"를 의미하는 것으로 기재한다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, "증가" 또는 "감소"는 비교 대조군, 예를 들어 확립된 표준 대조군(예를 들어, AD로 진단되지 않았거나 AD의 증가된 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서 발견되는 특정 단백질의 평균적인 수준/양) 으로부터 검출가능한 양(quantity)의 양성 또는 음성 변화를 지칭한다. 증가는 일반적으로 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 50% 또는 100%인 양성 변화이며, 대조군 값보다 적어도 2배 또는 적어도 5배 또는 심지어 10배만큼 높을 수 있다. 유사하게, 감소는 일반적으로 적어도 10% 또는 적어도 20%, 30% 또는 50%의 음성 변화이며, 또는 심지어 대조군 값보다 적어도 80% 또는 90%만큼 높다. "더 많은(more)", "더 적은(less)", "더 높은(higher)", 및 "더 낮은(lower)" 등의 비교 기준과의 양적 변화 또는 차이를 나타내는 다른 용어는 상기와 같이 동일한 방식으로 본 출원에서 사용된다. 대조적으로 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 변화가 없는"이라는 용어는 표준 대조군 값으로부터 양적 변화가 거의 또는 전혀 없음을 나타내며, 일반적으로 표준 대조군의 ±10% 이내, 또는 ±5%, 2% 이내 또는 더 적은 편차를 나타낸다.

"라벨", "검출가능한 라벨", 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 유용한 라벨은 ³²P, 형광 염료, 전자-밀도 시약, 효소(예: ELISA에서 일반적으로 사용됨), 비오틴, 디곡시게닌(digoxigenin), 또는 합텐, 및 예를 들어 단백질 내에 방사성 성분을 결합함으로써 검출될 수 있는 단백질 또는 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 검출하는 데 사용될 수 있는 단백질을 포함한다. 일반적으로 검출 가능한 라벨은 정의된 결합 특성을 갖는 프로브 또는 분자에 부착되며(예를 들어, 폴리펩티드 항원에 대한 알려진 결합 특이성을 갖는 항체), 프로브의 존재(및 따라서 그의 결합 표적)를 쉽게 검출가능하도록 한다.

본 출원에서 사용되는 용어 "양(amount)"은 샘플에 존재하는 관심 폴리펩티드와 같은 관심 물질의 양(quantity)을 의미한다. 그러한 양은 절대적인 용어, 즉 샘플 내 물질의 총량, 또는 상대적인 용어, 즉 샘플 내 물질의 농도로 표현될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "개체" 또는 "치료를 필요로 하는 개체"는 AD의 위험성(예를 들어, 가족력이 있는)으로 인해 치료를 찾거나 AD로 진단된 개인을 포함한다. 개체는 또한 치료 요법의 조작(manipulation)을 찾는 현재 치료를 받고 있는 개인을 포함한다. 치료를 필요로 하는 개체 또는 개인은 AD의 증상을 나타내거나 AD 또는 그 증상을 겪을 위험이 있는 개체 또는 개인을 포함한다. 예를 들어, 치료가 필요한 개체는 AD에 대한 유전적 소인 또는 가족력이 있는 개인, 과거에 관련 증상을 겪었던 개인, 유발 물질 또는 사건에 노출된 사람, 뿐만 아니라 상태의 만성 또는 급성 증상을 겪고 있는 개인을 포함한다. "치료를 필요로하는 개체"는 모든 연령대에 있을 수 있다.

표적 단백질의 "억제제", "활성화제(activator)" 및 "조절제(modulator)"는 각각 단백질 결합 또는 신호전달에 대한 in vitro 및 in vivo 분석을 사용하여 확인된 억제, 활성화 또는 조절 분자, 예를 들어 리간드, 작용제, 길항제, 및 이들의 상동체 및 모방체를 지칭하는데 사용된다. 용어 "조절제"는 억제제 및 활성화제를 포함한다. 억제제는, 예를 들어 표적 단백질의 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단, 감소, 방지, 활성화 지연, 불활성화, 둔감화 또는 하향 조절하는 활성제이다. 경우에 따라 상기 억제제는 중화 항체와 같은 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합한다. 본원에서 사용된 억제제는 불활성화제 및 길항제와 동의어이다. 활성화제는 예를 들어 표적 단백질의 활성을 자극, 증가, 촉진, 활성화 강화, 민감화 또는 상향 조절하는 활성제이다. 조절제는 천연-발생 리간드 및 합성-설계된 리간드, 항체 및 항체 단편, 길항제, 작용제, 탄수화물-함유 분자를 포함하는 소분자, siRNA, RNA 압타머 등의 변형을 포함하는 표적 단백질의 리간드 또는 결합 파트너를 포함한다.

본 출원에서 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 소정의 의학적 상태의 임의의 증상의 제거, 감소, 완화, 역전, 예방 및/또는 개시 또는 재발의 지연을 초래하는 행위를 기술한다. 다시 말해서 상태를 "치료하는 것"은 상태에 대한 치료 및 예방 개입을 모두 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 치료 효과를 생성하는 물질이 투여되는 양을 의미한다. 효과에는 질환/상태 및 관련 합병증의 증상 진행을 검출 가능한 정도로 예방, 교정 또는 억제하는 것을 포함한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라지며, 공지 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 및 Pickar, Dosage Calculations (1999)을 참조하여라).

본원에서 사용되는 용어 "표준 대조군"은 소정의 질환 또는 상태(예: 알츠하이머병)를 발병할 위험이 없거나 이를 겪지 않은 표준의 건강한 개체로부터 취한 이러한 유형의 샘플에 존재하는 이러한 분석물의 양 또는 농도를 나타내기 위한 소정의 양의 분석물을 포함하는 샘플을 지칭한다(예를 들어, 소정의 DNA/mRNA 또는 단백질). 값을 설명하는 맥락에서 사용되는 경우, 이 용어는 단순히 "표준 대조군" 샘플에 존재하는 이 분석물의 양 또는 농도를 나타내는 데 사용될 수도 있다.

용어 "평균"이 관련 질환 또는 장애(예: AD)를 앓지 않고 발병할 위험이 없는 건강한 개체를 기술하는 맥락에서 사용되는 경우, 상기 질환 또는 장애를 겪지 않고 발병할 위험이 없는 건강한 사람의 군으로부터 무작위로 선택된 대표적인 사람의 샘플 내의 관련 단백질의 수준과 같은 특정 특성을 지칭한다. 이 선택된 군은 충분한 수의 인간 개체를 포함하여 이들 개인 사이에서 관심 있는 분석물의 평균 양 또는 농도가 합리적인 정확도로 일반 건강한 사람들의 해당 프로필을 반영하도록 해야 한다. 선택적으로, 상기 선택된 개체의 군은 관련 질환 또는 장애의 징후 또는 위험성에 대해 테스트를 받는 사람의 배경과 유사한 배경, 예를 들어 일치하거나 비슷한 연령, 성별, 민족 및 병력 등을 갖도록 선택될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "억제하는" 또는 "억제"는 표적 생물학적 과정 또는 바이오마커(예: 단백질)의 수준에 대한 임의의 검출가능한 부정적인 효과를 지칭한다. 전형적으로, 억제는 이러한 억제가 존재하지 않는 대조군에 비해 생물학적 과정 또는 이의 다운스트림 효과를 나타내는 하나 이상의 파라미터 또는 바이오마커의 수준의 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%의 감소로 반영된다. 용어 "강화하는(enhancing)" 또는 "강화"는 양의 효과를 나타내는 것을 제외하고 유사한 방식으로 정의되며, 즉, 양성 변화는 대조군과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상이다. 용어 "억제제" 및 "강화제(enhancer)"이라는 용어는 각각 상기 기술된 바와 같은 억제 또는 강화 효과를 나타내는 활성제를 기술하기 위해 사용된다. 또한 본 개시내용에서 유사한 방식으로 사용되는 용어 "증가하다", "감소하다", "더 많이" 및 "더 적게"는 하나 이상의 소정의 파라미터의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상의 양성 변화, 또는 하나 이상의 소정의 파라미터의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80% 또는 심지어 그 이상의 음성 변화를 나타내는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "중국인(Chinese)"이라는 용어는 이들 및 이들의 조상이 일정 기간, 예를 들어 적어도 지난 3, 4, 5, 6, 7 또는 8세대 또는 지난 100년, 150년, 200년, 250년 또는 300년동안 본토 및 홍콩을 포함하는 중국의 역사적 영토에서 거주한 중국민족(ethnic Chinese people)을 지칭한다.

발명의 상세한 설명

I. 서설

알츠하이머병(AD)은 모든 치매 사례의 60-70%를 차지하는 세계에서 가장 흔한 형태의 치매 중 하나이다. 이는 돌이킬 수 없는 퇴행성 뇌 질환이며 노인 사망의 주요 원인이다. 이 질환의 특징은 세포외 β-아밀로이드(Aβ) 플라크 및 세포내 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)의 침착(deposition)이며, 이는 기억력, 추론, 판단 및 운동 능력 저하를 초래하며, 이의 증상은 시간이 지남에 따라 악화된다.

현재, 전 세계적으로 추정되는 3500만명이 AD를 앓고 있다. 이 수치는 기대수명 연장으로 인해 2050년까지 1억 명으로 크게 증가할 것으로 예상된다. AD에 대한 치료법은 없으며; 상기 질환의 병리생리학은 아직 상대적으로 알려지지 않았다. 미국 식품의약국(FDA)에서 AD 치료용으로 승인한 약물은 5가지뿐이며, 이들은 상태를 반전시키거나 더 이상의 악화를 예방할 수 없고 심각한 상태에서 효과가 없는 바, 질환의 병리를 변경하기보다는 증상을 완화할 뿐이다. 따라서 조기 진단 및 조기 치료 개입은 AD 관리에 중요하다. 연구에 따르면 AD는 기억 상실 또는 인지 저하의 실제 증상이 실제로 나타나기 오래 전에 뇌에 영향을 미친다는 사실이 확인되었다. 그러나, 현재까지, AD의 조기 발견을 위한 효과적이고 신뢰할 수 있는 진단 도구는 없으며; 주관적인 임상 평가를 포함하는 현재 사용 중인 표준 방법을 사용하여 환자가 AD로 진단될 때까지 병리학적 증상은 이미 진행 단계에 있다. 본 개시는 조기 진단을 돕기 위해 AD 위험성을 평가하기 위한 하나 이상의 단백질 마커를 활용하는 고성능 진단 방법을 제공한다.

II. 마커 단백질의 정량

A. 샘플 수득

본 발명을 실행하는 첫 번째 단계는 AD 발병 위험성을 평가하거나 AD 중증도 또는 진행을 모니터링하기 위해 시험되는 개체로부터 혈액 샘플을 수득하는 것이다. 동일한 유형의 샘플을 대조군(AD를 앓지 않고 증가된 AD 위험성이 없는 정상인) 및 시험군(예를 들어 AD 가능성 또는 증가된 AD 위험성에 대해 시험 중인개체) 모두로부터 취해야한다. 이러한 목적을 위해 일반적으로 병원이나 진료소에서 일상적으로 사용되는 표준 절차를 따른다.

개체의 마커 단백질의 존재/양의 검출 또는 AD 발병 위험성 평가 목적을 위해, 개별 환자의 혈액 샘플을 취하고, 적절한 마커 단백질의 혈청/혈장 또는 전혈 수준(예: 아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL, 또는 표 1-4에서 확인된 하나 이상의 단백질)을 측정한 다음 표준 대조군과 비교할 수 있다. 대조군 수준과 비교했을 때 이러한 마커 단백질중 하나 이상의 수준의 증가 또는 감소(표 1-4에 제공된 단백질의 β 값에 따라 다름)가 관찰되는 경우, 시험 개체는 AD를 갖거나 이후 상기 상태를 발병할 증가된 위험성을 갖는 것으로 여겨진다. AD 환자의 질환 진행 모니터링 또는 치료 효과 평가 목적을 위해, 개별 환자의 혈액 샘플을 다른 시점에서 취하여 개별 마커 단백질(들)의 수준을 측정하여 질환 상태를 나타내는 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 환자의 마커 단백질 수준이 시간이 지남에 따라 증가 또는 감소하는 일반적인 경향을 보이는 경우, 환자는 AD의 중증도가 개선되고 있거나 환자가 받고 있는 치료법이 효과적인 것으로 여겨진다 (표에 나타난 바와 같이 단백질 마커의 특정 β 값에 따라 다름). 환자의 마커 단백질 수준에 실질적인 변화가 없다는 것은 AD 상태에 변화가 없다는 것과 환자에게 제공된 치료가 비효율적이라는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 개인의 AD 위험성을 평가하거나 둘 이상의 개인 간의 상대적인 AD 위험성을 평가하기 위해 다중 마커 단백질 수준(예를 들어, 아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL, 또는 표 1-1에서 확인된 하나 이상의 단백질) 기반의 복합 위험 점수를 생성하기 위한 신규한 계산 방법을 고안하였다.

B. 단백질 검출을 위한 샘플 준비

개체의 혈액 샘플은 본 발명에 적합하고 주지된 방법 및 표준 의학 문헌에 기술된 바에 따라 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 적용에서, 혈청 또는 혈장 또는 전혈이 바람직한 샘플 유형일 수 있다. 다른 경우에는 전혈 샘플을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 AD에 대해 시험 또는 모니터링될 사람으로부터 혈액 샘플을 수득한다. 개인의 혈액 샘플 수집은 병원이나 진료소에서 일반적으로 따르는 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 적절한 양의 혈액을 채취하여 추가 준비 전에 표준 절차에 따라 보관할 수 있다.

본 발명에 따른 환자의 샘플에서 발견되는 마커 단백질(들)의 분석은 예를 들어, 혈청 또는 혈장 또는 전혈을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 추출/정량적 검출을 위한 환자 샘플을 준비하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

C. 마커 단백질의 수준 결정

아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL, 또는 표 1-4에서 확인된 어느 하나와 같은 어느 특정 정체(identity)의 단백질은 다양한 면역학적 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 항체로 시험 샘플로부터 단백질을 포착(capture)하여 샌드위치 분석을 수행할 수 있다. 이후 상기 단백질에 대한 특이적 결합 친화력을 갖는 라벨링된 항체로 상기 단백질을 검출할 수 있다. 이러한 면역학적 분석은 마이크로어레이 단백질 칩과 같은 미세유체 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 관심 단백질(예: 아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL 또는 표 1-4에서 확인된 하나 이상의 단백질)은 겔 전기영동(예: 2차원 겔 전기영동) 및 특정 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로도 검출할 수 있다. 대안적으로, 적절한 항체를 사용하여 주어진 단백질(예: 아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL, 또는 표 1-4에서 확인된 하나 이상의 단백질)을 검출하기 위해 표준 면역조직화학 기술을 사용할 수 있다. 단일클론 항체 및 다클론 항체(바람직한 결합 특이성을 갖는 항체 단편 포함) 모두 폴리펩티드의 특이적 검출에 사용될 수 있다. 특정 단백질(예: 아밀로이드 β 단백질 40, 아밀로이드 β 단백질 42, NfL, 또는 표 1-4에서 확인된 하나 이상의 단백질)에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 이러한 항체 및 이들의 결합 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서 마커 단백질(들)의 수준을 측정하기 위해 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 대량의 샘플 내에서도 표적 단백질을 신속하고 정확하게 정량하기 위한 질량 분석 기술 기반의 다양한 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring, MRM) 기술을 사용하는 삼중 사중극자(triple quadrupole) (triple Q) 기구, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행-시간 탠덤 질량 분석기(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometer, MALDI TOF/TOF), 선택적 이온 모니터링(selective ion monitoring, SIM) 모드를 사용하는 이온 트랩 기구 및 전자 분무 이온화(electrospray ionization , ESI) 기반 QTOP 질량 분석기와 같은 매우 정교화된 장비를 수반한다. 예를 들어, Pan et al., J Proteome Res. 2009 February; 8(2):787-797를 참조하여라.

III. 표준 대조군 확립

본 발명의 방법을 실시하기 위한 표준 대조군 확립을 위해, 통상적으로 정의된 바와 같이 AD가 없거나 증가된 AD 발병 위험이 없는 건강한 사람의 군을 먼저 선택한다. 이러한 개인은 적용 가능한 경우 본 발명의 방법을 사용하여 AD를 스크리닝 및/또는 모니터링하기 위한 적절한 매개변수 내에 있다. 선택적으로 개인은 시험 대상과 동일한 성별, 유사한 연령 또는 유사한 민족적 배경을 갖는다.

선택된 개인의 건강 상태는 개인의 일반적인 신체 검사 및 병력의 일반적인 검토를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 잘 정립되고 일상적으로 사용되는 방법에 의해 확인된다.

또한, 선택된 건강한 개인의 군은 그룹으로부터 얻은 혈청 또는 혈장 또는 전혈 샘플에서 마커 단백질(들)의 평균 양/농도가 AD 또는 AD의 증가된 위험이 없는 건강한 사람들의 일반적인 인구 중의 정상 또는 평균 수준의 대표적인 것으로 합리적으로 간주될 수 있도록 합리적인 크기여야 한다. 바람직하게는, 상기 선택된 군은 적어도 10, 20, 30 또는 50명의 인간 개체를 포함한다.

선택된 건강한 대조군의 각 개체에서 발견된 개별 값을 기반으로 마커 단백질(들)에 대한 평균값이 일단 확립되면, 이 평균 또는 중앙값 또는 대표 값 또는 프로파일은 표준 대조군으로 여겨진다. 동일한 과정에서 표준 편차 또한 결정된다. 경우에 따라 연령, 성별 또는 민족적 배경과 같은 뚜렷한 특성을 가진 별도로 정의된 군에 대해 별도의 표준 대조군을 설정할 수 있다.

IV. 모니터링 및 치료

관련된 양상에서, 본 발명은 또한 환자에서 AD 또는 이후 AD가 발병할 증가된 위험성 검출 시 AD 환자를 위한 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 개체를 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정 시, 상기 개체에게 치료, 예를 들어 아세틸콜린에스테라제 억제제(예: 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine)), 메만틴(memantine), 글루타메이트 수용체 차단제, 시탈로프람(citalopram), 플루옥세틴(fluoxetine), 파록세인(paroxeine), 세르트랄린(sertraline), 트라조돈(trazodone), 로라제팜(lorazepam), 옥사제팜(oxazepam), 아리피프라졸(aripiprazole), 클로자핀(clozapine), 할로페리돌(haloperidol), 올란자핀(olanzapine), 퀘티아핀(quetiapine), 리스페리돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 노르트립틸린(nortriptyline), 삼환성 항우울제(tricyclic antidepressants), 벤조디아제핀(benzodiazepine), 테마제팜(temazepam), 졸피뎀(zolpidem), 잘레플론(zaleplon), 클로랄 수화물, 코엔자임 Q10, 유비퀴논, 코랄 칼슘(coral calcium), 징코 빌로바(Ginkgo biloba), 후페르진 A(huperzine A), 오메가-3 지방산, 포스파티딜세린 또는 임의의 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.

일부 경우에, 상기 및 본원에 기술된 진단 방법 단계가, 선택적으로 추가적인 확인 정보를 제공하기 위해 수행되는 추가 진단 검사(예를 들어, 뇌 부피의 과도한 손실을 보여주기 위한 CT 스캔 또는 기타 영상화 기술을 통한 뇌 영상화를 통한)와 함께 완료되고, 환자가 이미 AD를 갖거나 이후 AD 발병 위험성이 현저히 증가한 것으로 결정되는 경우, 환자를 치료하거나, 진행 중인 증상을 관리/완화시키거나, 또는 질환의 향후 발병을 지연시키기 위해 의사 또는 기타 의학 전문가로부터 적절한 치료 또는 예방 요법이 지시될 수 있다. 미국 식품의약국(FDA)은 도네페질(Aricept™, 중등도의 중증을 포함한 모든 단계의 AD 치료에 승인된 유일한 콜린에스테라아제 억제제), 리바스티그민(Exelon™, 경증 내지 중등도의 AD 치료에 승인된 것), 갈란타민(Razadyne™, 경증 내지 중등도 환자) 및 메만틴(Namenda™)을 포함하는 수 개의 콜린에스테라제 억제제를 승인하였다. 도네페질은 중등도(moderate) 내지 중증(severe)을 포함하는 AD의 모든 단계를 치료하도록 승인된 유일한 콜린에스테라제 억제제이다. 하나 이상의 이러한 약물은 본 발명의 방법에 따라 AD로 진단된 환자를 치료하기 위해 처방될 수 있다. 또 다른 치료의 가능성은 현재 항우울제로 사용이 승인되었으며 AD 증상을 개선하는 효과적인 활성제로 보고된 트라조돈의 투여이다.

향후 AD 발병 위험이 높거나 증가한 것으로 여겨지지만 아직 어떠한 임상 증상도 나타내지 않는 환자의 경우, 특히 증가된 빈도로 지속적인 모니터링이 또한 적절하다. 예를 들어, 환자는 인지 능력의 가속된 변화를 검출하기 위해 더 빈번하게 예정된 정기 시험(예: 6개월에 한 번, 1년에 한 번, 또는 2년에 한 번)을 받을 수 있다. 이러한 정기적인 모니터링에 적합한 방법에는 GPCOG(General Practitioner Assessment of Cognition), Mini-Cog, AD8(Eight-item Informant Interview to Differentiate Aging and Dementia), 및 짧은 IQCODE(Informant Questionnaire on Cognitive Decline in the Elderly)를 포함한다. 또한 트라조돈을 사용한 예방적 치료가 권장될 수 있다.

V. 키트 및 장치

본 발명은 개체의 혈청/혈장 또는 전혈의 적절한 마커 단백질 수준을 평가하기 위해 본원에 기술된 방법을 실행하기 위한 조성물 및 키트를 제공하며, 질환의 진단을 받고 치료를 받은 환자의 상태를 위해 투여된 치료의 효능을 평가하는 것을 포함하는 환자 내의 AD의 존재 검출 또는 진단, 상태 발병의 위험성 결정, 및 상태의 진행 모니터링과 같은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.

마커 단백질 수준을 결정하기 위한 분석을 수행하기 위한 키트는 일반적으로 마커 단백질 아미노산 서열에 대한 특이적 결합에 유용한 적어도 하나의 항체를 포함한다. 선택적으로, 이 항체는 검출 가능한 모이어티로 라벨링된다. 항체는 단일클론항체 또는 다클론항체일 수 있다. 경우에 따라, 상기 키트에는 적어도 두 개의 서로 다른 항체가 포함될 수 있으며, 하나는 마커 단백질에 대한 특이적 결합을 위한 것(즉, 1차 항체)이고 다른 하나는 1차 항체 검출을 위한 것(즉, 2차 항체)이며, 이는 종종 검출가능한 모이어티에 부착된다.

전형적으로, 상기 키트는 또한 적절한 표준 대조군을 포함한다. 표준 대조군은 AD를 앓지 않거나 증가된 발병 위험이 없는 건강한 개체의 혈청 또는 혈장 또는 전혈에서의 마커 단백질(들)의 평균값을 나타낸다. 일부 경우에, 이러한 표준 대조군는 설정 값(set value)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 사용자가 시험 샘플을 분석하고 시험 대상의 AD의 존재 또는 위험성, 또는 질환 상태/진행을 평가하도록 안내하는 사용 설명서를 제공할 수 있다.

추가 양상에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법 단계의 전부 또는 일부를 수행할 수 있는 하나 이상의 이러한 장치를 포함하는 장치 또는 시스템으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 상기 장치 또는 시스템은 AD 검출, AD 발병 위험 평가, 또는 질환 상태/진행 평가를 위해 시험 중인 개체로부터 취한 혈청 또는 혈장 또는 전혈 샘플을 받은 경우 다음 단계를 수행한다: (a) 샘플 내 마커 단백질의 양 또는 농도를 결정하는 단계; (b) 양/농도를 표준 대조군 값과 비교하는 단계; 및 (c) 개체에 AD가 존재하는지, 또는 개체가 증가된 AD 발병 위험이 있는지, 또는 환자가 시험 중인 다른 환자에 비해 이후 AD 발병 위험이 더 높은지 여부를 나타내는 결과를 제공하는 단계. 다른 경우에, 본 발명의 장치 또는 시스템은 단계 (a)가 수행되고 (a)의 양 또는 농도가 장치에 입력된 후에 단계 (b) 및 (c)의 작업을 수행한다. 바람직하게는, 상기 장치 또는 시스템은 부분적으로 또는 완전히 자동화된다.

실시예

하기 실시예는 단지 예시의 방법으로 제공되는 것이며, 제한의 방법으로 제공되는 것은 아니다. 당업자는 본질적으로 동일하거나 유사한 결과를 산출하도록 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.

서설

알츠하이머병(AD)은 주로 65세 이상의 개인에게 영향을 미치는 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다. 이는 뇌의 시냅스 기능 장애 및 신경 손실을 동반하는 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크의 축적 및 타우 단백질의 신경섬유 매듭을 특징으로 한다. 질병 증상은 기억 상실, 추론 및 판단 장애, 및 이동 능력 감소를 포함한다. 전 세계적으로 약 4,700만 명이 이 질환을 겪고 있으며 이 수치는 2050년까지 1억 3,200만 명으로 증가할 것으로 예상된다. 그러나, 상기 질병에 대한 불완전한 이해 및 지연된 진단으로 인해 아직 치료법이 없는 바, AD는 전 세계적으로 공중 보건에 대한 가장 큰 위협 중 하나이다.

현재, AD 진단은 대부분 병력 검토, 표준화된 기억 테스트, 및 주관적인 것으로 논란이 되는 의사 전문 지식으로 제한된다. 뇌의 AD-관련 바이오마커인 Aβ 및 타우의 구조적 변화 및 존재를 검출하는 자기공명영상(MRI) 및 양전자방출단층촬영(PET) 등의 영상화 기법 및 Aβ, 타우 및 뉴로필라멘트 라이트 폴리펩티드(NfL)의 뇌척수액(CSF) 수준 측정을 위한 단백질체학 기술의 채택은 질환의 보다 정확한 진단 및 분류를 가능하게 한다. 그러나 MRI 및 PET의 높은 비용과 CSF 수집을 위한 요추 천자(lumbar puncture)의 침습적 특성으로 인해 일상적인 임상 검사가 불가능하며, 따라서 AD의 조기 진단을 위한 사용을 지연시킨다. 전 세계적으로 AD 사례가 증가함에 따라, 인구-규모에서 효율적인 AD 선별 및 환자 분류를 용이하게 하기 위한 덜 침습적이고 보다 비용-효율적인 진단 기술을 개발하는 것이 중요하다.

AD에 대한 혈액-기반 시험은 이러한 상황에서 이상적인 해결책이 될 것이다. 최근 조사에 따르면 AD 환자의 혈액에서 변경된 AD-관련 바이오마커 수준(Aβ_42/40 비율, 타우 및 NfL)은 질환 병리를 나타내며 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 바이오마커 중 어느 것도 충분한 진단 정확도를 가지 않아 임상 사용 가능성이 제한된다. 본질적인 이유 중 하나는 말초혈액계의 구성이 더 복잡하고 뇌뿐만 아니라 말초계, 면역계, 심혈관계, 대사계 등 다른 신체계(body system)의 영향을 받기 때문이다. 따라서, 기존의 AD-관련 바이오마커는 혈액에서 질환-관련 표현형 변화를 적절하게 포착할 수 없다. 실제로, 연구에 따르면 시토카인 및 혈관신생 단백질도 AD에서 변경된 혈장 수준을 가지며, 그 중 일부는 AD 병리학에 기여하는 것으로 실험적으로 검증되었다. 따라서, AD에 대한 정확하고 민감한 혈액-기반 진단 시험의 개발은 AD 혈장 특징을 완전히 포착하기 위해 보다 포괄적인 단백질체 연구를 필요로한다.

이 연구에서, 본 발명자들은 AD-관련 바이오마커(Aβ 및 NfL)의 혈장 수준을 측정하는 것 외에, Hong Kong Chinese AD 코호트의 180명의 노인으로부터 수집한 샘플에서 429개의 혈장 단백질 수준을 추가로 측정하였다. 이러한 AD-관련 단백질의 혈장 수준을 통합함으로써, 본 발명자들은 AD 환자를 정상 대조군(NC)과 상당한 정도로 구별하는 AD 예측 모델을 개발하였다. 이러한 발견은 종합적으로 AD 위험성을 평가하기 위한 고-성능 혈액-기반 전략을 제공한다.

재료 및 방법

Hong Kong Chinese AD 코호트 개체 모집: Specialist Outpatient Department of the Prince of Wales Hospital, the Chinese University of Hong Kong을 방문한 홍콩 중국인 참가자 코호트를 모집했다(AD 및 정상 대조군[ND]에 대해 각각 n = 106 및 74). 모든 참가자는 60세 이상이었다. AD의 임상적 진단은 American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-5)에 근거하여 확립되었다. 모든 참가자는 병력 평가, 인지 및 기능 평가를 위한 Montreal Cognitive Assessment (MoCA), MRI에 의한 신경영상 평가를 받았다. 연령, 성별, 교육, 병력, 심혈관 질환 병력, 뇌 영역 용량, 및 백혈구 수를 포함한 각 개인의 데이터가 기록되었다. 현저한 신경계 질환 또는 정신 장애가 있는 개인은 제외되었다. 이 연구는 Prince of Wales Hospital of the Chinese University of Hong Kong 및 Hong Kong University of Science and Technology의 승인을 받았다. 모든 참가자는 연구 참여 및 샘플 수집에 대해 서면 동의서를 제공했다.

혈액 샘플로부터 DNA 및 혈장 추출: K3EDTA 튜브(VACUETTE)를 사용하여 참가자로부터 전혈(3mL)을 수집했다. 혈액 샘플을 2,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠렛(pellet) 및 혈장을 분리했다. 상기 혈장을 수집하고, 분취(aliquiot)하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관했다. QIAsymphony SP platform (QIAGEN) 상 QIAsymphony DSP DNA Midi Kit (QIAGEN)를 사용한 게놈 DNA 추출을 위해 상기 세포 펠릿을 Centre for PanorOmic Science (Genomics and Bioinformatics Cores, University of Hong Kong, Hong Kong, China) 로 보냈다. 게놈 DNA는 물 또는 Elution Buffer ATE(QIAGEN)로 용리하고 4℃에서 보관했다. DNA 농도는 BioDrop μLITE+(BioDrop)로 측정했다.

혈장 단백질의 검출: 429개 단백질의 혈장 수준을 Cardiometabolic, Cardiovascular II, Cardiovascular III, Cell regulation, Development, Immune response, Inflammation, Metabolism, Neuro exploratory, Neurology, Oncology II, Oncology III, 및 Organ damage을 포함하는 Olink 바이오마커 패널로 측정했다. "ATN" 바이오마커(즉, Aβ_40/42, 타우 및 뉴로필라멘트 라이트 폴리펩티드 [NfL])의 혈장 수준을 Quanterix NF-light Simoa Assay Advantage Kit 및 Neurology 3-Plex A Kit로 측정했다.

전체-게놈 시퀀싱, 변이 추출(variant calling) 및 주성분 분석: 참여자의 DNA 샘플을 라이브러리 구성 및 WGS를 위해 Novogene에 제출했다. 샘플을 Illumina Hiseq X (평균 깊이: 5×) 상에서 시퀀싱하였다. 후보 변이체의 업스트림 및 다운스트림 500킬로베이스를 커버하는 게놈 영역을 GotCloud 파이프라인을 사용하여 분석하였다. VCF 파일에 저장된 유전자형 결과는 주성분 분석에 사용되었다. 상위 5개의 주요 구성 요소를 -pca header tabs, --maf 0.05, --hwe 0.00001, 및 --not-chr x y 파라미터를 사용하여 PLINK 소프트웨어를 통해 생성하였다.

혈장 단백질과 AD 간의 연관성 분석: GenABEL 패키지의 R rntransform 기능을 사용하여 등급을 기준으로 혈장 단백질 수준을 정규화하였다. AD에서의 혈장 단백질의 변경은 다음 선형 모델(β _i , 해당 요인에 대한 가중 계수; ε, 선형 방정식의 절편)을 사용하여 연령, 성별, 질환 이력, 및 인구 구조(즉, 상위 5개 주요 구성 요소)를 조정한 정규화된 단백질 수준 및 AD 표현형 간의 연관성을 기반으로 결정되었다.

AD 예측 점수 생성: 각각의 예측 모델에 대해, 해당 후보 단백질의 가중 계수 (β _i ) 및절편 (ε)은 후보 단백질의 혈장 수준 및 발견 코호트 참가자의 AD 표현형 정보를 다음 공식을 사용하는 로지스틱 회귀 모델에 넣어 생성하였다:

개별 AD 예측 점수는 다음 선형 모델을 사용하여 후보 단백질의 혈장 수준 및 해당 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)을 기반으로 계산하였다:

예측된 AD 위험 단계는 AD 예측 점수의 분포에 의해 정의되었으며, 저위험군, 중등도 위험군 및 고위험군으로 구분되었다.

예측 정확도(prediction accuracy)의 평가: R plot.roc 및 auc 함수를 사용하여 AD 위험성 예측을 위한 예측 모델의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 및 해당 곡선 아래 영역(areas under the curve, AUC)을 생성했다. 모델의 예측 정확도는 AUC 값으로 표시하였다.

통계 분석 및 데이터 시각화. 단백질 검출을 수행한 조사관은 인간 참가자의 표현형에 대해 보지 못했다. 인간 참가자의 후보 요소 간의 연관성의 유의성은 연령, 성별, 질환 이력, 및 인구 구조(즉, 전체-게놈 시퀀싱 데이터를 사용한 주성분 분석으로부터 수득한 상위 5개 주성분)를 조정한 선형 회귀 분석으로 평가하였다. 유의성 수준은 P < 0.05로 설정하였다. 다른 모든 통계 플롯은 GraphPad Prism version 8.0을 사용하여 생성하였다.

실시예 I: AD 위험성 평가에 있어 개별 혈장 단백질을 사용하는 모델

HK Chinese AD 코호트(n = 180)로부터 수집된 샘플에서 429개의 혈장 단백질(표 2)의 수준을 측정하였다. 이들 429개의 혈장 단백질은 모두 NC와 비교하여 AD에서 유의한 변화를 나타냈다(p<0.05; 표 2). 특히, 74개의 신규한 혈장 단백질이 AD에서 강한 변화를 보였다(표 1). AD 환자의 74개 또는 429개 혈장 단백질의 변경된 혈장 수준을 기반으로, 혈장 단백질 유래 정보를 사용하여 개인 간의 AD 위험성을 비교하기 위한 평가 도구가 개발되었다. 개인이 AD 혈액에서 상승된 단백질의 더 높은 혈장 수준을 갖거나(β > 0) 또는 AD 혈액에서 감소된 단백질의 더 낮은 혈장 수준을 갖는 경우(β < 0; 표 1, 2), 개인은 더 높은 AD 위험을 가질 것이다.

실시예 II: AD 위험 예측에 있어 12개 또는 19개의 혈장 단백질을 통합한 모델

12개 단백질(즉, CD164, CETN2, GAMT, GSAP, hK14, LGMN, NELL1, PRDX1, PRKCQ, TMSB10, VAMP5 및 VPS37A; 표 3)의 혈장 수준을 통합함으로써, 본 발명자들은 AD 위험을 정확하게 예측한 혼합 예측 모델을 개발하였다(AUC = 0.8916; 도 1a). 개인에게 AD 예측 점수를 할당하여 AD 위험 점수 시스템을 확립하였다. 결과 점수는 NC 및 AD 환자를 구별했다(표 5 및 도 1b). 예측된 점수를 기반으로, 질환 위험성을 예측하기 위해 세 가지 AD 위험 단계를 추가로 제안하였다. AD 예측 점수가 0.25 미만인 개인은 낮은 AD 위험성을 가질 것이다. 이에 비해, 0.25 내지 0.79 범위의 점수 또는 0.79보다 큰 점수를 가진 개인은 각각 AD에 대한 중등도 또는 높은 위험성을 가질 것이다.

7가지 혈장 단백질(즉, AOC3, CASP-3, CD8A, KLK4, LIF-R, LYN, 및 NFKBIE)의 혈장 수준을 12가지-단백질 모델(표 4)에 추가로 통합함으로써, 본 발명자들은 AD 위험성에 대한 예측을 더욱 개선한 혼합 예측 모델을 개발하였다 (AUC=0.9661; 도 2a). AD 예측 점수는 NC 및 AD 환자를 더 잘 구별하였다(표 6 및 도 2b). AD 예측 점수가 0.21 미만인 개인은 낮은 AD 위험성을 가질 것이다. 이에 비해, 0.21 내지 0.8 범위의 점수 또는 0.8보다 큰 점수를 가진 개인은 각각 AD에 대한 중등도 또는 높은 위험성을 가질 것이다.

실시예 III: AD 위험성 예측에 있어서 혈장 AN 바이오마커 및 12 또는 19가지 혈장 단백질의 결합 모델

혈장 Aβ_42/40 비율 및 혈장 NfL 수준(AN)을 12가지-단백질 또는 19가지-단백질 모델에 통합하여 결합 예측 모델을 개발하였다. 두 결합 모델 모두 AD 예측을 개선했다 (AN+12가지 단백질 및 AN+19가지 단백질에 대해 각각 AUC = 0.9456 및 0.9855; 도 3a, 4a). 또한 두 가지 결합 모델은 NC 및 AD 환자를 명확하게 구별하는 AD 예측 점수를 생성했다(표 7-8 및 도 3b, 4b). AN 및 12가지 단백질을 사용하는 모델의 경우, AD 예측 점수가 0.2 미만, 0.2-0.8 범위, 및 0.8보다 큰 개인은 각각 낮은, 중등도 및 높은 AD 위험성을 가질 것이다. AN 및 19가지 단백질을 사용하는 모델의 경우, AD 예측 점수가 0.3 미만, 0.3-0.8 범위, 및 0.8보다 큰 개인은 각각 낮은, 중등도 및 높은 AD 위험성을 가질 것이다. 종합적으로, 이러한 결과는 우리가 개발한 AD 위험성 예측 모델이 질환 병리에서 각 후보 혈장 단백질의 효과를 최대한 활용하고 AD 위험성 예측을 위한 고-성능 전략으로 작용할 수 있음을 나타낸다.

GenBank Accession Numbers 및 등가물을 포함하는 본 출원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 기타 간행물은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 포함된다.

참조

1. Alzheimer's Association. (2016). 2016 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia, 12(4), 459-509.

2. McKhann, G., Drachman, D., Folstein, M., Katzman, R., Price, D., & Stadlan, E. M. (1984). Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: Report of the NINCDS-ADRDA Work Group* under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease. Neurology, 34(7), 939-939.

3. Carrillo, Maria C., et al. "Revisiting the framework of the National Institute on Aging-Alzheimer's Association diagnostic criteria." Alzheimer's & Dementia 9.5 (2013): 594-601.

4. Prince, M. J. (2015). World Alzheimer Report 2015: the global impact of dementia: an analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International.

5. Jack Jr, C. R., Bennett, D. A., Blennow, K., Carrillo, M. C., Dunn, B., Haeberlein, S. B., ... & Liu, E. (2018). NIA-AA research framework: toward a biological definition of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia, 14(4), 535-562.

6. Nakamura, A., Kaneko, N., Villemagne, V. L., Kato, T., Doecke, J., Dorι, V., ... & Tomita, T. (2018). High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature, 554(7691), 249.

7. Preische, O., Schultz, S. A., Apel, A., Kuhle, J., Kaeser, S. A., Barro, C., ... & Vφglein, J. (2019). Serum neurofilament dynamics predicts neurodegeneration and clinical progression in presymptomatic Alzheimer's disease. Nature medicine, 25(2), 277-283.

8. Religa, P., Cao, R., Religa, D., Xue, Y., Bogdanovic, N., Westaway, D., ... & Cao, Y. (2013). VEGF significantly restores impaired memory behavior in Alzheimer's mice by improvement of vascular survival. Scientific reports, 3, 2053.

9. American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5®). (Washington, DC, 2013).

10. Pangman, Verna C., Jeff Sloan, and Lorna Guse. "An examination of psychometric properties of the mini-mental state examination and the standardized mini-mental state examination: implications for clinical practice." Applied Nursing Research 13.4 (2000): 209-213.

11. Zhou, Xiaopu, et al. "Non-coding variability at the APOE locus contributes to the Alzheimer's risk." Nature communications 10.1 (2019): 1-16.

Claims

개체에서 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD)의 위험성을 평가하는 방법으로서:
(1) 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 표 1-4로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 수준을 AD를 앓지 않거나 AD의 증가된 위험이 없는 평균적인 건강한 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서 발견되는 동일한 단백질의 표준 대조군 수준과 비교하는 단계;
(2) 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서의 단백질(표 1, 2, 3, 또는 4에서 양의 β 값을 가짐) 수준이 표준 대조군 수준으로부터 증가한 것을 검출하거나, 또는 상기 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서의 단백질(표 1, 2, 3, 또는 4에서 음의 β 값을 가짐) 수준이 표준 대조군 수준으로부터 감소한 것을 검출하는 단계; 및
(3) 상기 개체가 AD에 대한 증가된 위험을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 표 1에서 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질은 표 3에서 선택되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 단백질은 표 4에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1) 이전에, 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
두 개체에서 알츠하이머 병(AD)의 위험성을 평가하는 방법으로서:
(i) 제 1 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 표 1-4로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 수준을 제 2 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 동일한 단백질 수준과 비교하는 단계;
(ii) 제1 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질(표 1, 2, 3 또는 4에서 양의 β 값을 가짐) 수준보다 더 높은 제2 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질 수준을 검출하는 단계, 또는 제1 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질(표 1, 2, 3 또는 4에서 음의 β 값을 가짐) 수준보다 낮은 제2 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 검출하는 단계; 및
(iii) 제2 개체가 제1 개체보다 AD에 대한 위험성이 더 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 단백질은 표 1에서 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질은 표 3에서 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 단백질은 표 4에서 선택되는 것인 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (i) 이전에, 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법. .
개체에서 알츠하이머 병(AD)의 위험성을 평가하기 위한 키트로서, 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 표 2로부터 독립적으로 선택되는 어느 5, 10, 15, 또는 20개의 단백질 각각의 수준을 결정할 수 있는 시약을 포함하는 키트.
제13항에 있어서, 상기 단백질들은 표 1에서 선택되는 것인 키트.
제14항에 있어서, 상기 단백질들은 표 3에서 선택되는 것인 키트.
제15항에 있어서, 상기 단백질들은 표 4에서 선택되는 것인 키트.
제13항에 있어서, 아밀로이드 β 단백질 42, 아밀로이드 β 단백질 40, 및 뉴로필라멘트 라이트 폴리펩티드(neurofilament light polypeptide, NfL) 각각의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 결정할 수 있는 시약을 추가로 포함하는 키트.
제13항에 있어서, AD를 앓지 않거나 AD에 대한 증가된 위험성이 없는 평균적인 건강한 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈에서 발견되는 동일한 단백질의 수준을 반영하는 각각의 단백질에 대한 표준 대조군을 추가로 포함하는 키트.
개체의 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD)에 대한 위험성을 평가하기 위한 검출 칩으로서, 고체 기질 및 표 2로부터 독립적으로 선택된 어느 5개, 10개, 15개 또는 20개의 단백질 각각의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 결정할 수 있는 시약을 포함하며, 상기 각 시약은 상기 기질의 확인 가능한(addressable) 위치에 고정되어 있는 것인, 검출 칩.
제19항에 있어서, 상기 단백질들은 표 1에서 선택되는 것인 칩.
제20항에 있어서, 상기 단백질들은 표 3에서 선택되는 것인 칩.
제21항에 있어서, 상기 단백질들은 표 4에서 선택되는 것인 칩.
개체에서 알츠하이머 병(AD)의 위험성을 평가하는 방법으로서:
(1) 일 세트의 값을 다음 공식에 넣어 예측 점수를 계산하는 단계:

및
(2) 0 내지 0.25 ± 0.05의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 낮은 것으로 결정하고, 0.25 ± 0.05 초과 내지 0.80 ± 0.01의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 중등도 (moderate)인 것으로 결정하고, 및 0.80 ± 0.01 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체를 AD 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하고,
상기 일 세트의 값은 상기 표 3에 제시된 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하고, 상기 단백질의 가중 계수(weighted coefficient, β _i ) 및 절편(ε)은 표 5-8에 제시되어 있는 것인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 세트의 값은 표 3의 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되고, 상기 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 5에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.25의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험성을 갖고; 0.25 초과 내지 0.79의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험성을 갖고; 0.79 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험성을 갖는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 세트의 값은 표 4의 19개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되고, 상기 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 6에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.21의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험성을 갖고; 0.21 초과 내지 0.8의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험성을 갖고; 0.8 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험성을 갖는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 3의 12개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 7에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.20의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험성을 갖고; 0.20 초과 내지 0.80의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험성을 갖고; 0.80 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험성을 갖는 것인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 4의 19개 단백질 각각의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준으로 구성되며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i ) 및 절편(ε)은 표 8에 제시되어 있으며, 여기서 0 내지 0.30의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 낮은 위험성을 갖고; 0.30 초과 내지 0.80의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 중등도의 위험성을 갖고; 0.80 초과 내지 1의 점수를 갖는 개체는 AD에 대한 높은 위험성을 갖는 것인, 방법.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1) 이전에, 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
두 개체 중에서 알츠하이머 병(AD)의 위험성을 평가하는 방법으로서:
(i) 일 세트의 값을 다음 공식에 넣어 두 개체에 대한 예측 점수를 계산하는 단계:

및
(ii) 더 높은 점수를 갖는 개체를 다른 개체보다 AD에 대한 위험성이 더 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하며,
상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 및 표 2에 제시된 단백질 중 적어도 하나의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 2, 3, 4, 및 9에 제시되어 있는 것인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 2에 제시된 단백질의 임의의 조합의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 2, 3, 4 및 9에 제시되어 있는 것인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4에 제시된 단백질 중 적어도 하나의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있는 것인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4로부터 독립적으로 선택되는 단백질 중 적어도 5개의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있는 것인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 세트의 값은 아밀로이드 β 단백질 42 및 아밀로이드 β 단백질 40의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준의 비율, NfL의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준, 표 1, 3, 또는 4로부터 독립적으로 선택되는 단백질 중 적어도 10개의 단백질의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 포함하며, 이에 상응하는 가중 계수(β _i )는 표 1, 3, 4 및 9에 제시되어 있는 것인, 방법.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (i) 이전에, 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
개체의 알츠하이머 병(AD)을 치료하기 위한 치료제의 효능을 평가하는 방법으로서:
(1) 개체에게 치료제를 투여하기 전 및 후의 표 1-4에서 선택되는 어느 하나의 단백질의 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 수준을 비교하는 단계;
(2) 치료제 투여 후에 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈 단백질 수준(표 1, 2, 3 또는 4에서 양의 β 값을 가짐)의 감소 또는 개체의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준(표 1, 2, 3 또는 4에서 음의 β 값을 가짐)의 증가를 검출하는 단계; 및
(3) 상기 치료제를 AD 치료에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 단백질은 표 1에서 선택되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 단백질은 표 3에서 선택되는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 단백질은 표 4에서 선택되는 것인 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1) 이전에, 투여 전 및 후의 혈장 또는 혈청 또는 전혈의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 측정 단계 이전에, 상기 개체로부터 투여 전 및 후에 혈장 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 및 제23항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 중국 후손인 것인 방법.