MX2014012306A - Biomarcadores salivales especificos para deteccion de riesgo, diagnostico temprano, pronostico y vigilancia de las enfermedades de alzheimer y de parkinson. - Google Patents

Abstract

Métodos mediante los cuales los biomarcadores específicos en saliva son utilizados para la detección de riesgo, diagnóstico temprano, pronóstico y vigilancia de las enfermedades de Alzheimer y Parkinson.

Description

BIOMARCADORES SALIVALES ESPECÍFICOS PARA DETECCIÓN DE RIESGO. DIAGNÓSTICO TEMPRANO. PRONÓSTICO Y VIGILANCIA DE LAS ENFERMEDADES DE ALZHEIMER Y DE PARKINSON REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud de Patente co-pendiente de la india No. 1138/DEL/2012, presentada el 13 abril de 2012, incorporada en la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es el uso de biomarcadores salivales para la detección de riesgo, diagnóstico temprano, pronóstico y vigilancia de las enfermedades de Alzheimer y Parkinson según uno de varios enfoques teenológicos, incluyendo, pero no limitado a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima [ELISA], inmunoensayos homogéneos, dispositivos de punto de cuidado, ensayos múltiples, tecnologías de biosensor, espectrometría de masa y otros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en ingles) es un trastorno progresivo neurodegenerativo en el que la neuro-degeneración comienza décadas antes de que aparezcan los síntomas clínicos (DeKosky ST, Marek K: “Looking Backward to Move Forward: Early Detection of Neurodegenerative Disorders,” Science (2003) 302 (5646): 830-834). La AD es la causa más común de demencia en las personas mayores, totalizando 50-60% de todos los casos (Blennow K, de León MJ, Zetterberg H: “Alzheimer's Disease”: Lancet (2006); 368 (9533): 387-403.). El riesgo en la vida para AD entre las edades de 65 y 100 es 33% para hombres y 45% para mujeres, con un aumento anual de 1-2% en la 7a década a casi 60% en la 10a década. La AD es muy común y así es un problema principal de salud pública (Ferri CP, Prince M, Brayne C, et al. “Global Prevalence of Dementia: A Delphi Consensus Study”. Lancet (2005) 366 (9503): 2112-2117).

Enfermedad de Alzheimer Internacional (ADI) estima que hay globalmente actualmente 30 millones de personas viviendo con demencia, con 4.6 millones de nuevos casos reportados anualmente (un nuevo caso cada 7 segundos). La estadística indica que el número de personas afectadas alcanzará más de 100 millones para 2050 (Ferri CP, Prince M, Brayne C, Brodaty H, Fratiglioni L, Ganguli M et al, “Global Prevalence of Dementia: a Delphi Consensus Study”, Lancet (2005) 17; 366: 2112-7). El envejecimiento demográfico procede rápidamente en China, India y América Latina y se estima que el número de personas ancianas en los países en desarrollo aumentará 200% en comparación con un aumento estimado mucho menor de 68% en los países desarrollados en los 30 años hasta 2020 (WHO report: Global Burden of Disease (GBD) 2010). Desafortunadamente, en los Estados Unidos, Medicare y la mayoría de las compañías privadas de seguros de salud no cubren el cuidado a largo plazo necesitado por las víctimas de esta enfermedad debilitante.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso central asociado con la pérdida progresiva de la memoria teniendo como resultado finalmente en la demencia. Se observan dos características patológicas en los pacientes con AD en la autopsia: placas extracelulares y enredos intracelulares en el hipocampo, corteza cerebral, y otras áreas del cerebro esenciales para la función cognitiva (vea Wostyn P, Audenaert K, De Dcyn PP; “Choroidal Proteins Involved in Cerebrospinal Fluid Production may be Potential Drug Targets for Alzheimer's Disease Therapy,” Perspectives in Medicinal Chemistry; 5:11-7; (2011); Sun X, Bhadelia R, Liebson E, Bergethon P, Folstein M, Zhu JJ, Mwamburi DM, Patz S, Qiu WQ; “The Relationship Between Plasma Amyloid-b Peptides and the Medial Temporal Lobe in the Homebound Elderly”, Int. J. Geriatric Psychiatry 26 (6): 593-601 (2011).

Los síntomas de la AD se manifiestan lentamente y los signos iniciales sólo pueden ser la falta moderada de la memoria. En esta etapa temprana, los individuos tienden a olvidar acontecimientos recientes, actividades, los nombres de personas o cosas familiares y no quizá no puedan resolver problemas matemáticos sencillos. A medida que la enfermedad progresa en las etapas moderadas de la AD, los síntomas son más fácilmente detectados y se vuelven suficientemente graves como para causar que las personas con AD o sus familiares busquen asistencia medica. Los síntomas de la etapa moderada de la AD incluyen la incapacidad de realizar tareas sencillas tales como arreglarse, y como problemas en el habla, en la comprensión, en la lectura, y en la escritura. Los de AD en etapa grave pueden volverse ansiosos o agresivos, pueden vagar lejos de casa y finalmente necesitarán un cuidado total. La única prueba de diagnóstico definitiva para el AD se basa en el análisis de tejido cerebral disponible sólo en la autopsia después de la muerte del paciente. Recientemente, se han introducido nuevas téenicas incluyendo los métodos "multi-modales" que combinan el uso de técnicas de formación de imágenes (por ejemplo escáner de PET, escáner de CT o IRM, por ejemplo) con el detección de varios biomarcadores en el líquido cefalorraquídeo [CSF], pero estos métodos son sumamente invasivos, caros y hasta ahora no han demostrado ser confiables en términos de la sensibilidad y la especificidad para detectar el AD de manera exacta.

Una prueba de diagnóstico sencilla, económica y no invasiva que puede ser realizada mientras el paciente está vivo, no depende del uso del líquido cefalorraquídeo, la remoción de un espécimen de biopsia, ni del uso de técnicas caras e poco confiables de formación de imágenes, sería muy valioso para identificar el AD tempranamente, así como para proporcionar información útil de pronóstico. Además, si tal herramienta pudiera ser utilizada para vigilar el avance de la enfermedad para los pacientes tratados con una de varias intervenciones terapeuticas actualmente en desarrollo por varias compañías farmacéuticas incluyendo Pfizer, Genentech, Medivation, Eli Lilly, Aphios y otros, la teenología sería más atractiva. Además, el desarrollo de una prueba de diagnóstico no invasivo utilizando saliva como el espécimen de elección, expandiría oportunidades para probar en poblaciones de difícil acceso y facilitar el diagnóstico en los consultorios médicos, clínicas satélite, facilidades de paciente externo y otras instalaciones de pruebas no tradicionales y reducirían los costos generales del cuidado de los enfermos de AD y del sistema de asistencia sanitaria en general. Además, si tal tecnología tuvo la capacidad de proporcionar información de diagnóstico exacta en pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson además de la AD, la tecnología sería todavía más atractiva. En la presente se demuestra que la tecnología descrita en este documento cumple estos criterios.

A pesar de los avances inmensos en la genómica en las últimas dos décadas que ha visto la formación de un enorme número de bases de datos de microarreglos, los procedimientos de análisis de datos y los protocolos generados, la proteómica de la enfermedad de Alzheimer está todavía en su infancia (Heese, K. et al. (2000); “Induction of Rat L-Phosphoserine Phosphatase by Amyloid-b (1-42) is Inhibited by Interleukin- 11,” Neuroscience Letters 288 (1): 37-40; Huberman, M. et al. (1994) “Correlation of Cytokine Secretion by Mononuclear Cells of Alzheimer Patients and Their Disease Stage” J. Neuroimmunology 52 (2): 147-152; Robakis, N.K. et al. (1991)‘Expression of the Alzheimer's Amyloid Precursor in Brain Tissue and Effects of NGF and EGF on its Metabolism” Clinical Neuropharmacology 14 (Supplement 1): S15-S23; Xia, M. et al. (1998)‘Immunohistochemical Study of the b-Chemokine Receptors CCR3 and CCR5 and Their Ligands in Normal and Alzheimer's Disease Brains” American. J. 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Varias patentes y solicitudes de patente de EEUU han sido publicadas con respecto a los metodos para el diagnóstico de la AD, incluyendo las Patentes de EEUU Números 4,728,605, 5,874,312, 6,027,896, 6,114,133, 6,130,048, 6,210,895, 6,358,681, 6,451,547, 6,461,831, 6,465,195, 6,475,161, y 6,495,335, y las Solicitudes de Patente de EEUU Números de Serie 11/580,405, 11/148,595, y 10/993,813.

Además, las siguientes patentes y solicitudes ofrecen antecedentes y téenica previa en esta área: La Patente de EEUU 7,794,948 enseña biomarcadores a base de proteínas y combinaciones de biomarcadores que son útiles para calificar el estado de la enfermedad de Alzheimer (AD) en un paciente. Ciertos biomarcadores de la invención tambien pueden ser adecuados para el despliegue como ligandos radio-marcados en téenicas no invasivas de formación de imagen tal como la Tomografía de Emisión de Positrón (PET).

La solicitud de patente de EEUU 20080261226 enseña biomarcadores y métodos de diagnóstico que apoyan los presentes biomarcadores con base en la detección de genes específicos que tienen una diferencia de dos veces o más grande en la expresión de genes en la médula espinal de un modelo pre-sintomático de ratón para la esclerosis lateral amiotrófica [ALS] Tales biomarcadores y métodos de diagnóstico son útiles para la detección temprana de lesión de la célula neural y la muerte en la enfermedad aguda y degenerativa. Aunque esta patente es útil para esta aplicación específica, la patente no definió biomarcadores específicos para la AD e implica además procedimientos invasivos, especialmente el análisis de la célula neural y no utiliza muestras no invasivas de saliva.

La solicitud de patente de EEUU 20090263829 enseña biomarcadores para la AD, un método para detectar la AD, un método de vigilancia de la AD, y de un kit para cuantificar biomarcadores para la AD; sin embargo esta patente se basa en biomarcadores de amplio espectro, recolectados en un modo invasivo, utilizando especímenes de líquido cefalorraquídeo, que son también sumamente caros de recolectar y analizar.

La patente de EEUU 7,851,172 enseña un método para cuantificar un trastorno neurodegenerativo en un paciente que incluye obtener una muestra de fluido del sujeto, midiendo un complejo de biomarcador de proteína en dicha muestra de fluido y correlacionar la medición con el deterioro cognitivo moderado o el estado de la enfermedad de Alzheimer. Los biomarcadores incluyen esos que comprenden por lo menos una de una proteína transtiretina y / o una proteína de prostaglandin-H2 D-isomerasa, y por lo menos una segunda proteína, diferente, seleccionada de una lista que comprende transtiretina, prostaglandin-H2 D-isomerasa, beta-2-microglobulina, cistatina C, superóxido dismutasa [Cu— Zn], proteína de unión a retinol de plasma, proteína de unión a fosfatidiletanolamina, anhidrasa carbónica 2, prostaglandin-H2 D- isomerasa, y / o proteína serotransferrina. Otra vez esta patente integra el uso de biomarcadores de amplio espectro e invasivos medidos en especímenes de líquido cefalorraquídeo [CSF], lo que es un procedimiento carísimo e invasivo.

La solicitud de patente de EEUU 20090226897 enseña el uso de biomarcadores a base de proteína y combinaciones de biomarcadores en el líquido cefalorraquídeo [CSF] que son útiles para calificar el estado de la enfermedad de Alzheimer en un paciente. Los biomarcadores pueden ser detectados por espectrometría de masa SELDI, una téenica cara y técnicamente difícil que requiere instrumentación sumamente cara. La técnica no es ni sencilla ni no invasiva.

La solicitud de patente de EEUU 20100167937 enseña la identificación y el uso de biomarcadores de suero para la enfermedad neurodegenerativa, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, y las enfermedades relacionadas. Más específicamente, esta invención se relaciona a la identificación de biomarcadores de proteína útiles para la investigación, para el diagnóstico, y para la diferenciación de la enfermedad de Alzheimer de la enfermedad de Parkinson, otras enfermedades neurodegenerativas, y controles normales, y en la vigilancia de la gravedad de la enfermedad de Alzheimer y los mecanismos de la enfermedad en los pacientes. El uso de biomarcadores bajo esta solicitud de patente enseña sólo el uso de especímenes invasivos incluyendo suero, pero no saliva.

La solicitud de patente de EEUU 20090061457 enseña el uso de la proteína Apolipoproteína E3 como un biomarcador para la enfermedad neurodegenerativa, incluyendo la enfermedad de Parkinson, y otras enfermedades relacionadas. Más específicamente, esta invención se relaciona a la aplicación de la proteína Apolipoproteína E3 como una herramienta para la investigación, el diagnóstico, y la diferenciación de la enfermedad de Parkinson de la enfermedad de Alzheimer, de otras enfermedades neurodegenerativas, y de controles normales. En este caso, otra vez, se sugieren sólo especímenes invasivos incluyendo suero.

La Patente de EEUU 7,598,049 enseña una colección de biomarcadores proteinaceos de suero ("biomarcadores de AD”), que puede ser medida en muestras de fluido biológico periférico como un auxiliar en el diagnóstico de los trastornos neurodegenerativos, particularmente la enfermedad de Alzheimer y deterioro cognitivo leve (MCI). La invención proporciona además los metodos para identificar agentes candidatos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer probando agentes prospectivos para la actividad en la modulación de los niveles de biomarcador de AD. Sin embargo, la patente se basa en la recolección de especímenes invasivos y no enseña el uso de muestras no invasivas [saliva].

La Patente de EEUU 7,833,513 enseña el diagnóstico de AD al determinar el nivel o la función de la insulina, los factores de crecimiento de tipo insulina, sus receptores y/o sus moléculas de señalización corriente abajo. La invención se relaciona además a métodos para el tratamiento de AD administrando un agonista de insulina y un agonista del factor de crecimiento de tipo insulina. La invención proporciona adicionalmente un modelo animal de AD y métodos de investigación para agentes útiles en el tratamiento, en la mejora, o en la prevención de AD. En este caso, la patente se basa sólo en la detección de biomarcadores de secciones histopatológicas. Esto requiere que se recolecte primero un espécimen invasivo de biopsia del paciente y que se evalúe por patólogos sumamente adiestrados, antes del diagnóstico de la enfermedad.

La patente de EEUU 7,718,394 enseña la aplicación de la encefalotoxina producida por fagocitos mononucleares activados, presentes en individuos que tienen enfermedad neurológica incluyendo enfermedades neurodegenerativas y neuro-inflamatorias, tales como la enfermedad de Alzheimer (AD), demencia asociada con HIV-1 (HAD), la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, deterioro cognoscitivo leve, enfermedad de prion, disfunción cognoscitiva/motriz menor, accidente cerebro-vascular agudo, trauma agudo, o neuro-SIDA. La detección bioquímica de la encefalotoxina según los metodos de la invención permitirá el diagnóstico de la enfermedad neurológica en etapas tempranas y pre-sintomáticas, permitiendo así la intervención temprana en la progresión de la enfermedad así como la identificación de sujetos o poblaciones en riesgo para desarrollar la enfermedad neurodegenerativa. Los métodos de la invención también proporcionan un mecanismo para vigilar la progresión y tratamiento de la enfermedad neurológica. Esta patente, de nuevo, utiliza sólo muestreo costoso e invasivo de biomarcador de líquido cefalorraquídeo [CSF] En la Patente de EEUU 7,897,361 se proporcionan métodos y composiciones que se relacionan a la enfermedad de Alzheimer. Específicamente, se proporcionan las proteínas que son expresadas diferencialmente en el estado de enfermedad de Alzheimer con respecto a su expresión en el estado normal. Se identifican y describen las proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer. También se proporcionan métodos de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer utilizando proteínas diferencialmente expresadas. La evaluación adicional indica que esta patente también se basa en el uso de detección de biomarcador invasivo de suero/plasma.

A pesar de los avances inmensos en la genómica mencionada antes que ha tenido como resultado las bases de datos completas de microarreglos, los procedimientos y protocolos de análisis de datos, la proteómica de la AD todavía es un campo inmaduro de investigación. Actualmente, no hay biomarcadores válidos identificados en muestras de pacientes (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, orina, etc.) que puedan ser utilizados para diagnosticar específicamente, para estratificar, o para vigilar la progresión o el retroceso de la AD u de otras formas de demencia (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), la demencia por múltiples infartos, etc.). En las pasadas dos decadas, cientos de biomarcadores novedosos de AD han sido descubiertos, pero los resultados de numerosos esfuerzos de investigación todavía no han cambiado la práctica clínica en una manera significativa, porque la inmensa mayoría de biomarcadores descubiertos no ha sido validada. La literatura apoya el hecho de que muy pocos estudios están disponibles acerca de biomarcadores salivales para la AD y PD y ningún marcador salival específico ha sido caracterizado ni validado para la AD y PD.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En esta patente, las palabras: "Evaluar", "determinar", "discriminar" y "establecer" son utilizadas para el diagnóstico y estas palabras son intercambiables. "Sano normal" se refiere a un valor de cero en la escala de evaluación clínica para la demencia [CRS] establecida por McKhann et al. (McKhann G, Drachman D, Folstein M, Katzman R, Price D, Stadlan E.

“Clinical Diagnosis of Alzheimer’s Disease: Report of the NINCDS-ADRDA Work Group Under the Auspices of the Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s Disease. Neurology.1984; 34: 939-944) también teniendo otros datos bioquímicos (biomarcadores salivales y otros datos) de estos sujetos que son considerados como normales.

Los inventores han descubierto conjuntos o grupos de marcadores bioquímicos presentes en la saliva de individuos, que están alterados en individuos con la enfermedad de Alzheimer (AD). Por consiguiente, estos conjuntos de biomarcadores (diagnóstico, pronóstico, biomarcadores de detección de riesgo, de AD) pueden ser utilizados para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de la AD, el pronóstico de la AD, el riesgo de la AD y/o para medir la progresión de la AD en pacientes confirmados con AD. La invención proporciona los métodos para el diagnóstico de la AD o para ayudar en el diagnóstico de la AD, el pronóstico de la AD y el riesgo de la AD en un individuo midiendo cuantitativamente la cantidad de cada uno de una serie de biomarcadores de diagnóstico individual de AD en muestras de saliva. Además, esta invención describe un medio para la cuantificación de múltiples biomarcadores, que, cuando son medidos en combinación son indicadores fuertes para el diagnóstico de la AD, pronóstico de la AD, detección temprana de la AD y riesgo de la AD en el individuo. Además, esta patente identifica los subconjuntos optimizados de biomarcadores que, cuando se usan conjuntamente, son sumamente sensibles y específicos para la AD. El método descrito en la presente es una evaluación/clasificación de factores de riesgo cardíaco no invasiva y libre de dolor, como indicadores de enfermedad neurológica que utiliza saliva como un fluido de diagnóstico, que, cuando se usa conjuntamente con teenologías de plataforma de ensayo inmunológico, tal como, por ejemplo el sistema de Prueba Rápido de Saliva VerOFy® de Oasis Diagnostics® Corporation [Patentes de EEUU Números 7,618,591 y 7,927,548] introducen la posibilidad de una prueba realizada en una clínica, consultorio medico o el hogar para la enfermedad de Alzheimer. Tal prueba puede basarse en una de una serie de tecnologías de prueba rápida disponibles comercialmente, semejantes en naturaleza a la tecnología de VerOFy®, y puede, o no puede necesitar un dispositivo lectura de sujeción manual para leer y cuantificar los niveles de los diversos biomarcadores en especímenes de saliva de los pacientes. Las tecnologías de detección disponibles para aplicaciones de punto de cuidado incluyen entre otros, inmunocromatografía lateral de flujo, aglutinación de látex, la tecnología de biosensor que utiliza fluorescencia, quimioluminiscencia, tecnologías a base de perlas magnéticas y otras así como las tecnologías alternas recientes incluyendo la nanotecnología, los biosensores y las metodologías de laboratorio en un circuito integrado. La incorporación de la tecnología de biomarcador salival descrita en la presente con el dispositivo de la plataforma de VerOFy®, u otras tecnologías semejantes, permitirán obtener resultados inmediatos a través del diagnóstico en el punto de cuidado en una manera efectiva en costo sin equipo o instrumentación sofisticados. Tal innovación tendrá como resultado una reducción significativa en los costos de asistencia médica asociados con el diagnóstico de la AD.

Los métodos descritos en la presente también pueden ser asociados con otras teenologías realizadas en el laboratorio para diagnosticar la AD de manera no invasiva. Tales tecnologías pudieran incluir el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima [ELISA], inmunoensayos homogéneos, quimioluminiscencia, espectrometría de masa y muchas otras.

Como parte de esta invención, los inventores también han desarrollado un método mediante el cual los biomarcadores salivales de AD y otros, sin limitación, son asignados a un índice Salival de AD, que puede ser utilizado para describir la capacidad del biomarcador (o la combinación de biomarcadores) para distinguir entre individuos sanos y con AD (como un ejemplo). El índice Salival del AD es un reflejo de la sensibilidad, de la especificidad, y de la exactitud general de los biomarcadores salivales para detectar la enfermedad. La invención presente proporciona un método para el diagnóstico, el pronóstico, la detección del riesgo para la enfermedad de Alzheimer (AD), que comprende una comparación de un nivel medido de un número de diferentes biomarcadores de AD en una muestra de saliva de un individuo que busca un diagnóstico para AD en comparación con un nivel de referencia para cada biomarcador, en donde los diferentes biomarcadores de AD comprenden: cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1 , mieloperoxidasa, IL-4, y / o IL-5; péptido natiurético de tipo B [BNP], I L- 1 a , IL-13, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a, IFN-g, cTnl, VEGF, insulina, GLP-1 (activa), GLP- 1 (total), TREMI, leucotrieno E4, Akt1, Ab-40, Ab-42, ligando Fas, o PSA, G-CSF, MIP-1a, IL-22, , IL-21, IL-15, IL-7, GM-CSF, IL-2, IL-12IL-17a, IL-Ib, MCP, IL-32 o RANTES, sVCAM-1, slCAM-1, apolipoproteínas A1, D y E, albúmina modificada por isquemia (IMA), fibronectina, mieloperoxidasa (MPO), s. alfa-amilasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa, actividad de factor de tejido, MCP-1, sCD-40, factor de crecimiento del tipo insulina I (IGF-I) y IGF-II.

En algunas modalidades, el metodo comprende comparar el valor medido a un valor de referencia para cada biomarcador de diagnóstico de AD medido y también puede comprender calcular el número de diferencias de número de veces [es decir, 2 veces, 3 veces, etc.] entre el valor medido y el valor de referencia. En otras modalidades, el método comprende comparar el número de veces de la diferencia para cada biomarcador de AD medido con un valor mínimo de número de diferencia. En algunas modalidades, los niveles medidos son normalizados contra valores de individuos sanos normales. En ciertas modalidades, los niveles de referencia son obtenidos de valores medidos de los biomarcadores diferentes de muestras en la saliva de individuos humanos sin AD. En algunas modalidades, los niveles de referencia son obtenidos de valores medidos de los biomarcadores diferentes de muestras en la saliva de individuos humanos con AD. En algunas modalidades, el método comprende comparar el nivel medido de biomarcadores de diagnóstico de AD en saliva a dos niveles de referencia para cada biomarcador. En algunas modalidades, los dos niveles de referencia para cada biomarcador comprenden: (a) un nivel de referencia obtenido de valores medidos de diferentes biomarcadores de muestras en la saliva de individuos humanos sin AD; y (b) un nivel de referencia obtenido de valores medidos de biomarcadores de muestras en la saliva de individuos humanos con AD. En algunas modalidades, el grupo de individuos sin AD es una población de control seleccionada de una población de edad pareja, de una población de control degenerativa, de una población de control neurodegenerativa sin AD, de una población de control sana de edad pareja, o de una población mezclada de las mismas. Este método es una evaluación/clasificación de la enfermedad neurológica no invasiva y libre de dolor [AD y/o PD] utilizando saliva como un fluido de diagnóstico, que, cuando se usa conjuntamente con un dispositivo de punto de cuidado, introduce la posibilidad de una prueba doméstica de evaluación de demencia. El uso de la teenología también puede ser aplicado a una multitud de otras tecnologías disponibles para el diagnóstico bajo condiciones de laboratorio y en campo, con y sin instrumentación. Tales métodos incluyen, sin limitación ELISA, inmunoensayos homogéneos, espectrometría de masa, aglutinación de látex, inmunoensayo de polarización de fluorescencia [FPIA], inmunoensayos de quimioluminiscencia y tecnología de biosensor, entre otros.

En otra modalidad, la diferencia estadísticamente significativa es medida en términos de un valor p, donde el valor p varía de 0 a 0.05, mientras que en otras modalidades, los parámetros para la diferencia estadísticamente significativa comprenden uno o más de: una correlación mayor que 90% (r = 0.9 a r = 0.99); un valor de p de entre 0 y 0.05; un número de veces de cambio en los niveles mayor que 20%, y a “una puntuación d” (una medición de la disminución o aumento en niveles específicos de biomarcadores en pacientes con AD). En este caso una puntuación d mayor que 1 es definida para biomarcadores cuyos niveles aumentan y una puntuación de d menor que 1 es aplicable para biomarcadores cuyos niveles disminuyen. En ciertas modalidades, el grupo de individuos sin AD es una población de control seleccionada de una población de edad pareja, de una población de control degenerativa, de una población de control neurodegenerativa sin AD, de una población de control sana de edad pareja, o de una población mezclada de las mismas. En algunas modalidades, todos los individuos del grupo tienen un mínimo de 60 años de la edad y un máximo de 85 años de edad. En otro aspecto de la invención, las pruebas realizadas en el laboratorio son utilizadas para medir los valores y/o los niveles de referencia. En la presente se proporcionan metodos para obtener valores comparativos para los niveles medidos con respecto a niveles de referencia en muestras de fluido biológico, especialmente saliva. En cualquiera de las modalidades antes mencionadas, la comparación del valor medido y el valor de referencia incluye calcular una diferencia en número de veces entre el valor medido y el valor de referencia. En algunas modalidades, el valor medido es obtenido cuantificando el nivel de varios biomarcadores de diagnóstico de AD en muestras disponibles del paciente, mientras que en otras modalidades el valor medido es obtenido de datos de la recolección de muestras realizada en tres clínicas independientes.

En aspectos adicionales, la muestra puede ser un fluido corporal incluyendo, pero no limitado a sangre, fluido crevicular gingival, suero, plasma, orina, hisopo nasal, líquido cefalorraquídeo, fluido pleural, fluido sinovial, fluido peritoneal, líquido amniótico, fluido gástrico, fluido linfático, fluido intersticial, homogenado de tejido, extractos celulares, saliva, esputo, heces, secreciones fisiológicas, lágrimas, moco, sudor, leche, semen, fluido seminal, secreciones vaginales, fluido de úlceras y otras erupciones superficiales, ampollas, y abscesos, y los extractos de tejidos incluyendo biopsias de tejidos normales y sospechosos o cualesquiera otros componentes del cuerpo que puedan contener el sustrato objetivo de interes.

Ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que sigue y en parte será evidente de la descripción, puede ser aprendida por la práctica de la invención. Las ventajas de la invención pueden ser deducidas y alcanzadas por medio de las instrumentalidades y combinaciones especialmente indicadas en las reivindicaciones anexas. Los beneficios y las ventajas adicionales de las modalidades de la invención se harán evidentes de la consideración de la siguiente descripción detallada dada con referencia a los dibujos adjuntos, que especifican y muestran modalidades preferidas de la invención presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de empezar una descripción detallada de la invención presente, es adecuada la mención de lo siguiente. En donde es apropiado, se usan materiales y caracteres de referencia similares para designar correspondientes componentes idénticos o similares en los diferentes dibujos. Los dibujos asociados con esta revelación típicamente no están dibujados con una precisión dimensional a escala, es decir, tales dibujos han sido esbozados con un enfoque en la claridad y comprensión de la vista más que en la precisión dimensional.

Con el interés en la claridad, no todas las características rutinarias de las implementaciones descritas en la presente son mostradas y descritas. Por supuesto, será apreciado que en el desarrollo de cualquiera tal implementación verdadera, numerosas decisiones específicas de la implementación deben realizarse para lograr los objetivos específicos del desarrollador, tales como el cumplimiento con las restricciones de aplicación y relacionadas con el negocio, y que estos objetivos específicos variarán de una implementación a otra y de un desarrollador a otro. Además, será apreciado que tal esfuerzo de desarrollo quizás sea complejo y consumidor de tiempo, pero no obstante sería una tarea rutinaria de ingeniería para los expertos en la téenica que tienen el beneficio de esta revelación.

Las respuestas inflamatorias y de lesión están asociadas invariablemente con la degeneración neuronal en la AD, la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia frontotemporal, la enfermedad cerebrovascular, la esclerosis múltiple, y las neuropatías. Los inventores afirman que la vigilancia de las concentraciones relativas de muchos marcadores secretados medidos simultáneamente en los especímenes de saliva es un metodo más sensible para vigilar la progresión de la enfermedad que la concentración absoluta de cualquier marcador bioquímico único. Los inventores describen en la presente un compuesto o serie de conjuntos de biomarcadores salivales cuantitativamente medidos simultáneamente, tales conjuntos de biomarcadores consisten en [a manera de ejemplo] anticuerpos unidos a un soporte sólido, o proteínas unidas a un soporte sólido, para la detección de inflamación y marcadores de respuesta a la lesión asociada con la AD. Además, los inventores han descubierto conjuntos de marcadores (llamados colectivamente "biomarcadores de AD") útiles para el diagnóstico de AD, como auxiliares en el diagnóstico de la AD y para vigilar la AD en pacientes con AD (por ejemplo, rastrear la progresión de la enfermedad en pacientes con AD, lo que puede ser útil para rastrear el efecto de la terapia médica o quirúrgica en pacientes con AD). Los biomarcadores de AD están presentes en niveles específicos y pueden ser cuantificados en varios fluidos biológicos de individuos. Esta invención enseña que ciertos biomarcadores de AD están presentes en los fluidos biológicos incluyendo la saliva de los individuos, permitiendo la recolección de muestras por procedimientos sencillos y no invasivos que son libres de dolor, especialmente en comparación con el procedimiento estándar de punción lumbar que es utilizado comúnmente hoy día para recolectar líquido cefalorraquídeo y muestras de sangre para la evaluación subsiguiente de la AD.

Definiciones La revelación presente incluye los metodos y las composiciones para la identificación de biomarcadores asociados con la enfermedad de Alzheimer (AD). Los biomarcadores identificados según los métodos y las composiciones reveladas pueden ser utilizados en el diagnóstico, la estratificación, o la vigilancia de la progresión o el retroceso de la AD. Los biomarcadores pueden ser utilizados como objetivos de fármacos para desarrollar nuevos fármacos y vigilar terapias diferentes para el tratamiento de la AD.

"Paciente con Alzheimer" y "Paciente con AD" cada uno se refiere a un individuo que ha sido diagnosticado con AD [por ejemplo, caracterizado como "diagnosticado con AD" por una puntuación de Mini-Examen de Estado Mental [MMSE] o autopsia post mortem o se le dio un diagnóstico probable de enfermedad de Alzheimer (AD)]. La AD incluye a individuos con un diagnóstico probable de AD leve, AD moderada AD, o AD grave. "Paciente sin AD" se refiere a un individuo "normal" o muestra de un individuo "normal" que es o será valorado por un médico como no teniendo AD o deterioro cognoscitivo leve (MCI). En varias modalidades, un paciente sin AD puede tener una puntuación de MMSE (mencionada en Folstein et al., J. Psychiatric Research (1975): 12: 1289-198), o lograría una puntuación de MMSE en el intervalo de 27 o superior, o podría haber sido valorado utilizando otros metodos de examen mental. En personas promedio con enfermedad de Alzheimer que no reciben tratamiento pierden 2 a 4 puntos cada año en el sistema de puntuación de MMSE. Un "individuo" es un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, primates, ganado, animales domésticos, animales de deportes, roedores y mascotas. Un " individuo con AD leve" o "AD leve" es un individuo que ha sido diagnosticado con AD (por ejemplo, por autopsia post mortem ) o ha recibido un diagnóstico de AD probable y habría sido valorado ya sea utilizando sistema de puntuación de MMSE, y con un puntaje entre 20 y 26 o lograría una puntuación de 20-26 con la prueba de MMSE o podría haber sido valorado por otros métodos disponibles de examen mental. Un " individuo con AD moderada" o "AD moderada" es un individuo que ha sido diagnosticado con AD (por ejemplo, por autopsia post mortem) o ha recibido un diagnóstico de AD probable y habría sido valorado utilizando sistema de puntuación de MMSE, y con un puntaje entre 10 y -19 o lograría una puntuación de 10-19 con la prueba de MMSE o podría haber sido valorado por otros métodos disponibles de examen mental. Un " individuo con AD grave" o "AD grave" es un individuo que ha sido diagnosticado con AD (por ejemplo, por autopsia post mortem) o ha recibido un diagnóstico de AD probable y habría sido valorado utilizando sistema de puntuación de MMSE, y con un puntaje debajo de 10 o lograría una puntuación debajo de 10 con la prueba de MMSE o podría haber sido valorado por otros métodos disponibles de examen mental.

Como es utilizado en la presente, los métodos para "ayudar al diagnóstico" se refieren a los métodos que participan en hacer una determinación clínica con respecto a la presencia, o a la naturaleza, de AD o MCI (deterioro cognoscitivo leve), y pueden o no pueden ser concluyentes con respecto a un diagnóstico definitivo. Por consiguiente, por ejemplo, un método de ayudar al diagnóstico de AD puede comprender medir la cantidad de uno o de una multiplicidad de biomarcadores de AD en una muestra biológica de un individuo.

El término "estratificar" se refiere a clasificar individuos en clases o estratos diferentes con base en las características de la forma y la naturaleza de la AD. Por ejemplo, estratificar una población de individuos con enfermedad de Alzheimer implica asignar a los individuos con base en la gravedad de la enfermedad (por ejemplo, leve, moderada, grave, etc.).

Como es utilizado en la presente, el término "tratamiento" se refiere al alivio, la mejora, y/o la estabilización de síntomas, así como a una demora en la progresión de los síntomas de un trastorno particular, mediante el uso de algún fármaco externo, dispositivo o teenología. Por ejemplo, "tratamiento" de AD incluye uno o más de: la eliminación de uno o más síntomas de AD, la reducción en uno o más síntomas de AD, la estabilización de los síntomas de AD (por ejemplo, la falla en el progreso a etapas más avanzadas de la AD), la demora en la progresión (por ejemplo, empeoramiento) de uno o más síntomas de AD, y del retroceso (por ejemplo, reversión a una etapa más temprana de la AD).

Como es utilizado en la presente, el termino "predecir" se refiere a hacer un juicio de que un individuo tiene una probabilidad apreciablemente aumentada de desarrollar AD.

El término "prognosis" incluye el resultado o el transcurso probables de la AD.

Por "efecto terapéutico," "actividad terapéutica" o "acción terapéutica" se entiende una actividad farmacológica deseada del agente contra el oligómero soluble tau, el complejo de tau-A 1-42 [que se abrevia en otras partes del documento como Ab-42, y / o el complejo de tau-A31-40 [abreviado en cualquier otra parte del documento como Ab-40] para el tratamiento de AD, AD leve, AD moderada, y / o AD grave. Por ejemplo, un fármaco (por ejemplo, NSAID, estatina, etc.) puede ser administrada a un paciente con AD, AD leve, AD moderada, o AD grave y puede medirse el nivel de líquido cefalorraquídeo extracelular [CSF] oligómero soluble tau, complejo de tau^1-42, y / o complejo de tau-A 1-40 para determinar si el tratamiento tiene el efecto terapéutico deseado de disminuir los niveles extracelulares de CSF del oligómero soluble de tau, complejo de tau-AB1-42, y/o complejo de tau-A 1-40, por ejemplo. Si hay una reducción en niveles de CSF, el fármaco tiene el efecto terapéutico deseado y podría llevar a un alivio de los síntomas de la AD. Si los niveles de CSF no se reducen, entonces la dosis del fármaco puede ser aumentada, descontinuada, u otro agente puede ser agregado para producir el efecto terapéutico deseado. Varias nuevas terapias prometedoras están en desarrollo que se agregarán a la batería de nuevas herramientas terapeuticas para la AD.

Diferencia en número de veces: Como es utilizado en la presente, la frase "diferencia en número de veces" se refiere a una representación numérica de la diferencia de magnitud entre un valor medido y un valor de referencia para un biomarcador salival de la AD. La diferencia en el número de veces es calculada matemáticamente por división del valor numérico medido por el valor numérico de referencia. Por ejemplo, si un valor medido para un biomarcador de AD es 180 lU/ml, y el valor de referencia es 60 lU/ml, la diferencia en número de veces es 3. Alternativamente, si un valor medido para un biomarcador de AD es 60 lU/ml, y el valor de referencia es 30 lU/ml, la diferencia en número de veces es 2.

Valor de referencia: Como es utilizado en la presente, un "valor de referencia" puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, un intervalo de valores, de un valor promedio, un valor mediano, un valor medio, de un valor de centroide encogido, o un valor en comparación con un valor control particular o valor de línea de base. Será comprendido que otras variables estadísticas pueden ser utilizadas para determinar el valor de referencia. Un valor de referencia puede estar basado en un valor de muestra individual, tal como por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del individuo con AD, pero en un punto anterior en el tiempo, o un valor obtenido de una muestra de un paciente con AD diferente del individuo que es examinado, o un individuo “normal”, que es un individuo que es diagnosticado sin AD. El valor de referencia puede estar basado en muchas muestras, tal como de pacientes con AD o individuos normales o basado en una combinación de muestras incluyendo o excluyendo la muestra a ser probada. índice Salival de AD: El índice salival de la AD se define como un índice de biomarcadores de diagnóstico utilizados para explicar la capacidad (la sensibilidad y la especificidad) del biomarcador salival (o la combinación de biomarcadores específicos) para distinguir entre individuos sanos y con AD. El índice Salival de la AD es un reflejo de la sensibilidad, de la especificidad, y de la exactitud general de los biomarcadores salivales para detectar la enfermedad. Como es utilizado en la presente, el 'índice Salival de la AD” tambien puede ser definido como la capacidad de un biomarcador (o la combinación de biomarcadores) para distinguir entre individuos sanos y diferentes tipos de AD. Por ejemplo la combinación de biomarcadores salivales de MMP-8, amilasa y MYO (mioglobina) distingue fácilmente entre individuos sanos y tipos diferentes de AD en comparación con las combinaciones de otro biomarcadores. Entonces, el MMP-8 salival, amilasa y MYO son definidos como un índice Salival de la AD porque los niveles de estos biomarcadores son apreciablemente mayores en pacientes con AD en comparación con esos en individuos sanos Metodos para Identificar Biomarcadores Los conjuntos de biomarcadores utilizados en los métodos descritos en la presente incluyen el conjunto: cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1, mieloperoxidasa [MPO], IL-4, y / o IL-5; péptido natiurético tipo B [BNP], IL-1a, IL-11, IL-10, TNF-a, IFN-g, VEGF, insulina, GLP-1 (activo), GLP-1 (total), TREMI, Leucotrieno E4, Akt1, Ab-40, Ab-42, ligando Fas, PSA, G-CSF, MIP-1a, IL-22, IL-8, IL-21, IL-15, IL-6, IL-7, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-17a, IL-Ib, MCP, IL-32 o RANTES, apolipoproteínas A1 , D y E, albúmina modificada por isquemia (IMA), fibronectina, s. alfa-amilasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa, actividad de factor de tejido, MCP-1, sVCAM-1, sCD-40, factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-l) e IGF-II.

Por consiguiente, en la presente se describen los métodos para identificar uno o más biomarcadores adicionales útil para el diagnóstico, ayuda en el diagnóstico, valoración del riesgo, vigilancia, y/o predicción de la AD.

En ciertos aspectos de la invención, los niveles cuantitativos de los grupos de biomarcadores son obtenidos de conjuntos de muestras salivales recolectadas de uno o más individuos. Las muestras son seleccionadas de manera que puedan ser segregadas en uno o más subconjuntos con base en el valor de diagnóstico de los varios biomarcadores para la detección de la AD. Los valores medidos de las muestras se comparan entre si para identificar esos biomarcadores que varían apreciablemente dentro de los subconjuntos. Los biomarcadores identificados que varían apreciablemente dentro de los subconjuntos poseen las características óptimas para propósitos de diagnóstico/pronósticos y entonces puede ser utilizado en metodos como ayuda en el diagnóstico, vigilancia, y/o la predicción de la AD. El procedimiento de comparar los valores medidos puede ser realizado por cualquier método conocido en la téenica. Los métodos incluyen métodos tradicionales de laboratorio incluyendo el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima [ELISA], inmunoensayo de polarización de florescencia [FPIA] e inmunoensayos homogéneos, pruebas de punto de cuidado que utilizan inmunocromatografía convencional de flujo lateral [LFA], pruebas cuantitativas de punto de cuidado que utilizan la determinación de quimioluminiscencia, fluorescencia, y partículas magnéticas, así como aglutinación de látex, biosensores, electroforesis en gel, espectrometría de masa [MS], cromatografía de gas-espectrometría de gas [GC-MS], y métodos a base de nanotecnología, sólo a manera de ejemplo.

Métodos de evaluación de la AD En la presente se describen métodos para evaluar la AD y para el diagnóstico y la ayuda en el diagnóstico de la AD al cuantificar los niveles de los conjuntos de biomarcadores de diagnóstico de la AD en muestras salivales de varios individuos y comparando los niveles medidos con los niveles de referencia, en donde los conjuntos de biomarcadores comprenden: cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1, mieloperoxidasa [MPO], IL-4, y / o IL-5; péptido natiurético de tipo B [BNP], IL-1a, IL-11, IL-10, TNF-a, IFN-g, VEGF, insulina, GLP-1 (activo), GLP-1 (total), TREMI, Leucotrieno E4, Akt1, Ab-40, Ab-42, ligando Fas, PSA, G-CSF, MIP-1a, IL-22, IL-8, IL-21, IL-15, IL-6, IL-7, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-17a, IL-1 b, MCP, IL-32 o RANTES, apolipoproteínas A1, D y E, albúmina modificada por isquemia (IMA), fibronectina, s. alfa-amilasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenase, actividad del factor de tejido, MCP-1, sVCAM-1, sCD-40, factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I), y IGF-II, cualquier conjunto de que pueda comprender opcionalmente paneles de biomarcadores que consisten de uno, dos, tres, o más biomarcadores adicionales. Estos conjuntos de biomarcadores son útiles para varios propósitos, por ejemplo, la evaluación del riesgo de desarrollar AD, valorar la gravedad de la enfermedad, vigilar la post diagnóstico y otros. La detección del biomarcador de la AD incluye pero no se limita a las proteínas o metabólitos secretados en los fluidos biológicos humanos (es decir, una muestra de fluido biológico), tal como por ejemplo, un fluido corporal incluyendo sangre, fluido crevicular gingival, suero, plasma, orina, hisopo nasal, líquido cefalorraquídeo, fluido pleural, fluido sinovial, fluido peritoneal, líquido amniótico, fluido gástrico, fluido linfático, fluido intersticial, homogenado de tejido, extractos celulares, saliva, esputo, heces, secreciones fisiológicas, lágrimas, moco, sudor, leche, semen, fluido seminal, secreciones vaginales, fluido de úlceras y otras erupciones superficiales, ampollas, y abscesos, y extractos de tejidos incluyendo biopsias de tejidos normales y sospechosos o cualesquiera otros componentes del cuerpo que puedan contener la molecula objetivo de interés. Como es descrito en la presente, la evaluación de resultados puede ser cualitativa o cuantitativa dependiendo del método específico de detección empleado.

En un aspecto, la invención presente proporciona los métodos para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer [AD] y al diagnóstico de la AD, al medir y cuantificar los niveles de cada biomarcador de AD en un conjunto de biomarcadores de AD en una muestra salival recolectada de una muestra de fluido biológico periférico de un individuo, y comparando los niveles medidos con los niveles de referencia establecidos para cada uno de los biomarcadores. En algunas modalidades, el conjunto de biomarcadores de diagnóstico de la AD comprende: IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa. En otras modalidades, el conjunto de biomarcadores de diagnóstico de AD comprende: cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1 , mieloperoxidasa, IL-4, y / o IL-5; péptido natiurético de tipo B, IL-1 a, IL-11 , IL-10, TNF-a, IFN-g, VEGF e insulina. Opcionalmente, estos conjuntos además pueden comprender biomarcadores adicionales tales como el ligando Fas, o PSA, G-CSF, MIP-1a, IL-22, IL-21, IL-15, IL-7, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-1a, IL-12, IL-17a, MCP, IL-32 o RANTES, sVCAM-1 , sICAM-1, apolipoproteínas A1 , D y E, albúmina modificada por isquemia (IMA) y fibronectina.

Los resultados de la cuantificación de varios niveles de biomarcadores en la saliva de pacientes con AD, llevan a la diferenciación de una lista prioritaria de biomarcadores (agrupados por los metodos descritos en la presente) en orden de escala decreciente con los biomarcadores más alto y más bajo escalados dentro de cada grupo escalado con base en los valores que se muestran como significativamente elevados o significativamente disminuidos en pacientes con AD en comparación con los controles sanos normales de edad pareja y contra otras enfermedades neurodegenerativas que no son AD, tal como por ejemplo la enfermedad de Parkinson ["PD"] y PN (las enfermedades neurodegenerativas que no son AD) en comparación con todas las muestras de control. Generalmente, un aumento o disminución significativa en el nivel de un biomarcador dado en comparación a un control apropiado puede ser un indicio de AD.

Mientras muchos subconjuntos proporcionan una buena sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la AD, de los varios subconjuntos de biomarcadores investigados, se encontró que el subconjunto que comprende IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa siendo el mejor subconjunto para el diagnóstico de la AD en comparación con otros subconjuntos de biomarcadores.

En un aspecto adicional, esta invención proporciona métodos para vigilar la progresión de la AD en un paciente diagnosticado con AD. Como un ejemplo, los inventores han mostrado que los niveles del marcador único, Ab-42 aumentan en pacientes con AD con un diagnóstico dudoso de AD (MMSE = 27-30) y que los niveles cuantitativos de Ab-42 aumentan en pacientes con AD con AD leve (MMSE=20-25); además de que los niveles de Ab-42 aumentan aún más a medida que se intensifica la gravedad de la AD En varias modalidades, la sensibilidad lograda mediante el uso de los conjuntos definidos de biomarcadores de AD tal como un biomarcador (Ab-42), dos biomarcadores (Ab-40 y Ab-42), tres biomarcadores (Ab-40, Ab-42 y IGF-II), cuatro biomarcadores (Ab-40, Ab-42, IGF-I y IGF-II) y así sucesivamente como parte de un metodo para el diagnóstico o la ayuda en el diagnóstico de la AD es por lo menos 70%, 78%, 89% y 98% según se usen uno, dos, tres o cuatro biomarcadores.

En varias modalidades, la especificidad lograda usando el conjunto definido de biomarcadores de AD tal como el conjunto que contiene un biomarcador único (Ab-42), dos biomarcadores (Ab-40 y Ab-42), tres biomarcadores (Ab-40, Ab-42 y IGF-II), cuatro biomarcadores (Ab-40, Ab-42, IGF-I y IGF-II) y así sucesivamente como parte de un método para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de la AD es por lo menos 75%, por lo menos 78%, por lo menos 89% y por lo menos 95% de especificidad, respectivamente.

En estas modalidades, la exactitud general lograda usando el conjunto definido de biomarcadores de AD tal como un conjunto que contiene un biomarcador único (Ab-42), dos biomarcadores (Ab-40 y Ab-42), tres biomarcadores (Ab-40, Ab-42 y IGF-II), cuatro biomarcadores (Ab-40, Ab-42, IGF-I y IGF-II) y así sucesivamente como parte de un método para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico de la AD es por lo menos 78%, por lo menos 80%, por lo menos 88% y por lo menos 95% de exactitud, respectivamente.

En algunas modalidades, las características del desempeño de la sensibilidad y/o de especificidad son medidas contra especímenes de pacientes con un diagnóstico clínico de AD. En ciertas modalidades de la invención, los niveles de biom arcad ores de AD tales como el conjunto de biomarcador que comprende Ab-40, Ab-42 e IGF-II se obtienen de un individuo en más de un punto de tiempo. En ciertas modalidades, las evaluaciones individuales son realizadas en individuos sin alguna indicación deAD, sospecha deAD, o de riesgo de AD.

Niveles de medición de Biomarcadores Salivales deAD Hay varios metodos estadísticos utilizados para identificar biomarcadores que varían apreciablemente entre subconjuntos de biomarcadores salivales, uno de los cuales es la "prueba T" convencional. Los biomarcadores identificados siendo colectivamente útiles como una ayuda en el diagnóstico, la vigilancia, y/o la predicción de la AD se basa en una diferencia significativa entre los subconjuntos de muestras salivales probadas. Los niveles de biomarcadores son "apreciablemente diferentes" cuando hay una probabilidad de que los niveles particulares de biomarcador sean apreciablemente más bajos o más altos que los valores medidos de línea de base. Detalles adicionales se presentan en los estudios siguientes.

Los siguientes estudios se proporcionan para ilustrar la invención, pero no pretenden limitar en ninguna manera el alcance de la invención.

Estudio 1: Determinación del Conjunto Óptimo de Biomarcadores Salivales Se realizó un estudio para determinar el conjunto óptimo de biomarcadores, lo que incluyó tres grupos de pacientes: 100 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD); 56 ancianos de control sin demencia sin enfermedad neurológica ni deterioro cognoscitivo y 51 pacientes con enfermedad de Parkinson (PD). Todos los casos de AD incluidos en este estudio fueron diagnosticados con demencia según el criterio del Manual de Diagnóstico y Estadística de Trastornos Mentales (DSM)-IV (American Psychiatric Association: DSM-IV: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Washington DC: American Psychiatric Association (1994) and NINCDS-ADRDA criteria (McKhann G, Drachman D, Folstein M, Katzman R, Price D, Stadlan EM: “Clinical Diagnosis of Alzheimer’s Disease: Report of the NINCDS-ADRDA Working Group Under the Auspices of the Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s Disease,” Neurology (1984) 34: 939-944), con evidencia verificada de descenso cognoscitivo (batería de pruebas neurosicológicas, examen mental clínico, etc.) así como evidencia de deterioro en la función social o profesional. El mini-examen de estado mental (MMSE) fue utilizado para valorar la función cognoscitiva (Folstein MF, Folstein SE, McHugh PR: 'Mini-mental State -A Practical Method for Grading the Cognitive State of Patients for the Clinician,” J Psychiatric Research (1975) 12: 189-198). La puntuación media de MMSE para los pacientes con AD enrolados fue 17. En todos los casos se realizó un trabajo bioquímico extenso incluyendo la medición de los niveles de vitamina B12/folato, hormonas tiroideas y análisis de neuro-formación de imagen (MRI de cerebro y/o escáner de CT). La clasificación de la AD como leve, moderada y grave fue determinada, y el diagnóstico de la demencia vascular fue excluido en todos los casos, utilizando el criterio establecido por la DSM-lll-R (American Psychiatric Association, DSM-lll-R, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, APA, Washington DC, USA 1987). El grupo de control comprendió miembros de la familia o cuidadores de los pacientes de AD, todos los cuales experimentaron entrevistas clínicas con un neurólogo experimentado que confirmó el desempeño completamente normal, cognoscitivo y funcional en este grupo. No se realizó ningún análisis neuropsicológico, bioquímico ni de neuro-formación de imagen formal en este grupo. El grupo de la enfermedad de Parkinson [PD] fue formulado de pacientes que fueron diagnosticados usando el criterio normal de “PD probable” (Calne DB, Snow BJ, Lee C: “Criteria for Diagnosing Parkinson’s Disease,” Ann Neurology (1992) 32:125-127; Gelb DJ, Oliver E, Gilman S: “Diagnostic Criteria for Parkinson’s Disease”, Arch Neurology (1999) 56: 33-39. En un intento de evaluar los biomarcadores salivales que se alteraron en pacientes con AD y PD y 19 controles de edad pareja sin demencia, los niveles de biomarcador en la saliva fueron medidos usando kits de ELISA de varios fabricantes como se describe a continuación. Se cuantificaron los niveles de MMP-2 y MMP-9 utilizando los kits de R&D Systems, (Minneapolis, Minnesota), IL-18 utilizando un kit de Medical & Biological Laboratories Co (Naka-ku, Nagoya, Japan), cTnl, y CD31/PCAM-1, slCAM-2, slCAM-3 (Life Diagnostic, West Chester, PA), sVCAM-1, BNP, RANTES (Diaclone, Besancon, Cedex, France); GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-1a, IL-12, IL-17a, IL-Ib, MCP, IL-32, IFN-y y TNF-a (Luminex, USA); alfa amilasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa (Salimetrics, USA); MYO y MPO (Biodesign International, Saco, ME), MCP-1 (AbD Serotec, Oxford, UK); sCD40 (HyTest Ltd, Turku, Finland); Actividad de factor de tejido (St. Charles, MO USA) y MMP-8 (Human Quantikine, USA); Ab-40, Ab-42 (Biosource International, Invitrogen), IGF-I e IGF-II RIA (Van Wyk y Underwood antibody). Los datos fueron analizados como se discute a detalle en la parte de la descripción de esta invención.

Resultados: Se encontró que el conjunto de biomarcadores salivales que comprende IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa es el mejor conjunto de biomarcadores en comparación con otros conjuntos para discriminar pacientes con AD de controles normales (Cuadro 1).

CUADRO 1 Nivel de Biomarcadores Salivales en Tipos Diferentes de Individuos de AD, PD y Sanos Normales Valor medio (Desviación estándar) Conclusión: Se determinó que un conjunto de biomarcadores salivales que comprende IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa es el mejor subconjunto de biomarcadores de una base de datos más grande de biomarcadores. Este subconjunto resulta ser el más apropiado para el i diagnóstico y propósitos de pronóstico así como para vigilar y detectar el riesgo de AD.

Estudio 2: El efecto de la saliva estimulada v no estimulada en los niveles de biomarcador de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, Alfa amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa.

Las muestras de saliva no estimulada fueron recolectadas por una téenica de ensalivado y comparadas con muestras de saliva estimulada recolectadas por el dispositivo de rodillo de poliéster Salivette® [Sarstedt, Germany] después de que se obtuvo el consentimiento informado y el permiso ético del comité ético necesario, de pacientes sanos normales y afectados por la AD. Las muestras fueron probadas por ELISA para los siguientes biomarcadores: IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa.

Resultados: Los niveles salivales de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa no fueron significativamente menores en la saliva estimulada en comparación con la saliva completa no estimulada, recolectada por la teenica de ensalivado, en ambos grupos (Cuadro-2, p = 0.001).

CUADRO 2 Niveles de varios biomarcadores en saliva no estimulada v estimulada en pacientes afectados por la AD v en individuos sanos normales Valor medio (Desviación estándar) Conclusión: La saliva no estimulada entera es el espécimen preferido para el análisis de los biomarcadores salivales para el AD; sin embargo la saliva estimulada puede ser utilizada como un espécimen alternativo. Tanto en los especímenes de saliva entera no estimulada como en los de saliva estimulada hay diferencias significativas entre cada uno de los biomarcadores salivales en pacientes con AD en comparación con los controles sanos. En ciertos casos los niveles de los biomarcadores aumentan [por ejemplo. TNF-alfa] mientras en otros casos [por ejemplo. IGF-I] los niveles disminuyen.

Estudio 3: /.Cuáles biomarcadores salivales del subconiunto optimizado de biomarcadores salivales, es decir IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa son suficientemente específicos para uso en pacientes con la AD leve moderada v grave v pacientes con PD? Los pacientes con AD y PD seleccionados para este estudio fueron los mismos que esos definidos en el Estudio 1. Los especímenes de saliva entera no estimulada fueron recolectados y analizados para los biomarcadores salivales como para el Estudio 1 anterior.

Resultados: Los niveles salivales de Ab-42, alfa amilasa e IL-1 beta fueron significativamente mayores en los pacientes con AD que en los pacientes con PD, mientras los niveles de esos biomarcadores en los pacientes con PD fueron mayores que en los especímenes del control sano normal. Los niveles de los biomarcadores IGF-I, IGF-II y Ab-40 fueron menores en los pacientes con AD en comparación con los pacientes con PD, lo que a su vez fue menor que los niveles en los especímenes del control sano normal. Los niveles del biomarcador para Ab-42, alfa amilasa e IL-1 beta aumentan a medida que aumenta la gravedad de la enfermedad de leve a moderada a grave, pero en el caso de los biomarcadores IGF-I, IGF-II y Ab-40 estos niveles disminuyeron de leve a moderado a grave (p = 0.001, vea el Cuadro-3).

CUADRO 3 Niveles de biomarcador salival en diferentes tipos de individuos con AD, PD y sanos normales Valor medio (Desviación estándar) Conclusión: La cuantificación de los niveles salivales de los biomarcadores IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa sirven como biomarcadores útiles para el diagnóstico de diferentes tipos de AD y PD.

Estudio 4: Biomarcadores salivales IGF-I, IGF-II, AB-40, A3-42, Alfa amilasa. IL-1 beta v TNF-alfa para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson Los tres grupos de pacientes: 100 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD); 56 controles ancianos sin demencia sin enfermedad neurológica ni deterioro cognoscitivo y 51 pacientes con la enfermedad de Parkinson (PD) seleccionados para este estudio fueron iguales que esos definidos en el Estudio 1. Los especímenes de saliva entera no estimulada fueron recolectados y analizados para los salivales IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa como para el Estudio 1 anterior. La comparación estadística de las dos poblaciones se realizó utilizando la prueba t de dos colas usando GraphPad Prism para Windows, v 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). El receptor que opera las curvas características (ROC) fue generado utilizando R (Fundación R para el Cálculo Estadístico, Viena, Austria).

Resultados y Conclusiones: El análisis de ROC estableció la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico de 82 %, 89% y 95%, en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, respectivamente (Cuadros 4 y 5). Los biomarcadores Ab-42, Ab-40 e IGF-II tienen altos valores de diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson seguido de IGF-I, TNF-alfa, IL-1 beta y alfa amilasa en orden decreciente de importancia.

CUADRO 4 Análisis de ROC v desempeño de diagnóstico de los biomarcadores IGF- I, IGF-II, Alfa Amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa en pacientes con la Enfermedad de Alzheimer.

CUADRO 5 Desempeño del análisis v diagnóstico de los biomarcadores IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, Alfa Amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa en pacientes con la enfermedad de Parkinson.

Estudio 5: Panel de combinación de biomarcador de los salivales IGF-I, IGF-II, Ab-40, A3-42, Alfa Amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer v la enfermedad de Parkinson.

Los tres grupos de pacientes en este estudio, es decir los 100 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD); 56 controles ancianos sin demencia sin enfermedad neurológica ni deterioro cognoscitivo y 51 pacientes con la enfermedad de Parkinson (PD) fueron los mismos que esos seleccionados en el Estudio 1. Los especímenes de saliva entera no estimulada fueron recolectados y analizados para los salivales IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa como para el Estudio 1 anterior. La comparación estadística de las dos poblaciones [AD y PD] por combinación de los biomarcadores salivales se realizó utilizando la prueba t de dos colas usando GraphPad Prism para Windows, v 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). El receptor que opera las curvas características (ROC) fue generado utilizando R (Fundación R para el Cálculo Estadístico, Viena, Austria). Los niveles de referencia son esos descritos en el Estudio 4 y los Cuadros 4 y 5.

Resultados v conclusiones: Los análisis ROC establecieron la sensibilidad y especificidad del diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson como se muestra en los Cuadros 6 y 7. Los modelos de combinación de Ab-42, Ab-40, e IGF-II tiene altos valores de diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson en comparación con los otros modelos de combinación.

CUADRO 6 El desempeño del análisis ROC v diagnóstico para varias combinaciones de biomarcadores (IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, Alfa Amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa) en pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

CUADRO 7 El desempeño del análisis ROC v diagnóstico para varias combinaciones de biomarcadores (IGF-I, IGF-II, Ab-40, AB-42. Alfa Amilasa, IL-1 beta, v TNF-alfa) en pacientes con la enfermedad de Parkinson.

Estudio 6: Biomarcadores de diagnóstico de la AD En un experimento adicional, comparamos diferentes proteínas salivales en pacientes con AD utilizando especímenes de saliva recolectados de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (con una edad media de 74) en comparación con especímenes de saliva de control recolectados de sujetos de control (con una edad media similar, 75). Los sujetos con la enfermedad de Alzheimer fueron diagnosticados clínicamente con AD por un neurólogo y tuvieron puntuaciones del Mini Examen de Estado Mental (MMSE) variando de 14-26. Las muestras salivales fueron probadas usando un ELISA con formato de emparedado (como se describió en el Estudio 1).

Una comparación de los niveles relativos de biomarcador en los especímenes salivales fue realizada comparando los grupos de control y de AD. Los resultados revelan los siguientes biomarcadores discriminatorios: IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF- alfa. Como se describe en algún lado en la presente, en ciertas modalidades de la invención, el conjunto de biomarcadores de diagnóstico de la AD puede comprender un conjunto más grande formado de los siguientes biomarcadores, o subconjuntos de los mismos: cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1, mieloperoxidasa [MPO], IL-4, y / o IL-5; péptido natiurético de tipo B [BNP], IL-1a, IL-11, IL-10, TNF-o, IFN-g, VEGF, insulina, GLP-1 (activo), GLP-1 (total), TREMI, Leucotrieno E4, Akt1, Ab-40, Ab-42, ligando Fas, PSA, G-CSF, MIP-1a, IL-22, IL-8, IL-21, IL-15, IL-6, IL-7, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-17a, IL-1 p, MCP, IL-32 o RANTES, apolipoproteínas A1, D y E, albúmina modificada por isquemia (IMA), fibronectina, s. alfa-amilasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa, actividad de factor de tejido, MCP-1, sVCAM-1, sCD-40, factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I) e IGF-II.

Un agrupamiento no supervisado (es decir, el algoritmo del agrupamiento que está blindado a los casos que son AD y que son normales) de los 40 resultados de marcadores discriminatorios en el agrupamiento de las muestras en 2 grupos o agrupamientos, un agrupamiento de muestras de control, y un agrupamiento de muestras de AD. La sensibilidad en este caso fue calculada como el número de muestras de AD correctamente clasificadas en el agrupamiento de AD dividido entre el número total de muestras de AD, que, en este ejemplo particular es 29/32 o 90.6%.

Se realizó una comparación entre los niveles de biomarcador en los grupos de control y de AD, revelando ocho (8) biomarcadores (mostrados en el Cuadro 8) que se regulan diferencialmente entre los dos grupos. Se realizaron los análisis estadísticos para encontrar la probabilidad de que el hallazgo de niveles diferenciales estaba equivocado (el valor de “q”) para cualquier biomarcador. Una diferencia en número de veces puede ser determinada midiendo la concentración absoluta de un biomarcador y comparando esa con el valor absoluto de una referencia. Alternativamente, una diferencia en número de veces puede ser medida como la diferencia relativa entre un valor de referencia y un valor de la muestra, en donde ningún valor es una medida de la concentración absoluta, y / o en donde ambos valores se miden simultáneamente. Una diferencia en número de veces puede ser un valor en el intervalo de 10% a 90%. Una prueba de ELISA puede ser utilizada para medir el contenido o concentración absoluta de una proteína de la que se determina un número de veces de cambio en comparación con la concentración absoluta del mismo biomarcador en la muestra de referencia.

Los biomarcadores con niveles diferenciales y valores q asociados (mostrados como valores en porcentaje) se muestran en el Cuadro 8 (el cambio en número de veces entre los niveles en las muestras de control contra AD). La sensibilidad fue calculada como el número de muestras de AD en el agrupamiento de AD dividido entre el número total de las muestras de AD, lo que resulta ser 29/32 o 90.6%. La especificidad fue calculada como el número total de AD predicho correctamente dividido entre el número predicho total de pacientes con AD, que en este caso es 29/34 = 85%.

CUADRO 8: Cambios en número de veces para los Biomarcadores salivales en la AD.

Estudio 7: Árboles de decisión de los datos anteriores de biomarcador de diagnóstico de AD Con un análisis adicional de los datos del Estudio 4, se formularon dos diferentes árboles de decisión para el diagnóstico de la AD, utilizando los biomarcadores de diagnóstico de AD. El primer árbol de decisión utiliza los niveles de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF- alfa y el segundo árbol de decisión utiliza cTnl, mioglobina, MMP-9, MMP-8, MMP-2, slCAM-1 y mieloperoxidasa [MPO] La especificidad fue calculada de las puntuaciones de prueba como los casos totales correctamente predichos de AD / número total de casos de AD (en este caso 29/33 casos fueron identificados correctamente resultando en una especificidad calculada de 29/33 = 0.878). La especificidad cuando se aplica el primer árbol de decisión fue 98.2% mientras que usando el segundo árbol de decisión resultó en una especificidad de sólo 45.8%.

Estudio 8: Para revisar la sensibilidad v la especificidad de los biomarcadores salivales para el diagnóstico de la AD.

Un total de 100 pacientes en diferentes etapas de la AD fueron seleccionados de un departamento de pacientes externos de un hospital elegido y cada uno fue enrolado en nuestro estudio después de recibir el permiso ético. El diagnóstico de pacientes se realizó con base en las téenicas estandarizadas de acuerdo con los lineamientos previamente descritos (vea el Estudio 1). Las muestras salivales fueron tomadas y enviadas para análisis sin saber si el diagnóstico de los pacientes se realizó por métodos alternativos. Los siguientes biomarcadores salivales: Se analizaron los niveles de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1beta, y TNF-alfa y después los pacientes fueron categorizados según el criterio descrito en el Estudio 3 para calcular las sensibilidades y especificidades para cada uno de estos biomarcadores específicos relevantes para el diagnóstico de la AD. La sensibilidad fue calculada como el número de muestras de AD en el agrupamiento de AD dividido entre el número total de las muestras de AD, lo que resulta ser 29/32 o 90.6%. La especificidad fue calculada como el número total de AD predicho correctamente dividido entre el número predicho total de pacientes con AD, que en este caso es 29/34 = 85%.

Resultados: Las sensibilidades calculadas de los diversos biomarcadores (usando una combinación de entre dos y ocho biomarcadores) fueron altas, variando de 87% a 98.9%. El intervalo de especificidades tambien fue alto (de 87.5%-96.5%), por lo tanto estos biomarcadores son altamente aplicantes al diagnóstico de las diferentes etapas de la AD.

Estudio 9: A3-42, AB-40 salivales v proporción de Ab-40 / Ab-42 como Biomarcadores potenciales para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer v la enfermedad de Parkinson Tres grupos de pacientes: 100 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD); 56 controles ancianos sin demencia sin enfermedad neurológica ni deterioro cognoscitivo y 51 pacientes con la enfermedad de Parkinson (PD) seleccionados para este estudio fueron iguales que esos definidos en el Estudio 1. Los especímenes de saliva entera no estimulada fueron recolectados y analizados para Ab-42 y Ab-40 salivales como en el Estudio 1 anterior. La comparación estadística de las dos poblaciones enfermas se realizó utilizando la prueba t de dos colas usando GraphPad Prism para Windows, v 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). El receptor que opera las curvas características (ROC) fue generado utilizando R (Fundación R para el Cálculo Estadístico, Viena, Austria).

Resultados: El análisis de ROC demostró una sensibilidad y especificidad de diagnóstico de 95% y 90%, respectivamente (Cuadro 9) en el caso de la enfermedad de Alzheimer. Los valores predictivos positivo y negativo fueron estimados cercanos a 95% y 90%, respectivamente, mientras que los biomarcadores Ab-40 y Ab-42 solos tuvieron valores predictivos negativos que fueron iguales que o menores que 75% en el caso de la enfermedad de Alzheimer. El análisis de ROC estableció una sensibilidad y especificidad de diagnóstico de 95% y 90%, respectivamente (Cuadro 10) en el caso de la enfermedad de Alzheimer. Los valores predictivos positivo y negativo fueron estimados a aproximadamente 95% y 95%, respectivamente, mientras que los biomarcadores Ab-40 y Ab-42 solo tuvieron valores predictivos negativos que fueron iguales que o menores que 70% en el caso de la enfermedad de Parkinson.

CUADRO 9 Desempeño del análisis ROC y diagnóstico de Ab-40, Ab-42, y una proporción de los biomarcadores Ab-40 / Ab-42 en la enfermedad de Alzheimer CUADRO 10 Desempeño del análisis ROC v diagnóstico de AB-40, Ab-42, v una proporción de los biomarcadores Ab-40 / Ab-42 en la enfermedad de Parkinson Conclusiones: Los salivales Ab-42, Ab-40 y la proporción de Ab-40 / Ab-42 son biomarcadores de detección temprana para la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

Estudio 10: Proporciones de Ab-42 / Ab-40 con un aumento del riesgo inminente de deterioro cognoscitivo leve v enfermedad de Alzheimer.

Los sujetos en este estudio fueron 100 adultos ancianos cognoscitivamente normales que forman un subconjunto completo de esos que ingresaron a las tres clínicas. Estos “pacientes” fueron registrados en las tres clínicas como controles normales entre 2006 y 2011 y tuvieron por lo menos 3 especímenes almacenados de saliva. Para el propósito de este y de otros estudios discutidos en la presente, los adultos cognoscitivamente normales son definidos como individuos inmersos en la comunidad, que funcionan de manera independiente que son examinados por un medico de una de las tres clínicas y que cumplieron con los siguientes criterios de selección: (1) Ninguna queja de dificultades con la memoria durante la historia tomada y el examen médico; (2) Ninguna condición siquiátrica o neurológica activa; (3) Ningún uso de medicamentos psicoactivos o psiquiátricos en cantidades suficientes para afectar la cognición; (4) anotaciones documentadas de que la memoria de la persona era normal.

Los individuos con una historia de condiciones o trastornos médicos que puedan afectar la cognición (por ejemplo, lesiones en la cabeza) se incluyeron sólo si la condición no fue más activa y no hubo evidencia de deterioro persistente o residual cognitivo. Los individuos con condiciones médicas actuales, crónicas médicas sólo fueron incluidos si su doctor juzgó que la condición existente estaba bajo control y que no afectaba la cognición.

Todos los sujetos se sometieron a evaluaciones de línea de base neurológicas y neurosicológicas tales como la Clasificación de Demencia Clínica (Morris JC, “The Clinical Dementia Rating (CDR): Current Versión and Scoring Rules,” Neurology (1993) 43: 2412-2414); Cummings JL, Mega M, Gray K, Rosenberg-Thompson S, Carusi D, Gornbein J. “The Neuropsychiatric Inventory: Comprehensive Assessment of Psychopathology in Dementia,” Neurology (1994) 44: 2308-2314; Kokmen E, Smith G, Petersen R, Tangalos E, Ivnik R, “The Short Test of Mental Status: Correlations with Standardized Psychometric Testing,” Arch Neurol. (1991); 48: 725-728); Hachinski VC, Lassen NA, Marshall J. “Hachinski Ischemic Index -Multi-lnfarct Dementia: a Cause of Mental Deterioration in the Elderly,” Lancet (1974); 2 (7874): 207-210 and “Unified Parkinson’s Disease Rating Scale,” In: Fahn S, Marsden C, Calne D, Golstein M, eds. “Recent Developments in Parkinson’s Disease” New York, NY: MacMillan Publishing Co Inc. (1987); Dementia Rating Scale (DRS) Mattis S. “Dementia Rating Scale: Psychological Assessment Resources,” (1983): Auditory Verbal Learning Test: Rcy A. “L’examen Psychologique dans les cas d’Encephalopathie Traumatique,” Arch Psychol. (1941); 28: 286-340, Wechsler Memory Scale-Revised; Wechsler D. Wechsler “Memory Scale-Revised”. New York, NY: Psychological Corporation; (1987); and Wechsler Adult Intelligence Scale- Revised; Wechsler D. “Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised”. New York, NY: Psychological Corporation; (1981). Los sujetos de estudio fueron contactados cada año para su re-examen. Las listas de medicinas y la información relacionada con la historia familiar de la demencia se actualizaron con cada visita de seguimiento. También, se repitieron la Clasificación de Demencia Clínica, el Registro de Forma de Vida Independiente, Inventario Neuropsiquiátrico, índice Isquémico de Hachinski, Escala de Clasificación Unificada de la Enfermedad de Parkinson, Prueba Corta de Estado Mental de Kokmen, y la batería de la prueba neuropsicológica. Todos los exámenes de seguimiento y de línea de base fueron revisados en conferencias mensuales de consenso. En la línea de base, se revisaron los criterios de ingreso y una puntuación de Clasificación de Demencia Clínica de 0 fue confirmada para todos los individuos normales enrolados en las tres clínicas. Los datos se compararon con esos de los estudios de la línea de base para evaluar la progresión a MCI o demencia. La AD posible y probable fue medida por métodos estandarizados (McKhann G, Drachman D, Folstein M, Katzman R, Price D, Stadlan E.: “Clinical Diagnosis of Alzheimer’s Disease: Report of the NINCDS-ADRDA Working Group Under the Auspices of the Department of Health and Human Services Task Forcé on Alzheimer’s Disease,” Neurology (1984) 34: 939-944). Los sujetos con hallazgos clínicos anormales en el seguimiento que no cumplieron los criterios establecidos para el MCI o demencia fueron codificados como teniendo deterioro cognitivo de origen indeterminado. Hemos reportado que más del 50% de la MCI con amnesia [es decir, la pérdida parcial o total de la memoria] se convierte en AD dentro de 5 años. Entonces, con un número limitado de pacientes que se convierten a AD, combinamos nuestro punto final como casos incidentes de pacientes con MCI con amnesia y con AD, que fueron identificados inicialmente durante este estudio particular por primera vez. El tiempo mediano de seguimiento para este estudio fue 3.2 (1.5) años. Veintidós [22] sujetos fueron diagnosticados teniendo MCI / AD durante su seguimiento. De los 22 convertidos, 12 desarrollaron MCI, y 10 de estos desarrollaron AD (6 casos probables y 4 casos posibles). Para evaluar la relación del cambio cognitivo a los niveles salivales de Ab-42 y Ab-40, identificamos un subgrupo de individuos que tuvieron evaluaciones de 2 en la Escala de Clasificación de Demencia [DRS] aproximadamente 4 años después y una muestra de saliva tomada al momento de la primera evaluación. Los pacientes también tuvieron que ser cognoscitivamente normales al momento del primer punto. Una ventana de 4 (±1)años se utilizó para el tiempo entre las evaluaciones de DRS, y una ventana de ±7 meses fue utilizada para el tiempo entre la visita inicial y la fecha en que se obtuvo la muestra de saliva. Los niveles salivales de Ab-42 y Ab-40 se midieron como se describe en el Estudio-1. El metodo de Kaplan-Meier fue utilizado para estimar la distribución en el tiempo al desarrollo de la MCI / AD, con el tiempo de la primera muestra de saliva recolectada considerada como el inicio del seguimiento.

Resultados: La proporción de Ab-42/ Ab-40 mostró evidencia de una asociación con la conversión a MCI/AD (Cuadro 11). El riesgo de MCI/AD para pacientes con una proporción de Ab-42/ Ab-40 en el cuartil más bajo se estimó siendo 3 veces mayor que el riesgo para los sujetos con una proporción en el cuartil más alto (P=.01). Los sujetos cuya proporción Ab-42 / Ab-40 estuvo en el cuartil más bajo (Q1, p <0.01) alcanzaron una incidencia del 10% después de un periodo de 5 años, seguido de esos en Q2 que tomaron aproximadamente 7 años, y esos en el Q3 y el Q4 que tomaron aproximadamente 10 años para alcanzar el 10% de incidencia acumulada.

CUADRO 11 Tiempo para MCI o AD v Medición de la proporción de Ab salival Conclusión: La proporción de los niveles salivales de Ab-42 / Ab- 40 puede ser usada para la detección del riesgo y el diagnóstico de la AD y de la MCI.

Estudio 11: Autopsia Cerebral Confirmó la AD v Biomarcadores Salivales Todos los sujetos en esta parte del trabajo fueron parte de una cohorte clínico. Cada sujeto se sometió a una evaluación estándar, incluyendo el historial medico, examen físico/neurológico y una batería neuropsicológica (Stern Y, Andrews H, Pittman J, et al.: “Diagnosis of Dementia ¡n a Heterogeneous Population-Development of a Neuropsychological Paradigm-based Diagnosis of Dementia and Quantified Correction for the Effects of Education,” Arch Neurol (1992) 49:453-60). Para este estudio usamos datos de 10 sujetos que murieron durante el periodo del estudio, se tuvieron datos sem ¡-cuantitativos de la autopsia cerebral y por lo menos dos evaluaciones completas antes de la muerte. La evaluación neuropátológica se realizó ciega a los datos clínicos. Una mitad del cerebro de cada paciente fue evaluada de manera general mientras se disecaba en el estado fresco para cosechar bloques que se congelaron por completo y se almacenaron. La mitad contralateral del cerebro se sumergió en solución amortiguada al 10% de fosfato de formalina para la evaluación neuropatológica, como fue descrito (Vonsattel JP, Aizawa H, Ge P, et al. “An Improved Approach to Prepare Human Brains for Research,” J Neuropathol Exp Neurol (1995) 54: 42-56). Muestras de saliva no estimulada fueron recolectadas de todos los sujetos por lo menos 2-3 meses antes de la muerte de los sujetos. Los niveles de biomarcador salival IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, Alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa fueron medidos como se describe en el Estudio-1.

Resultados: Los niveles de biomarcador salival IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa fueron significativamente diferentes en la AD (Cuadro 12) en comparación con los controles normales.

CUADRO 12 Los biomarcadores salivales en la autopsia cerebral confirmaron la AD.

Conclusión: La cuantificación de los niveles de los biomarcadores salivales IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa sirven como biomarcadores útiles para el diagnóstico de los diferentes tipos deAD.

Estudio 12: Biomarcadores salivales v CSF en la historia materna de los individuos con activación tardía de ia enfermedad de Alzheimer Veinticinco (25) individuos cognoscitivamente normales con una historia materna de activación tardía de la enfermedad de Alzheimer fueron seleccionados como sujetos de prueba en este estudio. Los sujetos de prueba fueron sometidos a exámenes clínicos, neuropsicológicos, de MRI y de punción lumbar y los biomarcadores de saliva fueron medidos dentro de un periodo de 3 meses.

El examen neuropsicológico fue realizado usando la batería de pruebas neuropsicológicas y la Escala de Deterioro Global (De Santi S, Pirraglia E, Barr WB, Babb J, Williams S, Rogers K, et al. Robust and conventional neuropsychological norms: Diagnosis and prediction of age-related cognitive decline. Neuropsychology. 2008; 22:469—484; Reisberg B, Ferris SH, de León MJ, Crook T. The global deterioration scale for assessment of primary degenerative dementia. Am J Psychiat. 1982; 139:1136-1139 ).

El examen de CSF fue realizado de la siguiente manera. Los 20 cc de CSF transparente se recolectaron usando fluoroscopía para guiar una aguja biselada LP de calibre 24. El CSF Ab1-40 y Ab1-42 fue medido (Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, Andreasson U, Londos E, Minthon L, et al. Prediction of Alzheimer's disease using the CSF Abeta42/Abeta40 ratio in patients with mild cognitive impairment. Dement Geriatr Cogn Disord. 2007; 23:316-320.). Las mediciones de CSF T-tau fueron realizadas de acuerdo con los metodos descritos en (Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, Londos E, Blennow K, Minthon L. Association between CSF biomarcadores and incipient Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment: a follow-up study. Lancet Neurol. 2006; 5:228-234.). Los especímenes de saliva entera no estimulada fueron recolectados y analizados para los biomarcadores salivales como para el Estudio 1 anterior. Se determinó la correlación entre Ab40, Ab42, Ab42/40 en la saliva y se determinó el CSF. Los datos fueron analizados usando SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, MI).

CUADRO 13: Datos demográficos. CSF y biomarcadores salivales en sujetos con una historia materna de activación tardía de la enfermedad de Alzheimer.

Valor medio (Desviación estándar) Se encontró una correlación significativa entre CSF y los biomarcadores salivales (r2=0.82 a 0.93). Los niveles de los biomarcadores salivales se encontraron fuera del intervalo sano normal (como se muestra en el Cuadro: 2). Entonces, estos biomarcadores son útiles para la detección del riesgo de AD y la detección de una historia familiar de AD.

Conclusiones: Los IGF-!, IGF-II, Ab-40, Ab-42, Alfa Amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa salivales sirven como biomarcadores útiles para la detección del riesgo de AD y la detección de una historia familiar de AD.

Metodos de Prueba en Campo Con base en los estudios discutidos antes, pueden usarse los métodos de prueba en precisos de campo por los practicantes para diagnosticar la AD y PD en campo. Todos los métodos tienen en común los pasos de probar una muestra de saliva para niveles de dos o más de un grupo de biomarcadores que consisten en IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa, luego determinar que la muestra de saliva es positiva si los niveles del grupo de biomarcadores pasa dos o más criterios en un grupo de criterios de prueba. Para una prueba de AD, los criterios de prueba son si los niveles de biomarcadores probados están por arriba o debajo (dependiendo del biomarcador) de los niveles de referencia del biomarcador. En algunas modalidades, los niveles de referencia son esos descritos en el Cuadro 4. En otras modalidades, los niveles de referencia pueden ser cualquier valor en un intervalo de ± 10% alrededor de los niveles de referencia descritos en el Cuadro 4. Para una prueba de PD, los criterios de prueba es cuando los niveles probados de los biomarcadores caen dentro de un intervalo de ± 10% alrededor de los valores promedio del biomarcador para la PD descrita en el Cuadro 4. De manera similar, para una prueba de AD grave AD, los criterios de prueba es cuando los niveles probados de los biomarcadores caen dentro de un intervalo de ± 10% alrededor de los valores promedio del biomarcador para AD grave descrito en el Cuadro 4.

Kits de prueba en campo Los kits de prueba en campo que realizan los metodos de prueba de campo pueden formarse en varias maneras. Una modalidad de un kit de prueba en campo tiene un conjunto de tiras de prueba y un dispositivo de lectura. El conjunto de tiras de prueba tiene un tipo de tiras de prueba para cada biomarcador en un grupo de biomarcadores a ser probados, tales como los biomarcadores en el Cuadro 3. Cada tipo de tira de prueba está configurada para producir un nivel de fluorescencia proporcional a un nivel presente en la tira de prueba de uno de los grupos de biomarcadores. El dispositivo de lectura está configurado para leer los niveles de fluorescencia en cada una de las tiras de prueba y está configurado para indicar un resultado positivo cuando los nieles de fluorescencia de cada una de las tiras de prueba son niveles de fluorescencia de las tiras de prueba expuestas a una muestra de saliva con niveles de un grupo de biomarcadores en la muestra de saliva que pasa uno o más criterios en un grupo de criterios de prueba. Los criterios de prueba pueden ser los criterios de prueba descritos en los métodos de prueba en campo en lo anterior.

Los expertos en la téenica reconocerán que numerosas modificaciones y cambios pueden realizarse a la modalidad preferida sin separarse del alcance de la invención reclamada. Se entenderá, por supuesto, que las modificaciones de la invención, en sus varios aspectos, serán evidentes para los expertos en la teenica, algunas siendo evidentes sólo después del estudio, otras siendo materia de rutina del diseño mecánico, químico y electrónico. Ninguna característica, función o propiedad únicas de la modalidad preferida es esencial. Son posibles otras modalidades, sus diseños específicos dependen de la aplicación particular. Como tal, el alcance de la invención no deberá limitarse a las modalidades particulares en la presente sino que deberán ser definidas únicamente por las reivindicaciones anexas y los equivalentes de las mismas.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para probar para la enfermedad de Alzheimer, que comprende los pasos de: probar una muestra de saliva para niveles de uno o más de un grupo de biomarcadores que consiste de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa; y determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer si los niveles del grupo de biomarcadores pasan dos o más criterios en un grupo de criterios de prueba que consiste en: nivel de Ab-40 inferior a un nivel de referencia de Ab-40, nivel de TNF-alfa superior a un nivel de referencia de TNF-alfa, nivel de IL-1 beta superior a un nivel de referencia de IL-1 beta, nivel de Ab-42 superior a un nivel de referencia de Ab-42, nivel de IGF-I inferior a un nivel de referencia de IGF-I, nivel de IGF-II inferior a un nivel de referencia de IGF-II, y nivel de alfa-amilasa superior a un nivel de referencia de alfa-amilasa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque: el nivel de referencia deAb-40 está entre 10.8 y 13.2 mg/ml, el nivel de referencia de TNF-alfa está entre 154.8 y 189.2 pg/ml, el nivel de referencia de IL-1 beta está entre 135 y 165 pg/ml, el nivel de referencia de Ab-42 está entre 4.68 y 5.72 pg/ml, el nivel de referencia de IGF-I está entre 1.56 y 1.9 ng/ml, el nivel de referencia de IGF-II está entre 0.56 y 0.68 ng/dl, y el nivel de referencia de alfa-amilasa está entre 28.8 y 35.2 U/ml.

3. El metodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer comprende adicionalmente determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer si los niveles del grupo de biomarcadores pasan todos los criterios en el grupo de criterios de prueba.

4. Un método para probar para la enfermedad de Alzheimer grave, que comprende los pasos de: probar una muestra de saliva para niveles de uno o más de un grupo de biomarcadores que consiste de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa; y determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer grave si los niveles del grupo de biomarcadores pasan dos o más criterios en un grupo de criterios de prueba que consiste en: un nivel de Ab-40 está entre 5.20 y 6.36 pg/ml, un nivel de TNF-alfa está entre 310.8 y 379.8 mg/ml, un nivel de IL-1 beta está entre 212.1 y 259.2 pg/ml, un nivel de Ab-42 está entre 13.9 y 17.0 pg/ml, un nivel de IGF-I está entre 0.60 y 0.74 ng/ml, un nivel de IGF-II está entre 0.50 y 0.62 ng/dl, y un nivel de Alfa-amilasa está entre 81.1 y 99.1 U/ml.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer grave comprende adicionalmente determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer grave si los niveles del grupo de biomarcadores pasan todos los criterios en el grupo de criterios de prueba.

6. Un método para probar para la enfermedad de Alzheimer moderada, que comprende los pasos de: probar una muestra de saliva para niveles de uno o más de un grupo de biomarcadores que consiste de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab-42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa; y determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer moderada si los niveles del grupo de biomarcadores pasan dos o más criterios en un grupo de criterios de prueba que consiste en: un nivel de Ab-40 está entre 9.88 y 12.08 mg/ml, un nivel de TNF-alfa está entre 208.31 y 254.6 pg/ml, un nivel de IL-1 beta está entre 177 y 216 pg/ml, un nivel de Ab-42 está entre 8.90 y 10.9 pg/ml, un nivel de IGF-I está entre 1.40 y 1.72 ng/ml, un nivel de IGF-II está entre 0.97 y 1.19 ng/dl, y un nivel de Alfa-amilasa está entre 61.4 y 75.0 U/ml.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer moderada comprende adicionalmente determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer moderada si los niveles del grupo de biomarcadores pasan todos los criterios en el grupo de criterios de prueba.

8. Un método para probar para la enfermedad de Parkinson, que comprende los pasos de: probar una muestra de saliva para niveles de uno o más de un grupo de biomarcadores que consiste de IGF-I, IGF-II, Ab-40, Ab- 42, alfa amilasa, IL-1 beta, y TNF-alfa; y determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Parkinson si los niveles del grupo de biomarcadores pasan dos o más criterios en un grupo de criterios de prueba que consiste en: un nivel de referencia de Ab-40 está entre 21.2 y 25.9 mg/ml, un nivel de referencia de TNF-alfa está entre 71.9 y 87.9 pg/ml, un nivel de referencia de IL-1 beta está entre 60.8 y 74.3 pg/ml, un nivel de referencia de Ab-42 está entre 5.2 y 6.4 pg/ml, un nivel de referencia de IGF-1 está entre 1.68 y 2.06 ng/ml, un nivel de referencia de IGF-II está entre 2.21 y 2.69 ng/dl, y un nivel de referencia de Alfa-amilasa está entre 34.9 y 42.7 U/ml.

9. El metodo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Parkinson comprende adicionalmente determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Parkinson si los niveles del grupo de biomarcadores pasan todos los criterios en el grupo de criterios de prueba.

10. Un kit de prueba que comprende: una pluralidad de tiras de prueba, cada una configurada para producir un nivel de fluorescencia proporcional a un nivel presente en la tira de prueba de uno de un grupo de biomarcadores; y un dispositivo de lectura configurado para leer los niveles de fluorescencia en cada una de las tiras de prueba y está configurado para indicar un resultado positivo cuando los nieles de fluorescencia de cada una de las tiras de prueba son niveles de fluorescencia de tiras de prueba expuestas a una muestra de saliva con niveles de un grupo de biomarcadores en la muestra de saliva que pasan uno o más criterios en un grupo de criterios de prueba que consiste en: nivel de Ab-40 inferior a un nivel de referencia de Ab-40, nivel de TNF-alfa superior a un nivel de referencia de TNF-alfa, nivel de IL-1 beta superior a un nivel de referencia de IL-1 beta, nivel de Ab-42 superior a un nivel de referencia de Ab-42, nivel de IGF-I inferior a un nivel de referencia de IGF-I, nivel de IGF-II inferior a un nivel de referencia de IGF-II, y nivel de alfa-amilasa superior a un nivel de referencia de alfa-amilasa.

11. El kit de prueba de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque: el nivel de referencia deAb-40 está entre 10.8 y 13.2 mg/ml, el nivel de referencia de TNF-alfa está entre 154.8 y 189.2 pg/ml, el nivel de referencia de IL-1 beta está entre 135 y 165 pg/ml, el nivel de referencia de Ab-42 está entre 4.68 y 5.72 pg/ml, el nivel de referencia de IGF-I está entre 1.56 y 1.9 ng/ml, el nivel de referencia de IGF-II está entre 0.56 y 0.68 ng/dl, y el nivel de referencia de alfa-amilasa está entre 28.8 y 35.2 U/ml.

12. El kit de prueba de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque la tira de prueba está configurada adicionalmente para cambiar sólo si los niveles del grupo de biomarcadores en la muestra de saliva pasan todos los criterios en el grupo de criterios de prueba.

13. Un metodo para probar para la enfermedad de Alzheimer, que comprende los pasos de: probar una muestra de saliva para los niveles de Ab-40 y Ab-42; y determinar que la muestra de saliva es positiva para la enfermedad de Alzheimer si una proporción de nivel de Ab-40 a nivel de Ab-42 es superior a una proporción de referencia.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la proporción de referencia es por lo menos 3.

15. Un kit de prueba que comprende: una pluralidad de tiras de prueba, cada una configurada para producir un nivel de fluorescencia proporcional a un nivel presente en la tira de prueba de uno de un grupo de biomarcadores; y un dispositivo de lectura configurado para leer los niveles de referencia en cada una de las tiras de prueba y está configurado para indicar un resultado positivo cuando los niveles de fluorescencia de cada una de las tiras de prueba son niveles de fluorescencia de las tiras de prueba expuestas a una muestra de saliva con una proporción de nivel de Ab-40 a nivel de Ab-42 superior a una proporción de referencia de por lo menos 3.