KR102496399B1 - 해조류 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
해조류 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Abstract
본 발명은 해조류 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 감태와 톳 추출물은 MUC5AC, COX-2, 및 MMP-9의 저해활성이 모두 높은 효과를 나타내는 바, 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 감태와 톳 추출물은 MUC5AC, COX-2, 및 MMP-9의 저해활성이 모두 높은 효과를 나타내는 바, 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 감태 및 톳의 유효성분을 포함한 천연물 추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 감태와 톳 추출물은 추출물은 MUC5AC, COX-2, 및 MMP-9의 저해활성이 모두 높은 효과를 나타내는 바, 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
현대사회에 환경오염과 미세먼지 등으로 인한 대기오염의 수준이 심각해짐에 따라 호흡기 질환의 유병률도 날로 증가하고 있다. 매연, 공해 등으로 인한 도시공기질 악화, 화학물질, 미세먼지 등은 현대인들의 호흡기질환이 증가되는 환경적 요인들이다. 특히, 미세먼지는 호흡기 질환을 유발하고, 기존 호흡기질환을 보다 심각한 폐질환으로 악화시킬 우려가 있다. 폐 기능이 떨어지는 유아나 노인은 더욱 취약 할 수밖에 없어서 이러한 호흡기 기도 질환의 증가는 세계적인 주요 보건문제가 되고 있다.
기관지 상피세포의 증식 및 기도 점액의 과도한 분비는 현재 천식, 만성폐쇄성폐질환 (COPD) 및 만성기관지염을 앓고 있는 많은 환자에서 나타나는 중요한 병리학적 특징이다. 정상적인 점액은 외부로부터 들어오는 병원체, 미생물, 화학물질 및 입자의 유입을 막아 기도의 보호역할을 한다. 그러나, 만성 호흡기 질환에서 기도 점액의 비정상적인 분비는 상피세포의 섬모운동성과 기도의 방어기능을 떨어뜨려 호흡기로 들어온 외부인자 및 박테리아의 배출이 어려워지고 오랫동안 머물게 하여 증식을 심화한다. 그것은 또 다른 감염에 위험을 증가시킨다. 점액은 여러가지 단백질을 포함하고 있는데 그 성상을 결정하는 것은 점액 내의 mucin이다. 뮤신은 뮤신 유전자에 의해 균형을 맞춘다. 현재 사람에게서 발견된 뮤신 중 MUC5AC는 특히 기관지 염증에서 분비되는 병리적 점액유전자로 기도 점막의 배 세포에서 주로 관찰된다. 겔 형성 뮤신으로 천식을 포함한 만성기관지염, COPD, 폐 섬유증 등 호흡기 질환자의 기도에서 증가되는 것이 확인되었다. 중증의 천식은 점액 및 분비된 점액 증가와 관련이 있으며 겔 형성 뮤신 중에서 MUC5AC가 가장 높은 수준으로 발현되어 MUC5AC의 생산은 호흡기 질환의 병인과 관련이 있는 것으로 보고 있다.
폐 염증 과정에는 interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 proinflammatory cytokine의 생성 및 프로스타그란딘 생합성에 관여하는 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 증가가 종종 관찰된다. 폐 염증이 지속되면 단백질 분해 효소 등을 분비하여 상피 기저막을 비롯한 세포외 기질을 파괴함으로써 생긴 기저막의 틈으로 섬유모세포를 비롯한 간질 세포들이 폐포강내로 이동하여 세포 외 기질의 생성과 침착을 유도, 폐포내의 섬유화 병소 (intraalveolar fibrosis)를 형성하는데 이는 폐포의 폐쇄 (obliteration)와 허탈 (collapse)을 초래하여 정상 폐 구조의 변형을 일으켜서 말기 폐섬유화, 즉 벌집모양 폐 (honeycomb lung)에 이른다. 세포외 기질이 끊임없이 생성되고 분해되면서도 정확한 생리학적 항상성을 유지하는 데에는 세포외 기질 분해 효소인 matrix metalloproteinase (MMP)의 작용이 중요하다. 특히 MMP-9은 92-kDa gelatinase B로 불리기도 하며, 기저막의 주성분인 collagen type IV를 분해함으로써 기저막의 파괴와 변형을 유발하여 폐 섬유화에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
천연물 기능성 소재들은 오랜 기간의 경험을 근거로 생리활성 효능이 검증되었고, 낮은 부작용이 있다는 장점이 있다. 이를 바탕으로 천연물 기능성 소재로부터 생리활성 물질을 탐색하여 질병의 예방 및 효과를 갖는 제품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 천연물 복합 소재는 천연물로 구성된 여러 물질의 복합적인 구성이므로 다양한 성분이 복합적으로 광범위한 효능을 나타낼 수 있으며, 추출 방법 또는 배합비에 따라 효능이 달라질 수 있다.
해양생물은 육상생물에 비하여 특유의 대사과정과 독특한 생육 환경으로 인하여 다양한 생리활성물질을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 최근엔 해양 동물, 해조류, 해양 미생 물 등 다양한 해양생물 유래 기능성 및 생리활성 물질에 대한 연 구가 진행되어 왔으며, 생리활성 물질에 관한 연구 결과를 토 대로 건강 기능성 식품 및 의약품 소재로 개발되고 있다. 해양생물 중에서도 해조류는 다양한 기능성 물질을 함유하고 있는 것으로 확인되어 식품, 화장품 및 의약품 소재 개발을 위한 유용한 자원 중 하나로 평가되고 있다. 감태(Ecklonia cava)는 다시마목 미역과에 속하는 갈조류의 일종으로, 한반도와 일본 등 온대 연안에 분포한다. 감태는 한국의 제주도에서 풍부하게 생산되며, 식품 첨가물, 가축 사료, 비료, 의약품 분야에서 널리 사용된다. 감태에는 carotenoid, fucoidan 및 phlorotannin 등의 성분들이 존재하는 것으로 알려져 있다. 최근 많은 연구에서 감태 추출물이 항산화, 항염증, 항알러지, 항암 등의 활성이 있는 것으로 보고되었다. 톳(Hizikia fusiformis)은 갈조류 모자반과에 속하며 형태는 원주상 줄기로 체장 20-100 cm까지 성장하는 다년생 해조류이다. 일반적으로 톳은 무기질과 다당류로 구성되어 있으며, 특히, 천연 정미성분인 아미노산(glutamic acid 및 aspartic acid)과 식이섬유 및 칼슘, 철, 요오드 같은 무기질, 비타민 등이 풍부한 식품으로 알려져 있다. 더구나, 톳은 항산화 효과, 항균성 효과, 항염증 효과 및 인간 피부 섬유아세포 보호 효과 등의 기능성 효과가 있다고 보고되어 있다. 감태와 톳의 일반적인 생리활성에 관한 연구는 발표되고 있지만 호흡기에 관련된 연구는 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 해조류 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 해조류 복합추출물에서 유효성분인 폴리페놀 및 플라보노이드를 추출함에 있어 우수한 추출성능을 나타내는 해조류 복합추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
감태 및 톳의 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
감태 및 톳의 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하는 단계;
1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척하는 단계;
2차 세척된 감태 및 톳을 48-52℃의 온도에서 2-4시간 동안 건조하는 단계;
건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하는 단계;
제조된 감태 분말 및 톳 분말을 1:1의 중량비율로 혼합한 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하는 단계;
1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 1차 혼합추출물을 제조하는 단계;
1차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 교반하면서 120℃의 온도에서 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하는 단계;
2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 제조하는 단계;
2차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 여기에 [BMIm][TFSI](1-Butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imide)를 2-3 g 첨가한 후 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 3차 열수추출을 수행하는 단계; 및
3차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 3차 혼합추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 해조류 복합추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 감태와 톳의 해조류 복합추출물은 MUC5AC, COX-2, 및 MMP-9의 저해활성이 모두 높은 효과를 나타내는 바, 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 감태와 톳의 해조류 복합추출물을 제조하는 방법은 총 폴리페놀 함량이 247.48-251.60 mg/g이고, 총 플라보노이드 함량이 16.21-17.02 mg/g으로 매우 높은 함량을 나타낸다.
도 1은 NCI-H292와 A549 세포에서 해조류 복합 추출물의 세포독성을 분석한 그래프로, (A)는 NCI-H292 세포를 추출물(0, 50, 100, 250 및 250 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 것이고, (B)는 A549 세포를 추출물(0, 50, 100, 250 및 250 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 것이며, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며, *P < 0.05, ** P < 0.01, and *** P < 0.001 대조군과 비교하였다.
도 2는 NCI-H292 세포에서 해조류 복합 추출물의 MUC5AC 발현 저해 활성을 분석한 그래프로, SD-EH 추출물로 처리한 NCI-H292 배양액에서 RNA를 추출하고 RT-PCR로 MUC5AC 및 Rig/S15의 유전자 발현을 분석한 것이고, 증폭된 산물은 1.2% 아가로스-에티듐 브로마이드 겔에서 실행되었으며, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며, ###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
도 3은 PMA로 유도된 A549 세포에서 해조류 복합 추출물의 COX-2 단백질 발현 저해 효과를 분석한 그래프로, 세포(5×105 cells/plate)를 24시간 동안 사전 인큐베이션 한 다음, PMA(10 nM) 및 샘플로 24시간 동안 처리하였으며, COX-2의 단백질 수준은 Western blot으로 조사하였고, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며,###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
도 4는 PMA로 유도된 A549 세포에서 해조류 복합 추출물의 MMP-9 단백질 발현 저해 효과를 분석한 그래프로, 세포(5×105 cells/plate)를 24시간 동안 사전 인큐베이션 한 다음, PMA(10 nM) 및 샘플로 24시간 동안 처리하였으며, MMP-9의 단백질 수준은 Western blot으로 조사하였고, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며,###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
도 2는 NCI-H292 세포에서 해조류 복합 추출물의 MUC5AC 발현 저해 활성을 분석한 그래프로, SD-EH 추출물로 처리한 NCI-H292 배양액에서 RNA를 추출하고 RT-PCR로 MUC5AC 및 Rig/S15의 유전자 발현을 분석한 것이고, 증폭된 산물은 1.2% 아가로스-에티듐 브로마이드 겔에서 실행되었으며, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며, ###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
도 3은 PMA로 유도된 A549 세포에서 해조류 복합 추출물의 COX-2 단백질 발현 저해 효과를 분석한 그래프로, 세포(5×105 cells/plate)를 24시간 동안 사전 인큐베이션 한 다음, PMA(10 nM) 및 샘플로 24시간 동안 처리하였으며, COX-2의 단백질 수준은 Western blot으로 조사하였고, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며,###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
도 4는 PMA로 유도된 A549 세포에서 해조류 복합 추출물의 MMP-9 단백질 발현 저해 효과를 분석한 그래프로, 세포(5×105 cells/plate)를 24시간 동안 사전 인큐베이션 한 다음, PMA(10 nM) 및 샘플로 24시간 동안 처리하였으며, MMP-9의 단백질 수준은 Western blot으로 조사하였고, 세 번의 독립적인 실험의 평균 값을 표시한 것으로 모든 데이터는 실험의 평균 ± SD로 표시되며,###P < 0.001 대조군과 비교하고, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001 PMA 대조군과 비교하였다.
본 발명은
감태 및 톳의 복합추출물을 유효성분으로 하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 감태 및 톳의 해조류 복합추출물은 MUC5AC, COX-2, 및 MMP-9의 저해활성이 모두 높은 효과를 나타내는 바, 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
상기 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한, 본 발명은
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하는 단계;
1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척하는 단계;
2차 세척된 감태 및 톳을 48-52℃의 온도에서 2-4시간 동안 건조하는 단계;
건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하는 단계;
제조된 감태 분말 및 톳 분말을 1:1의 중량비율로 혼합한 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하는 단계;
1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 1차 혼합추출물을 제조하는 단계;
1차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 교반하면서 120℃의 온도에서 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하는 단계;
2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 제조하는 단계;
2차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 여기에 [BMIm][TFSI](1-Butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imide)를 2-3 g 첨가한 후 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 3차 열수추출을 수행하는 단계; 및
3차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 3차 혼합추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 해조류 복합추출물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 1차 세척하는 단계, 2차 세척하는 단계, 건조하는 단계 및 감태 분말 및 톳 분말을 제조하는 단계를 포함하는 추출을 위한 원료를 준비하는 단계를 포함한다.
상기 1차 세척하는 단계는, 감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 수행된다.
상기 2차 세척하는 단계는, 1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 수행된다.
상기 건조하는 단계는, 2차 세척된 감태 및 톳을 48-52℃의 온도에서 2-4시간 동안 수행된다.
상기 감태 분말 및 톳 분말을 제조하는 단계는, 건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 수행된다.
상기와 같은 추출을 위한 원료를 준비하는 단계를 수행함으로써 추출을 위한 원료인 감태와 톳의 이물질을 완전히 제거하고, 감태와 톳을 자극하여 후단의 열수추출에서 더욱 높은 추출성능을 발휘할 수 있도록 한다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 제조된 감태 분말 및 톳 분말을 1:1의 중량비율로 혼합한 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 열수추출을 다단계로 수행함으로써 추출효율 또는 추출성능을 향상시키고자 하며, 이를 위해 상기 단계에서는 1차 열수추출을 진행한다.
상기 1차 열수추출은 80℃의 온도에서 10시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 1차 열수추출은 80℃의 온도에서 10시간 동안 수행함으로써 2차 열수추출 시 추출효율 또는 추출성능을 극대화시켜 높은 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 나타내는 복합추출물을 제조할 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 1차 혼합추출물을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 단계에서는 1차 열수추출 후, 여과지로 여과하고, 여과하여 얻어지는 여액은 동결건조하여 1차 혼합추출물을 제조한다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 1차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 교반하면서 120℃의 온도에서 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 단계에서는 1차 열수추출 후, 여과지로 여과하고, 남은 고형물은 다시 물과 혼합하여 2차 열수추출을 수행한다.
상기 2차 열수추출은 120℃의 온도에서 12시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 2차 열수추출은 120℃의 온도에서 12시간 동안 수행함으로써 1차 열수추출 후 얻어지는 고형물에서 유효성분을 더욱 높은 함량으로 추출할 수 있게 된다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 단계에서는 2차 열수추출 후, 여과지로 여과하고, 여과하여 얻어지는 여액은 동결건조하여 2차 혼합추출물을 제조한다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 2차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 여기에 [BMIm][TFSI](1-Butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imide)를 2-3 g 첨가한 후 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 3차 열수추출을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 3차 열수추출을 수행하는 단계는 첨가제로 [BMIm][TFSI]를 추가하는 것이 바람직하다. 상기 1차 열수추출 및 2차 열수추출을 통해 추출효율 또는 추출성능을 극대화시켜 대부분의 유효성분을 추출하였으나, 2차 열수추출 후 고형물에게서 남아있는 여분의 유효성분을 더욱 끌어내기 위해 단순히 물만을 이용한 열수추출이 아닌 첨가제를 적용하여 더욱 효율을 높였다.
상기 3차 열수추출을 수행하는 단계는 첨가제로 [BMIm][TFSI]를 2-3 g 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 상기 첨가제를 2-3 g 첨가함으로써 추출효율 또는 추출성능을 극대화시킬 수 있으며, 과량 사용하지 않아 경제적이다.
상기 3차 열수추출은 80℃의 온도에서 10시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 공정온도 및 공정시간 동안 수행함으로써 감태 및 톳의 혼합물의 유효성분을 대부분 끌어내어 복합추출물에 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 극대화시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법은 3차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 3차 혼합추출물을 제조하는 단계를 포함한다.
상기 단계에서는 3차 열수추출 후, 여과지로 여과하고, 여과하여 얻어지는 여액은 동결건조하여 3차 혼합추출물을 제조한다.
제조된 1차 혼합추출물, 2차 혼합추출물 및 3차 혼합추출물을 모두 모아 추출성분을 분석함으로써, 본 발명에 따른 해조류 복합추출물의 제조방법으로 추출된 톳 추출물의 총 폴리페놀 함량이 247.48-251.60 mg/g이고, 총 플라보노이드 함량이 16.21-17.02 mg/g으로 매우 높은 함량을 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
1) 원료 혼합분말과 물의 혼합비율에 대하여
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하고, 1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척한 후, 2차 세척된 감태 및 톳을 50℃의 온도에서 3시간 동안 건조하였다. 건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하였다.
상기 감태 분말 및 톳 분말을 1:1의 중량비율로 혼합한 혼합분말 10 g, 15 g, 20 g 및 25 g을 각각 준비하여 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 열수추출을 수행하였다.
열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액을 동결건조하여 추출물을 얻었다.
제조된 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였으며, 구체적으로, 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 방법을 응용하여 측정하였고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 혼합 분말(g) | 총 폴리페놀 함량(mg/g) | 총 플라보노이드 함량(mg/g) | |
| 실시예 1-1 | 10 | 80.52 | 5.67 |
| 실시예 1-2 | 15 | 112.46 | 7.40 |
| 실시예 1-3 | 20 | 125.85 | 7.98 |
| 실시예 1-4 | 25 | 118.23 | 7.53 |
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 혼합분말 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml인 경우(실시예 1-3의 혼합분말 20 g을 적용한 경우), 총 폴리페놀 함량 125.85 mg/g 및 총 플라보노이드 함량 7.98 mg/g으로 가장 우수함을 확인할 수 있다.
2) 열수추출 공정온도 및 공정시간에 대하여
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하고, 1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척한 후, 2차 세척된 감태 및 톳을 50℃의 온도에서 3시간 동안 건조하였다. 건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하였다.
상기 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃, 100℃ 및 120℃의 온도에서 8시간, 10시간, 12시간 및 24시간 동안 열수추출을 수행하였다.
열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액을 동결건조하여 추출물을 얻었다.
제조된 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였으며, 구체적으로, 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 방법을 응용하여 측정하였고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 공정온도(℃) | 공정시간(시간) | 총 폴리페놀 함량 (mg/g) |
총 플라보노이드 함량 (mg/g) |
|
| 실시예 2-1 | 80 | 8 | 112.47 | 6.67 |
| 실시예 2-2 | 80 | 10 | 125.85 | 7.98 |
| 실시예 2-3 | 80 | 12 | 124.42 | 7.53 |
| 실시예 2-4 | 80 | 24 | 124.57 | 7.78 |
| 실시예 2-5 | 100 | 8 | 115.77 | 7.04 |
| 실시예 2-6 | 100 | 10 | 127.42 | 8.04 |
| 실시예 2-7 | 100 | 12 | 126.82 | 7.98 |
| 실시예 2-8 | 120 | 8 | 104.38 | 6.72 |
| 실시예 2-9 | 120 | 10 | 113.27 | 6.90 |
| 실시예 2-10 | 120 | 12 | 110.76 | 6.89 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 열수추출시 공정온도 80-100℃ 및 공정시간 10-12시간인 경우와 총 폴리페놀 함량 124.42-127.42 mg/g 및 총 플라보노이드 함량 7.53-8.04 mg/g으로 우수한 것을 확인할 수 있었다.
다만, 120℃로 증가시킨 경우 오히려 감소하는 경향을 나타냄을 확인할 수 있다. 또한, 열수추출시 공정온도가 80℃이고, 공정시간을 12-24시간으로 늘릴 경우 큰 변화가 없음을 확인하였고, 이에 따라 열수추출시 공정온도가 80-100℃인 경우 공정시간이 10-12시간인 것이 가장 우수한 추출효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
3) 다단계 열수추출 공정온도 및 공정시간에 대하여
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하고, 1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척한 후, 2차 세척된 감태 및 톳을 50℃의 온도에서 3시간 동안 건조하였다. 건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하였다.
상기 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃ 및 100℃의 온도에서 8시간 및 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하고, 80℃, 100℃ 및 120℃의 온도에서 8시간, 10시간 및 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 공정온도 및 공정시간 동안 1차 열수추출을 수행하고, 1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액은 동결건조하여 1차 혼합추출물을 얻고, 여과지로 여과된 고형물은 다시 물과 혼합하되 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml로 혼합하고, 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 공정온도 및 공정시간 동안 2차 열수추출을 수행하고, 2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 얻고, 1차 추출물 및 2차 추출물을 합쳐 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.
제조된 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였으며, 구체적으로, 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 방법을 응용하여 측정하였고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 1차 열수추출 | 2차 열수추출 | 총 폴리페놀 함량 (mg/g) |
총 플라보노이드 함량 (mg/g) |
|||
| 공정온도 (℃) |
공정시간 (시간) |
공정온도 (℃) |
공정시간 (시간) |
|||
| 실시예 3-1 | 80 | 8 | 80 | 10 | 132.67 | 8.57 |
| 실시예 3-2 | 80 | 10 | 100 | 10 | 169.86 | 11.86 |
| 실시예 3-3 | 80 | 10 | 120 | 10 | 198.30 | 12.15 |
| 실시예 3-4 | 80 | 10 | 120 | 12 | 209.54 | 13.50 |
| 실시예 3-5 | 100 | 10 | 80 | 10 | 149.76 | 9.87 |
| 실시예 3-6 | 100 | 10 | 100 | 10 | 192.46 | 11.67 |
| 실시예 3-7 | 100 | 10 | 120 | 10 | 196.61 | 12.05 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 1차 열수추출 및 2차 열수추출을 하는 경우 추출효율이 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다. 더욱이, 1차 열수추출의 공정온도가 80℃ 및 공정시간이 10시간이고, 2차 열수추출의 공정온도가 120℃ 및 공정시간이 12시간인 경우 총 폴리페놀 함량 209.54 mg/g 및 총 플라보노이드 함량 13.50 mg/g으로 매우 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
1차 열수추출 시 100℃의 온도에서 10시간 동안 수행하는 것이 추출성능이 약간 높았으나, 2차 열수추출을 수행하는 경우, 1차 열수추출을 100℃의 온도에서 10시간 동안 수행하고 2차 열수추출을 80-120℃의 온도에서 8-12시간 동안 수행하는 경우에 비해 1차 열수추출을 80℃의 온도에서 8시간 동안 수행하고 2차 열수추출을 120℃의 온도에서 10시간 동안 수행하는 경우 우수한 추출성능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 1차 열수추출 시 바로 고온에서 수행하는 경우 높은 추출성능을 나타낼 수는 있으나, 다단계 열수추출 공정을 수행하는 경우 1차 열수추출을 상대적 저온인 80℃의 온도에서 수행하고, 이어 2차 열수추출을 상대적 고온인 120℃의 온도에서 수행함으로써 감태 및 톳에 포함된 유효성분의 추출을 극대화시키는 것으로 확인된다.
4) 다단계 열수추출 공정에 첨가제를 첨가하는 것에 대하여
감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하고, 1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척한 후, 2차 세척된 감태 및 톳을 50℃의 온도에서 3시간 동안 건조하였다. 건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하였다.
상기 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하고, 120℃의 온도에서 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하고, 80℃의 온도에서 12시간 동안 3차 열수추출을 진행하였다. 구체적으로, 1차 열수추출하고, 1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액은 동결건조하여 1차 혼합추출물을 얻고, 여과지로 여과된 고형물은 다시 물과 혼합하되 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml로 혼합하여 2차 열수추출하고, 2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 얻고, 여과지로 여과된 고형물은 다시 물과 혼합하되 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml로 혼합하고, 여기에 첨가제로 [BMIm][TFSI](1-Butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imide)를 1 g, 2 g, 3 g, 4 g 및 5 g을 첨가한 후 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 3차 열수추출하고, 3차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음, 그 여액을 동결건조하여 3차 혼합추출물을 얻고, 1차 혼합추출물, 2차 혼합추출물 및 3차 혼합추출물을 합쳐 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.
제조된 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였으며, 구체적으로, 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 방법을 응용하여 측정하였고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 첨가제 함량(g) | 총 폴리페놀 함량(mg/g) | 총 플라보노이드 함량(mg/g) | |
| 실시예 4-1 | 1 | 215.82 | 13.88 |
| 실시예 4-2 | 2 | 247.48 | 16.21 |
| 실시예 4-3 | 3 | 251.60 | 17.02 |
| 실시예 4-4 | 4 | 230.46 | 15.98 |
| 실시예 4-5 | 5 | 220.50 | 14.02 |
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 3차 열수추출을 진행하되, 첨가제로 [BMIm][TFSI]를 적용하여 톳으로부터 유효성분 추출을 극대화시켰다. 첨가제 함량이 1 g인 경우 3차 열수추출을 더 수행하여도 추가로 추출되는 유효성분 함량이 미미하였으나, 2-3 g을 추가하는 경우 총 폴리페놀 함량 247.48-251.60 mg/g 및 총 플라보노이드 함량 16.21-17.02 mg/g로 매우 높은 추출효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 반면, 첨가제를 더 첨가하여도 추출이 더이상 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 첨가제를 과량 사용하는 경우 경제적인 추출방법이 되지 않아 첨가제는 2-3 g 도입하여 3차 열수추출을 진행하는 것이 바람직한 것임을 확인하였다.
<실시예 2>
재료
추출에 사용된 감태(Ecklonia cava)는 제주도에 위치한 명성물산에서 구입하여 사용하였으며, 톳(Hizikia fusiformis)은 완도에 위치한 ㈜바다명가에서 구입하여 실험에 사용하였다. 주정은 주정판매월드(Jeonju-si, Jeollabuk-do, Korea)에서, 부형제인 덱스트린은 Roquette사(Lestrem, France)에서 각각 구입하였다.
복합 추출물 제조
감태추출물과 톳주정추출물은 ㈜에스앤디(Cheongju-si, Chungcheongbuk-do, Korea)에서 대량생산시스템으로 제조한 것을 공급받아 사용하였다.
감태추출물은 건조된 감태 440kg을 탱크에 투입하고 이물 제거를 위하여 침지 세척하였다. 세척된 감태는 70% 주정 용매를 첨가하여 추출하였고 추출액은 cartridge filter를 이용하여 여과 후 감압 농축하였다. 농축액을 정제한 다음 이 정제액에 부형제를 배합 후 분무건조하여 감태추출물(SD-EC-001)을 제조하였다. 톳주정추출물은 구입한 건조톳 50kg을 탱크에 투입하고 이물 제거를 위하여 침지 세척하였으며 50% 주정 용매를 첨가하여 추출하였다. 추출액은 cartridge filter를 이용하여 여과 후 감압 농축하였으며 이 농축액에 부형제를 배합하고 분무건조하여 톳주정추출물 (SD-HF-001)을 제조하였다. 상기의 감태추출물과 톳주정추출물은 Table 1과 같은 배합비로 혼합하여 시료로 사용하였다.
| Extract combination | SD-EHA-001 | SD-EHB-001 | SD-EHC-001 | SD-EHD-001 | SD-EHE-001 | SD-EHF-001 |
| Ecklonia cava (E) | 100 | 90 | 80 | 70 | 60 | 0 |
| Hizikia fusiformis (H) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 100 |
상기 표 5는 SD-EH(감태 및 톳) 해조류 복합추출물 혼합물의 제형화를 나타낸 것이다.
인간 폐 상피 세포(Human lung epithelial cell 배양)
본 실험에서 사용한 NCI-H292 및 A549는 각각 human bronchial epithelial cell 및 human alveolar epithelial cell로 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 배지(Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)에 불활성화시킨 fetal bovine serum (FBS; Gibco) 를 10% 첨가하고, penicillin-streptomycin (Gibco) 100 units/mL을 첨가하여 사용하였다. 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양시켰으며, 3~4일 간격으로 계대 배양해주었다.
세포 독성 평가
SD-EH 추출물에 대한 NCI-H292 및 A549 세포의 세포 독성을 평가하기 위해 Carmichael 등의(18) 방법을 응용하여 세포생존율을 확인하였다. NCI-H292 및 A549 세포를 각각 1×104 cells/well과 5×103 cell/well로 96-well plate에 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 상층액을 제거한 후, SD-EH 추출물 (50, 100, 250, 500 μg/mL)을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후에 5 mg/mL 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT; Amresco, Solon Ind. Ohio, USA) 시약을 10 μL씩 첨가한 후, 4시간 후에 상층액을 제거하고 MTT 환원으로 의해 형성된 formazan을 DMSO를 사용하여 세포를 용해시켜 microplate spectrophotometer (xMarkTM, BIO-RAD, USA)를 이용하여 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
RT-PCR을 이용한 MUC5AC mRNA 발현 측정
NCI-H292 세포를 6-well plate에 5×105 cells/well씩 분주한 뒤, 24시간 후에 무혈청 배지 1 mL에 SD-EH 추출물을 최종 농도가 100 μg/mL이 되도록 전처리하고, 1시간 후 무혈청 배지에 PMA의 최종 농도가 100 nM이 되도록 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 배지를 제조하여 각 well에 1 mL씩 처리하고 다시 SD-EH 추출물을 동일한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. NCI-H292 세포에서 RNA를 분리하기 세포를 회수하여 Trizol reagent (Molecular Research Center, USA)로 RNA를 분리 후 NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, USA)을 이용하여 RNA를 정량하였다. 분리된 RNA 1 μg과 oligo DT (100 pM) 1 μL를 포함하여 총량이 12 μL 되도록 DEPC를 첨가한 다음 70℃에서 10분간 반응시켰다. 그리고 RT premix kit (Bioneer, USA)의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다. MUC5AC와 Rig/S15 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응에서 얻은 cDNA 산물 2 μl를 PCR premix kit (Bioneer)의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다. MUC5AC와 Rig/S15의 primer sequence는 Table 2와 같으며 증폭반응을 위하여, PCR을 40회 실시 (PCR thermal cycler, Takara MP-300, Japan) 하였으며, denaturation 은 94℃에서 30 s, annealing은 60℃에서 30 s, extension은 72℃에서 45 s간 각각 시행하였다. RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 cDNA 산물들을 ethidium bromide가 첨가된 1.2% agarose gel로 전기영동을 실시하여 분석하였다.
| Gene | Product size (bp) | Sequences | |
| MUC5AC | 458 | Forward | 5’-TGA TCA TCC AGC AGG GCT-3’ |
| Reverse | 5’-CCG AGC TCA GAGGAC ATA TGG G-3’ | ||
| Rig/S15 | 361 | Forward | 5’-TTC CGC AAG TTC ACC TAC C-3’ |
| Reverse | 5’-CGG GCC GGC CAT GCT TTA CG-3’ | ||
상기 표 6은 본 연구에 사용된 프라이머의 서열을 나타낸 것이다.
Western blot을 이용한 COX-2 및 MMP-9 발현 측정
A549 세포를 6-well plate에 5×105 cells/well씩 분주한 뒤, 24시간 후에 무혈청 배지 1 mL에 SD-EH 추출물을 최종 농도가 100 μg/mL이 되도록 전처리하고 1시간 후 FBS가 포함되지 않은 RPMI1640 배지를 사용하여 다시 세포를 세척한 후, 무혈청 배지에 PMA 최종 농도가 10 nM이 되도록 PMA 배지를 제조한 후, 각 well에 1 mL씩 처리하고 다시 SD-EH 추출물을 동일한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 회수하였다. 세포는 1 M Tris-HCl, pH 7.5, 5 M NaCl, 10% triton X-100 및 5% Deoxycholate, 100 mM PMSF, 10% SDS, 0.5 M EDTA, pH 8.0, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Protease Inhibitor Cocktail을 첨가한 lysis buffer를 첨가하여 30분 동안 10분 간격으로 vortex 한 후 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 후, 상층액에서 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 BCA assay를 이용하여 단백정량한 후, SDS-PAGE에서 100 V로 단백질을 크기별로 분리하여 nitrocellulose membrane에 300 mA로 90분 동안 transfer 하였다. 5% skim milk가 함유된 TBST (TBS containing 0.1% Tween 20)를 사용하여 상온에서 1시간 정도 blocking 하였다. TBST로 10분씩 3회 washing하고 각 COX-2와 MMP-9 1차 항체와 4℃에서 12시간 반응시킨 후 TBST로 10분간 3회 세척한 다음 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체를 상온에서 2시간 반응시켰다 그 후 TBST로 10분간 3회 세척한 다음 ECL (Enhanced chemiluminescence) kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 필름으로 현상하여 결과를 확인하였다. 또한 각각의 단백질 발현양은 image J program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 통해 수치화하여 graph로 나타내었다.
통계분석
모든 분석 자료는 평균 ± 표준오차 (means ± SD)로 나타내었으며, 실험결과는 GraphPad Prism® Version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 분산 분석 (ANOVA)으로 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다 (p < 0.05).
세포독성
SD-EH 추출물에 대한 호흡기 상피세포에서 MUC5AC 저해 및 호흡기 염증 억제 효과를 측정하기 전에 각 복합 배합별 추출물이 NCI-H292 및 A549 세포에 독성을 나타내는지를 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 먼저, NCI-H292 세포에서 SD-EH 추출물을 다양한 농도 (50, 100, 250, 500 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였을 때, SD-EFA-001 (E(100):H(0))의 경우 250 μg/mL에서부터 50% 내외의 세포생존율을 보였으나 SD-EHC-001 (E(80):H(20)), SD-EHD-001 (E(70):H(30)), SD-EHE-001 (E(60):H(40))의 복합물에서 세포독성이 완화되는 것을 확인하였다(도 1의 (A) 참조). A549 세포에서도 유사하게 SD-EFA-001의 경우 250 μg/mL에서부터 20% 내외의 세포생존율을 보였으나 SD-EHC-001, SD-EHD-001, SD-EHE-001의 복합물에서 세포독성이 완화되는 것을 확인하였다(도 1의 (B) 참조).
MUC5AC 유전자 발현 저해 효과
NCI-H292 세포에 SD-EH 추출물의 최종 농도를 100 μg/mL의 농도로 1시간 동안 전처리 후, PMA를 100 nM의 농도로 세포를 자극하여 24 시간 후, RT-PCR을 수행하여 MUC5AC mRNA 발현을 분석한 결과는 도 2에 나타내었다. PMA처리로 유도된 MUC5AC 발현이 SD-EH 추출물에 처리에 의해 감소되었으며, 특히, SD-EFA-001 (E(100):H(0)), SD-EHB-001 (E(90):H(10)), SD-EHC-001 (E(80):H(20)), SD-EHD-001 (E(70):H(30)) 추출물 처리에 의해 MUC5AC 발현이 현저히 감소되는 것을 확인하였다.
COX-2 단백질 발현 억제 효과
PMA로 활성화된 A549 cell에서 SD-EH 추출물에 의한 COX-2의 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해 western blot assay를 통해 COX-2 단백질 발현양을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. PMA (10 nM)로 자극시킨 A549 세포에 SD-EH 추출물을 100 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 COX-2 단백질 발현양을 확인한 결과 대조군에 비해서 PMA 단독 처리군에서 염증반응에 의해 COX-2 단백질 발현이 증가되었음을 확인하였고, 이에 비해 PMA와 SD-EHC-001 (E(80):H(20)), SD-EHD-001 (E(70):H(30)), SD-EHE-001 (E(60):H(40)), SD-EHF-001 (E(0):H(100))을 처리한 군들은 COX-2의 단백질 발현이 PMA 단독 처리군에 비해 p <0.001 수준으로 감소한 것을 확인 할 수 있었다.
MMP-9 단백질 발현 억제 효과
폐섬유화에 있어서도 초기 병변인 폐포염에서 기저막의 파괴와 이를 통한 간질 세포의 폐포강내이동, 그리고 폐포강내에서의 세포 외 기질의 축적으로 인한 폐포강내섬유화가 중요한 발생 기전인 점을 고려하여 볼 때 각각의 단계에서 MMP는 중요한 역할을 한다. PMA로 유도된 A549 세포에서 SD-EH 추출물의 MMP-9 저해 효과를 측정한 결과, SD-EHF-001 (E(0):H(100))을 처리한 군을 제외한 모든 군에서 MMP-9 발현이 PMA 단독 처리군에 비해 p <0.001 수준으로 감소한 것을 확인 할 수 있었다(도 4 참조).
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (2)
- 감태 및 톳을 액체 분사가 가능한 분사각이 60°인 노즐을 2개씩 3열로 6개 포함하는 세척장치를 이용해 식초물을 분사하여 1차 세척하는 단계;
1차 세척된 감태 및 톳을 8-10℃ 온도의 정제수를 이용하여 2차 세척하는 단계;
2차 세척된 감태 및 톳을 48-52℃의 온도에서 2-4시간 동안 건조하는 단계;
건조한 감태 및 톳을 영하 50℃의 온도에서 동결건조한 후, 분쇄하여 감태 분말 및 톳 분말을 제조하는 단계;
제조된 감태 분말 및 톳 분말을 1:1의 중량비율로 혼합한 혼합분말 20 g을 물 200 ml와 혼합하고, 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 1차 열수추출을 수행하는 단계;
1차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 1차 혼합추출물을 제조하는 단계;
1차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 교반하면서 120℃의 온도에서 12시간 동안 2차 열수추출을 수행하는 단계;
2차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 2차 혼합추출물을 제조하는 단계;
2차 열수추출 후 여과지로 여과한 다음 남은 고형물을 다시 물과 혼합하되, 고형물 및 물의 혼합비율이 0.1 g/ml가 되도록 혼합하고, 여기에 [BMIm][TFSI](1-Butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl)imide)를 2-3 g 첨가한 후 교반하면서 80℃의 온도에서 10시간 동안 3차 열수추출을 수행하는 단계;
3차 열수추출 후, 여과지로 여과한 다음 그 여액을 동결건조하여 3차 혼합추출물을 제조하는 단계; 및
상기 1차 혼합추출물, 상기 2차 혼합추출물 및 상기 3차 혼합추출물을 혼합하여 해조류 복합추출물을 제조하되, 상기 해조류 복합추출물은 총 폴리페놀 함량 247.48-251.60 mg/g이고, 총 플라보노이드 함량 16.21-17.02 mg/g인 것을 특징으로 하는 단계;를 포함하는 해조류 복합추출물의 제조방법. - 삭제
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| KR102627221B1 (ko) * | 2023-07-28 | 2024-01-19 | 주식회사 엄마와바다 | 생선 손질 후 남은 부위를 활용한 생선 분쇄육 제품 |
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