KR102485314B1 - 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 유산균 발효 시어버터와 이 과정에서 얻은 유산균 배양액으로부터 정제된 엑소좀으로 이루어지는 복합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항산화, 피부주름개선, 피부 유해균 억제 및 피부재생효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 유산균 발효 시어버터와 이 과정에서 얻은 유산균 발효 시어버터 배양액으로부터 정제된 엑소좀으로 이루어지는 복합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항산화, 피부주름개선, 피부 유해균 억제 및 피부재생효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.
화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하는 것으로 확장되어 왔다. 피부는 각종 환경오염과 스트레스에 노출되어 거칠어지고 건조해지며, 칙칙하게 보이는 등 피부 노화가 가속되고 있으며 이러한 현상은 피부의 수분공급 및 유지와도 밀접한 관련이 있다.
시어버터는 아프리카에서 자라는 시어트리 열매에서 추출된다. 시어버터는 비타민 A, E, F 등이 풍부하여 피부 노화방지에 효과적이고, 수분의 보호막 형성에 뛰어난 작용을 하고, 거칠고 건조한 피부를 촉촉하게 하는 보습이 뛰어나며, 이외에도 모발 건강, 항염, 항균 효과가 있다고 알려져 있다.
유산균은 일반적으로 당을 발효해 에너지를 얻고 이를 통해 젖산을 생성하는 균으로 사람에게 매우 유용한 미생물이다. 화장품에 사용되는 유산균은 피부 미생물의 성장과 조절에 영향을 줄 수 있는 소재이다. 이를 활용한 화장품은 피부에 존재하는 상재균에 긍정적인 영향을 줘 피부 마이크로바이옴의 균형을 유지시키는데 도움을 주는 역할을 한다.
본 발명자들은 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물이 우수한 피부 개선효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항산화, 피부보습, 주름개선, 피부 유해균 억제 및 피부 재생효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 바람직하게는 상기 유산균은 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum인 것을 특징으로 한다.
상기 유산균 발효 시어버터는 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 제조된 것으로서 유기산 함량이 증대된 것임을 특징으로 한다.
상기 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀은 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 발효시키는 과정에서 분리된 유산균 배양액으로부터 정제된 것임을 특징으로 한다.
유효성분으로서의 상기 복합물은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유된다.
상기 화장료 조성물은 항산화용, 피부 주름개선용, 피부 유해균 억제용, 피부 보습용 또는 피부 재생용임을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
(A)유산균 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum을 배양배지에 접종하고, 시어버터를 첨가하여 25~30℃에서 20~30시간 발효시키는 단계;
(B)발효물을 원심분리하여 유산균 배양액과 발효 시어버터를 분리하는 단계;
(C)(c1)상기 유산균 발효 시어버터 배양액을 1,000Хg~10,000Хg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (c2)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (c3)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (c4)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하여 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 정제하는 단계; 및
(D)상기 (B)단계에서 분리한 유산균 발효 시어버터와 상기 (C)단계에서 정제된 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함하는 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물의 제조방법이 제공된다.
바람직하게는 상기 배양배지는 10 g/L 수크로스, 20 g/L 글리세린, 5 g/L 글루탐산 나트륨, 5 g/L 구연산 나트륨, 10 g/L 이스트 추출물, 0.5 g/L 인산 칼륨, 1g/L 염화마그네슘, 0.5 g/L 염화망간을 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물은 우수한 항산화, 피부 보습, 주름개선, 피부재생, 피부 유해균 억제 효과를 나타내므로 피부 개선 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 보습 효능을 AQP3 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3, 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부 유해균 억제 효능을 유해균 생장 억제능으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부재생 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 항노화 효능을 COL1A1 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 주름개선 효능을 MMP-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 보습 효능을 AQP3 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3, 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부 유해균 억제 효능을 유해균 생장 억제능으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 피부재생 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 항노화 효능을 COL1A1 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 주름개선 효능을 MMP-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따르면 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
시어버터는 약노란색 색상의 지방산 추출물로서 향기와 맛이 좋아 서아프리카에서는 식용으로 사용되기도 하는데, 코코아와 섞어서 쓰거나 초콜릿을 만들 때 코코아 버터의 대용품으로 사용한다. 시어버터는 비타민 E 성분이 풍부하여 강력한 항산화 작용 및 항염 작용으로 체내의 활성산소를 제거함으로 피부 노화를 방지해주는 효과가 있으며, 혈액순환을 원활히 하고 신진대사를 활발하게 해주기 때문에 두피로 전달되는 열을 감소시켜 두피 건강에 도움을 준다. 또한 염증을 유발하는 매개체인 류코트리엔의 합성을 억제하여 피부에 발생하는 기미, 주근깨, 잡티, 여드름, 피부염 등을 완화시키는 효과가 있으며 피부 보습, 재생 및 자외선 차단 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 시어버터의 발효와 엑소좀의 정제에 사용되는 유산균으로는 바람직하게는 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. Kefirgranum이 사용된다.
유산균 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum은 케피어 그레인으로부터 분리된 것으로서, 유산균 최적 배양 배지에 접종한 다음, 28℃에서 24시간 배양 유지될 수 있다.
바람직하게는 상기 유산균 발효 시어버터는 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 제조된 것이며, 이를 통해 유기산 함량이 증대되어 피부개선활성이 개선된다.
바람직하게는 상기 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀은 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 발효시키는 과정에서 분리된 유산균 배양액으로부터 정제된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 유효성분으로서의 상기 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물은 다음과 같이 제조된다.
(A)유산균 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum을 배양배지에 접종하고, 시어버터를 첨가하여 25~30℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (B)발효물을 원심분리하여 유산균 배양액과 발효 시어버터를 분리하는 단계; (C)(c1)상기 유산균 발효 시어버터 배양액을 1,000Хg~10,000Хg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (c2)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (c3)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (c4)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하여 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 정제하는 단계; 및 (D)상기 (B)단계에서 분리한 유산균 발효 시어버터와 상기 (C)단계에서 정제된 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 제조한다.
이때, 상기 (A) 단계에서 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum을 배양하는데 사용되는 배양배지는 10 g/L 수크로스, 20 g/L 글리세린, 5 g/L 글루탐산 나트륨, 5 g/L 구연산 나트륨, 10 g/L 이스트 추출물, 0.5 g/L인산 칼륨, 1g/L 염화마그네슘, 0.5 g/L 염화망간을 포함하여 이루어진다.
이와 같은 방법에 의하여 제조된 상기 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물은 우수한 항산화 효과, 피부 보습효과, 피부주름개선 효과, 피부세포 재생 효과 및 피부 유해균 억제 효과를 나타내었다.
그러므로 상기 복합물은 항산화용, 피부 보습용, 피부 주름개선용, 피부 유해균 억제용, 피부 재생용 화장료 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이때 상기 유효성분으로서의 복합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다.
상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등으로 제조될 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
실시예 1: 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물의 제조
10 g/L 수크로스, 20 g/L 글리세린, 5 g/L 글루탐산 나트륨, 5 g/L 구연산 나트륨, 10 g/L 이스트 추출물, 0.5 g/L인산 칼륨, 1g/L 염화마그네슘, 0.5 g/L 염화망간을 포함하는 배양 배지에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종 하고, 시어버터를 첨가하여 28℃에서 24시간동안 교반하며 발효하였다.
발효가 끝난 뒤, 상기 발효물을 4℃에서 3,000 Xg으로 20분동안 원심분리하여 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액을 분리하였다.
상기 단계에서 원심분리된 배양액을 고속원심분리기를 이용하여 4℃에서 10,000 Xg로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간 건조하였다. 이때 진공상태는 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.
동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2단계를 형성하였다. PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran은 분자랑이 300,000~650,000dls 것을 1.7중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.
상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 4℃에서 1,000 Xg으로 10분동안 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다. 순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 수성 2단계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.
정제된 엑소좀과 분리된 상기 유산균 발효 시어버터를 혼합하여 복합물을 제조하였다.
비교예 1: 유산균 배양액의 제조
상기 실시예 1의 유산균 배양배지 대신에 MRS(BD; Difco Lactobacilli MRS Broth)배지를 활용하여 유산균 배양액을 제조하였다.
MRS배지에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 28℃에서 24시간동안 교반하며 배양하여 유산균 배양액을 수득하였다.
비교예 2: 유산균 엑소좀의 제조
비교예 1의 조건과 동일하게 유산균을 배양하여 수득한 유산균 배양액으로부터, 실시예 1에서의 엑소좀 수득 방법과 동일한 방법을 활용하여 유산균 유래 엑소좀을 수득하였다.
비교예 3: 시어버터와 유산균 엑소좀 복합물의 제조
비교예 2의 유산균 엑소좀과 시어버터를 혼합하여 복합물을 제조하였다.
비교예 4: 유산균 발효 시어버터의 제조
비교예 1의 유산균 배양에서 시어버터를 첨가하여 동일 조건으로 발효 후, 유산균 발효 시어버터를 수득하였다.
MRS배지에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고, 시어버터를 첨가하여 28℃에서 24시간동안 교반하며 배양하여 발효하였다.
발효가 끝난 뒤, 상기 발효물을 4℃에서 3,000 Xg으로 20분동안 원심분리하여 발효 시어버터와 유산균 배양액을 분리하여 유산균 발효 시어버터를 제조하였다.
시험예 1: 세포독성 평가
세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 각질형성세포(HaCaT)를 1Х105 cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지와 실시예 1에서 제조한 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물 및 비교예 1~4에 해당하는 시료를 농도 별로 투여하고 다시 24시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution (5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1은 상기 실시예 1 및 비교예 1~4 시료의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 모든 시료에 있어서, 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.
시험예 2: 보습 효능 평가(AQP3 발현)
보습 효능을 확인하기 위해 AQP3 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 무혈청배지로 교체하였다. 각 웰에 상기 실시예 1의 복합물 및 비교예 1~4에 해당하는 샘플을 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 15mJ/cm2 UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.005% 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 30분)하였다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 30분)하였다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol(Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 10분)하여 세척하였다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260nm와 280nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA), HPLC(J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.
AQP3 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 1에 나타내었으며, 도 2는 상기 시료들의 보습 효능을 AQP3 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
시험 결과, 실시예 1의 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물 시료를 처리하였을 때, 세포의 수분 이동에 관여하는 보습인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3 mRNA가 농도 의존적으로 증가하였으며, 비교예 1~4에 해당하는 시료와 비교하여 처리 농도 범위에서 발현율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였을 때는 145.63% 발현율을 보였다.
| 유전자 | Forward primer (5'→3') | Reverse primer (5'→3') |
| AQP3 | 5'-CCT TTG GCT TTG CTG CAC TC-3' | 5'-ACG GGG TTG TTG TAA GGG TCA-3' |
| GAPDH | 5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3' | 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3' |
시험예 3: 항산화 효능 평가
항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성 시험을 진행하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력으로 측정하였다. DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시약을 에탄올에 용해하여 0.4mM 용액을 제조하였으며 96 well plate에 농도별로 실시예 1에 따라 제조된 유산균 발효 시어버터 추출물과 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물 및 비교예 1~4에 해당하는 시료 또는 양성 대조군인 BHT(Butylated hydroxyl toluene 또는 2,6-Di-tert-butyl-p-cresol)를 에탄올에 용해한 용액 100㎕와 0.4 mM DPPH 용액 100㎕을 넣고 혼합하였다. 이때 음성 대조군으로는 에탄올을 처리하였으며, 혼합 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였으며 아래 계산식을 이용하여 시료 또는 양성대조군인 BHT의 DPPH 라디칼 소거능(%)을 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거능(%) = {1-(양성 대조군 또는 시료의 흡광도/대조군의 흡광도)} × 100
표 2는 각 시료의 항산화 효과를 DPPH 라디칼 소거능으로 평가한 결과를 나타낸 표이다.
| 농도(%) | DPPH 라디칼 소거 활성 (%) | ||||
| 복합물 (실시예 1) |
비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | 비교예 4 | |
| 0.001 | 14.27 | 1.06 | 1.79 | 3.65 | 10.71 |
| 0.01 | 35.76 | 10.54 | 11.25 | 14.69 | 21.28 |
| 0.1 | 61.27 | 21.78 | 26.01 | 29.31 | 42.17 |
| 1 | 78.62 | 35.01 | 40.51 | 43.01 | 65.97 |
| BHT (0.01%) | 75.27 | ||||
시험 결과, 실시예 1에 따라 제조된 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물시료와 비교예 1~4에 해당하는 시료를 처리하였을 때 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 그 중에서도 실시예 1의 복합물 시료를 처리하였을 때 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
시험예 4: 피부 유해균 억제 효능 평가(MIC assay)
피부 유해균 억제 효능을 확인하기 위해 MIC assay 평가를 진행하였다. 피부 유해균으로 알려져 있는 Staphylococcus aureus(S. aureus), 여드름의 원인이 되는 Cutibacterium acnes(C. acnes) 균을 배양하여 96 well Plate에 180㎕와 실시예 1에 따라 제조된 복합물과 비교예 1~4에 해당하는 시료 또는 양성 대조군인 Salicylic acid를 D.W에 용해한 용액 20㎕를 넣고 혼합하여, S. aureus는 30℃, 24시간, C. acnes는 37℃에서 48시간 배양한 뒤 600nm에서 흡광도를 측정하였으며 아래 계산식을 이용하여 시료 또는 양성대조군인 Salicylic acid의 유해균 생장 억제능(%)을 계산하였다.
유해균 생장 억제능(%) = {1-(양성 대조군 또는 시료의 흡광도/대조군의 흡광도)} × 100
도 3, 4는 상기 시료들의 피부 유해균 억제 효능을 유해균 생장 억제능으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 실시예 1에 해당하는 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물을 처리하였을 때, 피부 유해균의 생장 억제율이 농도 의존적으로 증가하였으며, 비교예 1~4에 해당하는 시료 대비 실시예 1의 시료 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 Salicylic acid 0.2%를 처리하였을 때는 S. aurueus, C. acnes에서 각각 90.54%, 88.18%의 억제율을 보였다.
시험예 5: 세포재생 효능 평가(Wound healing assay)
세포재생 효능을 확인하기 위해 wound healing assay 평가를 진행하였다. 세포는 화학적 및 물리적 자극에 의해 손상을 받게 되면 다양한 케모카인(chemokine)과 사이토카인(cytokine)을 분비함과 동시에 피부 손상 부위로 이동해 세포의 증식을 유도한다. 따라서 피부 세포의 성장 및 이동을 시험하는 wound healing assay를 통해 시료에 의한 세포 재생 유도 효과를 확인하였다. 각질형성세포(HaCaT)를 12well 플레이트에 2×105 cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어 내었다. 긁어낸 후 떨어져 나간 세포들은 PBS buffer로 반복해서 세척하고 1.5% 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체한 후 실시예 1에 따라 제조된 복합물과 비교예 1~4에 해당하는 시료를 처리하고 양성 대조군으로는 Madecassoside 1,000㎍/㎖을 처리하였다. 그 후 18시간 동안 배양하였으며 상처가 생긴 후 0시간과 8시간에 같은 위치를 현미경으로 촬영하여 8시간 동안 줄어든 면적을 Image J(National Institutes of Health, USA)로 측정하여 평균값을 계산하였다.
도 5는 상기 시료들의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이며, 0.05% 처리하였을 때의 결과를 나타내었다.
도 6은 wound gap 면적율에 대한 그래프 결과이며, 농도별 시료를 처리한 결과를 나타내었다. 시험 결과, 실시예 1의 복합물을 처리하였을 때 가장 높은 면적 감소율을 보였다. 이로 인해 세포의 성장 및 이동이 증가하여 세포재생에 효과가 있음을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Madecassoside 1,000㎍/㎖을 처리하였을 때는 51.78% 면적율을 보였다.
시험예 6: 항노화 효능 평가(COL1A1 발현)
항노화(주름개선) 효능을 확인하기 위해 COL1A1 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Fibroblast Basal Medium(Medium 106) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 무혈청배지로 교체하였다. 각 웰에 실시예 1에 따라 제조된 복합물과 비교예 1~4에 해당하는 시료를 농도 별로 투여하여 4시간 전처리를 수행하였다. 각 well plate에 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 15mJ/cm2 UVB를 조사하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 TGF-β 5ng/mL 처리하였다. Ribo Ex TM Total RNA Isolation Solution(GeneAll Biotechnology, Korea)와 scraper를 이용하여 세포배양이 끝난 세포를 용해한 다음 0.2mL 클로로포름(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 30분)하였다. RNA가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올(Merck-Millipore, Germany)을 상층액과 동량 넣어 inverting 후 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 30분)하였다. RNA를 침전시켜 침전물을 제외한 상층액은 버린 후 남아있는 침전물에 ethanol (Merck-Millipore, Germany) 70%를 넣어 원심 분리(12,000 rpm, 4℃ 10분)하여 세척하였다. Ethanol을 제거하고 상온에서 건조시킨 후, Nuclease-Free Water(Affymetrix, USA)로 용해하여 total RNA를 추출하였다. MaestroNano® Micro-volume Spectrophotometer(MN-913, Maestrogen, USA)를 이용하여 A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정한 뒤, 260nm와 280nm의 비가 2.0-2.2 범위에 해당함을 확인하였다. cDNA는 PCR tube에 1μg RNA와 Oligo dT(Bionics, Korea) dNTP(Takara, Korea), nuclease free water를 total 13μL로 제조한 다음 65℃에서 5분 반응시킨 후, M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)를 이용하여 37℃에서 50분 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 각 세포 내에서 일어나는 유전자 발현 패턴을 정량적으로 분석하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. qRT-PCR은 PCR tube에 primer, cDNA, 2X SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA), HPLC(J. T baker, USA)를 total 20μL로 혼합하여 반응액을 만들어 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 PCR을 진행하였다.
COL1A1 유전자의 PCR primer 서열은 아래 표 3에 나타내었으며, 도 7은 상기 시료들의 항노화 효능을 COL1A1 mRNA 발현율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 실시예 1의 복합물 시료를 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐생성인자인 COLA1A mRNA가 증가하였으며 비교예 1~4에 해당하는 시료 대비 처리 농도 범위에서 발현율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 TGF-β 5ng/mL을 처리하였을 때는 154.7% 발현율을 보였다.
| 유전자 | Forward primer (5'→3') | Reverse primer (5'→3') |
| COL1A1 | 5'-GAG AGC ATG ACC GAT GGA TT-3' | 5'-CCT TCT TGA GGT TGC CAG TC-3' |
| GAPDH | 5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3' | 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3' |
시험예 7: 항노화 효능 평가(MMP-1 발현 억제)
항노화(주름개선) 효능을 확인하기 위해 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 실험 방법은 위 시험예 6과 동일하며 MMP-1 유전자의 PCR primer 서열을 아래 표 4에 나타내었다. 도 8은 상기 시료들의 주름개선 효능을 MMP-1 mRNA 발현 억제율로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
시험 결과, 실시예 1에 해당하는 복합물 시료를 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐분해효소인자인 MMP-1 mRNA가 감소하였으며, 비교예 1~4에 해당하는 시료 대비 처리 농도 범위에서 억제율이 훨씬 더 증가됨을 확인하였다. 이때 양성 대조군인 TGF-β 5ng/mL을 처리하였을 때는 48.35% 발현율을 보였다.
| 유전자 | Forward primer (5'→3') | Reverse primer (5'→3') |
| MMP-1 | 5'-GGG CTT GAA GCT GCT TAC GA-3' | ACA GCC CAG TAC TTA TTC CCT TTG-3' |
| GAPDH | 5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3' | 5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3' |
제형예 1: 크림의 제조
하기 표 5의 조성으로 상기 실시예 1에 따라서 제조된 복합물을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1~4를 함유하는 크림을 비교 제형 예 1~4로 하였다.
| 성분 | 제형예 1 | 비교제형예 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| 함량(중량 %) | |||||
| 실시예 1 | 5 | - | - | - | - |
| 비교예 1 | - | 5 | - | - | - |
| 비교예 2 | - | - | 5 | - | - |
| 비교예 3 | - | - | - | 5 | - |
| 비교예 4 | - | - | - | - | 5 |
| 글리세린 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 부틸렌글라이콜 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 글리세릴올리에이트 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 |
| 세테아릴올리베이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 솔비탄올리베이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 세틸에틸헥사노에이트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 비즈왁스 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 1,2-헥산다이올 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 디메치콘 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 세티아릴알코올 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 미네랄 오일 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 디소듐이디티에이 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 비에이치티 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 토코페릴아세테이트 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 판테놀 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 에칠헥실메톡시신나메이트 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 향 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 |
시험예 8: 경피 수분 증발 억제 효과
경피 수분증발 억제효과(보습활성)를 확인하기 위해 투와미터(Tewameter, Courage & Khazaka)를 사용하였다. 피부가 건조한 30세~40세의 남녀 성인 20명을 대상으로 왼쪽 팔 하부 안쪽에 구획을 나누고 경피 수분 손실량을 각 구획 당 3회씩 측정 한 후 제형예 1 및 비교제형예 1~4를 1일 2회씩 5일간 도포하고, 경피수분증발량(Transepidermal Water Loss;TEWL)을 측정하였다. 측정은 실내온도 24±2℃ 상대 습도 40±2℃의 항온 항습실에서 실시하였고 각 조건당 3회씩 측정하여 얻어진 평균값을 사용하였다. 결과값은 시료를 도포하기 전 경피 수분 손실량을 100% 기준으로 하여 도포 3일 후, 5일 후에 따른 수분 증발량을 나타내었다. 표 6은 상기 시료들의 경피 수분 증발 억제 효과를 평가한 결과를 나타낸 표이다.
| 수분 증발량 (%) | |||
| 초기 | 도포 3일 후 | 도포 5일 후 | |
| 제형예 1 | 100 | 52 | 41 |
| 비교제형예 1 | 100 | 70 | 59 |
| 비교제형예 2 | 100 | 65 | 56 |
| 비교제형예 3 | 100 | 60 | 49 |
| 비교제형예 4 | 100 | 59 | 48 |
상기 표 6의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀 복합물이 포함된 크림에서 우수한 경피 수분증발 억제 효과를 확인하였다.
Claims (12)
- 유산균(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum) 발효 시어버터와 유산균(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum) 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 유산균(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum) 발효 시어버터는 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 제조된 것으로서 유기산 함량이 증대된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유산균(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum) 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀은 시어버터에 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum를 접종하고 배양하여 발효시키는 과정에서 분리된 유산균 배양액으로부터 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 복합물은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 유해균 억제용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 재생용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- (A)유산균 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum을 배양배지에 접종하고, 시어버터를 첨가하여 25~30℃에서 20~30시간 발효시키는 단계;
(B)발효물을 원심분리하여 유산균 배양액과 발효 시어버터를 분리하는 단계;
(C)(c1)상기 유산균 배양액을 1,000Хg~10,000Хg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (c2)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (c3)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (c4)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하여 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 정제하는 단계; 및
(D)상기 (B)단계에서 분리한 유산균 발효 시어버터와 상기 (C)단계에서 정제된 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀을 혼합하는 단계를 포함하는 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물의 제조방법. - 제11항에 있어서, 상기 배양배지는 10 g/L 수크로스, 20 g/L 글리세린, 5 g/L 글루탐산 나트륨, 5 g/L 구연산 나트륨, 10 g/L 이스트 추출물, 0.5 g/L인산 칼륨, 1g/L 염화마그네슘, 0.5 g/L 염화망간을 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 유산균 발효 시어버터와 유산균 발효 시어버터 배양액 유래 엑소좀의 복합물의 제조방법.
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