KR102483938B1

KR102483938B1 - 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지 또는 아토피피부염 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102483938B1
Application number: KR1020200071658A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 김선수
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2023-01-04
Also published as: WO2021251788A1; EP4166156A4; KR20210154536A; CN115697370A; US20230321181A1; JP2023529202A; EP4166156A1

Abstract

본 발명은 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지 또는 아토피피부염 개선용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 펜타펩타이드는 알러지 반응으로 인한 아토피피부염의 개선 효과가 있으며, 염증 반응을 감소시킴으로써 다양한 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

Description

펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지 또는 아토피피부염 개선용 조성물{Composition Comprising Pentapeptide as Active Ingredients for Anti-Allergy or Improvement of Atopic Dermatitis}

본 발명은 새롭게 합성한 펜타펩타이드의 항알러지 또는 아토피피부염 개선 용도에 관한 것이다.

아토피피부염(Atopic Dermatitis, AD)은 유전적, 환경적, 면역학적 이상 반응과 피부장벽의 붕괴로 인해 발병되는 질환으로 건조증, 소양증, 홍반성 습진을 야기하는 만성 염증성 피부질환이다. 최근 전세계적으로 환경변화, 식습관 및 환경오염 등에 의해 유병률이 증가하고 있어 해결 수단에 대한 관심도 증가하고 있다.

아토피성 피부염의 정확한 원인은 아직까지 밝혀져 있지 않지만 질환의 진행과 관련하여 나타나는 면역학적 특성으로는 혈중 IgE 항체의 수준이 유의하게 상승하고 인터루킨-4(IL-4)의 발현 수준은 상승하는 반면 인터페론 감마(interferon gamma: IFNγ) 발현은 저하된다는 점이다(Boguniewicz and Beltrani, 2002; AbdelHamid, 2003). IgE는 두 개의 이소폼의 IgE 수용체와 순환하며 결합한다. 고 친화성 IgE 수용체(FcεRI)는 비만세포 및 염기성 백혈구의 표면에 존재하고, 저 친화성 IgE 수용체(FcεRⅡ 또는 CD23)는 림프구, 산성 백혈구, 혈소판 및 대식세포의 표면에 존재한다. 알러지성 질환의 증상 개시는 비만세포상의 IgE 수용체의 교차결합, 알러지원을 만난 후 결과적인 비만세포의 탈과립이다. 비만세포에 의해 방출된 분자는 히스타민, 헤파린, 프로테아제 및 자유 라디칼을 포함하며, 혈관확장, 장관 내 및/또는 기관지 평활근 수축, 점액분비 및 국소 단백질 분비와 같은 다양한 생물학적 효과를 매개한다. 비만세포의 초기 매개 반응에 따라 산성백혈구, 염기성 백혈구 및 림프구의 유입이 6-24시간 후에 발생한다. 이 후기 단계의 반응은 끊임없이 항원에 노출된 조직의 만성적 염증을 유도한다.

일반적으로, 알러지성 질환의 치료를 위하여 항히스타민, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증용 의약품 및 류코트리엔 길항제와 같은 의약품이 사용된다. 이러한 의약품들은 주로 증후성의 효과에 유용한데, 과도한 체액성 면역을 완화하거나 IgE 생산을 억제하는 것과 같은 알러지성 질환의 근본적인 치유에 요구되는 치료를 제공하지는 못한다. 또한, 국소 스테로이드 제제는 장기간 사용 시 피부 위축, 혈관확장, 색소 탈실 및 팽창 선조(튼살)의 발생 등의 다양한 부작용을 야기할 수 있다.

이에 본 발명자들은 새로운 아토피피부염 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 새롭게 합성한 펜타펩타이드가 아토피성피부염을 포함하는 알러지성 피부 염증의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 알러지성 질환 또는 아토피피부염을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 알러지성 피부 염증 또는 아토피피부염을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 위하여, 본 발명의 일 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 또는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 피부 염증 또는 아토피피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 가려움증과 염증 반응을 유도하는 β-헥소사미니데이즈의 방출을 억제하고, 세포의 면역반응으로 인해 분비되는 염증성 사이토카인의 발현을 유의적으로 감소시키며, 아토피피부염의 증상을 완화시킴으로써 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 피부 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 용도로 사용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1a 및 도 1b는 KFLIK 펩타이드의 열안정성 평가 결과를 나타낸 것이다:
도 1a는 45℃에서 장기 보관시 펩타이드의 고온 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 최대 가온 온도(121℃)에서 펩타이드의 고온 안정성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 비만세포에서 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 β-헥소사미데이즈 방출량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 비만세포에서 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 염증성 사이토카인(IL-3, IL-4 및 TNF-α)의 발현 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 비장세포에서 KFLIK 펩타이드 처리에 의한 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β 및 COX-2)의 발현 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 인체효능평가를 통하여, 본 발명의 KFLIK 펩타이드에 의한 아토피피부염 개선 효과를 나타내는 그래프이다:
도 5a는 병변 부위에서 피부수분변화율(%)을 나타낸 것이고, 도 5b는 병변 부위에서 경피수분손실량 변화율(%)을 나타낸 것이며, 도 5c는 병변 부위에서 피부가려움지수 변화율(%)을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 또는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 '펩타이드'는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형 또는 환형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드의 제작은 본 기술분야에서 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 것이고, 일 예로 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 '펜타펩타이드'는 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 선형 분자를 의미하며, 본 발명의 펜타펩타이드는 Lys, Phe, Leu, Ile 및 Lys이 순서대로 연결된 선형 펩타이드 분자를 의미한다.

상기 '펩타이드' 및 '펜타펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성된 펜타펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 KFLIK의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 면역반응으로염증성 분비되는 염증성 사이토카인 IL-3, IL-4, TNF-α, IL-1β 및 COX-2의 발현을 억제하여 아토피피부염을 포함하는 알러지성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 비만세포에서 가려움증과 염증 반응을 유도하는 β-헥소사미니데이즈의 방출을 감소시킴으로써 아토피피부염을 포함하는 알러지성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드는 아토피피부염 병변 부위에서 피부 보습, 피부장벽 개선 및 가려움증 개선 효과를 나타내어 아토피피부염의 증상을 개선 또는 예방 할 수 있다.

본 발명에서 '알러지성 질환'이란 외부 항원에 대한 신체 내 면역 반응이 과도하게 나타나는 알러지(allergy) 반응에 의해 발병하는 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis),　접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 '아토피피부염'은 알러지성 질환 중 하나로서 가려움증, 피부 건조, 피부 두께 증가, 특징적인 습진과 같은 증상을 동반하는 피부 질환을 의미한다.

본 발명에 따른 알러지성 질환 또는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 피부 염증 또는 아토피피부염 증상의 개선 또는 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드, 펜타펩타이드, 알러지성 질환, 아토피피부염의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 '알러지성 피부 염증'은 외부 항원에 대한 신체 내 면역 반응이 과도하게 나타나는 알러지(allergy) 반응에 의해 피부에 나타나는 염증을 의미하며, 예를 들어, 접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 건선 및 습진일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드에 더하여 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 트롤록스-펩타이드 결합체에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 상기 펜타펩타이드와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 펜타펩타이드는 비만세포의 탈과립을 억제하여 β-헥소사미데이즈의 방출량을 감소시키고, 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 가려움증과 염증 반응을 억제하는 효과가 있으므로 알러지성 질환 또는 아토피피부염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 목적으로 하는 의약품 또는 화장료 조성물의 원료로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

신규한 펜타펩타이드의 합성 및 물성 확인

1-1. 펜타펩타이드의 합성

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 신규 펩타이드 서열 'KFLIK'은 공지의 방법을 이용하여 제조하였다. 분자량 측정기를 이용하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 분자량을 측정한 결과, 그 분자량이 647.4 Da에 해당함을 확인하였다.

1-2. 장기 보관시 고온안정성 평가

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 45℃에서 7일, 14일, 28일, 60일, 75일 동안 보관한 후, HPLC 분석을 수행하였다.

그 결과, [도 1a]에 나타낸 바와 같이, 45℃ 조건에서 최대 관찰일인 75일 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

1-3. 고온 안정성 평가

본 발명의 펩타이드를 1000ppm 농도로 멸균 증류수에 녹이고, 121℃에서 15분, 30분 동안 가온 한 후 HPLC 분석을 수행하였다.

그 결과, [도 1b]에 나타낸 바와 같이, 121℃에서 최대 가온 시간인 30분 동안 본 발명의 펩타이드가 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 1]

비만세포에서 펜타펩타이드 처리에 의한 탈과립 억제 효과 확인

본 발명의 펜타펩타이드에 의한 알러지성 염증반응 억제 효과 및 아토피피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 비만세포(rat basophilic leukemia cell line, RBL-2H3)를 사용하여 탈과립(degranulation) 정도를 확인하였다.

구체적으로, RBL-2H3세포를 5x10⁵cells/well의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 완전 배지에 DNP-IgE를 첨가하여 감작하였다. 3시간 뒤에 DPBS로 3번 세척한 다음 PIPES 버퍼를 첨가하였다. 또한, 실시예 1에서 합성한 본 발명의 펜타펩타이드를 30분간 전처리한 뒤 DNP-HSA를 3시간 동안 처리하여 면역반응을 유도하였다. 이후 상층액(supernatant) 25μL를 회수하여 기질용액(5mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide dissolved in 0.2 M sodium citrate buffer, pH 4.5) 25μL를 넣은 후 37℃에서 90분 동안 배양하여 반응시켰다. 반응 후 각 웰에 200μL 의 stop solution (0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃, pH 10.0)을 첨가하여 효소 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 상층액으로부터 분비된 β-헥소사미데이즈는 0.5% 트리톤 X-100용액을 세포에 첨가하여 하기 수학식 1에 따라 정량화하였다.

[수학식 1]

% release= (experimental β-hexosaminidase release-spontaneous β-hexosaminidase release) / total cellular β-hexosaminidase x 100

그 결과, [도 2]에 나타난 바와 같이 DNP-IgE로 감작하고 DNP-HSA로 면역반응을 유도한 대조군(NC)에서는 정상 비만세포(NON)에 비해 β-헥소사미데이즈의 방출량이 현저히 증가되었다. 그러나 DNP-IgE로 감작하고 DNP-HSA로 면역반응을 유도하면서 본 발명의 펜타펩타이드를 10 μM, 100 μM 처리한 경우, β-헥소사미데이즈의 방출량이 농도의존적으로 감소하였다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드가 비만세포로부터 β-헥소사미데이즈의 방출량을 감소시킴으로써, 비만세포의 탈과립현상을 효과적으로 억제하고, 가려움증과 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 2]

비만세포에서 펜타펩타이드 처리에 의한 염증 관련 사이토카인의 발현 억제 효과 확인

본 발명의 펜타펩타이드에 의한 알러지성 염증반응 억제 효과 및 아토피피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 비만세포(rat basophilic leukemia cell line, RBL-2H3)를 사용하여 염증 관련 사이토카인의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, RBL-2H3세포를 5x10⁵cells/well의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 완전 배지에 DNP-IgE를 첨가하여 감작하였다. 3시간 뒤에 DPBS로 3번 세척한 다음 PIPES 버퍼를 첨가하였다. 또한, 실시예 1에서 합성한 본 발명의 펜타펩타이드를 30분간 전 처리한 뒤 DNP-HSA를 2시간 동안 처리하여 면역반응을 유도하였다. 이때, 양성 대조군으로는 케토티펜(ketotifen) 20μg/mL를 사용하였다.

이후 세포를 회수하여 RNA를 분리한 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 IL-3, IL-4, TNF-α 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고, 증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다. 이때 사용된 프라이머 서열은 [표 1]에 제시된 바와 같다.

유전자	프라이머	서열(5'->3')	서열번호
IL-3	F	CCA GAT TTC AGA CAG GGG CTC	2
IL-3	R	CAG GTT TAC TCT CCG CAA GGT	3
IL-4	F	TCC ACG GAT GTA ACG ACA GC	4
IL-4	R	TCA TTC ACG GTG CAG CTT CT	5
TNF-α	F	ATG GGC TCC CTC TCA TCA GT	6
TNF-α	R	GAA ATG GCA AAT CGG CTG AC	7

그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이 DNP-IgE로 감작하고 DNP-HSA로 면역반응을 유도한 대조세포(NC)에서는 정상 비만세포(NON)에 비해 염증성 사이토카인인 IL-3, IL-4 및 TNF-α의 발현이 유의적으로 증가하였다. 한편 DNP-IgE로 감작하고 DNP-HSA로 면역반응을 유도하면서 본 발명의 펜타펩타이드를 처리한 결과, 면역반응으로 증가된 염증성 사이토카인의 발현이 모두 유의하게 감소되었다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드가 알러지성 염증반응을 억제하고, 아토피피부염 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.

[실험예 3]

비장세포에서 펜타펩타이드 처리에 의한 염증 관련 사이토카인의 발현 억제 효과 확인

본 발명의 펜타펩타이드에 의한 알러지성 염증반응 억제 효과 및 아토피피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 마우스 비장세포를 사용하여 염증 관련 사이토카인의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 마우스의 비장세포를 분리한 후 1x10⁷cells/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 교환한 후 4시간 후에 본 발명의 펜타펩타이드와 TNF-α 를 처리하여 30분가나 배양하였다. 이때, 양성 대조군으로는 케토티펜(ketotifen) 20μg/mL를 사용하였다.

이후 세포를 회수하여 RNA를 분리한 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 TNF-α, IL-1β 및 COX-2 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고, 증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였다. 이때 사용된 프라이머 서열은 [표 2]에 제시된 바와 같다.

유전자	프라이머	서열(5'->3')	서열번호
TNF-α	F	AACATCCAACCTTCCCAAACG	8
TNF-α	R	GACCCTAAGCCCCCAATTCTC	9
IL-1β	F	TGAGTGGTAGCCAGCAAAGC	10
IL-1β	R	CTGCAGTCCAGGTTCAATGG	11
COX-2	F	TTCGACACATGGGATAACGA	12
COX-2	R	TCTTTCAACACGCAGGACAG	13

그 결과, [도 4]에 나타난 바와 같이 TNF-α로 면역반응을 유도시킨 대조세포에서는 정상 비장세포에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 COX-2의 발현이 유의적으로 증가하였다. 한편, TNF-α, IL-1β 및 COX-2와 함께 본 발명의 펜타펩타이드를 함께 비장세포에 처리한 결과, 면역반응으로 인해 증가된 염증성 사이토카인의 발현이 모두 유의적으로 감소되었다.

이를 통해, 본 발명의 펜타펩타이드가 알러지성 염증반응을 억제하고, 아토피피부염을 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.

[실험예 4]

임상시험을 통한 아토피피부염 개선 효과 확인

시험대상자 21명을 대상으로 건조증에 기인한 가려움증 완화에 대한 인체효능평가를 실시하였다. 건조증 병변 부위를 시험 부위로 하였으며, 제품 사용 전, 제품 사용 2주 후, 제품 사용 4주 후 환부에 대하여 기기 측정을 진행하였다.

아토피피부염 개선 효과는 Comeometer CM825를 이용한 피부 수분 측정, Tewameter TM300을 이용한 피부 수분손실량 측정, 가려움중 개선도 평가(VAS)를 통해 확인하였다.

4-1. 펜타펩타이드를 함유하는 세럼 및 크림의 제조

펜타펩타이드에 의한 아토피 피부 증상 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1에서 합성한 본 발명의 펜타펩타이드가 2000ppm 포함되도록 세럼과 크림을 제조하였다.

4-2. 피부 보습 효과 확인

[도 5a]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 펜타펩타이드 함유 세럼 및 크림을 사용하는 경우 통계적으로 유의미하게 병변 부위의 피부수분개선효능을 나타내는 것으로 확인되었다(사용 2주, 4주; P<0.05).

4-3. 병변부위 피부장벽개선 효과 확인

[도 5b]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 펜타펩타이드를 함유한 세럼과 크림을 사용한 경우 통계적으로 유의미하게 병변 부위의 경피수분손실 개선 효능을 나타내었다 [경피수분손실 변화율 (%)=(after-before)/before*100].

4-4. 가려움증 개선 효과 확인

[도 5c]에 도시된 바와 같이, 가려움증 개선 효과에 있어서도 본 발명의 펜타펩타이드를 함유한 세럼과 크림을 사용한 경우 도포 전 대비 사용 2주, 4주 후 통계적으로 유의하게 가려움증 지수가 개선되는 것으로 확인되었다.

이로부터, 본 발명의 펩타이드 세럼 및 크림은 피부 보습, 피부장벽 개선 및 가려움증 개선 효과를 나타내며, 아토피와 같은 피부건조증에 기인한 피부소양증, 수분, 가려움증 개선 기능성 소재로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Composition Comprising Pentapeptide as Active Ingredients for Anti-Allergy or Improvement of Atopic Dermatitis <130> 2020-DPA-3656 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pentapeptide <400> 1 Lys Phe Leu Ile Lys 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-3 <400> 2 ccagatttca gacaggggct c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-3 <400> 3 caggtttact ctccgcaagg t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-4 <400> 4 tccacggatg taacgacagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-4 <400> 5 tcattcacgg tgcagcttct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 6 atgggctccc tctcatcagt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNF-alpha <400> 7 gaaatggcaa atcggctgac 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 8 aacatccaac cttcccaaac g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNF-alpha <400> 9 gaccctaagc ccccaattct c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-1beta <400> 10 tgagtggtag ccagcaaagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-1beta <400> 11 ctgcagtcca ggttcaatgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for COX-2 <400> 12 ttcgacacat gggataacga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for COX-2 <400> 13 tctttcaaca cgcaggacag 20

Claims

KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 또는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 알러지성 질환은 부종, 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis),　접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 펜타펩타이드는 i) 비만세포에서 염증성 사이토카인 IL-3, IL-4, 및 TNF-α의 발현을 억제하고, ii) 비장세포에서 TNF-α, IL-1β 및 COX-2의 발현을 억제하며, iii) 비만세포에서 β-헥소사미니데이즈의 방출을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약학적 조성물은 경구용 제제, 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 외용제는 크림, 젤, 연고, 유화액, 현탁액, 분무제 및 경피 전달성 패치제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
KFLIK의 아미노산 서열로 구성되는 펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알러지성 피부 염증 또는 아토피피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 알러지성 피부 염증은 접촉성 피부염, 두드러기, 소양증, 건선 및 습진으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 유액, 젤, 핸드크림, 립스틱, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 분무제, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 바디클렌져, 비누, 팩, 마사지제, 페이스파우더, 콤팩트, 파운데이션, 투웨이케이크, 및 메이크업베이스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조되는 것인, 화장료 조성물.