KR20210102548A

KR20210102548A - 신규 펩타이드 3ps_i014 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210102548A
Application number: KR1020200016497A
Authority: KR
Inventors: 박준형; 정호용; 사티시쿠마 나타라잔
Original assignee: 주식회사 쓰리빅스
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-08-20
Also published as: KR102354916B1

Abstract

본 발명은 신규 펩타이드 3PS_I014 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 3PS_I014와 이의 항염증 용도에 관한 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 신규 펩타이드가 인간 표피 세포에서 염증을 유도하는 사이토카인 CCL17 및 CCL22의 발현을 감소함으로써, 항염 활성을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 신규 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 항염증용 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 제공한다.

Description

신규 펩타이드 3PS_I014 및 이의 용도{A novel peptide 3PS_I014 and uses thereof}

본 발명은 신규 펩타이드 3PS_I014 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 아미노산 서열로 구성된 펩타이드와 이의 항염증 용도에 관한 것이다.

피부는 신체의 외부를 구성하는 기관으로서 다양한 외부 물리적 및 화학적 자극으로부터 신체를 보호하면서 내부의 항상성을 유지하는 중요한 물리적 장벽이다. 피부는 수분과 전해질의 외부 유출을 방지할 뿐만 아니라, 체온 조절, 온도 등의 항상성을 유지하고, 촉각, 압각, 통각, 온각 등의 자극에 대한 반응을 할 뿐만 아니라, 면역 기능, 비타민 D 합성 등의 기능을 수행한다.

이러한 피부가 기능을 수행할 수 없도록 문제가 생기는 것을 피부 질환이라고 하며, 그 중 피부에 염증이 생기는 염증성 피부 질환은 발적, 종창, 열감 및 동통 등의 증상이 나타나는 질환이며, 유형별로 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉 피부염, 접촉 두드러기 증후군, 아토피 피부염, 지루성 피부염, 물집 습진, 동전모양 습진, 자가감작 피부염, 주부습진, 울체 피부염 등과 같이 분류된다.

염증성 피부 질환은 T 림프구, 랑게르 한스 세포, 호산구 및 피부각질형성세포와 같이 여러 세포들이 관여하며, 사이토카인, 케모카인, 면역글로불린 분자와 같은 여러 요소에 의해 유발된다. 이중, 피부각질형성세포는 피부의 표피 대부분을 구성하는 성분으로서 피부에서 발생하는 면역반응의 유도체 및 표적으로 작용한다.

피부각질형성세포가 환경적, 생리적 스트레스에 노출되면 염증 반응이 유도되는데, IL-4, TNF-α, IFN-γ 등 다양한 염증성 사이토카인을 분비하기도 하고, TGF-β, Keratinocyte growth factor (KGF)의 수용체를 갖고 있어 이러한 사이토카인에 의해 영향을 받기도 한다. 특히, 염증성 사이토카인인 TNF-α는 여러 사이토카인의 생성, 세포의 성장과 분화, 괴사에 작용하여 피부염에 영향을 미치며, 이러한 사이토카인들은 피부각질형성세포의 증식 속도를 감소시키고, 염증을 유도하는 사이토카인의 분비를 증가시켜, 피부의 염증을 악화하게 된다. 즉, 염증성 피부 질환은 피부각질형성세포가 외부 자극 및 스트레스에 대해 반응하는 민감도와 관련이 있으며, 피부각질형성세포에 영향을 주는 요인을 제거하거나 피부각질형성세포의 반응을 감소시키면, 염증성 피부 질환을 치료하거나 개선하는 효과를 볼 수 있다.

이와 같은 염증성 피부 질환은 의학적으로 인체의 건강을 손상할 뿐만 아니라, 외모를 손상하기 때문에, 현재까지 많은 사람들이 염증성 피부 질환으로 고통받고 있다. 염증성 피부 질환의 치료로서는 피부의 수분 유지를 위한 보습제를 도포하거나, 면역계 염증 반응을 조절하기 위한 스테로이드제를 투여하는 등의 방법들이 흔히 사용되고 있다. 그러나 이러한 방법들은 일시적으로 증상을 완화할 뿐이였으며, 스테로이드제의 경우 과량으로 사용할 시에는 혈압 및 혈당의 상승, 부종, 불면, 정신과적 문제 발생, 쿠싱병, 전해질 이상, 월경불순, 식욕 증가, 체중 증가, 간기능 이상, 뼈의 괴사, 근력 약화, 백내장, 녹내장, 안압 증가, 상처 치유의 지연 등의 부작용이 나타난다고 보고되고 있다. 따라서 염증성 피부 질환을 치료 또는 개선하기 위해서는 피부에 안전할 뿐만 아니라 항염 활성을 나타내는 새로움 염증성 피부 질환에 대한 제제 개발에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 펩타이드 제제는 단백질 구성요소인 아미노산이 2-50개 정도 연결된 물질로 ‘단백질 기능을 가진 최소단위’로 정의한다. 펩타이드 제제는 단백질 중에서도 뛰어난 생리활성을 가진 최소 단위를 선별해 생체 신호전달 및 기능을 조절하며 신약후보 물질로써 ‘생체친화적’, ‘생체내 특이성’이라는 차별성을 가져, 부작용은 적으면서 소량으로도 강력한 약리작용 및 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 저분자 화합물에 비해 임상단계에서 신약 성공률이 2배 이상 높다. 2008년 이후 펩타이드 신약 임상시험이 증가하고 있으며, 현재 임상단계에 있는 펩타이드 신약 수만 400개에 이른다고 보고되었다. 따라서 특정 질환에 대한 치료하는 데에 적합한 신규 펩타이드 제제를 새롭게 발견하고, 이를 신약으로 제공될 수 있는지에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.

본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 새로운 서열의 펩타이드를 합성하였고, 상기 펩타이드가 인간 상피 세포에서 항염증 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규 펩타이드 3PS_I014를 제공하는 것이며, 신규 펩타이드 3PS_I014의 항염 활성을 확인하여 신규 펩타이드의 항염증 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 신규 펩타이드 3PS_I014는 인간 표피 세포에서 염증을 유도하는 사이토카인 CCL17 및 CCL22의 발현을 감소함으로써, 항염 활성을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 신규 펩타이드 3PS_I014를 유효성분으로 포함하는 조성물은 항염증용 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 인간각질세포주(HaCaT cell)에 처리하였을 때에 사이토카인인 CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량 변화를 확인한 전기영동 사진이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

	아미노산 서열	서열번호
실시예 1	KGFIRIHKQV NLTNK	1

상기 아미노산 서열의 K는 라이신(Lysine, Lys), G는 글리신(Glycine, Gly), F는 페닐알라닌(Phenylalanine, Phe), I는 이소류신(Isoleucine, Ile), R은 아르기닌(Arginine, Arg), H는 히스티딘(Histidine, His), Q는 글루타민(Glutamine, Gln), V는 발린(Valine, Val), N은 아스파라긴(Asparagine, Asn), L은 류신(Leucine, Leu), T는 트레오닌(Threonine, Thr)을 나타낸다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하며, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 이들을 모두 포함한다. 상기 펩타이드는 변이체를 포함하는 것으로, 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 주요 활성에 변화를 주지 않으면서 본 발명 펩타이드 구조의 일부가 변이된 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드 3PS_I014는 염증 반응이 유도된 세포에서 사이토카인인 CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낼 수 있다.

상기 염증 반응이 유도된 세포는 다른 세포 또는 자기 자신이 분비한 TNF-α 또는 IFN-γ 사이토카인의 자극을 받아 염증 반응을 유도하거나 악화할 수 있는 세포를 의미한다. 예컨대, TNF-α 또는 IFN-γ와 같은 염증을 유도하는 사이토카인의 자극을 받은 피부 세포는 CCL17 또는 CCL22와 같은 사이토카인의 분비가 증가하여 피부에 염증을 일으킨다. 즉, 피부 세포에 TNF-α 또는 IFN-γ와 같은 염증을 유도하는 사이토카인의 자극이 있을 경우, CCL17 또는 CCL22의 발현을 억제하거나, 염증을 유도하는 사이토카인 TNF-α 또는 IFN-γ의 자극을 받은 것에 비해 발현을 감소하면 피부 염증을 예방 또는 억제하는 효과가 나타난다고 할 수 있다.

따라서 상기 “CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량을 억제”한다는 것은 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 피부 세포에 염증을 유도하는 사이토카인, 예컨대 TNF-α 또는 IFN-γ의 자극을 받은 것에 비해 CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량이 감소되는 경우를 의미할 수 있고, 또는 CCL17 또는 CCL22 유전자가 발현되지 않는 경우를 의미할 수 있다.

상기 “염증 반응이 유도된 세포”는 염증 반응을 일으키는 화학적 또는 면역적 자극을 받은 세포로서 염증을 일으키는 사이토카인, 케모카인, 면역글로불린의 자극을 받은 모든 세포들을 의미한다. 예컨대, 피부각질형성세포일 수 있으며, 염증 반응을 일으키는 화학적 또는 면역적 자극은 예컨대, 다른 세포 또는 세포 자기 자신이 분비한 사이토카인 일 수 있으며, 예컨대 TNF-α 또는 IFN-γ의 자극일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 3PS_I014를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있으며, 상기 염증성 피부 질환은 아토피 피부염, 전신 홍반성 낭창, 접촉성 피부염, 알레르기 피부 질환, 여드름, 좌창 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물을 투여, 예컨대 피부에 도포함으로써 염증성 피부 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물을 투여, 예컨대 피부에 도포함으로써 염증성 피부 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 3PS_I014를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 세럼, 에멀젼, 에센스, 파우더, 파운데이션, 스프레이, 마스크팩, 시트팩, 수면팩, 워시오프팩 및 필오프팩로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제형화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 화장료 조성물은 피부 외용제로서, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

이하, 실시예 등에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다.

실시예 1. 신규 펩타이드 제조

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드 3PS_I014를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다. 상기 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 Nα-아미노 그룹(amino group)의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 DCC (N-hydroxybenzotriazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H2O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC(reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C18 300Å, 15μm, 19.0 mm x 30mm, Waters)을 이용하여 정제하였다.

합성 펩타이드를 6N-HCl로 110℃ 서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrixassisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2. 펩타이드의 항염증 활성 평가

실시예 1에서 합성된 신규 펩타이드 3PS_I014가 항염증 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 사람의 표피 세포인 인간각질세포주(HaCaT 세포)에서 염증반응시 발현되는 사이토카인의 억제 정도를 평가하였다.

HaCaT 세포를 1% penicillin-streptomycin과 10% FBS(Fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지 (Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 6-well cell culture plate에 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 분주하고, 배양된 HaCaT 세포를 3 x 10^5/well 로 24시간 배양하였다. serum-free 배지로 세척한 후 TNF-α/IFN-γ 10 ng/mL를 단독으로 처리(양성 대조군)하거나, TNF-α/IFN-γ 10 ng/mL과 실시예 1의 펩타이드 10 μg/mL 동시에 처리한 다음, 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 well에서 배지를 제거하고, D-PBS로 세척한 후, RNA-prep (Bio-Zol, MA500, 바이오세상) 용액으로 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 5 μg으로 cDNA를 합성하고, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, CCL17 또는 CCL22 유전자를 타겟하는 각각의 프라이머로 PCR를 수행하고, 1.2% agarose gel로 전기영동 하여 각각의 CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량을 확인하였다 (도 1). house keeping 유전자로 GAPDH를 사용하였고, TNF-α/IFN-γ 또는 실시예 1의 펩타이드를 전혀 처리하지 않은 HaCaT 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.

구분	(방향)프라이머 서열	서열번호
CCL17	(forward) actgtctcccgggactacct	2
CCL17	(reverse) tccctcactgtggctcttct	3
CCL22	(forward) tgccctgggtgaagatgatt	4
CCL22	(reverse) agaggatgggttagaggggt	5

도 1에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 TNF-α/IFN-γ을 처리한 결과, TNF-α/IFN-γ 또는 실시예 1의 펩타이드를 전혀 처리하지 않은 HaCaT 세포에 비해 CCL17 및 CCL22 유전자의 발현이 증가하였으며, 이는 HaCaT 세포에 TNF-α/IFN-γ를 처리함에 따라 염증 반응이 유도되었다는 것을 보여주었다.

반면, HaCaT 세포에 TNF-α/IFN-γ와 실시예 1의 펩타이드를 동시에 처리한 경우 TNF-α/IFN-γ만 처리한 경우 보다 CCL17 및 CCL22 유전자의 발현이 감소하였으며, 이는 실시예 1의 펩타이드가 TNF-α/IFN-γ 처리로 인하 유도된 염증 반응을 억제하는 효과가 있음을 보여준다. 상기 결과는 실시예 1의 펩타이드가 항염 활성을 나타낸다는 것을 입증하고 있으며, 실시예 1의 펩타이드를 포함하는 조성물이 항염증용 제제로 사용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> 3BIGS <120> A novel peptide 3PS_I014 and uses thereof <130> DP-2020-0025 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3PS_I014 <400> 1 Lys Gly Phe Ile Arg Ile His Lys Gln Val Asn Leu Thr Asn Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL17_f <400> 2 actgtctccc gggactacct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL17_r <400> 3 tccctcactg tggctcttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL22_f <400> 4 tgccctgggt gaagatgatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL22_r <400> 5 agaggatggg ttagaggggt 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도된 세포에서 사이토카인 CCL17 또는 CCL22 유전자의 발현량을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 것인 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 염증성 피부 질환은 아토피 피부염, 전신 홍반성 낭창, 접촉성 피부염, 알레르기 피부 질환, 여드름, 좌창 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화된 약학 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물.
제8항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 세럼, 에멀젼, 에센스, 파우더, 파운데이션, 스프레이, 마스크팩, 시트팩, 수면팩, 워시오프팩 및 필오프팩로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제형화된 화장료 조성물.