KR102462458B1 - 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 tanshinone1, tanshinone2a, Cryptotanshinone 및 Dihydrotanshinone를 포함하는 탄시논류를 2-70% 함유하는 것을 특징으로 하며, 탈모증 및 전립선비대증 치료 및 예방을 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공할 수 있다.

Description

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물{Composition for preventing or treating of benign prostatic hyperplasia or alopecia comprising extracts of Salvia miltiorrhiza Bunge as an effective ingredient}
본 발명은 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
양성 전립선비대증 (BPH)은 50 세 이상의 남성들에게 요로계의 흔한 만성 질환이다 (Berry S.J. et al., 1984). BPH는 또한 요로 간헐적 증가, 요로 빈도 증가, 요로 응급, 요로 흐름 약화 및 불완전한 방광 비움을 포함한 요로 증상 저하 (LUTS)와 관련이 있으며, 이로 인해 노인의 삶의 질이 나빠지며 일상 생활에 부정적인 영향을 미치게 된다 (Sarma, A.V. et al., 2012).
BPH의 근본적인 원인은 알려져 있지 않지만, 노화된 남성의 전립선은 안드로겐에 의해 영향을 받는다는 것이 잘 알려져 있다 (Kim S.K. et al., 2015). BPH가 진행되는 동안, 안드로겐은 자가 분비 또는 파라 크린 방식으로 전립선에서 상피 세포 또는 기질 세포의 증식을 촉진하여 전립선 세포 증식 및 세포 자살의 불균형을 초래한다. 이것은 BPH의 중요한 원인으로 여겨져 왔다 (Choi, H.M. et al., 2016).
특히, 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosteron, DHT)은 BPH의 발달과 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 나이가 들면서 남성의 성호르몬인 테스토스테론(testosteron)이 전립선에서 디하이드로테스토스테론(DHT)으로 높은 비율로 전환되기 시작하는데, 이것은 일차적으로 테스토스테론을 DHT로 전환시키는 효소인 리덕타아제(reductase) 효소의 농도가 높아지는 것이 원인이다. DHT는 안드로겐 수용체 (AR)에 대한 결합력이 높기 때문에 TST와 비교하여 더 강력한 안드로겐이다. 5α환원효소 유형-2 (5AR2)는 전립선에서 TST를 DHT로 변환하며, DHT는 AR과 결합하여 안드로겐-의존성 유전자의 전사를 증가시키고, 궁극적으로 전립선 증식과 관련된 단백질 합성의 자극을 유발하며, 전립선-특이적 항원 (PSA) 수준을 향상시킨다. 한편, BPH 및 전립선암이 진행되는 동안 PSA 수준이 증가하는데, 이 때문에 PSA는 BPH의 진단에 널리 사용된다 (Chen, Y. et al., 1996).
세포주기는 전립선 기질 및 상피 세포에서 발생하여 이들의 분열 및 복제로 이어진다. G1 / S 진행은 사이클린 D1 에 의해 고도로 규제된다. 또한 증식 세포핵 항원 (PCNA)은 세포주기에서 G1 / S 단계에 대한 조직 학적 마커로 인식된 산성 핵 단백질이다. 따라서 PCNA와 cyclin D1의 발현은 BPH 동안 전립선 세포의 증식 상태를 반영할 수 있다 (Wang, W., et al., 2004).
반대로, 전립선 상피의 세포 자살은 BPH보다 정상적인 상태에서 전립선에서 더 자주 발생한다. 세포 자살을 억제하는 Bcl-2는 또한 전립선 상피에서 발견되며, 전립선 조직의 증식으로 이어진다 (Cardillo, M., et al., 1997).
디하이드로테스토스테론 (DHT) 등의 남성 호르몬에 의한 또 다른 증상 중의 하나는 남성형 탈모증(male pattern baldness)이다. 탈모의 원인으로는 혈액순환 불량설, 남성호르몬 작용 과잉설, 피지 분비 과잉설, 비듬균 및 기타세균 등에 의한 두피기능 저하설, 유전적 요인, 노화 스트레스 등이 제시되어 왔으나, 현재까지 남성호르몬 과잉 분비에 직접적인 관계가 있는 탈모중의 가장 흔한 유형인 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia)의 원인이 밝혀지고 있다.
안드로겐성 탈모증이 있는 경우 건강한 모발은 점차로 가늘어지고, 짧아지며, 모발이 약해져서 쉽게 부서지는 현상이 나타나게 되는데 이러한 현상을 축소화(miniaturization)라고 한다. 축소화가 일어나는 모낭은 결국 가늘고 눈에 잘 보이지 않으며 짧은 솜털로 변해 탈모가 진행되는 것이다. 이에 따라 최근 남성호르몬 활성 억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고 되고 있다.
테스토스테론(testosterone)이 5α환원효소(5α-reductase)에 의해 활성형 남성호르몬인 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)으로 전환되고, 이렇게 활성화된 디히드로테스토스테론이 안드로겐 수용체와 결합하여 모낭세포의 단백질 합성을 지연시켜 모낭의 생장기가 단축되고 모낭을 위축시켜 탈모를 유발한다. 또한 안드로겐성 탈모 과정에서 피지가 과잉 생성되기도 하며 그 결과로서 두피에서는 염증을 동반한 탈모가 나타나기도 한다 (Dennis A. Holt, et. al,. 1990).
현재 개발된 테라조신, 독사조신, 탐술래신, 알푸조신 등과 같은 alpha-1 adrenergic blocker 로 사용되는 전립선비대증 치료제의 경우 전립선 평활근을 이완시켜 요도 폐쇄 증상을 완화시키나 교감신경 차단으로 저혈압, 혈관 확장성 두통 등의 부작용이 보고되고 있다.
5α환원효소 inhibitor인 피나스테라이드 (Fi)와 두타스테라이드는 테스토스테론이 5α환원효소에 의해 활성 대사물질인 디하이드로테스토스테론 (DHT)으로의 전환을 억제하여 전립선 크기를 줄이고 BPH 및 탈모증에 사용되는 효과적인 것으로 알려져 있으나(Park, E.S., et al., 2018), 이들 약물은 발기 부전, 성욕 감소 및 사정에서의 정액 부피 감소와 같은 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이렇듯 현재 사용하고 있는 약물치료가 다소 효과가 있다고는 하나, 그 부작용이 문제가 되며, 사실상, 전립선비대증은 지속적인 노화현상 중 하나로 근본적 치료가 어려운 문제점이 있다.
따라서 부작용이 적은 효과적인 치료 전략을 찾는 연구자들은 천연 재료로 제조된 약제를 포함한 대체 의학에 관심이 증가되고 있다. 현재 천연 재료 중에서 쏘팔메토 추출물만이 BPH에 효과를 갖는 기능성 식품으로 널리 알려져 있다 (Marks, L.S., et al., 2000).
단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 꿀풀과에 속하는 여러해살이 풀로, 뿌리가 인삼과 모습이 비슷하고 빛깔이 붉어 단삼이라는 이름이 붙었다. 단삼은 예로부터 혈관을 튼튼하게 하는 약초로 알려져 있으며, 단삼 속에 들어있는 탄시논 성분이 혈관 속 노폐물이 산화되는 것을 억제하여 혈관 회춘에 도움을 주고 혈관을 확장시켜 혈액순환을 개선하고 고혈압이나 심근경색과 같은 혈관질환을 예방하는 것으로 알려져 있다. 한의학에서도 단삼은 혈액의 흐름을 촉진하고 어혈을 제거하여 새로운 혈액 생성에 도움을 주는 약초로 기록되어 있다.
한국 공개특허공보 제2012-0020639호에는 단삼을 포함하는 전립선암 치료용 조성물이 전립선암 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 한국 공개특허공보 제2001-0076810호에는 전립선 질환 및 치질 치료용 조성물의 제조방법 및 그제조방법에 의한 조성물로 호장근, 마치현, 익지인, 차전자, 포공영, 금은화, 용담초, 대황, 계내금, 소목, 목과, 천련자, 오령지, 단삼, 몰약, 파고지, 위령선, 유향, 용뇌, 현호색, 백굴채, 소회향, 삼릉, 봉출, 사상자, 향부자, 오약, 지룡, 수질을 각각 2-5wt%를 혼합하여 제조한 환제가 개시되어 있으나, 본 발명의 단삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 치료 조성물은 기재되어 있지 않다.
또한 한국 등록특허공보 제0259037호에는 반하, 정향, 복분자, 산초, 만형자, 단삼 및 백자인 분말을 기름 및 에탄올 각각에 침지후 일정기간 숙성시켜 결과된 추출물을 이용하여 외용액제를 제조하여 직접 적용하는 발모촉진용 외용액제가 기재되어 있으나, 본 발명의 구성과는 차이가 있다.
한국공개특허 제2012-0020639호, 단삼을 포함하는 전립선암 치료용 조성물, 2012.03.08. 공개 한국공개특허 제2001-0076810호, 전립선 질환 및 치질 치료용 조성물의 제조방법 및 그 제조방법에 의한 조성물, 2001.08.16. 공개. 한국등록공보 제0259037호, 발모촉진용 외용액제, 2000.03.16. 등록
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본 발명의 목적은 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물의 유효성분을 포함하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 단삼 추출물은 증류수 또는 에탄올 추출물일 수 있으며, 다른 용매가 사용될 수도 있다. 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등이 다르게 설계될 수 있다. 추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있는데, 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올, 이소프로판올 및 메틸렌클로라이드 등이 있다.
상기 단삼 추출물은 특히 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있다. 상기 알코올은 에탄올 일 수 있으며, 40~99% 에탄올일 수 있다.
상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 40~99% 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 단삼 추출물은 농축될 수 있다. 마이크로바 건조 방법으로 추출물을 40~80℃에서 가열하여 수분을 제거할 수 있다. 또는 저온진공건조 방법으로 추출물을 농축건조할 수 있다. 저온진공건조는 건조기 내부의 압력을 진공으로 유지하고, 온도를 5~15℃ 정도로 조절하여 건조하는 방법으로, 추출성분의 변성이 없고, 맛과 향도 소실되지 않는다. 설계조건에 따라서는, 분무건조, 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 음건조, 감압건조 등의 방법이 이용될 수도 있다.
단삼은 또한, 극저온 초미세분쇄 공정(Cryogenic Micro Grinding Technology, CMGT)를 이용하여 제조할 수 있다. 보다 구체적으로는 -196 내지 -80℃의 극저온에서 단삼 뿌리를 단시간에 동결하고 미세 분말로 분쇄하여 향상된 물성을 갖는 분말을 제조할 수 있다.
상기 단삼 농축물은 건조하여 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 분무 건조 방법으로 추출물을 농축건조한 후에 다양한 제형으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 분말로 제조할 수 있다. 저온진공건조는 건조기 내부의 압력을 진공으로 유지하고, 온도를 5~15℃ 정도로 조절하여 건조하는 방법으로, 추출성분의 변성이 없고, 맛과 향도 소실되지 않는다. 설계조건에 따라서는, 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 음건조, 감압건조 등의 방법이 이용될 수도 있다. 바람직하게는 단삼(S. miltiorrhza)은 에탄올 50 ℓ로 24 시간 용출시킨 후 감압 농축할 수 있다. 여기에, 물 1500ml를 첨가하고 동량의 n-헥산, 디클로로메탄(CH2Cl2) 및 에틸아세테이트(EtOAc)를 넣어 차례로 2 회 반복 추출하여 겔(gel) 상태의 붉은색 추출물의 단삼 추출물을 제조할 수 있다.
단삼의 극저온냉동동결 미세분말의 증류수 또는 에탄올 용해물일 수 있다. 그러나 이에 한정하는 것은 아니며, 단삼은 열수추출법, 증류추출법, 에탄올추출법, 초음파 에탄올추출법, 초음파 물 추출법 등 이용가능한 공지의 추출방법으로 추출할 수 있다. 상기 단삼 추출물은 0.01 내지 700 ㎍/㎖ 의 양으로 포함되는 것일 수 있다.
상기와 같은 방법으로 단삼의 유효성분인 탄시논류의 함량을 증가시킬 수 있다. 단삼(S. miltiorrhiza Bunge) 추출물은 탄시논류가 전체중량의 2% 내지 70% 포함된 것일 수 있다.
상기에서 단삼 추출물은 메틸렌클로라이드를 포함하는 유기용매로 분별추출할 수 있으며, 컬럼을 통하여 특정 성분을 농축을 수행할 수 있다.
상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 탄시논류가 전체중량의 2% 내지 70% 포함된 것일 수 있다.
상기 탄시논류는 Tanshinone1 (1,6-Dimethylphenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione 또는 1,6-dimethylnaphtho[1,2-g]benzofuran-10,11-dione), Tanshinone2a (1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione), Cryptotanshinone ((R)-1,2,6,7,8,9-Hexahydro-1,6,6-trimethyl-phenanthro(1,2-b)furan-10,11-dione), 15,16-Dihydrotanshinone ((1R)-1,6-dimethyl-1,2-dihydronaphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione Dihydrotanshinone-I)으로 이루어진 군 중 하나 이상을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 상기 4종의 탄시논을 제외한 기타 탄시논일 수 있다.
본 발명은 tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone, dihydrotanshinone 및 tanshinoic acid로 이루어진 군 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선비대증 또는 탈모증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
지금까지 알려진 주요 탄시논류로는 tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone 또는 dihydrotanshinone가 있으며, Tanshinoic acid를 비롯하여 말단 작용기를 달리하는 기타 Tanshinone이 포함된다. 단삼의 유효성분은 tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone 또는 dihydrotanshinone일 수 있으며, 유효성분으로 바람직하게는 tanshinone2a, 또는 dihydrotanshinone 또는 tanshinoic acid를 포함하는 기타 탄시논류 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 dihydrotanshinone 또는 기타 탄시논류 일 수 있다.
본 발명은 단삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 치료 또는 예방 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 단삼 추출물, tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone, dihydrotashinone 및/또는 tanshinoic acid 등 기타 탄시논류를 포함하는 단삼의 유효성분을 포함할 수 있다.
상기 약학조성물은 담체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 상기 각각은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 90중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 상기 탄시논 유도체들을 유효 성분으로 함유한다. 상기 약학 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 탄시논 유도체들에 적어도 하나 또는 그 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 탄시논 유도체들의 유효용량은 농도 의존적이나 바람직하게는 0.1 mg 내지 1,000 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 500 mg/kg이며, 하루 1 - 6회 투여할 수 있다. 따라서, 성인 체중 1 kg 당 0.1 ~ 6,000 mg/일 범위로 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 5α환원효소 타입2 (5AR2), 전립선특이적 항원(PSA), 스테로이드수용체공활성인자-1(SRC-1) 및 안드로겐수용체(AR)로 이루어진 군 중 하나 이상의 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 상기 단백질은 안드로겐 관련 단백질로, 전립선비대증 또는 탈모증에서 증가하는 양상을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 5α환원효소 타입2 (5AR2), 전립선특이적 항원(PSA), 스테로이드수용체공활성인자-1(SRC-1) 및 안드로겐수용체(AR)로 이루어진 군 중 하나 이상의 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 상기 건강기능식품은 단삼 추출물, tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone, dihydrotashinone 또는 tanshinoic acid 등 기타 탄시논류를 포함하는 단삼의 유효성분 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 상기 단삼 추출물, tanshinone1, tanshinone2a, cryptotanshinone, dihydrotashinone 및/또는 tanshinoic acid 등 기타 탄시논류를 포함하는 단삼의 유효성분이 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 단삼 추출물은 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 분유, 선식, 생식, 유산균 발효유, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 구체적으로, 단삼 추출물을 포함하는 건강 식품으로는 단삼 추출물을 주성분으로 만든 즙, 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있으며, 부종, 신장염, 요도염 등을 목적으로 하는 민간요법제 등을 들 수 있다.
상기 단삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 치료 또는 예방용 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 화장료 조성물로 사용할 경우 단삼 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 화장품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 일반적으로, 단삼 추출물을 이용한 화장품 제조시에 원료의 전체중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 화장품으로는 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 색조화장품, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민 및 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 치료 또는 예방용 조성물은 종래 부작용이 많은 치료제를 대체할 수 있는 안전하고 강력한 전립선비대증의 치료 및 예방 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 DHT 유도된 LNCaP 세포주에서 salvianolic acid가 주성분으로 포함(약 10~20%)되어 있는 단삼 추출물S, 탄시논류(Tanshinone)가 주성분으로 포함(약 22%)되어 있는 단삼 추출물T 및 이의 유효성분 Tanshinone1(Tan1), Tanshinone2a(Tan2a), Cryptotanshinone(CryT) 및 Dihydrotanshinone(DihT)에 의한 5α환원효소 타입2(5α reductase type2, 5AR2), 안드로겐수용체(Androgen Receptor, AR), 스테로이드수용체공활성인자-1(Steroid Receptor Coactivator-1, SRC-1), 전립선특이항원(Prostate Specific Antigen, PSA)의 발현 변화를 Western blotting 으로 확인한 결과이다.
도 2는 도 1의 각 단백질을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 DHT 처리 LNCaP 세포주에 단삼 추출물T95, T70, T40을 농도별로 처리하고 안드로겐수용체(AR) 및 전립선특이항원(PSA)의 발현에 미치는 효과를 보여주는 Western blotting 결과이다.
도 4는 도 3의 안드로겐수용체(AR) (A) 및 전립선특이항원(PSA) (B)을 각각 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 몸무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 전립선 크기 변화를 보여주는 사진이다.
도 7은 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 전립선 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 Prostate index(몸무게 대비 전립선무게) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T40가 랫드의 전립선비대 관련 단백인 5α-환원효소(5α-reductase, 5AR2), 안드로겐수용체(Androgen receptor, AR), 전립선특이항원(PSA)의 발현에 미치는 효과를 보여주는 Western blotting 결과이다.
도 10은 BPH에서 Testosterone의 신호전달경로 및 단삼추출물의 약리기전을 나타낸 모식도이다.
전립선비대증 (BPH)은 노인들에게 요로계의 흔한 만성 질환으로, 특히 노인의 안드로겐 대사 불균형은 BPH의 주요 원인 중 하나이다. 안드로겐 수용체 (AR)와 결합하는 5α환원효소 타입2 (5AR2)에 의한 디하이드로테스토스테론 (DHT)은 전립선 증식 및 성장에 영향을 미친다. BPH에서, 안드로겐 신호 전달 관련 단백질 발현 수준이 높게 나타나는 것으로 보고되고 있으며, 안드로겐 신호 전달은 전립선특이적 항원(PSA)의 과발현과 관계가 있다. 또한 디하이드로테스토스테론 (DHT) 의 조절과 관련된 또 다른 증상으로 탈모증을 들 수 있다.
본 발명은 상기 전립선비대증 (BPH) 및 탈모증의 신호전달경로를 연구하던 중, 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물 및 이의 유효성분이 해당 경로에 관여함으로써 전립선비대증 (BPH) 또는 탈모증의 치료와 예방에 탁월한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 단삼 추출물의 성분분석>
1.1. 단삼 추출물S 제조
파쇄시킨 단삼뿌리를 50~100℃의 열수에서 추출하였다. 상기 열수에서 2시간 내지 24시간 추출한 후, 여과하여 찌꺼기를 제거하고 추출액을 취합 후 가열하여 증발 건조시켰다. 증발시킨 고형물은 필요에 따라 100℃ hot water로 세척 후, 마이크로웨이브에서 55℃, 25~30분간 건조시킨 다음 분쇄하여 60mesh 이상에서 필터링하여 준비하였다. 상기 단계를 통하여 단삼으로부터 추출한 단삼 추출물S의 주요 성분은 Savianolic acid로, 추출물 중 약 10~20%를 함유하는 것으로 나타났다.
단삼 추출의 효율을 높이기 위하여 단삼뿌리를 극저온 초미세분쇄 공정 (Cryogenic Micro Grinding Technology, CMGT)을 이용할 수 있다. CMGT(Cryogenic MicroGrinding Technology)는 액체질소를 이용하여 -196도의 초저온상태에서 천연물이나 식품소재를 급속 냉동 분쇄하여 본연의 물성과 맛, 영양, 향 등의 변화를 최소화하는 가공기술이다. 상온에서 분쇄가 어렵거나, 지방함량이 높은 소재, 수분이 많은 소재 등을 가공할 수 있으며 특히 원물 고유특성의 손상 없이 용해력과 분산력의 향상이 가능하다. 또한 CMGT는 원료를 초저온으로 냉각해서 취성파괴(충격에 대해 현저히 부서지기 쉽게 함)에 유효한 충격식 분쇄방식방법이다. 입자간 마찰에 의한 분쇄로 입자의 형태가 원형을 이루며 타 분쇄방식에 비해 같은 입도일 경우 변성이 적고, 분쇄발열이 낮기 때문에 지분이 많은 소재의 연속분쇄가 가능하여 식품소재에 적용이 수월하다. 원물 크기가 큰 것은 조분쇄기(덕산, 한국)에서 5mm 이하로 분쇄하여 사용하였고, Hosokawa에서 제작한 것(Linrex Mill LX-1, Japan)과 덕산에서 제작한 것의 screw를 이용할 수 있는 크기의 원물은 그대로 사용하여 분쇄한다.
단삼뿌리를 극저온 초미세분쇄 공정(Cryogenic Micro Grinding Technology, CMGT)를 이용하여 단삼CMGT를 제조하였다. 보다 구체적으로는 -110 내지 -90 ℃의 극저온에서 단삼 뿌리를 단시간에 동결하고 4500 내지 5500 rpm으로 분쇄하여 단삼 추출물S 및 하기 단삼 추출물T 제조에 사용할 수 있다.
1.2. 단삼 추출물T 제조
단삼 추출물T는 파쇄시킨 단삼뿌리를 50~80℃에서 주정(EtOH)으로 추출하였다(단삼 추출물 T). 또한 추출 주정의 농도에 따른 효과를 확인하기 위하여 주정의 농도를 달리하여 단삼 추출물 T10(EtOH10%), T40(EtOH40%), T70(EtOH70%), T95(EtOH95%), T99(EtOH99%)를 각각 획득하였다. 상기 주정에서 2 내지 24시간 추출하고 필요에 따라 새로운 주정에서 다시 2 내지 12시간 추출한 다음, 필요에 따라 새로운 주정에서 2 내지 5시간 더욱 추출하여 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 수득한 상등액을 취합하여 45 내지 75℃에서 증발, 건조시킨 후, 분쇄하여 80mesh 이상에서 필터링하여 준비하였다.
1.3. 단삼 추출물의 성분 분석
상기 실시예 1.2 및 1.3에서 추출한 단삼 추출물S 및 단삼 추출물T의 성분 및 함량을 측정하였다. 특히 단삼에 함유된 주요 탄시논 4종 성분을 설정하기 위해 기존 연구자에 의해 밝혀진 다양한 화합물 중에서 표준품이 판매되어지고 있는 Tanshinone1, Tanshinone2a, Cryptotanshinone, Dihydrotanshinone 및 salvianolic acid B 등의 성분이 단삼 추출물에 존재하는지 여부를 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. HPLC 조건은 다음과 같다. 컬럼(Column); cadeza cd-C18 3.0㎛, 3.0㎜ × 250㎜, 검출기(Detector); DAD (254 nm), 온도(Temp.); 40℃, 시료량(Injection Volume); 10 μL, 유속(Flow rate); 0.2 mL/min, 이동상(Mobile phase); 80% MeOH 이다.
단삼 추출물에는 주요 탄시논 성분이외에도 다양한 기타 탄시논류가 포함되어 있다. 기타 탄시논류의 표준품의 구매에 어려움이 있다. 따라서 일반적으로 탄시논류는 분자구조상 공통 골격을 갖고 있으며, 분자량이 일정(분자량 300kDa 내외)하고 물리화학적 성격이 유사하다. 이러한 점에 착안하여 Tanshinone2a을 지표성분으로 설정한 후 농도별 흡광도 표준곡선(standard curve)을 설정하였고, 분광광도계(spectrophotometer)로 270nm 파장대에서 흡광도를 측정하여 회귀방정식으로 전체 탄시논을 정량하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
Compound 단삼추출물S 단삼추출물T
T10 T40 T70 T95
Total Tanshinones ≪0.1% 1.72% 10.79% 19.34% 22.22%
15,16-Dihydrotanshinone ≪0.1% ≪0.1% 0.64% 1.31% 1.75%
Tanshinone1 ≪0.1% 0.20% 1.22% 1.84% 2.03%
Tanshinone2a ≪0.1% 0.28% 1.76% 2.81% 3.11%
Cryptotanshinone ≪0.1% 0.50% 2.62% 5.16% 5.88%
기타 Tanshinones ≪0.1% 0.74% 4.55% 8.22% 9.45%
Salvianolic acid B 15.14% 12.98% 2.54% ≪0.1% ≪0.1%
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 열수추출물인 단삼추출물S에는 탄시논류는 거의 검출되지 않았으며, 살비아놀릭산 B가 추출물 내 15.14% 검출되었다. 또한 에탄올 10%에서 탄시논류는 1.72%, 에탄올 40%에서 10.79%가 추출되었으며, 에탄올의 농도를 높일수록 탄시논류의 추출효율이 높아지는 것을 확인하였다. 에탄올 95% 용매조건에서 추출물 내에 총 탄시논류는 22.22% 포함되었다. 이와 반대로 에탄올의 농도가 높아짐에 따라 살비아놀릭산 B의 함량은 급격히 감소하였다.
탄시논류 중 Cryptotanshinone이 가장 많이 검출되었으며, Tanshinone2a, Tanshinone1, 15,16-Dihydrotanshinone 의 순서로 검출되었고, 주요 탄시논류를 제외한 기타 탄시논류 또한 에탄올 농도에 증가함에 따라 추출효율이 증가하였다. 단삼추출물T99의 경우에도 단삼추출물T95와 유사하였으나, 추출과정 시 가열과정에서 불안정성이 높아 대량생산 시 효율성이 낮으므로 이후 단삼추출물T95를 대표로 사용하였다.
< 실시예 3. 단삼 추출물의 DHT 처리 LNCaP 세포에서 안드로겐 경로 관련 단백질 수준에 미치는 확인>
3.1. 세포의 배양
본 발명의 단삼 추출물의 전립선비대증 및 탈모증에 대한 효과를 확인하기 위하여 동물 세포를 배양하였다. 이때 동물 세포는 안드로겐에 민감한 인간 전립선 선암 세포주인 LNCaP 세포를 사용하였으며, 한국 세포주 은행(서울, 한국 KCLB #:21740)에서 구입하였다. 세포는 100 ㎎/㎖ 페니실린/스테렙토마이신 과 10% FBS (fetal bovine serum) 가 첨가된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지에서 배양되었으며 37℃로 유지되는 CO2 배양기 내에서 배양되었다.
3.2 재료의 준비
염소 항 토끼 면역 글로불린G (IgG, 7074) 및 항 마우스 IgG (7076)에 대한 항체는 Cell Signaling (Danvers, MA)에서 구입하였다. AR (SC-816), SRC1 (SC-32789), PSA (SC-7638) 및 β-액틴 (SC-1616)에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (미국 텍사스주 댈러스)에서, 5AR2에 대한 항체 (ab124877)는 Abcam Inc. (미국 메사추세츠 주 캠브리지 소재)에서 구입하였다. 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 배지, 태아 우혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신은 Gibco(빅 캐빈, OK, 미국)에서 구입하였다. 이 외의 피나스테라이드, Fi (≥97 % 순도) 및 DHT (≥99 % 순도)를 포함하는 시약들은 Sigma-Aldrich Inc. (미국 미주리 주 세인트루이스 소재)로부터 구매하였다.
3.3 DHT 처리 LNCaP 세포에 대한 단삼 추출물의 효과
LNCaP 세포주를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎎/mL 스트렙토 마이신이 보충된 2 mL의 RPMI 배지에서 6-웰 플레이트(1×106 세포/웰)에 접종(seed) 하였다. 하루 후, 세포를 24 시간 동안 DHT(10 nmol) 및 단삼 추출물S, 단삼 추출물T95 를 15 ㎍/ml, Tanshinone1, Tanshinone2a, Cryptotanshinone 및15,16-Dihydrotanshinone을 각각 5μM 농도가 되도록 처리하였다. 수확된 LNCaP 세포는 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 냉 방사선 면역 침전 분석 (RIPA)완충액을 사용하여 용해시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 20 분 동안 13,000 RPM에서 원심 분리하고, 단백질 농도를 BCA 분석을 사용하여 측정하였다. 세포 용해물(30 ㎍ 단백질/샘플)을 120%에서 90분 동안 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 분리하고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지유로 막았다. 직후, AR, 5AR2, PSA 및 SRC-1와 같은 1차 항체(1:2000으로 희석 됨)를 밤새 막에 반응시켰다. 막을 세척 한 후 이들은 염소 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG 양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 이차 항체(1:10000로 희석 됨)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 강화 화학 발광(ECL) 검출 시약을 사용하여 면역 검출을 수행하고 이를 도 1에 나타내었다. 그 후, 다빈치 (Davinch-Chemi) 이미징 시스템 (Davinch-K., 서울)을 사용하여 막을 촬영 하였다. 단백질 신호의 화학 발광 강도를 ImageJ 1.47v 소프트웨어를 사용하여 정량화 하여 도 2에 나타내었다. 결과는 Windows 용 SPSS 버전 11.5 (미국 일리노이 주 시카고에있는 SPSS Inc.)에 의해 얻어진 데이터를 평균 ± 평균 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 두 개의 연속 정규 분포 변수의 평균을 독립 표본에 대해 스튜던트 t- 검정으로 비교하였다. Dunnett의 다중 범위 검정을 사용하여 정규 분포를 따르지 않은 2 개 또는 3 개 이상의 변수 그룹의 평균을 비교하였다. p <0.05 및 p <0.01은 통계적 유의성에 대한 기준으로 간주하였다.
도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, LNCaP 세포주는 DHT에 의하여 안드로겐 수용체(AR)를 제외한 안드로겐 관련 단백질의 발현 수준이 증가하였다. 여기에 단삼 추출물S 를 처리한 경우, DHT에 의하여 증가된 SRC-1의 발현이 다소 감소하였으며, 안드로겐 수용체(AR)의 발현량을 40% 감소시켰다. 그러나 전립선비대증에 주요하게 증가하는 5α환원효소 타입2 (5AR2) 및 전립선특이항원(PSA)의 경우, 오히려 발현이 증가하는 양상을 나타내었다. 그러나 단삼 추출물T의 경우, 5α환원효소 타입2 (5AR2), 전립선특이적 항원(PSA), 스테로이드수용체공활성인자-1(SRC-1) 및 안드로겐수용체(AR) 모두의 단백질 발현을 현저히 감소시켰다. 특히 단삼 추출물T는 5α환원효소 타입2 (5AR2), 전립선특이적 항원(PSA) 및 안드로겐수용체(AR) 의 발현을 대조군보다 낮은 수준으로 발현을 억제하였다.
또한, 단삼에서 확인된 주요 탄시논인 Tanshinone1, Tanshinone2a, Cryptotanshinone 및 15,16-Dihydrotanshinone 각 5μM를 DHT 유도 LNCaP 세포주에 처리한 경우, 15,16-Dihydrotanshinone 이 DHT 에 의하여 증가된 안드로겐 관련 단백질의 억제효과를 가장 많이 나타내었다. 특히 15,16-Dihydrotanshinone 는 같은 농도에서 Tanshinone2a 보다 전립선특이적 항원(PSA) 및 안드로겐수용체(AR) 의 발현을 5배 이상 억제하였다. 이는 전립선비대증 또는 탈모증과 같은 안드로겐 관련 단백질을 매개로 하는 질병의 치료와 예방에 효과적인 조성물을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 15,16-Dihydrotanshinone 는 5α환원효소 타입2 (5AR2) 및 스테로이드수용체공활성인자-1(SRC-1)의 발현 또한 Tanshinone2a 보다 더 효과적으로 억제하였다. 한편, 단삼 추출물T 15 ㎍/ml 처리는 15,16-Dihydrotanshinone 보다 더 효과적으로 안드로겐 관련 단백질의 발현을 억제하였다. 이것이 처리 농도의 차이인지 확인하기 위하여 단삼 추출물T 15 ㎍/ml 의 개별 탄시논의 함량을 상기 표 1의 결과를 바탕으로 환산하여 표 2에 나타내었다.
Compound 단삼 추출물T95
Total Tanshinones 15 ㎍/ml 3.33㎍/ml
15,16-Dihydrotanshinone 0.26㎍/ml
Tanshinone1 0.30㎍/ml
Tanshinone2a 0.47㎍/ml
Cryptotanshinone 0.89㎍/ml
기타 Tanshinones 1.42㎍/ml
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 단삼 추출물T에 3.33㎍/ml로 탄시논류가 포함되어 있으며, 여기에는 안드로겐 관련 단백질의 억제효과가 가장 뛰어난 15,16-Dihydrotanshinone의 함량이 0.26 ㎍/ml 밖에 되지 않으나, 다른 주요 탄시논류의 효과보다 뛰어난 안드로겐 관련 단백질의 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 단삼 추출물T에 포함된 여러 종류의 탄시논 혼합물이 상승적 효과를 내거나, 또는 4종의 주요 탄시논 이외의 기타 탄시논류에 안드로겐 관련 단백질의 억제효과가 뛰어난 화합물이 포함되어 있을 가능성이 있다.
3.4 DHT 처리 LNCaP 세포에 대한 단삼 추출물T의 농도별 효과
에탄올 농도에 따른 단삼추출물의 안드로겐 관련 단백질의 억제 효과를 확인하기 위하여 에탄올 95%, 70%, 40%로 각각 추출한 단삼추출물95T, 70T, 40T를 DHT 처리 LNCaP 세포에 농도별로 처리하고 그 효과를 확인하였다. 실시예 3.3과 동일한 방법으로 LNCaP 세포에 DHT를 처리하고, 단삼추출물T95, T70, T40를 각각 5, 10, 15 ㎍/ml로 투여한 후, 안드로겐수용체(AR) 및 전립선특이항원(Prostate PSA)의 발현을 확인하여 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 단삼추출물T95, T70, T40은 농도 의존적으로 안드로겐수용체(AR) 및 전립선특이항원(Prostate PSA)의 발현을 억제하였으며, 단삼추출물T95가 가장 효과가 뛰어났다. 또한 단삼추출물T70은 T40과 비교하여 큰 차이는 없었으나 단삼추출물T70이 T40보다 억제효과가 우수한 경향을 보였다. 이러한 결과를 표 1의 성분함량을 토대로 분석하면, 탄시논류의 추출비율이 현저히 증가하고 살비아놀릭산 등의 물질 함유량이 감소하는 에탄올 40%~99%가 최적 용매농도임을 확인하였다.
< 실시예 4. 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T의 효과 확인>
4.1. 테스토스테론으로 유도한 전립선비대증 동물 모델 구축
9주령(몸무게 350 g이하)의 Sprague-Dawley 랫드를 일주일 이상 순화사육후 실험에 사용하였다. 전립선비대증을 유도하기 위해 고환을 제거한 뒤, 테스토스테론(Testosterone, 옥수수 오일에 녹여서 사용)을 3 mg/kg의 용량으로 1회/3일, 총 10회 피하주사(subcutaneous injection)하였다.
4.2. 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물의 효과 확인
9주령(몸무게 350 g이하)의 Sprague-Dawley 랫드를 무작위로 (1) 정상군, (2) 전립선비대증 유도 및 Vehicle 투여군 (음성대조군), (3) 전립선비대증 유도 및 단삼 추출물S 투여군, (4) 전립선비대증 유도 및 단삼 추출물T70 투여군, (5) 전립선비대증 유도 및 단삼 추출물T40 투여군, (6) 전립선비대증 유도 및 단삼 추출물T10 투여군, (7) 전립선비대증 유도 및 쏘팔메토열매추출물 투여군(양성대조군, 고시형 원료), (8) 전립선비대증 유도 및 피나스테라이드(Finasteride) 투여군 (양성대조군, 치료제) 으로 분리하였다. 전립선비대증 유도군은 상기 실시예 4.1의 방법으로 고환을 제거한 뒤, 디하이드로테스토스테론(Dihydro-testosterone, 옥수수 오일에 녹여서 사용)을 3 mg/kg의 용량으로 1회/3일, 총 10회 피하주사(subcutaneous injection)하였으며, 정상군의 경우, 동량의 옥수수 오일을 피하주사하였다.
단삼 추출물T70~T10과 쏘팔메토 열매추출물은 증류수에 녹여 10-25 mg/kg의 용량으로 1회/일, 14일 간 경구 투여하였다. 피나스테라이드 투여군(시그마, 0.2% tween 80에 녹여서 사용)은 10 mg/kg의 용량으로 1회/1일, 14일 간 경구 투여하였다. 음성대조군은 증류수만을 경구 투여하였다. 실험이 종료되는 시점에 몸무게를 측정하였으며, 마지막 투약 및 처리가 끝난 다음 날 SD-랫드를 이산화탄소 가스로 희생시킨 뒤, 전립선 조직을 적출하고 무게를 측정하고, 그 결과를 도 5 내지 도7에 나타내었다. 모든 동물 관련 절차는 건국대학교 동물 보호 기관과 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었다.
도 5는 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 몸무게 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보는 바와 같이, 전립선비대증 동물 모델(BPH)은 대조군(Con)과 비교하여 몸무게에 유의한 차이가 없어, 고환 제거 수술 후, 테스토스테론 처리되는 전립선비대증 동물 모델이 적절히 확립된 것을 확인하였다. 여기에 양성대조군인 소팔메토(BPH+Saw) 및 피나스테라이드(BPH+Fi)를 투여한 경우, 대조군(Con)과 큰 차이를 보이지 않았으며, 단삼 추출물T(BPH+단삼T70~T10)을 처리한 경우에도 역시의 몸무게에 유의한 변화는 나타내지 않았다. 그러나 단삼 추출물S의 경우, 대조군과 비교하여 몸무게가 감소되었다. 단삼 추출물S는 표 1에서 본 바와 같이, 살비아놀릭산 B가 15% 이상 포함되어 있다. SHAN GAO 등(2019)에 의하면, 살비아놀릭산 B는 세포내에서 강력한 항산화 기능을 하여 산화상태에 의하여 개시되는 프로그램된 세포 사멸을 억제하는 기능을 나타내며, 그 외에도 항염, 항암 기능이 다수 알려져 있다. 그러나, SHAN GAO 등(2019)이 보고한 바와 같이, 살비아놀릭산 B는 일정 농도에서 세포독성을 갖고 있으며, 다른 항암기능 또한 암세포에 나타내는 세포독성 효과를 이용하는 경우가 많다. 본 발명자들은 단삼 추출물S가 살비아놀릭산 B를 높은 농도로 포함하고 있어, 전립선비대증 동물 모델에서 일정한 세포독성을 나타내고 이러한 과정이 SD 랫드의 체중감소로 나타나는 것으로 해석하였다. 특히 도 1 및 표 1에서 본 바와 같이, 살비아놀릭산 B를 주로 포함하고 있는 단삼 추출물S는 전립선비대증에 주요하게 증가하는 5α환원효소 타입2 (5AR2) 및 전립선특이항원(PSA)을 오히려 증가하는 양상을 나타내어, 단삼 추출물을 전립선비대증에 사용하기 위해서는 살비아놀릭산 B의 제거가 필요하다고 사료된다.
도 6은 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 전립선 크기 변화를 보여주는 사진이다. BPH 처리에 의하여 크기가 증가한 랫드의 전립선은 단삼 추출물T70~T10 처리에 의하여 감소하였다. 도 7은 전립선비대증 동물 모델에서 단삼 추출물T70~T10 처리에 따른 랫드의 전립선 무게 변화를 나타내는 그래프이며, 도 8은 각 샘플의 Prostate index(몸무게 대비 전립선무게) 변화를 나타내는 그래프이다. 도 6 내지 도 8에서 보는 바와 같이, 단삼 추출물S는 전체적으로 랫드의 몸무게를 감소시키며, 전립선의 크기를 거의 줄이지 않아 Prostate index(몸무게 대비 전립선무게)가 전립선비대증 모델(BPH)보다 오히려 증가하였다.
이에 반하여 단삼 추출물T70 및 T40은 대조군(Con)과 유사한 정도로 전립선 무게 및 Prostate index를 나타내었으며, 40% 에탄올 추출물에서 전립선비대증이나 남성형 탈모를 치료하기 위해 주로 사용되는 약물인 피나스테라이드와 거의 동일한 효과를 나타내었다. 단삼 추출물T10 의 경우, 전립선 무게 및 Prostate index 감소에 일정 효과는 있었으나, 단삼 추출물T70 및 T40과 같은 현저한 차이를 나타내지 못하였다. 이는 에탄올 농도를 높여 추출함에 따라 증가하는 탄시논류의 함량이 감소하고 살비아놀릭산 B가 감소하는 경향이 있으며, 에탄올 40% 이상에서 추출한 단삼 추출물이 안드로겐 관련 효소의 억제에 효과가 있는 것으로 이해된다.
4.3. 전립선비대증 동물 모델 유래 전립선 조직에서 단삼 추출물의 효과 확인
단삼 추출물T40 의 도 9는 전립선비대증 동물 모델에서 전립선비대 관련 단백인 5α-환원효소(5α-reductase, 5AR2), 안드로겐수용체(Androgen receptor, AR), 전립선특이항원(PSA)의 발현에 미치는 효과를 확인하였다.
상기 실시예 4.2에서 수확된 전립선 조직은 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 냉 방사선 면역 침전 분석 (RIPA) 완충액을 사용하여 용해시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 20 분 동안 13,000 RPM에서 원심 분리하고, 단백질 농도를 BSA 분석을 사용하여 측정하였다. 세포 용해물 (30 ㎍ 단백질 / 샘플)을 120 %에서 90 분 동안 10 % 소듐도데실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지유로 막았다. 직후, AR, 5AR2, PSA 및 β-Actin과 같은 1 차 항체를 밤새 막에 반응시켰다. 막을 세척 한 후 이들은 염소 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 이차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 강화 화학 발광 (ECL) 검출 시약을 사용하여 면역 검출을 수행하였고, 다빈치 (Davinch-Chemi) 이미징 시스템 (Davinch-K.,서울)을 사용하여 막을 촬영하고 이를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 전립선비대증 유도 동물 모델에서 5AR2 및 PSA이 현저히 증가하였으며, 단삼 추출물40T에 의하여 5AR2, AR 및 PSA 모두 단백질의 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
도 10은 BPH에서 Testosterone의 신호전달경로 및 단삼추출물의 약리기전을 나타낸 모식도이다. 전립선비대증의 원인은 아직까지 분명하지 않으나 노화, 남성호르몬의 불균형(특히 디하이드로테스토스테론, DHT), 대사장애가 전립선비대증을 유발하는 주요 발생 요인으로 추측하고 있다. 현재 사용 중인 쏘팔메토열매추출물(건강기능식품 고시형 소재)과 피나스테리드(전립선비대증 치료제)는 남성호르몬만을 표적으로 삼지만, 치료효과를 극대화하기 위해선 노화, 불균형상태인 남성호르몬, 대사장애를 복합적으로 개선할 수 있는 전략이 필요하다. 단삼주정추출물의 주요 탄시논 성분은 NAD+-촉진제로서 세포질 내 ‘NQO1’효소를 표적으로 하며, 동시에 조기질(co-substrate)인 NADH를 NAD+로 전환하여 생체 내 NAD+의 농도를 증가시킨다. NQO1 효소는 플라보 단백질 계통의 2-전자 환원효소로 NADH 또는 NADPH를 보조인자로 Quinone(퀴논) 계통을 화합물을 hydroquinone으로 환원하며, 일반적으로 활성산소의 제거, 비타민K 대사를 수행한다. NAD+-촉진제(주요 탄시논 성분)에 의한 세포 내 NAD+ 증가는 Sirtuin과 AMPK 및 PGC-1α를 활성화하며, 이는 미토콘드리아의 양과 기능을 동시에 증진해 세포 내 에너지대사를 활성화할 수 있다. 특히, Sirtuin은 항노화 효과를, AMPK 및 PGC-1α는 대사질환 개선 효과에 핵심적인 역할을 하는 단백질로서, ‘노화, 대사질환, 남성호르몬 불균형’으로 유발되는 ‘전립선비대증’을 효과적으로 호전시킬 가능성이 클 것으로 기대하였으며, 상기와 같은 결과를 통해 단삼 추출물의 40% 이상(40~99%)의 에탄올 추출물은 전립선비대증 또는 탈모증의 예방 또는 치료에 탁월한 효과를 갖는 것을 확인하였다

Claims (12)

  1. 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 치료 또는 예방용 조성물에 있어서,
    상기 단삼 추출물은 40~99% 에탄올 추출물이며,
    상기 단삼 추출물의 탄시논류는 전체중량의 2% 내지 70% 포함되며,
    상기 탄시논류는 15,16-Dihydrotanshinone을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선비대증의 치료 또는 예방용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은 5α환원효소 타입2 (5AR2), 전립선특이적 항원(PSA), 스테로이드수용체공활성인자-1(SRC-1) 및 안드로겐수용체(AR)로 이루어진 군 중 하나 이상의 단백질 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 전립선비대증의 치료 또는 예방용 조성물.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서,
    상기 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물은,
    불순물을 제거한 단삼을 파쇄시키는 단계(1);
    상기 (1) 단계의 파쇄된 단삼을 50~80℃에서 40~99%의 주정(EtOH)에 침지시키고 2~24시간 방치하는 단계(2);
    상기 (2)단계의 단삼이 추출된 주정을 분리하고, 남은 잔사에 새로운 주정을 넣어 50~80℃에서 40~99%의 주정(EtOH)에 침지시키고 2~12시간 방치하는 단계(3);
    상기 (3)단계의 단삼이 추출된 주정을 분리하고,남은 잔사에 새로운 주정을 넣어 50~80℃에서 40~99%의 주정(EtOH)에 침지시키고 2~5시간 방치하는 단계(4);
    상기 (2)~(4) 단계에서 분리해 놓은 주정을 취합하여 45 ~75℃에서 증발, 건조시키는 단계(5);
    상기 (5)단계에서 증발, 건조시킨 고형추출물을 분쇄하여 80mesh 이상에서 필터링하여 단삼 추출물을 얻는 단계(6);를 포함하는 단삼 추출물 제조방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 전립선비대증의 치료 또는 예방용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 불순물을 제거한 단삼을 파쇄시키는 단계(1)는 단삼을 -196 내지 -80℃의 극저온에서 단시간에 동결하고 5mm 이하로 분쇄하는 초미세분쇄 공정(Cryogenic Micro Grinding Technology, CMGT)으로 분쇄하는 것을 특징으로 하는 전립선비대증의 치료 또는 예방용 조성물.
  10. 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서,
    상기 단삼 추출물은 40~99% 에탄올 추출물이며,
    상기 단삼 추출물의 탄시논류는 전체중량의 2 % 내지 70% 포함되며,
    상기 탄시논류는 15,16-Dihydrotanshinone을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 삭제
  12. 삭제
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