KR102459785B1 - 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법 - Google Patents
세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 추출하기 위한 용액으로 RNA 분해 효소 억제제를 포함하는 조성물을 이용하고, 특정한 온도로 가열하는 단계를 포함하여 별도의 정제과정과 용리과정 없이 중합효소 연쇄반응을 수행하여 분자진단을 위한 시간을 최소화하며, 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감할 수 있는 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 추출하기 위한 용액으로 RNA 분해 효소 억제제를 포함하는 조성물을 이용하고, 특정한 온도로 가열하는 단계를 포함하여 별도의 정제과정과 용리과정 없이 중합효소 연쇄반응을 수행하여 분자진단을 위한 시간을 최소화하며, 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감할 수 있는 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법에 관한 것이다.
최근 인간 유전체 연구 결과를 바탕으로 유전자 수준에서 질병의 원인을 해석함에 따라, 인간의 질병을 치유하거나 예방하고자 하는 목적으로 생체 시료의 조작 및 생화학적 분석에 대한 요구가 점차 증가하고 있다. 또한, 질병의 진단 외에도 신약개발, 바이러스나 박테리아 감염 여부의 사전 검사 및 법의학 등의 다양한 분야에서 생체 시료나 세포가 포함된 시료로부터 핵산을 추출, 분석하는 기술이 요구된다.
한편, 분자진단을 하기 위해서는 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액 또는 혈액 등에서 유전자 정보를 담고 있는 DNA 또는 RNA인 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 질병의 감염여부를 확인하는 것이 일반적이다.
도 1은 종래기술에 따른 중합효소 연쇄반응을 나타낸 순서도이다. 상기 도 1을참고하면, 종래의 경우 검체(S10)로부터 유전자 정보를 담고 있는 핵산을 추출(Extraction, S30)하고 이를 중합효소 연쇄반응을 수행하여 핵산을 증폭(S70, S90)하여 결과를 분석하는 것이 일반적이다. 상기 핵산을 추출하기 위해서는 용해(Lysis, S31), 용리(Elution, S33) 및 정제(Purufication, S50)하는 과정을 필요로 하였다. 다만, 핵산을 추출하기 위하여 용해 및 정제하는 과정에서는 이를 수행하기 위한 전용 추출 장비 및 추출을 위하여 소모되는 용품(플라스틱으로 된 도구, 자성 비드 또는 용액 등)이 필요로 하였다.
상술한 종래기술로 핵산을 추출하는 경우 순도가 높은 핵산을 추출할 수 있지만, 추출하는 과정에서 오랜시간이 소요되어 긴급한 상황이나 응급실에서 진단 또는 검진을 하기 적합하지 못한 문제가 있었으며, 바이러스의 급격한 확산으로 국가 방역이 필요한 상황에 이를 적용하는 것과 추출을 위한 전용기기 및 소모되는 용품을 지속적으로 사용해야 하므로 진단을 위하여 고가의 비용을 지불해야하는 문제점이 있었다.
따라서, 상술한 문제점을 해결하기 위하여 특정한 조성물을 사용함으로써 정제과정이나 용리과정 없이 세포 용해만으로 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있는 기술에 대한 개발이 시급한 실정이었다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 세포 내의 핵산을 추출하기 위하여 세포를 용해하는 과정에서 특정한 성분을 포함하는 조성물을 사용하며, 상기 용해된 세포를 포함하는 혼합물을 가열함으로써 별도의 세포가 용해된 용액의 정제 및 용리과정을 생략하고, 상기 용해된 용액을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있는 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 분자진단방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시상태는 RNA 분해 효소 억제제; 및 완충 용액을 포함하는 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 RNA 분해 효소 A를 억제하는 억제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 완충 용액은 pH 6.0 이상 pH 9.0 이하 인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 완충 용액은 글리세롤(glycerol), 하이드록시에틸피페라진에테인설폰산(HEPES, Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid), 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol), 염화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태는 핵산을 포함하는 시료를 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 25 ℃ 이상 45 ℃ 이하의 온도로 유지하는 1차 가열하는 단계; 및 상기 1차 가열된 혼합물을 75 ℃ 이상 100 ℃ 미만의 온도로 유지하는 2차 가열하는 단계를 포함하는 세포 용해 및 핵산 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계는 각각 1 분 이상 30 분 이하로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는 상기 혼합물의 부피가 30μL인 것을 기준으로 7.5 Unit/reaction 이상 60.0 Unit/reaction 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태는 상기 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물에 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 첨가하는 단계; 및 상기 추출된 핵산을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계;를 포함하는 것인 분자진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물은 별도의 세포가 용해된 용액의 정제과정 및 용리과정을 생략하고 상기 용해된 용액을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 핵산의 증폭하여 분자 진단하는 과정에서 소요되는 시간을 최소할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 세포 용해 및 핵산 추출 방법은 핵산을 추출하는 과정에서 가열을 통하여 중합 연쇄 반응의 정확성을 저해하는 요소들을 비활성화함으로써, 분자 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법은 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상술한 효과로 한정되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본원 명세서 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 종래기술에 따른 중합효소 연쇄반응을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 개략도 및 튜브 내부의 성분을 반응을 간략하게 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 순서도이다.
도 4는 실시예 1에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 1-1 및 1-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 2-1 내지 2-4의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 3에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 3-1 및 3-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 4에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 4-1 및 4-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 4-3 내지 4-6에 따른 분자진단방법의 개략도이다.
도 9는 종래기술인 RNA의 추출과정 및 정제과정을 포함하는 PCR과 제조예의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 제조예의 1차 가열단계에서 RNA 분해 효소 억제제의 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 11은 제조예의 1차 가열단계의 온도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 개략도 및 튜브 내부의 성분을 반응을 간략하게 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 순서도이다.
도 4는 실시예 1에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 1-1 및 1-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 2-1 내지 2-4의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 3에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 3-1 및 3-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 4에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 4-1 및 4-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 4-3 내지 4-6에 따른 분자진단방법의 개략도이다.
도 9는 종래기술인 RNA의 추출과정 및 정제과정을 포함하는 PCR과 제조예의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 제조예의 1차 가열단계에서 RNA 분해 효소 억제제의 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 11은 제조예의 1차 가열단계의 온도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"는 "A 및 B, 또는 A 또는 B"를 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는 RNA 분해 효소 억제제; 및 완충 용액을 포함하는 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물은 별도의 세포가 용해된 용액의 정제과정 및 용리과정을 생략하고 상기 용해된 용액을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써, 핵산의 증폭하여 분자 진단하는 과정에서 소요되는 시간을 최소할 수 있다.
상기 도 1을 참고하면, 종래기술에 따른 분자진단법은 세포 내 DNA 또는 RNA 등의 핵산을 추출(Extraction, S30)하기 위하여 시료를 검체(S10)한 이루 용해(Lysis, S31), 용리(Elution, S33) 및 정제(Purification, S50)과정을 거치고 용리된 용액에 추가적인 PCR 완충용액(buffer)을 첨가하여 RT-PCR(Reverse Transciption PCR, S70) 및 PCR(중합효소 연쇄반응, S90)을 수행한다. 이후 상기 PCR에 의하여 증폭된 핵산을 진단에 이용하는 것이 일반적이었다. 다만, 상기 방법은 용해과정, 용리과정 및 정제과정에 이용되는 전용기기가 요구되며, 상기 과정에서 이용되는 용액 또는 플라스틱 웨어(plasticware)인 플레이트 및/또는 튜브 등과 같은 다양한 소모품을 지속적으로 사용하여야 하는 문제점이 있었다.
다만, 종래기술에 따른 분자진단법에서 핵산을 추출한 이후 샘플을 농축하여 농도가 높은 샘플에 대하여 PCR을 수행하므로 Ct 값이 낮은 경향을 보였다. 이에 대하여 다이렉트 PCR(d-PCR)은 세포를 검체하여 용해(Lysis)를 위한 완충 용액이 첨가되어 희석되므로 PCR 을 수행하기 위한 샘플의 농도가 낮아지므로 상기 종래기술에 따른 분자진단법에 비하여 Ct 값이 높을 수 밖에 없는 한계가 존재하였다. 따라서, 소량의 세포 샘플을 검체하여 RNA를 추출하더라도 RNA의 손상 및 손실을 최소화하여 PCR 효율을 극대화하여 시간을 단축할 수 있는 분자진단방법이 요구되었다.
나아가, 종래의 d-PCR에서 계면활성제를 이용한 화학적 용해과정을 수행하는 경우 검체한 세포와 함께 존재하는 RNA 분해 효소가 필연적으로 포함되어 있는 문제가 있었다. 즉, 세포를 검체하는 과정에서 RNA 분해 효소가 함께 동반되고 계면활성제를 이용하여 상기 세포를 용해(Lysis)하는 과정에서 상기 RNA 분해 효소는 상기 세포로부터 나온 RNA를 분해하여 PCR의 효율이 급격히 저하되는 문제점이 있었다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물은 RNA 분해 효소 억제제를 포함한다. 구체적으로, 가열하더라도 비활성되지 않은 RNA 분해 효소를 억제할 수 있는 RNA 분해 효소 억제제를 포함함으로써, 분자진단을 단순화하며, 분자진단에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 RNA 분해 효소 A를 억제하는 억제제를 포함하는 것일 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 RNA 분해 효소 억제제를 RNA 분해 효소 A를 억제하는 억제제로 선택함으로써, 가열에 의하여 타 RNA 분해 효소를 억제하는 동시에 온도에 안정한 RNA 분해 효소 A를 비활성화 시킴으로써, 분자진단을 단순화하며, 분자진단에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
RNA 분해 효소의 특성을 살펴보면 하기의 표 1과 같다.
| 종류 | RNA 분해 효소 A (Rnase A) |
RNA 분해 효소 T2 (Rnase T2) |
RNA 분해 효소 T1 (Rnase T1) |
RNA 분해 효소 H (Rnase H) |
RNA 분해 효소 P (Rnase P) |
RNA 분해 효소 I (Rnase I) |
| RNA 절단의 필요조건 | - | - | - | divalent metal ion | divalent metal ion | - |
| RNA 절단의 원리 | SsRNA에서 짝을 이루지 않는 시토닌/우라실(pyrimidine) 잔기의 3`말단을 특이적으로 절단 | 모든 잔기 절단(A 잔기 선호) | 3` end의 짝을 이루지 않은 G 잔기 절단 | DNA/RNA hybrid 에서 RNA의 phosphodiester bond 가수분해 | Pre-tRNA의 phosphordiester bond의 가수분해 | T2 유사 모든 잔기 절단 |
| 온도 관련 특성 | 100℃까지 안정 | - | 20℃~50℃ | 60℃, 10분 열처리시 비활성 | 50℃에서 활성,65℃, 10분 열처리시 비활성 | 70℃, 20분 열처리시 비활성 |
구체적으로, RNA 분해 효소는 온도에 따라 영향을 받는 효소에 해당한다. 다만, 가열을 하는 경우, RNA 분해 효소 T2, RNA 분해 효소 T1, RNA 분해 효소 H, RNA 분해 효소 P 및 RNA 분해 효소 I는 낮은 온도에서 비활성되어 RNA를 분해하는 활성을 잃어버리지만, RNA 분해 효소 A는 100 ℃까지 가열하더라도 안정하므로 가열을 통하여 RNA 분해 효소를 모두 비활성시킬 수 없는 문제점이 있었다.
도 2는 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 개략도 및 튜브 내부의 성분을 반응을 간략하게 나타낸 개략도이다. 상기 도 2(a) 및 (b)를 참고하면, 세포 또는 바이러스를 인체로부터 검체를 채취한다. 상기 채취한 검체를 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물에 포함된 RNA 분해 효소 A 억제제는 상기 검체에 포함된 RNA 분해 효소 A를 비활성화하며, 상기 혼합물을 가열하여 RNA 분해 효소 A 이외의 RNA 분해 효소를 모두 비활성화하여 열비활성화(thermal inactivation)시키며, 이와 동시에 세포를 열용해(thermal lysis)하여 세포 내부에 있는 핵산 즉, RNA 또는 DNA를 추출한다. 이후 상기 추출된 핵산에 프라이머, 프로브 및 프리믹스를 혼합해 RT-PCR 및 PCR을 수행하는 경우 핵산을 증폭시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 RNA 분해 효소 억제제는 분자의 크기가 큰 것일 수 있다. 즉, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것으로서 분자의 크기가 큰 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 RNA 분해 효소 억제제는 쥐의 폐로부터 유래된 것, 인간의 태반으로부터 유래된 것 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나인 것일 수 있다. 상기 쥐의 폐로부터 유래된 것인 RNA 분해 효소 억제제는 nanohelix RI(Rnase Inhibitor)일 수 있다. 상기 RNA 분해 효소 억제제는 Nanohelix HelixAyme Rnase Inbibitor(RNI2000), Themo Scientific RiboLock Inhibitor(EO0381), Invitrogen RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor(10777019), Takara Recombinant RNase Inhibitor (2313A), Invitrogen™ SUPERase·In™ RNase Inhibitor (AM2694), Applied Biosystems™ RNase Inhibitor (N8080119), Roche Protector RNase Inhibitor (RNAINH-RO/3335399001), Sigma-Aldrich Ribonuclease inhibitor human (R2520), Promega RNasin®/RNasin® Plus Ribonuclease Inhibitor, NEW ENGLAND BioLabs Inc. RNase Inhibitor, Murine (M0314), NEW ENGLAND BioLabs Inc. RNase Inhibitor, Human Placenta (M0307), ABclonal Technology RNase Inhibitor, Mammalian (RK21401), BioVision RNaseOFF ribonuclease Inhibitor (M1238), PCR Biosystems RiboShield™ RNase Inhibitor (PB30.23-02), Blirt RIBOPROTECT Hu RNase Inhibitor (RT35), highQu GmbH SecurRIN™ Advanced RNase Inhibitor (RNI0305), Enzynomics RNase Inhibitor (M007), Meridian Bioscience RiboSafe RNase Inhibitor (BIO-65027), QIAGEN RNase Inhibitor (Y9240L), Lucigen RiboGuard™ RNase Inhibitor (RG90925), Jena Bioscience RNase Inhibitor - recombinant (PCR392S), abm RNaseOFF Ribonuclease Inhibitor (G138), biotechrabbit RNase Inhibitor (BR0400901), BioFACT™ RNase Inhibitor (RI 152-20h), Canvax RNase Inhibitor (P0269), ShineGene RNasin(RNase Inhibitor) (ZP00801), TOYOBO RNase inhibitor (SIN-201) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 군으로부터 하나일 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것은 분자의 크기가 큰 특징이 있으며, 상기 분자의 크기가 큰 단백질 유래 RNA 분해 효소 억제제를 사용하는 경우 후술할 분자진단과정에서의 PCR(중합 효소 연쇄반응)의 저해를 방지할 수 있으나, PVSA와 같은 화학물질로부터 유래한 RNA 분해 효소 억제제는 분자의 크기가 작아 분자진단과정에서의 PCR(중합 효소 연쇄반응)을 저해하는 역할을 할 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 RNA 분해 효소 억제제를 단백질로부터 유래된 것으로부터 선택함으로써, 분자진단과정에서의 PCR(중합 효소 연쇄반응)의 저해를 방지하여 분자진단과정에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물은 완충 용액을 포함한다. 상술한 것과 같이 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물이 완충 용액을 포함함으로써, 분자진단과정에서의 PCR(중합 효소 연쇄반응)을 반응성을 향상시켜 분자진단과정에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 완충 용액은 pH 6.0 이상 pH 9.0 이하인 것일 수 있다. 구체적으로 상기 완충 용액은 pH 6.1 이상 pH 8.9 이하, pH 6.2 이상 pH 8.7 이하, pH 6.3 이상 pH 8.6 이하, pH 6.4 이상 pH 8.5 이하, pH 6.5 이상 pH 8.4 이하, pH 6.6 이상 pH 8.3 이하, pH 6.7 이상 pH 8.2 이하, pH 6.8 이상 pH 8.1 이하, pH 6.9 이상 pH 8.0 이하, pH 7.0 이상 pH 7.9 이하, pH 7.1 이상 pH 7.8 이하, pH 7.2 이상 pH 7.7 이하, pH 7.3 이상 pH 7.6 이하 또는 pH 7.4 이상 pH 7.5 이하일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 완충 용액의 pH를 조절함으로써, 상기 세포 용해과정에서의 효율을 향상시킬 수 있으며, 상기 RNA 분해 효소 억제제와 RNA 분해 효소와의 반응을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 완충 용액은 글리세롤, 하이드록시에틸피페라진에테인설폰산(HEPES, Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol), 염화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다. 상술한 것으로부터 상기 완충 용액에 포함된 성분을 조절함으로써, 상기 세포 용해과정에서의 효율을 향상시킬 수 있으며, 상기 RNA 분해 효소 억제제와 RNA 분해 효소와의 반응을 촉진시키고, 분자진단과정에서의 PCR(중합 효소 연쇄반응)을 반응성을 향상시켜 분자진단과정에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태는 핵산을 포함하는 시료를 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 25 ℃ 이상 45 ℃ 이하의 온도로 유지하는 1차 가열하는 단계; 및 상기 1차 가열된 혼합물을 75 ℃ 이상 100 ℃ 미만의 온도로 유지하는 2차 가열하는 단계를 포함하는 세포 용해 및 핵산 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 세포 용해 및 핵산 추출 방법은 핵산을 추출하는 과정에서 가열을 통하여 중합 연쇄 반응의 정확성을 저해하는 요소들을 비활성화함으로써, 분자 진단의 정확성을 향상시킬 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법의 순서도이다. 인간으로부터 생물학적인 검체를 채취하는 검체 채취 단계; 상기 채취된 검체를 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계(S110); 상기 혼합물을 1차 가열(인큐베이팅, incubating)하는 단계(S130); 및 상기 인큐베이팅된 혼합물을 2차 가열(열용해, thermal lysis)하는 단계(S150);를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 핵산을 포함하는 시료를 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계(S110)를 포함한다. 구체적으로 상기 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 핵산을 포함하는 시료, 즉 인간으로부터 채취된 생물학적인 검체를 포함하는 것으로 RNA 분해 효소가 포함되어 있으므로 상기 조성물에 포함된 RNA 분해 효소 억제제를 이용해 RNA 분해 효소를 비활성화시켜 후술할 2차 가열(열용해) 단계를 수행하기 전에 세포에서 용해되어 나오는 RNA 등을 RNA 분해 효소로부터 보호할 수 있다. 나아가, 특정한 RNA 분해 효소 억제제를 사용함으로써 불필요한 성분을 최소화하여 PCR 감도를 향상시킬 수 있고 분자진단에 소요되는 시간을 최소화할 수 있다.
본 명세서의 세포 용해 및 핵산 추출 방법에서 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물과 중복되는 내용은 생략한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물 제조 단계(S110) 이전에 인간으로부터 생물학적인 검체를 채취하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 인간으로부터 생물학적인 검체는 혈액, 채액, 타액 등 핵산, 즉 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 세포 등의 검체로 제한없이 채취될 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 혼합물 제조 단계(S110) 이전에 인간으로부터 생물학적인 검체를 채취함으로써, 분자진단 대상 즉, COVID 19의 원인이 되는 SAR-CoV-2 유전자 등을 증폭하여 분자진단을 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물을 25 ℃ 이상 45 ℃ 이하의 온도로 유지하는 1차 가열하는 단계(S130)를 포함한다. 구체적으로 상기 1차 가열 단계는 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 혼합물에 포함된 RNA 분해 효소와 RNA 분해 효소 억제제가 충분히 결합하여 상기 RNA 분해 효소를 비활성화되는 단계일 수 있다. 보다 구체적으로 1차 가열하는 단계의 온도는 26 ℃ 이상 44 ℃ 이하, 27 ℃ 이상 43 ℃ 이하, 28 ℃ 이상 42 ℃ 이하, 29 ℃ 이상 41 ℃ 이하, 30 ℃ 이상 40 ℃ 이하, 31 ℃ 이상 39 ℃ 이하, 32 ℃ 이상 38 ℃ 이하, 33 ℃ 이상 37 ℃ 이하 또는 34 ℃ 이상 37 ℃ 이하일 수 있다. 가장 바람직하게는 1차 가열하는 단계의 온도는 37 ℃로 유지하는 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 1차 가열(인큐베이팅)하는 단계의 온도를 조절함으로써, RNA 분해 효소와 RNA 분해 효소 억제제의 반응을 촉진시켜 RNA 분해 효소가 비활성화될 수 있으며, 세포의 열용해 전에 RNA 분해 효소를 비활성화시킴으로써, 세포로부터 방출되는 RNA의 분해를 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 1차 가열된 혼합물을 75 ℃ 이상 100 ℃ 미만의 온도로 유지하는 2차 가열하는 단계(S150)를 포함한다. 구체적으로 상기 2차 가열하는 단계는 세포의 열용해(thermal lysis) 단계로서, 상기 혼합물에 포함되고 핵산을 포함하는 시료, 즉 인간으로부터 생물학적인 검체인 세포를 포함하는 시료에서 상기 세포를 용해하여 세포 내에 포함된 즉 DNA 및/또는 RNA를 세포 밖으로 노출시키는 단계일 수 있다. 나아가, 상기 세포의 열용해와 동시에 RNA 분해 효소를 비활성화시키는 열비활성화(thermal inactivation)을 동시에 구현하는 것이며, 추가적으로 PCR을 저해하는 세포 내의 성분을 비활성화하는 것을 동시에 구현하는 것일 수 있다. 구체적으로 2차 가열하는 단계(S150)는 세포의 열용해(thermal lysis), RNA 분해 효소의 열비활성화(thermal inactivation) 및 세포 내의 성분을 비활성화를 동시에 구현하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 2차 가열하는 단계는 상기 1차 가열된 혼합물을 76 ℃ 이상 99 ℃ 이하, 77 ℃ 이상 98 ℃ 이하, 76 ℃ 이상 97 ℃ 이하, 77 ℃ 이상 96 ℃ 이하, 78 ℃ 이상 95 ℃ 이하, 79 ℃ 이상 94 ℃ 이하, 80 ℃ 이상 93 ℃ 이하, 81 ℃ 이상 92 ℃ 이하, 82 ℃ 이상 91 ℃ 이하, 83 ℃ 이상 90 ℃ 이하, 84 ℃ 이상 89 ℃ 이하, 85 ℃ 이상 88 ℃ 이하, 86 ℃ 이상 87 ℃ 이하로 유지하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 2차 가열하는 단계는 상기 1차 가열된 혼합물을 94.5 ℃ 이상 95.5 ℃ 이하 또는 95 ℃로 유지하는 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 2차 가열(열용해)하는 단계의 온도를 조절함으로써, 별도의 RNA 분해 효소를 억제하기 위한 첨가물을 생략하여 핵산 이외의 물질의 농도를 낮게 유지하여 최대한 방해요소를 제외할 수 있으며, 별도의 RNA 분해 효소를 억제하기 위한 첨가물을 포함하지 않아 상기 첨자물에 의한 PCR 저해를 방지할 수 있다. 또한, RNA 분해 효소 A 이외의 RNA 분해 효소를 비활성화하는 동시에 세포 내 물질을 비활성화하며, 세포를 열용해하여 세포 내의 핵산(DNA 및/또는 RNA)을 노출하여 분자진단에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 핵산을 포함하는 시료를 가지고 핵산을 추출한 이후 별도로 용리 단계 및 정제 단계를 포함하지 않는다. 상술한 것과 같이 핵산 추출한 이후 별도로 용리 단계 및 정제 단계를 포함하지 않음으로써, 분자진단에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있으며, 핵산 추출을 위한 소모품이나 전용장치를 사용하지 않아 비용을 절감시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계는 각각 1 분 이상 30 분 이하로 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계는 각각 2 분 이상 29 분 이하, 3 분 이상 28 분 이하, 4 분 이상 27 분 이하, 5 분 이상 26 분 이하, 6 분 이상 25 분 이하, 7 분 이상 24 분 이하, 8 분 이상 23 분 이하, 9 분 이상 22 분 이하, 10 분 이상 21 분 이하, 11 분 이상 20 분 이하, 12 분 이상 19 분 이하, 13 분 이상 18 분 이하, 14 분 이상 17 분 이하 또는 15 분 이상 16 분 이하로 수행하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계는 각각 4.5 분 이상 5.5 분 이하 또는 5 분 동안 수행되는 것일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계 각각이 수행되는 시간을 조절함으로써, RNA 분해 효소의 비활성화를 극대화할 수 있으며, 세포 열용해 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는 상기 혼합물의 부피가 30μL인 것을 기준으로 7.5 Unit/reaction 이상 60.0 Unit/reaction 이하인 것일 수 있다. 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는 총 부피의 증가 또는 감소에 따라 변화될 수 있다. 구체적으로 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는 7.5 Unit/reaction 이상 60.0 Unit/reaction 이하, 8.0 Unit/reaction 이상 59.0 Unit/reaction 이하, 9.0 Unit/reaction 이상 58.0 Unit/reaction 이하, 10.0 Unit/reaction 이상 57.0 Unit/reaction 이하, 15.0 Unit/reaction 이상 55.0 Unit/reaction 이하, 20.0 Unit/reaction 이상 50.0 Unit/reaction 이하, 25.0 Unit/reaction 이상 45.0 Unit/reaction 이하, 30.0 Unit/reaction 이상 40.0 Unit/reaction 이하일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는 7.5 Unit/reaction 이상 52.5 Unit/reaction 이하, 30.0 Unit/reaction 이상 52.5 Unit/reaction 이하 또는 30.0 Unit/reaction 이상 45.0 Unit/reaction 이하일 수 있다. 상술한 범위에서 상기 혼합물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도를 조절함으로써, 상기 세포의 열용해 이전에 RNA 분해 효소의 비활성화를 극대화시킬 수 있으며, 상기 세포의 열용해 이후 상기 세포로부터 노출되는 RNA의 분해를 방지할 수 있고, 이후에 PCR을 저해하는 요소를 최소화하여 분자진단에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
본 명에서에서, 단위 “Unit/reaction(U/rxn)”은 1번의 반응 당 5 ng의 RNA 분해 효소 A의 활성을 50 % 저해하기 위해 요구되는 RNA 분해 효소 억제제의 양을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태는 상기 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물에 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 첨가하는 단계; 및 상기 추출된 핵산을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계;를 포함하는 것인 분자진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 분자진단방법은 추출에 이용되는 전용장치 및 소모품을 최소화함으로써 분자진단의 비용을 절감시킬 수 있다.
상기 도 3을 참고하면, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물에 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 첨가하는 단계(S170)를 포함한다. 본 명세서에서, 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 포함하는 조성물는 “PCR 시료”를 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 포함하는 PCR 시료를 상기 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물에 첨가함으로써, 핵산 증폭에 사용되는 성분을 완비하여 용이하게 핵산을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, PCR 시료는 프라이머를 포함하며, 상기 프라이머의 염기서열은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 프라이머는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프라이머 서열(N1)을 사용할 수 있다. 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것일 수 있으며, PCR 반응이 수행되는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, PCR 시료는 프로브를 포함하며, 상기 프로브의 염기서열은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 프로브는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프로브 서열(N1)을 사용할 수 있다. 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것일 수 있으며, PCR 반응이 수행되는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, PCR 시료는 프리믹스를 포함하며, 상기 프리믹스는 특별히 한정되는 것은 아니지만, Nanohelix사의 RealHelixTM qRT-PCR Kit [v6] (UDG System)을 사용하는 것이 바람직하며, PCR 반응이 수행되는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 첨가하는 단계는 상기 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물이 포함된 well(또는 튜브)에 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스 즉, PCR 시료를 첨가하는 것일 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 혼합물로부터 시료를 채취하여 별도의 튜브에 놓고 상기 PCR 시료를 첨가하지 않음으로써, 상기 추출된 핵산을 모두 핵산 증폭을 사용하도록 하여 타겟 유전자의 손실을 최소화하며 PCR 성능을 극대화할 수 있다. 또한, 별도의 용액 이동 과정이 불필요하므로 PCR 준비 시간을 감소시킬 수 있다. 나아가, 상기 세포의 열용해에 의하여 노출된 핵산을 최대한 이용하며, 첨가되는 PCR 시료에 의한 농도 희석을 방지하여 분자진단에 소요되는 시간과 첨가물에 의한 PCR 저해를 방지할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 분자진단방법은 상기 추출된 핵산을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계(S190)를 포함한다. 구체적으로 상기 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계는 RT-PCR(S191)과 PCR(S193)이 순차적으로 수행되는 것일 수 있다. 상술한 것과 같이 상기 추출된 핵산을 중합효소 연쇄반응으로 증폭함으로써, 분자진단을 위한 핵산을 확보할 수 있으며, 분자진단을 위해 소요되는 시간을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 분자진단방법은 상기 프라이머 및 프로브가 포함된 용액;과 프리믹스를 첨가된 well(또는 튜브)을 별도의 정제(purification)없이 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 것일 수 있다. 상술한 것과 같이 PCR 시료가 첨가된 well에 별도의 정제를 수행하지 않고 중합효소연쇄반응으로 증폭함으로써, 분자진단에 소요되는 시간을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1 내지 4에서 사용되는 화합물 및 PCR 수행 조건>
하기 실시예 1 내지 4에서 채취된 검체는 클리닉 스왑(clinical swab)을 이용하여 채취한 뒤 virus transport media에 보관한 검체에 해당하며, 추가적으로 첨가하는 RNA 시료는 정제된 타겟 RNA를 이용하였다.
나아가, 하기 실시예 1 내지 4에서 사용된 RNA 분해 효소 억제제는 쥐의 폐에서 유래된 RNA 분해 효소 억제제(nanohelix사의 Rnase Inhibitor)를 사용하였으며, 완충용액은 글리세롤, 하이드록시에틸피페라진에테인설폰산(HEPES, Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol)및 염화칼륨을 혼합한 것을 사용하였다.
또한, 하기 실시예 1 내지 4에서 PCR을 수행하기 위하여 첨가되는 PCR 시료의 프로브는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프로브 서열(N1)을 사용하였으며, 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것이며, 프라이머는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프라이머 서열(N1)을 사용하였으며 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것을 사용하였다, 나아가, 프리믹스는 Nanohelix사의 RealHelixTM qRT-PCR Kit [v6] (UDG System)을 사용하였다.
하기 실시예 1 내지 4에서 RT-PCR 및 PCR을 수행한 조건은 (1) 50 ℃에서 10 분간 수행하고, (2) 95 ℃에서 5 분 간 수행한 후, (3) 95 ℃에서 10 초간 /58 ℃에서 30초 간 수행하는 것인 (3)만을 40 회 반복하였으며, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)를 측정하였다.
실시예 1(열용해에 따른 효과 확인)
도 4는 실시예 1에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 1-1 및 1-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 4(a)는 실시예 1에 따른 분자진단방법의 개략도이다. 상기 도 4(a)를 참고하면, 실시예 1-1에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체에 증류수를 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분 간 수행하였다. 이후 별도로 배양된 RNA 시료를 RT-PCR을 수행하기 전에 첨가하고 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
실시예 1-2는 상기 실시예 1-1에서 열용해(thermal lysis)를 수행하지 않은 것을 제외하고 상기 실시예 1-1과 동일하게 수행하였다.
도 4(b)는 실시예 1-1 및 1-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다. 상기 도 4(b)를 참고하면, 실시예 1-1의 Ct 값이 실시예 1-2에 비하여 0.5 낮은 것을 확인하였으며, 이는 열용해(thermal lysis) 과정에서 상기 검체와 동반된 PCR 저해 물질(RNA 분해 효소 억제제 A를 제외한 RNA 분해 효소 억제제)가 비활성화되어 나타난 것임을 확인하였다.
실시예 2(RNA 분해 효소 억제제 종류에 따른 효과 확인)
도 5는 실시예 2에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 2-1 내지 2-4의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 5(a)는 실시예 2에 따른 분자진단방법의 개략도이다. 상기 도 5(a)를 참고하면, 실시예 2-1에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체에 증류수를 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 별도로 배양된 RNA 시료를 RT-PCR을 수행하기 전에 첨가하고 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
실시예 2-2는 상기 실시예 2-1에서 상기 RNA 시료를 증류수에 검체와 함께 첨가한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 수행하였다.
실시예 2-3은 상기 실시예 2-2에서 증류수 대신 상기 RNA 분해 효소 억제제를 첨가한 증류수를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 2-2와 동일하게 수행하였다.
실시예 2-4는 상기 실시예 2-2에서 증류수 대신 상기 화학물질로부터 유래한 RNA 분해 효소 억제제인 PVSA(polyvinylsulfonic acid)를 첨가한 증류수를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 2-2와 동일하게 수행하였다.
도 5(b)는 실시예 2-1 내지 2-4의 Ct 값을 나타낸 그래프이다. 상기 도 5(b)를 참고하면, 실시예 2-1은 검체에 포함된 RNA 분해 효소가 열용해에 의하여 대부분 비활성화되고 남은 RNA 분해 효소 A만이 일부 영향으로 주므로 RT-PCR 직전에 첨가된 RNA 시료가 증폭되어 낮은 Ct 값을 갖는 것을 확인하였다. 이에 비하여 실시예 2-2는 검체에 포함된 RNA 분해 효소가 열용해 이전에 영향을 일부 주므로 Ct 값이 증가하며, 실시예 2-1에 비하여 동일한 조건에서 순서만 변경해도 대략 4.8 내지 8 정도의 높은 Ct 값을 갖는 것을 확인하였다. 나아가, 실시예 2-3의 경우 검체와 함께 RNA 분해 효소 억제제를 첨가하므로 상기 RNA 분해 효소 A는 비활성화되어 실시예 2-2에 비하여 2.6 정도의 낮은 Ct 값이 구현되는 것을 확인하였다. 다만, 실시예 2-4는 단백질 유래 RNA 분해 효소 억제제가 아닌 화학물질 유래 RNA 분해 효소 억제제를 사용하므로 PCR을 저해하는 효과에 의하여 Ct 값이 실시예 2-2에 비하여 Ct 값이 0.02 높게 구현되는 것을 확인하였다.
실시예 3(완충 용액에 따른 효과 확인)
도 6은 실시예 3에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 3-1 및 3-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
도 6(a)는 실시예 3에 따른 분자진단방법의 개략도이다. 도 6(a)를 참고하면, 실시예 3-1에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체에 증류수와 별도로 배양된 RNA 시료를 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
실시예 3-2는 상기 실시예 3-1에서 증류수 대신 완충용액을 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 2-2와 동일하게 수행하였다.
도 6(b)는 실시예 3-1 및 3-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다. 상기 도 6(b)를 참고하면, 상기 실시예 3-2의 Ct 값이 상기 실시예 3-1에 비하여 1.8 낮게 구현되는 것으로부터 완충 용액만을 변화시키더라도 PCR 증폭효과가 향상되는 것을 확인하였다.
실시예 4(열용해, 완충 용액 및 RNA 분해 효소 억제제 종류에 따른 효과 확인)
도 7은 실시예 4에 따른 분자진단방법의 개략도와 실시예 4-1 및 4-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 7(a)는 실시예 4에 따른 분자진단방법의 개략도이다. 상기 도 7(a)를 참고하면, 실시예 4-1에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체를 증류수와 별도로 배양된 RNA 시료에 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
실시예 4-2에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체를 증류수에 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 별도로 배양된 RNA 시료를 RT-PCR을 수행하기 전에 첨가하고 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
도 7(b)는 실시예 4-1 및 4-2의 Ct 값을 나타낸 그래프이다. 상기 도 7(b)를 참고하면, 실시예 4-1은 검체와 함께 존재하는 RNA 분해 효소에 의하여 RNA 시료가 분해되어 핵산 증폭을 위한 RNA의 농도가 낮아지므로 Ct 값이 높게 구현되는 것을 확인할 수 있으며, 이에 비하여 실시예 4-2는 핵산 증폭을 위한 RT-PCR 직전에 RNA 시료를 첨가하므로 상기 RNA의 비활성화가 극히 소량 진행되므로 높은 농도의 RNA가 포함되어 Ct 값이 4.7으로 낮게 구현되는 것을 확인하였다.
도 8은 실시예 4-3 내지 4-6에 따른 분자진단방법의 개략도이다. 상기 도 8을 참고하면, 실시예 4-3은 상기 실시예 4-1에서 열용해과정을 추가한 것을 제외하고 상기 실시예 4-1과 동일하게 수행하였다.
실시예 4-4은 상기 실시예 4-3의 증류수에 RNA 분해 효소 억제제를 첨가한 것을 제외하고 상기 실시예 4-3과 동일하게 수행하였다.
실시예 4-5는 상기 실시예 4-3의 증류수에 완충 용액을 첨가한 것을 제외하고 상기 실시예 4-3과 동일하게 수행하였다.
실시예 4-6은 상기 실시예 4-3의 증류수에 RNA 분해 효소 억제제 및 완충 용액을 첨가한 것을 제외하고 상기 실시예 4-3과 동일하게 수행하였다.
상기 실시예 4-3은 상기 실시예 4-1에 비하여 Ct 값 0.5가 낮게 구현된 것을 확인하였으며, 이는 검체에 포함된 RNA 분해 효소가 열용해 과정에서 열비활성화되어 구현된 것임을 확인하였다.
나아가, 실시예 4-4는 상기 실시예 4-1에 비하여 Ct 값 3.1이 낮게 구현된 것을 확인하였으며, 이는 실시예 4-3에서 확인한 열비활성화 효과와 RNA 분해 효소 억제제가 RNA 분해 효소 A를 제거하여 분해되는 RNA를 최소화됨으로써 구현된 것임을 확인하였다.
또한, 실시예 4-5는 상기 실시예 4-1에 비하여 Ct 값 1.8이 낮게 구현된 것을 확인하였으며, 이는 완충 용액이 PCR 증폭효과가 향상되는 것을 확인하였다.
더불어, 실시예 4-6은는 상기 실시예 4-1에 비하여 Ct 값 4.9가 낮게 구현된 것을 확인하였으며, 이는 실시예 4-3에서 확인한 열비활성화 효과와 실시예 4-4에서 확인한 RNA 분해 효소 억제제의 RNA 분해 효소 A를 비활성화 효과가 구현됨과 동시에 실시예 4-5에서 확인한 완충 용액의 PCR에서 저해하는 요소를 방지하는 효과를 모두 구현함으로써, 실시예 4-2와 동등한 수준의 Ct값을 구현할 수 있는 것을 확인하였다.
<제조예>
하기 제조예에서 채취된 검체는 클리닉 스왑(clinical swab)을 이용하여 채취한 뒤 virus transport media에 보관한 검체를 이용하였다.
나아가, 하기 제조예에서 사용된 RNA 분해 효소 억제제는 쥐의 폐에서 유래된 RNA 분해 효소 억제제(nanohelix사의 Rnase Inhibitor)를 사용하였으며, 완충용액은 글리세롤, 하이드록시에틸피페라진에테인설폰산(HEPES, Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol)및 염화칼륨을 혼합한 것을 사용하였다. 또한, 상기 채취된 검체, RNA 분해 효소 억제제 및 완충 용액을 혼합한 혼합물을 제조하였다.
또한, 하기 제조예에서 PCR을 수행하기 위하여 첨가되는 PCR 시료의 프로브는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프로브 서열(N1)을 사용하였으며, 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것이며, 프라이머는 CDC(미국질병통제예방센터)에서 공개한 2019-COVID 프라이머 서열(N1)을 사용하였으며 상기 서열은 http://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-pane;-primer-probes.pdf에서 공개하는 것을 사용하였다, 나아가, 프리믹스는 Nanohelix사의 RealHelixTM qRT-PCR Kit [v6] (UDG System)을 사용하였다.
하기 제조예에서 RT-PCR 및 PCR을 수행한 조건은 (1) 50 ℃에서 10 분간 수행하고, (2) 95 ℃에서 5 분 간 수행한 후, (3) 95 ℃에서 10 초간 /58 ℃에서 30초 간 수행하는 것인 (3)만을 40 회 반복하였으며, 이 과정에서 상기 핵산을 증폭하여 결과를 확인할 수 있는 최소한의 역치 횟수인 Ct(Threshold Cycle)를 측정하였다.
실험예 1(종래의 추출과정이 포함된 PCR과 비교)
도 9는 종래기술인 RNA의 추출과정 및 정제과정을 포함하는 PCR과 제조예의 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
제조예에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체에 증류수, RNA 분해 효소 억제제 및 완충 용액을 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다.
상기 도 9를 참고하면 상기 도 1과 같이 종래기술로 PCR을 수행한 것을, 상기 제조예와 비교한 결과이다. 검체에 RNA 분해 효소 억제제를 포함한 완충 용액을 첨가하여 열용해를 통하여 수행하는 경우 기존의 PCR 방법에 비하여 동등한 수준으로 Ct 값이 구현되는 것을 확인하였다.
실험예 2(1차 가열단계의 혼합물 내 RNA 분해 효소 억제제 농도에 따른 효과 확인)
도 10은 제조예의 1차 가열단계(인큐베이팅)에서 RNA 분해 효소 억제제의 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 제조예에서 RT-PCR 및 PCR을 수행하기 이전에 상기 제조예의 혼합물 농도를 달리하여 상기 혼합물을 37 ℃에서 5분간 1차 가열단계(인큐베이팅)을 수행하였으며, 상기 농도에 따라 Ct 값을 측정하였다. 보다 구체적으로 제조예에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체를 증류수, RNA 분해 효소 억제제 및 완충 용액에 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 상기 제조예의 혼합물 농도를 달리하여 상기 혼합물을 37 ℃에서 5분간 1차 가열단계(인큐베이팅)을 수행하였으며, 다음으로 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다. 상기 변화된 농도는 0 Unit/Reaction(U/rxn), 7.5 U/rxn, 15 U/rxn, 22.5 U/rxn, 30 U/rxn, 37.5 U/rxn, 45 U/rxn 및 52.5 U/rxn이며, 각각의 농도에 대하여 Ct 값을 측정하였다.
상기 도 10을 참고하면, 0 U/rxn에서는 RNA 분해 효소 억제제가 포함되지 않아 Ct 값이 높게 구현되는 것을 확인하였다. 이후 7.5 U/rxn 내지 45 U/rxn의 농도에서는 RNA 분해 효소 억제제의 농도 증가에 따라 Ct 값이 점점 감소하는 것을 확인하였다. 다만, 52.5 U/rxn의 경우 RNA 분해 효소 억제제의 농도가 증가하더라도 Ct 값이 증가하는 것을 확인하지만, 7.5 U/rxn 의 농도에 비하여 Ct 값이 낮은 것을 확인하였다.
실험예 3(1차 가열단계의 온도에 따른 효과 확인)
도 11은 제조예의 1차 가열단계의 온도에 따른 Ct 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 제조예에서 RT-PCR 및 PCR을 수행하기 이전에 상기 제조예의 혼합물에서 RNA 분해 효소 억제제의 농도를 30 U/rxn으로 고정하고 상기 혼합물을 5분간 1차 가열단계(인큐베이팅)의 온도를 변화시키면서 수행하였으며, 상기 온도에 따라 Ct 값을 측정하였다. 보다 구체적으로 제조예에서는 핵산을 포함하는 검체를 채취하고 상기 채취된 검체를 증류수, RNA 분해 효소 억제제 및 완충 용액에 첨가하여 열용해(thermal lysis)를 95 ℃에서 5분간 수행하였다. 이후 상기 제조예의 혼합물 농도를 30 U/rxn으로 고정하고 상기 혼합물의 온도를 변화시키면서 5분간 1차 가열단계(인큐베이팅)을 수행하였으며, 다음으로 RT-PCR 및 PCR을 순차적으로 수행하였다. 상기 변화된 온도는 25 ℃, 37 ℃, 45 ℃ 및 60 ℃이며, 각각의 온도에 대하여 Ct 값을 측정하였다.
상기 도 11을 참고하면, 25 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서는 Ct 값이 일정하게 구현되는 것을 확인하였다. 이후 45 ℃를 이상의 온도에 대하여 Ct 값이 증가하는 것으로부터 온도가 45 ℃ 이상으로 구현되는 경우 RNA 분해 효소 억제제가 저해되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 실시상태에 따른 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 이를 이용한 분자진단방법은 핵산을 추출하기 위한 조성물로 RNA 분해 효소 억제제를 포함하는 동시에 가열하여 RNA 분해 효소를 비활성시킴으로써, 별도의 핵산 정제과정을 생략하여 전체 실험 시간을 단축시킬 수 있고, RNA 손상을 최소화하여 PCR 성능을 개선시킬 수 있다.
이상에서 본 발명은 비록 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
S10: 검체 채취 단계 S30: 추출 단계
S31: 용해 단계 S33: 용리 단계
S50: 정제 단계 S70: RT-PCR
S90: PCR S110: 검체를 포함한 혼합물 제조 단계
S130: 1차 가열(인큐베이팅) 단계 S150: 2차 가열(열용해) 단계
S170: PCR 시료 첨가 단계 S190: 핵산 증폭 단계
S191: RT-PCR S193: PCR
S31: 용해 단계 S33: 용리 단계
S50: 정제 단계 S70: RT-PCR
S90: PCR S110: 검체를 포함한 혼합물 제조 단계
S130: 1차 가열(인큐베이팅) 단계 S150: 2차 가열(열용해) 단계
S170: PCR 시료 첨가 단계 S190: 핵산 증폭 단계
S191: RT-PCR S193: PCR
Claims (9)
- RNA 분해 효소 억제제; 및 완충 용액을 포함하며,
상기 RNA 분해 효소 억제제는 RNA 분해 효소 A를 억제하는 억제제인 것인,
세포 용해 및 핵산 추출용 조성물로서,
상기 조성물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는, 상기 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스; 및 프라이머 및 프로브가 포함된 용액을 포함하는 PCR 반응을 위한 혼합물의 부피가 30μL인 것을 기준으로, 30 Unit/reaction 이상 45 Unit/reaction 이하인 것이고,
상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것으로, RNA 분해 효소와 결합하여 PCR 반응의 저해를 방지하는 것인, 조성물. - 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 완충 용액은 pH 6.0 이상 pH 9.0 이하인 것인,
세포 용해 및 핵산 추출용 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 완충 용액은 글리세롤, 하이드록시에틸피페라진에테인설폰산(HEPES, Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol), 염화칼륨 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것인,
세포 용해 및 핵산 추출용 조성물. - 핵산을 포함하는 시료를 청구항 1의 세포 용해 및 핵산 추출용 조성물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 25 ℃ 이상 45 ℃ 이하의 온도로 유지하는 1차 가열하는 단계; 및
상기 1차 가열된 혼합물을 75 ℃ 이상 100 ℃ 미만의 온도로 유지하는 2차 가열하는 단계를 포함하는,
세포 용해 및 핵산 추출 방법으로서,
상기 조성물에서의 RNA 분해 효소 억제제의 농도는, 상기 조성물; 핵산을 포함하는 시료; 프리믹스; 및 프라이머 및 프로브가 포함된 용액을 포함하는 PCR 반응을 위한 혼합물의 부피가 30μL인 것을 기준으로, 30 Unit/reaction 이상 45 Unit/reaction 이하인 것이고,
상기 RNA 분해 효소 억제제는 단백질로부터 유래된 것으로, RNA 분해 효소와 결합하여 PCR 반응의 저해를 방지하는 것인, 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 1차 가열하는 단계 및 2차 가열하는 단계는 각각 1 분 이상 30 분 이하로 수행하는 것인,
세포 용해 및 핵산 추출 방법. - 삭제
- 청구항 6의 세포 용해 및 핵산 추출 방법으로 추출된 핵산을 포함하는 혼합물에, 프라이머 및 프로브가 포함된 용액,과 프리믹스를 첨가하는 단계; 및
상기 추출된 핵산을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계;를 포함하는 것인, 분자진단방법.
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