KR102443523B1 - 리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 - Google Patents

리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카인산으로 유도된 발작 마우스에서 뇌신경세포의 사멸이 증가하고, 해마 조직 및 혈액에서의 리포칼린-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로, 혈중 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 발작에 의한 뇌신경세포 사멸을 예측 또는 진단할 수 있다.

Description

리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법{Method for providing information of prediction or diagnosis of seizure-derived neuronal death using lipocalin-2 protein}
본 발명은 리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
발작(seizure)은 대뇌피질의 신경세포가 비정상적으로 과도하게 동시 다발적인 활성화로 인해 일어나는 증상으로, 평상시에는 신경세포 내 전기적 활성이 주변의 신경회로로 확대되지 않는 상태로 유지되다가 몸 상태나 환경 변화에 의해서 전기적 활성이 주변의 신경회로로 확대되어 일어난다. 발작이 일어날 경우 뇌세포에서는 평소보다 훨씬 높은 1초당 500회의 전기신호를 내보내게 되며, 발작은 뇌세포의 구조적 신경 회로 상의 문제나 신호전달에 중추적 역할을 하는 신경전달물질(neurotransmitter)의 불균형 등에 의해서 일어나기도 한다. 그 외에도 중풍이나 뇌 부상으로 뇌에 손상이 있었을 경우 뇌조직에서 자체적으로 회복하는 과정에서 뇌세포 사이에 부적절한 전기적 신호가 방출되면서 일어나거나, 뇌종양 및 치매 등의 질환으로 인해 뇌기능의 장애가 일어나 발작이 일어나기도 한다.
카인산(kainic acid)은 글루탐산 유사 화합물로, 신경세포의 사멸을 유도하여 발작을 유발하는 인자로 알려져있다(McCord et al., 2008. Neuroscience. 2008 154: 1143-1153). 또한, 카인산 주입은 성상교세포 및 소교세포의 세포 사멸과 손상된 해마의 신경 세포에서의 염증성 사이토카인 분비를 활성화시킨다고 보고된 바 있다(Ravizza et al., 2005. Epilepsia. 46: 113-117).
한편, 리포칼린-2(Lipocalin-2, LCN2)는 리포칼린 슈퍼패밀리 멤버 중 하나로, oncogene 24p3 또는 호중구 젤라틴 분해효소 관련 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)이라고도 알려져 있으며 약 25kDa의 당단백질로 이루어져 있다.
한편, 한국등록특허 제2156089호에는 '리포칼린-2의 선택적 과발현을 통한 염증형성 형질전환 동물모델 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1575093호에는 '리포칼린-2 억제제를 유효성분으로 함유하는 염증성 통증의 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 카인산으로 유도된 발작 마우스의 해마 조직에서 뇌신경세포 사멸이 증가하였고, 해마 조직 및 혈액에서 리포칼린-2의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 의심 환자의 혈액 내 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 상기 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우에 발작에 의한 뇌신경세포 사멸로 판단하는 단계;를 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈중 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 투여 후, 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 카인산으로 유도된 발작 마우스에서 뇌신경세포의 사멸이 증가하고, 해마 조직 및 혈액에서의 리포칼린-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로, 혈중 리포칼린-2 단백질 발현 수준을 측정함으로써 발작에 의한 뇌신경세포 사멸을 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있다.
도 1은 카인산 유도 발작 마우스의 해마 조직에서 뇌신경세포 사멸을 확인한 결과이다. 대조구는 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스의 해마 조직이다. 초록색 형광은 사멸된 세포를 나타내는 것이고, 파란색 형광은 세포의 핵을 나타내는 것이다.
도 2는 카인산 유도 발작 마우스의 해마 조직에서의 리포칼린-2(LCN2)의 발현을 확인한 결과로, (a)는 웨스턴 블랏으로 확인한 리포칼린-2 단백질 밴드 사진이고 (b)는 β-actin으로 정량화한 리포칼린-2의 상대적 발현양을 나타낸 결과이다. 대조구는 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스의 해마 조직이다.
도 3은 카인산 유도 발작 마우스의 해마 조직 및 제3뇌실에서의 리포칼린-2의 발현을 확인한 결과이다. 대조구는 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스의 해마 조직이다. 제3뇌실의 사진에서 초록색 형광은 리포칼린-2-positive 세포를 나타내는 것이고, 파란색 형광은 세포의 핵을 나타내는 것이다. 해마 조직의 CA3 영역 사진에서 갈색점은 리포칼린-2-positive 세포인 성상교세포를 나타내는 것이다.
도 4는 카인산 유도 발작 마우스의 혈중 리포칼린-2(LCN2) 농도를 확인한 결과로, (a)는 ELISA 분석 결과이고 (b)는 웨스턴 블랏으로 확인한 리포칼린-2 단백질 밴드 사진이며 (c)는 IgG로 정량화한 리포칼린-2의 상대적 발현양을 나타낸 결과이다. 대조구는 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스의 혈청이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 의심 환자의 혈액 내 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우에 발작에 의한 뇌신경세포 사멸로 판단하는 단계;를 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 '발작(seizure)'은 간질, 발열, 뇌수막염 또는 전해질 이상 등의원인에 의해 발생하는 데, 이러한 발작으로 인한 뇌신경세포 사멸을 혈액 검사를 통해 예측 또는 진단할 수 있는 것이다.
본 발명에서, 용어 '진단(diagnosis)'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 여부를 확인하는 것이다.
상기 정보를 제공하는 방법에 있어서, 사용되는 시료는 혈청, 혈장 및 혈액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 혈청을 시료로 사용하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 (1) 단계의 단백질의 발현 수준 측정은 리포칼린-2 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머를 이용한 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 '단백질의 발현 수준 측정'은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위해 생물학적 시료에서의 리포칼린-2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 통상적으로 단백질의 양을 확인함으로써 수행될 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 혈중 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 리포칼린-2(LCN2) 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 리포칼린-2(LCN2) 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, LCN2 유전자의 전장 혹은 일부를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자의 전장 혹은 일부에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질을 면역원(항원)으로 사용하여, 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 기능적인 단편도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 ScFv 등이 있다.
본 발명에서, 용어 "압타머(aptamer)"는 안정된 삼차구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 특이적 결합을 하는 기능 때문에 항체와 비교되며 항체의 대체 기술로 평가되고 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트에서, 상기 키트는 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 키트가 ELISA 키트인 경우, 바람직하게 리포칼린-2 단백질에 결합된 항체를 검출할 수 있는 표지 물질, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수도 있다.
상기 표지 물질은 염색원, 형광물, 효소, 리간드, 발광물 및 방사선동위원소 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 투여 후, 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 발작에 의한 뇌신경세포 사멸을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 LCN2 단백질의 발현 수준의 변화(증가 또는 감소)를 비교하는 방법으로 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 치료제를 스크리닝할 수 있고, 바람직하게는 LCN2 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 치료제로서 선택할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 카인산 유도 발작 마우스 모델 제작
수컷 C57BL/6 마우스를 중앙실험동물에서 구입하여 20㎎/㎏의 카인산(kainic acid, KA)을 복강 주사로 주입하여 카인산으로 유도된 발작 마우스 모델을 제작하였다. 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스를 대조구로 이용하였고, 모든 실험 동물은 카인산을 주입하고 6시간 또는 24시간 후에 5㎎/㎏의 졸레틸(zoletil)로 마취한 후 뇌 조직을 적출하거나, 혈청을 분리하여 이후 실험에 사용하였다.
실시예 2. 카인산 처리에 의한 뇌신경세포 사멸 분석
카인산 유도 발작 마우스의 뇌신경세포 사멸을 분석하기 위하여 크레실 바이올렛 염색(cresyl violet staining)과 TUNEL 어세이를 수행하였다. 카인산을 주입하고 6시간 또는 24시간 후에, 생리식염수를 이용하여 경심관류로(trancardially) 마우스의 혈액을 제거하고, 뇌 조직을 적출하여 0.1M PBS에 녹인 4%(v/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 처리하여 6시간 동안 조직을 고정시켰다. 이후, 4℃에서 15% 수크로즈(sucrose)가 포함된 0.1M PBS에 담그고, 30% 수크로즈가 포함된 0.1M PBS에 담가 뇌 조직을 가라앉게 하였다. 뇌 조직을 OCT에 임베드(embed)하여 얼린 후, 40㎛의 두께로 관상면(coronal section)으로 절편을 만들어 크레실 바이올렛 염색을 실시하고 BX51 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
뇌 조직에서의 신경세포사멸을 측정하기 위하여 in situ 세포 사멸 검출 키트(Roche Molecular Biochemicals, Germany)를 이용하여 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 어세이를 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 진행하였고, 핵은 DAPI(4'-6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하여 BX51-DSU 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 카인산을 처리한 마우스의 해마 CA3 영역에서 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였다. 특히, 카인산을 6시간 처리하였을 때보다 24시간 처리하였을 때 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 3. 카인산 처리에 의한 뇌조직의 리포칼린-2 발현 분석
카인산 유도 발작 마우스의 해마 조직을 라이시스 버퍼(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 균질화(homogenize)시켜, Bio-Rad 단백질 어세이 키트를 이용하여 단백질을 농도를 정량하고, 리포칼린-2 항체(R&D, AF1857, 1:1,000)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 대조군으로는 β-actin 단백질을 이용하였고, ECL(Pierce, Rockford, USA) 용액으로 단백질 밴드를 관찰하였으며, Multi-Gauge V 3.0 이미지 분석 프로그램(Fujifilm, Japan)을 이용하여 리포칼린-2 단백질의 상대적 발현양을 분석하였다.
그 결과, 0.9% 생리식염수를 주입한 마우스의 해마 조직에서는 리포칼린-2 단백질이 검출되지 않은 반면, 카인산을 주입한 마우스의 해마 조직에서는 리포칼린-2의 단백질이 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 카인산을 6시간 처리하였을 대보다 24시간 처리하였을 때, 해마 조직에서 리포칼린-2 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
또한, 카인산으로 유도된 발작 마우스의 뇌 조직 중 어느 부위에서 리포칼린-2의 발현이 증가하는지 분석하기 위해 면역조직화학 실험을 수행하였다. 프리-플로팅(Free-floating) 뇌 조직 절편을 4℃에서 리포칼린-2 항체(1:200)와 하룻밤 동안 반응시킨 후, 세척하고 2차 항체와 반응시켰다. 이후, ABC 솔루션(avidin-biotin-peroxidase complex solution, Vector Laboratories, USA)과 반응시키고, 0.025% DAB(3,3'-Diaminobenzidine, Sigma, USA)으로 염색하였다. 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 상기 염색한 조직 절편을 마운팅(mountint)하고 건조시킨 뒤, 커버 슬라이드를 덮어 고정시켜 BX51 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 카인산 처리에 의해 해마의 CA3 영역에서 리포칼린-2의 발현이 증가하였고 특히, 제3뇌실의 성상교세포(astrocyte)에서 리포칼린-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 4. 카인산 처리에 의한 혈중 리포칼린-2 농도 분석
카인산 유도 발작 마우스의 혈중 리포칼린-2의 농도를 측정하기 위하여 ELISA 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. 카인산을 주입하고 6시간 또는 24시간 후에, 왼쪽 뇌실에서 채취한 혈액에서 혈청을 분리하여 샘플로 이용하였다. ELISA 분석은 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 진행하여 리포칼린-2의 농도를 정량하였고, 웨스턴 블랏은 상기 전술한 방법과 동일하게 진행하였으며 대조군으로는 IgG 단백질을 이용하였다.
그 결과, 0.9% 생리 식염수를 주입한 마우스의 혈청에서는 리포칼린-2 단백질이 검출되지 않은 반면 카인산을 주입한 마우스의 혈청에서는 리포칼린-2 단백질이 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 카인산을 6시간 처리하였을 때보다 24시간 처리하였을 때, 혈중 리포칼린-2의 농도가 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
따라서, 카인산으로 유도된 발작 마우스에서는 신경세포사멸이 일어나며, 해마 조직 및 혈액에서 리포칼린-2의 단백질 발현이 모두 증가하는 것을 알 수 있었다.

Claims (8)

  1. (1) 글루탐산 유사 화합물에 의해 특이적으로 유발된 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 의심 환자의 혈액 내 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 리포칼린-2 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머를 이용한 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 또는 단백질 칩(protein chip)을 통해 측정하는 단계;
    (2) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우에 글루탐산 유사 화합물에 의해 특이적으로 유발된 발작에 의한 뇌신경세포 사멸로 판단하는 단계;를 포함하는 글루탐산 유사 화합물에 의해 특이적으로 유발된 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 리포칼린-2 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머를 이용하여 혈중 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 글루탐산 유사 화합물에 의해 특이적으로 유발된 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제4항의 조성물을 포함하는 글루탐산 유사 화합물에 의해 특이적으로 유발된 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단용 단백질 칩 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
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KR1020200159021A KR102443523B1 (ko) 2020-11-24 2020-11-24 리포칼린-2 단백질을 이용한 발작에 의한 뇌신경세포 사멸 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법

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JP2011519037A (ja) 2008-04-30 2011-06-30 ヴァーシテック・リミテッド 心臓及び脳卒中のリスクのための予後診断及び診断マーカーとしてのリポカリン−２

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Title
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