KR102431011B1

KR102431011B1 - 림프행성 약제 투여법으로 유효한 약제

Info

Publication number: KR102431011B1
Application number: KR1020197007005A
Authority: KR
Inventors: 데츠야 고다마; 시로 모리; 고 노하라
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 도호쿠다이가쿠; 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤
Priority date: 2016-10-05
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2022-08-09
Also published as: TWI754666B; RU2019109965A; MX2019003943A; EP3524269B1; CA3039442A1; EP3524269A4; AU2017340350A1; JPWO2018066278A1; AU2017340350B9; KR20190064570A; EP3524269A1; RU2019109965A3; CN110022899A; AU2017340350B2; CA3039442C; US20200038400A1; US20230119275A1; WO2018066278A1; BR112019006949A2; RU2759640C2

Abstract

항암제를 림프절 내 투여하는 림프행성 약제 투여에 있어서, 바람직한 의약 조성물을 제공한다. 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제를 유효 성분으로 하는, 림프절 내 투여되는 암 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.

Description

림프행성 약제 투여법으로 유효한 약제

본 발명은 림프행성 약제 투여법에 적합한 의약 조성물에 관한 것이다.

암은 일본인의 두 명 중 한 명이 걸리는 병으로, 암 환자의 사인 9 할이 전이에서 기인한다. 유방암이나 두경부암을 비롯한 암의 상당수는, 림프관을 통하여 소속 림프절에 전이를 초래한다. 최초로 전이를 초래하는 림프절은 센티넬 림프절로 불린다.

전이 림프절의 치료에는, 림프절 숙청술이나 방사선 치료 외에, 정맥에 항암제를 주사하는 전신 화학 요법이 일반적이지만, 항암제와 같은 저분자는, 종양 주위의 간질에 있는 모세 혈관에서 용이하게 재흡수되어 버리기 때문에, 전신 화학 요법으로는 반드시 충분한 치료 성과를 올릴 수 없다.

최근, 본 발명자들은, 인간의 림프절과 동등한 크기를 갖는 특수한 마우스를 수립하는 것에 성공하였다. 그리고, 이러한 마우스의 림프절 (장골하 림프절 (SiLN)) 에 암세포를 이입하고 고유 액와 림프절 (PALN) 에 전이시킨 림프절 전이 모델에 있어서, 장골하 림프절 (SiLN) 로부터 독소루비신을 투여한 경우에, 암이 발병한 고유 액와 림프절 (PALN) 에 있어서, 항암 작용이 발휘되는 것을 알아내었다 (비특허문헌 1).

Shigeki Kato, Shiro Mori, Tetsuya Kodama, Journal of Cancer 2015, 6 (12) : 1282-1294.

본 발명은, 항암제를 림프절 내 투여하는 경우의 보다 바람직한 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 이러한 실정을 감안하여 검토한 결과, 대사 길항제 또는 식물 알카로이드계 항암제가, 림프절 내 투여한 경우에 소량으로 우수한 항종양 활성을 발휘하여, 림프절 내 투여를 위한 약제로서 보다 유용한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하의 (1) ∼ (10) 에 관련된 것이다.

(1) 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제를 유효 성분으로 하는, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.

(2) 대사 길항제가 5-플루오로우라실 또는 그 염인 (1) 에 기재된 의약 조성물.

(3) 식물 알카로이드계 항암제가 이리노테칸, SN-38, 도세탁셀 및 그것들의 염에서 선택되는 1 종 이상인 (1) 또는 (2) 에 기재된 의약 조성물.

(4) 투여 대상의 림프절이, 치료 또는 예방적 치료를 목적으로 하는 림프절 또는 당해 림프절이 속하는 림프관 네트워크 상류에 위치하는 림프절인 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

(5) 단회 투여량이, 대사 길항제로서 1 ng ∼ 100 ㎎ 및/또는 식물 알카로이드계 항암제로서 1 ng ∼ 20 ㎎ 인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

(6) 점도가, 40 mPa·s 이하인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

(7) 점도가, 1 ∼ 10 mPa·s 인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

(8) 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물을 제조하기 위한, 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제의 사용.

(9) 림프절 내 투여에 의해 암의 치료 또는 예방적 치료를 실시하기 위한, 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제를 포함하는 의약 조성물.

(10) 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제를 포함하는 의약 조성물을 환자에게 림프절 내 투여하는, 암의 치료 또는 예방적 치료 방법.

본 발명의 림프절 내 투여를 위한 의약 조성물은, 저용량으로 우수한 항종양 효과를 발휘한다. 또, 림프관 네트워크의 상류에 위치하는 림프절 내에 투여함으로써, 하류에 위치하는 림프절도 치료 대상으로 하는 것이 가능해진다. 이로써, 전이 초기 단계에 있는 림프절이나 전이될 위험성이 높은 림프절을 치료 또는 예방적 치료의 대상으로 할 수 있다.

도 1 은 고유 액와 림프절 전이 모델 마우스와 당해 마우스를 사용한 약제 투여의 도면이다. 종양 세포를 장골하 림프절 (SiLN) 에 이식함으로써, 림프관을 통하여 고유 액와 림프절 (PALN) 에 종양 세포의 전이를 유도한다. 다음으로 부액와 림프절 (AALN) 에 약제를 투여함으로써, 림프관을 통하여 고유 액와 림프절에 약제를 송달시켜, 전이된 종양 세포를 치료한다.
도 2 는 Solution B 투여 후, day 9^T 시에 있어서의 고유 액와 림프절의 병리도 사진 (a : 2 배, b : 10 배) 이다. b 는 a 의 □ 부분을 확대한 것으로, cor 은 림프절의 피질을, T 는 종양을 나타낸다. 림프절 피질 표층에 종양 세포의 잔존을 확인하지만, 림프절 변연동 상당부에 종양 세포는 보이지 않는다.
도 3 은 Solution C 투여 후, day 9^T 시에 있어서의 고유 액와 림프절의 병리도 사진 (a : 2 배, b : 10 배) 이다. b 는 a 의 □ 부분을 확대한 것으로, T 는 종양을 나타낸다. 림프절 실질 및 변연동에 종양의 침윤·증식이 확인된다.
도 4 는 Solution C 투여 후, day 9^T 시에 있어서의 부액와 림프절의 병리도 사진 (a : 2 배, b : 10 배) 이다. b 는 a 의 □ 부분을 확대한 것으로, F 는 섬유화를 나타낸다. 림프절 수질을 중심으로 광범위한 괴사와 섬유화가 확인되고, 변이는 림프절 피질 및 수출 림프관 기부를 포함한 림프절 피막 외에도 이르러, 수출 림프관의 통과 장해가 시사된다.

본 발명의 의약 조성물은, 대사 길항제 및 식물 알카로이드계 항암제에서 선택되는 1 종 이상의 항암제를 함유하고, 림프절 내에 국소 투여되는 것이다.

대사 길항제로는, 예를 들어, 5-플루오로우라실 (5-FU), 5-FU 의 프로드러그 (예를 들어, 테가푸르 또는 그 염), 카페시타빈 또는 그 염, TS-1 (S-1 이라고도 한다. 테가푸르에 모듈레이터를 병용한 배합제), 카르모푸르, 독시플루리딘 등의 불화피리미딘계 항암제 외에, 젬시타빈, 시타라빈, 에노시타빈, 메르캅토푸린, 플루다라빈, 클라드리빈, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 하이드록시카르바미드, 넬라라빈, 펜토스타틴이나 이것들의 프로드러그 등을 들 수 있고, 생체 내에서 5-플루오로우라실을 존재시키는 불화피리미딘계 항암제가 보다 바람직하고, 특히 5-플루오로우라실 또는 그 염이 바람직하다.

여기서, 염으로는, 약학적으로 허용되는 무기산 (예를 들어, 염산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 인산) 또는 유기산 (예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산) 의 염을 들 수 있다.

식물 알카로이드계 항암제로는, 예를 들어, 빈크리스틴, 빈브라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 에토포사이드, 이리노테칸 혹은 그 활성 대사물 또는 그것들의 염, 노기테칸, 소부족산, 도세탁셀, 파클리탁셀, 파클리탁셀 주사제, 에리불린 등을 들 수 있고, 이리노테칸 혹은 그 대사물 또는 그것들의 염이 바람직하다. 이리노테칸의 활성 대사물로는, 7-에틸-10-하이드록시캠토테신 (SN-38) 을 들 수 있다.

이리노테칸의 염으로는, 상기 서술한 약학적으로 허용되는 무기산 또는 유기산의 염을 들 수 있고, 바람직하게는 염산염이다.

본 발명의 의약 조성물의 단위 투여 제형 중의 항암제의 함유량은, 그 종류에 따라서도 상이한데, 1 ng ∼ 1000 mg, 바람직하게는 10 ng ∼ 100 mg, 보다 바람직하게는 100 ng ∼ 10 mg, 보다 바람직하게는 1 ㎍ ∼ 1 ㎎ 이다.

본 발명의 의약 조성물은, 림프절 내에 투여하는 점에서, 림프절 내에 주사 가능한 제형인 것이 바람직하다. 주사 가능한 제형으로는, 주사 가능한 용액, 주사 가능한 현탁액, 주사 가능한 유화액, 주사 가능한 겔, 주사 가능한 고체 형태를 들 수 있다.

주사 가능한 고체 형태란, 사용시에 림프절 내 주사로서 사용할 수 있도록, 주사용 수, 주사용 생리 식염수, 주사용 포도당액 등의 용매와 혼합되는, 동결 건조 제제나 분말 충전 제제를 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에는, 상기 항암제 외에, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이 경우, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는, 수용성 용매 혹은 유성 용매, 분산제, 등장화제, 방부제, 가용화제, 안정제 등으로부터 적절히 선택할 수 있다.

여기서, 수용성 용매로는, 예를 들어, 증류수, 생리 식염수, 링겔액 또는 인산염 완충액 (PBS) 등을 들 수 있다. 유용성 용매로는, 예를 들어, 올리브유, 피마자유, 참기름, 면실유, 옥수수유 등의 식물유를 들 수 있다. 분산제로는, 예를 들어, tween 20 혹은 tween 80, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨 등을 들 수 있다. 등장화제로는, 예를 들어, 염화나트륨, 글리세롤, 소르빈알코올, 글루코오스 등을 들 수 있다. 가용화제로는, 예를 들어, 살리실산나트륨, 폴록사머, 아세트산나트륨 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질알코올, 클로로부탄올, 벤조산나트륨, 페놀 등을 들 수 있다. 안정제로는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 등의 알부민을 들 수 있다.

당해 의약 조성물은, 본 발명의 항암제를, 공지된 제제 기술을 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항암제를, 상기의 분산제, 등장화제, 방부제, 가용화제, 안정제 등과 함께, 수용성 용매 또는 유용성 용매에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 조제할 수 있다.

또, 본 발명의 의약 조성물은, 종양 축소 효과의 점에서, 점도가 40 mPa·s 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30 mPa·s 이하, 보다 바람직하게는 20 mPa·s 이하, 보다 바람직하게는 10 mPa·s 이하이다. 또 0.5 mPa·s 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 mPa·s 이상이다.

예를 들어, 바람직하게는 0.5 ∼ 40 mPa·s, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 30 mPa·s, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 20 mPa·s, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 10 mPa·s, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 10 mPa·s 이다.

점도는 후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 20 ℃ 에 있어서 진동 점도계 (예를 들어, 음차 진동식 점도계 ＜SV-1A, 에이·앤드·디 주식회사 제조＞) 를 사용하여 측정하는 것이 가능하다.

점도의 조정은, 일반적으로 주사 제제에 있어서, 증점제로서 사용되는 각종 친수성 폴리머를 사용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 셀룰로오스, 아밀로오스, 펙틴, 젤라틴, 덱스트린, 알긴산염 등의 직사슬형의 다당류 ; 셀룰로오스 유도체 (메틸셀룰로오스 (MC), 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC) 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC) 등의 하이드록시알킬셀룰로오스, 카르복시알킬셀룰로오스, 그리고 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 를 포함하는 이들의 염 등) ; 글리코사미노글리칸 (히알루론산 및 그 염 등의 비황산화글리코사미노글리칸, 탈황산화헤파린, 탈황산화콘드로이틴황산 및 탈황산화데르마탄황산 등) ; 갈락토만난 (구아검, 페뉴그릭검, 타라검, 로커스트빈검 및 캐롭검 등) ; 카보머 ; 폴리아크릴산 ; 폴리카르보필 ; 폴리비닐피롤리돈 ; 폴리아크릴아미드 ; 폴리비닐알코올 ; 폴리아세트산비닐의 유도체 및 혼합물을 들 수 있는 것 외에, 안정화제, 계면 활성제, 현탁화제, 유화제, 분산제, 용제, 용해제, 용해 보조제 등으로서도 사용 가능한, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류를 사용할 수 있고, 종양 축소 효과의 점에서 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류를 사용하는 것이 바람직하다. 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르로는, 모노라우르산폴리옥시에틸렌소르비탄 (폴리소르베이트 20, Tween 20), 모노스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄 (폴리소르베이트 60, Tween 60), 트리스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄 (폴리소르베이트 65, Tween 65), 올레산폴리옥시에틸렌소르비탄 (폴리소르베이트 80, Tween 80) 이 바람직하고, 올레산폴리옥시에틸렌소르비탄이 보다 바람직하다.

이렇게 하여 조제된 본 발명의 의약 조성물은, 환자의 림프절 내에 국소 투여된다. 여기서, 투여 대상이 되는 림프절은, 치료 또는 예방적 치료를 목적으로 하는 림프절 (표적 림프절) 자체여도 되고, 또는 당해 림프절이 속하는 림프관 네트워크 상류에 위치하는 림프절이어도 된다. 구체적으로는, 예를 들어, 종양 세포가 원발소로부터 이동하여 최초로 전이를 발병하는 센티넬 림프절이나, 센티넬 림프절의 하류에 위치하는 림프절 (2 차 림프절), 원발소 주위의 소속 림프절의 상류에 위치하는 림프절, 소속 림프절이 속하는 림프관 네트워크의 상류에 위치하는 림프절 등을 들 수 있다.

여기서, 표적 림프절은, 암을 갖고 있는지의 여부는 따지지 않는다. 예를 들어, 림프절을 숙청하기 전에, 숙청역 내의 림프절 (상류측 림프절) 에 본 발명의 의약 조성물을 투여하고, 림프관 네트워크를 통하여 숙청역 외의 림프절 (하류측 림프절) 에 항암제를 송달시키고, 숙청을 실시함으로써, 하류측 림프절의 예방적 치료가 가능하다.

본 발명의 의약 조성물의 림프절로의 투여는, 림프절 내에 본 발명의 의약 조성물을 주입할 수 있으면 그 수법은 한정되지 않고, 환자의 피부를 절개하여 노출된 림프절에 주입 투여해도 되고, 환자의 피부 위에서부터 림프절의 위치로서 짐작을 한 부위에 주사 투여해도 된다.

후기 실시예에 나타내는 바와 같이, 5-플루오로우라실, 이리노테칸 및 도세탁셀은, 림프절 내 투여함으로써, 소량의 투여로 독소루비신에 비해 우수한 항종양 효과를 발휘한다. 암세포주에 대한 세포 증식 저해 활성 (GI₅₀ 값) 은, 독소루비신이, 5-플루오로우라실 및 이리노테칸과 비교하여 훨씬 강하고, 도세탁셀과 동일한 정도인 것이 알려져 있는 점에서 (비교예 참조), 5-플루오로우라실, 이리노테칸 또는 도세탁셀의 림프절 내 투여에 의해 얻어진 항종양 효과는 종래의 지견으로부터는 전혀 예측할 수 없다.

또, 당해 항종양 효과는, 예방 또는 치료 목적의 림프절보다 상류에 위치하는 림프절 내 투여에 의해 발휘된다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물은, 전이 초기 단계에 있는 림프절이나 전이될 위험성이 높은 림프절을 치료 또는 예방적 치료의 대상으로 할 수 있고, 재발 방지 등에 있어서 특히 유용하다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「치료」란, 암을 갖는 대상의 치료 (즉시 치료) 인 것을 나타내고, 그 상태, 또는 그 상태에 의해 발생하는 1 개 혹은 복수의 증상을, 개선, 경감 또는 소실시키는 것을 의미한다. 「예방적 치료」란, 암이 될 리스크는 있지만, 현시점에서는 그 상태나 증상을 갖지 않는 대상의 치료를 의미한다.

본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써 치료할 수 있는 악성 종양의 종류로는, 본 발명의 항암제에 감수성을 나타내는 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 두경부암, 위암, 결장암, 직장암, 간암, 담낭·담관암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 인두암, 식도암, 신장암, 난소암 등을 들 수 있다. 특히 결장암, 직장암, 유방암, 식도암, 위암, 두경부암, 폐암, 췌장암 및 담낭·담관암에 대해 높은 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여 빈도 및 투여량은, 적절히 조정 또는 변경할 수 있지만, 투여 간격으로는, 예를 들어, 1 ∼ 42 일에 1 회, 바람직하게는 1 ∼ 28 일에 1 회, 보다 바람직하게는 1 ∼ 21 일에 1 회를 들 수 있다.

단회 투여량은, 대사 길항제로서 1 ng ∼ 100 mg, 바람직하게는 10 ng ∼ 10 mg, 보다 바람직하게는 100 ng ∼ 1 mg 이고, 종래의 전신 투여에 사용하는 양의 1/10⁹ ∼ 1/3 정도이다. 또, 식물 알카로이드계 항암제로서 1 ng ∼ 20 mg, 바람직하게는 10 ng ∼ 10 mg, 보다 바람직하게는 100 ng ∼ 1 mg 이고, 종래의 전신 투여에 사용하는 양의 1/10⁷ ∼ 2/3 정도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 5-FU 의 림프절 내 투여에 의한 항종양 활성

1. 재료

(a) 사용 동물

기보 (J Immunol Methods 2013 ; 389 (1-2) : 69-78 doi 10. 1016/j. jim. 2013. 01. 004) 의 방법에 따라서, 림프절 종창 모델 마우스 MXH10/Mo/lpr/lpr (MXH10/Mo/lpr) 을 제조하였다. 이하의 실시예에서는, 15 ∼ 18 주령의 당해 모델 마우스를 암수 합계 5 마리 사용하였다.

(b) 종양 세포

기보 (PLoS One 2013 ; 8 (2) : e55797 doi 10. 1371/journal. pone. 0055797) 의 방법에 따라서, 마우스 선유아 세포 유래의 KM-Luc/GFP 세포를 제조하였다. KM-Luc/GFP 세포는, MRL/MpTn-gld/gld 마우스의 선유아 세포 유래의 종양 세포인 MRL/N1 세포에 pEGFPLuc 플라스미드를 트랜스펙션한 것으로, 루시페라아제 유전자와 녹색 형광 유전자를 항상적으로 발현하고 있다. 이하의 실시예에서는, 당해 세포를, FBS (소 태아 혈청) 10 ％, L-Glutamine-P. S. 용액 1 ％ (Thermo Fisher Scietific 제조), G418 을 0.5 ％ 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Sigma-Aldrich 제조) 을 이용하고 배양하여, 사용하였다.

(c) 피험약

5-FU 는, 5-FU 주 (注) 250 ㎎ (쿄와 발효 기린 제조) 을 사용하였다. 마우스의 체중당, 0 ㎍/g, 0.1 ㎍/g, 1 ㎍/g, 10 ㎍/g 이 되도록 생리 식염수를 사용하여 농도 조정하였다.

2. 방법

(a) 고유 액와 림프절 전이 모델 마우스의 제조

-80 ℃ 보존의 종양 세포를 융해시킨 후, 통산 2 회 계대한 KM-Luc/GFP 세포를, PBS (인산 완충 생리 식염수) 를 사용하여 1.0 × 10⁶ cells/㎖ 로 농도 조정하였다. 그 후, 마트리겔 (Basement membrane matrix, Becton, Dickinson and Co. 제조) 과 혼합하고 3.3 × 10⁵ cells/㎖ 로 희석시킨 후에, 마우스의 장골하 림프절에 60 ㎕ 를 접종하였다 (도 1). 종양 세포를 접종한 날을 day 0 으로 하였다.

(b) in vivo 에 있어서의 종양 세포 증식 평가

생체 발광 이미징 시스템 (IVIS, Caliper Life Science 제조) 을 사용하여, 장골하 림프절 및 고유 액와 림프절의 종양 세포의 증식률을 측정하였다. 측정일은 종양 세포 접종 후 0, 6, 9 일째 (day 0, day 6, day 9) 에 실시하였다. 15 mg/㎖ 로 조정한 루시페린 (Promega 제조) 200 ㎕ 를 마우스의 복강에 주사하고, 10 분 후에 IVIS 를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다.

(c) 부액와 림프절로부터의 약제 투여

종양 세포 접종 후 day 6 의 마우스 중, 고유 액와 림프절에서의 루시페라아제 활성이 1.0 × 10⁶ photos/sec 이상인 마우스에 대하여, 시린지 펌프 (KDS100, Muromachi 제조) 를 사용하여, 부액와 림프절에 10 ㎕/min 의 속도로 5-FU 를 120 ㎕ 투여하였다 (도 1).

(d) 항종양 활성의 평가

day 6 및 day 9 의 루시페라아제 활성을 하기 [식 1] 에 의해 표준화 (normalized) 하였다. 그 후, 하기 [식 2] 에 의해 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비를 산출하였다. 얻어진 활성비에 대하여, 하기 [식 3] 에 의해, 0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비를 100 으로 하였을 때의, 5-FU 의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비를 계산하였다.

[식 1]

표준화한 day 6 또는 day 9 의 루시페라아제 활성 = ((day 6 또는 day 9 의 루시페라아제 활성)/(day 0 의 루시페라아제 활성))

[식 2]

표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비 = ((표준화한 day 9 의 루시페라아제 활성)/(표준화한 day 6 의 루시페라아제 활성))

[식 3]

0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비를 100 으로 하였을 때의, 5-FU 의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비 = ((5-FU 의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비)/(0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 9 와 day 6 의 루시페라아제 활성비) × 100)

3. 결과

결과를 표 1 에 나타낸다.

5-FU 의 투여에 의해, 루시페라아제 활성비는 대폭 저하되어 있고, 종양이 축소되어 있는 것, 또, 극히 소량의 투여 (0.1 ㎍/g) 에 있어서도 90 ％ 이상의 종양 축소 효과가 있는 것이 확인되었다. 5-FU 는, 림프절의 상류인 부액와 림프절로부터 투여하고 있고, 항종양 활성은 하류의 고유 액와 림프절에서 확인되고 있다. 이점으로부터, 소량의 5-FU 를 림프절, 특히 상류의 림프절에 투여하는 것은, 암의 치료, 재발 방지, 전이 방지 등에 있어서 유용하고, 특히 하류의 림프절의 치료, 재발 방지 등에 효과가 높은 것이 시사되었다. 또, 극히 소량으로도 항종양 활성을 갖기 때문에, 본 방법은, 부작용이 적고, 안전성이 높은 것이 시사되었다.

실시예 2 이리노테칸 염산염 (CPT-11) 의 림프절 내 투여에 의한 항종양 활성

1. 재료

사용 동물, 사용 세포는, 실시예 1 과 동일한 것을 사용하였다.

피험약으로서, CPT-11 은, 이리노테칸 염산염 (야쿠르트 본사 제조) 을 사용하였다. 마우스의 체중당, 0 ㎍/g, 0.5 ㎍/g, 5㎍/g 이 되도록 이리노테칸 염산염을 생리 식염수에서 용해시켜, 농도를 조정하였다.

2. 방법

부액와 림프절에 투여하는 피험약을 CPT-11 로 변경한 것 이외에는 모두 실시예 1 과 동일한 방법으로 실시하였다.

3. 결과

결과를 표 2 에 나타낸다.

CPT-11 의 투여에 의해, 루시페라아제 활성비는 대폭 저하되어 있고, 종양이 축소되어 있는 것, 또, 극히 소량의 투여 (0.5 ㎍/g) 에 있어서도 90 ％ 이상의 종양 축소 효과가 있는 것이 확인되었다. CPT-11 은, 림프절의 상류인 부액와 림프절로부터 투여하고 있고, 항종양 활성은 하류의 고유 액와 림프절에서 확인되고 있다. 이점으로부터, 소량의 CPT-11 을 림프절, 특히 상류의 림프절에 투여하는 것은, 암의 치료, 재발 방지 등에 있어서 유용하고, 특히 하류의 림프절의 치료, 재발 방지 등에 효과가 높은 것이 시사되었다. 또, 극히 소량으로도 항종양 활성을 갖기 때문에, 본 방법은, 부작용이 적고, 안전성이 높은 것이 시사되었다.

실시예 3 도세탁셀의 림프절 내 투여에 의한 항종양 활성

1. 재료

(a) 사용 동물

사용 동물은, 실시예 1 과 동일한 것을 사용하였다.

(b) 종양 세포

기보 (J Immunol Methods 2013 Mar 29 ; 389 (1-2) : 69-78. doi : 10. 1016/j. jim. 2013. 01. 004) 의 방법에 따라서, 마우스 유방암 세포 유래의 FM3A-Luc 를 제조하였다. FM3A-Luc 세포는, FM3A 세포에 전기 천공법을 사용하여 pGL4.51 을 유전자 도입하여 얻어진 세포로, 루시페라아제 유전자를 항상적으로 발현하고 있다. 이하의 실시예에서는, 당해 세포를, FBS (소 태아 혈청) 10 ％, L-Glutamine-P. S. 용액 1 ％ (Thermo Fisher Scietific 제조), G418 을 0.5 ％ 포함하는 RPMI-1640 (Sigma-Aldrich 사 제조) 을 이용하고 배양하여, 사용하였다.

(c) 피험약

도세탁셀은, 탁소텔 점적 정맥 주사용 80 ㎎ (사노피 제조) 을 사용하였다. 탁소텔 점적 정맥 주사용 80 ㎎ 2 ㎖ 를 13 ％ 에탄올 6 ㎖ 에 용해하여, 10 mg/㎖ 의 Stock 용액을 조제하고, 그 후, 마우스의 체중당, 0 ㎍/g, 1 ㎍/g, 10 ㎍/g 이 되도록 Stock 용액을 멸균수에서 용해시켜, 농도를 조정하였다.

2. 방법

(a) 고유 액와 림프절 전이 모델 마우스의 제조

-80 ℃ 보존의 종양 세포를 융해시킨 후, 통산 2 회 계대한 FM3A-Luc 세포를, PBS (인산 완충 생리 식염수) 를 사용하여 1.0 × 10⁶ cells/㎖ 로 농도 조정하였다. 그 후, 마트리겔 (Basement membrane matrix, Becton, Dickinson and Co. 제조) 과 혼합하고 3.3 × 10⁵ cells/㎖ 로 희석시킨 후에, 마우스의 장골하 림프절에 60 ㎕ 를 접종하였다 (도 1). 종양 세포를 접종한 날을 day 0 으로 하였다.

(b) in vivo 에 있어서의 종양 세포 증식 평가

생체 발광 이미징 시스템 (IVIS, Caliper Life Science 제조) 을 사용하여, 장골하 림프절 및 고유 액와 림프절의 종양 세포의 증식률을 측정하였다. 측정일은 종양 세포 접종 후 0, 7, 14, 17, 20, 23, 26, 29 일째에 실시하였다. 15 mg/㎖ 로 조정한 루시페린 (Promega 제조) 200 ㎕ 를 마우스의 복강에 주사하고, 10 분 후에 IVIS 를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다.

(c) 부액와 림프절로부터의 약제 투여

고유 액와 림프절에서의 루시페라아제 활성이 1.0 × 10⁶ photos/sec 이상인 것이 확인된 마우스에 대하여, 확인된 다음날에, 시린지 펌프 (KDS100, Muromachi 제조) 를 사용하여, 부액와 림프절에 10 ㎕/min 의 속도로 도세탁셀을 120 ㎕ 투여하였다 (도 1).

(d) 항종양 활성의 평가

도세탁셀 투여일을 day 0^T 라고 정의하고, day 3^T (도세탁셀 투여 후 3 일째) 및 day 6^T (도세탁셀 투여 후 6 일째) 의 루시페라아제 활성을 하기 [식 4] 에 의해 표준화 (normalized) 하였다. 그 후, 하기 [식 5] 에 의해 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T (고유 액와 림프절에서의 루시페라아제 활성이 1.0 × 10⁶ photos/sec 이상인 것이 확인된 날이며, 도세탁셀 투여 전날) 의 루시페라아제 활성비를 산출하였다. 얻어진 활성비에 대하여, 하기 [식 6] 에 의해, 0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비를 100 으로 하였을 때의, 도세탁셀의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비를 계산하였다.

[식 4]

표준화한 day 3^T, day 6^T 또는 day-1^T 의 루시페라아제 활성 = ((day 3^T, day 6^T 또는 day-1^T 의 루시페라아제 활성)/(day 0 의 루시페라아제 활성))

[식 5]

표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비 = ((표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 의 루시페라아제 활성)/(표준화한 day-1^T 의 루시페라아제 활성))

[식 6]

0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비를 100 으로 하였을 때의, 도세탁셀의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비 = ((도세탁셀의 각 농도 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비)/(0 ㎍/g 투여에 있어서의 표준화한 day 3^T 또는 day 6^T 와 day-1^T 의 루시페라아제 활성비) × 100)

3. 결과

결과를 표 3 에 나타낸다.

도세탁셀의 투여에 의해, 루시페라아제 활성비는 대폭 저하되어 있고, 종양이 축소되어 있는 것, 또, 소량의 투여 (1 ㎍/g) 에 있어서도 치료 후 6 일째에 있어서 90 ％ 이상의 종양 축소 효과가 있는 것이 확인되었다. 도세탁셀은, 림프절의 상류인 부액와 림프절로부터 투여하고 있고, 항종양 활성은 하류의 고유 액와 림프절에서 확인되고 있다. 이점으로부터, 소량의 도세탁셀을 림프절, 특히 상류의 림프절에 투여하는 것은, 암의 치료, 재발 방지, 전이 방지 등에 있어서 유용하고, 특히 하류의 림프절의 치료, 재발 방지 등에 효과가 높은 것이 시사되었다. 또, 극히 소량으로도 항종양 활성을 갖기 때문에, 본 방법은, 부작용이 적고, 안전성이 높은 것이 시사되었다.

실시예 4 도세탁셀의 점도를 변화시켰을 때의 림프절 내 투여에 의한 항종양 활성

1. 재료

사용 동물은, 실시예 1 과 동일한 것을 사용하였다.

사용 세포는, 실시예 4 와 동일한 것을 사용하였다.

도세탁셀은, 탁소텔 점적 정맥 주사용 80 ㎎ (사노피 제조) 을 사용하였다. 탁소텔 점적 정맥 주사용 80 ㎎ 2 ㎖ 를 13 ％ 에탄올 6 ㎖ 에 용해하여, 10 mg/㎖ 의 Stock 용액을 조제하였다. 그 후, 도세탁셀의 농도가 마우스의 체중 당 1 ㎍/g 이 되도록, 표 4 의 배합비로 Solution A, Solution B 및 Solution C 를 조제하였다.

2. 방법

(a) 고유 액와 림프절 전이 모델 마우스의 제조, (b) in vivo 에 있어서의 종양 세포 증식 평가, (c) 부액와 림프절로부터의 약제 투여는, 실시예 4 와 동일한 방법으로 실시하였다.

(d) 항종양 활성의 평가

Solution A, B 또는 C 에 대하여, 투여일을 day 0^T 로 정의하고, day-1^T (고유 액와 림프절에서의 루시페라아제 활성이 1.0 × 10⁶ photos/sec 이상인 것이 확인된 날이며, 도세탁셀 투여 전날) 에 대한 day 9^T 의 루시페라아제 활성을 하기 [식 7] 에 의해 계산하였다.

[식 7]

day-1^T 에 대한 day 9^T 의 루시페라아제 활성 = ((day 9^T 의 루시페라아제 활성)/(day-1^T 의 루시페라아제 활성))

(e) 점도의 측정

음차 진동식 점도계 (SV-1A : 점도 측정역 : 0.3 ∼ 10,000 mPa·s, SV-1H : 점도 측정역 : 0.3 ∼ 1,000 mPa·s, 에이·앤드·디 주식회사 제조) 를 사용하여, 일본 약국방 점도 측정법에 준하여, Solution A, Solution B 및 Solution C 의 점도를 측정하였다.

(f) 병리도 사진의 촬영

Solution B 또는 Solution C 투여 후의 day 9^T 시에, 도립 현미경 BX51 (Olympus 사 제조) 을 사용하여 명시야 관찰법으로 고유 액와 림프절 및 부액와 림프절의 병리도 사진을 촬영하였다. 촬영 배율은, 2 배 및 10 배에서 실시하였다.

3. 결과

(a) 점도와 루시페라아제 활성의 관계

결과를 표 5 에 나타낸다.

식 7 에 의해 계산한 루시페라아제 활성은, day-1^T 에 대한 day 9^T 의 루시페라아제 활성이기 때문에, 수치가 작을수록 day 9^T 시의 종양이 축소되어 있는 것을 나타내고 있다. Solution A 및 Solution B 의 루시페라아제 활성은 낮고, 종양 축소 효과가 높은 것이 나타났다. 한편, Solution C 는, 종양 축소 효과가 거의 확인되지 않았다. 이점으로부터, 도세탁셀의 림프절 투여에 있어서 종양 축소 효과를 나타내기 위해서는, 점도가 40 mPa·s 이하, 특히 1 ∼ 10 mPa·s 인 것이 좋다고 생각된다.

(b) day 9^T 시에 있어서의 Solution B 및 Solution C 의 병리도 사진

Solution B 또는 Solution C 를 투여 후, day 9^T 시에 있어서의 고유 액와 림프절의 병리도 사진을 도 2 및 도 3 에 나타낸다.

Solution B 에서는, 림프절 피질 표층에 종양 세포의 잔존을 확인하지만, 림프절 변연동 상당부에 종양 세포는 보이지 않았다. 한편, Solution C 에서는, 림프절 실질 및 변연동에 종양의 침윤·증식이 확인되었다. 이것으로부터, 점도에 의한 종양 축소 효과는, 고유 액와 림프절의 병리도 사진으로부터도 확인할 수 있었다.

또한, Solution C 의 투여 부위인 부액와 림프절의 병리도 사진을 동일한 방법으로 촬영한 결과, 림프절 수질을 중심으로 광범위한 괴사와 섬유화가 확인되고, 변이는 림프절 피질 및 수출 림프관 기부를 포함한 림프절 피막 외에도 이르러, 수출 림프관의 통과 장해가 시사되었다 (도 4). 이것은, Solution C 가 고점도이기 때문에, 상류인 부액와 림프절에 투여하였을 때에, 하류의 림프절에 흐르지 않고 부액와 림프절에 머물렀기 때문이라고 생각된다. 이 때문에, 도세탁셀에 한정되지 않고, 동일한 식물 알카로이드계 항암제인 CPT-11 이나 SN-38, 대사 길항제인 5-FU 에 있어서도, 림프절 투여를 실시하는 경우에는, 약제의 점도를 40 mPa·s 이하로 할 필요가 있다고 생각된다.

비교예 독소루비신의 림프절 내의 투여에 의한 항종양 활성

1. 재료

피험약으로서, 독소루비신은, 독소루비신 염산염 (Wako 제조) 을 사용하였다. 마우스의 체중당, 0 ㎍/g, 0.1 ㎍/g, 1 ㎍/g, 10 ㎍/g 이 되도록 생리 식염수를 사용하여 농도 조정하였다.

2. 방법

부액와 림프절에 투여하는 피험약을 독소루비신으로 변경한 것 이외에는 모두 실시예 1 과 동일한 방법으로 실시하였다.

3. 결과

결과를 표 6 에 나타낸다. 독소루비신의 항종양 활성과, 5-FU, CPT-11 및 도세탁셀의 항종양 활성을 비교하기 위해서, 실시예 1 ∼ 3 의 결과를 아울러 표 6 에 나타냈다.

독소루비신의 투여에 의해, 루시페라아제 활성비는 저하되었지만, 종양의 축소율은, 5-FU, CPT-11 및 도세탁셀과 비교하여 작았다. 특히 독소루비신에서는 10 ㎍/g 으로 종양의 축소율이 25 ％ 정도이고, 가장 결과가 좋은 1 ㎍/g 에 있어서도 종양의 축소율이 60 ％ 미만이지만, 5-FU 및 CPT-11 에서는 1 ㎍/g 미만의 투여량에 있어서도 종양의 축소율이 90 ％ 이상을 나타내고, 도세탁셀에서는 10 ㎍/g 의 투여로 80 ％ 이상의 종양 축소율을 나타냈다. 이로써, 5-FU, CPT-11 및 도세탁셀의 효과는, 독소루비신과 비교하여 높은 것이 시사되었다.

암세포주에 대한 세포 증식 저해 활성 (GI₅₀ 값) 은, 표 7 에 나타내는 바와 같이, 독소루비신이, 5-FU 및 CPT-11 과 비교하여, 약 10 ∼ 1000 배 가깝게 강한 것이 알려져 있다 (NIH DTP database (https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/cancerscreeningdata/index.jsp) 에 기재되어 있는 각 세포주에 대한 GI₅₀ 값을 평균하여 산출). 또, 도세탁셀에 대해서는, 독소루비신과 거의 동일한 정도인 것이 알려져 있다.

표 7 과 같이, 종래, 독소루비신의 효과는, 5-FU 및 CPT-11 과 비교하여 높고, 도세탁셀과 동일한 정도로 생각되었지만, 림프절 투여의 경우에는, 표 6 에 나타내는 바와 같이, 독소루비신의 투여보다, 5-FU, CPT-11 및 도세탁셀의 항종양 활성이 높은 것이 나타난 점으로부터, 이들 약제는, 림프절 투여에 특별히 적합한 것이 밝혀졌다.

본 발명의 의약 조성물에 의하면, 숙청 전에 림프절에 항암제를 투여하고, 투여한 림프절로부터 하류의 림프절에도 항암제를 흘려 넣을 수 있어, 표적의 림프절에서 항암 작용을 발휘할 뿐만 아니라, 미소한 암이 전이되어 있을 가능성이 있는 다른 림프절에도 항암제를 흘려 넣을 수 있어, 미소한 암을 죽임으로써, 재발을 방지할 수 있다.

또, 수술로 숙청할 수 없는 영역의 림프절에 암이 있는 경우, 외과적 수술로의 치유는 불가능하지만, 본 발명의 의약 조성물을 사용함으로써, 상류의 림프절로부터 항암제를 흘려 숙청할 수 없는 영역의 림프절의 치료를 실시하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 있어서는, 사용하는 항암제의 양은, 종래의 전신 투여에 사용하는 양보다 적기 때문에, 부작용도 적고, 안전성이 높다.

Claims

이리노테칸, 7-에틸-10-하이드록시캠토테신 (SN-38), 도세탁셀 및 그것들의 염에서 선택되는 1 종 이상의 식물 알카로이드계 항암제를 유효 성분으로 하는, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
투여 대상의 림프절이, 치료 또는 예방적 치료를 목적으로 하는 림프절 또는 당해 림프절이 속하는 림프관 네트워크 상류에 위치하는 림프절인, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
단회 투여량이, 식물 알카로이드계 항암제로서 1 ng ∼ 20 ㎎ 인, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
점도가, 40 mPa·s 이하인, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
점도가, 1 ∼ 10 mPa·s 인, 림프절 내 투여되는 암의 치료 또는 예방적 치료용 의약 조성물.
림프절 내 투여에 의해 암의 치료 또는 예방적 치료를 실시하기 위한, 이리노테칸, 7-에틸-10-하이드록시캠토테신 (SN-38), 도세탁셀 및 그것들의 염에서 선택되는 1 종 이상의 식물 알카로이드계 항암제를 포함하는, 의약 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제