KR102377681B1

KR102377681B1 - 백수오와 이엽우피소 판별용 InDel 마커 및 이를 이용한 판별 방법

Info

Publication number: KR102377681B1
Application number: KR1020210097321A
Authority: KR
Inventors: 김정은; 최재필; 박종화; 김기현; 신용국
Original assignee: 세명대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2022-03-23
Also published as: KR102377679B1; KR102283596B1; KR102377675B1; KR20210110522A; KR102389187B1; KR20210110777A; KR20210110776A; KR102377677B1; KR102377678B1; KR102389182B1; KR20210110524A; KR20210061502A; KR102389178B1; KR20210110523A; KR20210110778A; KR20210110521A; KR20210110525A

Abstract

본 발명은 백수오와 이엽우피소 판별용 InDel 마커 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 Indel 마커 및 상기 마커를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 백수오를 이엽우피소 등 백미꽃 속 다른 식물체들과 손쉽게 구분할 수 있으며, 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 백수오의 종 분류가 가능하다.

Description

백수오와 이엽우피소 판별용 InDel 마커 및 이를 이용한 판별 방법{InDel Markers for Discrimination of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum and Method for Use thereof}

본 발명은 백수오와 이엽우피소 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 백수오와 이엽우피소 판별용 InDel 마커 및 이를 이용한 백수오와 이엽우피소의 판별 방법에 관한 것이다.

2010년 공표된 나고야의정서는 생물자원을 활용하여 생기는 이익을 공유하기 위한 국제협약으로, 동 협약은 2017년 8월 17일부터 우리나라에서도 발효 중이다. 우리나라는 국립생물자원관과 2012년 설립되는 국립생태원을 중심으로, 10만여 종의 국내 생물 유전자원을 발굴하고 자원 이용을 위한 데이터베이스를 만들어 나고야의정서에 대비하고 있다.

‘나고야의정서’가 발효되면서 우리 생물주권을 지키고 보전하는 것이 매우 중요한 문제로 떠오르고 있다. 우리 생물자원 보존과 관련하여 지리산과 한라산의 대표 식물인 구상나무는 1904년 서양으로 반출되어 크리스마스 트리로 외국에서 널리 사용된 바 있고, 1947년 미국으로 반출되어 ‘미스킴라일락’으로 불리며 정원수로 높은 인기를 누리고 있는 정향나무나, 소로나로 알려진 우리나라 토종 밀인 앉은뱅이밀은 모두 해외로 반출된 우리나라 생물자원이다.

따라서, 우리나라 고유생물의 무단 반출을 막고, 생물자원을 확보하기 위한 다양한 노력이 필요하다. 특히, 나고야의정서에 대비하고, 경제적 부가가치가 높은 백수오와 같은 고유종의 경우에는 생물 주권보장을 위한 종특이 마커의 개발이 필수적인 상황이다.

한편, 백수오(Cynanchum wilfordii)는 한국과 중국의 산이나 들의 양지바른 풀밭, 바닷가 경사지에 나는 박주가리과(또는 협죽도와 박주가리아과) 백미꽃속의 덩굴성 여러해살이풀로, 큰조롱, 은조롱 등으로도 불린다. 백수오는 동의보감이나 동의수세보원 등 많은 한의학 서적에서 한약재로서의 특성이 기술되어 있는데, 독성이 없고 갱년기 여성에게 좋다고 알려져 건강기능식품으로 많이 이용되고 있다. 최근에는 백수오가 퇴행성 관절염의 개선, 유방암, 자궁내막암 등의 에스트로겐 활성에 따른 부작용이 없다는 사실이 과학적으로 입증되어 있을 뿐만 아니라 그 효능에 대한 메커니즘이 규명되고 있다.

한편, 백수오와 이엽우피소는 모두 박주가리과(Asclepiadaceae) 백미꽃 속(Cynanchum)에 속하는 덩굴성 여러해살이 식물로 국내에서는 백수오 뿌리, 중국에서는 이엽우피소 뿌리를 각각 약용으로 사용하며, 같은 백미꽃 속에 속하는 친척이지만 종에서는 차이가 있다. 현재 국내 한약재 유통시장에서는 하수오를 적하수오(적수오)와 백하수오(백수오)로 나누고 동일하게 취급하고 있으며, 특히 백수오의 경우는 중국에서 수입된 백수오의 개량종으로 잘못 알려져, 대한약전 및 생약규격집에 등재되어있지 않은 전혀 다른 식물인 이엽우피소가 백수오로 유통되고 있다. 적하수오(적수오)로 알려진 하수오는 적갈색을 띄며 절편하면 불가사리 모양의 형태적 특징이 있어 하얀색을 띄는 백하수오(백수오)와 구분되나, 이엽우피소의 경우는 모양과 색깔이 백수오와 같아 육안으로 구분하기가 매우 어렵다. 또한, 형태학적 특징에 따른 종 동정 및 분류는 환경요인에 따라 변수가 발생하기 쉽고, 형태학적 특징에 따른 구분을 통한 종 동정 작업은 많은 시간과 노력, 비용이 요구되며, 많은 경험과 전문성을 가진 연구자들에 의해서만 제한적으로 가능하다. 그러나, 최근 생명공학 기술의 발달로 인해 DNA 수준에서 생물 종의 다양성 연구가 가능해지면서, 핵산지문 분석법을 통한 신속 정확한 종 동정이 가능해졌다.

종래기술인 특허등록 KR 제10-1821040호는 엽록체의 matK 유전자와 trnL-trnF 지역의 InDel 부위를 기반으로 한 마커를 공개하고 있다. 또한, 특허등록 KR 제10-1866163호는 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈을 분석하여 발굴한 InDel 마커를 공개한 바 있다. 그리고, 공개특허공보 KR 제10-2017-0024388호는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism)을 이용한 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 판별 마커를 제공한다.

그러나, 상기 엽록체 유전자 유래의 InDel 부위를 기반으로 한 마커들은 모계 유전되는 엽록체 유전자를 기반으로 하는 마커 특성으로 인하여, 꽃가루에 의해 발생하는 hybrid 식물체를 구별할 수 없는 한계를 가지고 있었다.

또한, 백수오와 이엽우피소의 종 판별을 위하여 엽록체의 유전자를 기반으로 한 종래기술들은 엽록체의 인트론 부분의 높은 변이성을 포함하는 부위를 InDel 부위를 기반으로 하여 해당 부위의 변이가 있는 경우 판별에 어려움이 있었고, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism)을 이용한 마커의 경우 InDel 마커에 비해 분석의 직관성이 떨어지는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 백수오와 이엽우피소를 구분할 수 있는 종 특이 마커를 개발하기 위해 예의 연구노력한 결과, 백미꽃 속 식물체의 표준유전체를 작성하고 이를 백수오, 이엽우피소, 절관우피소 등의 개체에서 분석된 단서열 유전체 정보와 비교 분석하여 백수오와 이엽우피소의 상 염색체 상에 존재하는 SNP 부위를 확보한 후, 다시 백수오와 이엽우피소의 상 염색체 상에 존재하는 9개의 Indel 부위를 발굴하였고, 상기 SNP와 Indel 부위를 크로스 체크하여 동 Indel 서열을 기반으로 제작한 프라이머들을 이용하여 백수오와 이엽우피소를 손쉽게 구분할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 Indel 마커에 기반한 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 Indel 마커에 기반한 프라이머 세트를 이용하여 백수오와 이엽우피소를 판별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 Indel 마커에 기반한 프라이머 세트를 포함하는 백수오와 이엽우피소를 판별하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명자들은 백미꽃 속 식물체의 표준유전체를 작성하고 이를 백수오, 이엽우피소, 절관우피소 등의 개체에서 분석된 단서열 유전체 정보와 비교 분석하여 백수오와 이엽우피소의 상 염색체 상에 존재하는 SNP 부위를 확보한 후, 다시 백수오와 이엽우피소의 상 염색체 상에 존재하는 9개의 Indel 부위를 발굴하였고, 상기 SNP와 Indel 부위를 크로스 체크하여 동 Indel 서열을 기반으로 제작한 프라이머들을 이용하여 백수오와 이엽우피소를 손쉽게 구분할 수 있는 Indel 마커를 발굴하였다.

본 발명의 상기 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 유전자 마커는 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum)의 상 염색체에 존재하는 해당 유전자에 상호 보완적으로 결합 가능하므로, 그 자체로 백수오와 이엽우피소의 종 판별을 위한 마커, 또는 마커 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC 배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.

본 발명에서 "마커"란 백미꽃 속 식물체의 종 특이성을 분석할 수 있는 물질로, 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum)의 종 판별과 관련된 핵산(예: DNA, mRNA 등), 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명의 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 321bp이고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 350bp이며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 333bp이고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 303bp이며, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 339bp이고, 상기 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 305bp이며, 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 301bp이고, 상기 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 357bp이며, 상기 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 350bp인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 프라이머 세트를 포함하는 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 "키트"는 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 상기 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg²⁺ 이온이 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg²⁺ 이온이 부족한 경우 PCR 산물의 산출률이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 BSA이 추가로 포함될 수도 있다.

*본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 대상 백수오(Cynanchum wilfordii) 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 321bp이고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 350bp이며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 333bp이고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 303bp이며, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 339bp이고, 상기 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 305bp이며, 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 301bp이고, 상기 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 357bp이며, 상기 서열번호 17 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 350bp인 경우 백수오(Cynanchum wilfordii) 종으로 판정하는 단계;를 포함하는 백수오(Cynanchum wilfordii) 종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명의 상기 9종 프라이머 세트로 유전자 서열을 증폭하는 경우, 백수오와 이엽우피소에서 증폭되는 서열이 뚜렷하게 구분되어 백수오 종 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였다.

따라서, 백미꽃 속 식물체에 특이적인 Indel 부위의 유전자 서열에 기반한 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 유전자 마커를 이용하여 백수오와 이엽우피소를 용이하게 판별할 수 있으며, PCR 증폭 산물의 길이의 차이를 통해 다른 백미꽃 속 식물체들과 백수오를 용이하게 구분이 가능함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 조성물 및 이를 이용한 백수오와 이엽우피소의 판별 방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 백수오와 이엽우피소의 종 판별용 Indel 마커 및 상기 마커를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 백수오를 이엽우피소 등 백미꽃 속 다른 식물체들과 손쉽게 구분할 수 있으며, 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 백수오의 종 분류가 가능하다.

도 1은 백미꽃 속 식물체들의 SNP 변이량를 분석하여 나타낸 그래프이다(Class Ⅰ: 백수오, Class Ⅱ:일부 이엽우피소 표현형을 보이는 백수오, Class Ⅲ: 절관우피소, Class Ⅳ: 이엽우피소, Class Ⅴ: genotype이 백수오로 나오는 이엽우피소).
도 2는 백수오 및 이엽우피소를 포함한 백미꽃 속 식물체의 유전자형을 PCA 분석을 통하여 classification 한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 3은 백미꽃 속 식물체에 대한 SNP chip 생산과정에서 원인별로 필터링된 SNP 개수를 나타난 모식도이다.
도 4는 Group I에 속하는 백수오 개체들 모두에서 인델 부위가 발굴되지 않은 유전자좌 중에서, Group IV에 속하는 이엽우피소 개체에서 homozygous 하며 동일한 유전자형을 가진 유전자좌를 선정한 결과 선택된 113개의 유전자좌에 대한 매트릭스에 대한 예시이다.
도 5는 본 발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 그리고 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 백수오와 이엽우피소의 DNA를 PCR 분석한 결과를 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명의 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 그리고 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트로 백수오와 이엽우피소의 DNA를 PCR 분석한 결과를 촬영한 사진이다.
도 7은 본 발명의 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 그리고 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트로 백수오와 이엽우피소의 DNA를 PCR 분석한 결과를 촬영한 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 백수오 및 이엽우피소의 표준 유전체 서열 결정

1-1. PromethION read 생산

백미꽃 속 2종 식물체인 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum)의 전장 유전체를 분석하기 위하여 Oxford Nanopore(ONT)社의 promethION 플랫폼을 이용하여 백수오 및 이엽우피소의 전장 유전체 서열을 해독하였다. 상기 해독과정에서 promethION 플랫폼을 2차례 이용하여 백수오 및 이엽우피소 유전체에서 평균 5Kb 이상의 장서열을 생산하였고, 전체 해독 길이, 평균 read 길이, 및 최장 read 길이는 아래 [표 1]에 정리하였다. 분석 서열의 평균 ‘quality score(Q=-10log₁₀P)’는 모두 11로 90% 이상의 정확성을 갖는 것으로 분석되었다.

[표 1]

1-2. 백미꽃 속 2종 식물체의 표준유전체 어셈블리 제작

긴 서열의 염기서열 결정(base calling)은 Minknow 프로그램과 Filp-Flop 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)을 이용하여 수행하였고, NanoPlop 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)으로 결정된 서열들의 퀄리티(quality)를 확인하였다. 또한, Porechop 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)으로 어댑터(adaptor) 서열들을 제거하였다.

또한, 백미꽃 속 식물체인 백수오와 이엽우피소 유전체를 어셈블리하기 위하여 Wtdbg2(V2.4) 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)을 사용하였고, Racon(v.1.4.3) 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)으로 긴 서열의 에러 교정(error correction)을 4회 수행하였다. 그리고, Medaka(v.0.8.1) 프로그램(Oxford Nanopore Technologies, UK)의 r941_prom_high 모델을 이용하여 에러 교정(error correction)을 추가적으로 수행하였다. 마지막으로 Pilon 프로그램과 단서열(short-read)을 이용하여 폴리싱(polishing)을 수행하여 최종 어셈블리(assembly)를 생성하였다.

어셈블리 결과, 백수오는 총 6,365개의 콘티그(contig)로부터 229Mbp 길이의 백수오 전장 유전체를 어셈블리(assembly)하였고, 이엽우피소는 총 5,524개의 콘티그로 250Mbp 길이의 전장 유전체를 어셈블리하였다.

[표 2]

상기 제작된 백수오 및 이엽우피소의 전장 유전체 분석 결과를 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 마커 개발에 활용하였다.

실시예 2. 백수오 및 이엽우피소 샘플 선정 및 서열분석

백수오 및 이엽우피소의 2종 식물체를 포함하는 백미꽃 속 유전자원의 종 구별을 위한 SNP chip을 생산하기 위해서, 백수오 및 이엽우피소의 유전자원을 충북 농업기술원에서 공여받았다. 백수오 및 이엽우피소의 변이체(표준유전체와 다른 뉴클레오타이드 염기의 총합) 분석을 위하여, 일루미나(Illumina) 社에서 개발한 “차세대 유전체 서열 플랫폼(NGS, Next generation sequencing)” 방법을 이용하여 백수오 유전체 서열의 30배수 내지 50배수로 해독하였고, 하기 [표 3]에 해독 결과를 요약하였다.

[표 3]

실시예 3. 백미꽃 속 식물의 단서열 정렬 및 SNP 분석

백미꽃 속 개체의 단서열 유전체 정보를 약 300Mbp 길이의 백수오 표준유전체 서열과 비교하여 SNV(Single nucleotide variation) 변이를 동정하기 위한 변이체 분석을 다음과 같이 수행하였다.

먼저, 백미꽃 속 식물 16개체에서 생산한 단서열을 229Mbp 길이의 백수오 표준유전체 서열에 BWA-MEM(ver. 0.7.17) 프로그램으로 정렬(align)하였고, Picard (ver. 2.9.2) 프로그램의 MarkDuplicate tool을 이용하여 실험 과정에서 중복(duplication)된 리드(read)를 마스킹(masking)하였다. Indel 영역의 얼라인먼트(alignment)를 보정하기 위하여 GATK(Genome Analysis Tool Kit, ver. 3.8, Broad Institute)의 realignerTarget Creator(Category Sequence Data Processing Tools) 모듈과 IndelRealigner 모듈을 이용하였다.

Samtools(ver. 1.9) 프로그램의 mappingQScoreFilter 모듈을 이용하여 퀄리티 스코어 30(quality score 30) 이하를 제거한 후, GATK(ver. 3.8)의 Unifiedgenotyper 모듈을 이용하여 각 개체별 SNV(Single nucleotide variation)를 예측하였다. 하기 [표 4]에서 Group Ⅰ은 백수오, Group Ⅱ는 일부 이엽우피소의 표현형을 보이는 백수오, Group Ⅲ은 절관우피소, Group Ⅳ는 이엽우피소, Group Ⅴ는 genotype이 실제는 이엽우피소이나 백수오로 나오는 이엽우피소로 구분된다.

예측 결과, 백미꽃 속 식물들의 단서열 맵핑(mapping) 비율은 평균 40.58%로 나타났다.

[표 4]

구체적으로 6개체의 백수오 품종(CBM0134, CBM0134-2, CBM0144, CBM0103, CBM0110, CBM0111, CBM0221)과 3개체의 이엽우피소 품종(CBM0212, CBM0212-2, CBM0212-3) 사이에 맵핑 비율(mapping rate)에 대한 차이는 없었다. 또한, 정렬된 리드(read)는 전체 조립된 백수오 표준유전체 서열의 72.34%를 커버하는 것으로 나타났다. 그리고, 충북 농업기술원에서 종 동정된 백수오 개체의 SNV(Single nucleotide variation)는 약 1.4Mbp로 어셈블(assemble)된 백수오 유전체 서열의 약 0.61% 영역에서 발굴되었고, 이엽우피소 개체의 SNV는 약 3.7Mbp로 어셈블(assemble)된 백수오 유전체의 약 1.61% 영역에서 발굴되었다.

따라서, 백수오 표준유전체와 비교한 이엽우피소의 변이체는 백수오 개체 사이의 변이체보다 2.6배 높게 나타나는 것으로 확인되었고, 절관우피소의 SNV도 약 3.6M로 이엽우피소와 백수오 간의 유전적 차이와 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

각 개체의 이형접합성(heteryzygosity)를 분석한 결과, 레퍼런스 어셈블리(reference assembly)에 사용된 백수오 CBM0134 개체는 이형접합형(heterzygous) SNV의 비율이 가장 높게 나타났고, CBM0111 개체는 5.47로 다음으로 높게 나타났다. 반면, 이엽우피소의 이형접합형 SNV 비율은 0.88~1.69로 상대적으로 낮고 비슷한 비율로 나타났다.

실시예 4. 백수오 종 동정을 위한 SNP 마커 개발

백수오와 이엽우피소의 종 구별을 위한 SNP 마커를 개발하기 위하여, 실시예3에서 동정된 SNP를 유전자좌 별로 머징(merging)하여 매트릭스(matrix)를 작성한 결과, 총 8,508,402개의 유전자좌에서 SNP를 발굴하였다.

상기 8.5Mbp의 SNP를 기반으로 백수오 및 이엽우피소를 포함한 백미꽃 속 식물의 유전자형을 PCA 분석을 통하여 classification 하였다. 그 결과, 이엽우피소의 표현형을 일부 보이는 백수오 (Group II)나, 백수오의 유전형(genotype)을 가지는 이엽우피소 (Group V)의 경우, 백수오 (Group I) 또는 이엽우피소 (Group IV)와는 유전적으로 떨어져 있음을 확인할 수 있었다. 특히, Group V에 속한 개체는 PCA(principal components analysis) 그래프 상에서 백수오와 이엽우피소 사이에 위치함을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

종 동정을 위한 SNP Chip을 제작하기 위하여 먼저 SNP Chip 생산 효율을 저해할 수 있는 아래의 3가지 요인을 선별하여 필터링 과정을 거쳤다.

1) 타겟 SNP의 양방향 200 염기서열 내에 다른 SNP가 나타나는 경우

2) 타겟 SNP 및 양방향 200 염기서열이 백수오의 repeat 서열과 겹치는 경우

3) 타겟 SNP 및 양방향 200 염기서열 내에 삽입/결손 변이(insertion/deletion, InDel variant)가 동정 된 경우

상기 3가지 요인에 해당하는 경우에는 프라이머 맵핑(primer mapping) 및 유전형(genotyping)에 에러(error)를 유발할 수 있으므로 필터링하였고, 필터링 결과 전체 유전자좌의 0.92%에 해당하는 7,865개의 유전자좌에서 감도 높은 SNP Chip을 생산 가능할 것으로 판단하였다(도 3 참조).

다음으로, 6개체의 백수오의 유전좌형이 표준유전체로 어셈블리 된 유전체서열과 모두 동일하고, 3개체의 이엽우피소의 유전자형이 발굴된 SNP 유전좌형과 모두 동일하면서 동형접합체(homozygous)인 유전자좌만을 추가로 선별하였다. 그 결과, 약 4%에 해당하는 319개의 유전자좌가 선별되었다.

SNP 예측의 정확도가 높은 영역을 SNP Chip으로 만들기 위하여, 백수오 및 이엽우피소에서 SNP 분석에 이용된 리드(read)의 심도(depth)가 모두 10 이하인 영역을 제거한 결과 182(57.10%) 개의 SNP 유전자좌 영역을 확보하였고, 리드(read)의 심도(depth)가 100 이상인 영역을 다시 제거한 결과, 총 143 SNP 유전자좌 영역을 확보하였다.

실시예 5. 백수오 및 이엽우피소의 In-Del 마커 분석

실시예 2의 차세대염기서열의 맵핑(mapping) 결과로부터 백수오 및 이엽우피소의 상염색체 상의 인델(indel; insertion and deletion) 부위를 찾아내기 위해 GATK(Genome Analysis Tool Kit, ver. 3.8, Broad Institute)의 Unifiedgenotyper 모듈을 이용하여 분석하였다. 총 16개체의 백미꽃 속 식물의 indel 부위를 CBM0134의 표준유전체와 비교한 결과, 각 개체별로 발굴된 Indel 부위의 개수는 130,213개에서 666,406개로 발굴되었다.

[표 5]

Group I에 속한 백수오 개체들의 평균 indel 변이량(274,707)은 Group IV에 속한 이엽우피소의 평균 indel 변이량(504,363)보다 적은 것으로 나타났다.

상기 [표 5]의 백미꽃 속 변이체의 indel 유전자좌를 머징(merging)하여 매트릭스를 만든 결과 총 3,230,257개의 영역에서 1bp 이상의 삽입/결실이 예측되었다. 이렇게 작성한 매트릭스를 이후 백수오와 이엽우피소의 유전적 차이를 밝히기 위한 기초 데이터로 활용하였다.

실시예 6. 백수오 및 이엽우피소의 In-Del 마커 선정

백수오와 이엽우피소를 구별하기 위하여 전체 인델 변이체 매트릭스로부터 리드 심도(read depth)가 10 이하인 유전자좌는 모두 제거하여 인델 예측률이 높은 영역만 확보하였다. 이후, Group I에 속하는 백수오 개체들 모두에서 인델 부위가 발굴되지 않은 유전자좌 중에서, Group IV에 속하는 이엽우피소 개체에서 homozygous 하며 동일한 유전자형을 가진 유전자좌를 선정함으로써 113개의 유전자좌만을 확보하였다(도 4). 도 4을 참조하면, 파랑색 백그라운드는 백수오 개체들이 속한 Group I이고, 초록색 백그라운드는 이엽우피소가 속한 Group IV이다. 나머지 그룹들은 백수오와 이엽우피소의 hybrid로 구분된다.

상기와 같이 선정된 113개의 유전좌 중에서 반복(repeat) 서열과 겹치는 부분을 제거하고, 9개의 Indel 영역으로부터 primer 3 프로그램을 이용하여 9 세트의 PCR 증폭 프라이머를 제작하였다(표 6).

[표 6]

실시예 7. 백수오 및 이엽우피소의 In-Del 마커 실증

상기 실시예 6에서 선별한 미토콘드리아 유전체의 Indel 마커를 이용하여 백수오 종을 판별할 수 있는지 알아보기 위하여, 백수오의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하고 상기 [표 6]의 Indel 마커 기반의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로, 유전형 분석(genotyping)을 위한 게놈 DNA 분리를 위하여, 백수오를 분쇄한 후, 액체 질소를 처리하여 동결하고 분말화하였다. 상기 백수오 분말에 700㎕의 마이크로프렙 버퍼(microprep buffer)를 첨가하고 65℃에 15분간 배양하면서 5분 간격으로 혼합하였다. 그 다음, 700㎕의 클로로포름:이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 첨가하고 1분간 혼합한 후 11,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 분리한 상측액에 약 60% 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 DNA가 응축될 때까지 혼합한 후, 13,000rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 DNA 펠렛(pellet)를 획득하였다. 상기 획득한 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척 및 건조한 후, RNaseA가 50 mg/L 첨가된 1xTE 버퍼 50㎕를 첨가하고 37℃에서 120분간 두어 DNA 펠렛 내 포함된 RNA를 제거하여 백수오의 DNA를 획득하였다. 그 후, 증폭 반응에 주형(template)으로 사용하기 위하여 상기 백수오 DNA의 농도를 측정하고 약 100ng/㎕가 되도록 희석하였다.

그 다음, 상기 실시예 6에서 9세트의 PCR 증폭 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.

비교 실험을 위하여, 상기 DNA 추출방식과 동일한 방식을 사용하여 추출한 이엽우피소를 대조군으로 사용하였다.

PCR을 위하여 하기 [표 7]에 기재된 반응물 조성으로 PCR 반응물을 구성하였고, 하기 [표 8]의 조건으로 PCR을 수행하여 증폭된 마커 산물을 획득하였다.

[표 7]

[표 8]

그 다음, 상기 증폭된 Indel 마커 산물은 2.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩하고, 100V에서 50-60분간 전기영동하여 증폭 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 4 내지 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 6에서 발굴한 Indel 마커를 증폭하기 위해 제작한 상기 [표 6]의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 경우, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트의 경우 백수오는 321bp, 이엽우피소는 298bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트의 경우 백수오는 350bp, 이엽우피소는 312bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였으며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트의 경우 백수오는 333bp, 이엽우피소는 311bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트의 경우 백수오는 303bp, 이엽우피소는 274bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였으며, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트의 경우 백수오는 339bp, 이엽우피소는 312bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트의 경우 백수오는 305bp, 이엽우피소는 274bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였으며, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트의 경우 백수오는 301bp, 이엽우피소는 281bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트의 경우 백수오는 357bp, 이엽우피소는 306bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였으며, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트의 경우 백수오는 350bp, 이엽우피소는 315bp 길이의 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 백미꽃 속 식물의 유전체 Indel 부위의 유전자 서열에 기반한 백수오 종 판별용 유전자 마커를 이용하여 백수오와 이엽우피소를 용이하게 판별할 수 있으며, 밴드 사이즈의 확인을 통해 다른 백미꽃 속 식물체들과 백수오를 용이하게 구분이 가능함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 백미꽃 속 식물의 유전체 InDel 부위를 기반으로 한 마커들은 모계 유전되는 엽록체 유전자를 기반으로 하는 마커들과는 달리, 꽃가루에 의해 발생하는 hybrid 식물체[본 발명에서는 이엽우피소의 표현형을 일부 보이는 백수오 (Group II)나, 백수오의 유전형(genotype)을 가지는 이엽우피소 (Group V)에 해당]를 원천적으로 구별이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Semyung University Division of Industry-Academy Cooperation <120> InDel Markers for Discrimination of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum and Method for Use thereof <130> PN190082AN <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 1 gccggtggct ggtatttaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 2 aggcatcggc atgttctcaa 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 3 tctacgatat caccagcacg g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 4 cagtcacatg ggagcttggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 5 caccagtgac acctgcagaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 6 aggctgttcc attgctaggc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 7 cggccacacc tttgacaaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 8 tccttccgcc gcacattatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 9 tgctgccaca ggagtttgta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 10 ctcagatcca ttgcctcccg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 11 tgcatgaggg agaagttgga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 12 ccagccacag ccagagttaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 13 cccttgagag cacccgaatt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 14 tctcaggcga gggttatgga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 15 tccagggtcc tccttccaat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 16 aaaaacacca ccggaccagt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer Sequence <400> 17 gggtacgggt ctggcattag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer Sequence <400> 18 aagaaggggg gtgtgagagt 20

Claims

서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 이루어지고,
상기 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 백수오 종의 PCR 증폭 산물은 305bp 인 것을 특징으로 하는,
백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 판별용 프라이머 세트 조성물.
삭제
삭제
(a) 대상 백수오(Cynanchum wilfordii) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물이 305bp 인 경우 백수오(Cynanchum wilfordii) 종으로 판정하는 단계;를 포함하는 백수오(Cynanchum wilfordii) 종 판별 방법.