KR102265148B1 - 개선된 특성들을 갖는 아실-ａｃｐ 레덕타아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 숙주 세포들에서 발현될 때 개선된 지방족 알데히드 및 지방족 알코올 생성을 유도하는 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 효소 변이체들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정한 특성들을 갖는 지방족 알코올 조성물들의 생성을 위해 이러한 AAR 변이체들을 만들고 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 특성들을 갖는 아실-ＡＣＰ 레덕타아제{ACYL-ACP REDUCTASE WITH IMPROVED PROPERTIES}

본 출원은 2013년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 61/753,273의 이익을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에서 전문이 인용 참조된다.

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 본 명세서에서 전문이 인용 참조된다. 2014년 1월 13일에 작성된 상기의 ASCII의 복사본은 파일명을 LS00046PCT_SL.txt라고 하였고, 크기는 155,731 바이트이다.

본 발명은, 재조합 숙주 세포들에서 발현될 때 개선된 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 생성을 유도하는 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 효소 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정한 특성들을 갖는 지방족 알코올 조성물의 생성을 위해 이러한 AAR 변이체를 만들고 이용하는 방법에 관한 것이다.

지방족 알코올은 산업 생화학의 중요한 카테고리를 나타낸다. 예를 들어, 지방족 알코올 및 이의 유도체의 세계적인 연간 매출은 US 달러로 10 억 달러가 넘는다. 이러한 분자들 및 이의 유도체들은, 계면활성제, 윤활제, 가소제, 용제, 유화제, 연화제(emollients), 증점제(thickeners), 향미제(flavors), 향료(fragrances) 및 연료로서의 이용을 포함하여, 다수에 적용들을 갖는다. 이들의 양친매성 성질(amphiphilic nature)로 인해, 지방족 알코올은 비이온 계면활성제처럼 행동하며, 이는 개인용품(personal care) 및 가정용품, 예를 들어 세제에 유용하다. 짧은 사슬형 지방족 알코올은 유화제, 연화제 및 증점제로서 화장품 및 식품 산업에 이용된다.

본질적으로, 지방족 알코올은 다양한 아실-ACP 또는 아실-CoA 분자들을 대응하는 1차 알코올들로 환원시킬 수 있는 효소들에 의해 만들어진다(예를 들어, 미국 특허 8,323,924; 8,268,599 및 8,097,439; 및 미국 특허 공보 20120282663 및 20100105963, 본 명세서에서 인용 참조됨). 하지만, 현재의 기술들은 주로 지방산의 대응하는 1차 알코올로의 무기 촉매-매개 환원(inorganic catalyst-mediated reduction)을 수반한다. 이러한 지방족 알코올은, 석유화학 공급원료(petrochemical feedstock)로부터 생성된 알파-올레핀의 화학적 수화에 의해, 또는 코코넛유, 팜유, 팜핵유, 우지 및 돈지와 같은 천연 자원으로부터 생성된 지방산의 촉매 수소화를 통해 생성된다. 천연 자원으로부터 유도된 지방족 알코올은 다양한 사슬 길이를 갖는데, 이는 특정 적용들과 관련이 있으며 특수하다(specific). 지방족 알코올의 알파-올레핀으로의 탈수가 화학 촉매에 의해 달성될 수 있다.

지방족 알데히드는 공업용 특수 화학제들을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 알데히드는 통상적으로 중합체, 수지, 염료, 착향료, 가소제, 향수, 약제를 생성하는데 사용된다. 또한, 알데히드는 용제, 보존제 및 소독제로서 사용될 수 있다. 비타민 및 호르몬과 같은 몇몇 천연 및 합성 화합물이 알데히드이며, 많은 당류가 알데히드기를 함유한다. 지방족 알데히드는 화학적 또는 효소적 환원에 의해 지방족 알코올로 전환될 수 있다.

지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생성에 대한 더 환경친화적이고 더 깨끗한 대안(greener and cleaner alternative)은 발효성 당 및/또는 바이오매스를 통하는 것이다. 하지만, 발효성 당 또는 바이오매스로부터의 지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생성이 상업적으로 실현가능하게 하기 위해서는, 산업 공정들이 최종 생성물의 효율적인 전환 및 회수(recovery)를 위해 최적화되어야 한다. 본 발명은 생체촉매로서 조작 숙주 세포(engineered host cell)를 이용하여 지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 개선된 생성을 위한 방법들 및 조성물들을 제공함으로써 이러한 필요성에 대처한다(address).

본 발명은, 정제된 지방산의 촉매 전환이 필요하지 않도록 특정 사슬 길이의 지방족 알코올 및/또는 지방족 알데히드fmf 바로 생성하는 광합성 및 종속영양 숙주 세포(heterotrophic host cell)를 제공한다. 이 생물학적 경로는 더 고품질의 생성물, 상당한 비용 감소 및 환경에 대한 더 적은 영향을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 및 이의 조성물을 생성하는 신규한 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 효소 변이체들을 제공한다. 또한, 특수한 AAR 변이 핵산 및 단백질 서열들 및 신규한 재조합 숙주 세포들 및 세포 배양물들 - 이는 이러한 조작 AAR 효소 변이체들을 포괄함 - 이 제공된다. 또한, 본 발명은 특정한 특성들을 갖는 지방족 알데이드 및/또는 지방족 알코올 조성물을 만들기 위해 재조합 AAR 변이-발현 숙주 세포들을 이용하는 방법들을 제공한다.

본 발명의 일 실시형태는, 아실-ACP의 지방족 알데히드로의 전환을 촉진시키는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드들 - AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 44로서 제시된 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성(sequence identity)을 가짐 -, 및 대응하는 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 역가(titer)에 비해, 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도하는 재조합 숙주 세포에서 변이 AAR 폴리펩티드들을 발현시키는 방법들을 제공한다. 일 실시예에서, 유전적 조작 변이 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28로서 제시된 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 가지며, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 역가에 비해 C12, C14 또는 C16 지방족 알코올의 더 높은 역가 또는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도한다.

일 실시형태에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28의 아미노산들 18, 24, 31, 34, 35, 43, 50, 63, 86, 112, 113, 116, 118, 120, 135, 148, 153, 155, 157, 159, 168, 172, 187, 188, 191, 209, 210, 211, 236, 277, 283, 285, 291, 324, 328, 335, 337 및 338 중 1 이상의 아미노산 위치들에서 돌연변이를 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 유전적 조작 변이 AAR 폴리펩티드는 S18W 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 유전적 조작 변이 AAR 폴리펩티드는 S18W 돌연변이를 가지며, 또한 M21L, D24E, D24Y, L31V, W34F, W35F, D43E, A50Q, C63A, C63G, C63Y, S86G, A112R, S113K, Q116G, R118Q, T120S, A135S, T148C, T148E, T148V, I153P, Q155C, Q155L, T157V, A159V, I168V, C172L, T187V, T188H, T188V, Q191A, L209R, E210Y, A211W, T236C, Q277V, E283G, E283S, A285V, M291V, A324T, A328S, Q335N, L337V 및/또는 L338W과 같은 돌연변이를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, SEQ ID NO: 34로서 제시된 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 AAR 폴리펩티드 및 재조합 숙주 세포에서 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 역가에 비해 C12 지방족 알코올의 더 높은 역가 또는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올의 더 높은 역가를 유도한다. 변이 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 34의 아미노산 40, 52, 58, 61, 273, 303, 339, 340, 344, 345, 346 및 588을 포함하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 아미노산 위치에서 돌연변이 Q40V, G52V, S58V, D61E, G273E, K303G, K339L, H340P, L344A, L344D, L344S, L344T, L345R, V346P, V346G, 및/또는 S588V를 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시형태는, 숙주 세포가 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 34의 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키도록 조작될 때 앞서 설명된 바와 같은 1 이상의 돌연변이들을 갖는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 이 재조합 숙주 세포는, 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원을 함유한 배지에서 배양될 때, 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 10 % 더 큰, 적어도 15 % 더 큰, 적어도 20 % 더 큰, 적어도 25 % 더 큰, 또는 적어도 30 % 더 큰 역가를 갖는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물을 생성한다. 일 실시예에서, 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물은 30 g/L 내지 250 g/L의 역가에서 생성된다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 세포외에서(extracellularly) 생성된다.

또한, 본 발명은 앞서 설명된 바와 같은 재조합 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물을 포함하며, 지방족 알코올 조성물은 C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 및 C18 지방족 알코올, 예를 들어 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1, 또는 C18:1 불포화 지방족 알코올 중 1 이상을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 포화 지방족 알코올을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 57에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드를 제공하며, AAR 폴리펩티드는 아실-ACP의 지방족 알데히드로의 전환을 촉진시킨다. 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가에 비해 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도한다. 또 다른 실시예에서, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가에 비해 C12, C14 및/또는 C16 지방족 알코올 조성물인 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도한다. 상기 SEQ ID NO: 57의 서열은 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)이 아미노산 위치 '0'으로 시작한다. 또 다른 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 아미노산 위치 18에서 돌연변이를 가지며, 돌연변이는 S18W이다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 57에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드를 제공하며, 변이 AAR 폴리펩티드는 아미노산 8, 16, 21, 24, 31, 34, 35, 43, 50, 63, 86, 112, 113, 116, 118, 120, 135, 148, 153, 154, 155, 157, 159, 168, 172, 187, 188, 191, 209, 210, 211, 236, 277, 281, 283, 285, 291, 324, 328, 335, 337 및/또는 338의 아미노산 위치에서 또 다른 돌연변이를 갖는다. 상기 SEQ ID NO: 57의 서열은 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)이 아미노산 위치 '0'으로 시작한다. 일 실시예에서, 돌연변이는 L8A, D16L, M21L, D24E, D24Y, D24V, D24P, L31V, L31M, W34F, W35F, D43E, A50Q, C63A, C63G, C63Y, S86G, A112R, S113K, Q116G, R118Q, T120S, A135S, T148C, T148E, T148V, I153P, T154A, Q155C, Q155L, T157V, A159V, I168V, C172L, T187V, T188H, T188V, Q191A, L209R, E210Y, A211W, T236C, Q277V, A281L, E283G, E283S, A285V, M291V, A324T, A328S, Q335N, L337V 및/또는 L338W로부터 선택된다. 바람직한 일 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 M21L 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 58)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L8A 돌연변이, M21L 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A 돌연변이, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 59)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 D16L 돌연변이, M21L 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 60)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L8A 돌연변이, D24V 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, Q155L 돌연변이, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 61)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 D24P 돌연변이, L31M 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A 돌연변이, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 62)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L8A 돌연변이, D16L 돌연변이, D24V 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A 돌연변이, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 63)를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 D24E 돌연변이, C63G 돌연변이, S113K 돌연변이, T154A 돌연변이, 및 A281L 돌연변이(SEQ ID NO: 64)를 갖는다. 상기 SEQ ID NO: 58 내지 64의 서열들은 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)이 아미노산 위치 '0'으로 시작한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 앞서 설명된 바와 같은 변이 AAR 폴리펩티드들을 발현시키는 재조합 숙주 세포를 제공한다(위 참조). 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는, 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원을 함유한 배지에서 배양될 때, 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 10 % 더 큰, 적어도 15 % 더 큰, 적어도 20 % 더 큰, 적어도 25 % 더 큰, 또는 적어도 30 % 더 큰 역가를 갖는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물을 생성한다. 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물은 약 30 g/L 내지 약 250 g/L의 역가로 생성된다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물은 세포외에서 생성된다.

또한, 본 발명은 앞서 설명된 바와 같은 변이 AAR 폴리펩티드들을 발현시키는 재조합 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물을 고려한다(위 참조). 일 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 포화 및/또는 불포화 지방족 알코올을 포함한다. 일 실시예에서, 세포 배양물은 C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 및 C18 지방족 알코올 중 1 이상을 포함하는 지방족 알코올 조성물을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 C10:l, C12:l , C14:l, C16:l, 및 C18:1 불포화 지방족 알코올 중 1 이상을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 지방족 알코올의 환원 말단으로부터 C7과 C8 사이의 탄소 사슬의 위치 7에서 이중 결합을 갖는 지방족 알코올을 포함한다.

또한, 본 발명은 역가의 증가를 갖는 지방족 알코올 조성물을 생성하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 탄소원을 갖는 (앞서 설명된 바와 같은) 변이 AAR-발현 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 지방족 알코올 조성물을 수득(harvest)하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 지방족 알코올의 역가는 야생형 AAR-발현 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 20 % 내지 30 % 더 크다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 65에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드를 제공하며, 폴리펩티드는 아실-ACP의 지방족 알데히드로의 전환을 촉진시킨다. 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가에 비해 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도한다. 또 다른 실시예에서, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가에 비해 C12, C14 및/또는 C16 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도한다. 일 특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 65에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드를 제공하며, 폴리펩티드는 아미노산 위치 61에서 돌연변이를 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 돌연변이는 D61E이다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 34에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드를 포함하며, 재조합 숙주 세포에서의 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서의 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 지방족 알코올 조성물의 역가에 비해 C12, C14 및/또는 C16 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가 또는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도하며, AAR 폴리펩티드는 아미노산 위치 40, 52, 273, 303, 340, 344, 345, 또는 346에서 돌연변이를 갖는다. 일 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 Q40V, G52V, G273E, K303G, H340P, L344A, L344D, L344S, L344T, L345R, V346P, 및 V346G로부터 선택된 돌연변이를 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 V346P(SEQ ID NO: 66)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 Q40V(SEQ ID NO: 67)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 돌연변이 A345R(SEQ ID NO: 68)을 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L344S(SEQ ID NO: 69)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 V346G(SEQ ID NO: 70)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L344D(SEQ ID NO: 71)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 G52V(SEQ ID NO: 72)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L344T(SEQ ID NO: 73)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 K303G(SEQ ID NO: 74)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 L344A(SEQ ID NO: 75)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 H340P(SEQ ID NO: 76)에서 돌연변이를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 변이 AAR 폴리펩티드는 G273E(SEQ ID NO: 77)에서 돌연변이를 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 앞서 설명된 바와 같은 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 숙주 세포를 제공한다(위 참조). 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는, 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원을 함유한 배지에서 배양될 때, 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 10 % 더 큰, 적어도 15 % 더 큰, 적어도 20 % 더 큰, 적어도 25 % 더 큰, 또는 적어도 30 % 더 큰 역가를 갖는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물을 생성한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 약 30 g/L 내지 약 250 g/L의 역가로 생성된다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 세포외에서 생성된다.

또한, 본 발명은 앞서 설명된 바와 같은 변이 AAR 폴리펩티드들을 발현시키는 재조합 숙주 세포를 갖는 세포 배양물을 고려한다(위 참조). 일 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 및 C18 지방족 알코올 중 1 이상을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 포화 또는 불포화 지방족 알코올을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 C10:l, C12:l , C14:l, C16:l, 및 C18:1 불포화 지방족 알코올 중 1 이상을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알코올 조성물은 지방족 알코올의 환원 말단으로부터 C7과 C8 사이의 탄소 사슬의 위치 7에서 이중 결합을 갖는 지방족 알코올을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 역가의 증가를 갖는 지방족 알코올 조성물을 생성하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 탄소원을 갖는 (앞서 설명된 바와 같은) AAR을 발현시키는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 지방족 알코올 조성물을 수득하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 지방족 알코올은 야생형 AAR-발현 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 20 % 내지 30 % 더 크다.

본 발명은 바람직한 실시예들을 예시하는데 도움을 주는 첨부한 도면들과 연계하여 읽을 때 가장 잘 이해될 것이다. 하지만, 본 발명은 도면들에 개시된 특정 실시예들로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
도 1은 재조합 숙주 세포에서 지방산 유도체들에 대한 전구체로서 아실-CoA의 생성에 사용하기 위한 예시적인 생합성 경로의 개략도이다. 사이클은 말로닐-ACP 및 아세틸-CoA의 축합(condensation)에 의해 개시된다.
도 2는 예시적인 지방산 생합성 사이클의 개략도로, 신장 주기(elongation cycles)는 β-케토아실-ACP 신타아제 I(fabB) 및 β-케토아실-ACP 신타아제 II(fabF)에 의해 촉진된 아실-ACP 및 말로닐-ACP의 축합으로 시작하여 β-케토-아실-ACP를 생성하고, 이후 β-케토-아실-ACP가 NADPH-의존적 β-케토아실-ACP 레덕타아제(fabG)에 의해 환원되어 β-하이드록시-아실-ACP를 생성하며, 이는 β-하이드록시아실-ACP 탈수효소(fabA 또는 fabZ)에 의해 트랜스-2-엔오일-아실-ACP로 탈수된다. 또한, FabA는 트랜스-2-엔오일-아실-ACP를 시스-3-엔오일-아실-ACP로 이성질화(isomerize)할 수 있고, 이는 fabI를 바이패스(bypass)할 수 있으며, (통상적으로, C16의 지방족 사슬 길이 이하에 대하여) fabB에 의해 이용될 수 있어 β-케토-아실-ACP를 생성한다. 각 사이클의 최종 단계는 트랜스-2-엔오일-아실-ACP를 아실-ACP로 전환하는 NADH 또는 NADHPH-의존적 엔오일-ACP 레덕타아제(fabI)에 의해 촉진된다. 본 명세서에 설명된 방법들에서, 지방산 합성의 종결은 아실-ACP로부터 아실기의 티오에스테라아제 제거에 의해 일어나 유리 지방산(FFA)을 방출한다. 티오에스테라아제(예를 들어, tesA)는 티오에스테르 결합을 가수분해하며, 이는 설프하이드릴 결합을 통해 아실 사슬과 ACP 사이에 일어난다.
도 3은 아세틸-CoA 카르복실라아제(accABCD) 효소 복합체의 구조 및 기능을 예시한다. 비오틴 카르복실라아제는 accC 유전자에 의해 인코딩되는 한편, 비오틴 카르복실 운반 단백질(biotin carboxyl carrier protein: BCCP)은 accB 유전자에 의해 인코딩된다. 카르복실 트랜스페라아제 활성에 관련된 2 개의 서브유닛(subunit)은 accA 및 accD 유전자들에 의해 인코딩된다. BCCP의 공유 결합된 비오틴은 카르복실레이트 모이어티(carboxylate moiety)를 갖는다(carries). birA 유전자는 홀로-accB를 비오틴화한다.
도 4는 아실-ACP로 시작하는 지방족 알코올의 생성을 위한 예시적인 생합성 경로의 개략도이며, 지방족 알데히드의 생성은 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 또는 티오에스테라아제 및 카르복실산 레덕타아제(Car)의 효소 활성에 의해 촉진된다. 지방족 알데히드는 알데히드 레덕타아제(또한, 알코올 디하이드로제나아제라고도 함)에 의해 지방족 알코올로 전환된다. 이 경로는 지방족 아실-CoA 신테타아제(fadD)를 포함하지 않는다.
도 5는 시네코코쿠스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) 아실-ACP 레덕타아제(AAR_7942)를 발현시키고, 다양한 시아노박테리아 아실기 운반 단백질(ACP)을 공동발현시키는(coexpressing) 대장균 DV2의 지방족 알코올 생성을 나타낸다.
도 6은 시네코코쿠스 엘롱카투스 아실-ACP 레덕타아제(AAR_7942)를 발현시키고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(pSL9-185-D+)으로부터 아세틸 카르복실라아제 복합체를 동시발현시키는 대장균 DV2의 지방족 알코올 생성을 나타낸다(3 개의 개별 균주들이 도시되어 있음, D+1, D+2 및 D+3 참조).
도 7은 ifab 및 ifadR 과발현에 의한 AAR-매개에 의존하는 재조합 숙주 세포들의 개선된 지방족 알코올 생성을 예시하는 결과들을 나타낸다.
도 8은 ACP, AlrA[알코올 디하이드로제나아제(ADH)] 및 균주 Shu2에서의 합성 acc 오페론으로 공동발현되는 조합 라이브러리(AAR_Com 2a-d)로부터 유도된 AAR_7942 변이체들을 발현시키는 재조합 숙주 세포들에서의 상승된 지방족 알코올 수준을 나타낸 결과들을 나타낸다. 다수의 알코올 디하이드로제나아제 폴리펩티드는 본 발명에 따라 유용하며, 아시네토박터 종 M-1(SEQ ID NO: 52)의 AlrA 및 AlrAadp1(SEQ ID NO: 53)와 같은 AlrA 동족체를 포함한다(이로 제한되지 않음).
도 9a 및 도 9b는 AAR_7942 변이 S18W의 발현이 변경된 활성 및 사슬 길이 분포를 유도함을 나타내는 FALC 역가(도 9a) 및 글루코오스의 산출량(도 9b)을 예시하는 AAR_7942 변이 S18W의 탱크 발효로부터 얻어진 결과들을 나타낸다.
도 10은 MED4_AAR의 D61E 변이체가 재조합 숙주 세포들에서 발현되었을 때 C16 내지 C14의 FALC에 대한 사슬 길이 분포의 시프트(shift)를 예시하는 결과들을 나타낸다.

개관(General Overview)

석유화학제품에 대한 의존성을 없애는 한가지 방법은, 소형 생성 숙주(miniature production host)로서 역할하는 환경-친화적인 미생물들을 통해 지방족 알데히드 및 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체를 생성하는 것이다. 이러한 세포 숙주들(즉, 재조합 숙주 세포들 또는 생성 균주들)은 재생가능한 공급원료(예를 들어, 발효성 당, 탄수화물, 바이오매스, 셀룰로오스, 글리세롤, CO, CO₂, 등)와 같은 재생가능한 공급원으로부터 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올을 생성하도록 조작되었다. 이러한 지방족 알데히드 및 지방족 알코올은 세제 및 연료를 포함하는 다수의 산업 제품들에 대한 원재료(raw material)이다.

본 발명은, 재조합 숙주 세포들에서 발현될 때, 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성들의 개선된 역가, 수율 및/또는 생산성을 유도하는 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 효소 변이체에 관한 것이다. 본 명세서에서, 향상된 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 생합성은, 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 단백질을 발현시키도록 숙주 세포들을 형질전환시킴으로써 달성되며, 이는 아실-ACP의 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올로의 반응을 촉진시킨다. 또한, 본 발명은 AAR 효소 변이체들을 발현시키는 재조합 숙주 세포들 또는 생성 균주들에 관한 것이다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 본문에 명확히 다르게 명시되지 않는다면 복수의 지시대상(referent)을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "숙주 세포"에 대한 언급은 이러한 2 이상의 숙주 세포를 포함하고, "지방족 에스테르"에 대한 언급은 1 이상의 지방족 에스테르 또는 에스테르의 혼합물을 포함하며, "핵산 서열"에 대한 언급은 1 이상의 핵산 서열을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 1 이상의 효소를 포함한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 수탁 번호는 (여기에서 "NCBI 수탁 번호" 또는 대안적으로 "GenBank 수탁 번호"로 식별되는) 미국 국립보건원에 의해 유지되는 NCBI(미국 국립 생물공학 정보센터)에 의해 제공되는데이터베이스로부터 그리고 (여기에서 "UniProtKB 수탁 번호"로 식별되는) 스위스 생물정보학 연구소에 의해 제공되는 UniProt 지식베이스(UniProtKB) 및 Swiss-Prot 데이터베이스로부터 얻어졌다.

EC(Enzyme Classification) 번호는 생화학 및 분자생물학 국제 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)의 명명 위원회(Nomenclature Committee)에 의해 제정되며, 이의 설명은 월드 와이드 웹의 IUBMB 효소 명명 웹사이트에서 이용가능하다. EC 번호는 촉진된 반응에 따라 효소들을 분류한다. 예를 들어, 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 효소 활성은 E.C. 1.2.1.80(또한, 긴-사슬형 아실-[아실기-운반-단백질] 레덕타아제라고도 알려짐) 또는 EC 1.2.1.42로 분류된다. AAR의 기능은 하나의 종으로부터 다음 종으로 대부분의 원핵생물들에 보존된다. 따라서, 상이한 미생물 종이 E.C. 1.2.1.80 또는 EC 1.2.1.42로 분류된 동일한 AAR 효소 활성을 수행할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"라는 용어는 헤테로사이클릭 염기, 당 및 1 이상의 인산기로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 단위체 단위를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 염기들[구아닌(G), 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)]은 통상적으로 퓨린 또는 피리미딘의 유도체들이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 염기 유사체(base analog)들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 자연적으로 발생하는 당은 펜토오스(5-탄당)의 (DNA를 형성하는) 디옥시리보오스 또는 (RNA를 형성하는) 리보오스이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 당 유사체들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 핵산은 통상적으로 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 인산 결합을 통해 연결되지만, 많은 다른 연결들(예를 들어, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 등)이 해당 기술분야에 알려져 있다.

"폴리뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 중합체를 지칭하고, 이는 외가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 비-자연적 또는 변경된 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. 본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 여하한 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, RNA 또는 DNA 중 하나를 지칭하는데 교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 및 외가닥의 DNA, 및 이중 및 외가닥의 RNA를 포함한다. 이 용어는 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드(단, 이로 제한되지 않음)와 같은 변형된 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체를 등가물로서 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 바이러스성, 염색체의, EST, cDNA, mRNA 및 rRNA를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 여하한 형태로 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는데 교환가능하게 사용된다. "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 기술들에 의해 생성된 폴리펩티드를 지칭하며, 일반적으로 발현된 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA는 숙주 세포를 형질전환하여 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 적합한 발현 벡터(expression vector) 내로 삽입된다. 유사하게, "재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA"라는 용어는 당업자에게 알려진 재조합 기술들에 의해 생성된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동족체" 및 "상동(homologous)"이라는 용어는 대응하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50 % 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직하게, 상동 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들은 대응하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 약 99 % 상동성(homology)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열들 또는 아미노산 서열들을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 서열 "상동성" 및 서열 "동일성"은 교환가능하게 사용된다. 해당 기술분야의 당업자는 2 이상의 서열들 간의 상동성을 결정하는 방법들을 잘 알고 있다. 간명하게, 두 서열들 간의 "상동성"의 계산은 다음과 같이 수행될 수 있다. 이 서열들은 최적의 비교를 위해 정렬된다[예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있으며, 비교를 위해 비-상동 서열들은 무시될 수 있다]. 바람직한 일 실시예에서, 비교를 위해 정렬되는 제 1 서열의 길이는 제 2 서열의 길이의 적어도 약 30 %, 바람직하게는 적어도 약 40 %, 더 바람직하게는 적어도 약 50 %, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60 %, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 %, 또는 약 100 %이다. 이후, 제 1 및 제 2 서열들의 대응하는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오티드 위치들에서의 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들이 비교된다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열들 간의 퍼센트 상동성은 두 서열들의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 갭의 개수 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 개수의 함수이다. 두 서열들 간의 퍼센트 상동성의 결정 및 서열의 비교는 BLAST와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다[Altschul 외(1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-410]. 또한, 두 아미노산 서열들 간의 퍼센트 상동성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량(length weight)을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다[Needleman 및 Wunsch(1970), J. Mol. Biol. 48:444-453]. 또한, 두 뉴클레오티드 서열들 간의 퍼센트 상동성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 그리고 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 해당 기술분야의 당업자는 초기 상동성 계산을 수행할 수 있으며, 이에 따라 알고리즘 파라미터들을 조정할 수 있다. 바람직한 파라미터들의 세트(및, 당업자가, 분자가 청구항의 상동성 제한 내에 있는지 여부를 결정하기 위해 어떤 파라미터들이 적용되어야 하는지에 대한 확신이 없는 경우에 사용되어야 하는 파라미터들의 세트)는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 확장 페널티 및 5의 프레임시프트 갭 페널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)이다. 서열 정렬의 추가적인 방법들은 생물공학 분야에 알려져 있다[예를 들어, Rosenberg(2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul 외(2005) FEBS J. 272(20):5101-5109].

"낮은 엄격성, 중간 엄격성, 높은 엄격성 또는 매우 높은 엄격성 조건들 하에서 혼성화한다(hybridize)"라는 용어는 혼성화 및 세정에 대한 조건들을 설명한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 Current Protocols in Molecular Biology[John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 수성 및 비-수성 방법들이 상기 참고문헌에 설명되며, 어느 하나의 방법이 이용될 수 있다. 여기에 언급된 특정 혼성화 조건들은 다음과 같다: (1) 낮은 엄격성 혼성화 조건들 -- 약 45 ℃에서 6X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC), 이후에 적어도 50 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 두 번 세정(세정의 온도는 낮은 엄격성 조건들에 대해 55 ℃로 증가될 수 있음); (2) 중간 엄격성 혼성화 조건들 -- 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 60 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세정; (3) 높은 엄격성 혼성화 조건들 -- 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세정; 및 (4) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건들 -- 65 ℃에서 0.5 M 소듐 포스페이트, 7 % SDS, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 1 % SDS로 한번 이상 세정. 다르게 명시하지 않는다면, 매우 높은 엄격성 조건들 (4)가 바람직한 조건들이다.

"내인성" 폴리펩티드는 모 세포(parental cell)(또는 숙주 세포)의 게놈(genome)에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. "외인성" 폴리펩티드는 모 세포의 게놈에 의해 인코딩되지 않은 폴리펩티드를 지칭한다. 변이 또는 돌연변이 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드의 일 예시이다. 따라서, 비-자연적으로-발생하는 핵산 분자가, 세포 내로 도입되면, 그 세포에 대해 외인성인 것으로 고려된다. 또한, 자연적으로-발생하는 핵산 분자는 특정 세포에 대해 외인성일 수 있다. 예를 들어, 세포 X로부터 격리된(isolated) 전체 코딩 서열은, 그 코딩 서열이 세포 Y 내로 도입되면, X 및 Y가 동일한 세포 타입이더라도, 세포 Y에 대해 외인성 핵산이다.

"과발현"이라는 용어는, 유전자가 그 유전자에 대한 내인성 전사율(endogenous transcription rate)에 비해 상승된 비율로 전사되도록 유도됨을 의미한다. 몇몇 예시들에서, 과발현은 추가적으로 유전자에 대한 내인성 번역률(endogenous translation rate)에 비해 유전자의 상승된 번역률을 포함한다. 과발현에 대한 테스트 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 전사된 RNA 수준이 rtPCR을 이용하여 평가되고, 단백질 수준이 SDS page 겔 분석을 이용하여 평가될 수 있다.

"이종(heterologous)"이라는 용어는 상이한 유기체, 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유도됨을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이는 주어진 유기체에 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오티드-, 폴리뉴클레오티드-, 폴리펩티드- 또는 단백질 서열을 지칭한다. 예를 들어, 시아노박테리아에 대해 원시(native)인 폴리뉴클레오티드 서열이 재조합 방법들에 의해 대장균의 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 그 후 시아노박테리아로부터의 폴리뉴클레오티드는 대장균 세포(예를 들어, 재조합 세포)에 대해 이종이다. 또한, "이종"이라는 용어는 비-원시 상태에서 재조합 숙주 세포에 존재하는 뉴클레오티드-, 폴리뉴클레오티드-, 폴리펩티드- 또는 단백질 서열에 대한 언급에 사용될 수 있다. 예를 들어, "이종" 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열은 대응하는 야생형 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 야생형 서열에 대해 변형될 수 있으며, 이는 예를 들어 발현의 수준, 또는 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열의 변형이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "분절(fragment)"이라는 용어는 2 개의 아미노산 잔기에서부터 1 개의 아미노산 잔기를 뺀 전체 아미노산 서열에 이르는 크기 범위를 갖는 전체-길이 폴리펩티드 또는 단백질의 더 짧은 부분을 지칭한다. 본 발명의 특정 실시예들에서, 분절은 폴리펩티드 또는 단백질의 도메인[예를 들어, 기질 결합 도메인 또는 촉매 도메인]의 전체 아미노산 서열을 지칭한다.

"돌연변이유발(mutagenesis)"이라는 용어는 유기체의 유전 정보가 안정한 방식으로 변화되는 과정을 지칭한다. 단백질 코딩 핵산 서열의 돌연변이유발은 돌연변이 단백질을 생성한다. 또한, 돌연변이유발은 변형된 단백질 활성을 유도하는 비-코딩 핵산 서열의 변화를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "돌연변이"는 유전자의 핵산 위치 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 위치의 영구적인 변화를 지칭한다. 돌연변이는 치환, 추가, 삽입 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 위치의 돌연변이는 일 유형의 아미노산을 다른 유형의 아미노산으로 치환한 것일 수 있다[예컨대, 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환될 수 있고; 리신(L)이 T(트레오닌)로 치환될 수 있음]. 이와 같이, 폴리펩티드 또는 단백질은 1 이상의 돌연변이를 가질 수 있으며, 일 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된다.

"아실-ACP 레덕타아제(AAR) 변이체" 및 "변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR)"라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용되며, 아미노산 서열에서 1 이상의 돌연변이들을 갖는 AAR 관련 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. AAR은 아실-ACP의 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올로의 환원을 촉진시키는 효소를 지칭한다. AAR 변이체는 그 폴리펩티드 서열의 1 이상의 아미노산에서의 돌연변이를 포괄할 수 있다. 세포가 AAR 변이체로 형질전환되었을 때, 이는 AAR 변이체(예를 들어, 재조합 세포)를 발현시키는 세포이다. 일 실시예에서, AAR 변이체를 발현시키는 세포에 의해 생성된 지방족 알코올의 역가 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포(즉, AAR 변이체를 발현시키지 않는 대응 세포)보다 적어도 2 배이다. 대장균과 같은 이종 숙주에서, 지방족 알데히드는 내인성 알코올 디하이드로제나아제에 의해 지방족 알코올로 전환될 수 있다. 또 다른 실시예에서, AAR 변이체를 발현시키는 세포에 의해 생성된 지방족 알코올의 역가 및/또는 수율은, 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율보다 적어도 약 1 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 9 배, 또는 적어도 약 10 배 더 크다. 일 실시예에서, AAR 변이체를 발현시키는 세포에 의해 생성된 지방족 알코올의 역가 및/또는 수율은, 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율보다 적어도 약 1 퍼센트, 적어도 약 2 퍼센트, 적어도 약 3 퍼센트, 적어도 약 4 퍼센트, 적어도 약 5 퍼센트, 적어도 약 6 퍼센트, 적어도 약 7 퍼센트, 적어도 약 8 퍼센트, 적어도 약 9 퍼센트, 또는 적어도 약 10 퍼센트 더 크다. 또 다른 실시예에서, AAR 변이체의 발현으로 인해 재조합 세포에 생성된 지방족 알코올들의 역가 및/또는 수율은 야생형 세포의 역가 및/또는 수율보다 적어도 약 20 퍼센트 내지 적어도 약 100 퍼센트 더 크다. 특정 실시예들에서, 세포에 의해 생성된 지방족 알코올의 역가 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율보다 적어도 약 20 퍼센트, 적어도 약 25 퍼센트, 적어도 약 30 퍼센트, 적어도 약 35 퍼센트, 적어도 약 40 퍼센트, 적어도 약 45 퍼센트, 적어도 약 50 퍼센트, 적어도 약 55 퍼센트, 적어도 약 60 퍼센트, 적어도 약 65 퍼센트, 적어도 약 70 퍼센트, 적어도 약 75 퍼센트, 적어도 약 80 퍼센트, 적어도 약 85 퍼센트, 적어도 약 90 퍼센트, 적어도 약 95 퍼센트, 적어도 약 97 퍼센트, 적어도 약 98 퍼센트, 또는 적어도 약 100 퍼센트 더 크다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자"라는 용어는 RNA 생성물 또는 단백질 생성물 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라, RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 작동가능하게-연결된 핵산 서열들(operably-linked nucleic acid sequences)[예를 들어, 이러한 서열들은 프로모터 또는 증폭자(enhancer) 서열들을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)] 또는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 서열들을 인코딩하는 작동가능하게-연결된 핵산 서열들[예를 들어, 이러한 서열들은 리보솜 결합 부위 또는 번역 조절 서열(translational control sequence)들을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)]을 지칭한다.

발현 조절 서열(expression control sequence)들은 해당 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 증폭자, 아데닐산중합반응 신호(polyadenylation signal), 전사 종결자(transcription terminator), 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry sites: IRES) 등을 포함한다. 발현 조절 서열들은 특히 전사에 관련된 세포성 단백질들과 상호작용한다[Maniatis 외(1987) Science 236:1237-1245]. 예시적인 발현 조절 서열들은, 예를 들어 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에 개시되어 있다. 본 발명의 방법들에서, 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"이라는 것은, 적절한 분자들(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질들)이 발현 조절 서열에 결합될 때, 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현 조절 서열이 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 프로모터는, 전사 및 번역의 방향에 관하여, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 상류(upstream)에 위치된다. 작동가능하게 연결된 증폭자는 선택된 폴리뉴클레오티드의 상류, 내부 또는 하류(downstream)에 위치될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 벡터가 연결된 다른 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 유형의 유용한 벡터는 에피솜(episome)[즉, 염색체외 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산]이다. 유용한 벡터는 벡터가 연결된 핵산의 자동 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지향할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술들에 유용한 발현 벡터는 흔히 "플라스미드"의 형태로 되어 있으며, 이는 일반적으로 벡터 형태로 염색체에 결합되지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유용한 발현 벡터가 선형 형태로 제공된다. 또한, 등가의 기능들을 제공하고, 이후에 해당 기술분야에 알려지는 이러한 다른 형태들의 발현 벡터도 포함된다. 몇몇 실시예들에서, 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 프로모터는 발달-조절된 프로모터(developmentally-regulated promoter), 세포소기관-특이적 프로모터(organelle-specific promoter), 조직-특이적 프로모터(tissue-specific promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 구성적 프로모터(constitutive promoter), 또는 세포-특이적 프로모터이다. 재조합 벡터는 통상적으로 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열(secretion sequence); 및 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열(targeting sequence)로부터 선택된 1 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시예들에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정하게 통합되며, 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 구역의 제어를 받는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 발현 벡터는 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 형태로 된 본 명세서에 설명된 바와 같은 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 해당 기술분야의 당업자라면, 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 인자들에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명되는 발현 벡터는 본 명세서에 설명되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열들에 의해 인코딩되는, 융합 폴리펩티드들을 포함하는 폴리펩티드들을 생성하기 위하여 숙주 세포들 내로 도입될 수 있다. 원핵생물, 예를 들어 대장균에서 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 및 비-융합 폴리펩티드들 중 어느 하나의 발현을 지향하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터들은 그 안에 인코딩된 폴리펩티드에, 일반적으로는 재조합 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단에 다수의 아미노산들을 첨가한다. 이러한 융합 벡터들은 통상적으로 다음의 세 가지 목적: 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것 중 1 이상을 제공한다. 흔히, 융합 발현 벡터에서, 융합 모이어티와 재조합 폴리펩티드의 접합점에 단백질분해 절단(proteolytic cleavage) 부위가 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리를 가능하게 한다. 특정 실시예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지 T5로부터 유도된 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

특정 실시예들에서, 숙주 세포는 효모 세포이고, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모인 맥주효모균(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터들의 예시들은 pYepSec1[Baldari 외(1987) EMBO J. 6:229-234]; pMFa[Kurjan 외(1982) Cell 30:933-943]; pJRY88[Schultz 외(1987) Gene 54:113-123]; pYES2(Invitrogen Corp., San Diego, CA), 및 picZ(Invitrogen Corp., San Diego, CA)를 포함한다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 곤충 세포이고, 발현 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포들(예를 들어, Sf9 세포들)에서의 단백질들의 발현에 이용가능한 배큘로바이러스 벡터들은, 예를 들어 pAc 계열(series)[Smith 외(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 및 pVL 계열[Lucklow 외(1989) Virology 170:31-39]을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열들은 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포들에서 발현될 수 있다. 원핵 및 진핵 세포들 둘 모두에 대한 다른 적절한 발현계들이 당업계에 잘 알려져 있다; 예를 들어, Sambrook 외, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)를 참조한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "CoA" 또는 "아실-CoA"는 조효소 A(CoA)의 4'-포스포판테티오닐 모이어티의 설프하이드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에 형성되는 아실 티오에스테르를 지칭하고, 이는 화학식 R-C(O)S-CoA를 가지며, 여기서 R은 적어도 4 개의 탄소 원자들을 갖는 여하한의 알킬기이다.

"ACP"라는 용어는 아실기 운반 단백질을 의미한다. ACP는 지방산 생합성 동안의 아실 중간체(intermediates)의 고보존성 운반체(highly conserved carrier)이며, 성장 사슬(growing chain)은 4'-포스포판테테인 모이어티의 말단 티올에서 티올 에스테르로서 합성 동안 결합된다. 단백질은 두 가지 형태, 즉 아포-ACP(지방산 생합성에서 비활성)및 ACP 또는 홀로(holo)-ACP(지방산 생합성에서 활성)로 존재한다. "ACP" 및 "홀로-ACP"라는 용어들은 본 명세서에서 교환가능하게 사용되며, 단백질의 활성 형태를 지칭한다. 포스포판테테이닐트랜스페라아제라고 하는 효소가 비활성 아포-ACP의 활성 홀로-ACP로의 전환에 관련된다. 더 구체적으로, ACP는 비활성 아포-ACP 형태로 발현되고, 4'-포스포판테테인 모이어티가 홀로-ACP를 생성하기 위해 홀로-아실기 운반 단백질 신타아제(ACPS), 포스포판테테이닐트랜스페라아제의 작용에 의해 ACP 상의 보존된 세린 잔기에 번역-후(post-translationally) 부착되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아실-ACP"라는 용어는 아실기 운반 단백질(ACP)의 포스포판테테이닐 모이어티의 설프하이드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에 형성되는 아실 티오에스테르를 지칭한다. 몇몇 실시예들에서, ACP는 완전히 포화된 아실-ACP의 합성에 있어서 중간체이다. 다른 실시예들에서, ACP는 불포화된 아실-ACP의 합성에 있어서 중간체이다. 몇몇 실시예들에서, 탄소 사슬은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 탄소들을 가질 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 유도체"라는 용어는 "지방산" 또는 "지방산 유도체"를 의미하고, 이는 "지방산 또는 이의 유도체"로 칭해질 수 있다. "지방산"이라는 용어는 화학식 RCOOH를 갖는 카르복실산을 의미한다. R은 지방족기(aliphatic group), 바람직하게는 알킬기를 나타낸다. R은 약 4 내지 약 22 개의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 지방산들은 포화, 단일불포화 또는 다중불포화될 수 있다. "지방산 유도체"는 부분적으로 생성 숙주 유기체의 지방산 생합성 경로로부터 만들어지는 생성물이다. "지방산 유도체들"은 부분적으로 ACP, 아실-ACP 또는 아실-ACP 유도체들로부터 만들어지는 생성물들을 포함한다. 예시적인 지방산 유도체들은, 예를 들어 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 지방족 알코올, 탄화수소, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르 또는 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 생합성 경로"라는 용어는 지방산들 및 이의 유도체들을 생성하는 생합성 경로를 의미한다. 지방산 생합성 경로는 원하는 특성들을 갖는 지방산 유도체들을 생성하도록 추가 효소들을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 알데히드"는 카르보닐기(C=O)에 의해 특성화되는 화학식 RCHO를 갖는 알데히드를 의미한다. 몇몇 실시예들에서, 지방족 알데히드는 지방족 알코올로부터 만들어지는 여하한의 알데히드이다. 특정 실시예들에서, R기는 길이가 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19 개의 탄소들이다. 대안적으로 또는 추가적으로, R기는 길이가 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하 또는 6 이하의 탄소들이다. 따라서, R기는 상기의 종단점들 중 어느 두 개로 한정되는 R기를 가질 수 있다. 예를 들어, R기는 길이가 6 내지 16 개의 탄소들, 길이가 10 내지 14 개의 탄소들, 또는 길이가 12 내지 18 개의 탄소들일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 지방족 알데히드는 C₆, C₇, C₈, C₉, C_1O, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₁, C₂₂, C₂₃, C₂₄, C₂₅ 또는 C₂₆ 지방족 알데히드이다. 특정 실시예들에서, 지방족 알데히드는 C₆, C₈, C_1O, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇ 또는 C₁₈ 지방족 알데히드이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 알코올"은 화학식 ROH를 갖는 알코올을 의미한다. 몇몇 실시예들에서, R기는 길이가 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 , 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19 개의 탄소들이다. 대안적으로 또는 추가적으로, R기는 길이가 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하 또는 6 이하의 탄소들이다. 따라서, R기는 상기의 종단점들 중 어느 두 개로 한정되는 R기를 가질 수 있다. 예를 들어, R기는 길이가 6 내지 16 개의 탄소들, 길이가 10 내지 14 개의 탄소들, 또는 길이가 12 내지 18 개의 탄소들일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 지방족 알코올은 C₆, C₇, C₈, C₉, C_1O, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₁, C₂₂, C₂₃, C₂₄, C₂₅ 또는 C₂₆ 지방족 알코올이다. 특정 실시예들에서, 지방족 알코올은 C₆, C₈, C_1O, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇ 또는 C₁₈ 지방족 알코올이다.

본 명세서에서 언급된 바와 같은 "지방족 알코올 조성물"은 재조합 숙주 세포에 의해 생성되며, 통상적으로 지방족 알코올의 혼합물을 포함한다. 몇몇 경우, 혼합물은 1 이상의 유형의 생성물(예를 들어, 지방족 알코올 및 지방산)을 포함한다. 다른 경우, 지방산 유도체 조성물은, 예를 들어 다양한 사슬 길이 및 포화 또는 분지 특성들을 갖는 지방족 알코올의 혼합물을 포함할 수 있다. 또 다른 경우, 지방족 알코올 조성물은 다양한 사슬 길이 및 포화 또는 분지 특성들을 갖는 생성물과 1 이상의 유형의 생성물의 혼합물을 둘 모두 포함한다.

지방족 알데히드를 생성하도록 조작된 숙주 세포는 통상적으로 지방족 알데히드의 일부를 지방족 알코올로 전환할 것이다. 일 예시적인 실시예에서, 아실-ACP는 AAR의 작용을 통해 지방족 알데히드로 전환된다. 지방족 알데히드의 지방족 알코올로의 전환은, 예를 들어 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드를 통해 더 용이해질 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 숙주 세포에서 발현 또는 과발현된다. 특정 실시예들에서, 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드는 알데히드 레덕타아제 또는 알코올 디하이드로제나아제 활성을 갖는다.

본 발명에 따라 유용한 알코올 디하이드로제나아제 폴리펩티드들의 예시들은 아시네토박터 종 M-1(SEQ ID NO: 52)의 AlrA 또는 AlrAadp1(SEQ ID NO: 53)와 같은 AlrA 동족체, 그리고 내인성 대장균 알코올 디하이드로제나아제, 예컨대 YjgB(AAC77226), DkgA(NP_417485), DkgB(NP_414743), YdjL(AAC74846), YdjJ(NP_416288), AdhP(NP_415995), YhdH(NP_417719), YahK(NP_414859), YphC(AAC75598), YqhD(446856) 및 YbbO[AAC73595.1]을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 추가적인 예시들은 국제 특허 출원 공개공보 WO 2007/136762, WO2008/119082 및 WO 2010/062480에 개시되어 있다. 특정 실시예들에서, 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드는 알데히드 레덕타아제 또는 알코올 디하이드로제나아제 활성(EC 1.1.1.1)을 갖는다.

지방산, 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 R기는 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 분지쇄형은 1 이상의 분지점을 가질 수 있으며, 사이클릭형 분지들을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 C₆, C₇, C₈, C₉, C_1O, C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₁, C₂₂, C₂₃, C₂₄, C₂₅ 또는 C₂₆ 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올이다. 특정 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 C₆, C₈, C_1O, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇ 또는 C₁₈ 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올이다. 특정 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올의 하이드록실기는 첫번째(C₁) 위치에 있다.

특정 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 이소(iso)-지방산, 이소-지방족 알데히드 또는 이소-지방족 알코올, 또는 안테이소(anteiso)-지방산, 안테이소-지방족 알데히드 또는 안테이소-지방족 알코올이다. 예시적인 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 이소-C_7:0, 이소-C_8:0, 이소-C_9:0, 이소-C_10:0, 이소-C_11:0, 이소-C_12:0, 이소-C_13:0, 이소-C_14:0, 이소-C_15:0, 이소-C_16:0, 이소-C_17:0, 이소-C_18:0, 이소-C_19:0, 안테이소-C_7:0, 안테이소-C_8:0, 안테이소-C_9:0, 안테이소-C_10:0, 안테이소-C_11:0, 안테이소-C_12:0, 안테이소-C_13:0, 안테이소-C_14:0, 안테이소-C_15:0, 안테이소-C_16:0, 안테이소-C_17:0, 안테이소-C_18:0 및 안테이소-C_19:0 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올로부터 선택된다.

분지형 또는 비분지형 지방산, 분지형 또는 비분지형 지방족 알데히드, 또는 분지형 또는 비분지형 지방족 알코올의 R기는 포화 또는 불포화될 수 있다. 불포화된 경우, R기는 1 이상의 불포화점을 가질 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올은 단일불포화 지방산, 단일불포화 지방족 알데히드, 또는 단일불포화 지방족 알코올이다. 특정 실시예들에서, 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올은 C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1 또는 C26:1 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올이다. 특정한 바람직한 실시예에서, 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올은 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1이다. 다른 실시예들에서, 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올은 오메가-7 위치에서 불포화된다. 특정 실시예들에서, 불포화 지방산, 불포화 지방족 알데히드, 또는 불포화 지방족 알코올은 cis 이중 결합을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "재조합 숙주 세포" 또는 "조작된 숙주 세포"는 숙주 세포, 예를 들어 지방족 알코올들을 생성하도록 변형된 미생물이다. 몇몇 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 1 이상의 폴리뉴클레오티드들을 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오티드는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 생합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하며, 재조합 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드들을 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시에 배양될 때 지방족 알코올 조성물을 생성한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "클론"이라는 용어는 통상적으로 단일 공통 선조와 본질적으로 유전적으로 동일하고 이의 자손인 세포 또는 세포들의 그룹, 예를 들어 단일 박테리아성 세포에서 발생하는 클로닝된 박테리아성 콜로니(cloned bacterial colony)의 박테리아를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배양물"이라는 용어는 통상적으로 생세포(viable cell)들을 포함하는 액체 배지를 지칭한다. 일 실시예에서, 배양은 제어된 조건들 하에서 사전설정된 배양 배지에서 번식하는 세포들, 예를 들어 선택된 탄소원 및/또는 질소를 포함하는 액체 배지에서 성장되는 재조합 숙주 세포들의 배양을 포함한다.

"배양하는" 또는 "배양"이라는 용어는 액체 또는 고체 배지의 적절한 조건들 하에서 세포들의 개체군을 성장시키는 것을 지칭한다. 특정 실시예들에서, 배양은 최종 생성물로의 기질의 발효성 생물전환(bioconversion)을 지칭한다. 배양 배지는 잘 알려져 있으며, 이러한 배양 배지의 각각의 성분들은 예를 들어 DIFCO 배지 및 BBL 배지라는 이름의 상용 공급원(commercial source)들로부터 이용가능하다. 비-제한적인 일 예시에서, 수성 영양 배지(aqueous nutrient medium)는 YP 배지와 같이 질소, 염 및 탄소의 복합원을 포함하는 "풍부한 배지(rich medium)"이며, 이는 이러한 배지의 10 g/L의 펩톤 및 10 g/L 효모 추출물을 포함한다.

추가적으로, 숙주 세포는 미국 특허 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; 5,602,030; 및 특허 출원 공개공보 WO 2010127318에 설명된 방법들에 따라, 탄소를 효율적으로 동화시키고 탄소원으로서 셀룰로오스 물질(cellulosic material)들을 사용하도록 조작될 수 있다. 또한, 숙주 세포는 인베르타아제를 발현시키도록 조작될 수 있어, 수크로오스가 탄소원으로서 사용될 수 있도록 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상기 이종 뉴클레오티드 서열들을 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서"라는 용어는 숙주 세포가 원하는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올을 생성하게 하는 여하한 조건들을 의미한다. 적합한 조건들은, 예를 들어 발효 조건들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 숙주 세포 내에서 단백질, 예를 들어 효소의 "변형된" 또는 "변경된 수준"의 활성은 모(parent) 또는 원시(native) 숙주 세포에 대해 결정된 활성의 1 이상의 특성의 차이를 지칭한다. 통상적으로, 활성의 차이는 변형된 활성을 갖는 재조합 숙주 세포와 대응하는 야생형 숙주 세포 사이에서 결정된다(예를 들어, 야생형 숙주 세포에 대한 재조합 숙주 세포의 배양물의 비교). 예를 들어, 변형된 활성은 [예를 들어, 단백질을 인코딩하는 DNA 서열의 증가 또는 감소된 수의 복제, 단백질을 인코딩하는 증가 또는 감소된 수의 mRNA 전사체, 및/또는 mRNA로부터의 단백질의 증가 또는 감소된 양의 단백질 번역(protein translation)의 결과로서] 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 변형된 양의 단백질; 단백질의 구조 변화[예를 들어, 기질 특수성의 변화, 관찰되는 운동 파라미터들(kinetic parameters)의 변화를 유도하는 단백질 코딩 서열에 대한 변화와 같은 일차 구조에 대한 변화); 및 단백질 안정성의 변화(예를 들어, 단백질의 증가 또는 감소된 분해)의 결과일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 설명된 폴리펩티드 중 어느 하나의 돌연변이체 또는 변이체이다. 특정 경우에서, 본 명세서에 설명된 바와 같은 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열은 특정 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈(codon)이다. 예를 들어, 대장균의 발현을 위해, 1 이상의 코돈이 최적화될 수 있다[Grosjean 외(1982) Gene 18:199-209].

통상적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절 서열(regulatory sequences)"이라는 용어는 궁극적으로 단백질의 발현을 제어하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열들에 작동가능하게-연결된, DNA의 염기 서열을 지칭한다. 조절 서열의 예시들은 RNA 프로모터 서열, 전사 인자 결합 서열(transcription factor binding sequences), 전사 종결 서열, (증폭자 요소와 같은) 전사의 조절인자(modulators), RNA 안정성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열, 및 번역 조절 서열[예컨대, 리보솜 결합 부위(예를 들어, 원핵생물의 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequences) 또는 진핵생물의 코작 서열(Kozak sequences), 개시 코돈, 종결 코돈]을 포함한다(이로 제한되지 않음).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 야생형 뉴클레오티드 서열에 대해 변형된다"라는 어구는, 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현 및/또는 활성 또는 이종 혹은 비-원시 폴리펩티드-인코딩 뉴클레오티드 서열의 발현 및/또는 활성의 수준의 증가 또는 감소를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에 대한 "발현"이라는 용어는 이것이 기능하게 한다는 것이다. 폴리펩티드(또는 단백질)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 발현될 때, 그 폴리펩티드(또는 단백질)를 생성하기 위해 전사 및 번역될 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "과발현"이라는 용어는 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포에서 정상적으로 발현되는 것보다 더 높은 농도로 세포에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현시키는(또는 발현되게 하는) 것을 의미한다.

"변경된 수준의 발현" 및 "변형된 수준의 발현"이라는 용어는 교환가능하게 사용되며, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 탄화수소가 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포의 농도에 비해 조작된 숙주 세포에서 상이한 농도로 존재함을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "역가"라는 용어는 숙주 세포 배양의 단위 부피당 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 양(quantity)을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들의 여하한의 실시형태에서, 지방족 알코올은 약 25 mg/L, 약 50 mg/L, 약 75 mg/L, 약 100 mg/L, 약 125 mg/L, 약 150 mg/L, 약 175 mg/L, 약 200 mg/L, 약 225 mg/L, 약 250 mg/L, 약 275 mg/L, 약 300 mg/L, 약 325 mg/L, 약 350 mg/L, 약 375 mg/L, 약 400 mg/L, 약 425 mg/L, 약 450 mg/L, 약 475 mg/L, 약 500 mg/L, 약 525 mg/L, 약 550 mg/L, 약 575 mg/L, 약 600 mg/L, 약 625 mg/L, 약 650 mg/L, 약 675 mg/L, 약 700 mg/L, 약 725 mg/L, 약 750 mg/L, 약 775 mg/L, 약 800 mg/L, 약 825 mg/L, 약 850 mg/L, 약 875 mg/L, 약 900 mg/L, 약 925 mg/L, 약 950 mg/L, 약 975 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1050 mg/L, 약 1075 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1125 mg/L, 약 1150 mg/L, 약 1175 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1225 mg/L, 약 1250 mg/L, 약 1275 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1325 mg/L, 약 1350 mg/L, 약 1375 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1425 mg/L, 약 1450 mg/L, 약 1475 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1525 mg/L, 약 1550 mg/L, 약 1575 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1625 mg/L, 약 1650 mg/L, 약 1675 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1725 mg/L, 약 1750 mg/L, 약 1775 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1825 mg/L, 약 1850 mg/L, 약 1875 mg/L, 약 1900 mg/L, 약 1925 mg/L, 약 1950 mg/L, 약 1975 mg/L, 약 2000 mg/L(2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 1O g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 1OO g/L 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위의 역가로 생성된다. 다른 실시예들에서, 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올은 1OO g/L 초과, 200 g/L 초과 또는 300 g/L 초과, 또는 500 g/L, 700 g/L, 1000 g/L, 1200 g/L, 1500 g/L 또는 2000 g/L과 같은 더 높은 역가로 생성된다. 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 바람직한 역가는 5 g/L 내지 200g/L, 1O g/L 내지 150 g/L, 20 g/L 내지 120 g/L, 및 30 g/L 내지 1OO g/L이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 수율"은 투입된 탄소원이 숙주 세포의 생성물(즉, 지방족 알코올 또는 지방족 알데히드)로 전환되는 효율을 지칭한다. 본 발명의 방법들에 따라 지방족 알코올 및/또는 지방족 알데히드를 생성하도록 조작된 숙주 세포는 적어도 약 3 %, 적어도 약 4 %, 적어도 약 5 %, 적어도 약 6 %, 적어도 약 7 %, 적어도 약 8 %, 적어도 약 9 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 11 %, 적어도 약 12 %, 적어도 약 13 %, 적어도 약 14 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 16 %, 적어도 약 17 %, 적어도 약 18 %, 적어도 약 19 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 21 %, 적어도 약 22 %, 적어도 약 23 %, 적어도 약 24 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 26 %, 적어도 약 27 %, 적어도 약 28 %, 적어도 약 29 % 또는 적어도 약 30 %, 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 한정되는 한정되는 범위의 수율을 갖는다. 다른 실시예들에서, 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올은 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상을 초과하는 수율로 생성된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수율은 약 30 % 이하, 약 27 % 이하, 약 25 % 이하 또는 약 22 % 이하이다. 따라서, 수율은 상기 종단점들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알코올 또는 지방족 알데히드의 수율은 5 % 내지 15 %, 10 % 내지 25 %, 10 % 내지 22 %, 15 % 내지 27 %, 18 % 내지 22 %, 20 % 내지 28 %, 또는 20 % 내지 30 %일 수 있다. 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알코올의 바람직한 수율은 10 % 내지 30 %이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산성"이라는 용어는 단위 시간당 숙주 세포 배양의 단위 부피당 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 양을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들의 여하한의 실시형태에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 생산성은 적어도 100 mg/L/hour, 적어도 200 mg/L/hour₀, 적어도 300 mg/L/hour, 적어도 400 mg/L/hour, 적어도 500 mg/L/hour, 적어도 600 mg/L/hour, 적어도 700 mg/L/hour, 적어도 800 mg/L/hour, 적어도 900 mg/L/hour, 적어도 1000 mg/L/hour, 적어도 1100 mg/L/hour, 적어도 1200 mg/L/hour, 적어도 1300 mg/L/hour, 적어도 1400 mg/L/hour, 적어도 1500 mg/L/hour, 적어도 1600 mg/L/hour, 적어도 1700 mg/L/hour, 적어도 1800 mg/L/hour, 적어도 1900 mg/L/hour, 적어도 2000 mg/L/hour, 적어도 2100 mg/L/hour, 적어도 2200 mg/L/hour, 적어도 2300 mg/L/hour, 적어도 2400 mg/L/hour, 또는 적어도 2500 mg/L/hour이다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 생산성은 2500 mg/L/hour 이하, 2000 mg/L/OD₆₀₀ 이하, 1500 mg/L/OD₆₀₀ 이하, 120 mg/L/hour 이하, 1000 mg/L/hour 이하, 800 mg/L/hour 이하, 또는 600 mg/L/hour 이하이다. 따라서, 생산성은 상기 종단점들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올의 바람직한 생산성은 500 mg/L/hour 내지 2500 mg/L/hour, 또는 700 mg/L/hour 내지 2000 mg/L/hour에서 선택된다.

"총 지방 종" 및 "총 지방산 생성물"이라는 용어는 국제 특허 출원 공개공보 WO 2008/119082에 개시된 GC-FID에 의해 평가되는 바와 같이 샘플에 존재하는 지방족 알코올, 지방족 알데히드, 유리 지방산 및 지방족 에스테르의 전체 양과 관련하여 본 명세서에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 샘플들은 상황에 따라 이러한 화합물들 중 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개를 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "글루코오스 이용률"이라는 용어는 그램/리터/시간(g/L/hr)으로 기록되는 단위 시간당 배양에 사용되는 글루코오스의 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탄소원"이라는 용어는 원핵 또는 단순 진핵 세포 성장을 위한 탄소원으로서 사용되는데 적합한 기질 또는 화합물을 지칭한다. 탄소원은 중합체, 탄수화물, 산, 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩티드 및 기체(예를 들어, CO 및 CO₂)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 다양한 형태로 존재할 수 있다. 예시적인 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로오스 및 아라비노오스와 같은 단당류; 프럭토-올리고당 및 갈락토-올리고당과 같은 올리고당류; 녹말, 셀룰로오스, 펙틴 및 자일란과 같은 다당류; 수크로오스, 말토오스, 셀로비오스 및 투라노오스(turanose)와 같은 이당류; 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 메틸 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 물질 및 변이체들; 숙시네이트, 락테이트 및 아세테이트와 같은 포화 또는 불포화 지방산류; 에탄올, 메탄올 및 글리세롤과 같은 알코올류, 또는 이의 혼합물들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또한, 탄소원은 글루코오스와 같은 광합성의 산물일 수 있다. 특정 실시예들에서, 탄소원은 플루 가스(flu gas)로부터 나오는 CO를 함유한 기체 혼합물이다. 또 다른 실시예에서, 탄소원은 바이오매스, 석탄, 또는 천연 가스와 같은 탄소 함유 물질의 개량(reformation)으로부터 나오는 CO를 함유한 기체 혼합물이다. 다른 실시예들에서, 탄소원은 합성가스, 메탄, 또는 천연 가스이다. 바람직한 특정 실시예들에서, 탄소원은 바이오매스이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 탄소원은 글루코오스이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 탄소원은 수크로오스이다. 다른 실시예들에서, 탄소원은 글리세롤이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 탄소원은 사탕수수 쥬스, 사탕수수 시럽, 또는 옥수수 시럽이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 탄소원은 CO₂, CO, 글루코오스, 수크로오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글리세롤, 마노오스, 또는 이의 혼합물들과 같은 재생가능한 공급원료로부터 유도된다. 다른 실시예들에서, 탄소원은 녹말, 셀룰로오스 바이오매스, 당밀, 및 셀룰로오스 바이오매스의 가수분해로부터 유도된 탄수화물 혼합물들 또는 식물이나 천연 오일 처리로부터 유도된 폐기물을 포함한 다른 탄수화물 공급원들을 포함하는 재생가능한 공급원료로부터 유도된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이오매스"라는 용어는 탄소원이 유도되는 여하한의 생물학적 물질을 지칭한다. 몇몇 실시예들에서, 바이오매스는 탄소원으로 처리되며, 이는 생물전환에 적합하다. 다른 실시예들에서, 바이오매스는 탄소원으로의 추가적인 처리를 요구하지 않는다. 예시적인 바이오매스의 공급원은 옥수수, 사탕수수 또는 스위치그래스(switchgrass)와 같은 식물성 물질 또는 식생(vegetation)이다. 또 다른 예시적인 바이오매스의 공급원은 동물성 물질[예를 들어, 우분(cow manure)]과 같은 신진대사 노폐물(metabolic waste products)이다. 또 다른 예시적인 바이오매스의 공급원은 조류 및 다른 해양 식물을 포함한다. 또한, 바이오매스는 글리세롤, 발효 찌꺼기, 목초, 짚, 목재, 오수, 쓰레기, 셀룰로오스 도시 폐기물 및 음식 쓰레기(예를 들어, 비누, 오일 및 지방산)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 산업, 농업, 임업 및 가정으로부터의 폐기물을 포함한다. 또한, "바이오매스"라는 용어는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류)과 같은 탄소원을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, (지방산 및 이의 유도체와 같은) 생성물들에 대하여 "격리된(isolated)"이라는 용어는 세포 성분, 세포 배양 배지, 또는 화학적 또는 합성 전구체로부터 분리된(separated) 생성물들을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 방법들에 의해 생성된 지방산 및 이의 유도체는 세포질뿐만 아니라 발효액에서 비교적 혼합되지 않을 수 있다. 그러므로, 지방산 및 이의 유도체는 세포내 또는 세포외에서 유기 상(organic phase)으로 수집될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정제한다", "정제된" 또는 "정제"라는 용어는, 예를 들어 격리 또는 분리에 의해 그 환경으로부터 분자의 제거 또는 격리를 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 연계된 다른 성분들로부터 적어도 약 60 % 유리(예를 들어, 적어도 약 70 % 유리, 적어도 약 75 % 유리, 적어도 약 85 % 유리, 적어도 약 90 % 유리, 적어도 약 95 % 유리, 적어도 약 97 % 유리, 적어도 약 99 % 유리)된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 또한 이러한 용어는 샘플로부터 오염물의 제거를 지칭한다. 예를 들어, 오염물의 제거는 샘플에서의 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체의 비율의 증가를 유도할 수 있다. 예를 들어, 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포에서 생성될 때, 지방산 유도체는 숙주 세포 단백질 또는 다른 숙주 세포 물질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 샘플에서의 지방산 유도체의 비율이 증가된다. "정제한다", "정제된" 및 "정제"라는 용어는 절대 순도를 필요로 하지 않는 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포에 생성될 때, 정제된 지방산 유도체는 다른 세포 성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 탄화수소)로부터 실질적으로 분리되는 지방산 유도체이다.

증가된 지방족 알코올 생성

본 발명은 숙주 세포에서의 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 유전자의 변형된 발현의 결과로서 향상된 지방족 알코올 조성물의 생성을 제공한다. AAR은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생성을 위한 생합성 경로과 관련된다. 변이 AAR은 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환하는 생합성 경로와 관련된 또 다른 유전자의 변형된 발현과 조합하여 또는 단독으로 사용된다. 본 명세서에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포들을 제공하며, 이는 야생형 AAR 또는 AAR과 동일한 기능을 갖는 다른 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드들을 발현시키는 비-조작된 또는 원시 또는 야생형 숙주 세포들에 대해 향상된 지방족 알코올 생합성을 제공하기 위해 변이 AAR을 발현시키도록 조작되었다. 본 발명은 재조합 숙주 세포들에 유용한 AAR 관련 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들을 식별한다. 하지만, AAR 관련 폴리뉴클레오티드들에 대한 절대적 서열 동일성이 필수적인 것은 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 변화가 이루어질 수 있으며, 인코딩된 폴리펩티드가 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 변화는 통상적으로, 이를테면 코돈 최적화를 통해 보존적 돌연변이들 및 잠재적 돌연변이들을 포함한다. 변형된 또는 돌연변이된(즉, 돌연변이) 폴리뉴클레오티드들 및 인코딩된 변이 폴리펩티드들은, 해당 기술분야에 알려진 방법들을 이용하여, 증가된 촉매 활성, 증가된 안정성 또는 감소된 억제(예를 들어, 감소된 피드백 억제)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 모 폴리펩티드에 비해 개선된 기능과 같은 원하는 기능에 대해 스크리닝될 수 있다. 본 발명은 효소 분류(Enzyme Classification: EC) 번호에 따라 본 명세서에 설명된 지방산 생합성 경로들의 다양한 단계들(즉, 반응들)과 관련된 효소 활성을 식별하며, 이러한 EC번호에 의해 분류된 예시적인 폴리펩티드들(효소들) 및 이러한 폴리펩티드들을 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 수탁 번호 및/또는 서열 식별 번호(Sequence Identifier Number: SEQ ID NO)에 의해 본 명세서에서 식별되는 이러한 예시적인 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들은 본 명세서에 설명된 재조합 숙주 세포들을 얻기 위해 모 숙주 세포들의 지방산 경로들을 조작하는데 유용하다. 하지만, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들은 예시이며, 따라서 비-제한적임을 이해하여야 한다. 본 명세서에 설명된 예시적인 폴리펩티드들의 동족체들의 서열들은, 데이터베이스들[예를 들어, 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI)에 의해 제공되는 Entrez 데이터베이스, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)에 의해 제공되는 ExPasy 데이터베이스, 브라운슈바이크 기술대학(Technical University of Braunschweig)에 의해 제공되는 BRENDA 데이터베이스, 및 교토대 및 동경대의 생물정보학 센터(Bioinformatics Center of Kyoto University and University of Tokyo)에 의해 제공되는 KEGG 데이터베이스, 이 모두는 월드 와이드 웹에서 이용가능함]을 이용하여 해당 기술분야의 당업자들이 이용가능하다. 지방족 알코올 조성물들의 향상된 생성에 적합한 재조합 숙주 세포들을 유도하는 본 명세서에 설명된 효소들과 같은 변이 AAR 지방족 알코올 생화학 효소들을 발현시키기 위해 여러 상이한 숙주 세포들이 변형될 수 있다. 다양한 세포들이 본 명세서에 설명된 바와 같은 재조합 숙주 세포에서의 사용에 적합한 폴리펩티드들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 포함한 유전 물질원을 제공할 수 있음을 이해할 것이다.

아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드 및 이의 변이체

일 실시형태에서, 본 발명은 원시 또는 비-원시 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 단백질을 발현시키기 위해 숙주 세포를 조작함으로써 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체들의 개선된 생성에 관한 것이다. AAR 단백질은 아실-ACP의 지방족 알데히드로의 환원을 촉진시키며, 또한 지방족 알데히드의 지방족 알코올로의 전환을 촉진시킬 수 있다(본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 공개공보 20120282663을 참조). AAR 폴리펩티드 또는 AAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 원시(예를 들어, 내인성) 또는 비-원시(예를 들어, 외인성, 이종 등)일 수 있으며, 즉 이는 대응하는 야생형 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 야생형 서열 및 이의 발현과 상이할 수 있다. 예시들은 변이 AAR(예를 들어, 돌연변이체) 및/또는 이의 발현의 수준을 유도하는 AAR 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열의 변형을 포함한다. 본 발명은 AAR 폴리펩티드들, 동족체들 및 변이체들을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 44의 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, AAR은 시네코코쿠스 종 또는 프로클로로코쿠스 종으로부터 유도된다. 다른 실시예들에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 44의 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 가지며, 또한 본 명세서에 설명된 바와 같은 유용한 특징들 및/또는 특성들을 유도하는 1 이상의 치환체들을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 34의 야생형 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시예들에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 44에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시예들에서, 개선된 또는 변이 AAR 폴리펩티드 서열은 시네코코쿠스 종 또는 프로클로로코쿠스 종 이외의 종으로부터 유도된다.

관련된 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 43에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 갖는 AAR 폴리펩티드들을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 핵산 서열은 본 명세서에 설명된 바와 같은 개선된 특징들 및/또는 특성들을 유도하는 1 이상의 치환체들을 갖는 AAR 변이체를 인코딩한다. 또 다른 관련된 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 43에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 43에 대응하는 핵산의 실질적인 전체 길이에 걸쳐 엄격한 조건들 하에서 혼성화하는 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 AAR 폴리펩티드에 관한 것이다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 57 내지 SEQ ID NO: 78 중 어느 하나의 변이 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시예들에서, AAR은 시네코코쿠스 종 또는 프로클로로코쿠스 종으로부터 유도된다. 다른 실시예들에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 57 내지 SEQ ID NO: 78 중 어느 하나의 변이 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는다. 변이 AAR 폴리펩티드는 본 명세서에 설명된 바와 같은 유용한 특징들 및/또는 특성들을 유도하는 1 이상의 치환체(들)를 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 또는 SEQ ID NO: 65의 변이 AAR 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시예들에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 AAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 57 내지 SEQ ID NO: 78 중 어느 하나에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시예들에서, 개선된 또는 변이 AAR 폴리펩티드 서열은 시네코코쿠스 종 또는 프로클로로코쿠스 종 이외의 종으로부터 유도된다.

본 발명자들은 야생형 AAR_7942를 넘어서는 개선점들을 갖는 변이체들을 스크리닝하기 위해 시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942(AAR_7942)로부터 아실-ACP 레덕타아제의 오류 유발 라이브러리(error prone library)를 만들었다(아래의 예시 3을 참조). 이러한 개선점들은, 전반적으로 지방족 알코올 역가를 개선시키거나, 역가에 실질적인 영향을 주지 않고 C10, C12, C14 또는 C16 지방족 알코올들의 분율을 증가시키는 것으로서 분류될 수 있다. 오류 유발 라이브러리는 아미노산 위치 18을 포함하는 다양한 아미노산 위치들을 식별한다. 이러한 위치들을 더 테스트하기 위해 포화 및 조합 라이브러리들이 제조(prepare)되었다. SEQ ID NO: 57은 아미노산 18의 돌연변이를 갖는 AAAR 변이체(돌연변이체)에 대한 아미노산 서열에 대해 코딩한다. 세린이 트립토판으로 대체된 돌연변이 S18W는 세포들에서 발현될 때 지방족 알코올 생성의 상당한 증가를 유도한다(아래의 예시 3 및 4 참조). 더 구체적으로, S18W 돌연변이는 대조군으로서 사용된 야생형 AAR에 비해 총 지방족 알코올(FALC) 생성물의 227 % 증가 및 C14 지방족 알코올의 324 % 증가를 야기하였다(아래의 표 4A 및 4B 참조).

본 발명자들은 C12 지방족 알코올들의 분율 또는 전반적인 FALC 역가를 더 증가시킨 변이체들(돌연변이체들)을 식별하기 위해 S18W 돌연변이에 기초하여 포화 라이브러리들을 만들었다(아래의 예시 4 및 표 5 참조). 주형(template)으로서 S18W 돌연변이(SEQ ID NO: 57)를 이용한 조합 라이브러리들은 총 FALC 역가 및/또는 C12 지방족 알코올 생성물의 더 상당한 증가를 나타낸 7 개의 돌연변이체들을 생성하였다(아래의 표 6B 참조). 7 개의 조합 돌연변이체들은 돌연변이 S18W(SEQ ID NO: 57)를 갖는 AAR; 돌연변이들 M21L, C63G, S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 58)을 갖는 AAR; 돌연변이들 L8A, M21L, C63G, A77A(GCC 내지 GCA 잠재성 코돈 돌연변이), S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 59)을 갖는 AAR; 돌연변이들 D16L, M21L, C63G, S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 60)을 갖는 AAR; 돌연변이들 L8A, D24V, C63G, S113K, Q155L, A281L(SEQ ID NO: 61)을 갖는 AAR; 돌연변이들 D24P, L31M, C63G, S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 62)을 갖는 AAR; 돌연변이들 L8A, D16L, D24V, C63G, S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 63)을 갖는 AAR; 돌연변이들 D24E, C63G, S113K, T154A, A281L(SEQ ID NO: 64)을 갖는 AAR을 포함한다. 특히, SEQ ID NO: 58은 C12 지방족 알코올들의 최고 분율을 나타낸 한편, SEQ ID NO: 59는 조합 돌연변이체들의 최고 역가를 나타내었다(아래의 표 6B 참조).

또한, 본 발명자들은 야생형 MED4_AAR을 넘어서는 개선점들을 나타낸 변이체들을 스크리닝하기 위해 프로클로로코쿠스 마리누스 MED4_AAR로부터 아실-ACP 레덕타아제의 전체 포화 라이브러리(full saturation library)를 만들었다(아래의 예시 7을 참조). AAR 변이체들은 야생형 AAR 효소보다 더 많은 지방족 알코올들의 생성 또는 변경된 사슬 길이 프로파일, 예를 들어 C12, C14 또는 C16 지방족 알코올들의 증가된 분율을 갖는 지방족 알코올들을 생성할 수 있는 능력에 기초하여 선택되었다. 표 8(아래의 예시 7 참조)은 아생형 MED4_AAR을 넘어서는 1.4-배(fold) 내지 2.2 배 범위의 최고 FALC 역가를 생성한 16 개의 AAR 변이체들로부터 대표적인 데이터를 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 변경된 사슬 길이 프로파일을 갖는 AAR 변이체들을 스크리닝하였으며, C16보다 짧은 사슬 길이를 갖는 FALC 종의 증가된 비율이 관심거리이다(of interest). FALC의 양의 2-3-배 증가를 야기하는 2 개의 변이 클론들이 도 10에 나타나 있다. 재조합 숙주 세포에서의 이러한 AAR 변이체들 중 하나, 즉 D61E 돌연변이체(SEQ ID NO: 65)의 발현은 더 짧은 탄소 사슬들 쪽으로 지방족 알코올 종의 사슬 길이 분포를 치우치게 했다(skewed). 모든 변이체들이 증가된 역가를 가짐에 따라 더 높은 양의 지방족 알코올을 야기하였지만, SEQ ID NO: 65만이 C14의 증가된 분율(및 더 높은 역가)을 가졌다. 표 9(아래의 예시 7 참조)는 변경된 사슬 길이를 갖는 생성물들을 생성하지 않은 MED4_AAR의 V346P 변이체 그리고 야생형(WT) MED4_AAR에 비해 MED4_AAR의 D61E 변이체를 발현시키는 재조합 숙주 세포들에 의해 생성된 FALC 사슬 길이 분포를 예시한다.

아실기 운반 단백질(ACP)

대장균(E. coli)과 같은 숙주 세포들에서 지방산 생합성을 제한할 수 있는 인자들에 관하여 문헌들에 상반된 보고가 존재한다. 아실기 운반 단백질(ACP)들은 모든 유기체에서 어느 정도까지 보존되지만, 이들의 일차 서열(primary sequence)이 상이할 수 있다. 지방족 아실-ACP를 생성물로 전환시키기 위해 대장균 이외의 공급원들로부터의 말단 경로 효소들이 대장균에서 발현될 때, 예를 들어 지방족 아실-ACP를 향한 재조합 경로 효소의 인식, 친화성, 및/또는 대사회전(turnover)에 있어서 한계들이 존재할 수 있음이 제안되었다[Suh 외(1999) The Plant Journal 17(6):679-688; Salas 외(2002) Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34 참조]. 한 가지 제안은, 지방산 생합성을 위한 주요 전구체들, 예를 들어 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 한계가 지방산 유도체들의 감소된 합성을 유도할 수 있다는 점이다. 지방산 생합성을 통해 플럭스(flux)를 증가시키는 한가지 접근법은 경로에서 다양한 효소들을 조정하는 것이다(도 1 내지 도 3 참조). 아세틸-CoA 카르복실라아제(acc) 복합체 및 지방산 생합성(fab) 경로를 통한 아세틸-CoA로부터의 아실-ACP의 공급은 지방산 유도체 생성률에 영향을 줄 수 있다(도 2 참조). 예시들(이하 참조)에 자세히 설명된 바와 같이, 예시를 위해 지방족 알코올들의 생성에 관한 ACP의 과발현의 효과가 평가되었다.

ACP를 발현시키도록 조작된 숙주 세포는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물 또는 특정 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 역가의 증가를 나타낼 수 있으며, 이러한 증가는 동일한 조건들 하에서 배양될 때 ACP를 발현시키지 않는 대응하는 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 3 %, 적어도 4 %, 적어도 5 %, 적어도 6 %, 적어도 7 %, 적어도 8 %, 적어도 9 %, 적어도 10 %, 적어도 11 %, 적어도 12 %, 적어도 13 %, 적어도 14 %, 적어도 15 %, 적어도 16 %, 적어도 17 %, 적어도 18 %, 적어도 19 %, 적어도 20 %, 적어도 21 %, 적어도 22 %, 적어도 23 %, 적어도 24 %, 적어도 25 %, 적어도 26 %, 적어도 27 %, 적어도 28 %, 적어도 29 %, 또는 적어도 30 % 더 크다. 일 실시형태에서, 본 발명은 원시(예를 들어, 내인성) 또는 비-원시(예를 들어, 외인성, 이종 등) ACP 단백질을 발현시키기 위해 숙주 세포를 조작함으로써 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 조성물의 개선된 생성에 관한 것이다. ACP 폴리펩티드 또는 ACP 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 비-원시일 수 있으며, 즉 이는 대응하는 야생형 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 야생형 서열과 상이할 수 있다. 예시들은 뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열 또는 이의 발현의 수준의 변형을 포함한다. 본 발명은 ACP 폴리펩티드들 및 이의 동족체들을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 ACP 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, ACP는 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus) 또는 대장균으로부터 유도된다. 다른 실시예에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 ACP 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 SEQ ID NO: 10의 야생형 ACP 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 가지며, 또한 본 명세서에 설명된 바와 같은 유용한 특징들 및/또는 특성들을 유도하는 1 이상의 치환체들을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 ACP 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 100 %의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시예들에서, 개선된 또는 변이 ACP 폴리펩티드 서열은 M. 하이드로카보노클라스티쿠스 또는 대장균 이외의 종으로부터 유도된다. 관련 실시형태에서, 본 발명을 구현하는데 사용하기 위한 ACP 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 9에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 9에 대해 적어도 75 %(예를 들어, 적어도 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 99 %)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 ACP 폴리펩티드에 관한 것이다. 몇몇 실시예들에서, 핵산 서열은 본 명세서에 설명된 바와 같은 개선된 특징들 및/또는 특성들을 유도하는 1 이상의 치환체들을 갖는 ACP 변이체를 인코딩한다. 다른 실시예들에서, 개선된 또는 변이 ACP 핵산 서열은 마리노박터 종 또는 대장균 이외의 종으로부터 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 9에 대응하는 핵산의 실질적인 전체 길이에 걸쳐 엄격한 조건들 하에서 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 ACP 폴리펩티드들에 관한 것이다.

변이체 및 돌연변이체

몇몇 실시예들에서, AAR 또는 ACP 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드들 중 어느 하나의 돌연변이체 또는 변이체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 변이 또는 돌연변이 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산에 의해 야생형 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이체는 다음의 보존적 아미노산 치환체들: 지방족 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신의 또 다른 지방족 아미노산으로의 대체; 세린의 트레오닌으로의 대체; 트레오닌의 세린으로의 대체; 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 대체; 아미드기를 지닌 잔기, 예컨대 아스파라긴 및 글루타민의 또 다른 아미드기를 지닌 잔기로의 대체; 염기성 잔기, 예컨대 리신 및 아르기닌의 또 다른 염기성 잔기로의 교체; 및 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌 및 티로신의 또 다른 방향족 잔기로의 대체 중 1 이상을 포함할 수 있다(단, 이로 제한되지 않음). 몇몇 실시예들에서, 변이 또는 돌연변이 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 아미노산 치환, 추가, 삽입 또는 결실을 갖는다. 변이체 또는 돌연변이체로서 기능하는 폴리펩티드의 몇몇 바람직한 분절은 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능(예를 들어, 효소 활성)의 일부 또는 전부를 보유한다. 몇몇 실시예들에서, 분절은 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능의 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 또는 적어도 98 % 이상을 보유한다. 다른 실시예들에서, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능의 약 100 %를 보유한다. 어떤 아미노산 잔기들이 생물학적 활성에 영향을 주지 않고 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 가이던스(guidance)는 해당 기술분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램들, 예를 들어 LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)를 이용하여 찾을 수 있다. 다른 실시예들에서, 분절은 대응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 증가된 생물학적 기능을 나타낸다. 예를 들어, 분절은 대응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 효소 활성에 있어서 적어도 10 %, 적어도 25 %, 적어도 50 %, 적어도 75 %, 또는 적어도 90 %의 개선을 나타낼 수 있다. 다른 실시예들에서, 분절은 대응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 효소 활성에 있어서 적어도 100 % 또는 적어도 200 % 또는 적어도 500 %의 개선을 나타낸다.

본 명세서에 설명된 폴리펩티드들은 추가적인 보존적 또는 비-필수 아미노산 치환체들을 가질 수 있으며, 이는 폴리펩티드 기능에 실질적인 영향을 주지 않는다는 것을 이해한다. 특정 치환이 용인되는지(즉, 아실-ACP 레덕타아제 활성과 같은 요구되는 생물학적 기능에 부정적인 영향을 주지 않는지)의 여부가 해당 기술분야에서 설명되는 바와 같이 결정될 수 있다[Bowie 외(1990) Science 247:1306-1310 참조]. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬(side chain)을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 곁사슬들을 갖는 아미노산 잔기들의 계열(family)들이 해당 기술분야에 정의되어 있다. 이 계열들은 염기성 곁사슬(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 곁사슬(uncharged polar side chain)(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 곁사슬(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 곁사슬(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 곁사슬(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산들을 포함한다.

변이체들은 자연적으로 발생하거나 시험관 내에서(in vitro) 생성될 수 있다. 특히, 이러한 변이체들은 위치 지정 돌연변이, 무작위 화학적 돌연변이유발(random chemical mutagenesis), 엑소뉴클레아제 Ⅲ 결실 절차, 또는 표준 클로닝 기술들과 같은 유전자 조작 기술들을 이용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 변이체, 돌연변이체, 분절, 유사체, 또는 유도체는 화학 합성 또는 변형 절차들을 이용하여 생성될 수 있다. 변이체를 만드는 방법들이 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 변이체들은 무작위 및 위치 지정 돌연변이를 이용함으로써 제조될 수 있다. 무작위 및 위치 지정 돌연변이는 일반적으로 당업계에 알려져 있다[예를 들어, Arnold(1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455 참조]. 무작위 돌연변이유발은 오류 유발 PCR[예를 들어, Leung 외(1989) Technique 1:11-15; 및 Caldwell 외(1992) PCR Methods Applic. 2:28-33 참조]을 이용하여 달성될 수 있다. 오류 유발 PCR에서, 실제 PCR은 DNA 폴리메라아제의 복사 정확도(copying fidelity)가 낮은 조건들 하에서 수행되어, PCR 생성물의 전체 길이를 따라 높은 점 돌연변이율(high rate of point mutations)이 얻어지도록 한다. 간명하게, 이러한 절차들에서, 돌연변이유발될 핵산(AAR 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)은 PCR 생성물의 전체 길이를 따라 높은 점 돌연변이율을 달성하기 위하여 PCR 프라이머, 반응 완충제, MgCl₂, MnCl₂, Taq 폴리메라아제, 및 적절한 농도의 dNTP와 혼합된다. 예를 들어, 이러한 반응은 돌연변이유발될 20 fmole의 핵산, 30 pmole의 각 PCR 프라이머, 50 mMKCl, 10 mM Tris HCl(pH 8.3) 및 0.01 % 젤라틴을 포함하는 반응 완충제, 7 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 5 단위(unit)의 Taq 폴리메라아제, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 그리고 1 mM dTTP를 이용하여 수행될 수 있다. PCR은 94 ℃에서 1 분, 45 ℃에서 1 분, 그리고 72 ℃에서 1 분의 30 회 주기 동안 수행될 수 있다. 하지만, 이러한 파라미터들은 적절하게 변동될 수 있음을 이해할 것이다. 이후, 돌연변이유발된 핵산은 적절한 벡터 내로 클로닝되며, 돌연변이유발된 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드들의 활성이 평가된다. 위치 지정 돌연변이가 관심 있는 여하한의 클로닝된 DNA의 부위-특이적 돌연변이를 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 이용하여 달성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발은 당업계에 기술되어 있다[예를 들어, Reidhaar-Olson 외(1988) Science 241:53-57 참조]. 간명하게, 이러한 절차들에서, 클로닝된 DNA 내로 도입될 1 이상의 돌연변이를 지닌 복수의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 돌연변이유발될 클로닝된 DNA(예를 들어, AAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열) 내로 삽입된다. 돌연변이유발된 DNA를 함유한 클론들이 회수되고, 이들이 인코딩한 폴리펩티드의 활성이 평가된다.

변이체를 생성하는 또 다른 방법은 조립 PCR이다. 조립 PCR은 작은 DNA 분절들의 혼합으로부터 PCR 생성물의 조립을 수반한다. 다수의 상이한 PCR 반응이 동일한 바이알(vial)에서 병행하여 일어나며, 일 반응의 생성물이 또 다른 반응의 생성물을 프라이밍한다(priming)(미국 특허 5,965,408 참조). 변이체를 생성하는 또 다른 방법은 유성(sexual) PCR 돌연변이유발이다. 유성 PCR 돌연변이유발에서는, 강제된(forced) 상동성 재조합이 서열 상동성에 기초한 DNA 분자의 무작위 분절화(random fragmentation)의 결과로서 시험관 내에서 상이하지만 고도로 관련된 DNA 서열의 DNA 분자들 사이에 일어난다. 이후, PCR 반응의 프라이머 신장법에 의한 크로스오버(crossover)의 고정이 후속된다. 유성 PCR 돌연변이유발은 당업계에 알려진 출간물에 기술되어 있다[예를 들어, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91:10747-10751]. 또한, 변이체들은 생체 내 돌연변이유발(in vivo mutagenesis)에 의해 생성될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 핵산 서열에서의 무작위 돌연변이는 DNA 복원 경로(repair pathway) 중 1 이상에서 돌연변이를 갖는(carries) 박테리아 균주, 예컨대 대장균 균주에서의 서열을 증식시킴으로써 생성된다. 이러한 돌연변이유발 유전자 균주(mutator strain)는 야생형 균주보다 높은 무작위 돌연변이율을 갖는다. 이러한 균주들 중 하나에서의 DNA 서열(예를 들어, AAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)의 증식이 결국 DNA 내에서 무작위 돌연변이를 생성할 것이다. 생체 내 돌연변이유발에 사용하기 적절한 돌연변이유발 유전자 균주는 해당 기술분야의 공보(예를 들어, 국제 특허 출원 공개공보 WO 1991/016427)에 기술되어 있다. 또한, 변이체들은 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis)을 이용하여 생성될 수 있다. 카세트 돌연변이유발에서는, 이중 가닥 DNA 분자의 작은 영역이 원시 서열과 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 카세트로 대체된다. 올리고뉴클레오티드는 흔히 완전히 및/또는 부분적으로 무작위화된 원시 서열을 포함한다. 또한, 반복 앙상블 돌연변이유발(Recursive ensemble mutagenesis)이 변이체들을 생성하는데 사용될 수 있다. 반복 앙상블 돌연변이유발은 표현형 관련 돌연변이체들(phenotypically related mutants)(이의 멤버들은 아미노산 서열에 있어서 상이함)의 다양한 개체군들을 생성하기 위해 개발된 단백질 조작(즉, 단백질 돌연변이유발)을 위한 알고리즘이다. 이 방법은 조합 카세트 돌연변이유발의 연속 라운드(successive rounds)를 제어하기 위해 피드백 메커니즘을 이용한다[예를 들어, Arkin 외(1992) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:7811-7815 참조]. 몇몇 실시예들에서, 변이체들은 지수 앙상블 돌연변이유발(exponential ensemble mutagenesis)을 이용하여 생성된다. 지수 앙상블 돌연변이유발은 높은 비율의 독특한 기능성 돌연변이체를 갖는 조합 라이브러리를 생성하는 프로세스이며, 잔기들의 작은 그룹들이 기능성 단백질들을 야기하는 아미노산을 각각의 변경된 위치에서 식별하기 위해 병행하여 무작위화된다[예를 들어, Delegrave 외(1993) Biotech. Res. 11:1548-1552 참조]. 몇몇 실시예들에서, 변이체들은 별개의 폴리펩티드들을 인코딩하는 복수의 핵산들의 부분들이 함께 융합되어 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 핵산 서열들을 생성하도록 셔플링 절차(shuffling procedure)들을 이용하여 생성된다(예를 들어, 미국 특허 5,965,408 및 5,939,250에 개시됨).

지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생성

원시 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알데히드 생합성 활성을 갖는 효소(또한, 본 명세서에서 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 효소라고도 함)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 지방족 알데히드 생합성 효소가 숙주 세포에서 발현되거나 과발현될 때 지방족 알데히드가 생성된다. 재조합 숙주 세포에서의 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드의 발현 또는 과발현은 재조합 숙주 세포에 의한 지방족 알데히드의 생성을 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드를 생성한다. 몇몇 실시예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드가 지방족 알코올로 전환된다. 몇몇 실시예들에서, 알데히드 레덕타아제와 같은 원시(내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드들이 숙주 세포(예를 들어, 대장균) 내에 존재하며, 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환하기에 효과적이다. 다른 실시예들에서, 원시(내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드가 과발현된다. 다른 실시예들에서, 외인성 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드가 재조합 숙주 세포로 도입되며, 발현되거나 과발현된다. 지방족 알데히드는 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 활성을 갖는 폴리펩티드와 같은 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포에서 발현시키거나 과발현시킴으로써 생성된다. 재조합 숙주 세포에서의 AAR의 발현은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생성을 유도한다(도 4). 예시적인 AAR 폴리펩티드들은 본 명세서에 그리고 PCT 공개공보 WO2009/140695 및 WO2009/140696에 개시되어 있으며, 이는 둘 다 본 명세서에서 인용 참조된다.

지방족 알데히드를 포함하는 조성물(지방족 알데히드 조성물)이 지방족 알데히드 생합성 효소, 예를 들어 AAR을 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시에 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 지방족 알데히드를 생성하도록 조작된 재조합 숙주 세포는 통상적으로 지방족 알데히드의 일부를 지방족 알코올로 전환시킬 것이다. 몇몇 실시예들에서, 지방족 알데히드 조성물은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올을 포함한다. 통상적으로, 지방족 알데히드 조성물은 재조합 숙주 세포들의 세포외 환경, 즉 세포 배양 배지로부터 회수된다. 몇몇 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 지방족 알코올 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드(효소)(또한, 본 명세서에서 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드 또는 지방족 알코올 생합성 효소라고도 함)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 지방족 알코올이 재조합 숙주 세포에 의해 생성된다. 지방족 알코올을 포함하는 조성물(즉, 지방족 알코올 조성물)이 지방족 알코올 생합성 효소를 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시에 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균)에 존재하는 원시(예를 들어, 내인성) 알데히드 레덕타아제는 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시킬 것이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포에 존재하는 알데히드 레덕타아제와 같은 원시(예를 들어, 내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시키기에 충분하다. 하지만, 다른 실시예들에서 지방족 알코올은 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시키는 지방족 알코올 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포에서 발현시키거나 과발현시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 알코올 디하이드로제나아제(또한, 본 명세서에서 알데히드 레덕타아제라고도 함, 예를 들어 EC 1.1.1.1)가 본 발명을 구현하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 알코올 디하이드로제나아제라는 용어는 지방족 알데히드의 지방족 알코올로의 전환을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업자라면, 특정 알코올 디하이드로제나아제들이 다른 반응들도 촉진시킬 수 있고, 이러한 비-특이적 알코올 디하이드로제나아제들도 알코올 디하이드로제나아제라는 용어에 포괄된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에 따라 유용한 알코올 디하이드로제나아제 폴리펩티드의 예시들은 아시네토박터 종 M-1(SEQ ID NO: 52)의 AlrA 또는 AlrAadp1(SEQ ID NO: 53)과 같은 AlrA 동족체들, YjgB(AAC77226)(SEQ ID NO: 5), DkgA(NP_417485), DkgB(NP_414743), YdjL(AAC74846), YdjJ(NP_416288), AdhP(NP_415995), YhdH(NP_417719), YahK(NP_414859), YphC(AAC75598), YqhD(446856) 및 YbbO[AAC73595.1]와 같은 내인성 대장균 알코올 디하이드로제나아제들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 추가적인 예시들이 국제 특허 출원 공개공보 WO 2007/136762, WO 2008/119082 및 WO 2010/062480에 개시되어 있으며, 이 각각은 본 명세서에서 인용 참조된다. 특정 실시예들에서, 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드는 알데히드 레덕타아제 또는 알코올 디하이드로제나아제 활성(EC 1.1.1.1)을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 원시(예를 들어, 내인성) 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드가 과발현되며, 다른 실시예들에서는 외인성 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드가 재조합 숙주 세포로 도입되고 발현 또는 과발현된다.

지방족 알코올은 지방족 아실-ACP 및 지방족 아실-CoA 중간체들을 이용하는 아실-CoA 의존적 경로, 및 지방족 아실-ACP 중간체들을 이용하지만 지방족 아실-CoA 중간체는 이용하지 않는 아실-CoA 독립적 경로를 통해 생성될 수 있다. 특정 실시예들에서, 과발현된 유전자에 의해 인코딩되는 효소는 지방산 신타아제, 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방족 아실-CoA 신타아제 및 아세틸-CoA 카르복실라아제로부터 선택된다. 또한, 지방족 알코올은 다양한 아실-ACP 또는 아실-CoA 분자들을 대응하는 일차 알코올들로 환원시킬 수 있는 효소들에 의해 자연적으로 만들어진다(본 명세서에서 명시적으로 인용 참조되는 미국 특허 공개 20100105963 및 20110206630; 및 미국 특허 8,097,439 참조). 지방족 알코올 조성물은 흔히 다른 지방산 유도체들, 예를 들어 지방족 알데히드 및/또는 지방산과 함께 지방족 알코올을 포함한다. 통상적으로, 지방족 알코올 조성물은 재조합 숙주 세포의 세포외 환경, 즉 세포 배양 배지로부터 회수된다. 몇몇 실시예들에서, 지방산 생합성과 직접적 또는 간접적으로 관련된 폴리펩티드, 예를 들어 효소의 발현이 조절(예를 들어, 발현, 과발현 또는 감쇠)되며, 이러한 조절은 지방족 알코올과 같은 관심 지방산 유도체의 더 높은 수율, 더 높은 역가 또는 더 높은 생산성을 유도한다. 효소는, 외인성 또는 이종인 지방산 생합성 폴리뉴클레오티드[예를 들어, 모 숙주 세포 이외의 유기체로부터 발생하는 폴리펩티드, 또는 모 미생물 세포에 고유한(native) 폴리펩티드의 변이체] 또는 내인성 폴리펩티드(예를 들어, 모 숙주 세포에 고유한 폴리펩티드)에 의해 인코딩될 수 있으며, 내인성 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포에서 과발현된다. 표 1은 특정 지방족 알코올 조성물의 생성을 용이하게 하도록 재조합 숙주 세포들에서 발현될 수 있는 예시적인 단백질들의 목록을 제공한다.

표 1: 유전자 명칭(Gene Designations)

재조합 숙주 세포 및 세포 배양물

재조합 숙주 세포에 의해 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 생성을 증가시키기 위한 전략들은 생성 숙주 내의 상이한 유기체들로부터의 외인성 지방족 알데히드 및 지방족 알코올 생합성 유전자들의 발현 및 원시 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 생합성 유전자들의 과발현에 의한 지방산 생합성 경로를 통한 증가된 플럭스를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 숙주 세포 또는 조작된 숙주 세포라는 용어는 유전적 구성(genetic makeup)이, 예를 들어 새로운 유전적 요소들의 의도적인 도입 및/또는 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 유전적 요소들의 의도적인 변형에 의해 대응하는 야생형 숙주 세포에 대해 변경된 숙주 세포를 지칭한다. 또한, 이러한 재조합 숙주 세포의 자손은 이러한 새로운 및/또는 변형된 유전적 요소들을 함유한다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시형태들 중 어느 것에서, 숙주 세포는 식물 세포, 곤충 세포, 균류 세포[예를 들어, 칸디다 종(Candida sp.)과 같은 사상균류, 사카로미세스 종(Saccharomyces sp.)과 같은 출아 효모], 조류 세포(algal cell) 및 박테리아 세포로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는 재조합 미생물이다. 미생물인 숙주 세포의 예시들은 에스체리치아(Escherichia) 속, 바실루스(Bacillus) 속, 락토바실루스(Lactobacillus) 속, 자이모모나스(Zymomonas) 속, 로도코쿠스(Rhodococcus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 트리코데르마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 후미콜라(Humicola) 속, 리조무코르(Rhizomucor) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 무코르(Mucor) 속, 미셀리오프토라(Myceliophtora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 파네로카에테(Phanerochaete) 속, 느타리(Pleurotus) 속, 트라메테스(Trametes) 속, 크리소스포리움(Chrysosporium) 속, 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas) 속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 또는 스트렙토미세스(Streptomyces) 속으로부터의 세포들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-음성(Gram-negative) 박테리아 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus lichenoformis) 세포, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실루스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실루스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실루스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 또는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 트리코데르마 코닌지(Trichoderma koningii) 세포, 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코데르마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코데르마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 로도코쿠스오파쿠스(Rhodococcusopacus) 세포, 리조무코르미에헤이(Rhizomucormiehei) 세포, 또는 무코르미에헤이(Mucormichei) 세포이다. 또 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포 또는 스트렙토미세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포이다. 또 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 방선균(Actinomycetes) 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다.

다른 실시예들에서, 숙주 세포는 진핵 식물(eukaryotic plant) 세포, 조류 세포, 남세균(cyanobacterium) 세포, 녹색-황 세균 세포, 녹색 비-황 세균(green non-sulfur bacterium) 세포, 자색 황세균 세포, 자색 비-황 세균 세포, 극한 생물(extremophile) 세포, 효모 세포, 균류 세포, 본 명세서에 설명된 종 중 어느 것의 조작된 세포, 또는 합성 유기체이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 광 의존적이거나 탄소를 고정시킨다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 존재 하에서와 같이, 광독립영양적 활성(photoautotrophic activity)을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 부재 하에서 종속영양적 또는 혼합영양적이다. 특정 실시예들에서, 숙주 세포는 애기장대, 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 미스칸투스 기간테우스(Miscanthus giganteus), 제아 메이스(Zea mays), 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcuse braunii), 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii), 두나리엘라 살리나(Dunaliela salina), 시네코코쿠스 종 PCC 7002, 시네코코쿠스 종 PCC 7942, 시네코시스티스 종(Synechocystis Sp.) PCC 6803, 서모시네코코쿠스 엘롱가투스(Thermosynechococcus elongates) BP-1, 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum), 클로로프렉수스 아우란티쿠스(Chlorojlexus auranticus), 크로마티움 비노숨(Chromatiumm vinosum), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도박터 캡술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 서모셀룸(Clostridium thermocellum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 피치아파스토리스(Pichiapastoris), 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 세포이다.

숙주 세포의 조작

몇몇 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드(또는 유전자) 서열이 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 숙주 세포에 제공된다. 특정 실시예들에서, 프로모터는 발달-조절된, 세포소기관-특이적, 조직-특이적, 유도성, 구성적, 또는 세포-특이적 프로모터이다. 몇몇 실시예들에서, 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 숙주 세포 내에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적절한 형태인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업자라면, 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 요인들에 의존할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 앞서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열들에 의해 인코딩되는, 융합 폴리펩티드들을 포함하는 폴리펩티드들을 생성하도록 숙주 세포들에 도입될 수 있다(위 참조). 원핵생물, 예를 들어 대장균에서 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 또는 비-융합 폴리펩티드들의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터들은 그 안에 인코딩된 폴리펩티드에, 일반적으로는 재조합 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단에 다수의 아미노산들을 첨가한다. 이러한 융합 벡터들은 통상적으로 다음의 세 가지 목적, 즉 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것 중 1 이상을 수행한다. 흔히, 융합 발현 벡터에서, 융합 모이어티와 재조합 폴리펩티드의 접합점에 단백질분해 절단 부위가 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소들 및 이들의 동족 인식 서열(cognate recognition sequence)들의 예시들은 Xa 인자(Factor Xa), 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 pGEX 벡터[Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith 외(1988) Gene 67:31-40], pMAL 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA), 및 pRITS 벡터(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.)를 포함하고, 이들은 표적 재조합 폴리펩티드에 각각 글루타티온 S-트랜스페라아제(GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합시킨다.

유도성, 비-융합 대장균 발현 벡터의 예시들은 pTrc 벡터[Amann 외(1988) Gene 69:301-315] 및 pET 11d 벡터[Studier 외, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990) 60-89]를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리메라아제 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공동발현되는 바이러스 RNA 폴리메라아제(T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스 폴리메라아제는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에서 T7 gn1 유전자를 보유하는 내재성 λ 프로파지(resident λ prophage)로부터 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)와 같은 숙주 균주들에 의해 공급된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적절한 발현계들이 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다[예를 들어, Sambrook 외(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory 참조]. 유도성, 비-융합 대장균 발현 벡터의 예시들은 pTrc 벡터[Amann 외(1988) Gene 69:301-315] 및 PET 11d 벡터[Studier 외(1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89]를 포함한다. 특정 실시예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지 T5로부터 유도된 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 실시예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 이 실시예에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 벡터들은 외래성(foreign) 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 본 기술분야에서 인정되는 다양한 기술들을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염(transfecting)시키는 적절한 방법들은, 예를 들어 Sambrook 외에서 찾아볼 수 있다(위 참조). 박테리아 세포들의 안정적인 형질전환을 위하여, (사용되는 발현 벡터 및 형질전환 기술에 따라) 세포들의 특정 부분이 발현 벡터를 흡수하고 복제하는 것으로 알려져 있다. 이 형질전환체들을 식별하고 선택하기 위하여, 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 인코딩하는 유전자가 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 선택가능한 마커들은 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린과 같은(단, 이로 제한되지 않음) 약물들에 대한 내성을 제공하는 것들을 포함한다. 선택가능한 마커를 인코딩하는 핵산들은 본 명세서에서 설명되는 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터와 동일한 벡터에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 별개의 벡터에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질전환된 세포들은 적절한 선택 약물의 존재 하에서 성장에 의해 식별될 수 있다. 본 명세서에서(위 참조) 설명된 바와 같은 조작된 또는 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체 조성물을 생성하는데 사용되는 세포이다. 본 명세서에서 설명된 본 발명의 실시형태들 중 어느 것에서, 숙주 세포는 진핵 식물, 박테리아, 조류, 남세균, 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균, 자색 황 세균, 자색 비-황 세균, 극한 생물, 효모, 균류, 이들의 조작된 유기체, 또는 합성 유기체로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 광 의존적이거나 탄소를 고정시킨다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 다양한 숙주 세포들이 본 명세서에 설명된 바와 같은 지방산 유도체들을 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 숙주 세포 또는 미생물은, 효소 활성들에 대한 특정 돌연변이의 효율성을 테스트하기 위해 변경들을 포함하도록 유전적으로 조작되거나 변형된 숙주 균주 또는 숙주 세포(즉, 재조합 세포 또는 미생물)를 포함한다. 다양한 선택적인 유전적 조정 및 변경이, 어떠한 원시 효소 경로들이 원래 숙주 세포에 존재하는지에 따라 한 숙주 세포로부터 다른 세포로 교환가능하게 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 숙주 균주는 다른 생합성 폴리펩티드(예를 들어, 효소)와 조합하여 AAP 폴리펩티드의 발현을 테스트하는데 사용될 수 있다. 숙주 균주는, 발효 성분들, 탄소원(예를 들어, 공급원료), 온도, 압력, 감소된 배양 오염 상태들, 및 산소 수준들을 포함한 배양 조건들을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 특정 변수들을 테스트하기 위해 다수의 유전적 변경들을 포함한다.

일 실시예에서, 숙주 균주는 선택적인 fadE 및 fhuA 결실을 포함한다. 아실-CoA 디하이드로제나아제(FadE)는 지방산을 대사시키는데 중요한 효소이다. 이는 지방산 이용(베타-산화)에서 두번째 단계를 촉진시키며, 이는 지방산(아실-CoA)의 긴 사슬들을 아세틸-CoA 분자로 쪼개는 프로세스이다. 더 구체적으로, 박테리아의 지방산 분해의 β-산화 사이클의 두번째 단계는 아실-CoA의 2-엔오일-CoA로의 산화이며, 이는 FadE에 의해 촉진된다. 대장균에 FadE가 없는 경우, 이는 탄소원으로서 지방산에서 성장할 수 없지만, 아세테이트에서 성장할 수 있다. 여하한의 사슬 길이의 지방산 이용의 불능(inability)은 fadE 균주들, 즉 FadE 기능이 파괴되는 fadE 돌연변이 균주들의 보고된 표현형과 일치한다. fadE 유전자는 선택적으로 녹아웃(knock out)되거나 감쇠되어, 지방산 유도체 경로에서 중간체일 수 있는 아실-CoA가 모두 지방산 유도체로 효율적으로 전환될 수 있도록 세포에 누적될 것을 보장할 수 있다. 하지만, fadE 감쇠는 탄소원으로서 당(sugar)이 사용될 때 선택적인데, 이는 이러한 조건 하에서 FadE의 발현이 억제될 가능성이 있고, 이에 따라 FadE가 소량만 존재할 수 있으며 아실-CoA 기질에 대해 에스테르 신타아제 또는 다른 효소들과 효율적으로 경쟁할 수 없기 때문이다. FadE는 분해대사물 억제(catabolite repression)로 인해 억제된다. 대장균 및 많은 다른 미생물들은 지방산보다 당의 소모를 선호하므로, 두 공급원들이 이용가능한 경우 fad 레귤론을 억제함으로써 당이 우선 소모된다[D. Clark, J Bacteriol.(1981) 148(2):521-6 참조]. 또한, 당의 부재 및 지방산의 존재는 FadE 발현을 포함한다. (FadE를 포함한) fad 레귤론에 의해 발현되는 단백질들이 상향-조절되고 아실-CoA에 대해 효율적으로 경쟁할 것이므로, 아실-CoA 중간체들이 베타 산화 경로에 대해 손실될 수 있다. 따라서, 녹아웃 또는 감쇠되는 fadE 유전자를 갖는 것이 유리할 수 있다. 대부분의 탄소원들이 주로 당 기반이기 때문에, FadE를 감쇠시키는 것은 선택적이다. 유전자 fhuA는 TonA 단백질을 코딩하며, 이는 대장균의 외막에서의 에너지-관련 운반체(energy-coupled transporter) 및 수용체이다[V. Braun(2009) J Bacteriol. 191(11):3431-3436 참조]. 이것의 결실은 선택적이다. fhuA 결실은 세포로 하여금 특정 발효 조건들에 유리할 수 있는 파지 공격(phage attack)에 대해 더 내성이 되게 한다. 따라서, 발효 진행 시 잠재적 오염의 가능성이 있는 숙주 세포에서 fhuA를 결실시키는 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 숙주 세포(위 참조)는 fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV, 및/또는 fabF를 포함하는 유전자들 중 1 이상의 선택적인 과발현을 포함한다. 이러한 유전자들의 예시들은 대장균으로부터의 fadR, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)으로부터의 fabA(NP_460041), 쥐티푸스균으로부터의 fabD(NP_460164), 쥐티푸스균으로부터의 fabG(NP_460165), 쥐티푸스균으로부터의 fabH(NP_460163), 콜레라균(Vibrio cholera)으로부터의 fabV(YP_001217283), 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 fabF(NP_350156)이다. 지방산 생합성에서 효소들 및 조절제를 코딩하는 이러한 유전자들 중 1 이상의 과발현은 다양한 배양 조건들 하에서 지방족 알데히드 및 지방족 알코올을 포함하는 지방산 유도체 화합물들의 역가를 증가시키는 역할을 할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드 및/또는 지방산 알코올과 같은 지방산 유도체들의 생성을 위해 숙주 세포로서 대장균 균주가 사용된다. 이와 유사하게, 이러한 숙주 세포들은 fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV, 및/또는 fabF를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 다양한 배양 조건들 하에서 지방산 유도체(예를 들어, 지방족 알코올, 지방족 알데히드 등)와 같은 지방산 유도체 화합물의 역가를 더 증가시키거나 증대시킬 수 있는 1 이상의 생합성 유전자들(즉, 지방산 생합성의 효소들 및 조절제들을 코딩하는 유전자들)의 선택적인 과발현을 제공한다. 유전적 변경의 예시들은 대장균으로부터의 fadR, 쥐티푸스균으로부터의 fabA(NP_460041), 쥐티푸스균으로부터의 fabD(NP_460164), 쥐티푸스균으로부터의 fabG(NP_460165), 쥐티푸스균으로부터의 fabH(NP_460163), 콜레라균으로부터의 fabV(YP_001217283), 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 fabF(NP_350156)를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 이러한 생합성 유전자들을 운반하는 합성 오페론들이, 다양한 배양 조건들 하에서 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 과발현을 테스트하고, 및/또는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올 생성을 더 증대시키기 위해 세포 내에서 조작되고 발현될 수 있다. 이러한 합성 오페론들은 1 이상의 생합성 유전자를 함유한다. ifab138 오페론은, 예를 들어 특정한 배양 조건들을 테스트하기 위해 지방산 유도체들의 과발현을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 콜레라균으로부터의 fabV, 쥐티푸스균으로부터의 fabH, 쥐티푸스균으로부터의 fabD, 쥐티푸스균으로부터의 fabG, 쥐티푸스균으로부터의 fabA, 및/또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 fabF를 포함한 선택적인 지방산 생합성 유전자들을 함유하는 조작된 오페론이다. 이러한 합성 오페론들의 한가지 장점은, 지방산 유도체 생성률이 더 증가되거나 증대될 수 있다는 것이다.

몇몇 실시예들에서, ACP 및 생합성 효소들(예를 들어, TE, ES, CAR, AAR, ADC 등)을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포 또는 미생물은, 지방족 알코올, 지방족 알데히드, 지방족 에스테르, 지방족 아민, 이작용기 지방산 유도체, 디애시드(diacid) 등과 같은 1 이상의 특정 지방산 유도체(들)에 대한 생성을 증가시킬 수 있는 특정 효소 활성들을 포괄하는 유전자들을 더 발현시킬 것이다. 일 실시예에서, 숙주 세포는 유전자를 과발현시킴으로써 증가될 수 있는 지방산의 생성을 위해 티오에스테라아제 활성(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5)을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 에스테르의 생성을 위해 에스테르 신타아제 활성(E.C. 2.3.1.75)을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-ACP 레덕타아제(AAR)(E.C, 1.2.1.80) 활성 및/또는 알코올 디하이드로제나아제 활성(E.C. 1.1.1.1) 및/또는 지방족 알코올 아실-CoA 레덕타아제(FAR)(E.C. 1.1.1.*) 활성 및/또는 카르복실산 레덕타아제(CAR)(E.C. 1.2.99.6) 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 알데히드의 생성을 위해 아실-ACP 레덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 알칸 및 알켄의 생성을 위해 아실-ACP 레덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성 및 탈카르보닐라아제(ADC) 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-CoA 레덕타아제(E.C. 1.2.1.50) 활성, 아실-CoA 신타아제(FadD)(E.C. 2.3.1.86) 활성, 및 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 에스테르의 생성을 위해 에스테르 신타아제 활성(E.C. 2.3.1.75), 아실-CoA 신타아제(FadD)(E.C. 2.3.1.86) 활성, 및 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 케톤의 생성을 위해 OleA 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 내부 올레핀의 생성을 위해 OleBCD 활성을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-ACP 레덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성 및 알코올 디하이드로제나아제 활성(E.C. 1.1.1.1)을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 숙주 세포는 말단 올레핀을 만들기 위해 티오에스테라제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성 및 탈카르복실라아제 활성을 갖는다. 미생물 및 미생물 세포에서의 효소 활성들의 발현은 미국 특허 8,097,439; 8,110,093; 8,110,670; 8,183,028; 8,268,559; 8,283,143; 8,232,924; 8,372,610; 및 8,530,221에 개시되어 있으며며, 이들은 본 명세서에서 인용 참조된다. 다른 실시예들에서, ACP 및 다른 생합성 효소들을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포 또는 미생물은 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올과 같은 1 이상의 특정 지방산 유도체(들)를 생성하기 위해 상향조절되거나 과발현되는 특정 원시 효소 활성들을 포함할 것이다. 일 실시예에서, 숙주 세포는 티오에스테라아제 유전자를 과발현시킴으로써 증가될 수 있는 지방산의 생성을 위해 원시 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다.

본 발명은 AAR 및 다른 생합성 효소들을 코딩하는 유전자들을 발현시키는 숙주 균주 또는 미생물을 포함한다(위 참조). 재조합 숙주 세포들은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체들 및 이들의 조성물들 및 블렌드(blend)들을 생성한다. 지방산 유도체들은 통상적으로 배양 배지로부터 회수되고, 및/또는 숙주 세포로부터 격리된다. 일 실시예에서, 지방족 알데히드 및 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체들은 배양 배지(세포외)로부터 회수된다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드 및 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체들은 숙주 세포(세포내)로부터 격리된다. 또 다른 실시예에서, 지방족 알데히드 및 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체들은 배양 배지로부터 회수되고, 숙주 세포로부터 격리된다. 숙주 세포에 의해 생성되는 지방산 유도체 조성물은, 지방족 알데히드 및 지방족 알코올 조성물들과 같은 지방산 유도체 조성물의 성분들의 포화도 및 사슬 길이뿐만 아니라 특정 지방산 유도체들의 분포를 결정하기 위해 당업계에 알려진 방법들, 예를 들어 GC-FID를 이용하여 분석될 수 있다.

미생물(예를 들어, 미생물 세포)로서 기능하는 숙주 세포의 예시들은 에스체리치아 속, 바실루스 속, 락토바실루스 속, 자이모모나스 속, 로도코쿠스 속, 슈도모나스 속, 아스페르길루스 속, 트리코데르마 속, 뉴로스포라 속, 푸사리움 속, 후미콜라 속, 리조무코르 속, 클루이베로미세스 속, 피치아 속, 무코르 속, 미셀리오프토라 속, 페니실리움 속, 파네로카에테 속, 느타리 속, 트라메테스 속, 크리소스포리움 속, 사카로미세스 속, 스테노트로파모나스 속, 스키조사카로미세스 속, 야로위아 속, 또는 스트렙토미세스 속으로부터의 세포들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-양성 박테리아 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 대장균 B 세포, 대장균 C 세포, 대장균 K 세포, 또는 대장균 W 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 바실루스 렌투스 세포, 바실루스 브레비스 세포, 바실루스 스테아로서모필루스 세포, 바실루스 리케니포르미스 세포, 바실루스 알칼로필루스 세포, 바실루스 코아굴란스 세포, 바실루스 키르쿨란스 세포, 바실루스 푸밀리스 세포, 바실루스 투린지엔시스 세포, 바실루스 클라우시 세포, 바실루스 메가테리움 세포, 바실루스 서브틸리스 세포, 또는 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 트리코데르마 코닌지 세포, 트리코데르마 비리데 세포, 트리코데르마 르에세이 세포, 트리코데르마 롱기브라키아텀 세포, 아스페르길루스 아와모리 세포, 아스페르길루스 푸미가테스 세포, 아스페르길루스 포에티두스 세포, 아스페르길루스 니둘란스 세포, 아스페르길루스 니게르 세포, 아스페르길루스 오리재 세포, 후미콜라 인솔렌스 세포, 후미콜라 라누기노세 세포, 로도코쿠스 오파쿠스 세포, 리조무코르 미에헤이 세포, 또는 무코르 미에헤이 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 스트렙토미세스 리비단스 세포 또는 스트렙토미세스 무리누스 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 방선균 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 맥주효모균 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 진핵 식물, 조류, 남세균, 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균, 자색 황 세균, 자색 비-황 세균, 극한 생물, 효모, 균류, 이들의 조작된 유기체, 또는 합성 유기체로부터의 세포이다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 광 의존적이거나 탄소를 고정시킨다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 존재 하에서와 같이, 광독립영양적 활성을 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 부재 하에서 종속영양적 또는 혼합영양적이다. 특정 실시예들에서, 숙주 세포는 애기장대, 파니쿰 비르가툼, 미스칸투스 기간테우스, 제아 메이스, 보트리오코쿠스 브라우니, 녹조류, 두나리엘라 살리나, 시네코코쿠스 종 PCC 7002, 시네코코쿠스 종 PCC 7942, 시네코시스티스 종 PCC 6803, 서모시네코코쿠스 엘롱가투스 BP-1, 클로로비움 테피둠, 클로로프렉수스 아우란티쿠스, 크로마티움 비노숨, 로도스피릴룸 루브룸, 로도박터 캡술라투스, 로도슈도모나스 파루스리스, 클로스트리디움 융달리, 클로스트리디움 서모셀룸, 페니실리움 크리소게눔, 피치아 파스토리스, 맥주효모균, 스키조사카로미세스 폼베, 슈도모나스 플루오레센스, 또는 자이모모나스 모빌리스로부터의 세포이다. 일 특정 실시예에서, 미생물 세포는 프로클로로코쿠스(Prochlorococcus), 시네코코쿠스, 시네코시스티스, 시아노테세(Cyanothece), 및 노스톡 펑크티포르메(Nostoc Punctiforme)를 포함하는 시아노박테리아로부터의 세포이다(단, 이로 제한되지 않음). 또 다른 실시예에서, 미생물 세포는 시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942, 시네코시스티스 종 PCC6803, 및 시네코코쿠스 종 PCC7001을 포함하는 특정한 시아노박테리아 종으로부터의 세포이다(단, 이로 제한되지 않음).

재조합 숙주 세포의 배양 및 발효

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 발효라는 용어는 광범위하게 숙주 세포에 의한 유기 물질의 표적 물질로의 전환, 예를 들어 탄소원을 포함하는 배지에서 재조합 숙주 세포의 배양물을 증식시킴으로써 재조합 숙주 세포에 의한 탄소원의 지방산 또는 그 유도체들로의 전환을 지칭한다. 생성을 위하여 허용되는 조건들은 숙주 세포로 하여금 원하는 생성물, 예컨대 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올을 생성하게 하는 여하한의 조건들을 지칭한다. 이와 유사하게, 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건 또는 조건들은 숙주 세포로 하여금 폴리펩티드를 합성하게 하는 여하한의 조건들을 의미한다. 적절한 조건들은, 예를 들어 발효 조건들을 포함한다. 발효 조건들은 온도 범위, 통기 수준, 공급량(feed rate), 및 배지 조성물을 포함하는 다수 파라미터를 포함할 수 있다(단, 이로 제한되지 않음). 이러한 조건들의 각각은 개별적으로 그리고 조합하여 숙주 세포가 성장하게 한다. 발효는 호기성, 혐기성, 또는 [미-호기성(micro-aerobic)과 같은] 이의 변이성(variations)일 수 있다. 예시적인 배양 배지는 배양액(broths) 또는 겔(gels)을 포함한다. 일반적으로, 배지는 숙주 세포에 의해 직접적으로 대사될 수 있는 탄소원을 포함한다. 또한, 효소들이 탄소원의 가동화(mobilization)[예를 들어, 전분 또는 셀룰로오스의 발효성 당들로의 해중합(depolymerization)] 및 탄소원의 후속한 대사를 용이하게 하도록 배지에서 사용될 수 있다.

소규모 생성을 위해, 조작된 숙주 세포들은 예를 들어 약 100 μL, 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL, 1 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 25 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L 또는 10 L의 뱃치(batchs)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 원하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 ACP 및/또는 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키도록 유도될 수 있다. 대규모 생성을 위해, 조작된 숙주 세포들은 약 10 L, 100 L, 1000 L, 10,000 L, 100,000 L 및 1,000,000 L 또는 그 이상의 뱃치에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키도록 유도될 수 있다. 대안적으로, 대규모 유가배양식 발효(fed-batch fermentation)가 수행될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체 조성물은 재조합 숙주 세포 배양의 세포외 환경에서 발견되고, 배양 배지로부터 쉽게 격리될 수 있다. 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올과 같은 지방산 유도체는 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있고, 세포외 환경으로 수송될 수 있거나 또는 수동적으로 재조합 숙주 세포 배양의 세포외 환경으로 전달될 수 있다. 지방산 유도체는 해당 기술분야에 알려진 통상의 방법들을 이용하여 재조합 숙주 세포 배양물로부터 격리된다.

재조합 숙주 세포로부터 유도된 생성물

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 현대 탄소의 분율 또는 fM은 각각 옥살산 표준 HOxI 및 HOxII로 알려져 있는 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology: NIST) 표준 참고 물질(Standard Reference Materials: SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 기본적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95 배의 ¹⁴C/¹²C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 붕괴-보정된 산업혁명-전 목재(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)에 거의 등가이다. 현재 생존 생물권(living biosphere)(식물 재료)에 대하여, fM은 약 1.1이다. 바이오생성물(Bioproduct)(예를 들어, 본 발명에 따라 생성되는 지방족 알데히드 및/또는 지방족 알코올을 포함하는 지방산 유도체들)은 생물학적으로 생성되는 유기 화합물을 포함한다. 특히, 본 명세서의 지방산 생합성 경로를 이용하여 생성되는 지방산 유도체들은 재생가능한 공급원들로부터 생성되지 않았으며, 이를테면 새로운 물질의 조성물이다. 이러한 새로운 바이오생성물은 이중 탄소-동위원소 핑거프린팅(dual carbon-isotopic fingerprinting) 또는 ¹⁴C 연대측정(dating)에 기초하여 석유화학의 탄소로부터 유도되는 유기 화합물과 구별될 수 있다. 추가적으로, 생물자원 탄소(biosourced carbon)의 특이적 공급원(예를 들어, 글루코오스 대 글리세롤)은 이중 탄소-동위원소 핑거프린팅에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 7,169,588 참조). 석유 기반 유기 화합물과 바이오생성물을 구별하는 능력은 상업적으로(in commerce) 이러한 물질들을 추적하는데 유익하다. 예를 들어, 생물학적 기반 및 석유 기반 탄소 동위원소 프로파일 둘 모두를 포함하는 유기 화합물 또는 화학물질은 석유 기반 물질들로만 만들어진 유기 화합물 및 화학물질과 구별될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 바이오생성물은 이들의 특유한 탄소 동위원소 프로파일에 기초하여 상업적으로 후속되거나 추적될 수 있다. 바이오생성물은 각 샘플의 안정적인 탄소 동위원소 비율(¹³C/¹²C)을 비교함으로써 석유 기반 유기 화합물과 구별될 수 있다. 주어진 바이오생성물의 ¹³C/¹²C 비율은, 이산화탄소가 고정된 시간에 대기 중의 이산화탄소에서의 ¹³C/¹²C 비율의 결과이다. 또한, 이는 정확한 대사 경로를 반영한다. 또한, 국부적인 변이들도 일어난다. 석유, C3 식물(활엽), C4 식물(목초), 및 해양 탄산염(marine carbonate)이 모두 ¹³C/¹²C 및 대응하는 δ¹³C 값들에서 상당한 차이를 나타낸다. 또한, C3 및 C4 식물들의 지질 물질은 대사 경로의 결과로서 동일한 식물들의 탄수화물 성분들로부터 유도된 물질들과 상이하게 분석한다. 측정의 정확도 내에서, ¹³C은 동위원소 분별 효과들로 인하여 큰 변화들을 나타내며, 바이오생성물들에 대한 이의 가장 중요한 점은 광합성 메카니즘이다. 식물들에서의 탄소 동위원소 비율 차이의 주요한 원인은 식물들에서의 광합성 탄소 대사의 경로, 특히 일차 카르복실화(primary carboxylation)(즉, 대기 중 CO₂의 초기 고정) 동안 발생하는 반응의 차이들과 밀접하게 관련된다. 식생의 크게 두 가지 종류들은 C3[또는 캘빈-벤슨(Calvin-Benson)] 광합성 사이클을 병합하는 것들 및 C4[또는 해치-슬랙(Hatch-Slack)] 광합성 사이클을 병합하는 것들이다. C3 식물들에서, 일차 CO₂ 고정 또는 카르복실화 반응은 효소인 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제를 수반하며, 첫번째 안정적인 생성물은 3-탄소 화합물이다. 경목(hardwood)들 및 침엽수들과 같은 C3 식물들은 온대 기후 지역들에서 우세하다. C4 식물들에서, 또 다른 효소인 포스포엔올-피루베이트 카르복실라아제를 수반하는 부가적인 카르복실화 반응은 일차 카르복실화 반응이다. 첫번째 안정적인 탄소 화합물은 이후에 탈카르복실화되는 4-탄소산(carbon acid)이다. 이에 따라 방출된 CO₂는 C3 사이클에 의해 재고정된다. C4 식물의 예시들은 열대형 목초들, 옥수수, 및 사탕수수이다. C4 및 C3 식물들이 모두 ¹³C/¹²C 동위원소 비율의 범위를 나타내지만, 통상적인 값들은 C4 식물에 대해 약 -7 내지 약 -13 퍼밀(per mil)이고, C3 식물에 대해 약 -19 내지 약 -27 퍼밀이다[예를 들어, Stuiver 외(1977) Radiocarbon 19:355 참조]. 석탄 및 석유는 일반적으로 이 후자의 범위에 속한다. ¹³C 측정 척도는 본래 Pee Dee Belemnite(PDB) 석회암에 의한 제로 세트(zero set)에 의해 정의되며, 여기서 값들은 이 재료로부터 천분율 편차로 주어진다. δ13C 값들은 천분율(퍼밀), 약어로는 ‰로 표현되고, 아래와 같이 계산된다:

PDB 표준 물질(RM)이 고갈되었으므로, 일련의 대안적인 RM들이 IAEA, USGS, NIST 및 다른 선택된 국제 동위원소 실험실들과 협력하여 개발되었다. PDB로부터의 퍼밀 편차에 대한 표기는 δ¹³C이다. 질량 44, 45 및 46의 분자 이온들에 대한 고정밀 안정 비율 질량 분석[high precision stable ratio mass spectrometry](IRMS)에 의해 CO₂ 상에서 측정이 행해진다. 본 명세서에서 설명되는 조성물들은 본 명세서에서 설명되는 방법들 중 어느 하나에 의해 생성되는 바이오생성물을 포함하며, 예를 들어 지방산 유도체 생성물을 포함한다. 구체적으로, 바이오생성물은 약 -28 이상, 약 -27 이상, -20 이상, -18 이상, -15 이상, -13 이상, -10 이상, 또는 -8 이상의 δ¹³C를 가질 수 있다. 예를 들어, 바이오생성물은 약 -30 내지 약 -15, 약 -27 내지 약 -19, 약 -25 내지 약 -21, 약 -15 내지 약 -5, 약 -13 내지 약 -7, 또는 약 -13 내지 약 -10의 δ¹³C를 가질 수 있다. 다른 경우들에서, 바이오생성물은 약 -10, -11, -12 또는 -12.3의 δ¹³C를 가질 수 있다. 또한, 본 명세서의 기재내용에 따라 생성되는 바이오생성물은 각 화합물의 ¹⁴C의 양을 비교함으로써 석유 기반 유기 화합물과 구별될 수 있다. ¹⁴C는 핵 반감기가 5730년이기 때문에, 더 오래된 탄소를 함유한 석유 기반 연료가 더 새로운 탄소를 함유한 바이오생성물과 구별될 수 있다[예를 들어, Currie, Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992) 참조]. 방사성탄소 연대측정법(radiocarbon dating)의 기본적인 가정은 대기 중의 ¹⁴C 농도의 항상성(constancy)이 생물(living organism)의 ¹⁴C의 항상성을 유도한다는 것이다. 하지만, 1950년 이후부터의 대기권 핵실험 및 1850년 이후부터의 화석 연료의 연소로 인하여, ¹⁴C는 제 2의, 지구화학적인 시간 특성을 얻었다. 대기 CO₂ 및 이에 따른 생물권(living biosphere)의 그 농도는 1960년대 중반의 핵실험 피크의 거의 두 배였다. 이후, 7년 내지 10년의 근사적 이완 "반-감기"(approximate relaxation "half-life")를 갖는 약 1.2×10^-12의 정상-상태 우주기원(steady-state cosmogenic) (대기) 기준 동위원소 비율(¹⁴C/¹²C)로 점진적으로 복귀되었다. 이 후자의 반감기가 문자 그대로 취해져야 하는 것이 아니라; 그보다는 핵무기 시대의 시작 이후로 대기권 및 생물권의 ¹⁴C의 변이성을 추적하기 위해 상세한 대기 핵 투입/붕괴의 함수(detailed atmospheric nuclear input/decay function)를 사용하여야 한다. 이는 최근 생물권 탄소의 매년 연대측정의 가능성(promise of annual dating)을 지속하는 후자의 생물권 ¹⁴C 시간 특성이다. ¹⁴C는 현대 탄소의 분율(fM)의 단위로 주어지는 결과들을 갖는 가속기 질량 분광 분석(accelerator mass spectrometry: AMS)에 의해 측정될 수 있다. fM은 미국 국립표준기술연구소(NIST) 표준 참고 물질(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 현대 탄소의 분율 또는 fM은 각각 옥살산 표준 HOxI 및 HOxⅡ로 알려져 있는 미국 국립표준기술연구소(NIST) 표준 참고 물질들(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 기본적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95 배의 ¹⁴C/¹²C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 붕괴-보정된 산업혁명-전 목재에 거의 등가이다. 현재 생물권(식물 재료)에 대하여, fM은 약 1.1이다. 본 명세서에서 설명되는 조성물들은 적어도 약 1의 fM ¹⁴C를 가질 수 있는 바이오생성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 바이오생성물은 적어도 약 1.01의 fM ¹⁴C, 약 1 내지 약 1.5의 fM ¹⁴C, 약 1.04 내지 약 1.18의 fM ¹⁴C, 또는 약 1.111 내지 약 1.124의 fM ¹⁴C를 가질 수 있다.

¹⁴C의 또 다른 측정은 pMC(percent of modern carbon)로 알려져 있다. ¹⁴C 연대를 이용하는 고고학자 또는 지질학자에 대하여, AD 1950년은 0의 해(zero years old)와 같다. 또한, 이는 100 pMC를 나타낸다. 대기 중의 핵무기 탄소(Bomb carbon)는 열(thermo)-핵무기의 피크에서 1963년의 통상 수준의 거의 두 배에 달하였다. 대기권 내의 이의 분포는 이의 출연 이후로 근사화되었으며, AD 1950년 이후로 살아 있는 식물들 및 동물들에 대하여 100 pMC보다 더 큰 값을 나타낸다. 이는 시간이 지나면서 107.5 pMC 부근인 현재의 값으로 점차 감소하였다. 이는 옥수수와 같은 신선한(fresh) 바이오매스 재료가 107.5 pMC 부근의 ¹⁴C 시그너처(signature)를 제공한다는 것을 의미한다. 석유 기반 화합물들은 0의 pMC 값을 가질 것이다. 오늘날의 탄소와 화석 탄소의 조합은 오늘날의 pMC 함량의 희석을 유도할 것이다. 107.5 pMC가 오늘날의 바이오매스 재료의 ¹⁴C 함량을 나타내고 0 pMC가 석유 기반 생성물의 ¹⁴C 함량을 나타낸다고 가정함으로써, 재료에 대해 측정된 pMC 값은 두 성분 유형의 비율을 반영할 것이다. 예를 들어, 오늘날의 콩으로부터 100 % 유도된 재료는 107.5 pMC 부근의 방사성탄소 시그너처를 제공할 것이다. 그 재료가 석유 기반 생성물로 50 % 희석되었다면, 이는 약 54 pMC의 방사성탄소 시그너처를 제공할 것이다. 생물학적 기반 탄소 함량은 107.5 pMC와 같은 100 %, 및 0 pMC와 같은 0 %를 할당함으로써 유도된다. 예를 들어, 99 pMC로 측정된 샘플은 93 %의 등가의 생물학적 기반 탄소 함량을 제공할 것이다. 이 값은 평균 생물학적 기반 탄소 결과로 지칭되며, 오늘날의 생물학적 재료 또는 석유 기반 재료 중 어느 하나로부터 비롯된 분석된 재료 내의 모든 성분을 가정한다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 1 이상의 지방산 유도체를 포함하는 바이오생성물은 적어도 약 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100의 pMC를 가질 수 있다. 다른 경우에, 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체는 약 50 내지 약 100; 약 60 내지 약 100; 약 70 내지 약 100; 약 80 내지 약 100; 약 85 내지 약 100; 약 87 내지 약 98; 또는 약 90 내지 약 95의 pMC를 가질 수 있다. 또 다른 경우에, 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체는 약 90, 91, 92, 93, 94, 또는 94.2의 pMC를 가질 수 있다.

지방족 알데히드 및 지방족 알코올 조성물들 및 이들의 이용

알데히드는 많은 특수 화학물질을 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 알데히드는 중합체, 수지[예를 들어, 베이클라이트(BAKELITE) 수지], 염료, 착향료, 가소제, 향수, 약제 및 다른 화학물질들을 생성하는데 사용되고, 이들 중 일부는 용제, 보존제 또는 소독제로서 사용될 수 있다. 또한, 비타민 및 호르몬과 같은 특정 천연 및 합성 화합물들이 알데히드들이고, 많은 당이 알데히드기들을 함유한다. 지방족 알데히드들은 화학적 또는 효소적 환원에 의해 지방족 알코올들로 전환될 수 있다. 지방족 알코올 또한 많은 상업적 용도들을 갖는다. 지방족 알코올 및 이들의 유도체들의 전 세계적인 연간 판매액은 10억 달러를 초과한다. 짧은 사슬형 지방족 알코올들은 유화제, 연화제 및 증점제로서 화장품 산업 및 식품 산업에 사용된다. 이들의 양친매성 성질로 인해, 지방족 알코올은 비이온성 계면활성제처럼 행동하고, 이는 예를 들어 세제와 같은 개인 위생 용품 및 가정 용품에 유용하다. 또한, 지방족 알코올은 왁스, 검, 수지, 약제학적 연고 및 로션, 윤활유 첨가제, 직물 정전기 방지제 및 마무리제, 가소제, 화장품, 공업 용제 및 지방용 용제에 사용된다.

또한, 본 발명은 본 명세서에서 설명되는 방법들 중 어느 것에 의해 생성되는 지방족 알코올을 포함하는 계면활성제 조성물 또는 세제 조성물을 제공한다. 본 기술분야의 당업자라면, 계면활성제 또는 세제 조성물의 의도된 목적에 따라, 상이한 지방족 알코올이 생성되고 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 지방족 알코올이 계면활성제 또는 세제 생성을 위한 공급원료로서 사용되는 경우, 본 기술분야의 당업자라면 지방족 알코올 공급원료의 특성들이 생성되는 계면활성제 또는 세제 조성물의 특성들에 영향을 미칠 것임을 이해할 것이다. 따라서, 계면활성제 또는 세제 조성물의 특성들은 공급원료로서 사용되는 특정 지방족 알코올을 생성함으로써 선택될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 지방족 알코올-기반 계면활성제 및/또는 세제 조성물은 본 기술분야에 잘 알려진 다른 계면활성제 및/또는 세제와 혼합될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 혼합물은 지방족 알코올의 중량의 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위를 포함할 수 있다. 다른 예시들에서, 계면활성제 또는 세제 조성물은 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 개의 탄소들인 탄소 사슬을 포함하는 지방족 알코올의 중량의 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위를 포함하도록 만들어질 수 있다. 또한, 이러한 계면활성제 또는 세제 조성물은 식물성유 또는 석유와 같은 비-미생물 공급원(nonmicrobial sources)으로부터의 계면활성제 또는 세제 또는 마이크로에멀션(microemulsion)과 같은 적어도 하나의 첨가제를 포함할 수 있고, 이는 지방족 알코올의 중량의 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위의 양으로 존재할 수 있다.

예시들

다음의 특정 예시들은 본 발명을 예시하기 위해 의도된 것이며, 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

프로토콜들 및 방법들

라이브러리 스크리닝

본 명세서에 설명된 모든 프로토콜들은 배양물을 성장시키기 위한 96 웰 플레이트(96 well plates)-마스터 블록-2mL 시스템(Greiner Bio-One, Monroe, NC 또는 Corning, 암스테르담, 네덜란드), 및 배양액으로부터 지방산 종을 추출하기 위한 플레이트들(Costar, Inc.)에 의존한다. 아래에 제공된 프로토콜들은 발효 조건들의 예시이다. 지방산 종의 생성을 평가하기 위해 대안적인 프로토콜들이 사용될 수 있다.

32 ℃ 배양 프로토콜(4NBT)

(96 웰 플레이트에서 성장된 LB 배양물로부터) 20 μL LB 배양물이 400 μL 2NBT 배지(표 2)를 주입(inoculate)하는데 사용되었으며, 이는 이후 32 ℃ 진탕으로 약 16 시간 동안 배양되었다. 하룻밤이 지난 종자(overnight seed)의 20 μL가 400 μL NBT에 1 또는 2 g/L 질소(NBT_1N 또는 NBT_2N)를 주입하는데 사용되었다. 6 시간 동안 32 ℃에서 성장한 후, 배양물은 IPTG(최종 농도 1 mM)로 유도되었다(표 2). 이후, 배양물은 18 시간 동안 32 ℃에서 진탕으로 배양되었으며, 이후 배양물은 아래에 자세히 설명된 표준 추출 프로토콜에 따라 추출되었다.

표 2: 배지명 및 제제(Formulations)

지방산 종 표준 추출 프로토콜

각각의 웰에 40 μL의 1M HCl이 추출되게 하기 위해, 이후 (내부 표준으로서 500 mg/L C11-FAME을 갖는) 300 μL의 부틸 아세테이트가 첨가되었다. 96 웰 플레이트는 이후 플레이트 실러(plate sealer)(ALPS-300 가열기; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL)를 이용하여 열-융착되었고(heat-sealed), MIXMATE 혼합기(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 2000 rpm으로 15 분 동안 진탕되었다. 진탕 후, 상기 플레이트는 실온에서 4500 rpm으로 10 분 동안 원심분리되어(Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA), 수성 및 유기 층들을 분리하였다. 유기 층의 50 μL가 96 웰 플레이트(폴리프로필렌, Corning, Amsterdam, The Netherlands)로 전달되었으며, 이후 이는 열-융착되었고, FALC_Broth.met 방법을 이용하여 GC-FID에 의해 평가될 때까지 -20 ℃로 저장되었다. FALC_Broth.met 방법은 다음과 같이 수행되었다: 1 μL의 샘플이 불꽃 이온화 검출기(FID)를 갖는 Agilent 7890A GC Ultra 장치(Agilent, Santa Clara, CA)에서 분석 컬럼(DB-1, 10 m x 180 ㎛ x 0.2 μΜ 막 두께, JW 121-101A로부터 이용가능함) 상으로 주입되었다. 이 기구는 C6 내지 C18 지방족 알코올을 검출 및 정량화하도록 셋업되었다. 앞서 자세히 설명된 프로토콜은 표준 조건들을 나타내며, 이는 분석 결과들을 최적화하기 위해 필요에 따라 변형될 수 있다.

지방산 종 - 표준 나일 레드 어세이 프로토콜(Standard Nile Red Assay Protocol)

24 시간 발효 후, 나일 레드 어세이는 Greiner MicrolonFluotrac 200 플레이트에서 1 ㎍/mL 나일 레드의 최종 어세이 농도에 대해 84.6 %의 물 및 15.4 %의 아세토니트릴 용액의 1.54 ㎍/mL 나일 레드의 130 μL에 70 μL의 발효액을 첨가함으로써 수행되었으며, 위아래로 피펫팅(pipetting)함으로써 혼합되었다. 상대 형광 단위(Relative fluorescence units)는 SpectraMax M2 유닛을 이용하여 630 nm의 방출(emission) 및 540 nm의 여기(excitation)에서 측정되었다.

오류 유발 라이브러리 구축

해당 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 기술들은 오류 유발 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 일 예시에서, 벡터 골격(vector backbone)은 벡터의 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases)를 이용함으로써 제조된 한편, DNA 삽입체의 다양성(diversity)의 생성은 미스매치된 뉴클레오티드의 통합에 우호적인 조건들 하에서 DNA 주형으로부터 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 일 접근법에서, 다양성을 갖는 DNA 삽입체 및 벡터 골격의 클로닝은 제조업체의 프로토콜에 따라 INFUSION Cloning System(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)을 이용하여 수행되었다.

포화 라이브러리 구축

해당 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 기술들은 포화 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 일 예시에서, 벡터 골격은 벡터의 제한 엔도뉴클레아제를 이용함으로써 제조된 한편, DNA 삽입체의 다양성의 생성은 변성 프라이머(degenerate primers)를 이용하여 생성되었다. 일 접근법에서, 다양성을 갖는 DNA 삽입체 및 벡터 골격의 클로닝은 제조업체의 프로토콜에 따라 INFUSION Cloning System(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)을 이용하여 수행되었다.

조합 라이브러리 구축

유익한 것으로 식별된 돌연변이들이 지방족 알코올 종의 생성 시 AAR 변이체에 추가 개선들을 제공하도록 조합되었다. 해당 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 기술들은 조합 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 일 예시에서, 벡터 골격은 벡터의 제한 엔도뉴클레아제를 이용함으로써 제조된 한편, DNA 삽입체의 다양성의 생성은 원하는 돌연변이들을 도입하기 위한 프라이머를 이용하여 생성되었다. 앞서 설명된 바와 같이, 일 접근법에서, 다양성을 갖는 DNA 삽입체 및 벡터 골격의 클로닝은 제조업체의 프로토콜에 따라 INFUSION Cloning System(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)을 이용하여 수행되었다. 조합 라이브러리는 tPCR(transfer PCR) 프로토콜을 이용하여 생성될 수 있다[Erijman 외(2011) J. Structural Bio.175:171-177].

라이브러리 스크리닝

라이브러리 다양성이 오류-유발, 포화 라이브러리 또는 조합 라이브러리에 생성되었으면, 이는 앞서 설명된 방법들 중 하나를 이용하여 스크리닝되었다. 두 가지 유형의 히트(hit)들이 식별되었다: (1) 증가된 양의 지방족 알코올(FALC 역가); 및/또는 (2) 도데칸올(C12) 또는 테트라데칸올(C14)과 같은 증가된 양의 중간-사슬 FALC. 또한, 헥사데칸올(C16) 및 옥타데칸올(C18)이 식별되었다. 각 히트 내의 AAR 변이체의 돌연변이들은 해당 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이용되는 표준 기술들을 이용하여 서열화함으로써 식별되었다. 표 4, 표 5 및 표 6은 포화 라이브러리 및 조합 라이브러리에 유익한 것으로 식별된 돌연변이(히트)들을 목록화한 것이다.

예시 1: 지방산 합성 경로를 통한 아실기 운반 단백질(ACP) 매개되는 증가된 플럭스에 의한 AAR_7942를 이용하여 개선된 지방족 알코올 생성

지방족 아실-ACP를 생성물로 전환시키기 위해 대장균 이외의 공급원들로부터의 말단 경로 효소들이 이종 숙주로서 대장균에서 발현될 때, 대장균 지방족 아실-ACP를 향한 재조합 경로 효소의 인식, 친화성, 및/또는 대사회전에 있어서 한계들이 존재할 수 있다. ACP 단백질들이 모든 유기체들에서 어느 정도 보존되더라도, 이들의 일차 서열(primary sequence)은 주어진 종 내에서조차 상이할 수 있다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 수 개의 시아노박테리아로부터의 acp 유전자들이 플라스미드 pLS9-185에 존재하는 시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942 아실-ACP 레덕타아제(AAR_7942)로부터 하류에 클로닝되었으며, 이는 pCL1920 유도체(3-5 복사체/세포)이다. 또한, 폭넓은 기질 특이성을 갖는 포스포판테테이닐 트랜스페라아제를 인코딩하는 바실루스 서브틸리스로부터의 sfp 유전자(수탁 번호 X63158; SEQ ID NO: 11)는 각각의 acp 유전자들의 하류에 클로닝되었다. 이 효소는 비활성 아포-ACP의 활성 홀로-ACP로의 전환에 관련된다. 구성된 플라스미드들이 표 3에 설명되어 있다.

표 3: S. 엘롱가투스 PCC7942 AAR로부터의 하류에 B. 서브틸리스 sfp를 포함 및 불포함하는 시아노박테리아 ACP를 공동발현시키는 플라스미드들

*NA = 핵산 서열; AA = 아미노산 서열/폴리펩티드 서열

acp 유전자들은 모두 INFUSION 기술을 이용하여 pLS9-185에서 aar 유전자의 하류에 가까운 EcoRI 부위로 합성 RBS와 클로닝되었다. EcoRI 부위는 acp 유전자의 하류에 재구성되었다. 이와 유사하게, B. 서브틸리스 sfp 유전자는 합성 RBS와 함께 이 EcoRI 부위로 INFUSION 클로닝되었다. 모든 플라스미드들은 대장균 MG1655 DV2로 형질전환되었다. 이러한 실험들에 대한 대조군은 AAR 단독(pLS9-185) 발현이다.

표준 진탕 플라스크 발효 실험들로부터 얻어진 결과들이 도 5에 나타나 있다. 지방족 알코올 역가의 상당한 개선이 플라스미드들 pDS171S, pDS172S, pDS168 및 pDS169를 함유하는 균주들에서 관찰되었으며, 이는 ACP 과발현이 지방족 알코올 생성에 유익할 수 있음을 입증한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, ACP 과발현이 이종의 말단 경로 효소에 의해 아실-ACP의 인식, 친화성 및/또는 대사회전에 도움을 줌으로써 지방족 알코올 생성에 유익할 수 있다는 가설을 세웠다[sfp의 유무 및 ACP의 공급원에 대한 표 3(위) 참조].

예시 2: 지방산 합성을 통한 아세틸-CoA 카르복실라아제(ACC) 매개되는 증가된 플럭스에 의한 AAR_7942를 이용하는 개선된 지방족 알코올 생성

지방산 생합성의 주요한 전구체들은 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA이다. 이러한 전구체들은 대장균에서 지방산 생합성의 속도를 제한하는 것으로 여겨졌다. 이 예시에서, 합성 아세틸-CoA 카르복실라아제, acc, 오페론[코리네박테리움 글루타미쿰 accDCAB+birA; SEQ ID NO: 45 또는 46, 48, 및 50, D+라고도 지칭함]이 시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942(AAR_7942)로부터의 아실-ACP 레덕타아제(AAR)과 함께 발현되었다. accD+ 오페론은 플라스미드 pLS9-185에서 AAR_7942의 하류에 클로닝되었다. 결과적인 플라스미드 및 pLS9-185 대조군 플라스미드는 대장균 DV2로 형질전환되었다. 균주들은 표준 진탕 플라스크 프로토콜에서 지방족 알코올 생성에 대해 평가되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 합성 코리네박테리움 글루타미쿰 acc 오페론의 공동발현은 증가된 지방족 알코올 생성을 야기하였다.

예시 3: 주형으로서 AAR_7942를 이용하여 제조된 오류 유발 라이브러리, 조합 및 제한된 포화 라이브러리들

A. 오류 유발 라이브러리

시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942(AAR_7942)로부터의 아실-ACP 레덕타아제의 오류 유발 라이브러리는 야생형 AAR_7942를 넘어서는 개선들을 나타낸 변이체들에 대해 구축 및 스크리닝되었다. 오류 유발 라이브러리를 만드는데 사용된 플라스미드는 "pDS171S"(표 3 참조)로 지정되었다. 오류 유발 라이브러리는 앞서 설명된 표준 프로토콜들 중 하나를 이용하여 스크리닝되었다. 이러한 개선들은 역가를 개선하거나, 역가에 실질적인 영향을 주지 않고 생성된 C10 내지 C14의 분율을 증가시키는 것으로서 분류되었다(결과들이 나타나 있지 않음).

B. 조합 및 제한된 포화 라이브러리들

해당 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 기술들은 위치들 17, 18 및 19에 기초하여 조합 라이브러리 및 포화 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 조합 라이브러리 및 포화 라이브러리에서 테스트된 돌연변이들(표 4A 및 4B)은 앞서 설명된 AAR_7942의 오류 유발 라이브러리에서 근원적으로 식별되었다. 사용된 플라스미드들, 균주들 및 스크리닝 프로토콜들은 예시 1에 설명된 것과 동일하였다. 오류 유발 라이브러리의 스크리닝으로부터 얻어진 결과들이 표 4A 및 4B에 나타나 있다. 표 4A는 증가된 지방족 알코올 역가를 야기한 AAR_7942 돌연변이들을 나타내고, 표 4B는 전체 지방족 알코올 역가에 실질적인 영향을 주지 않고 C14 지방족 알코올의 증가된 분율을 야기한 돌연변이들을 나타낸다.

표 4A: 개선된 지방족 알코올 역가와 상호관련된 AAR 7942 조합 및 제한된 포화 라이브러리들로부터의 돌연변이들

표 4B: 개선된 C14 지방족 알코올 분율과 상호관련된 AAR_7942 조합 및 제한된 포화 라이브러리들로부터의 돌연변이들

예시 4: 주형으로서 AAR(S18W)을 이용하여 제조된 포화 라이브러리

시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC7942("AAR(S18W)_7942")로부터의 아실-ACP 레덕타아제 변이체의 전체 포화 라이브러리가 구축되었으며, 스크리닝의 제 1 라운드에서 상당히 개선된 AAR 변이체로서 식별된, AAR(S18W)을 넘어서는 개선들을 나타낸 변이체들에 대해 스크리닝되었다(예시 2 및 3). 선택 기준은 C12의 퍼센트 분율의 증가 또는 FALC 역가의 증가였다. 높은 역가를 산출하기 위해 ACP 과발현에 대한 AAR의 의존성을 완화시키는 것에 조작 노력이 집중되었다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, ACP를 과발현시킨 균주들에서 관찰된 장점은 AAR에 의한 분할(cleavage)에 이용가능한 지방산 생합성 중간체들의 더 높은 농도에 기인한다는 가설을 세웠다. (FAS 중간체들의 더 낮은 농도를 갖는) 균주 결여 ACP 과발현에서 AAR에 구축된 포화 및 조합 라이브러리들을 스크리닝함으로써, FAS 중간체들에 대해 더 높은 친화성을 갖는 변이체들이 선택될 수 있다.

전체 포화 라이브러리를 만드는데 사용된 플라스미드는 pAAR-1로 지정되었다. 이는 아시네토박터균(Acinetobacter baylyi)(SEQ ID NO: 54)으로부터 알데히드 레덕타아제 유전자, AlrA에 의해 후속되는 (S18W) 변이체를 인코딩하는 AAR 유전자를 포함하는(harboring) pLS9-185의 유도체이다. AlrA는 AAR에 의해 생성되고 대장균의 내인성 지방족 알데히드 레덕타아제에 의해 완전히 환원되지 않은 지방족 알데히드 중간체들을 완전히 환원시키도록 첨가되었다. 전체 포화 라이브러리는 균주 Shu.002에서 스크리닝되었다. 균주 Shu.002는 DV2 PT5-ifab138 PT5_ifadR이다(표 7, 아래 참조). ifab138의 경우, 표 10의 SEQ ID NO: 55를 참조한다. 라이브러리들은 앞서 설명된 표준 프로토콜들 중 하나를 이용하여 스크리닝되었다. 개선들은 역가를 개선하거나, 역가에 실질적인 영향을 주지 않고 아실-ACP 레덕타아제에 의해 생성된 C12 지방족 알코올의 분율을 증가시키는 것으로 분류되었다. 포화 라이브러리의 스크리닝으로부터 얻어진 결과들이 아래의 표 5에 나타나 있다.

표 5: 증가된 지방족 알코올 역가 및/또는 증가된 C12 지방족 알코올 분율과 상호관련된 AAR(S18W) 7942 전체 포화 라이브러리로부터의 돌연변이들

* 4회 복제로부터 얻어진 평균(Average from 4 replicates)

** FIOC = AAR(S18W) 대조군을 넘어서는 배 증가[fold increase over AAR(S18W) control]

예시 5: 주형으로서 AAR(S18W)을 이용하여 제조된 조합 라이브러리

해당 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 기술들은 조합 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. 조합 라이브러리에서 테스트된 돌연변이들(표 6A, 6B 및 6C)은 전체 포화 라이브러리에서 근원적으로 식별되었다(예시 4). 조합 라이브러리는 예시 3에 설명된 것과 동일한 플라스미드에서 구축되었고 동일한 균주에서 스크리닝되었다. 이 라이브러리는 앞서 설명된 표준 프로토콜들 중 하나를 이용하여 스크리닝되었다. 개선들은 역가를 개선하거나, 역가에 실질적인 영향을 주지 않고 아실-ACP 레덕타아제에 의해 생성된 C12 지방족 알코올의 분율을 증가시키는 것으로 분류되었다. AAR 조합 라이브러리의 스크리닝으로부터 얻어진 결과들이 아래의 표 6A, 6B 및 6C에 나타나 있다.

표 6A: 증가된 지방족 알코올 역가와 상호관련된 제 1 AAR(S18W)_7942 조합 라이브러리로부터의 돌연변이들

* 4회 복제의 평균

** FIOC = (S18W) 대조군을 넘어서는 배 증가

표 6B: 증가된 지방족 알코올 역가와 상호관련된 제 2 AAR(S18W)_7942 조합 라이브러리로부터의 돌연변이들

* 4회 복제로부터 얻어진 평균

** FIOC = (S18W) 대조군을 넘어서는 배 증가

*** A77A 돌연변이는 gcc 내지 gca 잠재적 코돈 돌연변이임

표 6C: C12 지방족 알코올의 증가된 분율과 상호관련된 AAR(S18W)_7942 조합 라이브러리로부터의 돌연변이들

* 4회 복제로부터 얻어진 평균

** FIOC = (S18W) 대조군을 넘어서는 배 증가

예시 6: 지방산 합성 경로를 통해 증가된 플럭스 - AAR을 이용하여 iFab 및 iFadR 매개되는 지방족 알코올 생성

이 예시에서는, 지방산 대사의 조절, FadR 단백질(ifad)의 과발현 및/또는 수 개의 FAB 단백질(ifab138)을 포함하는 합성 오페론의 과발현에 의해 매개되는 지방산 합성 경로를 통해 플럭스를 증가시킴으로써, AAR을 이용하는 개선된 지방족 알코올 생성을 나타내었다. iFAB138(SEQ ID NO:55)은 다음의 순서로 유전자들 콜레라균으로부터의 fabV, 쥐티푸스균으로부터의 FabH, fabD, fabG 및 fabA, 그리고 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 FabF를 포함하며, 이는 PlacUV5 또는 PT5 프로모터에 의해 제어되는 합성 오페론으로서 통합된다. iFadR은 T5 프로모터에 의해 제어되는 대장균(SEQ ID NO: 56)으로부터의 fadR 유전자를 포함한다. 이 예시에서 평가된 대장균 균주에 존재하는 성분들은 아래의 표 7에 나타나 있다.

표 7: iFAB138 또는 fadR을 갖는 대장균 균주

AAR(S18W)은 AAR 코돈 18이 세린 (pCL-AAR(S18W)+ACP-sfp) 대신 트립토판을 특정하는 플라스미드 pDS171S의 변이체인 플라스미드 pDS311로부터 발현되었고, 아시네토박터균(SEQ ID NO: 54)으로부터의 알데히드 레덕타아제 유전자 alrA가 B. 서브틸리스로부터의 sfp 유전자의 하류에 클로닝되었다. pDS311은 균주들 DV2, BD061, BD064 및 Shu002로 형질전환되었다. 균주들은 4NBT_2N 프로토콜에서 평가되었다(상기 참조). 도 7에 도시된 바와 같이, 지방족 알코올 생성은 ifab138 및 ifadR의 존재의 결과로서 상당히 증가하였으며, 균주 Shu002는 가장 높은 지방족 알코올 역가를 나타낸다.

예시 7: 지방산 합성 경로를 통해 증가된 플럭스를 갖는 균주에서의 개선된 AAR 변이체들

이 예시에서는, 조합 라이브러리로부터의 AAR 변이체로 형질전환된 재조합 숙주 세포들에서의 개선된 지방족 알코올 생성이 FadR 단백질(위 참조)의 과발현 및 ifab138의 과발현에 의해 매개되는 지방산 생합성 경로를 통해 증가된 플럭스를 갖는 대장균 균주인 Shu2에서 입증되었다. 제 2 조합 라이브러리(표 6B)로부터의 4 개의 AAR 변이체가 평가되었다. 이러한 변이체들은 다음의 돌연변이들: Com2a: S18W, D24P, L31M, C63G, S113K, T154A, A281L; Comb2b: S18W, D16L, M21L, C63G, S113K, T154A, A281L; Com2c: S18W, L8A, M21L, C63G, A77A, S113K, T154A, A281L; Com2d: D24E, C63G, S113K, T154A, A281L을 포함한다(도 8 참조). 이러한 변이체들은 플라스미드 pJL104의 골격 내로 클로닝되었다. pJL104는 pDS311의 alrA 유전자의 하류에 C. 글루타미쿰(예시 2에 설명됨, 위 참조)으로부터의 합성 accD+ 오페론을 클로닝함으로써 생성되었다. 결과적인 플라스미드는 균주 Shu002 내로 형질전환되었고, 균주들은 4NBT_1N 프로토콜(위 참조)에서 평가되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, 상승된 지방족 알코올 생성이 모든 균주들에서 관찰되었다. 또한, AAR_7942의 S18W 변이체를 발현시키는 플라스미드 pDS311을 포함하는 균주 BD064가 탱크 발효로 평가되었다. 균주는 도 9에 도시된 바와 같이 42 g/L의 최대 역가, (글루코오스 상에서의) 12.6 %의 수율 및 0.62 g/L/h의 생산성을 갖는 지방족 알코올을 생성하였다. 지방족 알코올의 사슬 길이 분포는 다음과 같다: 1.2 % C8, 7.7 % C1O, 26.9 % C12, 44.7 % C14, 16.0 % C16 및 1.9 % C18. 포화 및 불포화 지방족 알코올의 분율은 각각 72.6 % 및 27.4 %이었다.

예시 8: C14 지방족 알코올 생성을 위한 사슬 길이 선택성의 재분포 및 증가된 MED4 아실 알데히드 레덕타아제(AAR) 활성

AAR은 시아노박테리아 알칸 생합성에 필수적인 성분들 중 하나이며, 다른 필수적인 성분은 알데히드 탈카르보닐라아제(aldehyde decarbonylase: ADC)이다. 본 발명자들은 MED4_ADC가 존재하지 않으면 프로클로로코쿠스 마리누스 MED4_AAR가 촉매 비활성임을, 즉 MED4_AAR만이 대장균에서 발현될 때에는 생성물들이 검출되지 않으며, MED4_AAR 및 ADC가 대장균에서 공동발현될 때에만 검출된 생성물들이 알칸임을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, MED4_AAR이, 히스티딘 156이 아르기닌[이후, MED4_ADC(H156R)라고도 함], 지방족 알코올에 의해 대체되는 MED4_ADC의 피상적 촉매 비활성 변이체(apparently catalytically inactive variant)를 갖는 대장균에서 공동발현될 때, 알칸이 검출되지 않음을 발견하였다(도 10 참조). 이 데이터로부터, MED4_AAR은 촉매 활성화될 MED4_ADC와 물리적인 상호작용을 필요로 하는 것으로 결론을 내렸다. 본 발명자들은 FALC 생성 목적으로 증가된 활성 및/또는 변경된 기질 특이성을 갖는 MED4_AAR을 식별하기 위해 이 시스템을 사용하였다.

MED4_ADC(H156R)는 MED4_AAR의 전체 포화 라이브러리와 함께 발현되었다. MED4_AAR 포화 라이브러리는 플라스미드 pCL1920-유도체(pLS9-195)에서 제조되었고, (ADC 유전자에 H156R을 포함하는 플라스미드 pACYC-Ptrc-MED4_ADC인) 플라스미드 pGLAK-043을 갖는 생성 균주 내로 도입되었다. 클론들이 유도되었으며, 야생형 AAR 효소보다 더 많은 지방족 알코올의 생성 또는 변경된 사슬 길이 프로파일, 예를 들어 C14 지방족 알코올의 증가된 분율을 갖는 지방족 알코올을 생성할 수 있는 능력에 기초하여 AAR 변이체들이 선택되었다. 이후, 선택된 클론들은 검증 라운드(validation round)에서 다시 테스트되었다. 1차 및 2차 발효 중에 일관적인 FALC 역가를 나타낸 모든 변이체들이 재성장되었고, 플라스미드 DNA가 격리되었으며, 서열화되었고, 추가 테스트를 위해 모 생성 균주 내로 재도입되었다. 이후, 이러한 새로운 형질전환체들은 또 다른 확증적 발효 및 분석을 거쳤다. 아래의 표 8은 가장 높은 FALC 역가를 생성한 16 개의 AAR 변이체들로부터의 대표적인 데이터를 나타낸다(위에서부터 아래 순서로 활성 감소됨). 이러한 변이체들은 야생형보다 1.4-배 내지 2.2 배 범위를 가졌다. 이러한 변이체들은 방향성 진화 기술(directed evolution technique)들을 이용하여 MED4_AAR 활성을 증가시키고, 추가적인 개선들에 대한 토대를 더욱 형성할 수 있는 능력을 나타내었다.

표 8: 야생형(WT) MED4 AAR에 대한 MED4 AAR 돌연변이체들의 FALC 생산성

* 잘린 변이체(Truncated variant)는 마지막 두 개의 아미노산이 빠져 있다.

또한, 데이터 세트는 변경된 사슬 길이 프로파일을 나타낸 AAR 변이체들에 대해 스캐닝되었다. 야생형 AAR에 의해 생성된 대다수의 종은 C16의 사슬 길이를 갖는다. C16보다 짧은 사슬 길이를 갖는 FALC 종의 증가된 비율이 관심거리이다. C14의 양에서 거의 3-배 증가를 나타낸 2 개의 변이 클론들이 식별되었다(도 10). 이러한 클론들의 서열화는 이러한 클론들이 동일한 뉴클레오티드 코돈 서열을 갖는 동일 D61E 돌연변이체들임을 나타내었다. D61E 변이체에 대한 플라스미드 DNA는 H156R ADC를 함유하는 모 균주 내로 재도입되었다. 결과들은 재조합 숙주 세포에서의 AAR의 D61E 변이체의 발현이 더 짧은 탄소 사슬들 쪽으로 FALC 종의 사슬 길이 분포를 치우치게 했다. 아래의 표 9는 변경된 사슬 길이를 갖는 어떤 생성물들도 생성하지 않은 MED4_AAR의 V346P 변이체 그리고 야생형(WT) MED4_AAR에 비해 MED4_AAR의 D61E 변이체를 발현시키는 재조합 숙주 세포들에 의해 생성된 FALC 사슬 길이를 예시한다.

표 9: AAR 변이체 및 야생형 AAR에 대한 사슬 길이 분포

* 평균으로부터의 편차에 기인한 1 % 분산(variance)

이러한 변이체들은 더욱 조합될 수 있으며, MED4_ADC (H156R) 백그라운드(background)의 개선들에 대해 스크리닝될 수 있다. MED4_AAR (D61E) 변이체 및 추가 돌연변이된 자손이 지방족 알코올과 알칸 둘 모두의 평균 사슬 길이를 감소시키는데 유용할 수 있다. MED4_AAR (D61E) 변이체는, MED4_AAR 사슬-길이 특이성이 가변성적(malleable)이고, 추가 단백질 조작 노력을 통해 이 활성의 추가 개선에 대한 가능성을 제시함을 입증한다. 설명된 모든 변이체들은 pLS9-195의 자손으로부터 서열화되었으며, 목록화된 아미노산 치환체들에 대응하는 코돈 돌연변이들을 함유하였다.

표 10: 서열 목록과 관련된 명칭

당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 앞선 실시형태들 및 실시예들의 다양한 변형들 및 변경들이 본 발명의 기술사상 및 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 이러한 변형들 및 변경들은 본 발명의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> REG Life Sciences, LLC <120> ACYL-ACP REDUCTASE WITH IMPROVED PROPERTIES <130> FPA11964-D02/C <150> PCT/US2014/011859 <151> 2014-01-16 <150> 61/753,273 <151> 2013-01-16 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 255 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme <400> 1 atgagccaaa cggaactttt tgaaaaggtc aagaaaatcg tcatcgaaca actgagtgtt 60 gaagatgctt ccaaaatcac tccacaagct aagtttatgg aagatttagg agctgattcc 120 ctggatactg ttgaactcgt gatggctttg gaagaagaat ttgatatcga aattcccgac 180 gaagctgccg agcagattgt atcggttcaa gacgcagtag attacatcaa taacaaagtt 240 gctgcatcag cttaa 255 <210> 2 <211> 84 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 2 Met Ser Gln Thr Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Ile Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Asp Ala Ser Lys Ile Thr Pro Gln Ala Lys Phe 20 25 30 Met Glu Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met 35 40 45 Ala Leu Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu 50 55 60 Gln Ile Val Ser Val Gln Asp Ala Val Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ala <210> 3 <211> 234 <212> DNA <213> Synechocystis sp. <400> 3 atgaatcagg aaatttttga aaaagtaaaa aaaatcgtcg tggaacagtt ggaagtggat 60 cctgacaaag tgacccccga tgccaccttt gccgaagatt taggggctga ttccctcgat 120 acagtggaat tggtcatggc cctggaagaa gagtttgata ttgaaattcc cgatgaagtg 180 gcggaaacca ttgataccgt gggcaaagcc gttgagcata tcgaaagtaa ataa 234 <210> 4 <211> 77 <212> PRT <213> Synechocystis sp. <400> 4 Met Asn Gln Glu Ile Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Val Glu Gln 1 5 10 15 Leu Glu Val Asp Pro Asp Lys Val Thr Pro Asp Ala Thr Phe Ala Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala Leu 35 40 45 Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Val Ala Glu Thr Ile 50 55 60 Asp Thr Val Gly Lys Ala Val Glu His Ile Glu Ser Lys 65 70 75 <210> 5 <211> 243 <212> DNA <213> Prochlorococcus marinus <400> 5 atgtcacaag aagaaatcct tcaaaaagta tgctctattg tttctgagca actaagtgtt 60 gaatcagccg aagtaaaatc tgattcaaac tttcaaaatg atttaggtgc agactcccta 120 gacaccgtag agctagttat ggctcttgaa gaagcatttg atatcgagat acctgatgaa 180 gcagctgaag gtatcgcaac agtaggagat gctgttaaat tcatcgaaga aaaaaaaggt 240 taa 243 <210> 6 <211> 80 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 6 Met Ser Gln Glu Glu Ile Leu Gln Lys Val Cys Ser Ile Val Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Ser Ala Glu Val Lys Ser Asp Ser Asn Phe Gln 20 25 30 Asn Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala 35 40 45 Leu Glu Glu Ala Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu Gly 50 55 60 Ile Ala Thr Val Gly Asp Ala Val Lys Phe Ile Glu Glu Lys Lys Gly 65 70 75 80 <210> 7 <211> 243 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 7 atgagccaag aagacatctt cagcaaagtc aaagacattg tggctgagca gctgagtgtg 60 gatgtggctg aagtcaagcc agaatccagc ttccaaaacg atctgggagc ggactcgctg 120 gacaccgtgg aactggtgat ggctctggaa gaggctttcg atatcgaaat ccccgatgaa 180 gccgctgaag gcattgcgac cgttcaagac gccgtcgatt tcatcgctag caaagctgcc 240 tag 243 <210> 8 <211> 80 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 8 Met Ser Gln Glu Asp Ile Phe Ser Lys Val Lys Asp Ile Val Ala Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Asp Val Ala Glu Val Lys Pro Glu Ser Ser Phe Gln 20 25 30 Asn Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala 35 40 45 Leu Glu Glu Ala Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu Gly 50 55 60 Ile Ala Thr Val Gln Asp Ala Val Asp Phe Ile Ala Ser Lys Ala Ala 65 70 75 80 <210> 9 <211> 255 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 9 atgagccaat cagaaacttt tgaaaaagtc aaaaaaattg ttatcgaaca actaagtgtg 60 gagaaccctg acacagtaac tccagaagct agttttgcca acgatttaca ggctgattcc 120 ctcgatacag tagaactagt aatggctttg gaagaagaat ttgatatcga aattcccgat 180 gaagccgcag agaaaattac cactgttcaa gaagcggtgg attacatcaa taaccaagtt 240 gccgcatcag cttaa 255 <210> 10 <211> 84 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 10 Met Ser Gln Ser Glu Thr Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Ile Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Asn Pro Asp Thr Val Thr Pro Glu Ala Ser Phe 20 25 30 Ala Asn Asp Leu Gln Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met 35 40 45 Ala Leu Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu 50 55 60 Lys Ile Thr Thr Val Gln Glu Ala Val Asp Tyr Ile Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ala <210> 11 <211> 674 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 11 atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60 atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120 gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180 ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240 cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300 tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360 cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420 gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480 ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540 gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600 aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgtt tccccgagga tatcacaatg gtctcgtacg 660 aagagctttt ataa 674 <210> 12 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu 1 5 10 15 Asn Glu Arg Phe Met Thr Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys 20 25 30 Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp 35 40 45 Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser 50 55 60 Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp 65 70 75 80 Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile 85 90 95 Gly Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys 100 105 110 Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr 115 120 125 Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr 130 135 140 His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly 165 170 175 Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys 180 185 190 Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His 195 200 205 Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu 210 215 220 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 13 ggcaatttga gaatttaagg aggaaaacaa aatgagccaa gaagacatct tc 52 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 14 cccaagcttc gaattcctag gcagctttgc tag 33 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 15 ggcaatttga gaatttaagg aggaaaacaa aatgaatcag gaaatttttg aaaaag 56 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 16 cccaagcttc gaattcttat ttactttcga tatgctcaac g 41 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 17 ggcaatttga gaatttaagg aggaaaacaa aatgtcacaa gaagaaatcc ttc 53 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 18 cccaagcttc gaattcttaa cctttttttt cttcgatgaa tttaac 46 <210> 19 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 19 ggcaatttga gaatttaagg aggaaaacaa aatgagccaa acggaacttt ttg 53 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 20 cccaagcttc gaattcttaa gctgatgcag caactttg 38 <210> 21 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 21 ggcaatttga gaatttaagg aggaaaacaa aatgagccaa tcagaaactt ttg 53 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 22 cccaagcttc gaattcttaa gctgatgcgg caac 34 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 23 agctgcctag gaatttaagg aggaataaac catgaagatt tac 43 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 24 aaaaggttaa gaatttaagg aggaataaac catgaagatt tac 43 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 25 atcagcttaa gaatttaagg aggaataaac catgaagatt tac 43 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 26 cccaagcttc gaattcttat aaaagctctt cgtacgagac c 41 <210> 27 <211> 1029 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 27 atggcattcg gtcttatcgg tcatctcacc agtttggagc aggcccgcga cgtttctcgc 60 aggatgggct acgacgaata cgccgatcaa ggattggagt tttggagtag cgctcctcct 120 caaatcgttg atgaaatcac agtcaccagt gccacaggca aggtgattca cggtcgctac 180 atcgaatcgt gtttcttgcc ggaaatgctg gcggcgcgcc gcttcaaaac agccacgcgc 240 aaagttctca atgccatgtc ccatgcccaa aaacacggca tcgacatctc ggccttgggg 300 ggctttacct cgattatttt cgagaatttc gatttggcca gtttgcggca agtgcgcgac 360 actaccttgg agtttgaacg gttcaccacc ggcaatactc acacggccta cgtaatctgt 420 agacaggtgg aagccgctgc taaaacgctg ggcatcgaca ttacccaagc gacagtagcg 480 gttgtcggcg cgactggcga tatcggtagc gctgtctgcc gctggctcga cctcaaactg 540 ggtgtcggtg atttgatcct gacggcgcgc aatcaggagc gtttggataa cctgcaggct 600 gaactcggcc ggggcaagat tctgcccttg gaagccgctc tgccggaagc tgactttatc 660 gtgtgggtcg ccagtatgcc tcagggcgta gtgatcgacc cagcaaccct gaagcaaccc 720 tgcgtcctaa tcgacggggg ctaccccaaa aacttgggca gcaaagtcca aggtgagggc 780 atctatgtcc tcaatggcgg ggtagttgaa cattgcttcg acatcgactg gcagatcatg 840 tccgctgcag agatggcgcg gcccgagcgc cagatgtttg cctgctttgc cgaggcgatg 900 ctcttggaat ttgaaggctg gcatactaac ttctcctggg gccgcaacca aatcacgatc 960 gagaagatgg aagcgatcgg tgaggcatcg gtgcgccacg gcttccaacc cttggcattg 1020 gcaatttga 1029 <210> 28 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 28 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Ser Arg Arg Met Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Cys 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Ala Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 29 <211> 1023 <212> DNA <213> Synechocystis sp. <400> 29 atgtttggtc ttattggtca tctcacgagt ttagaacacg cccaagcggt tgctgaagat 60 ttaggctatc ctgagtacgc caaccaaggc ctggattttt ggtgttcggc tcctccccaa 120 gtggttgata attttcaggt gaaaagtgtg acggggcagg tgattgaagg caaatatgtg 180 gagtcttgct ttttgccgga aatgttaacc caacggcgga tcaaagcggc cattcgtaaa 240 atcctcaatg ctatggccct ggcccaaaag gtgggcttgg atattacggc cctgggaggc 300 ttttcttcaa tcgtatttga agaatttaac ctcaagcaaa ataatcaagt ccgcaatgtg 360 gaactagatt ttcagcggtt caccactggt aatacccaca ccgcttatgt gatctgccgt 420 caggtcgagt ctggagctaa acagttgggt attgatctaa gtcaggcaac ggtagcggtt 480 tgtggcgcca cgggagatat tggtagcgcc gtatgtcgtt ggttagatag caaacatcaa 540 gttaaggaat tattgctaat tgcccgtaac cgccaaagat tggaaaatct ccaagaggaa 600 ttgggtcggg gcaaaattat ggatttggaa acagccctgc cccaggcaga tattattgtt 660 tgggtggcta gtatgcccaa gggggtagaa attgcggggg aaatgctgaa aaagccctgt 720 ttgattgtgg atgggggcta tcccaagaat ttagacacca gggtgaaagc ggatggggtg 780 catattctca agggggggat tgtagaacat tcccttgata ttacctggga aattatgaag 840 attgtggaga tggatattcc ctcccggcaa atgttcgcct gttttgcgga ggccattttg 900 ctagagtttg agggctggcg cactaatttt tcctggggcc gcaaccaaat ttccgttaat 960 aaaatggagg cgattggtga agcttctgtc aagcatggct tttgcccttt agtagctctt 1020 tag 1023 <210> 30 <211> 340 <212> PRT <213> Synechocystis sp. <400> 30 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu His Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Leu Gly Tyr Pro Glu Tyr Ala Asn Gln Gly Leu Asp 20 25 30 Phe Trp Cys Ser Ala Pro Pro Gln Val Val Asp Asn Phe Gln Val Lys 35 40 45 Ser Val Thr Gly Gln Val Ile Glu Gly Lys Tyr Val Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Thr Gln Arg Arg Ile Lys Ala Ala Ile Arg Lys 65 70 75 80 Ile Leu Asn Ala Met Ala Leu Ala Gln Lys Val Gly Leu Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Val Phe Glu Glu Phe Asn Leu Lys 100 105 110 Gln Asn Asn Gln Val Arg Asn Val Glu Leu Asp Phe Gln Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu Ser 130 135 140 Gly Ala Lys Gln Leu Gly Ile Asp Leu Ser Gln Ala Thr Val Ala Val 145 150 155 160 Cys Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Ser Lys His Gln Val Lys Glu Leu Leu Leu Ile Ala Arg Asn Arg Gln 180 185 190 Arg Leu Glu Asn Leu Gln Glu Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Met Asp 195 200 205 Leu Glu Thr Ala Leu Pro Gln Ala Asp Ile Ile Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Lys Gly Val Glu Ile Ala Gly Glu Met Leu Lys Lys Pro Cys 225 230 235 240 Leu Ile Val Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Thr Arg Val Lys 245 250 255 Ala Asp Gly Val His Ile Leu Lys Gly Gly Ile Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Thr Trp Glu Ile Met Lys Ile Val Glu Met Asp Ile Pro Ser 275 280 285 Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Ile Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Gly Trp Arg Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Ser Val Asn 305 310 315 320 Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Lys His Gly Phe Cys Pro 325 330 335 Leu Val Ala Leu 340 <210> 31 <211> 1023 <212> DNA <213> Cyanothece sp. <400> 31 atgtttggtt taattggtca tcttacaagt ttagaacacg cccactccgt tgctgatgcc 60 tttggctatg gcccatacgc cactcaggga cttgatttgt ggtgttctgc tccaccccaa 120 ttcgtcgagc attttcatgt tactagcatc acaggacaaa ccatcgaagg aaagtatata 180 gaatccgctt tcttaccaga aatgctgata aagcgacgga ttaaagcagc aattcgcaaa 240 atactgaatg cgatggcctt tgctcagaaa aataacctta acatcacagc attagggggc 300 ttttcttcga ttatttttga agaatttaat ctcaaagaga atagacaagt tcgtaatgtc 360 tctttagagt ttgatcgctt caccaccgga aacacccata ctgcttatat catttgtcgt 420 caagttgaac aggcatccgc taaactaggg attgacttat cccaagcaac ggttgctatt 480 tgcggggcaa ccggagatat tggcagtgca gtgtgtcgtt ggttagatag aaaaaccgat 540 acccaggaac tattcttaat tgctcgcaat aaagaacgat tacaacgact gcaagatgag 600 ttgggacggg gtaaaattat gggattggag gaggctttac ccgaagcaga tattatcgtt 660 tgggtggcga gtatgcccaa aggagtggaa attaatgccg aaactctcaa aaaaccctgt 720 ttaattatcg atggtggtta tcctaagaat ttagacacaa aaattaaaca tcctgatgtc 780 catatcctga aagggggaat tgtagaacat tctctagata ttgactggaa gattatggaa 840 actgtcaata tggatgttcc ttctcgtcaa atgtttgctt gttttgccga agccatttta 900 ttagagtttg aacaatggca cactaatttt tcttggggac gcaatcaaat tacagtgact 960 aaaatggaac aaataggaga agcttctgtc aaacatgggt tacaaccgtt gttgagttgg 1020 taa 1023 <210> 32 <211> 340 <212> PRT <213> Cyanothece sp. <400> 32 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu His Ala His Ser 1 5 10 15 Val Ala Asp Ala Phe Gly Tyr Gly Pro Tyr Ala Thr Gln Gly Leu Asp 20 25 30 Leu Trp Cys Ser Ala Pro Pro Gln Phe Val Glu His Phe His Val Thr 35 40 45 Ser Ile Thr Gly Gln Thr Ile Glu Gly Lys Tyr Ile Glu Ser Ala Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ile Lys Arg Arg Ile Lys Ala Ala Ile Arg Lys 65 70 75 80 Ile Leu Asn Ala Met Ala Phe Ala Gln Lys Asn Asn Leu Asn Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Ile Phe Glu Glu Phe Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Asn Arg Gln Val Arg Asn Val Ser Leu Glu Phe Asp Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Ile Ile Cys Arg Gln Val Glu Gln 130 135 140 Ala Ser Ala Lys Leu Gly Ile Asp Leu Ser Gln Ala Thr Val Ala Ile 145 150 155 160 Cys Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Arg Lys Thr Asp Thr Gln Glu Leu Phe Leu Ile Ala Arg Asn Lys Glu 180 185 190 Arg Leu Gln Arg Leu Gln Asp Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Met Gly 195 200 205 Leu Glu Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Ile Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Lys Gly Val Glu Ile Asn Ala Glu Thr Leu Lys Lys Pro Cys 225 230 235 240 Leu Ile Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Thr Lys Ile Lys 245 250 255 His Pro Asp Val His Ile Leu Lys Gly Gly Ile Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Lys Ile Met Glu Thr Val Asn Met Asp Val Pro Ser 275 280 285 Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Ile Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Gln Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Val Thr 305 310 315 320 Lys Met Glu Gln Ile Gly Glu Ala Ser Val Lys His Gly Leu Gln Pro 325 330 335 Leu Leu Ser Trp 340 <210> 33 <211> 1044 <212> DNA <213> Prochlorococcus marinus <400> 33 atggcatttg ggcttatagg tcattcaact agttttgaag atgcaaaaag aaaggcttca 60 ttattgggct ttgatcatat tgcggatggt gatttagatg tttggtgcac agctccacct 120 caactagttg aaaatgtaga ggttaaaagt gctataggta tatcaattga aggttcttat 180 attgattcat gtttcgttcc tgaaatgctt tcaagattta aaacggcaag aagaaaagta 240 ttaaatgcaa tggaattagc tcaaaaaaaa ggtattaata ttaccgcttt gggggggttc 300 acttctatca tctttgaaaa ttttaatctc cttcaacata agcagattag aaacacttca 360 ctagagtggg aaaggtttac aactggtaat actcatactg cgtgggttat ttgcaggcaa 420 ttagagatga atgctcctaa aataggtatt gatcttaaaa gcgcaacagt tgctgtagtt 480 ggtgctactg gagatatagg cagtgctgtt tgtcgatggt taatcaataa aacaggtatt 540 ggggaacttc ttttggtagc taggcaaaag gaacccttgg attctttgca aaaggaatta 600 gatggtggaa ctatcaaaaa tctagatgaa gcattgcctg aagcagatat tgttgtatgg 660 gtagcaagta tgccaaagac aatggaaatc gatgctaata atcttaaaca accatgttta 720 atgattgatg gaggttatcc aaagaatcta gatgaaaaat ttcaaggaaa taatatacat 780 gttgtaaaag gaggtatagt aagattcttc aatgatatag gttggaatat gatggaacta 840 gctgaaatgc aaaatcccca gagagaaatg tttgcatgct ttgcagaagc aatgatttta 900 gaatttgaaa aatgtcatac aaactttagc tggggaagaa ataatatatc tctcgagaaa 960 atggagttta ttggagctgc ttctgtaaag catggcttct ctgcaattgg cctagataag 1020 catccaaaag tactagcagt ttga 1044 <210> 34 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 34 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 35 <211> 1053 <212> DNA <213> Gloeobacter violaceus <400> 35 atgtttggcc tgatcggaca cttgaccaat ctttcccatg cccagcgggt cgcccgcgac 60 ctgggctacg acgagtatgc aagccacgac ctcgaattct ggtgcatggc ccctccccag 120 gcggtcgatg aaatcacgat caccagcgtc accggtcagg tgatccacgg tcagtacgtc 180 gaatcgtgct ttctgccgga gatgctcgcc cagggccgct tcaagaccgc catgcgcaag 240 atcctcaatg ccatggccct ggtccagaag cgcggcatcg acattacggc cctgggaggc 300 ttctcgtcga tcatcttcga gaatttcagc ctcgataaat tgctcaacgt ccgcgacatc 360 accctcgaca tccagcgctt caccaccggc aacacccaca cggcctacat cctttgtcag 420 caggtcgagc agggtgcggt acgctacggc atcgatccgg ccaaagcgac cgtggcggta 480 gtcggggcca ccggcgacat cggtagcgcc gtctgccgat ggctcaccga ccgcgccggc 540 atccacgaac tcttgctggt ggcccgcgac gccgaaaggc tcgaccggct gcagcaggaa 600 ctcggcaccg gtcggatcct gccggtcgaa gaagcacttc ccaaagccga catcgtcgtc 660 tgggtcgcct cgatgaacca gggcatggcc atcgaccccg ccggcctgcg caccccctgc 720 ctgctcatcg acggcggcta ccccaagaac atggccggca ccctgcagcg cccgggcatc 780 catatcctcg acggcggcat ggtcgagcac tcgctcgaca tcgactggca gatcatgtcg 840 tttctaaatg tgcccaaccc cgcccgccag ttcttcgcct gcttcgccga gtcgatgctg 900 ctggaattcg aagggcttca cttcaatttt tcctggggcc gcaaccacat caccgtcgag 960 aagatggccc agatcggctc gctgtctaaa aaacatggct ttcgtcccct gcttgaaccc 1020 agtcagcgca gcggcgaact cgtacacgga taa 1053 <210> 36 <211> 350 <212> PRT <213> Gloeobacter violaceus <400> 36 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Asn Leu Ser His Ala Gln Arg 1 5 10 15 Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Ser His Asp Leu Glu 20 25 30 Phe Trp Cys Met Ala Pro Pro Gln Ala Val Asp Glu Ile Thr Ile Thr 35 40 45 Ser Val Thr Gly Gln Val Ile His Gly Gln Tyr Val Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ala Gln Gly Arg Phe Lys Thr Ala Met Arg Lys 65 70 75 80 Ile Leu Asn Ala Met Ala Leu Val Gln Lys Arg Gly Ile Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Ser Leu Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Val Arg Asp Ile Thr Leu Asp Ile Gln Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Ile Leu Cys Gln Gln Val Glu Gln 130 135 140 Gly Ala Val Arg Tyr Gly Ile Asp Pro Ala Lys Ala Thr Val Ala Val 145 150 155 160 Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Thr 165 170 175 Asp Arg Ala Gly Ile His Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Asp Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Asp Arg Leu Gln Gln Glu Leu Gly Thr Gly Arg Ile Leu Pro 195 200 205 Val Glu Glu Ala Leu Pro Lys Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Asn Gln Gly Met Ala Ile Asp Pro Ala Gly Leu Arg Thr Pro Cys 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Met Ala Gly Thr Leu Gln 245 250 255 Arg Pro Gly Ile His Ile Leu Asp Gly Gly Met Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Phe Leu Asn Val Pro Asn Pro Ala 275 280 285 Arg Gln Phe Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ser Met Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Gly Leu His Phe Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn His Ile Thr Val Glu 305 310 315 320 Lys Met Ala Gln Ile Gly Ser Leu Ser Lys Lys His Gly Phe Arg Pro 325 330 335 Leu Leu Glu Pro Ser Gln Arg Ser Gly Glu Leu Val His Gly 340 345 350 <210> 37 <211> 1020 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme <400> 37 atgtttggtc taattggaca tctgactagt ttagaacacg ctcaagccgt agcccaagaa 60 ttgggatacc cagaatatgc cgatcaaggg ctagactttt ggtgcagcgc cccgccgcaa 120 attgtcgata gtattattgt caccagtgtt actgggcaac aaattgaagg acgatatgta 180 gaatcttgct ttttgccgga aatgctagct agtcgccgca tcaaagccgc aacacggaaa 240 atcctcaacg ctatggccca tgcacagaag cacggcatta acatcacagc tttaggcgga 300 ttttcctcga ttatttttga aaactttaag ttagagcagt ttagccaagt ccgaaatatc 360 aagctagagt ttgaacgctt caccacagga aacacgcata ctgcctacat tatttgtaag 420 caggtggaag aagcatccaa acaactggga attaatctat caaacgcgac tgttgcggta 480 tgtggagcaa ctggggatat tggtagtgcc gttacacgct ggctagatgc gagaacagat 540 gtccaagaac tcctgctaat cgcccgcgat caagaacgtc tcaaagagtt gcaaggcgaa 600 ctggggcggg ggaaaatcat gggtttgaca gaagcactac cccaagccga tgttgtagtt 660 tgggttgcta gtatgcccag aggcgtggaa attgacccca ccactttgaa acaaccctgt 720 ttgttgattg atggtggcta tcctaaaaac ttagcaacaa aaattcaata tcctggcgta 780 cacgtgttaa atggtgggat tgtagagcat tccctggata ttgactggaa aattatgaaa 840 atagtcaata tggacgtgcc agcccgtcag ttgtttgcct gttttgccga atcaatgcta 900 ctggaatttg agaagttata cacgaacttt tcgtggggac ggaatcagat taccgtagat 960 aaaatggagc agattggccg ggtgtcagta aaacatggat ttagaccgtt gttggtttag 1020 <210> 38 <211> 339 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 38 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu His Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Glu Leu Gly Tyr Pro Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu Asp 20 25 30 Phe Trp Cys Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Ser Ile Ile Val Thr 35 40 45 Ser Val Thr Gly Gln Gln Ile Glu Gly Arg Tyr Val Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ala Ser Arg Arg Ile Lys Ala Ala Thr Arg Lys 65 70 75 80 Ile Leu Asn Ala Met Ala His Ala Gln Lys His Gly Ile Asn Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Lys Leu Glu 100 105 110 Gln Phe Ser Gln Val Arg Asn Ile Lys Leu Glu Phe Glu Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Ile Ile Cys Lys Gln Val Glu Glu 130 135 140 Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ile Asn Leu Ser Asn Ala Thr Val Ala Val 145 150 155 160 Cys Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Thr Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Ala Arg Thr Asp Val Gln Glu Leu Leu Leu Ile Ala Arg Asp Gln Glu 180 185 190 Arg Leu Lys Glu Leu Gln Gly Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Met Gly 195 200 205 Leu Thr Glu Ala Leu Pro Gln Ala Asp Val Val Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Arg Gly Val Glu Ile Asp Pro Thr Thr Leu Lys Gln Pro Cys 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Ala Thr Lys Ile Gln 245 250 255 Tyr Pro Gly Val His Val Leu Asn Gly Gly Ile Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Lys Ile Met Lys Ile Val Asn Met Asp Val Pro Ala 275 280 285 Arg Gln Leu Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ser Met Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Lys Leu Tyr Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Val Asp 305 310 315 320 Lys Met Glu Gln Ile Gly Arg Val Ser Val Lys His Gly Phe Arg Pro 325 330 335 Leu Leu Val <210> 39 <211> 1020 <212> DNA <213> Anabaena variabilis <400> 39 atgtttggtc taattggaca tctgacaagt ttagaacacg ctcaagcggt agctcaagaa 60 ctgggatacc cagaatacgc cgaccaaggg ctagattttt ggtgcagcgc tccaccgcaa 120 atagttgacc acattaaagt tactagcatt actggtgaaa taattgaagg gaggtatgta 180 gaatcttgct ttttaccaga aatgctagcc agccgtagga ttaaagccgc aacccgcaaa 240 gtcctcaatg ctatggctca tgctcaaaaa catggcattg acatcaccgc tttgggtggt 300 ttctcctcca ttatttttga aaacttcaaa ttggaacagt ttagccaagt tcgtaatgtc 360 acactagagt ttgaacgctt cactacaggc aacactcaca cagcttatat catttgtcgg 420 caggtagaac aagcatcaca acaactcggc attgaactct cccaagcaac agtagctata 480 tgtggggcta ctggtgacat tggtagtgca gttactcgct ggctggatgc caaaacagac 540 gtaaaagaat tactgttaat cgcccgtaat caagaacgtc tccaagagtt gcaaagcgag 600 ttgggacgcg gtaaaatcat gagcctagat gaagcattgc ctcaagctga tattgtagtt 660 tgggtagcta gtatgcctaa aggcgtggaa attaatcctc aagttttgaa acaaccctgt 720 ttattgattg atggtggtta tccgaaaaac ttgggtacaa aagttcagta tcctggtgtt 780 tatgtactga acggaggtat cgtcgaacat tccctagata ttgactggaa aatcatgaaa 840 atagtcaata tggatgtacc tgcacgccaa ttatttgctt gttttgcgga atctatgctc 900 ttggaatttg agaagttgta cacgaacttt tcttgggggc gcaatcagat taccgtagac 960 aaaatggagc agattggtca agcatcagtg aaacatgggt ttagaccact gctggtttag 1020 <210> 40 <211> 339 <212> PRT <213> Anabaena variabilis <400> 40 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu His Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Glu Leu Gly Tyr Pro Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu Asp 20 25 30 Phe Trp Cys Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp His Ile Lys Val Thr 35 40 45 Ser Ile Thr Gly Glu Ile Ile Glu Gly Arg Tyr Val Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ala Ser Arg Arg Ile Lys Ala Ala Thr Arg Lys 65 70 75 80 Val Leu Asn Ala Met Ala His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Lys Leu Glu 100 105 110 Gln Phe Ser Gln Val Arg Asn Val Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Ile Ile Cys Arg Gln Val Glu Gln 130 135 140 Ala Ser Gln Gln Leu Gly Ile Glu Leu Ser Gln Ala Thr Val Ala Ile 145 150 155 160 Cys Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Thr Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Ala Lys Thr Asp Val Lys Glu Leu Leu Leu Ile Ala Arg Asn Gln Glu 180 185 190 Arg Leu Gln Glu Leu Gln Ser Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Met Ser 195 200 205 Leu Asp Glu Ala Leu Pro Gln Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Lys Gly Val Glu Ile Asn Pro Gln Val Leu Lys Gln Pro Cys 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Thr Lys Val Gln 245 250 255 Tyr Pro Gly Val Tyr Val Leu Asn Gly Gly Ile Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Lys Ile Met Lys Ile Val Asn Met Asp Val Pro Ala 275 280 285 Arg Gln Leu Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ser Met Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Lys Leu Tyr Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Val Asp 305 310 315 320 Lys Met Glu Gln Ile Gly Gln Ala Ser Val Lys His Gly Phe Arg Pro 325 330 335 Leu Leu Val <210> 41 <211> 1026 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 41 atgttcggtc ttatcggtca tctcaccagt ttggagcagg cccgcgacgt ttctcgcagg 60 atgggctacg acgaatacgc cgatcaagga ttggagtttt ggagtagcgc tcctcctcaa 120 atcgttgatg aaatcacagt caccagtgcc acaggcaagg tgattcacgg tcgctacatc 180 gaatcgtgtt tcttgccgga aatgctggcg gcgcgccgct tcaaaacagc cacgcgcaaa 240 gttctcaatg ccatgtccca tgcccaaaaa cacggcatcg acatctcggc cttggggggc 300 tttacctcga ttattttcga gaatttcgat ttggccagtt tgcggcaagt gcgcgacact 360 accttggagt ttgaacggtt caccaccggc aatactcaca cggcctacgt aatctgtaga 420 caggtggaag ccgctgctaa aacgctgggc atcgacatta cccaagcgac agtagcggtt 480 gtcggcgcga ctggcgatat cggtagcgct gtctgccgct ggctcgacct caaactgggt 540 gtcggtgatt tgatcctgac ggcgcgcaat caggagcgtt tggataacct gcaggctgaa 600 ctcggccggg gcaagattct gcccttggaa gccgctctgc cggaagctga ctttatcgtg 660 tgggtcgcca gtatgcctca gggcgtagtg atcgacccag caaccctgaa gcaaccctgc 720 gtcctaatcg acgggggcta ccccaaaaac ttgggcagca aagtccaagg tgagggcatc 780 tatgtcctca atggcggggt agttgaacat tgcttcgaca tcgactggca gatcatgtcc 840 gctgcagaga tggcgcggcc cgagcgccag atgtttgcct gctttgccga ggcgatgctc 900 ttggaatttg aaggctggca tactaacttc tcctggggcc gcaaccaaat cacgatcgag 960 aagatggaag cgatcggtga ggcatcggtg cgccacggct tccaaccctt ggcattggca 1020 atttga 1026 <210> 42 <211> 340 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 42 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg Asp 1 5 10 15 Val Ser Arg Arg Met Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu Glu 20 25 30 Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val Thr 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg Lys 65 70 75 80 Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu Ala 100 105 110 Ser Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu Ala 130 135 140 Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Val Ala Val 145 150 155 160 Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln Glu 180 185 190 Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu Pro 195 200 205 Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro Cys 225 230 235 240 Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val Gln 245 250 255 Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys Phe 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Ala Ala Glu Met Ala Arg Pro Glu 275 280 285 Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile Glu 305 310 315 320 Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln Pro 325 330 335 Leu Ala Leu Ala 340 <210> 43 <211> 1020 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 43 atgtttggtc taattggaca tctgacaagt ttagaacacg ctcaagcggt agctcaagaa 60 ctgggatacc cagaatacgc cgaccaaggg ctagattttt ggtgtagcgc tccaccgcaa 120 atagttgacc acattaaagt tactagtatt actggtgaaa taattgaagg gaggtatgta 180 gaatcttgct ttttaccgga gatgctagcc agtcgtcgga ttaaagccgc aacccgcaaa 240 gtcctcaatg ctatggctca tgctcaaaag aatggcattg atatcacagc tttgggtggt 300 ttctcctcca ttatttttga aaactttaaa ttggagcagt ttagccaagt tcgtaatgtg 360 acactagagt ttgaacgctt cactacaggc aacactcaca cagcatatat tatttgtcgg 420 caggtagaac aagcatcaca acaactcggc attgaactct cccaagcaac agtagctata 480 tgtggggcta ctggtgatat tggtagtgca gttactcgct ggctggatgc taaaacagac 540 gtgaaagaat tgctgttaat cgcccgtaat caagaacgtc tccaagagtt gcaaagcgag 600 ctgggacgcg gtaaaatcat gagccttgat gaagcactgc cccaagctga tatcgtagtt 660 tgggtagcca gtatgcctaa aggtgtggaa attaatcctc aagttttgaa gcaaccctgt 720 ttgctgattg atgggggtta tccgaaaaac ttgggtacaa aagttcagta tcctggtgtt 780 tatgtactga acggcggtat cgtcgaacat tcgctggata ttgactggaa aatcatgaaa 840 atagtcaata tggatgtacc tgcacgccaa ttatttgctt gttttgcgga atctatgctc 900 ttggaatttg agaagttgta cacgaacttt tcttgggggc gcaatcagat taccgtagac 960 aaaatggagc agattggtca agcatcagtg aaacatgggt ttagaccact gctggtttag 1020 <210> 44 <211> 339 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 44 Met Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu His Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Glu Leu Gly Tyr Pro Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu Asp 20 25 30 Phe Trp Cys Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp His Ile Lys Val Thr 35 40 45 Ser Ile Thr Gly Glu Ile Ile Glu Gly Arg Tyr Val Glu Ser Cys Phe 50 55 60 Leu Pro Glu Met Leu Ala Ser Arg Arg Ile Lys Ala Ala Thr Arg Lys 65 70 75 80 Val Leu Asn Ala Met Ala His Ala Gln Lys Asn Gly Ile Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Leu Gly Gly Phe Ser Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Lys Leu Glu 100 105 110 Gln Phe Ser Gln Val Arg Asn Val Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe Thr 115 120 125 Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Ile Ile Cys Arg Gln Val Glu Gln 130 135 140 Ala Ser Gln Gln Leu Gly Ile Glu Leu Ser Gln Ala Thr Val Ala Ile 145 150 155 160 Cys Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Thr Arg Trp Leu Asp 165 170 175 Ala Lys Thr Asp Val Lys Glu Leu Leu Leu Ile Ala Arg Asn Gln Glu 180 185 190 Arg Leu Gln Glu Leu Gln Ser Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Met Ser 195 200 205 Leu Asp Glu Ala Leu Pro Gln Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser 210 215 220 Met Pro Lys Gly Val Glu Ile Asn Pro Gln Val Leu Lys Gln Pro Cys 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Thr Lys Val Gln 245 250 255 Tyr Pro Gly Val Tyr Val Leu Asn Gly Gly Ile Val Glu His Ser Leu 260 265 270 Asp Ile Asp Trp Lys Ile Met Lys Ile Val Asn Met Asp Val Pro Ala 275 280 285 Arg Gln Leu Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ser Met Leu Leu Glu Phe Glu 290 295 300 Lys Leu Tyr Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Val Asp 305 310 315 320 Lys Met Glu Gln Ile Gly Gln Ala Ser Val Lys His Gly Phe Arg Pro 325 330 335 Leu Leu Val <210> 45 <211> 867 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 45 ttgggcgtgt cgcccttaaa gcgcgctttt cgacgcgacc ccactacatt ggcttccatg 60 aacgttgaca tttcacgatc cagagagccg ctaaacgttg agctcctgaa ggaaaaattg 120 ctccaaaacg gtgactttgg ccaggtcatt tacgaaaaag tgacaggctc cactaatgct 180 gacttgctgg cacttgcagg ttctggcgct ccaaactgga cggtgaaaac tgtcgagttt 240 caagatcatg cgcgtgggcg actcggccgc ccgtggtctg cccctgaggg ttcccaaaca 300 atcgtgtctg tgctcgttca actatctatt gatcaagtgg accggattgg cactattcca 360 ctcgcggcgg gactcgctgt catggatgcg ttgaatgacc tcggtgtgga aggtgccgga 420 ctgaaatggc ccaacgatgt tcaaatccac ggcaagaaac tctgcggcat cctggtggaa 480 gccaccggct ttgattccac cccaacagtt gtcatcggtt ggggcactaa tatcagcctg 540 actaaagagg agcttcctgt tcctcatgca acttccctcg cattggaagg tgttgaagtc 600 gacagaacca cattccttat taatatgctc acacatctgc atactcgact ggaccagtgg 660 cagggtccaa gtgtggattg gctcgatgat taccgtgcgg tatgttccag tattggccaa 720 gatgttcgag tgcttctacc tggggataaa gaactcttag gtgaagcgat cggtgtcgcg 780 actggcggag aaattcgtgt tcgcgatgct tcgggcaccg ttcacaccct caacgccggt 840 gaaattacgc accttcgcct gcagtaa 867 <210> 46 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 46 atgaatgttg acattagccg ctctcgtgaa ccgttgaacg tggaactgtt gaaagaaaaa 60 ctgctgcaga acggtgattt cggtcaagtg atctacgaga aggtcaccgg ctctaccaat 120 gcggacctgc tggctctggc gggcagcggc gctccaaact ggaccgtcaa gactgttgaa 180 tttcaggacc acgcccgtgg ccgtctgggt cgtccgtgga gcgcaccgga gggttcccaa 240 accatcgtca gcgttctggt ccaactgagc attgatcagg tggaccgtat tggtacgatc 300 ccgctggccg caggcttggc tgttatggat gcgctgaatg atctgggcgt ggagggtgca 360 ggcctgaaat ggccgaacga tgttcagatc cacggtaaga agttgtgcgg tattctggtt 420 gaagcaaccg gcttcgactc cactccgacc gtggttatcg gttggggtac gaatatctcg 480 ttgacgaaag aagagctgcc ggtcccgcac gcgaccagcc tggccctgga gggtgttgaa 540 gttgaccgta cgacgttcct gattaacatg ctgacccatc tgcatacccg tctggatcag 600 tggcagggtc cgtctgtgga ctggctggat gactatcgcg cggtttgtag cagcattggc 660 caagatgtgc gtgtcctgct gcctggtgac aaagagctgc tgggcgaggc gattggcgtg 720 gcgaccggtg gtgagatccg tgtgcgcgac gccagcggca cggtccacac gctgaatgcg 780 ggtgaaatca cgcatctgcg tttgcaataa 810 <210> 47 <211> 269 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 47 Met Asn Val Asp Ile Ser Arg Ser Arg Glu Pro Leu Asn Val Glu Leu 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Leu Leu Gln Asn Gly Asp Phe Gly Gln Val Ile Tyr 20 25 30 Glu Lys Val Thr Gly Ser Thr Asn Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Gly 35 40 45 Ser Gly Ala Pro Asn Trp Thr Val Lys Thr Val Glu Phe Gln Asp His 50 55 60 Ala Arg Gly Arg Leu Gly Arg Pro Trp Ser Ala Pro Glu Gly Ser Gln 65 70 75 80 Thr Ile Val Ser Val Leu Val Gln Leu Ser Ile Asp Gln Val Asp Arg 85 90 95 Ile Gly Thr Ile Pro Leu Ala Ala Gly Leu Ala Val Met Asp Ala Leu 100 105 110 Asn Asp Leu Gly Val Glu Gly Ala Gly Leu Lys Trp Pro Asn Asp Val 115 120 125 Gln Ile His Gly Lys Lys Leu Cys Gly Ile Leu Val Glu Ala Thr Gly 130 135 140 Phe Asp Ser Thr Pro Thr Val Val Ile Gly Trp Gly Thr Asn Ile Ser 145 150 155 160 Leu Thr Lys Glu Glu Leu Pro Val Pro His Ala Thr Ser Leu Ala Leu 165 170 175 Glu Gly Val Glu Val Asp Arg Thr Thr Phe Leu Ile Asn Met Leu Thr 180 185 190 His Leu His Thr Arg Leu Asp Gln Trp Gln Gly Pro Ser Val Asp Trp 195 200 205 Leu Asp Asp Tyr Arg Ala Val Cys Ser Ser Ile Gly Gln Asp Val Arg 210 215 220 Val Leu Leu Pro Gly Asp Lys Glu Leu Leu Gly Glu Ala Ile Gly Val 225 230 235 240 Ala Thr Gly Gly Glu Ile Arg Val Arg Asp Ala Ser Gly Thr Val His 245 250 255 Thr Leu Asn Ala Gly Glu Ile Thr His Leu Arg Leu Gln 260 265 <210> 48 <211> 1632 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 48 atgaccattt cctcaccttt gattgacgtc gccaaccttc cagacatcaa caccactgcc 60 ggcaagatcg ccgaccttaa ggctcgccgc gcggaagccc atttccccat gggtgaaaag 120 gcagtagaga aggtccacgc tgctggacgc ctcactgccc gtgagcgctt ggattactta 180 ctcgatgagg gctccttcat cgagaccgat cagctggctc gccaccgcac caccgctttc 240 ggcctgggcg ctaagcgtcc tgcaaccgac ggcatcgtga ccggctgggg caccattgat 300 ggacgcgaag tctgcatctt ctcgcaggac ggcaccgtat tcggtggcgc gcttggtgag 360 gtgtacggcg aaaagatgat caagatcatg gagctggcaa tcgacaccgg ccgcccattg 420 atcggtcttt acgaaggcgc tggcgctcgt attcaggacg gcgctgtctc cctggacttc 480 atttcccaga ccttctacca aaacattcag gcttctggcg ttatcccaca gatctccgtc 540 atcatgggcg catgtgcagg tggcaacgct tacggcccag ctctgaccga cttcgtggtc 600 atggtggaca agacctccaa gatgttcgtt accggcccag acgtgatcaa gaccgtcacc 660 ggcgaggaaa tcacccagga agagcttggc ggagcaacca cccacatggt gaccgctggt 720 aactcccact acaccgctgc gaccgatgag gaagcactgg attgggtaca ggacctggtg 780 tccttcctcc catccaacaa tcgctcctac gcaccgatgg aagacttcga cgaggaagaa 840 ggcggcgttg aagaaaacat caccgctgac gatctgaagc tcgacgagat catcccagat 900 tccgcgaccg ttccttacga cgtccgcgat gtcatcgaat gcctcaccga cgatggcgaa 960 tacctggaaa tccaggcaga ccgcgcagaa aacgttgtta ttgcattcgg ccgcatcgaa 1020 ggccagtccg ttggctttgt tgccaaccag ccaacccagt tcgctggctg cctggacatc 1080 gactcctctg agaaggcagc tcgcttcgtc cgcacctgcg acgcgttcaa catcccaatc 1140 gtcatgcttg tcgacgtccc cggcttcctc ccaggcgcag gccaggagta cggtggcatt 1200 ctgcgtcgtg gcgcaaagct gctctacgca tacggcgaag caaccgttcc aaagatcacc 1260 gtcaccatgc gtaaggctta cggcggagcg tactgcgtga tgggttccaa gggcttgggc 1320 tctgacatca accttgcatg gccaaccgca cagatcgccg tcatgggcgc tgctggcgca 1380 gttggattca tctaccgcaa ggagctcatg gcagctgatg ccaagggcct cgataccgta 1440 gctctggcta agtccttcga gcgcgagtat gaagaccaca tgctcaaccc gtaccacgct 1500 gcagaacgtg gcctgatcga cgccgtgatc ctgccaagcg aaacccgcgg acagatttcc 1560 cgcaaccttc gcctgctcaa gcacaagaac gtcactcgcc ctgctcgcaa gcacggcaac 1620 atgccactgt aa 1632 <210> 49 <211> 543 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 49 Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile 1 5 10 15 Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu 20 25 30 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala 35 40 45 Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly 50 55 60 Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp 85 90 95 Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr 100 105 110 Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys 115 120 125 Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr 130 135 140 Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe 145 150 155 160 Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro 165 170 175 Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly 180 185 190 Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met 195 200 205 Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile 210 215 220 Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly 225 230 235 240 Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val 245 250 255 Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Ala Pro 260 265 270 Met Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr 275 280 285 Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val 290 295 300 Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu 305 310 315 320 Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe 325 330 335 Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr 340 345 350 Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg 355 360 365 Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val 370 375 380 Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile 385 390 395 400 Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val 405 410 415 Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys 420 425 430 Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro 435 440 445 Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile 450 455 460 Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val 465 470 475 480 Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn 485 490 495 Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro 500 505 510 Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His 515 520 525 Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu 530 535 540 <210> 50 <211> 1776 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 50 atgtcagtcg agactcgcaa gatcaccaag gttcttgtcg ctaaccgtgg tgagattgca 60 atccgcgtgt tccgtgcagc tcgagatgaa ggcatcggat ctgtcgccgt ctacgcagag 120 ccagatgcag atgcaccatt cgtgtcatat gcagacgagg cttttgccct cggtggccaa 180 acatccgctg agtcctacct tgtcattgac aagatcatcg atgcggcccg caagtccggc 240 gccgacgcca tccaccccgg ctacggcttc ctcgcagaaa acgctgactt cgcagaagca 300 gtcatcaacg aaggcctgat ctggattgga ccttcacctg agtccatccg ctccctcggc 360 gacaaggtca ccgctcgcca catcgcagat accgccaagg ctccaatggc tcctggcacc 420 aaggaaccag taaaagacgc agcagaagtt gtggctttcg ctgaagaatt cggtctccca 480 atcgccatca aggcagcttt cggtggcggc ggacgtggca tgaaggttgc ctacaagatg 540 gaagaagtcg ctgacctctt cgagtccgca acccgtgaag caaccgcagc gttcggccgc 600 ggcgagtgct tcgtggagcg ctacctggac aaggcacgcc acgttgaggc tcaggtcatc 660 gccgataagc acggcaacgt tgttgtcgcc ggaacccgtg actgctccct gcagcgccgt 720 ttccagaagc tcgtcgaaga agcaccagca ccattcctca ccgatgacca gcgcgagcgt 780 ctccactcct ccgcgaaggc tatctgtaag gaagctggct actacggtgc aggcaccgtt 840 gagtacctcg ttggctccga cggcctgatc tccttcctcg aggtcaacac ccgcctccag 900 gtggaacacc cagtcaccga agagaccacc ggcatcgacc tggtccgcga aatgttccgc 960 atcgcagaag gccacgagct ctccatcaag gaagatccag ctccacgcgg ccacgcattc 1020 gagttccgca tcaacggcga agacgctggc tccaacttca tgcctgcacc aggcaagatc 1080 accagctacc gcgagccaca gggcccaggc gtccgcatgg actccggtgt cgttgaaggt 1140 tccgaaatct ccggacagtt cgactccatg ctggcaaagc tgatcgtttg gggcgacacc 1200 cgcgagcagg ctctccagcg ctcccgccgt gcacttgcag agtacgttgt cgagggcatg 1260 ccaaccgtta tcccattcca ccagcacatc gtggaaaacc cagcattcgt gggcaacgac 1320 gaaggcttcg agatctacac caagtggatc gaagaggttt gggataaccc aatcgcacct 1380 tacgttgacg cttccgagct cgacgaagat gaggacaaga ccccagcaca gaaggttgtt 1440 gtggagatca acggccgtcg cgttgaggtt gcactcccag gcgatctggc actcggtggc 1500 accgctggtc ctaagaagaa ggccaagaag cgtcgcgcag gtggtgcaaa ggctggcgta 1560 tccggcgatg cagtggcagc tccaatgcag ggcactgtca tcaaggtcaa cgtcgaagaa 1620 ggcgctgaag tcaacgaagg cgacaccgtt gttgtcctcg aggctatgaa gatggaaaac 1680 cctgtgaagg ctcataagtc cggaaccgta accggcctta ctgtcgctgc aggcgagggt 1740 gtcaacaagg gcgttgttct cctcgagatc aagtaa 1776 <210> 51 <211> 591 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 51 Met Ser Val Glu Thr Arg Lys Ile Thr Lys Val Leu Val Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ala Ile Arg Val Phe Arg Ala Ala Arg Asp Glu Gly Ile 20 25 30 Gly Ser Val Ala Val Tyr Ala Glu Pro Asp Ala Asp Ala Pro Phe Val 35 40 45 Ser Tyr Ala Asp Glu Ala Phe Ala Leu Gly Gly Gln Thr Ser Ala Glu 50 55 60 Ser Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ile Ile Asp Ala Ala Arg Lys Ser Gly 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ala Glu Asn Ala Asp 85 90 95 Phe Ala Glu Ala Val Ile Asn Glu Gly Leu Ile Trp Ile Gly Pro Ser 100 105 110 Pro Glu Ser Ile Arg Ser Leu Gly Asp Lys Val Thr Ala Arg His Ile 115 120 125 Ala Asp Thr Ala Lys Ala Pro Met Ala Pro Gly Thr Lys Glu Pro Val 130 135 140 Lys Asp Ala Ala Glu Val Val Ala Phe Ala Glu Glu Phe Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ile Ala Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Lys Val 165 170 175 Ala Tyr Lys Met Glu Glu Val Ala Asp Leu Phe Glu Ser Ala Thr Arg 180 185 190 Glu Ala Thr Ala Ala Phe Gly Arg Gly Glu Cys Phe Val Glu Arg Tyr 195 200 205 Leu Asp Lys Ala Arg His Val Glu Ala Gln Val Ile Ala Asp Lys His 210 215 220 Gly Asn Val Val Val Ala Gly Thr Arg Asp Cys Ser Leu Gln Arg Arg 225 230 235 240 Phe Gln Lys Leu Val Glu Glu Ala Pro Ala Pro Phe Leu Thr Asp Asp 245 250 255 Gln Arg Glu Arg Leu His Ser Ser Ala Lys Ala Ile Cys Lys Glu Ala 260 265 270 Gly Tyr Tyr Gly Ala Gly Thr Val Glu Tyr Leu Val Gly Ser Asp Gly 275 280 285 Leu Ile Ser Phe Leu Glu Val Asn Thr Arg Leu Gln Val Glu His Pro 290 295 300 Val Thr Glu Glu Thr Thr Gly Ile Asp Leu Val Arg Glu Met Phe Arg 305 310 315 320 Ile Ala Glu Gly His Glu Leu Ser Ile Lys Glu Asp Pro Ala Pro Arg 325 330 335 Gly His Ala Phe Glu Phe Arg Ile Asn Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn 340 345 350 Phe Met Pro Ala Pro Gly Lys Ile Thr Ser Tyr Arg Glu Pro Gln Gly 355 360 365 Pro Gly Val Arg Met Asp Ser Gly Val Val Glu Gly Ser Glu Ile Ser 370 375 380 Gly Gln Phe Asp Ser Met Leu Ala Lys Leu Ile Val Trp Gly Asp Thr 385 390 395 400 Arg Glu Gln Ala Leu Gln Arg Ser Arg Arg Ala Leu Ala Glu Tyr Val 405 410 415 Val Glu Gly Met Pro Thr Val Ile Pro Phe His Gln His Ile Val Glu 420 425 430 Asn Pro Ala Phe Val Gly Asn Asp Glu Gly Phe Glu Ile Tyr Thr Lys 435 440 445 Trp Ile Glu Glu Val Trp Asp Asn Pro Ile Ala Pro Tyr Val Asp Ala 450 455 460 Ser Glu Leu Asp Glu Asp Glu Asp Lys Thr Pro Ala Gln Lys Val Val 465 470 475 480 Val Glu Ile Asn Gly Arg Arg Val Glu Val Ala Leu Pro Gly Asp Leu 485 490 495 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Gly Pro Lys Lys Lys Ala Lys Lys Arg Arg 500 505 510 Ala Gly Gly Ala Lys Ala Gly Val Ser Gly Asp Ala Val Ala Ala Pro 515 520 525 Met Gln Gly Thr Val Ile Lys Val Asn Val Glu Glu Gly Ala Glu Val 530 535 540 Asn Glu Gly Asp Thr Val Val Val Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Asn 545 550 555 560 Pro Val Lys Ala His Lys Ser Gly Thr Val Thr Gly Leu Thr Val Ala 565 570 575 Ala Gly Glu Gly Val Asn Lys Gly Val Val Leu Leu Glu Ile Lys 580 585 590 <210> 52 <211> 340 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 52 Met Ser Asn His Gln Ile Arg Ala Tyr Ala Ala Met Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gln Val Val Pro Tyr Gln Phe Asp Ala Gly Glu Leu Lys Ala His Gln 20 25 30 Val Glu Val Lys Val Glu Tyr Cys Gly Leu Cys His Ser Asp Leu Ser 35 40 45 Val Ile Asn Asn Glu Trp Gln Ser Ser Val Tyr Pro Ala Val Ala Gly 50 55 60 His Glu Ile Ile Gly Thr Ile Ile Ala Leu Gly Ser Glu Ala Lys Gly 65 70 75 80 Leu Lys Leu Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Glu Thr Cys 85 90 95 Gln Ala Cys Asp Pro Cys Ile Gly Gly Asn Gln Val Leu Cys Thr Gly 100 105 110 Glu Lys Lys Ala Thr Ile Ile Gly His Ala Gly Gly Phe Ala Asp Lys 115 120 125 Val Arg Ala Gly Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Asp Asp Leu Asp 130 135 140 Pro Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Leu Asp 145 150 155 160 Pro Leu Leu Lys His Lys Ile Gln Ala Thr His His Val Gly Val Ile 165 170 175 Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu Lys Ala Trp 180 185 190 Gly Cys Glu Ile Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Asp Lys Thr Glu Glu 195 200 205 Leu Lys Ala Asn Gly Ala Asp Gln Val Val Asn Ser Arg Asp Ala Gln 210 215 220 Ala Ile Lys Gly Thr Arg Trp Lys Leu Ile Ile Leu Ser Thr Ala Asn 225 230 235 240 Gly Thr Leu Asn Val Lys Ala Tyr Leu Asn Thr Leu Ala Pro Lys Gly 245 250 255 Ser Leu His Phe Leu Gly Val Thr Leu Glu Pro Ile Pro Val Ser Val 260 265 270 Gly Ala Ile Met Gly Gly Ala Lys Ser Val Thr Ser Ser Pro Thr Gly 275 280 285 Ser Pro Leu Ala Leu Arg Gln Leu Leu Gln Phe Ala Ala Arg Lys Asn 290 295 300 Ile Ala Pro Gln Val Glu Leu Phe Pro Met Ser Gln Leu Asn Glu Ala 305 310 315 320 Ile Glu Arg Leu His Ser Gly Gln Ala Arg Tyr Arg Ile Val Leu Lys 325 330 335 Ala Asp Phe Asp 340 <210> 53 <211> 314 <212> PRT <213> Acinetobacter baylyi <400> 53 Met Ala Thr Thr Asn Val Ile His Ala Tyr Ala Ala Met Gln Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Leu Val Pro Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Glu Leu Gln Pro His 20 25 30 Gln Val Glu Val Lys Val Glu Tyr Cys Gly Leu Cys His Ser Asp Val 35 40 45 Ser Val Leu Asn Asn Glu Trp His Ser Ser Val Tyr Pro Val Val Ala 50 55 60 Gly His Glu Val Ile Gly Thr Ile Thr Gln Leu Gly Ser Glu Ala Lys 65 70 75 80 Gly Leu Lys Ile Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Glu Ser 85 90 95 Cys Gln Ala Cys Asp Gln Cys Ile Ser Gly Gln Gln Val Leu Cys Thr 100 105 110 Gly Glu Asn Thr Ala Thr Ile Ile Gly His Ala Gly Gly Phe Ala Asp 115 120 125 Lys Val Arg Ala Gly Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Asp Glu Leu 130 135 140 Asp Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe 145 150 155 160 Asp Pro Ile Leu Lys His Gln Ile Gln Ala Ile His His Val Ala Val 165 170 175 Ile Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Met Ala Ile Lys Leu Leu Lys Ala 180 185 190 Trp Gly Cys Glu Ile Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Asn Lys Thr Asp 195 200 205 Glu Leu Lys Ala Met Gly Ala Asp His Val Val Asn Ser Arg Asp Asp 210 215 220 Ala Glu Ile Lys Ser Gln Gln Gly Lys Phe Asp Leu Leu Leu Ser Thr 225 230 235 240 Val Asn Val Pro Leu Asn Trp Asn Ala Tyr Leu Asn Thr Leu Ala Pro 245 250 255 Asn Gly Thr Phe His Phe Leu Gly Val Val Met Glu Pro Ile Pro Val 260 265 270 Pro Val Gly Ala Leu Leu Gly Gly Ala Lys Ser Leu Thr Ala Ser Pro 275 280 285 Thr Gly Ser Pro Ala Ala Leu Arg Lys Leu Leu Glu Phe Ala Ala Arg 290 295 300 Lys Asn Ile Ala Pro Gln Ile Glu Met Tyr 305 310 <210> 54 <211> 341 <212> PRT <213> Acinetobacter baylyi <400> 54 Met Ala Thr Thr Asn Val Ile His Ala Tyr Ala Ala Met Gln Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Leu Val Pro Tyr Ser Phe Asp Ala Gly Glu Leu Gln Pro His 20 25 30 Gln Val Glu Val Lys Val Glu Tyr Cys Gly Leu Cys His Ser Asp Val 35 40 45 Ser Val Leu Asn Asn Glu Trp His Ser Ser Val Tyr Pro Val Val Ala 50 55 60 Gly His Glu Val Ile Gly Thr Ile Thr Gln Leu Gly Ser Glu Ala Lys 65 70 75 80 Gly Leu Lys Ile Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Glu Ser 85 90 95 Cys Gln Ala Cys Asp Gln Cys Ile Ser Gly Gln Gln Val Leu Cys Thr 100 105 110 Gly Glu Asn Thr Ala Thr Ile Ile Gly His Ala Gly Gly Phe Ala Asp 115 120 125 Lys Val Arg Ala Gly Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Asp Glu Leu 130 135 140 Asp Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe 145 150 155 160 Asp Pro Ile Leu Lys His Gln Ile Gln Ala Ile His His Val Ala Val 165 170 175 Ile Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Met Ala Ile Lys Leu Leu Lys Ala 180 185 190 Trp Gly Cys Glu Ile Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Asn Lys Thr Asp 195 200 205 Glu Leu Lys Ala Met Gly Ala Asp His Val Val Asn Ser Arg Asp Asp 210 215 220 Ala Glu Ile Lys Ser Gln Gln Gly Lys Phe Asp Leu Leu Leu Ser Thr 225 230 235 240 Val Asn Val Pro Leu Asn Trp Asn Ala Tyr Leu Asn Thr Leu Ala Pro 245 250 255 Asn Gly Thr Phe His Phe Leu Gly Val Val Met Glu Pro Ile Pro Val 260 265 270 Pro Val Gly Ala Leu Leu Gly Gly Ala Lys Ser Leu Thr Ala Ser Pro 275 280 285 Thr Gly Ser Pro Ala Ala Leu Arg Lys Leu Leu Glu Phe Ala Ala Arg 290 295 300 Lys Asn Ile Ala Pro Gln Ile Glu Met Tyr Pro Met Ser Glu Leu Asn 305 310 315 320 Glu Ala Ile Glu Arg Leu His Ser Gly Gln Ala Arg Tyr Arg Ile Val 325 330 335 Leu Lys Ala Asp Phe 340 <210> 55 <211> 4805 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 55 tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag 60 gaacttcgaa ctgcaggtcg acggatcccc ggaatattta aatcatttgt actttttgaa 120 cagcagagtc gcattatggc caccgaagcc caggctgttg gacagaacgt agttgacttc 180 tgcattacgg ccctcgttag gaacgtaatc caggtcgcat tccggatccg cctctttgta 240 gccgatggtc ggcggaatga aaccctcttc aatagctttg gcacagataa tcgcttcgac 300 tgcaccgcca gcgcccagca ggtggccggt catgctcttg gtgctagaca ccggcacttt 360 gtaggcgtat tcacccagga ccgtcttgat cgcttgggtt tcgaagctgt cattgtacgc 420 cgtgctcgta ccgtgcgcgt tgatatagga aatgtcctct gggcggacat tatcttcttc 480 cattgccagt ttcattgcac gtgcaccacc ttcaccattc ggcgctgggc tcgtgatatg 540 atatgcgtcg caggtcgcac catagccaac gatctcggca tagattttgg caccacgctt 600 cagcgcgtgc tccaactctt ccaagataac gataccgctg ccctcgccca tcacaaaacc 660 gctgcgatcc ttatcgaacg ggatgctggc gcgcttcggg tcctcagatt tggtcacggc 720 cttcatcgag gcaaaacccg ccaggctcaa cggggtgata cctgcttcgc taccaccaga 780 gatcataacg tcgctataac caaacttaat gttacggaag gactcaccaa tgctgttgtt 840 cgcgctcgca catgcggtga caatggtcgt gcaaatacct ttagcgccat aacgaatcgc 900 cagattaccg cttgccatat tcgcaatgat catcggaata gtcatagggc tcacacgacc 960 cggacctttg gtaatcagct tttcatcctg cttctcaatg gtgccgatgc cgccaatgcc 1020 gctaccaaca atgacgccga aacgattctt atcaatcgac tccaggtcca gtttgctgtc 1080 cttgattgcc tcatccgccg caacgatcgc aaactggcta aaacggtcca tacggttcgc 1140 ctcacgcttg tcgataaagt cctccggggt gaagtccttc acttcggcag ccagcttaac 1200 tttgaaatcg gttgcgtcaa acgctttgat cttgtcaatg ccacatttac cctctttgat 1260 gctgcaccag aagctatcag cgttgttacc caccggcgtc actgcaccaa tacccgtaat 1320 gacaacgcgg cgattcattt tgttgcctcc ttttagaacg cggaagtatc ctggaacaaa 1380 ccgactttca aatcgtgtgc ggtatagatc aggcgaccat ccaccagaac ctcaccgtcc 1440 gccaggccca tgatcaggcg acggtttacg atacgtttga aatgaatacg ataggtgact 1500 ttcctggctg tcggcagaac ctggccggta aatttcactt cgcccacgcc cagagcgcgg 1560 cctttgcctt cgccgcccaa ccagcccagg tagaatccca ccaattgcca catagcatcc 1620 agacccagac aaccgggcat caccggatcg ccgataaagt ggcatccgaa gaaccataga 1680 tccggattga tatccagctc ggcttcgaca tagcctttgt cgaaattgcc gcccgtttcg 1740 gtcatcttaa cgacgcggtc catcatcagc atgttcggtg cagggagttg cggcccttta 1800 gcgccaaaca gttcaccacg accagaggca agaaggtctt cttttgtata ggattcgcgt 1860 ttatctacca tgttttatgt aaaccttaaa attaaaccat gtacattccg ccgttgacgt 1920 gcagagtctc accagtgatg taactcgctt cgtcagaggc taaaaatgca accgcactgg 1980 cgatttcctg agcgccgccg aggcgacccg caggcacctg cgccaggata cccgcacgct 2040 gatcgtcaga cagcgcacgc gtcatgtccg tttcaataaa acccggagcc acaacattga 2100 cagtaatacc acgggacgca acttcacgcg ccagtgattt actgaaaccg atcaggcccg 2160 ctttcgccgc agcgtagttt gcctgacctg catttcccat ggtaccaacc acagaaccaa 2220 tagtgataat gcgaccacaa cgctttttca tcatagcgcg cattaccgct tttgacaggc 2280 ggaaaacgga tgataagttg gtttcgataa tatcgttcca ctcatcatct ttcattcgca 2340 tcaacagatt atcacgagtg ataccggcat tattaaccag gatatccact tcaccaaatt 2400 ctgcgcgaat attttccaga acagattcaa tagatgcagg atcggtcaca ttcaacatca 2460 aacctttccc gttagcacct aaatagtcgc taatgttctt cgcaccattt tcactggtcg 2520 cagtcccgat aactttcgcg ccgcgggcaa cgagagtctc tgcaattgcg cggcctatgc 2580 cacggcttgc accagtcacc agcgcaatct ttccttcaaa gctcatggtt ttcctctttt 2640 attgcgtaag tgccgcagac agcgccgccg gctcgttcag cgccgacgct gtcagggtgt 2700 cgacaatacg tttcgtcaga ccagtgagga ctttacctgg acccacttca taaagatgtt 2760 caacgccctg cgccgcgata aattccacgc tcttcgtcca ctgtaccgga ttgtacaact 2820 ggcgaaccag cgcatcgcgg atagcggcgg catcggtttc acatttcacg tcaacgttgt 2880 tcactaccgg caccgttggc gcgctaaagg taattttggc taattcaacc gccagcttat 2940 ctgccgctgg tttcatcagc gcgcagtgcg acggtacgct caccggcagc ggcagcgcgc 3000 gtttcgcgcc agcggcttta caggctgcgc ccgcacgttc taccgcctct ttatgcccgg 3060 cgataaccac ctgtcccggc gagttaaagt taaccggcga aacaacctgc ccttcggcag 3120 attcttcaca ggctttagca atagaggcat catccagccc gatgatcgca gacatgccgc 3180 cagtgccttc cggaaccgct tcctgcatga atttaccgcg catttccacc agacgaacgg 3240 catcagcaaa gttgatgacg ccagcgcaaa ccagcgcgga atattcgccc aggctgtgac 3300 ctgccattaa cgcaggcatt ttaccgccct gctgctgcca aacgcgccaa agcgcgacgg 3360 aagcggttaa taacgccggc tgcgtctgcc aggttttatt cagttcttcc gctggacctt 3420 gctgggtgag cgcccacaga tcatatccca gagccgcaga agcttcagca aacgtttctt 3480 ctacgatagg gtaatttgcc gccatctcgg ccaacatccc aacgctctga gaaccctgac 3540 cggggaacac aaatgcaaat tgcgtcatgt ttaaatcctt atactagaaa cgaatcagcg 3600 cggagcccca ggtgaatcca cccccgaagg cttcaagcaa taccagctga ccggctttaa 3660 ttcgcccgtc acgcacggct tcatccagcg cgcacggcac agaagccgcg gaggtattgc 3720 cgtgcctgtc cagcgtgacg acgacattgt ccatcgacat gccgagtttt ttcgctgtcg 3780 cgctaatgat acgcaggtta gcctgatgcg gcaccagcca atcgagttct gagcgatcca 3840 ggttattagc cgccagcgtc tcatcgacaa tatgcgccag ttcagtgacc gccactttaa 3900 agacttcatt gcccgccatt gtcaggtaaa tcgggttatc cggatttacg cgatcggcat 3960 tcggcagggt cagtaattca ccgtaacggc catcggcatg aagatgagtg gagataatac 4020 ccggttcttc agaagcgctc agtacggccg cgcctgcgcc atcgccgaaa ataatgatcg 4080 taccgcgatc gccaggatcg caagtgcggg ctaatacatc ggaaccgacc accagcgcgt 4140 gtttaaccgc gccggattta acgtactggt cggcgatgct taacgcgtag gtgaaacctg 4200 cgcacgctgc cgcgacatca aacgccgggc aacctttaat accgagcata ctttgaatct 4260 gacatgccgc gcttggaaat gcatgcgttg ctgatgtggt agccaccaca atcaagccaa 4320 tttggtcttt atcgatcccc gccatctcaa tcgcgcgatt cgcagcggta aagcccatcg 4380 tcgcgacagt ttcattcggc gcggcgatat ggcgtttacg aatacctgta cgagtgacaa 4440 tccactcgtc agaggtctca accatttttt ccagatcggc gttagtccgc acttgttcgg 4500 gcagatagct gccagtacca ataatcttcg tatacatgta cgctcagtca ctaaattact 4560 cgatatcaat cacatcaaat tcgacttctg gattgacgtc agcatcgtaa tcaatgcctt 4620 caatgccaaa gccaaacagc ttgatgaact cttctttgta catgtcgtaa tcggtcagct 4680 cacgcaggtt ctctgtggtg atttgtggcc acagatcacg gcagtgctgc tgaatgtcat 4740 cacgcagttc ccagtcatcc aaacgcagac gattgtgatc atccacttcc ggcgctgaac 4800 catct 4805 <210> 56 <211> 239 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 56 Met Val Ile Lys Ala Gln Ser Pro Ala Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Ile 1 5 10 15 Ile Glu Ser Ile Trp Asn Asn Arg Phe Pro Pro Gly Thr Ile Leu Pro 20 25 30 Ala Glu Arg Glu Leu Ser Glu Leu Ile Gly Val Thr Arg Thr Thr Leu 35 40 45 Arg Glu Val Leu Gln Arg Leu Ala Arg Asp Gly Trp Leu Thr Ile Gln 50 55 60 His Gly Lys Pro Thr Lys Val Asn Asn Phe Trp Glu Thr Ser Gly Leu 65 70 75 80 Asn Ile Leu Glu Thr Leu Ala Arg Leu Asp His Glu Ser Val Pro Gln 85 90 95 Leu Ile Asp Asn Leu Leu Ser Val Arg Thr Asn Ile Ser Thr Ile Phe 100 105 110 Ile Arg Thr Ala Phe Arg Gln His Pro Asp Lys Ala Gln Glu Val Leu 115 120 125 Ala Thr Ala Asn Glu Val Ala Asp His Ala Asp Ala Phe Ala Glu Leu 130 135 140 Asp Tyr Asn Ile Phe Arg Gly Leu Ala Phe Ala Ser Gly Asn Pro Ile 145 150 155 160 Tyr Gly Leu Ile Leu Asn Gly Met Lys Gly Leu Tyr Thr Arg Ile Gly 165 170 175 Arg His Tyr Phe Ala Asn Pro Glu Ala Arg Ser Leu Ala Leu Gly Phe 180 185 190 Tyr His Lys Leu Ser Ala Leu Cys Ser Glu Gly Ala His Asp Gln Val 195 200 205 Tyr Glu Thr Val Arg Arg Tyr Gly His Glu Ser Gly Glu Ile Trp His 210 215 220 Arg Met Gln Lys Asn Leu Pro Gly Asp Leu Ala Ile Gln Gly Arg 225 230 235 <210> 57 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 57 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Met Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Cys 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Ala Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 58 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 58 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Leu Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 59 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 59 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ala Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Leu Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 60 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 60 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Leu Val Trp Arg Arg Leu Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 61 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 61 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ala Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Met Gly Tyr Val Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Thr Leu Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 62 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 62 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Met Gly Tyr Pro Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Met 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 63 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 63 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ala Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Leu Val Trp Arg Arg Met Gly Tyr Val Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 64 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 64 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Trp Arg Arg Met Gly Tyr Glu Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Gly 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Lys Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Leu Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 65 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 65 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Glu Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 66 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 66 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Pro 340 345 <210> 67 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 67 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Val Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 68 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 68 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Arg Val 340 345 <210> 69 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 69 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Ser Ala Val 340 345 <210> 70 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 70 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Gly 340 345 <210> 71 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 71 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Asp Ala Val 340 345 <210> 72 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 72 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Val Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 73 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 73 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Thr Ala Val 340 345 <210> 74 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 74 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Gly 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 75 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 75 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Ala Ala Val 340 345 <210> 76 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 76 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys Pro Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 77 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 77 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Glu Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 78 <211> 345 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 78 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu 340 345

Claims (15)

1. 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성(sequence identity)을 포함하는 변이 아실-ACP 레덕타아제(AAR) 폴리펩티드로, 상기 변이 AAR 폴리펩티드는 Q40V, G52V, D61E, G273E, K303G, H340P, L344A, L344D, L344S, L344T, A345R, V346P, V346G, 및 A345와 V346 모두의 결실에 대응되는 절두(truncation)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 변이 AAR 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   재조합 숙주 세포에서의 상기 변이 AAR 폴리펩티드의 발현은 대응하는 야생형 숙주 세포에서 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 야생형 AAR 폴리펩티드의 발현에 의해 생성된 조성물에 비해 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가 또는 C14 지방족 알코올 조성물의 더 높은 역가를 유도하는, 변이 AAR 폴리펩티드.
3. 제1항의 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 숙주 세포.
4. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 숙주 세포는, 변이 AAR 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원을 함유한 배지에서 배양될 때, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 대응하는 야생형 AAR 폴리펩티드를 발현시키는 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알데히드 또는 알코올 조성물의 역가보다 적어도 10 % 더 큰, 적어도 15 % 더 큰, 적어도 20 % 더 큰, 적어도 25 % 더 큰, 또는 적어도 30 % 더 큰 역가를 갖는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 조성물을 생성하는, 재조합 숙주 세포.
5. 제4항에 있어서,
   상기 지방족 알코올 조성물은 30 g/L 내지 250 g/L의 역가에서 생성되는, 재조합 숙주 세포.
6. 제5항에 있어서,
   상기 지방족 알코올 조성물은 세포외에서(extracellularly) 생성되는, 재조합 숙주 세포.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 지방족 알코올 조성물은 C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 및 C18 지방족 알코올 중 하나 이상을 포함하는, 세포 배양물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 지방족 알코올 조성물은 불포화 지방족 알코올을 포함하는, 세포 배양물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 지방족 알코올 조성물은 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1, 또는 C18:1 불포화 지방족 알코올 중 하나 이상을 포함하는, 세포 배양물.
11. 제9항에 있어서,
    상기 불포화 지방족 알코올은 지방족 알코올의 환원 말단으로부터 C₇과 C₈ 사이의 탄소 사슬의 위치 7에서 이중 결합을 갖는, 세포 배양물.
12. 제8항에 있어서,
    상기 지방족 알코올 조성물은 포화 지방족 알코올을 포함하는, 세포 배양물.
13. 역가의 증가를 갖는 지방족 알코올 조성물을 생성하는 방법에 있어서,
    탄소원과 함께 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방족 알코올 조성물 생성 방법.
14. 제13항에 있어서,
    지방족 알코올 조성물을 수득(harvest)하는 단계를 더 포함하는, 지방족 알코올 조성물 생성 방법.
15. 제13항에 있어서,
    지방족 알코올의 역가는 야생형 AAR-발현 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 알코올 조성물의 역가보다 적어도 20 % 내지 30 % 더 큰, 지방족 알코올 조성물 생성 방법.

Images