KR102232216B1 - 의이인 유래 정유를 함유하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의이인 유래 정유의 탈모 예방 또는 발모 촉진 용도에 관한 것으로, 본 발명의 의이인 유래 정유는 모유두 세포에서 우수한 모발 성장 효과를 나타냈으므로, 본 발명의 의이인 유래 정유는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 탈모 예방 또는 발모 촉진용 식품 조성물로 유용할 수 있다.

Description

의이인 유래 정유를 함유하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss or promoting hair growth containing essential oil derived from Coicis semen}

본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

모발은 모근과 모간으로 나뉘며, 모근을 둘러싸고 있는 모낭에서 모발이 생장한다. 모낭에서 생물학적 특성을 조절하는 두 가지 중요한 요소는 모낭상피인 외측모근초 세포 (ORS)와 중간엽 유래의 모유두 (DP)이며, 모주기의 반복을 통하여 모발이 성장하고 탈락하게 된다. 모발은 크게 성장기(anagen), 퇴화기(catagen), 휴지기(telogen)의 3단계를 거치며, 각질층에서 모발은 각각 표피와 모낭의 증식 및 분화를 통하여 만들어지고 탈락되는데 모낭 하부의 결직초 (DP)에는 중간엽 유래의 전이증폭세포가 존재하여 성장기 모낭의 모유두를 유지하는 역할을 한다고 알려져 있다. 다양한 호르몬(testosterone), 사이토카인(cytokines) 및 성장인자(growth factors)가 모발 형태 발생과 모발 성장 조절에 관여한다고 알려져 있다. 모낭의 수와 크기의 증가는 성장기에 관찰되었는데, 휴지기의 모낭은 진피층(dermis)에 위치하는 것과 달리 성장기에는 모낭이 깊은 피하조직(subcutis)에 위치하므로 모낭의 수와 크기의 증가는 성장기와 밀접하게 연관되어 있다.

모발은 외모의 한 부분으로서 대외적인 이미지 개선에 있어 중요한 역할을 하기 때문에, 최근 발모, 양모 및 탈모예방에 대한 연구의 중요성이 높아지고 있는 추세이다. 특히, 생활패턴이 서구화되면서 삶의 질이 개선되고 스트레스가 증가하면서 탈모와 두피질환 등의 고민이 모든 사람의 관심사로 확대되고 있고, 그 원인도 단순한 유전적 요인과 후천적인 요인이 있으며, 이에 대한 중요성과 관심이 점차 커지고 있다. 탈모는 심리적인 위축감 등을 초래하여 대인관계 기피증과 자신감 상실 등으로 이어질 수 있기 때문에 개인의 윤택한 삶 유지에도 많은 영향을 미칠 수 있어 탈모산업 시장은 지속적으로 급성장하고 있는 추세이다.

현재 미국 식품의약품안전청(FDA)으로부터 승인을 받은 대표적인 탈모치료제로는 합성의약품으로 도포용 미녹시딜과 경구용 프로페시아가 있는데, 이들은 몇 가지 부작용들이 지속적으로 보고되고 있다. 프로페시아는 남성호르몬 (testosterone)에서 탈모의 원인물질인 dihydrotestosterone(DHT)으로 변환되는 과정을 억제하여 효과를 나타내지만 남성의 성욕을 감소시킬 수 있다는 문제가 제기되고 있으며 미녹시딜은 고혈압 치료제로 개발되다가 모낭 활성을 통한 모발 성장 촉진이 보고되면서 양모제로 개발되었지만 다양한 피부질환 등의 부작용이 보고되고 있다.

지금까지 연구된 모발성장에 유용한 천연물에는 콩(Glycine linne, isoflavone), 생강 (Zingiber officinale, 6-gingerol), 고추 (Capsicum annuum), 알로에 (Aloe arborescens), 감초 (Glycyrrhiza glabra), 차나무(Camellia sinensis), 은행나무(Ginkgo biloba), 아보카도(Persea americana), 백하수오(Polygonum multiflorum) 등이 보고되어 있다.

기존에 알려진 천연물 선행특허들을 살펴보면, 대한민국 공개특허 10-2014-0115400에서는 붉나무 추출물의 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 개시하고 있다. 또한, 대한민국 공개특허 10-2016-0069488에서는 봉독을 발모 촉진 및 탈모 방지에 이용하는 내용을 개시하고 있다.

그러나, 이와 같은 천연물을 활용하려는 노력에도 불구하고 의약품 대비 낮은 활성으로 인해 발모촉진제 또는 탈모억제제의 상용화는 아직 미미한 수준이다.

이에, 본 발명자들은 탈모 방지 및 발모 촉진을 위한 효과적인 천연 유래 발모제를 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, 의이인 유래 정유가 모유두 세포에서 모발 성장 효과가 우수함을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2014-0115400호 한국공개특허 제10-2016-0069488호

본 발명의 목적은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

더 나아가 본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 의이인 유래 정유는 모유두 세포에서 우수한 모발 성장 효과를 나타내므로, 본 발명의 의이인 유래 정유는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 탈모 예방 또는 발모 촉진용 식품 조성물로 유용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 의이인 유래 정유의 처리 농도별 Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포)에서의 성장효과에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 의이인 유래 정유가 Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포)의 세포 주기에 미치는 영향을 sub G1 phase 및 G1 phase로의 진행과정을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 의이인 유래 정유가 Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포)의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 의이인 유래 정유는 의이인을 헥산(hexane)으로 추출하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 상기 의이인 유래 정유는 다른 종류의 용매를 이용하여 추출된 추출물보다 높은 모유두세포 증식율을 나타내며, 즉, 우수한 모발 성장 효과를 갖는다(실험예 1 참조).

본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 추출 대상을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 의이인 유래 정유는 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 탈모 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 탈모 진행이 지연 또는 멈춰 탈모 증세를 호전시키거나, 모발이 길어지거나 수가 많아지는 등의 발모 및 육모가 촉진되는 등의 탈모 증세를 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형, 액상, 크림상, 로션상, 페이스트상 또는 고체상의 경피 국소 도포형 제형(피부 외용제), 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다. 바람직하게는 피부 외용제 형태인 것일 수 있다. 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭으로서 다양한 제형의 의약품 및 화장품이 여기에 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 경피, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물

본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 상술한 본 발명의 유효성분의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어팩, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태의 모발 또는 두피용 화장료인 것일 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 유효성분의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 본 발명에 따른 정유를 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 상기 함량을 만족하는 경우 부작용없이 우수한 효능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 의이인 유래 정유 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

탈모 예방 또는 발모 촉진용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물

본 발명은 의이인 유래 정유를 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 탈모방지제 또는 발모제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다. 예를들어, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것일 수 있고, 상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품 조성물 또는 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 의이인 유래 정유를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품 또는 건강식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강기능식품 또는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 의이인 유래 정유를 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 정유를 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 의이인 유래 정유는 천연 식물을 원료로 하므로 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물, 건강기능식품 및 건강식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 의이인 유래 정유의 제조

의이인 건조물((사)한국생약협회, 서울) 500g에 추출용매로서 헥산(hexane) 5L를 가하여 상온에서 24시간동안 침출시켰고, 추출액은 여과지(Advantec No.2)로 여과하여 여액을 회수한 후, 걸러진 추재에 다시 동량의 용매를 가하여 총 3회 반복 추출하였다. 상기 회수된 여액을 감압농축하여 용매를 제거하여 의이인의 정유 성분이 다량 함유된 추출물(의이인 유래 정유, 수율 5.79%, 건조물 기준)을 수득하였다.

수득된 상기 추출물에 함유된 정유 성분에 대한 HPLC 분석 결과는 하기 표 1과 같다. 실시예 1에 따른 의이인 추출물은 오일릭한 상태이며, 하기와 표 1과 같이, 정유 성분을 다량 함유하고 있으므로, 본 발명에서는 상기 추출물을 '의이인 유래 정유'라 표기하였다.

RT (min)	Area (%)	Compound name
8.082	1.85	D-Limonene
9.48	8.28	gamma-Terponene
10.415	4.45	o-Cymene
18.13	19.25	Cyclohexanone
18.404	22.51	Ylangene
23.276	9.04	Caryophyllene
50.365	25.84	beta-Asarone

<비교예 1> 의이인 에틸아세테이트 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc)를 추출용매로 사용하여 비교예 1의 의이인 에틸아세테이트 추출물을 제조하였다.

<비교예 2> 의이인 부틸렌 글리콜 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 10% 1,3-부틸렌 글리콜 수용액을 추출용매로 사용하여 비교예 2의 의이인 부틸렌 글리콜 추출물을 제조하였다.

<비교예 3> 의이인 95% 에탄올 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 95% 에탄올을 추출용매로 사용하여 비교예 3의 의이인 95%에탄올 추출물을 제조하였다.

<비교예 4> 의이인 50% 에탄올 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 30% 에탄올을 추출용매로 사용하여 비교예 4의 의이인 50%에탄올 추출물을 제조하였다.

<비교예 5> 의이인 메탄올 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 100% 메탄올을 추출용매로 사용하여 비교예 5의 의이인 메탄올 추출물을 제조하였다.

<비교예 6> 의이인 물 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 헥산 대신 물을 추출용매로 사용하여 100℃에서 2시간 동안 가열하면서 추출하여, 비교예 6의 의이인 물 추출물을 제조하였다.

<비교예 7> 의이인 수증기증류 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 의이인 건조물에 대하여 수증기증류법을 이용하여 정유 성분을 추출하여, 비교예 7의 수증기증류 추출물(수율 0.01%, 건조물 기준)을 수득하였다.

수득된 의이인 수증기증류 추출물에 함유된 정유 성분에 대한 HPLC 분석 결과는 하기 표 2와 같다.

RT (min)	Area (%)	Compound name
7.817	2.25	Alpha-Pinene
8.082	19.36	D-Limonene
8.880	4.46	Hexanal
10.415	2.56	o-Cymene
10.786	3.69	2-Heptanone

< 실험예 1> 의이인 유래 정유의 모발 성장 촉진 효능 분석

상기 실시예 1의 의이인 유래 정유 및 비교예 1 내지 7의 용매별 의이인 추출물에 대하여 세포 증식을 통한 모발 성장 효능을 확인하였다.

Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포, DP cell)은 세포바이오에서 구매하여 사용하였고, 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin을 첨가한 Low glucose DMEM 배지를 배양액으로 37℃, CO₂ incubator에서 배양하였다.

상기 DP cell 현탁액을 적당한 농도로 96-well plate에 가한 다음 배양기에서 24시간 안정화시킨 후 추출 용매를 달리한 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6의 의이인 추출물 또는 양성대조군인 minoxidil(MNXD) 각각을 농도별로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 media를 제거하고 PBS로 washing 하였다. 1 ㎎/㎖의 농도로 PBS에 녹인 MTT 용액을 100 ㎕씩 분주하여 37℃의 incubator에서 4시간 배양한 다음, 상층액을 제거하고 200 ㎕ DMSO를 넣어 완전히 formazan을 용해시킨 후 ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 OD값을 측정하여 도 1에 나타내었다.

실험성적의 통계적 유의성은 평균±표준편차로 표기하였고, 각 군간의 차이는 SPSS 25(SPSS Inc. USA)프로그램을 사용하였으며, ANOVA, Duncan 검정으로 사후 검정을 실시하여 유의성을 분석하였다. P<0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 정상군과의 통계학적 유의성을 도면에 표기하였다. 각각의 실험은 모두 적어도 3번 이상 실시하여 통계처리하였다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 의이인 유래 정유의 처리 농도별 Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포)에서의 성장효과에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

	DMSO	실시예 1 (정유 추출물)	비교예 1 (EtOAc 추출물)	비교예 2 (부틸렌글리콜 추출물)	비교예 3 (95% 에탄올 추출물)	비교예 4 (30% 에탄올 추출물)	비교예 5 (메탄올 추출물	비교예 6 (물 추출물)	비교예 7 (수증기증류 추출물)
0.05mg/ml	100.00	143.58	100.12	100.13	100.11	100.03	100.08	100.02	100.02
1mg/ml		144.14	104.79	101.24	102.02	101.95	102.64	101.82	107.82
2mg/ml		145.41	105.26	103.57	103.44	102.75	104.03	102.98	110.98

실험결과, 도 1에서 나타나는 바와 같이 100.00±0.00%인 control군과 107.05±1.02%인 minoxidil(MNXD, 10μM)군에 비해 실시예 1의 의이인 유래 정유 처리군은 농도별로 123.97±1.17, 135.39±8.28, 131.51±4.03, 130.52±7.40, 134.10±30.04, 143.58±14.11, 144.14±5.98, 145.41±0.03%로 증가함을 보였으며, 특히 0.05mg/ml 이상의 농도에서는 유의하게 증가하는 것으로 보아 의이인이 모발 성장을 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

또한, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 다른 종류의 추출용매를 이용하여 수득된 비교예 1 내지 7의 의이인 추출물 대비 실시예 1의 의이인 유래 정유 처리시 높은 모발 성장률을 나타내는 것을 확인하였다.

< 실험예 2> 의이인 유래 정유가 모유두 세포의 세포 주기에 미치는 영향 분석

G0/G1, S및 G2/M phase로의 cell cycle의 진행과정은 포유류 세포 증식의 주요과정이므로 의이인 추출물이 DP cell의 증식으로 cell cycle의 진행을 유도하는지 알아보기 위해 DNA에 결합하는 형광물질인 PI를 처리하여 Flow Cytometer로 각 세포주기 phase상의 세포 수를 측정하였다. 대조군으로는 추출물 대신 DMSO를 처리하였다.

실험결과, 도 2에서 나타나는 바와 같이 실시예 1의 의이인 유래 정유의 처리시 Sub G1 phase에서 0.1 및 0.2㎎/㎖의 농도에서 각각 3.16±0.56 및 4.77±0.07%으로 측정되는 것으로 보아 12.92±2.99%인 대조군에 비하여 유의하게 낮은 apoptosis가 발생하는 것을 확인하였다. 또한 G1 phase가 73.03±7.73%인 대조군에 비하여 각각 81.60±2.70 및 83.95±3.05%로 높게 측정되어 모발의 성장기를 유지하는 데 더 도움이 된다는 것을 확인하였다.

< 실험예 3> 의이인 유래 정유가 모유두 세포의 단백질 발현에 미치는 영향 분석

DP cell은 발생학적으로 간엽계에서 유래된 세포로 주위의 상피계 세포의 분열을 조절하는 능력이 있으며, 이러한 기능은 성장인자에 의해 조절된다고 알려져 있다. 현재까지 모낭에서 발현되는 것으로 보고된 성장인자로는 insulin like growth factor 1 (IGF1), vascular endothelial growth factor (VEGF) 등이 있다.

또한, 진피 모유두 세포 내 Wnt/β-catenin 기반 신호가 모낭세포와 상피세포간의 상호작용에 중요하다고 보고되고 있다. 이러한 Wnt/β-catenin 신호전달체계는 모낭 형성 및 재생에 중요하게 관여된다. 따라서 의이인 유래 정유에 대하여 단백질 발현을 통한 모발 성장 효능을 확인하였다.

상기 실시예 1의 의이인 유래 정유을 0.05, 0.1 및 0.2 mg/mL의 농도로 48h 동안 처리한 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 세척하였다. Radio-immunoprecipitation assay(RIPA) buffer 10 ml에 protase & phosphatase inhibitor 1 tab을 가한 lysis buffer로 용해하여 4℃ 13,200rpm에서 20분 간 원심분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액을 Bradford법으로 단백질을 정량 한 후 12% SDS-PAGE gel에서 전기 영동하여 크기별로 단백질을 분리한 후 전기적인 방법을 이용하여 PVDF membrane으로 분리된 단백질을 옮겼다. PVDF membrane은 5% skim milk 용액으로 1시간 동안 blocking 한 뒤 1차 항체를 1:1,000 또는 1:250으로 희석하여 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 이 후 1x PBST로 10분씩 3회 세척하고, 2차 항체를 실온에서 1:1,000으로 희석하여 1시간 반응시켰다. 이후 1x PBST로 10분씩 3번 세척하고 ECL substrate와 반응시킨 후 Image 분석기 (Gel Documentation system, UVP, USA)를 이용하여 각 factor의 발현을 조사하였다.

도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 의이인 유래 정유가 Human hair follicle dermal papilla cell(모유두세포)의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

실험 결과, 도 3에서 나타나는 바와 같이 wnt의 발현양은 control군과 양성대조군인 minoxidil(MNXD, 10μM)군에 비하여 높게 발현되었으며 IGF-1은 농도의존적으로 증가하였으며 0.1 및 0.2mg/ml의 농도에서 control군에 비해 발현양이 증가하였다. 또한, IGF-1의 하위인자인 Akt, Erk의 발현도를 확인한 결과 0.1 및 0.2 mg/ml 농도에서 control군에 비하여 증가함을 나타냈다. 따라서 모발 성장에 영향을 미치는 단백질 발현량이 증가함에 따라, 실시예 1의 방법으로 제조된 의이인 유래 정유가 우수한 모발 성장 효과를 갖는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 인비트로(in vitro)에서, 모유두 세포에 헥산으로 추출한 의이인 유래 정유를 처리하여 모유두 세포 주기의 Sub G1 phase에서 세포사멸을 감소시키는 방법.
   
2. 인비트로(in vitro)에서, 모유두 세포에 헥산으로 추출한 의이인 유래 정유를 처리하여 IGF-1(insulin like growth factor 1) 발현을 증가시키는 방법.
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