KR102092171B1

KR102092171B1 - 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 파이토크롬 b 단백질 변이체 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102092171B1
Application number: KR1020190142352A
Authority: KR
Inventors: 박연일; 전진
Original assignee: 충남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2020-03-23

Abstract

본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하면 고온 조건에서 열 형태 형성이 조절된 식물체의 개발이 가능할 것으로 사료된다.

Description

식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 파이토크롬 B 단백질 변이체 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vector comprising promoter of specifically expressed gene in plant epidermis cell and phytochrome B protein variant and uses thereof}

본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 파이토크롬 B 단백질 변이체 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 점점 기온이 상승하는 추세가 이어지고 있으며, 21세기에 0.8~4.8℃의 기온 상승이 있을 것으로 전망하고 있다. 이러한 기후 변화에 따라 몇몇 식물종들이 특정 환경에서 개화기 적응에 실패하면서 멸종되거나 고도와 위도가 높은 지역으로 점점 이동하는 경향을 보이고 있음이 보고된 바 있으며, 이를 통해 기후 변화가 식물 분포, 식물 성장 및 작물 생산량에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상하고 있다. 식물은 이러한 고온 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 이를 열 형태 형성(thermomorphogenesis)이라 하며 하배축(hypocotyl) 또는 잎자루(petiole)의 부분 성장은 이러한 현상의 대표적인 특징으로 지열로부터 멀어지고 공기와의 접촉을 늘림으로써 잎의 온도를 상대적으로 떨어뜨려주는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 열 형태 형성으로 인한 식물체의 웃자람 현상으로 인한 식물 쓰러짐과 작물 수율의 감소는 새로운 문제점으로 부상되고 있다.

최근 들어 온도에 따라 식물의 성장을 조절하는 주요 온도센서로 식물 광수용체인 '파이토크롬 B(phytochrome B)'와 전사활성화인자인 '에메라(HEMERA)'가 알려져 있다. 파이토크롬 B는 빛을 인지하여 식물의 발아 및 개화 등을 조절하는 광수용체로 파이토크롬 상호작용 인자(phytochrome interacting factor, PIF) 단백질의 기능을 억제하여 하단부 신호전달 경로를 변화시켜 식물 생장과 발달을 조절하는 역할을 한다.

한편, 한국등록특허 제0783652호에 귀리 유래 돌연변이 파이토크롬 A 유전자(S598A)를 이용한 '음지내성 형질전환 고구마 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1669484호에는 음지 내성을 증가시키는 '세균 유래 자색/오렌지색 광호변성 피토크롬 TpR0787 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 파이토크롬 B 단백질 변이체 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 코딩 유전자에 돌연변이가 발생하여 야생형에 비해 웃자란 phyB9 돌연변이 식물체와; 파이토크롬 B 단백질의 아미노산 서열에서 515번째 아미노산이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된 파이토크롬 B 단백질 변이체(PHYB G515E) 코딩 유전자를 phyB9 돌연변이 식물체에 과발현시킨 식물체(CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 )를 고온에서 생장시킨 결과, CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 식물체의 하배축 및 잎자루 길이가 phyB9 식물체 뿐만 아니라 야생형 식물체 보다 현저히 감소한 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 왁스 생합성에 필수적인 3-ketoacyl-CoA synthase 6를 코딩하는 표피 특이적 CER6 유래의 프로모터; 및 PHYB G515E 코딩 서열이 연결된 재조합 벡터를 phyB9에 형질전환시키고 고온에서 생장시킨 결과, 본 발명의 CER6p:PHYB G515E _phyB9 형질전환식물체의 잎 크기는 모든 조건에서 CsVMVp:PHYB G515E _phyB9 식물체에 비해 왜소성이 감소하고 고온 조건에서는 오히려 야생형, phyb9 및 CsVMVp:PHYB G515E _phyB9 식물체에 비해 잎 크기가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 하배축 및 잎자루 길이가 고온 조건에서 phyb9에 비해 확연히 낮은 수준으로 유지되어 고온에서 열 형태 형성으로 인한 식물체의 웃자람 현상이 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 고온에서 식물체의 열 형태 형성(thermomorphogenesis)을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 고온에서 열 형태 형성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 열 형태 형성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 열 형태 형성을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터와 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열이 연결된 재조합 벡터를 사용하여 고온에서 열 형태형성을 조절할 수 있는 식물체의 제조가 가능하므로, 기후 변화에 의한 식물의 생산성 문제를 해결하기 위한 작물의 개발에 유용하게 활용될 것이다.

도 1은 식물 큐티클(cuticle)층의 왁스 생합성(wax biosynthesis)을 조절하는 애기장대 유래 CER6 유전자(3-ketoacyl-CoA synthase 6)의 프로모터; 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 515번째 아미노산 글린신(Glycine, G)이 글루탐산(Glutamic acid, E)으로 치환된 파이토크롬 B 단백질 변이체(PHYB G515E) 코딩 서열;이 연결된 재조합 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 2는 야생형 애기장대 식물체(Col-O), 파이토크롬 B 돌연변이체(phyb9), phyb9의 유전적 배경에 PHYB G515E를 과발현시킨 형질전환체(CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 ) 및 phyb9의 유전적 배경에 CER6 유전자의 프로모터에 의해 파이토크롬 B 변이체의 발현량이 조절되는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체(CER6p:PHYB G515E _phyb9 )를 대상으로 RT-PCR(A) 및 웨스턴 블롯(B)을 수행한 결과이다.
도 3은 야생형 애기장대 식물체(Col-O), 파이토크롬 B 돌연변이체(phyb9), phyb9의 유전적 배경에 PHYB G515E를 과발현시킨 형질전환체(CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 ) 및 phyb9의 유전적 배경에 CER6 유전자의 프로모터에 의해 파이토크롬 B 변이체의 발현량이 조절되는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체(CER6p:PHYB G515E _phyb9 )를 배양하여 표현형을 확인한 결과로, A 및 B는 식물체를 각각 22℃(일반 온도) 및 28℃(고온)에서 배양한 사진이고, C 내지 F는 일반 온도 및 고온에서 배양된 식물체 잎의 단축 길이(short length), 장축 길이(long length), 하배축 길이(hypocotyl length), 잎자루 길이(petiole length)를 측정하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터는 바람직하게는 식물 큐티클(cuticle)층의 왁스 생합성(wax biosynthesis)을 조절하는 애기장대 유래 CER6 유전자(3-ketoacyl-CoA synthase 6; AT1G68530)의 프로모터이다.

본 발명의 CER6 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체의 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 CER6 유전자의 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 515번째 아미노산 글린신(Glycine, G)이 글루탐산(Glutamic acid, E)으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등 으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 합성(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "파이토크롬(phytochrome)"은 식물의 적색광 광수용체로, 빛을 흡수하여 흡수 스펙트럼의 형태가 가역적으로 변하는 식물체 내의 색소 단백질로서 균류 이외의 모든 식물에 들어 있는 단백질이다. 피토크롬은 간혹 근적외선에 활성을 띠기도 하나 대부분의 경우 적색광에 의해 활성을 띠고 식물 유전자 발현 조절, 종자 발아 유도, 음지회피 반응 등을 매개하는 것으로 알려져 있다. 피토크롬은 2개의 뚜렷한 스펙트럼의 형태인 Pr 형태를 흡수하는 적색광(R, λmax=660nm) 및 Pfr 형태를 흡수하는 원-적색광(FR, λmax=730nm)의 형태가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 고온에서 식물체의 열 형태 형성(thermomorphogenesis)을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 고온은 26~30℃일 수 있고, 바람직하게는 28℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

본 발명에서, 용어 "열 형태 형성"은 고온 조건에 의해서 일어나는 식물의 형태학적 변화를 의미한다. 식물체에서 관찰되는 열 형태 형성 반응에는 종자휴면 유도(종자발아 과정에서 30~35℃의 온도에 노출되는 경우 종자의 이차 휴면이 유도되어 종자발아가 억제됨), 하배축과 잎자루의 신장(발아한 어린 식물이 28~30℃의 온도에서 자라는 경우 하배축과 잎자루의 신장이 관찰됨), 잎 발달의 변화와 하편 생장(고온에서 자라는 잎은 좀 더 얇아지고 위쪽 방향으로 굽어 자라게 됨), 개화시기 조절(영양생장기의 애기장대 식물이 26~30℃의 온도에서 자라는 경우 개화시기가 빨라짐) 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 식물의 표피세포에서 파이토크롬 B 단백질 변이체를 과발현시킴으로써, 고온 조건에서 식물체의 웃자람 현상을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 고온에서 열 형태 형성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

본 발명의 제조방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하며, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 열 형태 형성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다. 상기 열 형태 형성이 조절된 형질전환 식물체는 고온에서 야생형에 비해 식물체의 웃자람(over growth) 현상이 감소된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고온은 26~30℃일 수 있고, 바람직하게는 28℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 열 형태 형성을 조절하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CER6 유전자의 프로모터; 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 포함하여, 고온 조건에서 CER6 유전자의 프로모터 활성 증가에 따라 파이토크롬 B 단백질 변이체(PHYB G515E)가 과발현되어, 고온에 의한 종자휴면 유도, 하배축과 잎자루의 신장, 잎 발달의 변화와 하편 생장 등과 같은 식물체의 열 형태 형성을 조절할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CER6 유전자의 프로모터 및 파이토크롬 B 단백질 변이체의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터의 제작

식물 큐티클층의 왁스 생합성에 필수적인 3-ketoacyl-CoA synthase 6 단백질을 코딩하는 CER6(At1g68530) 유전자의 프로모터와, 파이토크롬 B 단백질의 515번 아미노산인 글라이신(G)이 글루탐산(E)으로 치환된 변이체(PHYB G515E) 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터인 CER6p:PHYB G515E:GFP를 제작하여 애기장대 파이토크롬 돌연변이체(phyb9)에 형질전환하였다.

CER6 유전자의 프로모터에 Phusion DNA 중합효소와 프라이머(표 1)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 후 HindⅢ와 XbaI 제한효소를 이용하여 pJJ461 벡터에 삽입하였다. 파이토크롬 B 변이체는 전남대학교 김정일 교수님으로부터 분양받은 벡터에서 XbaI과 XmaI 제한효소를 이용하여 각각의 프로모터가 부착되어 있는 pJJ461 벡터에 삽입하였다. GFP(Green Fluorescent Protein)를 붙여 해당 모노크로날 항체를 이용하여 면역 침전 혹은 웨스턴 분석 등을 용이하게 할 수 있게 하였다(도 1).

재조합 벡터 제작에 사용된 프라이머 서열 정보

구분	서열정보 (5'→3') (서열번호)
CER6 프로모터	F: GATCAAGCTTGTCATTCCAAAGAAATCAGAGAACTG (3)
CER6 프로모터	R: GATCTCTAGACCGTCGGAGAGTTTTAATGTATAATTG (4)

실시예 2. 본 발명의 재조합 벡터를 이용한 애기장대 형질전환 식물체 제작

CER6p:PHYB G515E:GFP 발현 벡터를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움에 형질전환시킨 뒤 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환시킨 식물체는 종자를 받은 뒤 0.5X Murashige Skoog(MS), 20mg/㎖ 하이그로마이신 배지에서 자라는 독립적인 개체를 선별한 뒤 흙에 옮겨 심은 뒤 키워서 각각 종자를 따로 받아 다시 같은 조성의 배지에 심었을 때 살아남는 것과 죽는 표현형이 3:1 비율로 나타나는 개체군을 확인하였고 궁극적으로 CER6:PHYB G515E _phyB9 형질전환체 5개(#2-3, #4-2, #8-6, #9-1, #12-6)의 동형접합 형질전환 식물체(동형성 라인)를 분리한 후 실험에 사용하였다.

RT-PCR을 통해 전사량이 확인된 CER6:PHYB G515E _phyB9 형질전환체(#2-3, #4-2, #8-6, #9-1, #12-6; 도 2A)를 GFP(Green Fluorescent Protein) 모노크로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot)을 수행하였다. 형질전환 식물체를 12일간 배양한 후 단백질을 추출하였으며, 파이토크롬 B G515E 과발현 식물체(CsVMVp:PHYB G515E _phyB9 )는 50㎍ 단백질을, 나머지 라인은 100㎍ 단백질을 8% SDS-PAGE 겔에서 분리하여 Immobilon-blot PVDF 막(Merck, 독일)에 옮겨주고 모노크로날 GFP 항체(Sigma, 미국)와 염소 항 마우스 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, 미국), BIO-RAD clarity Max western ECL substrate(Bio-Rad, 미국)를 사용하였다. 웨스턴 블롯 결과, CER6p:PHYB G515E _phyB9 의 #4-2, #8-6 및 #9-1 라인에서 상대적으로 발현이 높음을 확인하였다(도 2B).

실시예 3. 고온에서 본 발명의 애기장대 형질전환 식물체의 표현형 분석

고온에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 애기장대 식물체의 형태학적 구조 및 생리학적 기능을 살펴보기 위해, 야생형 애기장대 식물체(Col-O); 파이토크롬 B(phytochrome B, PHYB) 단백질 코딩 유전자에 돌연변이가 발생하여 야생형에 비해 웃자란 phyb9 돌연변이 식물체; 과발현 프로모터와 PHYB G515E를 포함하는 재조합 벡터로 phyb9 돌연변이 식물체에 형질전환시킨 PHYB G515E 과발현 형질전환 식물체(CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 ); CER6 유전자의 프로모터와 PHYB G515E를 포함하는 재조합 벡터로 phyb9 돌연변이 식물체에 형질전환시킨 PHYB G515E 과발현 형질전환 식물체(CER6p:PHYB G515E _phyb9 #2-3, #4-2 및 #8-6)를 22℃(도 3A) 및 28℃(도 3B)의 16/8(광암)시간 장일 조건에서 17일 동안 배양하여 잎의 장축과 단축, 하배축 및 잎자루의 길이를 측정하였으며, 21일 동안 배양하여 야생형 애기장대 식물체 및 형질전환 식물체들의 사진을 찍어 표현형을 확인하였다.

그 결과, phyb9은 Col-O에 비해 잎의 단축 길이(short length) 및 장축 길이(long length)가 약간 감소하였으나, CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 은 Col-O와 phyb9에 비해 잎의 단축 및 장축 길이가 모두 현저하게 감소되어 왜소성이 증가한 것을 확인하였다. 반면, CER6p:PHYB G515E _phyB9 은 CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 에 비해 잎의 단축 및 장축 길이가 증가되어 왜소성이 감소된 것을 확인하였다. 특히, 고온 조건에서 Col-O 및 phyb9 식물체 잎의 단축 및 장축이 일반 온도에 비해 모두 현저하게 감소되었으나, 고온 조건에서 CER6p:PHYB G515E _phyB9 은 일반 온도에 비해 잎의 크기가 증가한 것을 확인하였다(도 3C 및 3D).

또한, phyb9은 Col-O에 비해 하배축 길이(hypocotyl length)와 잎자루 길이(petiole length)가 증가하고, 특히 고온 조건에서 하배축과 잎자루의 길이가 일반 조건에 비해 현저하게 증가하여 고온에 의한 열 형태 형성 반응으로 식물체의 웃자람 현상이 증가된 것을 확인하였고, CsVMVp:PHYB G515E_phyb9은 phyb9에 비해 하배축과 잎자루의 길이가 현저하게 감소하고, Col-O 보다 하배축 및 잎자루의 길이가 더 감소되어 웃자람 억제가 아닌 오히려 왜소성이 나타난 것을 확인하였다.

반면, CER6p:PHYB G515E _phyB9 의 하배축과 잎자루의 길이는 웃자람 현상이 강하게 나타났던 phyb9에 비해 짧고 왜소성이 나타난 CsVMVp:PHYB G515E _phyb9 에 비해 긴 것을 확인하였다. 특히, 고온 조건에서 일반 조건의 야생형과 비슷하거나 다소 낮은 수준의 하배축 및 잎자루의 길이를 유지함으로써, 고온에서 열 형태 형성으로 인한 웃자람 현상이 감소된 것을 확인하였다(도 3E 와 도 3F).

종합하면, PHYB G515E 단백질은 핵 내에서 계속 존재하여 PIF4(phytochrome interacting factor 4) 단백질을 분해시켜 PIF4 하단부에 존재하는 호르몬 관련 유전자들이 제대로 작동하지 못하도록 하여 식물체의 생장을 지연시키는 역할을 한다. 식물 세포 내에서 항상적으로 과발현하는 CsVMV 프로모터를 이용하여 PHYB G515E를 과발현시킬 경우 온도 조건에 상관없이 식물체의 하배축 및 잎자루의 길이가 과하게 감소되는 왜소성을 유도하여 식물체의 생장이 감소되는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 애기장대 유래 CER6 유전자의 프로모터가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 CER6 유전자의 프로모터가 포함되지 않은 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 비해, 식물체의 왜소성 및 고온에서 열 형태 형성으로 인한 웃자람 현상을 감소시킬 수 있으므로, CER6 유전자의 프로모터를 사용하여 파이토크롬 B 변이체의 발현을 유도할 경우 고온 조건하에서 열 형태 형성에 의한 식물체의 형태학적 변형을 조절할 수 있는 식물체의 제조가 가능할 것으로 사료되었다.

<110> The Industry ＆ Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Recombinant vector comprising promoter of specifically expressed gene in plant epidermis cell and phytochrome B protein variant and uses thereof <130> PN19417 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2496 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gtcattccaa agaaatcaga gaactgtctt taaaaatttg gaagcgagtt taatgatata 60 gcctatatga atggtacagt gtgaatgtct ctgagaaaaa ttacaattcc acatttttat 120 tacagactag atgagaaaaa aacattgatg agtaggtcaa attaaaaaac tatattcacg 180 ttttcggtga tacattggaa aaccatataa aacgatcatt tttcaaagga agaatagaaa 240 ctttatttac atatttaatt attatggaag atgaaggaag aactttatca tagactacga 300 aatcggtgtg gctaatgaaa tacagacacc ttatatatta catattaaat gtacatttca 360 atctggtgga tagttccaaa ctaatcttct tcatcaaata ttgttggcat taatgatctc 420 actatggaac acgaaaattc agcaatgttc atttttagtt aagaaacaaa tcctcttacg 480 aactctgtaa gatcttgaag gatcaaaagc ctttgatctc aatttctgta tagtttttat 540 tagcctagtg ctttatatat gtttgatact 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gtattacaaa aacatttttc 2280 tcgtcattta taaaaaaatg acaaaaaatt aaatagagag caaagcaaga gcgttgggtg 2340 acgttggtct cttcattaac tcctctcatc taccccttcc tctgttcgcc tttatatcct 2400 tcaccttccc tctctcatct tcattaactc atcttcaaaa ataccctaat cacattttgt 2460 aacaataata caattataca ttaaaactct ccgacg 2496 <210> 2 <211> 1172 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Val Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Gly Gly Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser His Thr Pro Asn Asn Arg Arg 20 25 30 Gly Gly Glu Gln Ala Gln Ser Ser Gly Thr Lys Ser Leu Arg Pro Arg 35 40 45 Ser Asn Thr Glu Ser Met Ser Lys Ala Ile Gln Gln Tyr Thr Val Asp 50 55 60 Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser 65 70 75 80 Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Val 85 90 95 Pro Glu Gln Gln Ile Thr Ala Tyr Leu Ser Arg Ile Gln Arg Gly Gly 100 105 110 Tyr Ile Gln Pro Phe Gly Cys Met Ile Ala Val Asp Glu Ser Ser Phe 115 120 125 Arg Ile Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Ala Arg Glu Met Leu Gly Ile Met 130 135 140 Pro Gln Ser Val Pro Thr Leu Glu Lys Pro Glu Ile Leu Ala Met Gly 145 150 155 160 Thr Asp Val Arg Ser Leu Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ile Leu Leu Glu 165 170 175 Arg Ala Phe Val Ala Arg Glu Ile Thr Leu Leu Asn Pro Val Trp Ile 180 185 190 His Ser Lys Asn Thr Gly Lys Pro Phe Tyr Ala Ile Leu His Arg Ile 195 200 205 Asp Val Gly Val Val Ile Asp Leu Glu Pro Ala Arg Thr Glu Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln Ser Gln Lys Leu Ala Val Arg 225 230 235 240 Ala Ile Ser Gln Leu Gln Ala Leu Pro Gly Gly Asp Ile Lys Leu Leu 245 250 255 Cys Asp Thr Val Val Glu Ser Val Arg Asp Leu Thr Gly Tyr Asp Arg 260 265 270 Val Met Val Tyr Lys Phe His Glu Asp Glu His Gly Glu Val Val Ala 275 280 285 Glu Ser Lys Arg Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gly Leu His Tyr Pro 290 295 300 Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala Ser Arg Phe Leu Phe Lys Gln Asn Arg 305 310 315 320 Val Arg Met Ile Val Asp Cys Asn Ala Thr Pro Val Leu Val Val Gln 325 330 335 Asp Asp Arg Leu Thr Gln Ser Met Cys Leu Val Gly Ser Thr Leu Arg 340 345 350 Ala Pro His Gly Cys His Ser Gln Tyr Met Ala Asn Met Gly Ser Ile 355 360 365 Ala Ser Leu Ala Met Ala Val Ile Ile Asn Gly Asn Glu Asp Asp Gly 370 375 380 Ser Asn Val Ala Ser Gly Arg Ser Ser Met Arg Leu Trp Gly Leu Val 385 390 395 400 Val Cys His His Thr Ser Ser Arg Cys Ile Pro Phe Pro Leu Arg Tyr 405 410 415 Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln Ala Phe Gly Leu Gln Leu Asn Met Glu 420 425 430 Leu Gln Leu Ala Leu Gln Met Ser Glu Lys Arg Val Leu Arg Thr Gln 435 440 445 Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu Leu Arg Asp Ser Pro Ala Gly Ile Val 450 455 460 Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Asp Leu Val Lys Cys Asp Gly Ala Ala 465 470 475 480 Phe Leu Tyr His Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu Gly Val Ala Pro Ser Glu 485 490 495 Val Gln Ile Lys Asp Val Val Glu Trp Leu Leu Ala Asn His Ala Asp 500 505 510 Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Gly 515 520 525 Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala Val Cys Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile 530 535 540 Thr Lys Arg Asp Phe Leu Phe Trp Phe Arg Ser His Thr Ala Lys Glu 545 550 555 560 Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly 565 570 575 Gln Arg Met His Pro Arg Ser Ser Phe Gln Ala Phe Leu Glu Val Val 580 585 590 Lys Ser Arg Ser Gln Pro Trp Glu Thr Ala Glu Met Asp Ala Ile His 595 600 605 Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ser Phe Lys Glu Ser Glu Ala Ala 610 615 620 Met Asn Ser Lys Val Val Asp Gly Val Val Gln Pro Cys Arg Asp Met 625 630 635 640 Ala Gly Glu Gln Gly Ile Asp Glu Leu Gly Ala Val Ala Arg Glu Met 645 650 655 Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Val Pro Ile Phe Ala Val Asp Ala 660 665 670 Gly Gly Cys Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Ile Ala Glu Leu Thr Gly 675 680 685 Leu Ser Val Glu Glu Ala Met Gly Lys Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile 690 695 700 Tyr Lys Glu Asn Glu Ala Thr Val Asn Lys Leu Leu Ser Arg Ala Leu 705 710 715 720 Arg Gly Asp Glu Glu Lys Asn Val Glu Val Lys Leu Lys Thr Phe Ser 725 730 735 Pro Glu Leu Gln Gly Lys Ala Val Phe Val Val Val Asn Ala Cys Ser 740 745 750 Ser Lys Asp Tyr Leu Asn Asn Ile Val Gly Val Cys Phe Val Gly Gln 755 760 765 Asp Val Thr Ser Gln Lys Ile Val Met Asp Lys Phe Ile Asn Ile Gln 770 775 780 Gly Asp Tyr Lys Ala Ile Val His Ser Pro Asn Pro Leu Ile Pro Pro 785 790 795 800 Ile Phe Ala Ala Asp Glu Asn Thr Cys Cys Leu Glu Trp Asn Met Ala 805 810 815 Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp Ser Arg Ser Glu Val Ile Gly Lys Met 820 825 830 Ile Val Gly Glu Val Phe Gly Ser Cys Cys Met Leu Lys Gly Pro Asp 835 840 845 Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile Val Leu His Asn Ala Ile Gly Gly Gln 850 855 860 Asp Thr Asp Lys Phe Pro Phe Pro Phe Phe Asp Arg Asn Gly Lys Phe 865 870 875 880 Val Gln Ala Leu Leu Thr Ala Asn Lys Arg Val Ser Leu Glu Gly Lys 885 890 895 Val Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln Ile Pro Ser Pro Glu Leu Gln 900 905 910 Gln Ala Leu Ala Val Gln Arg Arg Gln Asp Thr Glu Cys Phe Thr Lys 915 920 925 Ala Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Cys Gln Val Ile Lys Asn Pro Leu Ser 930 935 940 Gly Met Arg Phe Ala Asn Ser Leu Leu Glu Ala Thr Asp Leu Asn Glu 945 950 955 960 Asp Gln Lys Gln Leu Leu Glu Thr Ser Val Ser Cys Glu Lys Gln Ile 965 970 975 Ser Arg Ile Val Gly Asp Met Asp Leu Glu Ser Ile Glu Asp Gly Ser 980 985 990 Phe Val Leu Lys Arg Glu Glu Phe Phe Leu Gly Ser Val Ile Asn Ala 995 1000 1005 Ile Val Ser Gln Ala Met Phe Leu Leu Arg Asp Arg Gly Leu Gln Leu 1010 1015 1020 Ile Arg Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Ser Ile Glu Val Phe Gly Asp 1025 1030 1035 1040 Gln Ile Arg Ile Gln Gln Leu Leu Ala Glu Phe Leu Leu Ser Ile Ile 1045 1050 1055 Arg Tyr Ala Pro Ser Gln Glu Trp Val Glu Ile His Leu Ser Gln Leu 1060 1065 1070 Ser Lys Gln Met Ala Asp Gly Phe Ala Ala Ile Arg Thr Glu Phe Arg 1075 1080 1085 Met Ala Cys Pro Gly Glu Gly Leu Pro Pro Glu Leu Val Arg Asp Met 1090 1095 1100 Phe His Ser Ser Arg Trp Thr Ser Pro Glu Gly Leu Gly Leu Ser Val 1105 1110 1115 1120 Cys Arg Lys Ile Leu Lys Leu Met Asn Gly Glu Val Gln Tyr Ile Arg 1125 1130 1135 Glu Ser Glu Arg Ser Tyr Phe Leu Ile Ile Leu Glu Leu Pro Val Pro 1140 1145 1150 Arg Lys Arg Pro Leu Ser Thr Ala Ser Gly Ser Gly Asp Met Met Leu 1155 1160 1165 Met Met Pro Tyr 1170 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatcaagctt gtcattccaa agaaatcaga gaactg 36 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gatctctaga ccgtcggaga gttttaatgt ataattg 37

Claims

식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 515번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
삭제
제1항 또는 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 26~30℃에서 식물체의 웃자람(over growth) 현상을 감소시키는 방법.
삭제
제1항 또는 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 26~30℃에서 웃자람(over growth) 현상이 감소된 형질전환 식물체의 제조방법.
제6항의 제조방법에 의해 제조된 웃자람(over growth) 현상이 감소된 형질전환 식물체.
삭제
제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
식물의 표피세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 프로모터; 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 515번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 파이토크롬 B(phytochrome B) 단백질 변이체의 코딩 서열;을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물체의 웃자람(over growth) 현상을 감소시키기 위한 조성물.