KR20230047247A - 식물체의 병 저항성을 증가시키는 OsCM 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병 저항성을 증가시키는 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 벼 유래 OsCM 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)에 대한 저항성 증가 방법에 관한 것이다.

Description

식물체의 병 저항성을 증가시키는 OsCM 유전자 및 이의 용도{OsCM gene from Oryza sativa increasing disease resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물체의 병 저항성을 증가시키는 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

세계 인구의 약 50%가 먹는 주식인 쌀의 수확량은 생물학적, 생물학적 스트레스로 인해 감소된다. 생물학적 스트레스 중 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight, BLB)은 대부분의 아시아 국가에서 가장 심각하고 흔한 벼 질병 중 하나이고, 잔토모나스 오리재 피브이. 오리재 (Xanthomonas oryzae pv.oryza, Xoo)에 의해 발생하며 매년 상당한 수확량 손실을 초래한다. Xoo는 보통 단일 유전자 저항성을 통해, 형질도입 벼 품종의 개발에 의해 성공적으로 방제할 수 있다. 일반적으로 식물이 병원체에 노출되면 시킴산 경로(shikimate pathway)와 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp) 등의 방향족 아미노산(aromatic amino acids, AAAs)에 관여하는 유전자의 유도가 강화된다. 병원체의 공격은 식물 세포벽을 자극하고 올리고갈락투로니드(oligogalacturonide)를 방출하는데, 이는 다시 시킴산 경로 및 AAAs의 효소를 코딩하는 다양한 유전자 및 Phe와 Tyr에서 파생된 이차 대사물의 발현을 자극한다. 세균성 병원균은 병원체의 증식과 영양을 높이기 위해 Ⅲ형 이펙터 단백질의 무리를 전달하여 정상적인 숙주 신진대사를 촉진한다. 그러나 AAAs와 관련된 유전자는 세포벽의 변화를 통해 식물에서 침입 박테리아로 가는 영양분과 물의 통로를 조절하는 등 세균의 도전에 대처하기 위해 크게 조절된다. Phe, Tyr 및 Trp는 식물대사의 주요 AAA 분자로 살리실산, 옥신 등 다수의 호르몬 합성을 담당하며 생물학적 기능이 많은 필수 2차 대사물에도 사용된다.

ICS (isochorismate synthase) 활성을 통한 살리실산 합성과 함께 코리스메이트(chorismate)는 모든 AAAs와 그 유도체 합성에 있어 주요 전구 및 초기 분기점 대사물이기도 하다. Phe와 Tyr 생합성 주요 경로는 동일한 전구체인 코리스미트(chorismite)에서 시작하여 CM (chorismate mutase) 효소에 의해 프리페네이트(prephenate)를 생성하며, PAT (prephenate aminotransferase) 효소에 의해 추가로 촉매된다. 시킴산 경로 및 AAAs의 합성의 변형에서 CM 효소의 중요성에도 불구하고, 스트레스 조건에서 CM의 기능은 알려진 바가 없다.

한편, 한국등록특허 제1785095호에는 '벼 흰잎마름병 저항성을 가지는 OsGRX1 유전자 과발현 형질전환 식물체 및 이의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1841606호에는 '식물의 벼 흰잎마름병 저항성을 증가시키는 OsLCT1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물체의 병 저항성을 증가시키는 OsCM 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 생물학적 스트레스 조건에서 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질의 기능을 확인하기 위해, OsCM 과발현 식물체를 제조한 후 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)의 병원체인 Xoo (Xanthomonas oryzae pv.oryza)를 처리한 결과, 야생형 식물체와 비교하여 OsCM 과발현 식물체에서 벼 흰잎마름병에 대한 저항성이 현저히 증진되었음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현시키는 단계; 및 상기 OsCM 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 벼 유래 OsCM 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)에 대한 식물체의 저항성이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 내병성이 증가된 작물을 개발할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 캘러스 배양부터 OsCM 과발현 형질전환 계통으로의 발달 단계별 모습을 보여준다.
도 2는 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)균 감염 후 야생형 및 OsCM 과발현 형질전환 식물체(OxCM)의 병변 부위 변화를 보여준다. ***: p<0.05.
도 3은 벼 흰잎마름병균 감염에 따른 야생형 및 OsCM 과발현 형질전환 식물체(OxCM)의 OsCM 전사체(A) 및 단백질(B) 발현 수준의 변화와, 페닐알라닌(C) 및 티로신(D)의 함량 변화를 분석한 결과이다.
도 4는 벼 흰잎마름병균 감염 조건에서 야생형 및 OsCM 과발현 형질전환 식물체(OxCM)의 병 저항성 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 병 저항성 증가 방법은 벼 유래 OsCM 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 비형질전환 식물체에 비해 식물의 병 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "유전자 과발현"이란 비형질전환 식물체에서 발현되는 수준 이상으로 상기 OsCM 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 벼 유래 OsCM 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 병 저항성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 병 저항성 증가 방법에 있어서, 상기 병은 세균병일 수 있고, 보다 바람직하게는 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인합성효소(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물 세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현시키는 단계; 및 상기 OsCM 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 벼 유래 OsCM 단백질은 전술한 것과 같다.

본 발명의 제조 방법은 본 발명에 따른 벼 유래 OsCM 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체는 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자가 과발현되어 세균병, 특히 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)에 대한 저항성이 증가된 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 유채, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 벼 유래 OsCM 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 OsCM 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 병 저항성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. OsCM 형질전환 벼 계통 제작

본 발명에서는 청청벼 품종을 형질전환에 사용하였다. 종자를 3% 차아염소산염을 사용하여 10분간 멸균한 후 물에 담궈 32℃에서 발아될 때까지 배양하였다. 발아된 종자는 온실에 파종하고 3주 뒤 시료를 채취하여 총 RNA 추출에 사용하였다. 총 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였으며, OsCM (MH752192)의 ORF는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 그 후, 증폭된 OsCM를 pENTR/D-TOPO (pENTR Directional TOPO cloning kit; Invitrogen) 벡터로 클로닝한 후 게이트웨이 시스템(Gateway LR Clonase enzyme mix kit; Invitrogen)을 이용하여 PSB11 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 후 상기 벡터를 대장균 DH5α 균주 및 아그로박테리움 LBA4404 균주(Takara)로 열충격 방법을 이용하여 도입한 후 하이그로마이신을 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. 벡터의 삽입 여부는 NotI와 AscI, BamHI와 XhoI 제한효소 처리를 통해 각각 확인하였다.

OsCM 과발현(CM-overexpressing; 이하, OxCM) 계통은 캘러스 배양 기술을 통해 개발하였다. 고품질의 종자를 껍질을 벗기고 3% 차아염소산염을 사용하여 10분간 멸균한 후, 3회 세척하고, 70% 에탄올을 사용하여 5분간 재멸균하고 이차증류수로 세척한 후 건조시켰다. 건조된 종자를 캘러스 유도 배지에 플레이트 당 10~15개씩 올리고, 암 조건에 12일동안 두었다. 유도된 캘러스는 암 조건 하에서 3일간 캘러스 유도 배지에서 추가 배양하였다. OsCM이 삽입된 아그로박테리움을 배양하고 세포를 수거한 후, 세포 펠렛을 아세토시린곤(acetosyringone)으로 강화한 MS 배지에 재현탁하였다. 상기 아그로박테리움 재현탁액에 캘러스를 담구고 30분간 교반하며 반응시켰다. 그 후, 캘러스를 멸균지 위에 올려 30분간 건조시키고, 공배양 배지로 옮겨 암조건에서 3일간 두었다. 캘러스에서 아그로박테리움의 과도한 성장은 500 ㎎/ℓ 카르베니실린(carbenicillin)으로 3회 세척하여 조절하였으며, 30분간 건조시킨 후 50 ㎎/ℓ 하이그로마이신을 포함하는 선별 배지로 옮겼다. 상기 캘러스를 광 조건(16/8시간 광주기) 하의 선별 배지로 3회 접종하여 배양한 후 재분화 배지로 옮겨 10일간 암조건에서 배양시켰다. 두 번째 단계에서 캘러스를 새로운 동일 배지로 옮긴 후 소식물체가 자랄때까지 광 조건에 두었다. 세 번째 단계에서, 소식물체를 동일 배지가 들어있는 튜브로 옮기고 뿌리 발달을 유도하였다. 20일 후, 식물체를 토양이 든 포트로 옮겨 심었다.

2. 벼 흰잎마름병균의 접종 및 병변 길이 측정

야생형 및 OxCM 식물체를 온실에서 재배하였고, 하기의 방법을 따라 벼 흰잎마름병균을 접종하였다. 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae, Xoo) K3a 균주를 잎 클리핑 방법(Chen, H., et al., Phytopathology (2002) 92:750-754)을 사용하여 야생형 및 OxCM 식물체를 접종하였다. 실험은 Xoo K3a를 접종하지 않은 야생형 및 OxCM 식물체(대조구) 및 Xoo K3a를 접종한 야생형 및 OxCM 식물체의 두 세트로 수행되었다. 시료는 접종 후 0, 1, 6, 12, 24 및 36시간에 수집하였다. 그러나, 병변 길이는 감염 5주 후에 측정하였다.

3. RNA 분리 및 정량적(quantitative) RT-PCR 분석

총 RNA는 5장의 잎으로부터 추출하였으며, qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCRBIOSYSTEMS)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)은 합성한 cDNA를 주형으로 하고 유전자 특이적 프라이머 및 qPCRBIO SYBR Green Kit를 사용하여 진행하였다. 각 유전자의 상대적 발현 수준을 정규화하기 위해서, 액틴 유전자를 각 반응에 사용하였으며, 야생형 식물체 대비 OxCM 감염 식물체의 발현 수준을 계산하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

프라이머 명칭	서열정보(5'→3')	서열번호
OsCM-F	CCTCTTTCGCCGAGATGTTC	3
OsCM-R	AGATATCAAAAACGGCCGCA	4
NPR1-F	CTGAAAGAAGGGACCCACAA	5
NPR1-R	TAATCCTCGCCAAAGCAACT	6
Xa7-F	CGCTGATCATCCTGATCGTA	7
Xa7-R	GTTTGCAGGGAAGGCGTAAT	8
actin-F	TGCTGATCGTATGAGCAAGG	9
actin-R	TCTTTCTGGTGGTGCAATCA	10

4. 웨스턴 블랏

야생형과 형질전환체에서 단백질 발현을 확인하기 위해, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 벼 흰잎마름병균을 접종 2, 6 및 12시간 후의 야생형 및 OxCM 식물체의 단백질을 수집하였다. 총 단백질은 이전에 보고된 방법(Xu, C., et al., Crop Sci. (2008) 48:1608-1614)에 따라 10 ㎖의 TCA/acetone [10% trichloroacetic acid (TCA); 0.07% β-ME in acetone]을 이용하여 분리하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 전개하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼한 후, 일차 항체로 rabbit anti-CM synthase antibody, 이차 항체로 Gt anti-Ms IgG (H+L) antibody (Invitrogen)를 반응시킨 후 Amersham ECL (GE Healthcare, UK)을 사용하여 발현 수준을 확인하였다.

5. 통계 분석

모든 실험은 3반복으로 수행하였으며, 결과 값은 각 반복값을 모아서 평가하였다. 데이터는 two-way ANOVA을 사용한 후 Bonferroni post hoc test(유의 수준: p<0.05)를 사용하여 분석하였다. 완전히 랜덤화된 설계를 사용하여 여러 처리의 평균 값을 비교하였다.

실시예 1. 유전자 클로닝 및 OsCM 과발현 계통 개발

OsCM 유전자의 완전한 ORF 부위는 성공적으로 클로닝 벡터로 클로닝되었고, 증식을 위해 대장균으로 옮겨졌다. 분리된 플라스미드를 NotI 및 AscI 제한효소로 처리한 후 발현 벡터로 클로닝하였으며, 아그로박테리움으로 전달되었다. OsCM-과발현 벼 계통(OxCM)은 캘러스 배양을 통해 제작하였고, 다양한 발달 단계의 모습을 도 1E-L에 나타내었다. 형질전환 계통 발달의 효율은 선별 마커로 하이그로마이신을 사용하였을 때 약 18%인 것으로 확인되었다. 상기 형질전환 계통으로부터 획득한 종자를 추후 실험에 사용하였다.

실시예 2. OxCM의 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight, BLB) 저항성 분석

OxCM 및 야생형의 벼 흰잎마름병에 대한 저항성을 평가하였다. Xoo K3a 감염 후 병변의 길이를 1주일 간격으로 총 5주간 측정하였다. Xoo K3a 감염은 콜로니 카운팅을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 야생형 식물체의 병변 길이는 감염 후 첫 주 6mm에서 5주차에 138 mm로 매주 현저히 증가되는 것이 관찰되어 Xoo K3a 감염에 매우 감수성이 있음을 알 수 있었다. 반면, OxCM에서는 병변 크기가 첫 주 1.1 mm에서 5주차에 15 mm로, 5주 동안 크게 증가되지 않아 K3a에 대한 저항성이 높은 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 통해 OsCM 과발현이 벼 흰잎마름병에 대한 저항성을 증가시켰음을 알 수 있었다.

실시예 3. 병원균 감염에 따른 OsCM 발현 수준 및 페닐알라닌과 티로신 함량 변화

정상적인 조건 및 스트레스 환경에서 페닐알라닌(Phe)과 티로신(Tyr) 축적에 OsCM의 생물학적 기능을 평가하기 위해, Xoo K3a를 감염시키지 않은 야생형 및 OxCM과 Xoo K3a를 감염시킨 야생형 및 OxCM를 비교하였다. 그 결과, OsCM의 전사체 수준은 Xoo K3a를 감염시키지 않은 경우 야생형과 OxCM에서 큰 차이가 없었다. 그러나, Xoo K3a를 감염시킨 경우 OxCM 식물체에서 감염 후 시간 경과에 따라 OsCM의 전사체 및 단백질 발현 수준이 야생형 대비 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 3A 및 3B).

또한, 본 발명자는 Xoo K3a를 감염시킨 조건에서 야생형과 OxCM에서 페닐알라닌과 티노신의 축적을 비교해 보았다. 아미노산 함량 측정은 Gorissen 등(Amino acids, 2018, 50(12):1685-1695)의 방법을 참고하였다. 그 결과, 페닐알라닌의 경우 감염 후 시간 경과에 따라 식물체 내 축적이 증가되는 것이 관찰되었으나, 티로신의 경우 반대로 확인되었다(도 3C 및 3D). 상기 결과는 Xoo 감염 조건에서 OsCM이 페닐알라닌의 생합성은 상향 조절하고, 티로신 생합성은 하향 조절함을 의미하였다.

실시예 4. OsCM 의 병 저항성 유전자 발현 조절

본 발명자는 OxCM에서 Xoo 저항성과 관련된 유전자의 발현 수준을 분석하였다. Xoo로 감염된 OxCM에서 NPR1 (Natriuretic Peptide Receptor 1) 및 Xa7 (dominant R gene to Xoo strains) 전사체의 발현 변화를 확인한 결과, 야생형의 발현과 비교하여 Xoo 감염 후 높은 NPR1 및 Xa7의 발현이 현저히 증가되는 것이 관찰되었다(도 4). 이 결과는 벼에서 OsCM이 과발현되면 NPR1 유전자의 조절을 통해 벼 흰잎마름병에 대한 저항성이 증가하여, 방어 관련 유전자 Xa7을 조절하는 것으로 유추되었다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsCM gene from Oryza sativa increasing disease resistance of plant and uses thereof <130> PN21116 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 371 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gcggcggcga tgattctctc ctgcaggtat ctgctcatct gcagcgcgac gcttgcgctg 60 ctgctgctgc gactgtgcag cgggctgagc ctggacacgg tgagggagtt cctcacgagg 120 gaggaggaca ccgtcgtgtt cggcctcatc gagcgggcca agcacccgcg caacacgccg 180 gcctacgacc ccggctacct cgccggcggc ggccatggcc acgacgcctc tttcgccgag 240 atgttcgtgc gcgagtccga ggcggttcag gccaaggtgc ggccgttttt gatatctcaa 300 ctctggactc tagcttgctc ctcttctttc ttgctcctgt gtgttcttgt taggattcga 360 acttgcaatg c 371 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Ala Ala Ala Met Ile Leu Ser Cys Arg Tyr Leu Leu Ile Cys Ser Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Arg Leu Cys Ser Gly Leu Ser Leu Asp 20 25 30 Thr Val Arg Glu Phe Leu Thr Arg Glu Glu Asp Thr Val Val Phe Gly 35 40 45 Leu Ile Glu Arg Ala Lys His Pro Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Asp Pro 50 55 60 Gly Tyr Leu Ala Gly Gly Gly His Gly His Asp Ala Ser Phe Ala Glu 65 70 75 80 Met Phe Val Arg Glu Ser Glu Ala Val Gln Ala Lys Val Arg Pro Phe 85 90 95 Leu Ile Ser Gln Leu Trp Thr Leu Ala Cys Ser Ser Ser Phe Leu Leu 100 105 110 Leu Cys Val Leu Val Arg Ile Arg Thr Cys Asn 115 120 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cctctttcgc cgagatgttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agatatcaaa aacggccgca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctgaaagaag ggacccacaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 taatcctcgc caaagcaact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgctgatcat cctgatcgta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtttgcaggg aaggcgtaat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgctgatcgt atgagcaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tctttctggt ggtgcaatca 20

Claims (9)

1. 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 OsCM 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 병은 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCM 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 OsCM 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 OsCM 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 병은 벼 흰잎마름병(bacterial leaf blight)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
8. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCM (Oryza sativa chorismate mutase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 병 저항성 증가용 조성물.

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