KR102071081B1 - 질의적 세포-기초 분석법들 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본원 명세서에서는 모델 구축을 통하여, 생물학적 시스템 또는 프로세스 (예컨대, 질병 상태, 이를테면 암)을 분석하기 위한 새로운 발명의 플랫폼 기술이 개시된다. 특히, 본원 명세서에는, 생물학적 시스템을 위한 모델을 수립하여, 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1 데이터 세트를 수득하고, 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제 2 데이터 세트를 수득하며, 그리고 프로그램된 컴퓨터 장치를 이용하여 상기 제1 데이터 세트 및 상기 제2 데이터 세트에만 기초하여 복수의 유전자들의 발현 수준들 그리고 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 합의된 인과 관계 네트워크를 생성함으로써 생물학적 시스템의 조절물질을 동정하기 위한 방법이 개시된다.

Description

질의적 세포-기초 분석법들 및 이들의 용도 {INTERROGATORY CELL-BASED ASSAYS AND USES THEREOF}

질의적 세포-기초 분석법들 및 이들의 용도

[관련 출원들의 교차-참조]

본 출원은 2011년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/448,587호, 그리고 2012년 2월 1일에 출원된 미국 가출원 제61/593,848의 우선권을 주장하며, 각각의 문헌의 내용 전체는 본원에 편입된다.

1964년 오늘날 우리가 분자 생물학이라고 이르는 분야의 선구자인 제임스 왓슨 및 프랜시스 크릭에 의한 DNA의 발견 이래 새로운 약물 개발은 매우 진전되었다. 분자 생물학의 도구들과 산물들은 DNA 그리고 RNA 수준 모두에서 유전자 조절의 빠르고, 상세하며, 정확한 측정을 가능하게 하였다. 이 패러다임을 이동시킨 발견 이후 30년은, 넉-아웃(knock-out) 동물 모델들, 핵심(key) 효소-링크된 반응들, 그리고 질병 메커니즘들의 새로운 이해 그리고 전술한 플랫폼들로부터의 병태 생리학의 창시를 보게 될 것이었다. 2000년 봄, 크래이그 벤토르와 프랜시스 콜린스가 인간 게놈 서열화의 개시를 알렸을 때, 과학계는 의약의 새로운 물결에 접어들었다.

게놈의 맵핑은 곧바로 희망들, 예를 들면, 심지어 개시되기 이전에 질병 제어의 가능성, 알츠하이머 또는 파킨슨 질환을 일으키는 퇴행성 뇌 프로세스를 역행시키는 유전자 치료, 그리고 정상 조직 건축 및 생리를 복구하고 종양 부위에 도입될 수 있으며 그리고 질병의 근절을 일으킬 수 있는 구조체에 대한 희망의 불꽃을 일으켰다. 혹자는 논쟁거리가 되는 왜곡들 및 눈, 모발 색, 키, 등등에 대하 원하는 자손을 창조하는 개념을 제안하였다. 10년 후, 그러나, 우리는 여전히 시야에 특별한 궤도 없이 지속적으로 성공적인 유전자 치료, 또는 심지어 유전적 프로세스의 기초적인 제어에 대한 식견을 기다리고 있다.

따라서, 하나의 분명한 현실은 유전학은, 적어도 구조체들의 뒷받침과 무관하게, 생리학의 종점(end-point)을 쫓지 못하고 있다는 것이다. 사실, 많은 프로세스들 이를테면 전사 후 변형들, 돌연변이들, 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP's), 그리고 번역 후 변형들은 유전자 및/또는 이의 암호화된 상보 단백질의 섭리를 바꿀 수 있으며, 그리고 이로써 질병 프로세스에 공헌할 수 있다.

[발명의 요약]

정보 시대 그리고 인터넷의 창조는 정보의 범람을 초래하는 동시에, 국제적인 합작과 비평을 촉진시켰다. 아이러니하게도, 위와 같은 현실들은 또한 과학 공동체가 세포들 및/또는 조직들 내 그리고 이들 사이의 시그날 캐스캐이드의 커뮤니케이션 및 교차 대화(cross-talk)가 생체항상성 그리고 뭔가가 빗나간 경우 바른 메커니즘을 위한 전갈을 허용할 수도 있다는 것을 포함하여 몇몇 단순한 점들을 간과하도록 하는 원인이 될 수도 있다.

하나의 경우가 심혈관 질환 (CVD)에 관련되는데, 이는 미국 및 많은 선진국에서 사망의 주된 원인으로 남아있으며, 미국에서만 매 2.8 사망중 1을 차지한다. 또한, CVD는 연관된 합병증들 이를테면 만성 신장 질환 (~ 1900만 여의 미국 사례들), 만성 피로 증후군에 기저 병리로서 기여하며, 그리고 대사 증후군의 핵심 요인으로서 작용한다. 진단들, 최소한으로 침습적인 수술적 기술들, 약물 용출 스텐트들 그리고 효과적인 임상 감시에 관련된 기술에 있어서의 현저한 진보는 중재시술적 심장학(interventional cardiology) 분야에서 전대 미문의 성장 시대에 공헌하였으며, CVD의 보다 효과적 관리를 가능하게 하였다. 그러나, CVD 및 연관된 공존-질환들(co-morbidities) 이를테면 당뇨병 그리고 말초 혈관 질병 관련 질병 병인학은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.

생물학적 프로세스와 관련된 메커니즘들 및 경로들, 이를테면 질병 상태들 (예컨대, CVD)의 병인학, 을 탐구하는 보다 나은 질병 진단, 관리, 및/또는 치료를 위한 핵심 조절 경로들 및/또는 표적 분자들 (예컨대, "약물화 될 수 있는(drugable) 표적들") 및/또는 마커들의 동정을 위한 새로운 접근법들이 여전히 부족하다.

본원 명세서에서 설명한 본원 발명은 적어도 부분적으로, 네트워크 생물학, 게놈학, 프로테오믹, 대사학(metabolomic), 전사학 (transciptomic), 그리고 생물정보학적 도구들 및 방법론들의 신규한 협력적 사용에 기초하며, 이들은 조합되는 경우, 시스템 생물학 접근법을 사용하여, 이를테면 질병 상태들 포함하는 암, 당뇨병, 비만 그리고 심혈관 질환에서 선택되는 관심 대상의 여하한 생물학적 시스템의 연구에 사용될 수 있다. 제1 단계에서, 세포 모델링 시스템들이, 다양한 질병-관련 환경 자극들 (예컨대, 고혈당증, 저산소증, 면역-스트레스, 그리고 지질 과산화)에 도입되는 질병-관련된 세포들을 포함하여, 다양한 생물학적 시스템들, 이를테면 질병 프로세스를 탐지하기 위해서 개발된다. 일부 실시예들에서, 이 세포 모델링 시스템은 다양한 상호작용하는 세포 타입들 (이를테면 대동맥 평활근 세포들 (HASMC), 근위 세뇨관 신장 세포들 (HK-2), 대동맥 내피 세포들 (HAEC), 그리고 피부 섬유아세포 (HDFa)) 사이의 세포 교차 대화(cross-talk) 메커니즘에 관계된다. 세포 모델 시스템으로부터의 고 처리량 생물학적 판독(High throughput biological readouts)은, 예를 들면, 첨단 질량 분석법 (LC/MSMS), 유동 세포 분석법(flow cytometry), 세포-기초 분석법들, 그리고 함수 분석법들을 포함하는 기술들의 조합을 사용하여 수득 된다. 고 처리량 생물학적 판독은 이후 시험관 내, 생체 내, 그리고 인 실리코 ( in silico , 컴퓨터가상실험 ) 모델링에 의하여 부합하는 데이터 경향들을 분석하기 위하여 생물정보 분석에 도입된다. 도출되는 매트릭스들(matrices)은 어디에서 선형 그리고 비-선형 회귀 분석이 결정적인 압력 포인트들 (또는 "허브들(hubs)")에 도달하도록 발생되었는지를 캐내는 교차-관련 데이터를 허용한다. 이들 "허브들"은, 본원에서 제시되는 바와 같이, 약물 발명을 위한 후보들이다. 특히, 이들 허브들은 잠재적 약물 표적들 및/또는 질병 마커들을 나타낸다.

차별성(differentials, 미분)의 분자 시그니처들은 질병의 개시 및 진전에 이르게 하는 조직 마이크로환경의 변화를 좌우하는 메커니즘들에 대한 통찰을 허용한다. 함께 고려하면, 전략적인 세포 모델링을 갖는 전술한 기술 플랫폼들의 조합은 질병에 대한 이해를 더욱더 수립하기 위하여 적용될 수 있는 확고한 정보를 허용하면서, 중재시술적 심장학에 있어서 관리의 표준을 임상적으로 증대시킬 수 있는 바이오마커 라이브러리들 그리고 약물 후보들을 창출한다.

더욱이, 이러한 접근법은 질병 진단 또는 중재에 유용할 뿐만 아니라, 생물학적 시스템들, 이를테면 둘 또는 그 이상의 세포 시스템들이 상호 작용하는 생물학적 시스템들에서 사실상 모든 병리학적 또는 비-병리학적 상태들에 전반적인 적용가능성을 갖는다. 예를 들면, 이러한 접근법은 약물 독성과 연관되거나 인과(casual)관계가 있는 메커니즘들에 대한 통찰을 얻는데 유용하다. 본원 발명은 그러므로 광범위한 세팅에 일반적으로 적용될 수 있는 질의적 생물학적 평가를 위한 프레임워크를 제공한다.

본원 발명의 플랫폼의 현저한 특징은 AI-계 시스템이 생물학적 프로세스에 대하여 여하한 선행기술의 지식, 이를테면 공지된 생물학적 상관관계들 (즉, 데이터 포인트들이 인공적이지 않음), 에 의지하거나 또는 그를 참고하지 않고 세포 모델 시스템으로부터 수득 된 데이터 세트들에 기초한다는 것이다. 따라서, 플랫폼으로부터 생성된 도출되는 통계학적 모델들은 비편향(unbiased)되어 있다. 여타의 본원 발명의 플랫폼 및 이의 구성요소들, 예컨대, 세포 모델 시스템들 그리고 그로부터 수득 된 데이터 세트들, 의 현저한 특징은 시간의 경과에 걸쳐 세포 모델들의 연속적인 구축을 허용한다는 것인데 (예컨대, 새로운 세포들 및/또는 상태들의 도입에 의하여), 이로써 세포 생물학적 시스템을 위한 모델 또는 프로세스로부터 생성된 초기의, "제 1 세대(generation)"의 합의된 인과 관계 네트워크(consensus causal relationship network)가 세포 모델 자체의 진화에 따라 다중 세대 인과 관계 네트워크 (그리고 그로부터 수득 되는 델타 또는 델타-델타 네트워크들)로 진화할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 모델들, 세포 모델들로부터의 데이터 세트들, 그리고 플랫폼 기술 방법들을 사용함으로써 세포 모델들로부터 생성된 인과 관계 네트워크들 모두가 플랫폼 기술로부터 수득 된 이전의 지식 위에 계속 진화하고 구축될 수 있다.

따라서, 일 측면에서, 본원 발명은 생물학적 시스템의 조절물질을 동정하는 방법에 관련되는데, 상기 방법은 이하를 포함한다: (1) 생물학적 시스템의 특징적 측면을 나타내기 위하여, 생물학적 시스템과 연관된 세포들을 사용하여, 상기 생물학적 시스템을 위한 모델을 수립하는 단계; (2) 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포들에서 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타낸다; (3) 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제2 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제2 데이터 세트는 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다; (4) 프로그램된 컴퓨터 장치(computing device)를 사용하여 상기 제1 데이터 세트 및 상기 제2 데이터 세트에 단독으로 기초하여 상기 복수의 유전자들의 상기 발현 수준들 그리고 상기 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 합의된 인과 관계 네트워크(consensus causal relationship network)를 생성하는 단계, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다; (5) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 생물학적 시스템 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로서 동정 된다.

일부 실시예들에서, 상기 조절물질은 생물학적 시스템을 자극 또는 촉진한다.

일부 실시예들에서, 상기 조절물질은 상기 생물학적 시스템을 억제한다.

일부 실시예들에서, 상기 생물학적 시스템의 상기 모델은 생물학적 시스템과 연관된 세포들의 시험관 내(in vitro) 배양을 포함하며, 선택적으로 조화되는 (matching) 대조구(control) 세포들의 시험관 내 배양을 더욱 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 세포들의 시험관 내 배양은 환경의 동요(environmental perturbation)에 도입되며, 그리고 상기 조화되는 대조구 세포들의 시험관 내 배양은 상기 환경의 동요에 도입되지 않는 동일한 세포들이다.

일부 실시예들에서, 상기 환경의 동요는, 에이전트(agent)와의 접촉, 배양 조건 변화, 유전자 변형(genetic modification)/돌연변이, 그리고 유전자 변형/돌연변이를 일으키는 운반체(vehicle) (예컨대, 벡터)의 도입 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제1 데이터 세트는 복수의 유전자들의 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준들을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제1 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의, 지질체학(lipidomics) 데이터, 대사체군학(metabolomics) 데이터, 전사체학(transcriptomics) 데이터, 그리고 단일뉴클레오타이드다형성 (SNP) 데이터를 더욱 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제2 데이터 세트는, 하나 또는 그 이상의, 생물에너지학 프로파일링 (bioenergetics profiling), 세포 증식, 세포자멸사(apoptosis), 세포기관 기능(organellar function), 그리고 ATP, ROS, OXPHOS, 그리고 씨호스(Seahorse) 분석법들로부터 선택되는 기능적 모델들에 의하여 실현되는 유전자형-표현형 연관성을 포함한다.

일부 실시예들에서, 단계 (4)는 인공 지능(AI)-기초 정보학 플랫폼에 의하여 수행된다.

일부 실시예들에서, 상기 AI-기초 정보학 플랫폼은 REFS(TM)를 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 AI-기초 정보학 플랫폼은 통계학적 절사점(statistical cut-off point)을 적용하지 않고 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트로부터의 모든 데이터 입력을 수용한다.

일부 실시예들에서, 상기 단계 (4)에서 수립된 합의된 인과 관계 네트워크는, 상기 합의된 인과 관계 네트워크 내에서 하나 또는 그 이상의 인과 관계들의 예측을 위한 신뢰 수준을 제공하기 위하여, 단계 (5) 전에, 입력 데이터에 기초한

컴퓨터가상실험 ( in silico ) 시뮬레이션에 의하여 시뮬레이션 인과 관계 네트워크로 더욱 정교화된다.

일부 실시예들에서, 상기 고유의 인과 관계는, 세포들에 고유하게 존재하며, 그리고 상기 조화되는 대조구 세포들에 결여된(absent) 차별성(differential) 인과 관계 네트워크의 일부로서 동정 된다.

일부 실시예들에서, 상기 방법은 상기 생물학적 시스템에서 동정 된 고유의 인과 관계를 검증하는 단계를 더욱 포함한다.

다른 측면에서, 본원 발명은 질병 프로세스의 조절물질(modulator)의 동정방법에 관련되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (1) 상기 질병 프로세스의 특징적인 측면을 나타내기 위하여, 질병 관련 세포들을 사용하여, 상기 질병 프로세스의 질병 모델을 수립하는 단계; (2) 상기 질병 모델로부터 제1 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들에서 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타낸다; (3) 상기 질병 모델로부터 제2 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제2 데이터 세트는 상기 질병 관련세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다. ; (4) 프로그램된 컴퓨터 장치를 사용하여 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트에 단독으로 기초하여 상기 복수의 유전자들의 발현 수준들 그리고 상기 기능적 활성 또는 세포 반응 사이에 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다; (5) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 질병 프로세스 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 질병 프로세스의 조절 물질로서 동정 된다.

일부 실시예들에서, 상기 질병 프로세스는 암, 당뇨병, 비만 또는 심혈관 질환이다.

일부 실시예들에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 편평세포암종, 대장암, 췌장암, 갑상선 암, 자궁내막암, 방광 암, 신장암, 고형 종양, 백혈병, 비-호지킨 림프종, 또는 약제-내성 암이다.

일부 실시예들에서, 상기 조절물질은 상기 질병 프로세스를 자극 또는 촉진한다.

일부 실시예들에서, 상기 조절물질은 상기 질병 프로세스를 억제한다.

일부 실시예들에서, 상기 조절물질은 상기 에너지 대사 경로를 특히 질병 세포들에서 해당 경로(glycolytic pathway)로부터 산화적 인산화 경로(oxidative phosphorylation pathway) 쪽으로 전환(shift) 시킨다.

일부 실시예들에서, 상기 질병 모델은 질병 세포들의 시험관 내 배양을 포함하며, 선택적으로 조화되는 대조구 또는 정상 세포들의 시험관 내 배양을 더욱 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 질병 세포들의 상기 시험관 내 배양은 환경의 동요에 도입되며, 그리고 상기 조화되는 대조구 세포들의 상기 시험관 내 배양은 상기 환경의 동요에 도입되지 않은 동일한 질병 세포들이다.

일부 실시예들에서, 상기 환경의 동요는 하나 또는 그 이상의, 에이전트와의 접촉, 배양 조건 변화, 유전자 변형/돌연변이, 그리고 유전자 변형/돌연변이를 일으키는 운반체 (예컨대, 벡터)의 도입을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 질병 프로세스의 상기 특징적 측면은 저산소증(hypoxia) 상태, 고혈당증(hyperglycemic) 상태, 락틱 애시드 풍부(lactic acid rich) 배양 조건, 또는 이들의 조합들을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제1 데이터 세트는 상기 복수의 유전자들의 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준들을 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제1 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의 지질체학 데이터, 대사체군학 데이터, 전사체학 데이터, 그리고 단일뉴클레오타이드다형성 (SNP) 데이터를 더욱 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 제2 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의 생물에너지학 프로파일링, 세포 증식, 세포자멸사, 세포기관 기능, 그리고 ATP, ROS, OXPHOS, 그리고 씨호스 분석들로부터 선택되는 기능적 모델들에 의하여 실현되는 유전자형-표현형 연관성을 포함한다.

일부 실시예들에서, 단계 (4)는 인공 지능(AI)-기초 정보학 플랫폼에 의하여 수행된다.

일부 실시예들에서, 상기 AI-기초 정보학 플랫폼은 REFS(TM)를 포함한다.

일부 실시예들에서, 상기 AI-기초 정보학 플랫폼은 통계학적 절사점을 적용하지 않고 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트로부터의 모든 데이터 입력을 수용한다.

일부 실시예들에서, 단계 (4)에서 수립된 상기 합의된 인과 관계 네트워크는, 상기 합의된 인과 관계 네트워크 내에서 하나 또는 그 이상의 인과 관계들의 예측을 위한 신뢰 수준을 제공하기 위하여, 단계 (5) 전에, 입력 데이터에 기초한 컴퓨터가상실험( in silico ) 시뮬레이션에 의하여, 시뮬레이션 인과 관계 네트워크로 더욱 정교화된다.

일부 실시예들에서, 상기 고유의 인과 관계는, 세포들에 고유하게 존재하며, 그리고 상기 조화되는 대조구 세포들에 결여된 차별성 인과 관계 네트워크의 일부로서 동정 된다.

일부 실시예들에서, 상기 방법은 상기 생물학적 시스템에서 동정 된 고유의 인과 관계를 검증하는 단계를 더욱 포함한다.

다른 측면에서, 본원 발명은 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 생물학적 시스템을 위한 모델을 제공하는 방법에 관련되며, 이는 다음을 포함한다: 상기 생물학적 시스템의 특징적인 측면을 나타내기 위하여, 생물학적 시스템과 연관된 세포들을 사용하여, 생물학적 시스템을 위한 모델을 수립하는 단계, 여기서 상기 생물학적 시스템을 위한 모델은 상기 플랫폼 방법에 사용되는 데이터 세트들을 생성하는데 유용함; 이로써 플랫폼 방법에 사용하기 위한 생물학적 시스템을 위한 모델을 제공하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 플랫폼 방법에 사용하기 위한 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트를 수득하는 방법에 관련되며, 다음을 포함한다: (1) 상기 플랫폼 방법에 사용하기 위한 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 생물학적 시스템을 위한 모델은 생물학적 시스템과 연관된 세포들을 포함하며, 그리고 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포들에서의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타낸다; (2) 상기 플랫폼 방법에 사용하기 위한 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제2 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제2 데이터 세트는 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다; 이로써 플랫폼 방법에 사용하기 위한 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트를 수득하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 생물학적 시스템의 조절물질 동정 방법에 관련되며, 상기 방법은 다음을 포함한다.: (1) 프로그램된 컴퓨터 장치를 사용하여, 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 수득 되는 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트 사이에 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계, 여기서 상기 모델은 생물학적 시스템과 연관된 세포들을 포함하며, 그리고 여기서, 상기 제1 데이터 세트는 상기 세포들 내의 복수의 유전자들의 발현 수준을 나타내며 그리고 상기 제2 데이터 세트는 상기 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지의 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다; (2) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 생물학적 시스템 내의 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로서 동정 된다; 이로써 생물학적 시스템의 조절물질을 조절하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 생물학적 시스템의 조절물질 동정방법에 관련되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 1) 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 생성된 합의된 인과 관계 네트워크를 제공하는 단계; 2) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 생물학적 시스템 내의 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로서 동정 된다; 이로써 생물학적 시스템의 조절물질을 동정하는 단계.

다양한 방법들의 일부 실시예들에서, 프로그램된 컴퓨터 장치를 이용하여, 상기 합의된 인과 관계 네트워크가 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 수득 된 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트 사이에 생성되며, 여기서 상기 모델은 생물학적 시스템과 연관된 세포들을 포함하며, 그리고 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 세포들 내의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내며 그리고 상기 제2 데이터 세트는 상기 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지의 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다.

다른 측면에서, 본원 발명은 플랫폼 방법에 사용하기 위한 질병 모델의 제공 방법에 관련되며, 다음을 포함한다: 질병 프로세스의 특징적 측면을 나타내기 위하여, 질병 관련 세포들을 이용하여, 질병 프로세스를 위한 질병 모델을 수립하는 단계, 여기서 상기 질병 모델은 상기 플랫폼 방법에 사용되는 질병 모델 데이터 세트들의 생성에 유용함; 이로써 플랫폼 방법에 사용하기 위한 질병 모델을 제공하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 플랫폼 방법에 사용하기 위한 질병 모델로부터 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트를 수득하는 방법에 관련되며, 다음을 포함한다: (1) 플랫폼 방법에 사용하기 위한 질병 모델로부터 제1 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 질병 모델은 질병 관련 세포들을 포함하며, 그리고 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들에서 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타낸다; (2) 플랫폼 방법에 사용하기 위한 상기 질병 모델로부터 제2 데이터 세트를 수득하는 단계, 여기서 상기 제2 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다. ; 이로써 상기 질병 모델로부터 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트를 수득하는 단계; 이로써 플랫폼 방법에 사용하기 위한 질병 모델로부터 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트를 수득하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 질병 프로세스의 조절물질의 동정방법에 관련되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (1) 프로그램된 컴퓨터 장치를 사용하여, 질병 모델로부터 수득 된 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트 사이에 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계, 여기서 상기 질병 모델은 질병 세포들을 포함하며, 그리고 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들 내의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내며 그리고 상기 제2 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지의 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다; (2) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 질병 프로세스에서 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 질병 프로세스의 조절물질로서 동정 됨; 이로써 질병프로세스의 조절물질을 동정하는 단계.

다른 측면에서, 본원 발명은 질병프로세스의 조절물질 동정 방법에 관련되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 1) 상기 질병 프로세스를 위한 질병 모델로부터 생성된 합의된 인과 관계 네트워크를 제공하는 단계; 2) 상기 합의된 인과 관계 네트워크로부터, 상기 질병 프로세스 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 질병 프로세스의 조절물질로서 동정 된다; 이로써 질병 프로세스의 조절물질을 동정하는 단계.

일부 실시예들에서, 프로그램된 컴퓨터 장치를 사용하여, 상기 합의된 인과 관계 네트워크가 상기 질병 프로세스를 위한 상기 질병 모델로부터 수득 되는 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트 사이에 생성되며, 여기서 상기 질병 모델은 질병 세포들을 포함하며, 그리고 여기서 상기 제1 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들 내의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내며 그리고 상기 제2 데이터 세트는 상기 질병 관련 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 합의된 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지의 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다.

일부 실시예들에서, "환경의 동요", 또한 본원에서 "외부 자극 인자"로 지시됨, 는 치료 요법제이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는 저분자 (예컨 대, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 500 달톤, 또는 250 달톤 이하의 저분자)이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자 생물제(biologic)이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는 화학제(chemical)이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자 세포 내인성의 또는 외인성이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는 MIM 또는 에피쉬프터(epishifter)이다. 일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는 세포 시스템에 대한 스트레스 요인, 이를테면 저산소증, 고혈당증, 고지혈증, 고인슐린혈증, 및/또는 락틱 애시드 풍부 상태들이다.

일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는, 화학치료 요법제, 단백질-계 생물학적 약물들, 항체들, 융합 단백질들, 저분자 약물들, 지질들, 다당류들, 핵산들, 등등을 포함하는, 질병 상태의 치료를 위한 치료 요법제 또는 후보 치료 요법제를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 외부 자극 인자는, 하나 또는 그 이상의 스트레스 요인들, 이를테면, 저산소증, 고혈당 조건들, 산성 환경 (락틱 애시드 치료에 의하여 모방될 수 있음), 등등을 포함하여, 다양한 질병 상태들 하에서 전형적으로 생체 내와 맞닥뜨리는 것들 일 수 있다.

다른 실시예들에서, 외부 자극 인자는 본원에서 후에 정의되는 바와 같은 하나 또는 그 이상의 MIM들 및/또는 에피쉬프터들(epishifters)을 포함할 수 있다. 예시적 MIM들에는 코엔자임 Q10 (또한 본원에서 CoQ10로서 지시됨) 그리고 비타민 B군의 화합물들, 또는 비타민 B군 내의 화합물을 포함하는 뉴클레오사이드들(nucleosides), 모노뉴클레오타이드들(mononucleotides) 또는 디뉴클레오타이드들(dinucleotides)이 포함된다.

세포 아웃풋 측정들 (이를테면 단백질 발현)에서, 절대적 양 (예컨대, 발현 양) 또는 상대적 수준 (예컨대, 상대적 발현 수준) 어느 한쪽이 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 절대적 양들 (예컨대, 발현 양들)이 사용된다. 일 실시예에서, 상대적 수준들 또는 양들 (예컨대, 상대적 발현 수준들)이 사용된다. 예를 들면, 세포 시스템의 상대적 단백질 발현 수준의 측정을 위하여, 그 세포 시스템 내의 여하한 주어진 단백질 양이, 세포 시스템에 대한 외부 자극들이 있거나 또는 없이, 적합한 대조구 세포 라인 또는 세포 라인들의 혼합물 (이를테면 동일한 실험에 사용된 모든 세포들)에 비교될 수 있으며 배수 증가(fold-increase) 또는 배수 감소(fold-decrease) 값으로 주어진다. 통상의 기술자는 절대적인 양들 또는 상대적 양들이 여하한 세포 아웃풋 측정, 이를테면 유전자 및/또는 RNA 전사 수준, 지질의 수준, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은 여하한 기능적 아웃풋, 예컨대, 세포자멸사의 수준, 독성 수준, 또는 ECAR 또는 OCR에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 배수-증가 (예컨대, 적어도 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100 또는 그 이상의 배수 증가) 또는 배수-감소 (예컨대, 적어도 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 또는 0.05배로의 감소, 또는 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 이하로의 감소)에 대한 예정된 역치 수준이 현저한 차별성들(differentials)을 선택하기 위하여 사용될 수 있으며, 그리고 현저한 차별성을 위한 세포 아웃풋 데이터가 이후 본원 발명의 플랫폼 기술 방법들에 이용되는 데이터 세트들 (예컨대, 제1 그리고 제2 데이터 세트들)에 포함될 수 있다. 전술한 목록에 제공된 모든 값들은 범주들의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예컨대, 1.5 내지 5배, 5 내지 10배, 2 내지 5배 사이, 또는 0.9 내지 0.7, 0.9 그리고 0.5, 또는 0.7 그리고 0.3배 사이가 본 발명의 일부로 고려된다.

본원 명세서 전체에서, 열거되어 제공되는 모든 값들, 예컨대, 이를테면 전술한 것들은, 본원 발명의 일부로서 의도된 범주들의 상한 또는 하한일 수 있다.

본원 발명의 방법들의 일 실시예에서, 인과 관계 네트워크에서 관찰되는 인과 관계 모두가 생물학적으로 현저한 것은 아니다. 대상이 되는 질의적 생물학적 평가가 적용되는 여하한 주어진 생물학적 시스템에 대하여, 인과 관계들 (그리고 그와 연관된 유전자들) 일부 (또는 어쩌면 전부)는 문제가 되는 특이적 생물학적 문제와 관련하여 "결정요인(determinative)"일 수 있는데, 예컨대, 질병 상태를 일으키는 원인이거나 (치료적 중재의 잠재적 표적) 또는 질병 상태 (잠재적 진단 또는 예후 요인)에 대한 바이오 마커일 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템에서 관찰되는 고유의 인과 관계는 이슈가 되는 특이적 생물학적 문제와 관련된 결정요인이다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템에서 관찰되는 고유의 인과 관계 모두가 이슈가 되는 특이적 문제와 관련된 결정요인인 것은 아니다.

그러한 결정요인이 되는 인과 관계들은 대상 방법의 최종 사용자에 의하여 선택될 수 있으며, 또는 생물정보학 소프트웨어 프로그램, 이를테면 REFS, DAVID-구동의 비교 경로 분석 프로그램, 또는 KEGG 경로 분석 프로그램에 의하여 선택될 수도 있다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 사용되며, 그리고 둘 또는 그 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램들로부터의 합의(컨센서스, consensus) 결과들이 바람직하다.

본원에서 사용되는, 세포 아웃풋의 "차별성(differentials)"은 세포 아웃풋들의 여하한 하나 또는 그 이상의 파라미터들에서의 차이들 (예컨대, 증가된 또는 감소된 수준들)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 차별성은 mRNA 전사, 단백질 발현, 단백질 활성, 대사산물/중간생성물 수준, 및/또는 리간드-표적 상호작용에서의 차별성으로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택된다. 예를 들면, 단백질 발현 수준의 측면에 있어서, 두 세포 아웃풋들 사이의 차별성, 이를테면 외부 자극 인자에 의한 처치 전과 후의 세포 시스템과 연관된 아웃풋들, 은 공지된 기술들, 이를테면 질량 분석법에 기초한 분석들 (예컨대, iTRAQ, 2D-LC-MSMS, 등등)에 의하여 측정되고 수량화될 수 있다.

일 측면에서, 세포 생물학적 시스템을 위한 모델은 세포 교차-대화(cross-talking) 시스템을 포함하며, 여기서 외부 자극 인자가 있는 제1 세포 환경을 갖는 제1 세포 시스템은 제1 변경된 세포 환경을 생성하며; 따라서 교차-대화 세포 시스템은 제2 세포 환경을 갖는 제2 세포 시스템을 제1 변경된 세포 환경에 노출시킴으로써 수립된다.

일 실시예에서, 이 교차-대화 세포 시스템으로부터 하나 이상의 현저한 세포 교차-대화 차별성이 생성되며; 그리고 질의적 생물학적 평가가 일어나도록 하나 이상의 결정요인의 세포 교차-대화 차별성이 동정된다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 현저한 세포 교차-대화 차별성은 복수의 차별성이다.

일부 실시예들에서, 하나 이상의 결정요인 세포 교차-대화 차별성은 사용자 측에 의하여 선택된다. 대안적으로, 다른 실시예에서, 하나 이상의 결정요인 세포 교차-대화 차별성은 정량적 프로테오믹스 데이터에 기초한 생물정보학 소프트웨어 프로그램 (이를테면, 예컨대, REFS, KEGG 경로 분석 또는 DAVID-구동의 비교 경로 분석)에 의하여 선택된다.

일부 실시예들에서, 이 방법은 제1 세포 시스템을 위하여 현저한 세포 아웃풋 차별성을 생성하는 단계를 더욱 포함한다.

일부 실시예들에서, 차별성은 mRNA 전사, 단백질 발현, 단백질 활성, 대사산물/중간생성물 수준, 및/또는 리간드-표적 상호작용상의 차별성으로 구성된 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

일부 실시예들에서, 제1 세포 시스템 그리고 제2 세포 시스템은 다음으로부터 독립적으로 선택된다: 초대 배양(primary) 세포들, 암 세포 라인, 또는 정상 세포 라인의 동종성의 개체군.

일부 실시예들에서, 제1 변경된 세포 환경은 제1 세포 시스템을 외부 자극 인자와 접촉시킨 결과로서 제1 세포 시스템에 의하여 제1 세포 환경으로 분비된 인자들을 포함한다. 이 인자들은 분비된 단백질들 또는 여타의 시그널링(signaling) 분자들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 제1 변경된 세포 환경은 실질적으로 오리지날 외부 자극 인자가 없다.

일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 멤브레인에 의하여 분리된 웰 구획(well compartment) 및 삽입물 구획(insert compartment)을 갖는 트랜스웰(transwell)을 포함한다. 예를 들면, 제1 세포 시스템은 삽입물 구획 (또는 웰 구획)에서 성장할 수도 있으며, 그리고 제2 세포 시스템은 웰 구획 (또는 삽입물 구획)에서 성장할 수 있다.

일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 제1 세포 시스템을 기르기 위한 제 1 배양, 그리고 제2 세포 시스템을 기르기 위한 제2 배양을 포함한다. 이 경우, 제1 변경된 세포 환경은 제1 세포 시스템으로부터 조절된(conditioned) 배지일 수 있다.

일부 실시예들에서, 제1 세포 환경과 제2 세포 환경은 동일할 수 있다. 일부 실시예들에서, 제1 세포 환경과 제2 세포 환경은 상이할 수 있다.

일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 제1 세포 시스템 및 제2 세포 시스템의 공동 배양을 포함한다.

본원 발명의 방법들은 여하한 수의 "질의적 생물학적 평가들"을 위하여 사용되거나 또는 여기에 적용될 수 있다. 본원 발명의 방법들의 질의적 생물학적 평가에의 적용은 생물학적 시스템의 하나 또는 그 이상의 조절물질들 또는 생물학적 시스템 또는 프로세스의 결정요인의 세포 프로세스 "드라이버들(drivers)"의 동정을 가능하게 한다.

본원 발명의 방법들은 질의적 생물학적 평가들을 광범위한 범주로 수행하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 질병 상태의 진단이다. 일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 약물의 유효성 결정이다. 일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 약물의 독성 결정이다. 일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가 질병 상태의 단계화(staging)이다. 일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 항-노화 화장품을 위한 표적들의 동정이다.

본원 명세서에서 사용되는, "질의적 생물학적 평가"는 환경의 동요 또는 외부 자극 인자, 또는 생물학적 시스템 또는 프로세스에서 고유한 고유의 인과 관계와 연관된 하나 또는 그 이상의 생물학적 시스템의 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 "드라이버들," (예컨대, 생물학적 경로의 활성 증가 또는 감소, 또는 경로의 핵심 멤버들, 또는 경로의 멤버들에 대한 핵심 조절제들(regulators))의 동정을 포함할 수 있다. 이는 생체 내 동물 모델들 및/또는 시험관 내 조직 배양 실험들을 포함하여, 동정 된 결정요인의 세포 프로세스 드라이버들이 환경의 동요 또는 외부 자극 인자와 연관된 다운스트림 사건들에 대하여 필요하고 및/또는 충분한지 여부를 테스트하거나 실증하기 위하여 설계된 추가된 단계들을 더욱 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 질병 상태의 진단 또는 단계화이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버들 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스에서 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성)은 치료적 중재에 도입될 수 있는 질병 마커들이거나 또는 치료제 표적들 중 어느 하나를 나타낸다. 대상의 질의적 생물학적 평가는 이론적으로 여하한 질병 상태에 적합하나, 이를테면 종양학/암 생물학, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 그리고 신경학적 상태들 (특히 신경-퇴행성 질환들, 이를테면, 비제한적으로, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근축위성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)), 그리고 노화 관련된 신경퇴행성 질환)의 분야에 특히 유용한 것으로 밝혀질 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 약물의 유효성의 결정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성)는 성공적인 약물의 보증마크들(hallmarks)일 수 있으며, 그리고 순차로 동일한 질병 상태를 치료하기 위한 추가적인 에이전트들(agents), 이를테면 MIM들 또는 에피쉬프터들을 동정하기 위하여 사용될 수도 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 감염의 예방 또는 치료를 위한 약물 표적들의 동정이며, 여기서 동정 된 결정요인의 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성)는 마커들/인디케이터들(indicators) 또는 감염 상태의 원인이 되는 핵심 생물학적 분자들일 수 있으며, 그리고 순차로 항-감염제들의 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 주어진 질병 프로파일 상에서의 한 에이전트 (agent), 예컨대, 약물의 분자 효과의 평가이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성)는 하나 또는 그 이상의 생물학적 경로들, 또는 그 경로(들)의 핵심 멤버들, 또는 그 경로(들)의 멤버들에 대한 핵심 조절제들의 활성의 증가 또는 감소일 수 있으며, 그리고 순차로, 예컨대, 주어진 질병에 대한 그 에이전트의 치료적 유효성을 예측하기 위하여 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 한 에이전트, 예컨대, 약물의, 세포, 조직, 기관 또는 기관에 대한 독성학적 프로파일의 평가이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성),은 독성, 예컨대, 세포독성의 인디케이터들 일 수 있으며, 그리고 순차로 그 에이전트의 독성학적 프로파일의 예측 또는 동정에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성)은 약물 또는 약물 후보의 심장독성의 인디케이터일 수 있으며, 그리고 순차로 약물 또는 약물 후보의 심장독성학적 프로파일의 예측 또는 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는, 생물학적 무기들, 이를테면 질병을 일으키는 원생동물, 진균들, 박테리아, 프로테스트들(protests), 바이러스들, 또는 톡신들, 에 의한 질병 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약물 표적들의 동정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성)는 마커들/인디케이터들 또는 상기 질병 또는 장애의 원인이 되는 핵심 생물학적 분자들일 수 있으며, 그리고 순차로 생물방어 에이전트들의 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 항-노화 에이전트, 이를테면 항-노화 화장품을 위한 표적들의 동정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성)는 노화 프로세스, 특히 피부에서의 노화 프로세스의 마커들 또는 인디케이터들일 수 있으며, 그리고 순차로 동정 항-노화 에이전트들의 동정에 사용될 수 있다.

항-노화 화장품을 위한 표적들을 동정하기 위하여 본원 발명의 방법들에서 사용되는 노화를 위한 하나의 예시적 세포 모델에서, 상기 세포 모델은, 정확히 말하면, 예를 들어 UV 광 (환경의 동요 또는 외부 자극 인자)으로 처리된 노화 상피 세포, 및/또는 신생아의(neonatal) 세포들, 이들은 또한 선택적으로 UV 광으로 처리됨, 을 포함한다. 일 실시예에서, 노화를 위한 세포 모델은 세포 교차-대화 시스템을 포함한다. 항-노화 화장품을 위한 표적들의 동정을 위하여 수립된 하나의 예시적인 두-세포 교차-대화 시스템에서, 노화 상피 세포 (제1 세포 시스템)는 UV 광 (외부 자극 인자)으로 처리될 수 있으며, 그리고 변화들, 예컨대, 프로테오믹 변화들 및/또는 기능적 변화들이, 신생아의 세포들을 처리된 노화 상피 세포의 조절된 배지와 접촉시킴으로서 도출된 신생아의 세포 (제2 세포 시스템)에서 측정될 수 있는데, 예컨대, 단백질체 변화들이 전통적인 정량적 질량 분석기를 사용하여 측정될 수 있으며, 또는 노화의 고유한 인과 관계가 데이터로부터 생성된 인과 관계 네트워크로부터 동정 될 수 있다.

다른 측면에서, 본원 발명은, 발명 플랫폼 기술을 사용하여 질의적 생물학적 평가를 수행하며, 본원 발명의 방법들로부터 생성된 인과 관계 네트워크의 대상인 분석물(analyte)의 존재의 검출 및/또는 양의 정량을 위한 하나 또는 그 이상의 시약들을 포함하는, 키트를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 분석물은 생물학적 시스템에서 고유의 인과 관계의 대상이며, 예컨대, 생물학적 시스템에서 고유의 인과 관계와 연관된 유전자이다. 일부 실시예들에서, 상기 분석물은 단백질이며, 그리고 상기 시약들은 단백질에 대한 항체, 단백질에 대한 표지, 및/또는 고 처리량 분석 (예컨대, 질량 분석기에 기초한 서열화)을 위한 단백질의 제조를 위한 하나 또는 그 이상의 에이전트들을 포함한다.

실시예들에만 기술된 것들을 포함하여 본원에서 설명한 모든 실시예들은 본원 발명의 일반적인 설명의 일부이며, 명백히 부정되거나 또는 적용할 수 없는 것이 아닌 한 본원 발명의 여하한 여타의 실시예들과 조합될 수 있음을 이해하여야 한다.

본원에서 개시되는 다양한 실시예들이 이하의 도면들을 참조하여 설명될 것이며, 여기서:
도 1: 치료제들의 동정을 위한 접근법의 도해.
도 2: 암의 생물학 시스템들 및 통합된 멀티-생리적 쌍방향 아웃풋 조절의 결과 도해.
도 3: MIMS를 이용한 생물학적 관련성(relevance)의 체계적 질의의 도해
도 4: 질의적 생물학적 질문을 가능하게 하는 암 네트워크의 모델링 도해.
도 5: 질의적 생물학 플랫폼 기술의 도해.
도 6: 플랫폼 기술에 적용되는 기술들의 도해.
도 7: 데이터 수집, 데이터 통합, 그리고 데이터 탐색을 포함하는 플랫폼의 구성요소들의 도식.
도 8: MIMS를 이용한 체계적 질의 및 "~체학(omics)" 캐스캐이드로부터 반응 데이터의 수집의 도식.
도 9: 정상 그리고 당뇨병 상태들을 나타내는 시험관 내 모델들을 구축하기 위하여 적용된 구성요소들의 스케치.
도 10: 질병 병태생리학에 관련되므로, 단백질의 인과 관계 네트워크들의 생성을 위하여 사용되는 정보학 플랫폼 REFS^TM의 도식.
도 11: 당뇨병 대(vs) 정상 상태들에서 미분(differential, 차별성) 네트워크의 생성에 대한 접근법 및 MIMS로의 치료에 의하여 정상 상태들로 회복되는 당뇨성 노드들의 도식.
도 12: 당뇨병 대(vs) 정상 상태들에서의 대표적 미분(differential, 차별성) 네트워크.
도 13: 관심 대상의 노드 및 연관된 엣지들(edges)의 도식 (중심에 노드 1). 각각의 엣지와 연관된 세포 기능성이 나타난다.
도 14: 일부 실시예들에 따른, 예시적 방법의 고 수준 플로우 차트.
도 15A-15D: 예시적 실시예들에 사용될 수 있는 AI-기초 정보학 시스템을 위한 구성요소들 그리고 프로세스의 고 수준 도식적 도해.
도 16: 일부 예시적 실시예들에 사용될 수 있는 AI-기초 정보학 시스템에서의 프로세스의 플로우 차트.
도 17: 본원에서 교시된 예시적 실시예들을 실행하기 위하여 적합한 예시적 컴퓨팅 환경의 도식적 묘사들.
도 18: 실시예 1에 설명된 사례 연구 설계의 도해.
도 19: 다운스트림 노드들에 대한 CoQ10 치료들의 효과.
도 20: 암 세포 라인 HepG2에서 CoQ10 치료는 LDHA의 발현을 감소시킨다.
도 21: Paca2, HepG2 그리고 THLE2 세포 라인들로부터의 데이터에 기초한 70% 단편(fragment) 빈도(frequency)에서의 예시적 단백질 상호작용 합의 네트워크.
도 22: 두 암 세포 라인들에서 LDHA 발현 시뮬레이션에 반응성인 단백질들이 플랫폼 기술을 사용하여 동정 되었다.
도 23: LDHA-PARK7 네트워크의 Ingenuity Pathway Assist®분석이 업스트림 허브로서 TP53를 동정한다.
도 24: SKMEL28 암 세포 라인에서 TP53 발현 수준들에 대한 CoQ10 치료의 효과.
도 25: SKMEL28 암 세포 라인에서 세포자멸사를 일으키는 BCL-2 단백질들의 변경된 발현과 연관된 TP53의 활성화 및 SKMEL28에서 Bcl-2, Bax 그리고 Caspase3 발현 수준들에 대한 CoQ10 치료의 효과.
도 26: 델타-델타 네트워크들의 생성을 향한 수학적 접근법의 도해.
도 27: ECAR 및 OCR를 드라이브(drive)하는 암-건강 미분(differential, 차별성) (델타-델타) 네트워크. 각각의 드라이버는 엣지의 두께에 의하여 나타나는 바와 같이 엔드 포인트 (end point)에 차별성(differential) 효과를 가진다. 사이토스케이프(cytoscape)에서 엣지의 두께는 배수 변화의 강도를 나타낸다.
도 28: IPA를 이용하는 질의적 플랫폼 기술 아웃풋들로부터의 PARK7 맵핑 및 연관된 노드들: 회색 형태들은 IPA로 들여오는 질의적 생물학 아웃풋들로부터 PARK7와 연관된 모든 노드들을 포함한다. 채워지지 않은 형태들(이름있는)은 완전한 맵을 생성하기 위하여 IPA에 의하여 편입되는 새로운 연결들이다.
도 29: PARK7과 연관된 노드들의 신규한 연관성들을 입증하는, 본원 발명의 질의적 플랫폼 기술. 단속선(dashed lines)들로 나타낸 엣지들은, 중간생성물 노드들을 가지나 IPA에서 중간생성물 노드들을 가지지 않는, 시뮬레이션들에서 두 노드들 사이의 연결들이다. 점선(dotted lines)들로 표시된 엣지들은, 중간생성물 노드들을 가지나 IPA에서 상이한 중간생성물 노드들을 갖는, 시뮬레이션들에서의 두 노드들의 연결들이다.
도 30: 델타-델타 네트워크들의 생성을 향한 수학적 접근법의 도해. NG∩HG 델타 네트워크에서 NG로부터의 고유의 엣지들을 HG∩HGT1 델타 네트워크에서 HGT1의 고유의 엣지들과 비교. NG 및 HGT1의 교차점에 있는 엣지들은 T1으로 NG로 회복된 HG 엣지들이다.
도 31: NG∩HG 델타 네트워크상에 겹쳐진(superimposed) 코엔자임 Q10 처치 정상으로 회복된 당뇨성 엣지들의 델타-델타 네트워크
도 32: 정상 지혈 ∩ 고지혈증 델타 네트워크에 겹쳐진 코 엔자임 Q10 처치로 정상으로 회복된 고지혈증 엣지들의 델타-델타 네트워크.
도 33: 질병 그리고 약물 치료에서 변경된 지방산의 운명을 나타내는 도식. ATP의 생성을 위한 유리 지방산 (FFA)의 이용 및 멤브레인 생물학의 붕괴에 반응하는 멤브레인 리모델링 사이의 균형이 약물 유도 심장독성에 관련되어 있다.
도 34: 당뇨성 심근세포들에서 약물 유도 독성의 연구에 사용되는 실험적 설계 및 그리고 모델링 파라미터들을 나타내는 도식.
도 35: 전사 네트워크의 조절장애 및 약물 치료 (T)에 의한 당뇨성 심근세포들에서 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자들의 발현: 레스큐(rescue) 분자 (R)는 유전자 발현을 정상화시킨다.
도 36: A. 약물 치료 (T)가 고혈당(hyerglycemia)으로 조절된 심근세포들로부터 미토콘드리아에서의 GPAT1 및 TAZ 발현을 유도하였다. 레스큐 분자 (T+R)의 조합에서, GPAT1 그리고 TAZ의 수준들은 정상화되었다. B. G3P로부터의 TAG의 합성.
도 37: A. 약물 치료 (T)는 고혈당증으로 조절된(conditioned in) 심근세포들에서 미토콘드리아의 OCR (산소 소모율)을 감소시킨다. 레스큐 분자 (T+R)은 OCR을 정상화시킨다. B. 약물 치료 (T)는 고혈당증으로 조절된 심근세포들에서 미토콘드리아의 ATP 합성을 억압한다.
도 38: 약물 치료에 의하여 하향 조절되는(down regulated) 단백질들의 GO 어노테이션(Annotation). 미토콘드리아의 에너지 대사에 관련된 단백질들은 약물 치료로로 하향 조절되었다.
도 39: 델타 네트워크들의 생성을 향한 수학적 접근법의 도해. 양쪽 모델 모두 당뇨성 환경에서 T 대(versus) UT로부터의 고유의 엣지들 비교.
도 40: 약물 유도 독성의 병태생리를 드라이브하는 잠재적 단백질 허브들 및 네트워크들을 나타내는 도식.

[본원 발명의 상세한 설명]

I. 개요

본원 발명의 예시적 실시예들은, 생물학적 프로세스들, 이를테면, 질병 프로세스, 를 일으키는 요인을 포함하여, 질병 병태생리학, 그리고 그러한 생물학적 프로세스들의 기초를 이루는 핵심 분자 드라이버들, 의 광범위한 이해를 위한 도구인, 질의적 생물학 플랫폼 ("상기 플랫폼")을 사용하여 수행될 수 있는 방법들을 편입시킨다. 일부 예시적 실시예들은 상기 플랫폼의 적어도 일부, 또는 모두를 편입시킬 수 있는 시스템들을 포함한다. 일부 예시적 방법들은 상기 플랫폼의 적어도 일부, 또는 모두를 사용할 수 있다. 플랫폼에 관련된 일부 예시적 실시예들의 목표 및 목적은 실증적 목적들을 위하여 다음과 같이 일반적으로 개략 된다:

i) 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 프로세스)의 중대한 구성요소들의 드라이버들로서 특이적 분자 시그니처들을 창조하기 위하여, 그들이 생물학적 프로세스의 전체적 병태생리학에 관련되므로;

ii) 생물학적 프로세스에 관계되는 분자 시그니처들 또는 차별성 맵들을 생성하기 위하여, 이는 하나의 생물학적 상태 (예컨대, 질병 상태) 대(versus) 상이한 생물학적 단계 (예컨대, 정상 상태)를 구별하는 차별성 분자 시그니처들을 동정하는 것, 그리고 시그니처들 또는 분자 단위체들(entities)에 대한 이해를, 그들이 두 생물학적 상태들 (예컨대, 정상으로부터 질병 상태로) 사이의 변화의 메커니즘들을 중재하므로, 발달시키는 것을 도울 수 있음; 그리고,

iii) 분자 활성의 "허브들"의 생물학적 프로세스의 외부적 조절을 위한 잠재적 중재 표적들로서 (예컨대, 잠재적 치료제 표적으로서 허브를 이용하기 위하여), 또는 문제가 되는 생물학적 프로세스를 위한 잠재적 바이오-마커들로서 (예컨대, 예후 및/또는 치료진단적 용도에서의 질병 특이적 바이오마커들)의 역할을 조사하기 위하여.

플랫폼이 개입된 일부 예시적 방법들은 하나 또는 그 이상의 이하의 특징들을 포함할 수 있다:

1) 생물학적 프로세스와 연관된 세포들을 사용하여, 하나 또는 그 이상의 모델들, 바람직하게는 시험관 내 모델들에서, 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 생리학 & 병태생리학)의 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 프로세스) 및/또는 구성요소들을 모델링하는 단계. 예를 들면, 상기 세포들은 문제가 되는 생물학적 프로세스에서 일반적으로 참여하는 인간 유도 세포들일 수 있다. 상기 모델은 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병)에 특이적인 세포 신호들(cues)/상태들/동요들을 포함할 수 있다. 이상적으로, 상기 모델은 생물학적 (질병) 상태의 정적(static) 평가 대신에, 다양한 (질병) 상태들 그리고 유동(flux) 구성요소들을 나타낸다.

2) 여하한 기술분야에 공지된 수단들을 사용하여 mRNA 및/또는 단백질 시그니처들을 프로파일링 하는 단계. 예를 들면, 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) & 단백질체학 분석 도구들 이를테면 질량 분석기 (MS). 그러한 mRNA 그리고 단백질 데이터 세트들은 환경/동요에 대한 생물학적 반응을 나타낸다. 적절하고 가능한 경우, 지질체학, 대사체군학, 그리고 전사체학 데이터가 문제가 되는 생물학적 프로세스를 위하여 보충적 또는 대안적 대책들로서 통합될 수 있다. SNP 분석은 상기 프로세스에서 종종 사용될 수 있는 여타의 구성요소이다. 이것은, SNP 또는 특이적 돌연변이가 생물학적 프로세스에 여하한 효과를 가지는지 여부를 조사하는데 유용할 수 있다. 이러한 변동성은 생물학적 프로세스를, 정적인(static) "스냅샷(snapshot)," 또는 동력학적 프로세스의 표현 중 어느 하나로서, 설명하는데 사용될 수 있다.

3) 생물에너지학 프로파일링, 세포 증식, 세포자멸사, 그리고 세포기관 기능을 포함하는 그러나 이에 제한되지 않는, 신호들(cues) 그리고 동요들에 대한 하나 또는 그 이상의 세포 반응들을 분석하는 단계. 트루(True) 유전자형-표현형 연관성은 기능적 모델들, 이를테면 ATP, ROS, OXPHOS, 씨호스 분석들, 등등의 사용에 의하여 현실화된다. 그러한 세포 반응들은 mRNA/단백질 발현의 대응되는 상태(들), 그리고 위 2)의 여하한 여타의 관련된 상태들에 반응하는 생물학적 프로세스 (또는 이의 모델들)에서의 세포의 반응을 나타낸다.

4) 단백질체학으로 3)에서 수득 된 기능적 분석 데이터 그리고 2) 에서 수득 된 여타의 데이터를 통합하는 단계, 그리고 인공 지능 기초 (AI-기초) 정보학 시스템 또는 플랫폼을 사용함으로써, 인과 관계에 의하여 추진되는 대로 단백질 연관성들을 결정하는 단계. AI-기초 시스템은, 생물학적 프로세스에 관한 이미 존재하는 지식에 의존함이 없이, 2) 및/또는 3)에서 수득 된 데이터 세트들에 기초하며, 그리고 바람직하게는 오직 이들에만 기초한다. 바람직하게는, 어떠한 데이터 포인트들도 통계학적으로 또는 인위적으로 절사(cut-off)되지 않는다. 대신, 모든 수득 된 데이터가 단백질 연관성들의 결정을 위하여 AI-시스템으로 공급된다. 통합 프로세스의 하나의 목표 또는 아웃풋은 상이한 생물학적 상태들 (예컨대, 질병 vs. 정상 상태들) 사이의 하나 또는 그 이상의 차별성(differntial, 미분) 네트워크들 (그렇지 않으면 본원에서 "델타 네트워크들"로서 지시되거나 또는, 일부 경우들에서, 경우에 따라 "델타-델타 네트워크들"로 지시될 수 있음)이다.

5) AI-기초 정보학 플랫폼으로부터의 아웃풋들을 잠재적 치료제 표적 및/또는 바이오마커로서 각각의 활성의 허브를 탐색하기 위하여 프로파일링 하는 단계. 그러한 프로파일링은, 여하한 실제적인 웨트-랩(wet-lab) 실험들에 의지하지 않고, 수득 된 데이터 세트들에 기초하여 완전히 컴퓨터 가상실험으로 수행될 수 있다.

6) 분자 그리고 세포 기술들을 사용하여 활성의 허브를 검증하는 단계. 그러한 웨트-랩(wet-lab) 세포-기초 실험들로 아웃풋을 사후-정보(post-informatic) 검증하는 것은 임의 선택적일 수 있으나, 질의의 완전한-서클을 창조하는데 도움이 된다.

위에서 개략 된 여하한 또는 모든 접근법들은, 적어도 부분적으로, 특이적 용도의 성질에 따라, 여하한 생물학적 프로세스에 대하여 여하한 특이적 용도로 사용될 수 있다. 다시 말해서, 위에서 개략 된 하나 또는 그 이상의 접근법들은 생략되거나 또는 변경될 수 있으며, 그리고 하나 또는 그 이상의 추가적인 접근법들이 특이적 용도에 따라 사용될 수 있다.

상기 플랫폼을 설명하는 다양한 도식들이 제공된다. 특히, 플랫폼을 사용하여 치료제들을 동정하기 위한 예시적 접근법의 도해가 도 1에 도시되어 있다. 암의 시스템들 생물학 및 통합된 멀티-생리적 쌍방향 아웃풋 조절의 결과의 도해가 도 2에 도시되어 있다. MIMS를 이용한 생물학적 타당성의 체계적 질의의 도해가 도 3에 도시되어 있다. 질의적 생물학적 질문을 가능하게 하는 암 네트워크 모델링의 도해가 도 4에 도시되어 있다.

질의적 생물학 플랫폼 그리고 플랫폼에 적용되는 기술들의 도해가 도 5 및 6에 도시되어 있다. 데이터 수집, 데이터 통합, 그리고 데이터 탐색을 포함하는 플랫폼의 구성요소들의 도식이 도 7에 도시되어 있다. MIMS를 이용한 체계적 질의 및 "~체학(omics)" 캐스캐이드로부터 반응 데이터의 수집의 도식이 도 8에 도시되어 있다.

도 14는 일 예시적 방법 (10)의 고 수준 플로우 차트이며, 여기에 예시적 방법을 수행하기 위하여 사용되는 예시적 시스템의 구성요소들이 표시되어 있다. 처음에, 모델 (예컨대, 시험관 내 모델)이 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 생리학 그리고 병태생리학) 및/또는 구성요소들의 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 프로세스)를 위하여, 생물학적 프로세스와 정상적으로 연관된 세포들을 사용하여 수립된다. (단계 12). 예를 들면, 상기 세포들은 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병)에 일반적으로 참여하는 인간-유도 세포들일 수 있다. 상기 세포 모델은 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병)에 특이적인 다양한 세포 신호들(cues), 상태들, 및/또는 동요들을 포함할 수 있다. 이상적으로, 상기 세포 모델은, 생물학적 프로세스의 정적인(static) 평가 대신, 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병)의 다양한 (질병) 상태들 그리고 유동(flux) 구성요소를 나타낸다. 비교 세포 모델은 대조구 세포들 또는 정상 (예컨대, 비-질병의) 세포들을 포함할 수 있다. 세포 모델들의 추가적인 설명은 이하의 III.A 그리고 IV. 섹션들에서 찾아볼 수 있다.

제1 데이터 세트는 생물학적 프로세스를 위한 세포 모델로부터 수득 되는데, 이는 여하한 공지된 프로세스 또는 시스템 (예컨대, 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) & 단백질체학 분석 도구들 이를테면 질량 분석기 (MS))를 사용하여, 복수의 유전자들 (예컨대, mRNA 및/또는 단백질 시그니처들)의 발현 수준들 (단계 16)을 나타내는 정보를 포함한다.

제3 데이터 세트는 생물학적 프로세스를 위한 비교 세포 모델로부터 수득 된다. (단계 18). 상기 3 데이터 세트는 비교 세포 모델로부터 비교 세포들 내의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내는 정보를 포함한다.

본원 발명의 방법들의 일부 실시예들에서, 이들 제1 및 제3 데이터 세트들은 본원 명세서에서 집합적으로 "제1 데이터 세트"로서 지시되는데, 이는 생물학적 시스템과 연관된 세포들(비교 세포들을 포함하는 모든 세포들)에서의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타낸다.

제1 데이터 세트 그리고 제3 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의 mRNA 및/또는 단백질 시그니처 분석 시스템(들)으로부터 수득 될 수 있다. 제1 및 제3 데이터 세트들의 mRNA 및 단백질 데이터는 환경 및/또는 동요에 대한 생물학적 반응들을 나타낼 수 있다. 적절하고 가능한 경우, 지질체학, 대사체군학, 그리고 전사체학 데이터가 생물학적 프로세스를 위한 대한 보충적 또는 대안적 대책들로서 또한 통합될 수 있다. SNP 분석은 상기 프로세스에서 종종 사용되는 여타의 구성요소이다. 이는 예를 들면, 단일-뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 또는 특이적 돌연변이가 생물학적 프로세스에 여하한 효과를 가지는지 여부를 조사하는데 유용할 수 있다. 이러한 데이터 변동성은 생물학적 프로세스를, 정적인(static) "스냅샷(snapshot)," 또는 동력학적 프로세스의 표현 중 어느 하나로서, 설명하는데 사용될 수 있다. 세포들에서 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내는 정도를 수득하는 것에 대한 추가적 설명은 아래의 섹션 III.B.에 제공된다.

제2 데이터 세트는 생물학적 프로세스를 위한 세포모델로부터 수득 되는데, 이는 세포들의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보를 포함한다. (단계 20). 마찬가지로, 제4 데이터 세트는 생물학적 프로세스를 위한 비교 세포모델로부터 수득 되는데, 이는 비교 세포들의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보를 포함한다. (단계 22).

본원 발명의 방법들의 일부 실시예들에서, 이들 제2 및 제4 데이터 세트들은 본원 명세서에서 "제2 데이터 세트"로서 집합적으로 지시되는데, 이들은 생물학적 시스템과 연관된 세포들(비교 세포들을 포함하는 모든 세포들)의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다.

하나 또는 그 이상의 기능적 분석 시스템들이 세포들 또는 비교 세포들의 기능적 활성 또는 반응에 대한 정보를 수득하기 위하여 사용될 수 있다. 신호들 및 동요들에 대한 기능적 세포 반응들 관련 정보는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 생물에너지학 프로파일링, 세포 증식, 세포자멸사, 그리고 세포기관 기능을 포함할 수 있다. 프로세스들 그리고 경로들 (예컨대, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 반응성 산소 종 (ROS), 산화적 인산화 (OXPHOS), 씨호스 분석들, 등등)을 위한 기능적 모델들은 트루(true) 유전자형-표현형 연관성을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 기능적 활성 또는 세포 반응들은, 생물학적 프로세스 (또는 이들의 모델들)에서 mRNA/단백질 발현의 대응되는 상태(들), 그리고 여하한 여타의 관련된 적용되는 상태들 또는 동요들에 반응하는 세포들의 반응을 나타낸다. 세포들의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보의 수득에 대한 추가적 정보는 아래의 섹션 III.B에 제공되어 있다.

상기 방법은 또한 세포들 그리고 대조구 세포들 내의 생물학적 프로세스들의 컴퓨터-실행(implemented) 모델들의 생성을 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 (예컨대, 앙상블의), 복수의 유전자들의 발현 수준 및 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 인과 관계들의 베이지안(Bayesian) 네트워크들이 제1 데이터 세트 및 제2 데이터 세트로부터 세포 모델에 대하여 생성("생성된 세포 모델 네트워크들") 될 수 있다. (단계 24). 상기 생성된 세포 모델 네트워크들은, 개별적으로 또는 집합적으로, 상관관계들에 대한 정량적 확률 지향 (probabilistic directional) 정보를 포함한다. 상기 생성된 세포 모델 네트워크들은 제1 데이터 세트 및 제2 데이터 세트로부터의 정보 이외의, 유전자 발현 및/또는 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다. 하나 또는 그 이상의 생성된 세포 모델 네트워크들은 집합적으로 합의 세포 모델 네트워크로서 지시될 수 있다.

복수의 유전자들의 발현 수준과 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 인과 관계들의 하나 또는 그 이상의 (예컨대, 앙상블의) 베이지안 네트워크들이, 제1 데이터 세트 및 제2 데이터 세트로부터의 비교 세포 모델에 대하여 생성( "생성된 비교 세포 모델 네트워크들")될 수 있다. (단계 26). 상기 생성된 비교 세포 모델 네트워크들은, 개별적으로 또는 집합적으로, 상관관계들에 대한 정량적 확률 지향 정보를 포함한다. 상기 생성된 세포 네트워크들은 제1 데이터 세트 및 제2 데이터 세트에서의 정보 이외의, 유전자 발현 및/또는 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는다. 상기 하나 또는 그 이상의 생성된 비교 모델 네트워크들은 집합적으로 합의 세포 모델 네트워크로서 지시될 수 있다.

생성된 세포 모델 네트워크들 및 생성된 비교 세포 모델 네트워크들은 인공 지능에 기초한 (AI-기초) 정보학 플랫폼을 사용하여 창조될 수 있다. 생성된 세포 모델 네트워크들의 창조, 생성된 비교 세포 모델 네트워크들의 창조 그리고 AI-기초 정보학 시스템에 대한 더욱 상세한 설명은 아래의 섹션 III.C 그리고 도 2A-3의 설명 부분에 제공되어 있다.

많은 상이한 AI-기초 플랫폼들 또는 시스템들이 정량적 확률 지향 정보를 포함하는 인과 관계들의 베이지안 네트워크들을 생성하기 위하여 사용될 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 비록 본원 명세서에서 설명한 일부 실시예들이 하나의 특이적 상업적으로 이용 가능한 시스템, 즉, GNS (캐임브리지, MA)로부터의 REFS™ (Reverse Engineering/Forward Simulation)을 사용하지만, 실시예들은 제한적인 것이 아니다. 일부 실시예들을 실행하기 위하여 적합한 AI-기초 시스템들 또는 플랫폼들은, 입력 변수들(input variables) (예컨대, 제1 및 제2 데이터 세트들) 사이에 인과 관계들을 수립하기 위하여, 여하한 잠재적, 수립된, 및/또는 입증된 생물학적 상관관계들에 대한 선행기술에 존재하는 지식을 고려함이 없이, 오직 입력 데이터에 기초하여, 수학적 알고리즘들을 사용한다.

예를 들면, REFS™ AI-기초 정보학 플랫폼은 실험적으로 유도된 가공하지 않은 (오리지널) 또는 최소한으로 가공된 입력 생물학적 데이터 (예컨대, 유전자의, 게놈의, 후생유전의(epigenetic), 단백질체학의, 대사체군학의, 그리고 임상의 데이터)를 사용하며, 그리고 완전한 시스템에서 어떻게 분자들이 서로 반응하는지를 측정하기 위하여 수조(trillions)의 계산을 신속하게 수행한다. REFS™ AI-기초 정보학 플랫폼은, 입력 데이터에 기초하여, 인 실리코 컴퓨터-실행 세포 모델 (예컨대, 생성된 세포 모델 네트워크들)의 창조를 겨낭한, 역공학(reverse engineering) 프로세스를 수행하며, 이는 기저의 생물학적 시스템을 정량적으로 나타낸다. 또한, 기저의 생물학적 시스템에 대한 가설들은, 가설과 관련하여, 연관된 신뢰 수준들이 수반되는, 예측들을 수득하기 위하여, 컴퓨터-실행 세포 모델에 기초하여 개발되고 신속하게 시뮬레이션 될 수 있다.

이러한 접근법으로, 생물학적 시스템들은 정량적 컴퓨터-실행 세포 모델들로 나타내어지는데 여기서 "중재들(interventions)"은 생물학적 시스템 (예컨대, 질병), 효과적인 중재 전략들, 및/또는 어느 환자들이 주어진 치료 요법에 반응할 것인지를 측정하는 임상적 바이오마커들의 상세한 메커니즘들을 알아보기 위하여 시뮬레이션 된다. 전통적인 생물정보학 그리고 통계학적 접근법들은 물론, 공지된 생물학의 모델링에 기초한 접근법들은 전형적으로 이러한 타입의 통찰을 제공할 수 없다.

생성된 세포 모델 네트워크들 그리고 생성된 비교 세포 모델 네트워크들이 창조된 후, 이들은 비교된다. 생성된 세포 모델 네트워크들의 적어도 일부에 존재하는, 그리고 생성된 비교 세포 모델 네트워크들에 결여된, 또는 하나 이상의 현저히 상이한 파라미터를 갖는 하나 또는 그 이상의 인과 관계들이 동정 된다(단계 28). 그러한 비교는 미분(차별성, differential) 네트워크의 창조를 도출할 수 있다. 비교, 동정, 및/또는 차별성 (델타) 네트워크 창조는 차별적 네트워크 창조 모듈을 사용하여 수행될 수 있는데, 이는 아래의 섹션 III.D 그리고 도 26에 대한 설명에 더욱 상세히 설명되어 있다.

일부 실시예들에서, 입력 데이터 세트들은 하나의 세포 타입 그리고 하나의 비교 세포 타입으로부터이며, 이는 하나의 세포 타입에 기초한 세포 모델 네트워크들의 앙상블 및 하나의 비교 대조구 세포 타입에 기초한 비교 세포 모델 네트워크들의 별개의 앙상블을 창조한다. 미분(differential)은 하나의 세포 타입의 네트워크들의 앙상블과 비교 세포 타입(들)의 네트워크들의 앙상블 사이에서 수행될 수 있다.

다른 실시예들에서, 입력 데이터 세트들은 다중 세포 타입들 (예컨대, 둘 또는 그 이상의 암 세포 타입들) 그리고 다중 비교 세포 타입들 (예컨대, 둘 또는 그 이상의 정상, 비-암성(cancerous) 세포 타입들) 으로부터이다. 세포 모델 네트워크들의 앙상블은 각각의 세포 타입들 그리고 각각의 비교 세포 타입에 대하여 개별적으로 생성될 수 있으며, 및/또는 다중 세포 타입들 그리고 다중 비교 세포 타입들로부터의 데이터는 각자의 복합 데이터 세트들에 조합될 수 있다. 상기 복합 데이터 세트들은 다중 세포 타입들에 대응되는 네트워크의 앙상블을 (복합 데이터) 그리고 다중 비교 세포 타입들에 대응되는 네트워크의 별개의 앙상블 (비교 복합 데이터)을 생성할 수 있다. 미분(differential)은, 비교 복합 데이터에 대한 네트워크들의 앙상블에 비교하여, 복합 데이터에 대한 네트워크들의 앙상블에 수행될 수 있다.

일부 실시예들에서, 미분은 상이한 미분 네트워크들 사이에 수행될 수 있다. 이 아웃풋은 델타-델타 네트워크로서 지시될 수 있으며, 그리고 아래에서 도 26과 관련하여 설명되어 있다.

정량적 상관관계 정보는 생성된 세포 모델 네트워크들에서 각각의 상관관계에 대하여 동정 될 수 있다. (단계 30). 마찬가지로, 생성된 비교 세포 모델 네트워크들에서 각각의 상관관계에 대한 정량적 상관관계 정보가 동정 될 수 있다. (단계 32). 상관관계에 관한 정량적 정보는 방향 지시(direction indicating)인과 관계, 상관관계 (예컨대, 곡선하 면적 (AUC) 통계학적 측정)에 대한 통계학적 불확실성의 측정, 및/또는 상관관계 강도의 정량적 규모의 표현 (예컨대, 배(fold))을 포함할 수 있다. 생성된 세포 모델 네트워크들 내의 다양한 상관관계들은 잠재적 치료 표적 및/또는 바이오마커로서 네트워크들 내의 각각의 활성의 허브를 탐색하기 위하여 정량적 상관관계 정보를 이용하여 프로파일 될 수 있다. 그러한 프로파일링은 생성된 세포 모델 네트워크들로부터 도출된 결과들에 기초하여, 여하한 실제의 웨트-랩(wet-lab) 실험들에 의존함이 없이, 완전히 인 실리코로 수행될 수 있다.

일부 실시예들에서, 네트워크들 내의 활성의 허브는 분자 그리고 세포 기술들을 사용하여 검증될 수 있다. 그러한 웨트-랩(wet-lab) 세포-기초 실험들로 아웃풋을 사후-정보(post-informatic) 검증하는 것은 수행될 필요는 없으나, 질의의 완전한-서클을 창조하는데 도움이 된다. 도 15는 예시적 AI-기초 정보학 시스템 (예컨대, REFS™ AI-기초 정보학 시스템)의 기능성 그리고 AI-기초 시스템과 질의적 생물학 플랫폼("상기 플랫폼" )의 여타의 요소들 및 구역들 사이의 상호작용들의 단순화된 고 수준 표시를 도식적으로 묘사한다. 도 15A에서, 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병 모델)을 위한 모델로부터 수득 된 다양한 데이터 세트들, 이를테면 약물 투약량, 치료 투약량, 단백질 발현, mRNA 발현, 그리고 여하한 많은 연관된 기능적 척도들 (이를테면 OCR, ECAR)이 AI-기초 시스템으로 공급된다. 도 15B에 도시된 바와 같이, 입력 데이터 세트들로부터, AI-시스템은 "네트워크 단편들"의 라이브러리를 창조하는데, 이는 베이지안 단편 열거(Fragment Enumeration)로 지시되는 프로세스에서, 생물학적 프로세스 (예컨대, 질병)에서 분자 메커니즘들을 구동하는 변수들 (단백질들, 지질들 그리고 대사산물들)을 포함한다. (도 15B).

도 15C에서, AI-기초 시스템은 라이브러리에서 네트워크 단편들의 서브세트를 선택하며 그리고 상기 단편들로부터 초기 시험 네트워크(initial trial network)를 구성한다. AI-기초 시스템은 또한 별개의 초기 시험 네트워크를 구성하기 위하여 라이브러리에서 네트워크 단편들의 상이한 서브세트를 선택한다. 결국 초기 시험 네트워크들의 앙상블이 라이브러리 내의 네트워크 단편들의 상이한 서브세트들로부터 창조된다. (예컨대, 1000 네트워크들) 이 프로세스는 병렬(parallel) 앙상블 샘플링으로 지칭될 수 있다. 상기 앙상블의 각각의 시험 네트워크는 라이브러리로부터 추가적인 네트워크 단편들을 부가(adding), 공제(subtracting) 및/또는 치환(substitution)함으로써 진화되거나 최적화된다. 만약 추가적인 데이터가 수득 되는 경우, 상기 추가적인 데이터는 라이브러리 내의 네트워크 단편들로 편입될 수 있으며 그리고 각각의 네트워크의 진화를 통하여 시험 네트워크들의 앙상블로 편입될 수 있다. 최적화/진화 프로세스의 완성 후, 시험 네트워크들의 앙상블은 생성된 세포 모델 네트워크들로서 설명될 수 있다.

도 15D에 도시된 바와 같이, 생성된 세포 모델 네트워크들의 앙상블은 생물학적 시스템의 거동을 시뮬레이션하는데 사용될 수 있다. 상기 시뮬레이션은 조건들의 변화에 대한 생물학적 시스템의 거동을 예측하는데 사용될 있는데, 이는 웨트-랩(wet-lab) 세포-기초, 또는 동물-기초, 실험들에 기초하여 실험적으로 검증될 수 있다. 또한, 생성된 세포 모델 네트워크들의 상관관계들의 정량적 파라미터들은 시뮬레이션 기능성을 이용하여 시뮬레이션 된 동요들을 각각의 노드에 개별적으로 적용하는 동시에 생성된 세포 모델 네트워크에서 여타의 노드들에 대한 효과를 관찰함으로써 추출될 수 있다. 더욱 상세한 설명은 아래의 섹션 III.C에 제공되어 있다.

도 2A-2D에 도시된, AI-기초 정보학 시스템의 자동화된 역공학 프로세스는 세포들의 비편향된 체계적 컴퓨터-기초 모델인 생성된 세포 모델 네트워크들의 앙상블을 창조한다.

상기 역공학은 데이터의 분자 측정(molecular measurements)과 관심 대상의 표현형의 소산들(outcomes) 사이의 확률 지향 네트워크 연결들(연결들)을 결정한다. 분자 측정들의 변화는 이들 단위체들과 엔드포인트들 사이의 확률적 원인과 효과 상관관계들의 학습을 가능하게 한다. 상기 플랫폼의 기계적 학습 특성은 또한 계속 진화하는 데이터 세트에 기초한 교차훈련(cross training) 및 예측들을 가능하게 한다.

데이터에서 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들은 "확률적(probabilistic)"인데, 이는 부분적으로 이 연결이 컴퓨터 알고리즘에 의하여 “학습되는(learned)” 관찰되는 데이터 세트들 사이의 상호관계들(correlations)에 기초하기 때문일 것이다. 예를 들면, 만약 단백질 X의 발현수준 및 단백질 Y의 그것이 양성적으로 또는 음성적으로 상호 관련된다면, 데이터 세트의 통계학적 분석에 기초하여, 인과 관계가 단백질 X 및 Y 사이의 네트워크 연결의 수립을 위하여 할당될 수 있다. 그러한 추정적인(putative) 인과 관계의 신뢰도는 p-값 (예컨대, p < 0.1, 0.05, 0.01, 등등)에 의하여 측정될 수 있는 연결의 가능성에 의하여 더욱 정의될 수 있다.

데이터의 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들은 "지향성(directional)"인데, 이는 부분적으로 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들이, 역-공학 프로세스에 의하여 결정되는 바와 같이, 하나의 단백질의 발현 수준의 상승이, 상기 연결들이 촉진적인지 또는 억제적인지 여부에 따라, 다른 것의 발현 수준을 올라가게 하거나 떨어지도록 연결된 유전자/단백질 사이의 상관관계의 원인 및 효과를 반영하기 때문일 것이다.

데이터에서 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들은 “정량적(quantitative)"인데, 이는 부분적으로 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들이, 프로세스에 의하여 결정되는 바와 같이, 존재하는 데이터 세트 및 그와 연관된 확률적 측정들에 기초하여, 시뮬레이션 된 컴퓨터 가상실험이기 때문일 것이다. 예를 들면, 분자 측정들 사이에 수립된 네트워크 연결들에서, 이론적으로 주어진 단백질의 발현수준(또는 네트워크의 "노드")을 증가 또는 감소(예컨대, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50,100-배 또는 그 이상으로) 시키고, 정량적으로 네트워크 내의 다른 연결된 단백질들에 대한 효과를 시뮬레이션하는 것이 가능할 것이다.

데이터에서 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들은 "비편향적(unbiased)"인데, 이는 적어도 부분적으로 어떠한 데이터 포인트들도 통계학적으로 또는 인위적으로 절사되지 않기 때문이며, 그리고 부분적으로는 네트워크, 연결들이 문제가 되는 생물학적 프로세스에 대하여 이미-존재하는 지식을 참고하지 않고, 단독으로 입력 데이터에 기초하기 때문이다.

데이터에서 분자 측정들 사이의 네트워크 연결들은 "체계적(systemic)" 그리고 (비편향)인데, 부분적으로 모든 입력 변수들 중의 모든 잠재적 연결들이, 예를 들면, 페어-와이즈(pair-wise) 방식으로, 체계적으로 탐색 되기 때문이다. 그러한 체계적인 탐지를 수행하는 컴퓨팅 능력의 신용은 입력 변수들의 수의 증가에 따라 기하급수적으로 증가한다.

일반적으로, ~1,000 네트워크들의 앙상블이 측정된 단위체들 모두에서의 확률적 인과 정량 상관관계들의 예측에 대개 충분하다. 네트워크들의 앙상블은 데이터의 불확실성을 포획하고 각각의 모델 예측을 위한 신뢰 매트릭스(confidence metrics)의 계산을 가능하게 한다. 예측들은 네트워크들의 앙상블을 함께 사용하여 생성되며, 여기서 앙상블에서 개별적 네트워크들로부터의 예측들에 있어서의 차이들이 예측에서 불확실성의 정도를 나타낸다. 이 특징은 모델로부터 생성되는 임상 반응의 예측을 위한 신뢰 매트릭스(confidence metrics)의 할당을 가능하게 한다.

일단 모델들이 역-설계(reverse-engineered)되면, 추가의 시뮬레이션 질문들(queries)이 문제가 되는 생물학적 프로세스, 이를테면 질병 상태에 대한 핵심 분자 드라이버들을 결정하기 위하여 모델들의 앙상블에 수행될 수 있다.

정상 그리고 당뇨병 상태들을 나타내는 전형적 시험관 내 모델들을 구축하는데 사용되는 구성요소들의 스케치가 도 9에 도시되어 있다. 질병 병태생리학에 관련되므로, 단백질의 인과 관계 네트워크들의 생성을 위하여 사용되는 예시적 정보학 플랫폼 REFS^TM의 도식이 도 10에 도시되어 있다. 당뇨병 대(vs) 정상 상태들에서 미분 네트워크의 생성에 대한 예시적 접근법 및 MIMS로의 치료에 의하여 정상 상태들로 회복되는 당뇨성 노드들의 도식이 도 11에 도시되어 있다. 당뇨병 대(vs) 정상 상태들에서의 대표적 미분 네트워크가 도 12에 도시되어 있다. 관심 대상의 노드 및 연관된 엣지들(edges)의 도식 (중심에 노드 1) 그리고 각각의 엣지와 연관된 세포 기능성이 도 13에 도시되어 있다.

본원 발명이 위에서 일반적으로 설명되었으며, 이하의 섹션들은 본원의 방법들을 사용하여 분석될 수 있는 하나 또는 그 이상의 특이적 생물학적 시스템들과 함께, 일반적 발명의 다양한 측면들 또는 요소들에 대하여 보다 상세한 설명을 제공한다. 그러나 이하에서 도해 목적으로 사용되는 특이적 생물학적 시스템들은 제한적인 것이 아님에 유의하여야 한다. 오히려 반대로, 이의 여하한 대안들, 변형들, 그리고 균등물들을 포함하는 여타의 별개의 생물학적 시스템들이 본원의 대상 플랫폼 기술을 이용하여 마찬가지로 분석될 수 있음이 의도된다.

II . 정의들

본원 명세서에서 사용되는, 특별히 정의되고자 의도되나, 상세한 설명의 여타의 섹션들에서 이미 정의되지 않은 일부 용어들이 이하에서 정의된다.

부정관사 "일(a)" 그리고 "하나(an)" 는 본원에서 부정관사의 문법적인 대상의 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)를 지시하는 것으로 사용된다. 예로써, "한 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

"포함하는(including)"이라는 용어는 본원에서 "포함하는 그러나 이에 제한되지 않는"이라는 어구를 의미하며, 그리고 이와 상호 교환 가능하게 사용된다.

"또는(or)"이라는 용어는 본원에서 문맥에서 명확히 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"이라는 용어를 의미하며, 그리고 이와 상호 교환 가능하게 사용된다.

"이를테면(such as)"이라는 용어는 본원에서 "이를테면 그러나 이에 제한되지 않는"이라는 어구를 의미하며, 그리고 이와 상호 교환 가능하게 사용된다.

"대사 경로(Metabolic pathway)"는 하나의 화합물을 다른 것으로 변형시키며 그리고 중간생성물들 및 세포 기능들을 위한 에너지를 제공하는 효소-매개 반응들의 서열을 지시한다. 상기 대사 경로는 선형 또는 환형 또는 분지형일 수 있다.

"대사 상태(Metabolic state)"는 건강 또는 질병 상태에 관련되므로 다양한 화학적 그리고 생물학적 인디케이터들로 측정되는 바와 같은 주어진 시간의 포인트에서의 특유의 세포의, 멀티세포의 또는 조직의 환경의 분자 조성(content)을 지시한다.

"마이크로어레이(Microarray)"라는 용어는 기질(substrate), 이를테면 종이, 나일론 또는 멤브레인의 여타의 타입, 필터, 칩, 유리 슬라이드, 또는 여하한 여타의 적합한 고체 지지체 상에 합성되는 별개의 폴리뉴클레오타이드들, 올리고뉴클레오타이드들, 폴리펩티드들 (예컨대, 항체들) 또는 펩티드들의 어레이를 지시한다.

"장애들(disorders)" 및 "질환들(질병들)(diseases)"의 용어들은 포괄적으로 사용되며 그리고 신체의 여하한 부분, 기관 또는 시스템(또는 이들의 여하한 조합)의 정상 구조 또는 기능으로부터의 여하한 이탈을 지시한다. 특이적 질병은 생물학적, 화학적 그리고 물리적 변화들을 포함하는 특징적 징후들 및 신호들로 나타나며, 그리고 인구통계학적, 환경적, 직업적, 유전자적 그리고 의학적으로 역사적인 요인들을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 여타의 요인들과 종종 연관된다. 일부 특징적 신호들, 징후들, 및 관련된 요인들은 중요한 진단 정보를 산출하기 위하여 다양한 방법들을 통하여 정량화될 수 있다.

"발현(expression)"이라는 용어는 폴리뉴클레오타이드들, 이를테면 DNA로부터 폴리펩티드가 생성되는 프로세스를 포함한다. 상기 프로세스는 유전자의 mRNA로의 전사 및 이 mRNA의 폴리펩티드로의 번역에 관련될 수 있다. 사용되는 문맥에 따라, "발현"은 RNA, 단백질 또는 이들 모두의 생성을 지시할 수도 있다.

"유전자 발현의 수준(level of expression of a gene)" 또는 "유전자 발현 수준(gene expression level)" 이라는 용어들은 mRNA는 물론, 프리(pre)-mRNA 신생(nascent) 전사체(들), 전사 프로세싱 중간생성물들, 성숙한 mRNA(들) 그리고 분해 산물들의 수준, 세포에서 유전자에 의하여 인코딩된 단백질의 수준을 지시한다.

"조절(modulation)"이라는 용어는 반응의 상향제어(upregulation) (즉, 활성화 또는 자극), 하향제어(downregulation) (즉, 억제 또는 억압), 또는 둘의 조합 또는 별개, 를 지시한다. "조절물질(modulator)" 은 조절하는 화합물 또는 분자이며, 그리고 작용제, 길항제, 활성화제, 자극제, 억압제, 또는 억제제일 수 있다.

본원에서 사용되는 "트롤아민(Trolamine)"이라는 용어는 트롤아민 NF, 트리에탄올아민, TEALAN®, TEAlan 99%, 트리에탄올아민, 99%, 트리에탄올아민, NF 또는 트리에탄올아민, 99%, NF를 지시한다. 이들 용어들은 본원 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

"게놈(genome)"이라는 용어는 생물학적 단위체 (세포, 조직, 기관, 시스템, 기관)의 유전적 정보의 전체를 지시한다. 이는 DNA 또는 RNA (예를 들면 일부 바이러스들에서) 중 어느 하나로 인코딩된다. 게놈은 유전자들 그리고 DNA의 비-코딩 서열들 양쪽 모두를 포함한다.

"단백질체(proteome)"이라는 용어는 주어진 시간에 게놈, 세포, 조직, 또는 기관에 의하여 발현된 단백질들의 전체 세트를 지시한다. 보다 구체적으로, 이는 한정된 상태들 하에서 주어진 시간에 주어진 타입의 세포들 또는 기관에서 발현된 단백질들의 전체 세트를 지시할 수 있다. 단백질체는 예를 들면, 대안적 유전자의 스플라이싱(splicing) 및/또는 번역-후 변형들(post-translational modifications) (이를테면 글리코실화 또는 인산화)에 기인한 단백질 변이체들(variants)을 포함할 수 있다.

"전사체군(transcriptome)" 이라는 용어는 주어진 시간에 하나의 또는 세포들의 개체군에서 생성된 mRNA, rRNA, tRNA, 그리고 여타의 비-코딩 RNA를 포함하는 전사된 RNA 분자들의 전체 세트를 지시한다. 이 용어는 주어진 기관에서의 총 전사체들의 세트에, 또는 특유의 세포 타입에 존재하는 특이적 전사체들의 서브세트에 사용될 수 있다. 주어진 세포 라인(돌연변이들을 포함하여)에 대략적으로 고정되는 게놈과 달리, 전사체군은 외부적 환경적 상태들에 따라 변화될 수 있다. 이것은, 전사체군이 세포 내의 모든 mRNA 전사체들을 포함하기 때문인데, 전사체군은, mRNA 분해 현상들 이를테면 전사 감쇠(transcriptional attenuation)는 예외로 하고, 여하한 주어진 시간에 활발하게 발현되는 유전자들을 반영한다.

전사체학의 연구, 또한 발현 프로파일링으로도 지칭됨, 는, 종종 DNA 마이크로어레이 기술에 기초한 고-처리량 기술들을 이용하여, 주어진 세포 개체군에서 mRNAs의 발현 수준을 조사한다.

"대사체군(Metabolome)"이라는 용어는 생물학적 샘플 내에서 발견되는, 이를테면 단일 기관에서, 주어진 시간에 주어진 상태 하에서의, 저(small)-분자 대사산물들 (이를테면 대사 중간생성물들, 호르몬들 그리고 여타의 시그날링 분자들, 그리고 제2차 대사산물들)의 완전한 세트를 지시한다. 대사체군은 동력학적이며, 그리고 매 초당 변화할 수 있다.

"지질체(lipidome)"라는 용어는 생물학적 샘플 내에서, 이를테면 단일 기관에서, 주어진 시간에 주어진 상태 하에서 발견되는 지질들의 완전한 세트를 지시한다. 지질체는 동력학적이며, 매 초당 변화할 수 있다.

"인터액톰(interactome)"이라는 용어는 연구되는 생물학적 시스템 (예컨대, 세포들)에서의 분자 상호작용들의 전체 세트를 지시한다. 이는 유향(directed) 그래프로서 표시될 수 있다. 분자 상호작용들은 상이한 생화학적 패밀리들 (단백질들, 핵산들, 지질들, 탄수화물들, 등등.)에 속하는 분자들 사에서 그리고 또한 주어진 패밀리 내에서 일어날 수 있다. 단백질체학의 측면에서 말하자면, 인터액톰은 단백질-단백질 상호작용 네트워크(PPI), 또는 단백질 상호작용 네트워크 (PIN)을 지시한다. 별개의 광범위하게 연구되는 타입의 인터액톰은 단백질-DNA 인터액톰 (전사 요인들 (그리고 DNA 또는 크로마틴 조절 단백질들)그리고 그들의 표적 유전자들에 의하여 형성되는 네트워크)이다.

"세포 아웃풋(cellular output)"이라는 용어는 다음을 포함하는(제한적인 것은 아님) 세포 상태들에 관련된, 파라미터들, 바람직하게는 측정할 수 있는 파라미터들의 집합을 포함한다: 하나 또는 그 이상의 유전자들의 전사 수준 (예컨대, RT-PCR, qPCR, 마이크로어레이, 등등으로 측정할 수 있는), 하나 또는 그 이상의 단백질들의 발현 수준 (예컨대, 질량 분석기 또는 웨스턴 블럿으로 측정할 수 있는), 하나 또는 그 이상의 효소들 또는 단백질들의 절대적 활성 (예컨대, 기질 전환 속도들로서 측정할 수 있는) 또는 상대적 활성 (예컨대, 최대 활성에 비교되는 %값으로서 측정할 수 있는), 하나 또는 그 이상의 대사산물들 또는 중간생성물들의 수준, 산화적 인산화 수준 (예컨대, 산소 소모율 또는 OCR로 측정할 수 있는), 해당의 수준 (예컨대, 엑스트라 세포 산성화 속도 또는 ECAR로 측정할 수 있는), 리간드-표적 결합 또는 상호작용의 정도, 세포간 분비 분자들의 활성, 등등. 세포 아웃풋은 표적 유전자들 또는 단백질들, 등등의 예정된 수에 대한 데이터를 포함할 수 있으며, 또는 모든 탐지할 수 있는 유전자들 또는 단백질들에 대한 전체적인 평가를 포함할 수 있다. 예를 들면, 질량 분석기가 주어진 샘플 또는 세포 개체군에서 발현되는 모든 탐지할 수 있는 단백질들을, 여하한 특이적 단백질이 샘플 또는 세포 개체군에서 발현될 수 있는지 여부에 대하여 선행 기술의 지식 없이, 동정 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는, "세포 시스템(cell system)"은 동종성의 또는 이종성 세포들의 개체군을 포함한다. 시스템 내의 세포들은 생체 내에서, 자연의 또는 생리적인 환경 하에서 성장할 수 있으며, 또는 시험관 내에서, 예를 들면, 제어된 조직 배양 환경들에서 성장할 수 있다. 시스템 내의 세포들은 상대적으로 동종성 (예컨대, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 동종성)일 수 있으며, 또는 둘 또는 그 이상의 세포 타입들, 이를테면 생체 내에서 근접하여 자라는 것으로 발견된 세포 타입들 또는 생체 내에서, 예컨대, 파라크린(paracrine) 또는 여타의 장거리 세포-간 커뮤니케이션을 통하여, 서로 상호 작용할 수 있는 세포 타입들을 함유할 수 있다. 세포 시스템 내 세포들은, 암 세포 라인들, 불멸의 세포 라인들, 또는 정상 세포 라인들을 포함하는, 수립된 세포 라인들로부터 유도될 수 있으며, 또는 초대 배양 세포들 또는 살아있는 조직들 또는 기관들로부터 신선하게 분리된 세포들일 수 있다.

세포 시스템 내 세포들은 전형적으로 영양분들, 가스들 (산소 또는 CO₂, 등등.), 화학적 물질들, 또는 세포 거동에 영향을 주는 상태들을 정의할 수 있는 단백질성/비-단백질성 자극제들(stimulants)을 제공하는 "세포 환경"과 접촉하고 있다. 세포 환경은 규정된 화학적 구성요소들 및/또는 덜 잘 규정된(less well-defined) 조직 추출물들 또는 혈청 구성요소들을 갖는 화학적 배지들 일 수 있으며, 그리고 세포들이 성장되는 특이적 pH, CO₂ 조성, 압력, 그리고 온도를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포 환경은 특이적 세포 시스템에 대하여 생체 내에서 발견되는 자연의 또는 생리적인 환경일 수 있다.

일부 실시예들에서, 세포 환경은 생물학적 시스템 또는 프로세스의 일 측면을 시뮬레이션하는, 예컨대, 질병 상태, 프로세스, 또는 환경을 시뮬레이션하는 상태들을 포함한다. 그러한 배양 조건들은 예를 들면, 고혈당증, 저산소증, 또는 락틱-풍부(lactic-rich) 상태들을 포함한다. 수많은 여타의 그러한 상태들이 본원 명세서에서 설명된다.

일부 실시예들에서, 특이적 세포 시스템을 위한 세포 환경은 또한 세포 시스템의 일부 세포 표면 특징들, 이를테면 세포 표면상의 수용체들 또는 리간드들의 타입들 및 그들의 각각의 활성들, 탄수화물 또는 지질 분자들의 구조, 멤브레인 극성 또는 유동성, 일부 멤브레인 단백질들의 클러스터링(clustering) 상태, 등등을 포함한다. 이들 세포 표면 특징들은 근처 세포들, 이를테면 상이한 세포 시스템에 속하는 세포들, 의 기능들에 영향을 줄 수 있다. 일부 다른 실시예들에서, 그러나, 세포 시스템의 세포 환경은 세포 시스템의 세포 표면 특징들을 포함하지 않는다.

세포 환경은 수정되어 "변경된 세포 환경(modified cellular environment)"이 될 수 있다. 수정들은 세포 환경에 하나 또는 그 이상의 "외부 자극 인자(external stimulus component)" 의 추가를 포함하여, 세포 환경에서 발견되는 여하한 하나 또는 그 이상의 구성요소의 변화들(예컨대, 증가 또는 감소)을 포함할 수 있다. 환경의 동요 또는 외부 자극 인자는 세포 환경에 대하여 내인성(예컨대, 세포 환경은 일부 수준들의 자극제를 함유하며, 그리고 동일한 것이 그 수준을 증가시키기 위하여 추가된다)일 수 있거나, 또는 세포 환경에 외인성 (예컨대, 자극제가 수정 전에는 세포 환경에 크게 결여되어 있다)일 수 있다. 세포 환경은 외부 자극 인자의 추가로부터 도출되는 2차 변화들에 의하여 더욱 수정될 수 있는데, 이는 외부 자극 인자가, 세포 시스템에 의하여 세포 환경으로 분비되는 분자들을 포함하여, 세포 시스템의 세포 아웃풋을 변화시킬 수 있기 때문일 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는, "외부 자극 인자(external stimulus component)" , 또한 본원 명세서에서 "환경의 동요(environmental perturbation)"로서 지시됨, 는 세포 기능에 영향을 주는 여하한 외부적 물리적 및/또는 화학적 자극을 포함한다. 이것은 여하한 작은 또는 큰 유기 또는 무기 분자들, 자연의 또는 합성의 화학물질들, 온도 쉬프트, pH 변화, 방사(radiation), 광 (UVA, UVB 등등.), 마이크로파, 초음파, 전류, 변조된(modulated) 또는 변조되지 않은(unmodulated) 자기장, 등등을 포함할 수 있다.

"다차원 세포내 분자 (MIM , Multidimensional Intracellular Molecule)"라는 용어는 체내에서 자연적으로 생성되는 및/또는 인간의 하나 이상의 세포 내에 존재하는 내인성의 분자의 분리된 버전 또는 합성되어 생성된 버전이다. MIM는 세포로 들어갈 수 있으며 그리고 세포로의 입장(entry)은 분자의 생물학적 활성 구역이 완전히 세포로 들어가는 한 세포로의 완전히 또는 부분적 입장을 포함한다. MIMs는 세포 내에서 시그날 전달(transduction) 및/또는 유전자 발현 메커니즘의 유도를 할 수 있다. MIMs는 다차원인데, 이는 이 분자들이 치료제 그리고 담체, 예컨대, 약물 전달의, 양쪽 모두의 효과를 갖기 때문이다. MIMs는 또한 질병 상태에서 하나의 방식으로 그리고 정상 상태에서 상이한 방식으로 작용하기 때문에 다차원이다. 예를 들면, CoQ-10의 경우, CoQ-10를 VEGF의 존재 하에 흑색종 세포에 투여하는 것은 Bcl2를 감소된 수준으로 유도하고, 이는 순차로 흑색종 세포에 대하여 감소된 종양 형성 잠재력에 이르게 한다. 반대로, 정상 섬유아세포(fibroblast)에서, CoQ-10 및 VEFG의 공동-투여는 Bcl2의 수준에 영향을 미치지 못한다.

일 실시예에서, MIM는 또한 에피-쉬프터(epi-shifter)이다. 다른 실시예에서, MIM는 에피-쉬프터가 아니다. 다른 실시예에서, MIM는 하나 또는 그 이상의 전술한 기능들에 의하여 특징져진다. 다른 실시예에서, MIM는 둘 또는 그 이상의 전술한 기능들에 의하여 특징져진다. 또 다른 실시예에서, MIM는 셋 또는 그 이상의 전술한 기능들에 의하여 특징져진다. 또 다른 실시예에서, MIM는 모든 전술한 기능들에 의하여 특징져진다. 통상의 기술자는 본원 발명의 MIM가 또한 둘 또는 그 이상의 내인성의 분자들의 혼합물을 포괄하는 것으로 의도됨을 이해할 것이며, 여기서 상기 혼합물은 하나 또는 그 이상의 전술한 기능들에 의하여 특징져진다. 혼합물 내의 내인성의 분자들은 혼합물이 MIM로서 기능하는 비율로 존재한다.

MIMs는 지질계 또는 비-지질계 분자들일 수 있다. MIMs의 예시에는 CoQ10, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 아미노산들 이를테면, 예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 그리고 시스테인이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, MIM은 저분자이다. 본원 발명의 일 실시예에서, MIM은 CoQ10가 아니다. MIMs는 본원 명세서에서 상세하게 설명된 여하한 분석방법들을 사용하여 통상의 기술자에 의하여 일상적으로 동정 될 수 있다. MIMs는 미국 출원 제US 12/777,902호 (US 2011-0110914)에 더욱 상세히 기재되어 있으며, 상기 전체의 내용은 본원 명세서에 참조 문헌으로서 명백하게 편입된다.

본원 명세서에서 사용되는, “에피 메타볼릭 쉬프터(epimetabolic shifter)” 에피-쉬프터(epi-shifter)는 건강 (또는 정상) 상태로부터 질병 상태로 그리고 반대의 경우도 마찬가지로 대사 쉬프트를 조절하며, 이로써 세포, 조직, 기관, 시스템 및/또는 인간에서 숙주 건강을 유지 또는 재수립하는 분자이다. 에피-쉬프터들은 조직 마이크로환경에서 정상화에 영향을 일으키도록 할 수 있다. 예를 들면, 에피-쉬프터는 세포에 추가되거나 세포로부터 고갈되는 경우 세포의 마이크로환경 (예컨 대, 대사 상태)에 작용할 수 있는 여하한 분자를 포함한다. 통상의 기술자는 본원 발명의 에피-쉬프터가 또한 둘 또는 그 이상의 분자들의 혼합물을 포괄하도록 의도되며, 여기서 상기 혼합물은 하나 또는 그 이상의 전술한 기능들에 의하여 특징져짐을 이해할 것이다. 상기 혼합물 내의 분자들은 혼합물이 에피-쉬프터로서 기능할 수 있는 비율로서 존재한다. 에피-쉬프터들의 예시에는, CoQ-10; 비타민 D3; ECM 구성요소들 이를테면 피브로넥틴; 면역조절물질들, 이를테면 TNFa 또는 여하한 인터류킨들, 예컨대, IL-5, IL-12, IL-23; 신혈관생성(angiogenic) 인자들; 그리고 세포자멸(apoptotic) 인자들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 에피-쉬프터는 또한 MIM이다. 일 실시예에서, 에피-쉬프터는 CoQ10가 아니다. 에피-쉬프터들은 본원 명세서에서 상세하게 설명된 여하한 분석법들을 사용하여 통상의 기술자에 의하여 일상적으로 동정 될 수 있다. 에피-쉬프터들은 미국 출원 제 US 12/777,902호 (US 2011-0110914)에 더욱 상세히 설명되어 있으며, 상기 문헌 전체의 내용은 본원 명세서에 참조문헌으로서 명백히 편입된다.

본원 명세서에서 명시적으로 정의되지 않은 여타의 용어들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에 의하여 이해될 수 있는 의미를 갖는다.

III. 플랫폼 기술의 예시적 단계들 및 구성요소들

오로지 설명을 위한 목적을 위해서, 대상 플랫폼 기술의 이하의 단계들이 커스텀 구축된 암 모델로부터 수득 된 데이터의 통합을 위한, 그리고 암의 발병기전(pathogenesis)을 추진하는 신규한 단백질들/경로들을 동정하기 위한 예시적 용도로서 본원 명세서에서 아래에서 설명될 것이다. 이 분석으로부터 도출되는 관련 맵들은 암 치료 표적들은 물론 암과 연관된 진단/예후 마커들을 제공한다. 그러나, 본 플랫폼 기술은 여하한 생물학적 시스템 또는 프로세스, 그리고 여하한 특유의 암 또는 여타의 특이적 질병 모델들, 이에 제한되는 것은 아님, 에 대한 일반적 적용 가능성을 갖는다.

추가로, 비록 이하의 설명이 불연속적 단계들로서 일부 부분들에서 제시되나, 이는 설명 목적 그리고 단순성을 위한 것이며, 따라서, 현실에서는, 그러한 엄격한 순서 및/또는 단계들의 구분(demarcation)이 수반되지 않는다. 더욱이, 본원 발명의 단계들은 분리하여 수행될 수 있으며, 그리고 본원 명세서에 제공된 본원 발명은 각각의 개별적 단계들을 개별적으로는 물론 대상 플랫폼 기술의 하나 또는 그 이상의 (예컨대, 여하한 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 또는 모든 일곱 단계들), 나머지 단계들로부터 독립적으로 수행되는, 단계들의 조합들을 포괄하는 것으로 의도된다.

본원 발명은 또한 플랫폼 기술의 모든 측면들을 본원 발명의 실시예들 및 분리된 구성요소들로서 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 생성된 데이터 세트들은 본원 발명의 실시예들인 것으로 의도된다. 추가적 실시예들로서, 생성된 인과 관계 네트워크들, 생성된 합의된 인과 관계 네트워크들, 및/또는 생성된 시뮬레이션된 인과 관계 네트워크들 또한 본원 발명의 실시예들인 것으로 의도된다. 생물학적 시스템에서 고유한 것으로서 동정 된 인과관계들은 본원 발명의 실시예들인 것으로 의도된다. 또한, 특유의 생물학적 시스템을 위하여 커스텀 구축된 모델들 또한 본원 발명의 실시예들인 것으로 의도된다. 예를 들면, 질병 상태 또는 프로세스를 위하여 커스텀 구축된 모델들, 이를테면, 예컨대, 암, 비만/당뇨병/심혈관 질환을 위한 세포 모델들, 또는 약물의 독성 (예컨대, 심장독성)에 대하여 커스텀 구축된 모델 또한 본원 발명의 실시예들인 것으로 의도된다.

A. 커스텀 모델 구축

플랫폼 기술에서 제1 단계는 생물학적 시스템 또는 프로세스를 위한 모델의 수립이다. 생물학적 시스템 또는 프로세스의 일 실시에는 암이다. 여하한 여타의 복잡화된 생물학적 프로세스 또는 시스템과 같이, 암은 다중 고유의 측면들에 의하여 특징져지는 복잡화된 병리학적 상태이다. 예를 들면, 높은 성장 속도에 의하여, 많은 암 세포들은 저산소증 상태들에서 성장하고, 상향-제어된 해당 및 감소된 산화적 인산화 대사 경들을 갖도록 적응된다. 그 결과, 암 세포들은 환경의 동요, 이를테면 잠재적 약물로의 치료에 대하여, 동일한 치료에 반응하는 정상 세포에 의한 반응에 비교하여, 상이하게 반응할 수 있다. 따라서, 정상 세포들에 비교되는 약물 치료에 대한 암의 고유의 반응들을 해독하는 것이 관심의 대상일 것이다. 이러한 목적을 위하여, 커스텀 암 모델이, 생체 내에서 종양 내의 암세포의 조건들에 매우 가까운 세포 배양 조건들을 창조함으로써, 암 세포의 환경을 시뮬레이션하기 위하여, 또는 암 세포들의 상이한 성장 조건들을 분리함으로써, 암 성장의 다양한 측면들을 모방하기 위하여, 수립될 수 있다.

하나의 그러한 암 "환경" , 또는 성장 스트레스 상태가 저산소증으로서, 고형 종양 내에서 전형적으로 발견되는 상태이다. 저산소증은 세포들에서 관련 기술 분야에-알려져 있는 방법들을 이용하여 유도될 수 있다. 예를 들면, 저산소증은 세포 시스템들을 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도될 수 있는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업적 가스 믹스에 잠기게 할 수 있다. 효과들은, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100㎛의 CoQ10), 예정된 기간, 예컨대, 저산소증 처치 24 시간 후에 측정될 수 있다.

마찬가지로, 세포들의 락틱 애시드 처치는, 생체 내에서 종양 환경에 존재하는 것과 같은, 해당 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 락틱 애시드 유도 스트레스는, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100㎛의 CoQ10), 예정된 시간, 예컨대, 24시간에, 약 12.5mM의 최종 락틱 애시드 농도에서 조사될 수 있다.

고혈당증은 보통 당뇨병에서 발견되는 조건이다; 그러나 고혈당증 또한 어느 정도 암 성장의 하나의 측면을 모방하는데 이는 많은 암 세포들이 그들의 일차 에너지원으로서 글루코오스에 의존하기 때문이다. 대상 세포들을 전형적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은, 배지들 내의 글루코오스의 최종 농도가 약 22mM이 되도록 10% 배양 등급 글루코오스를 적합한 배지들에 추가하는 것을 포함할 수 있다.

암 성장의 상이한 측면들을 반영하는 개별적 조건들은 커스텀 구축된 암 모델에서 개별적으로 조사될 수 있으며, 및/또는 함께 조합될 수 있다. 일 실시예에서, 암 성장/조건들의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 암 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 암 성장/조건들의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는, 개별적 조건들 및, 추가로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 암 모델에서 조사된다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 또는 10 내지 50 사이의 상이한 조건들의 범주들이다.

본원 명세서의 이하에서 열거되는 것은 세포들의 처치에 사용될 수 있는 조건들의 몇몇 예시적 조합들이다. 여타의 조합들이 수행되는 특이적 질의적 생물학적 평가에 따라 쉽게 공식화될 수 있다.

1. 배지들만

2. 50μM CTL 코엔자임 Q10 (CoQ10)

3. 100μM CTL 코엔자임 Q10

4. 12.5mM 락틱 애시드

5. 12.5mM 락틱 애시드 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

6. 12.5mM 락틱 애시드 + 100μM CTL 코엔자임 Q10

7. 저산소증

8. 저산소증 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

9. 저산소증 + 100μM CTL 코엔자임 Q10

10. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드

11. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

12. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 100μM CTL 코엔자임 Q10

13. 배지들 + 22mM 글루코오스

14. 50μM CTL 코엔자임 Q10 + 22mM 글루코오스

15. 100μM CTL 코엔자임 Q10 + 22mM 글루코오스

16. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스

17. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

18. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 +100μM CTL 코엔자임 Q10

19. 저산소증 + 22mM 글루코오스

20. 저산소증 + 22mM 글루코오스 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

21. 저산소증 + 22mM 글루코오스 + 100μM CTL 코엔자임 Q10

22. 저산소증 +12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스

23. 저산소증 +12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 + 50μM CTL 코엔자임 Q10

24. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 +100μM CTL 코엔자임 Q10

대조구로서 하나 또는 그 이상의 정상 세포 라인들 (예컨대, THLE2 그리고 HDFa)이 암 고유의 단백질들 또는 경로들 동정하기 위하여 유사한 조건들 하에서 배양된다. (이하 참조). 상기 대조구는 위에서 설명한 비교 세포 모델일 수 있다.

단일 암 세포 타입에 대립되는, 동일한 또는 상이한 기원 (예를 들면, 암 라인들 PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7)의 다중 암 세포들이 암 모델에 포함될 수 있다. 일부 상황들에서, 상이한 암세포들 (예컨대, HepG2 그리고 PaCa2) 사이의 교차 대화 또는 ECS 실험들이 몇몇의 상호 관련된 목적들을 위하여 수행될 수 있다.

교차 대화가 개입된 일부 실시예들에서, 세포 모델들에 수행되는 실험들은 하나의 세포 시스템 또는 개체군 (예컨대, 간세포암 세포 HepG2)의 세포 상태 또는 기능의, 규정된 처치 조건들 (예컨대, 고혈당증, 저산소증 (ischemia)) 하의 별개의 세포 시스템 또는 개체군(예컨대, 췌장암 PaCa2)에 의한 조절을 측정하기 위하여 설계된다. 전형적인 세팅에 따르면, 제1 세포 시스템/개체군은, 외부 자극 인자들, 이를테면 후보 분자 (예컨대, 저(small) 약물 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예컨대, 저산소증, 고 글루코오스 환경)에 의하여 접촉된다. 반응하여, 제1 세포 시스템/개체군은, 세포 안과 밖 모두에서 쉽게 검출될 수 있는 변화들을 유도하는, 그의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 및/또는 인터액톰을 변화시킨다. 예를 들면, 전사체군의 변화들은 복수의 표적 mRNAs의 전사 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 단백질체의 변화들은 복수의 표적 단백질들의 발현 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 그리고 대사체군의 변화들은 주어진 대사산물들에 대하여 특별히 설계된 분석법들에 의하여 복수의 표적 대사산물들의 수준에 의하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 대사체군 및/또는 단백질체의 위에 참조된 변화들은, 적어도 일부 분리된 대사산물들 또는 단백질들에 대하여, 제2 세포 시스템/ 개체군의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 그리고 인터액톰의 조절을 포함하는, 그들의 제2 세포 시스템/개체군에 대한 효과들에 의하여 또한 측정될 수 있다. 그러므로, 상기 실험들은 제1 세포 시스템/개체군에 의하여 상이한 치료 상태들 하의 제2 세포 시스템/개체군에 분비되는, 관심 대상의 분자(들)의 효과들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 실험들은 또한 예를 들면, 단백질체학의 차별성 스크리닝에 의하여, 제1 세포 시스템으로부터 별개의 세포 시스템으로의 시그날링 (외부 자극 인자 치료에 반응하여)의 결과로서 조절되는 여하한 단백질들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 동일한 실험적 세팅은 또한 역(reverse) 세팅에 적용될 수 있어서, 두 세포 시스템들 사이의 상보적 효과들이 또한 평가될 수 있다. 일반적으로, 이러한 타입의 실험을 위하여, 세포 라인 쌍(pairs)의 선택은 이를테면 기원, 질병 상태 그리고 세포 기능과 같은 요인들에 주로 기초한다.

비록 두-세포 시스템들이 전형적으로 이러한 타입의 실험 세팅에 개입되어 있으나, 유사한 실험들 역시 둘 이상의 세포 시스템들을 위하여, 예를 들면, 분리된 고체 지지체 상에 각각 별개의 세포 시스템을 고정함으로써, 설계될 수 있다.

일단 커스텀 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 " 동요들(perturbations)"이 시스템에 적용될 수 있는데, 이를테면 환자들 사이의 유전적 변이, 또는 특정 약물들 또는 전구(pro)-약물들로의 치료/또는 치료하지 않음이다. 도 15D 참조. 질병 관련 암 세포들, 그리고 질병 관련 정상 대조구 세포들에 대한 효과를 포함하는, 시스템에 대한 그러한 동요들의 효과들은, 다양한 당해 기술분야에-알려진 또는 특허된 수단들을 이용하여, 아래의 섹션 III.B에 설명된 바와 같이 측정될 수 있다.

예시적 실험에서, 암 라인들 PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7, 그리고 정상 세포 라인들 THLE2 그리고 HDFa, 은 각각의 고혈당증, 저산소증, 그리고 락틱 애시드-풍부 조건들은 물론 둘 또는 셋의 상기 조건들의 모든 조합들, 그리고 추가로 환경의 동요, 특히 코엔자임Q10으로의 치료와 함께 또는 이것 없는, 조건으로 조절된다.

상기 커스텀 구축된 세포 모델은, 본원 명세서에서 설명한 단계들을 수행함으로써, 최종적으로 생물학적 시스템에서 고유한 인과 관계를 동정하기 위하여 본원 발명의 플랫폼 기술의 단계들의 전체에 걸쳐 수립되고 사용될 수 있다. 통상의 기술자들은, 그러나, 생물학적 프로세스의 초기의, "제1 세대(first generation)" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 사용된 커스텀 구축된 세포 모델이, 예컨대, 추가적인 암 또는 정상 세포 라인들 및/또는 추가적인 암 조건들의 도입에 의하여, 연속적으로 진화하거나 시간에 따라 발전(expanded)할 수 있음을 이해할 것이다. 진화된 세포 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 발전된 또는 진화된 세포 모델로부터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 수집된 새로운 데이터는, 더욱 확고한 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 "제1 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 앞서 사용된 데이터 세트들에 추가될 수 있다. 생물학적 시스템에 고유한 새로운 인과 관계들은 이후 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크로부터 동정 될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 모델의 진화는 합의된 인과 관계 네트워크들의 진화를 제공하며, 이로써 생물학적 시스템의 조절물질들에 대한 새로운 및/또는 더욱 신뢰할 수 있는 식견을 제공한다.

커스텀 구축된 세포 모델들의 추가적인 실시예들이 본원 명세서에서 설명된다.

B. 데이터 수집

일반적으로, 두 타입들의 데이터가 여하한 커스텀 구축된 모델 시스템들로부터 수집될 수 있다. 하나의 타입의 데이터 (예컨대, 제1 세트의 데이터, 제3 세트의 데이터)은 대개 일부 마크로 분자들, 이를테면 DNA, RNA, 단백질, 지질, 등등의 수준에 관련된다. 이 카테고리의 예시적 데이터 세트는 단백질체학 데이터 (예컨대, 샘플로부터의 모든 또는 실질적으로 모든 측정할 수 있는 단백질들의 발현에 관련된 정성적 그리고 정량적 데이터)이다. 여타의 타입의 데이터는 일반적으로 제1 타입의 데이터에서의 변화들로부터 도출되는 표현형의 변화들을 반영하는 기능적 데이터 (예컨대, 제2 세트의 데이터, 제4 세트의 데이터)이다.

제1 타입의 데이터와 관련하여, 일부 예시적 실시예들에서, 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) 그리고 단백질체학이 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) 그리고 단백질체학에 의하여 세포 mRNA 그리고 단백질 발현의 변화들을 프로파일 하기 위하여 수행된다. 총 RNA가 상업적 RNA 분리 키트를 이용하여 분리될 수 있다. cDNA 합성 이후, 질병 분야(area) 또는 세포 프로세스들 이를테면 혈관 신생, 세포자멸사, 그리고 당뇨병, 에 대한, 특정의 상업적으로 이용 가능한 qPCR 어레이들 (예컨대, SA Biosciences 社로부터의 제품들)이 제조사의 지시사항들에 따라 예정된 세트의 유전자들을 프로파일 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, Biorad cfx-384 증폭 시스템은 모든 전사 프로파일링 실험들에 사용될 수 있다. 데이터 수집 (Ct) 후, 대조구에 대한 최종 배수(fold) 변화가 δCt 방법을 이용하여 제조사의 프로토콜에 개략된 방법에 따라 측정될 수 있다. 단백질체학 샘플 분석은 아래의 섹션들에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.

본원 발명의 대상 방법은 유사한 특성의 수백 개의 샘플들의 대-규모 고-처리량 정량적 단백질체학 분석법을 사용할 수 있으며, 그리고 세포 아웃풋 차별성을 동정하기 위하여 필요한 데이터를 제공할 수 있다.

이러한 목적에 적합한 수많은 당해 기술 분야에-알려진 기술들이 있다. 하나의 예시적 기술은, 질량 분석기와 조합된 iTRAQ 분석법인데, 이하에서 간단히 설명된다.

정량적 단백질체학 접근법은, 펩티드 동정 및 그리고 정량화를 위하여 2D-LC MALDI MS/MS 및 8-플렉스 iTRAQ 시약으로의 안정한 동위 원소 표지화에 기초한다. 이 기술로의 정량화는 상대적이다: 펩티드들 및 단백질들은 참조 샘플에 상대적인 분포 비율들(abundance ratios)에 할당된다. 다중 iTRAQ 실험들에서의 공통 참조 샘플들은 다중 iTRAQ 실험들에 걸쳐 샘플들의 비교를 수월하게 한다.

예를 들면, 이 분석 계획을 실행하기 위하여, 제조사의 제안에 따르면, 여섯 개의 일차 샘플들 그리고 두 개의 대조구 풀(pool) 샘플들이 하나의 8-플렉스 iTRAQ 믹스로 조합될 수 있다. 8개의 샘플들의 이 혼합물은 이후 2-차원 액체 크로마토그래피에 의하여 분류될 수 있으며; 제 1차원에서 강한 양이온 교환(strong cation exchange) (SCX), 그리고 제2 차원에서 역-상 HPLC, 이후 질량 분석기 분석에 도입될 수 있다.

사용될 수 있는 예시적 실험실용 절차들의 간략한 개관이 본원 명세서에 제공된다.

단백질 추출: 세포들은 8M 우레아 용해(lysis) 버퍼와 프로테아제 억제제들 (Thermo Scientific Halt 프로테아제 억제제 EDTA-없음) 그리고 10분마다 5초간의 벌텍스(vertex)하면서 얼음에 30분간 인큐베이트 함으로써 용해될 수 있다. 용해는 5초 플러스의 초음파 처리로 완료될 수 있다. 세포 용해물들(lysates)은 14000 x g로 15 분간 (4 oC) 세포 찌꺼기(debris)를 제거하기 위하여 원심분리될 수 있다. 브래드포드(Bradford) 분석이 단백질 농도를 측정하기 위하여 수행될 수 있다. 각각의 샘플들로부터 100ug 단백질이 환원되고(10mM 디티오트레이톨 (DTT), 55 ℃, 1 h), 알킬화되고 (25mM 아이오도아세트아마이드, 실온, 30 분) 그리고 트립신으로 소화 (1:25 w/w, 200mM 트리에틸암모니움 바이카르보네이트(TEAB), 37 oC, 16 h) 될 수 있다.

분비단백체 ( secretome ) 샘플 제조: 1) 일 실시예에서, 세포들은 혈청 없는(free) 배지에서 배양될 수 있다: 조절된 배지들 동결 건조기로 농축되고, 환원되고 (10mM 디티오트레이톨 (DTT), 55 °C, 1 h), 알킬화되고 (25mM 아이오도아세트아마이드, 실온에서, 30 분 동안 인큐베이트), 그리고 이후 아세톤(actone) 침전으로 탈염될 수 있다. 농축된 조절된 배지들로부터의 단백질들의 동일한 용량이 트립신 (1:25 w/w, 200mM 트리에틸암모니움 바이카르보네이트 (TEAB), 37 oC, 16 h)으로 소화될 수 있다.

일 실시예에서, 세포들은 혈청 함유 배지에 배양될 수 있다: 이 배지의 부피는 3k MWCO Vivaspin 칼럼들 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 감소될 수 있으며, 이후 1xPBS (Invitrogen)으로 재구성될 수 있다. 혈청 알부민은, 제조사의 지시들에 따라, 조건 배지 용도를 위한 최적화를 위하여 버퍼-교환의 변경으로, AlbuVoid 칼럼 (Biotech Support Group, LLC)를 이용하여 모든 샘플들로부터 고갈시킬 수 있다.

iTRAQ 8 플렉스 표지( labeling ): 각각의 실험 세트에서 각각의 트립신 소화물들(tryptic digest)로부터의 분액은 연합된(pooled) 대조구 샘플을 만들기 위하여 함께 모아진다. 각각의 샘플로부터의 동등한 분액들 및 모아진 대조구 샘플은 제조사의 프로토콜들에 따라 iTRAQ 8 플렉스 시약(AB Sciex)들로 표지될 수 있다. 이 반응들은 조합되고, 진공 건조되고, 0.1% 포르믹 애시드의 추가로 재-현탁되며, 그리고 LC-MS/MS로 분석될 수 있다.

2D- NanoLC - MS / MS : 모든 표지된 펩티드들 혼합물들은 온라인 2D-nanoLC로 분리될 수 있으며 전기분무 탠덤 질량 분석기로 분석될 수 있다. 이 실험들은 나노전기분무 이온 원(nanoelectrospray ion source)이 장착된 LTQ Orbitrap Velos 질량 분석계에 연결된 Eksigent 2D NanoLC 울트라 시스템에서 수행될 수 있다. (Thermo Electron, Bremen, 독일).

펩티드들의 혼합물들은 4㎕/분의 유동의 5cm SCX 칼럼 (300㎛ID, 5㎛, PolySULFOETHYL 아스파르트아마이드 칼럼, 제조사 PolyLC, Columbia, MD)에 주입되며 그리고 10 이온 교환 용출 시그먼트들(segments)에서 C18 트랩(trap) 칼럼 (2.5cm, 100㎛ID, 5㎛, 300Å ProteoPep II, 제조사 New Objective, Woburn, MA)으로 용출되며 그리고 5분 동안 H2O/0.1% FA로 세척될 수 있다. 분리는 이후에 300 nL/분에서 2-45% B (H2O /0.1%FA (용제 A) 및 ACN /0.1% FA (용제 B))의 기울기(gradient)를 사용하여 120분간 15cm 용융 실리카 칼럼 (75㎛ID, 5㎛, 300Å ProteoPep II, 제조사 New Objective, Woburn, MA)상에서 더욱 수행될 수 있다.

풀 스캔(Full scan) MS 스펙트럼들 (m/z 300-2000)이 해상도 30,000으로 오비트랩(Orbitrap)에서 획득될 수 있다. 가장 강한(intense) 이온들은 (10까지) 순차적으로 조각화(fragmentation)에 대하여 HCD (고-에너지 C-trap Dissociation)를 이용하여 분리되며 그리고 동력학적으로 30초 동안 배제(exclude) 할 수 있다. HCD는 분리 폭(isolation width) 1.2 Da으로 수행될 수 있다. 도출되는 조각 이온들은 해상도 7500의 오비트랩에서 스캔될 수 있다. LTQ Orbitrap Velos는 Xcalibur 2.1 with foundation 1.0.1에 의하여 제어될 수 있다.

펩티드들/단백질들 동정 및 정량화: 펩티드들 그리고 단백질들은 SwissProt 데이터베이스에 대한 Mascot 검색 엔진을 갖는 단백질체 발견기 소프트웨어(Proteome Discoverer software) (Thermo Electron)를 이용하여 자동화된 데이터베이스 검색으로 동정될 수 있다. 검색 파라미터들은 MS 톨러런스(tolerance)를 위하여 10 ppm, MS2 톨러런스를 위하여 0.02 Da, 그리고 2까지의 누락된 분할(missed cleavages)을 허용하는 완전한 트립신 소화를 포함할 수 있다. 카르브아미도메틸레이션 (C)은 고정된 변경으로 설정될 수 있다. 산화 (M), TMT6, 그리고 탈아미드화(deamidation) (NQ)는 동력학적 변경들로서 설정될 수 있다. 펩티드들 및 단백질 동정들은 Mascot 현저 역치 (p<0.05)로 필터링 될 수 있다. 필터들은 99% 신뢰 수준의 단백질 동정 (1% FDA)을 허용할 수 있다.

단백질체 발견기 소프트웨어는 리포터 이온들(reporter ions)상에 정정 인자들(corretion factors)을 적용할 수 있으며, 그리고 만약 모든 정량 채널(quantitation channels)들이 존재하지 않으면 모든 정량 값들을 거부할 수 있다. 상대적 단백질 정량은 평균 강도에서 정상화(normalization)에 의하여 달성될 수 있다.

제2 타입의 데이터와 관련하여, 일부 예시적 실시예들에서, 암 그리고 정상 모델들의 생물에너지학 프로파일링은 해당 및 산화적 인산화 구성요소들의 이해를 가능하게 하기 위하여 씨호스™ XF24 분석기를 사용할 수 있다.

특히, 세포들은 최적을 밀도들로 씨호스(Seahorse) 배양 플레이트들 상에 플레이팅 될 수 있다. 이들 세포들은 100 ㎕의 배지 또는 처치에 플레이팅 되며 그리고 5% CO₂의 37^oC 인큐베이터에 방치될 수 있다. 두 시간 후, 세포들이 24 웰 플레이트에 부착되면, 추가적인 150 ㎕의 배지들 또는 치료 용액 중 어느 하나가 추가될 수 있으며 그리고 상기 플레이트들은 하룻밤 동안 배양 인큐베이터에 방치될 수 있다. 이 두 단계 씨딩(seeding) 절차는 배양 플레이트 내에 세포들이 골고루 분포되도록 한다. 산소 및 pH 센서를 함유하는 씨호스 카트리지들은 보정액(calibrating fluid)으로 비-CO₂ 인큐베이터로 37^oC에서 하룻밤동안 수화(hydrated)될 수 있다. 세 미토콘드리아의 약물들이 상기 카트리지의 세 포트들(ports)에 전형적으로 적재된다. 올리고마이신, 복합체 III 억제제, FCCP, 짝풀림제(uncoupler) 그리고 로테논(Rotenone), 복합체 I 억제제가 각각의 카트리지의 포트 A, B 그리고 C로 적재될 수 있다. 모든 저장(stock) 약물들은 10x 농도로 완충되지 않은(unbuffered) DMEM 배지들에 제조될 수 있다. 상기 카트리지들은 분석 전에 약 15분 동안 비-CO₂ 인큐베이터에서 미토콘드리아 화합물들로 제1 인큐베이션 될 수 있다. 씨호스 배양 플레이트들은 정상 성장 배지들에서 발견되는 농도의 글루코오스를 함유하는 DMEM 기초 완충되지 않은 배지들에 세척될 수 있다. 상기 세포들은 630 ㎕의 완충되지 않은 배지들로 적층될(layered) 수 있으며 그리고 미리 보정된 카트리지로 씨호스 기구에 배치되기 전에 비-CO₂ 인큐베이터에서 평형화(equilibriated) 될 수 있다. 상기 기구는 포트를 통하여 약물들의 주입이 개시되기 전에 기저선(baseline)을 얻기 위하여 혼합(mix), 기다림(wait) 그리고 측정 사이클로 삼-사 루프들 동안 작동될 수 있다. 다음 약물이 도입되기 전에 두 루프들이 있을 수 있다.

OCR (산소 소모율) 및 ECAR (세포외 산성화율 Extracullular Acidification Rate)은 7 ㎕ 챔버에서 전극으로 기록될 수 있으며 그리고 씨호스 배양 플레이트에 대한 카트리지 푸싱(pushing)으로 생성될 수 있다.

C. 데이터 통합 및 컴퓨터가상실험 ( in silico ) 모델 생성

일단 관련 데이터 세트들이 수득되면, 데이터 세트들의 통합 및 컴퓨터-실행된 통계학적 모델들의 생성이 AI-기초 정보학 시스템 또는 플랫폼 (예컨대, REFS™ 플랫폼)을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 예시적 AI-기초 시스템은, 대사 엔드(end) 포인트들(ECAR/OCR)의 핵심 드라이버들로서 단백질 연관성들의 시뮬레이션-기초 네트워크들을 생산할 수 있다. 도 15 참조. REFS™ 시스템에 대한 일부 배경의 상세한 설명이 Xing 등, "Causal Modeling Using Network Ensemble Simulations of Genetic and Gene Expression Data Predicts Genes Involved in Rheumatoid Arthritis," PLoS Computational Biology, vol. 7, issue. 3, 1-19 (March 2011) (e100105) 및 미국 특허 제7,512,497호 Periwal에 기재되어 있으며, 각 문헌 전체의 내용이 본원 명세서에 명시적으로 참조 문헌으로 편입된다. 본질적으로, 전술한 바와 같이, REFS™ 시스템은 입력 변수들 (예컨대, 단백질 발현 수준들, mRNA 발현 수준들, 그리고 대응되는 기능적 데이터, 이를테면 씨호스 배양 플레이트들 상에서 측정된 OCR/ECAR 값들) 사이의 인과 관계들을 수립하기 위하여 수학적 알고리즘들을 사용하는 AI-기초 시스템이다. 이 프로세스는 여하한 잠재적, 수립된, 및/또는 입증된 생물학적 상관관계들에 대한 선행기술에 존재하는 지식을 참고하지 않고, 오로지 입력 데이터에만 기초한다.

특히, 본원 발명의 플랫폼의 현저한 장점은 상기 AI-기초 시스템이, 생물학적 프로세스에 대하여 당해 기술 분야에 존재하는 여하한 지식에 의존하거나 이를 참고하지 않고, 세포 모델로부터 수득된 데이터 세트들에 기초한다는 것이다. 또한, 바람직하게는, 어떠한 데이터 포인트들도 통계학적으로 또는 인위적으로 절사되지 않으며, 대신, 모든 수득된 데이터가 단백질 연관성들을 결정하기 위하여 상기 AI-시스템에 공급된다. 따라서, 상기 플랫폼으로부터 생성된 도출되는 통계학적 모델들은, 그들이 여하한 공지된 생물학적 상관관계들을 참고하지 않으므로, 비편향된다.

특별히, 단백질체학 및 ECAR/OCR으로부터의 데이터는 상기 AI-기초 정보 시스템으로 공급될 수 있으며, 이는 위에서 설명한 바와 같이, 데이터 연관성들에 기초한 통계학적 모델들을 구축한다. 단백질 연관성들의 시뮬레이션-기초 네트워크들은 이후, 다음의 방법들을 이용하여 치료 및 조건들을 포함하는, 각각의 질병 대(versus) 정상 시나리오를 위하여 유도된다.

생성된 (예컨대, 최적화된 또는 진화된) 네트워크들의 구축을 위한 예시적 프로세스의 상세한 설명이 아래에서 도 16과 관련되어 제공된다. 위에서 설명한 바와 같이, 단백질체학 및 기능적 세포 데이터로부터의 데이터가 AI-기초 시스템으로 입력된다. (단계 210). 가공되지 않은(raw) 데이터 또는 최소한으로 가공된 데이터일 수 있는 상기 입력 데이터는 선-가공(pre-processed)되며, 이는 정상화 (예컨대, 분위수(quantile) 함수 또는 내부 표준물들을 이용)를 포함할 수 있다. (단계 212). 상기 선-가공은 또한 누락 데이터 값들의 대체(imputing) (예컨대, K-최근접 인접(K-nearest neighbor) (K-NN) 알고리즘을 사용함으로써)를 포함할 수 있다. (단계 212).

상기 선-가공된 데이터는 네트워크 단편 라이브러리를 구성하는데 상용된다. (단계 214). 상기 네트워크 단편들은 측정된 변수들 (입력 데이터)의 모든 가능한 소(small) 세트들 (예컨대, 2-3 멤버 세트들 또는 2-4 멤버 세트들) 사이의 정량적, 연속적 상관관계들을 정의한다. 단편 내의 변수들 사이의 상관관계들은 선형, 로지스틱(logistic), 다항식의(multinomial), 도미넌트(dominanat) 또는 열성 동형접합성(recessive homozygous), 등등일 수 있다. 각각의 단편에서의 상관관계는, 어떻게 후보 상관관계가 입력 데이터에 주어지는데 적합한지, 그리고 또한 그의 수학적 복잡성(complexity)에 대하여 상관관계를 벌하는지(penalizes)를 반영하는 베이지안 확률 스코어가 할당된다. 입력 데이터로부터 추론된 모든 가능한 페어와이즈(pairwise) 그리고 쓰리-웨이(three-way) 상관관계들 (그리고 일부 실시예들에서 또한 포-웨이(four-way) 상관관계들)을 스코어링함으로써, 라이브러리에서 가장 가능성 있는 단편들이 동정될 수 있다. (가능성 있는(the likely) 단편들). 상관관계의 정량적 파라미터들 또한 입력 데이터에 기초하여 컴퓨터 계산되며 그리고 각각의 단편에 대하여 저장된다. 다음으로 제한되지 않으나, 선형 회귀, 로지스틱 회귀, (Analysis of Variance) ANOVA 모델들, (Analysis of Covariance) ANCOVA 모델들, 비-선형/다항식 다항식 회귀 모델들 그리고 심지어 비-매개변수적(parametric) 회귀를 포함하여, 다양한 모델 타입들이, 단편 열거에 사용될 수 있다. 모델 파라미터들에 대한 이전의 추정들(assumptions)은 상기 모델에 사용된 파라미터들의 수에 관련된 베이지안 정보 기준 (BIC) 벌점들(penalties) 또는 걸 분포들(Gull distributions)을 추정할 수 있다. 네트워크 추론(inference) 프로세스에서, 초기 시험 네트워크들의 앙상블 내의 각각의 네트워크는 단편 라이브러리 내의 단편들의 서브세트로부터 구성된다. 초기 시험 네트워크들의 앙상블 내의 각각의 초기 시험 네트워크는 단편 라이브러리로부터의 단편들의 상이한 서브세트로 구성된다. (단계 216).

Xing 등의, "Causal Modeling Using Network Ensemble Simulations of Genetic and Gene Expression Data Predicts Genes Involved in Rheumatoid Arthritis," PLoS Computational Biology, vol. 7, issue. 3, 1-19 (March 2011) (e100105)에 기초하는, 베이지안 네트워크들 그리고 네트워크 단편들의 근간이 되는 수학적 표현의 개관이 아래에 제공된다.

랜덤 변수들

를 갖는 다변수 시스템은 다수의 파라미터들 Θ을 포함하는 다변수 확률 분포(multivariate probability distribution) 함수

로 특성화 된다. 다변수 확률 분포 함수는 인수분해 (factorized)되며 그리고 지역 조건부 확률 분포들 (local conditional probability distributions)의 산물에 의하여 표시될 수 있다:

,

여기서 각각의 변수

는, 그것의

부모(parent) 변수들, 이는

임, 를 감안하면 그것의 비-파생(descendent) 변수들로부터 독립적이다. 인수분해 후, 각각의 지역 확률 분포는 그 자신의 파라미터들 Θ _i 을 갖는다.

다변수 확률 분포 함수는 각각의 특유의 인수분해에서 상이한 방식으로 인수분해될 수 있으며, 그리고 대응되는 파라미터들은 별개의 확률적 모델이 된다. 각각의 특유의 인수분해 (모델)은, 지역 조건부 분포들

내의 변수들 사이에 의존성을 나타내는 버텍스들 사이의 방향이 있는 엣지들 및 각각의 변수

에 대한 버텍스(vertex)를 갖는 방향이 있는(Directed) 아크릴릭 그래프 (DAC)에 의하여 표시될 수 있다. 각각 버텍스 및 연관된 방향이 있는 엣지들을 포함하는, DAG의 서브그래프들은 네트워트 단편들이다.

모델은 입력 데이터를 감안하여, 가장 가능성 있는 인수분해 및 가장 가능성 있는 파라미터들을 결정함으로서 진화되거나 최적화된다. 이것은 "베이지안 네트워크 학습(learning)," 또는, 다시 말해서, 주어진 입력 데이터의 트레이닝 세트(training set)를 감안하여, 입력 데이터에 가장 어울리는 네트워크의 발견으로서 표현될 수 있다. 이것은 입력 데이터에 대하여 각각의 네트워크를 평가하는 스코어링 함수에 의하여 달성된다.

베이지안 프레임워크는 입력 데이터를 감안하여 인수분해의 가능성을 측정하기 위하여 사용된다. 베이즈의 법칙(Bayes Law)은, 주어진 데이터 D에서, 모델 M의 사후(posterior) 확률,

은, 데이터의 확률, P(D)이 상수 교차(constant across) 모델들이라고 가정하면, 모델의 사전(prior) 확률,

이 곱해진, 주어진 모델 추정 데이터의 사후 확률,

, 의 산물의 결과에 비례한다고 기술한다. 이것은 아래의 방정식으로 표현된다:

.

모델 추정 데이터의 사후 확률은 파라미터들의 사전 분포에 대한 데이터 가능성의 적분이다:

.

모든 모델들이 동등한 가능성 (즉, P(M)은 상수) 이라고 가정하면, 주어진 데이터 D에서 모델 M의 사후 확률은, 다음과 같이, 각각의 지역 네트워크 단편 M_i 을 위한 대한 파라미터들에 대한 적분들의 결과들로 인수분해 될 수 있다:

.

상기 방정식에서 선도 상수항(leading constant term)이 생략되었음에 유의 하여야 한다. 일부 실시예들에서, 모델의 사후 확률

의 음수(negative) 로그를 취하는, 베이지안 정보 기준 (BIC)이 다음과 같이 각각의 모델을 "스코어(Score)” 하는데 사용될 수 있다:

,

여기서 모델 M에 대한 총 스코어 S _tot 는 각각의 지역 네트워크 단편에 대한 지역 스코어들 S _i 의 합이다. BIC는 각각의 개별적 네트워크 단편의 스코어를 결정하는 식을 더욱 제공한다:

여기서 κ(M _i )는 모델 M _i 에서의 피팅(fitting) 파라미터의 수이며 그리고 N은 샘플들의 수(데이터 포인트들)이다. S _MLE (M _i )는 네트워크 단편에 대한 가능성(likelihood) 함수의 음수 로그이며, 이는 각각의 네트워크 단편에 사용된 함수(functional) 상관관계들로부터 계산될 수 있다. BIC 스코어에 있어서, 상기 스코어가 낮을수록, 모델이 입력 데이터에 적합하다.

시험 네트워크들의 앙상블은 세계적으로 최적화되어 있는데, 이는 네트워크들의 최적화 또는 진화로 표현될 수 있다 (단계 218). 예를 들면, 시험 네트워크들 은 메트로폴리스 몬테 카를로(Metropolis Monte Carlo 샘플링 알고리즘)에 따라 진화되고 최적화될 수 있다. 시뮬레이션된 어닐링(annealing)이 지역 변환들(local transformations)을 통하여 앙상블에서 각각의 시험 네트워크를 최적화하고 진화시키는데 사용될 수 있다. 예시적 시뮬레이션된 어닐링 프로세스들에서, 각각의 시험 네트워크는 라이브러리로부터 네트워크 단편을 추가함으로써, 시험 네트워크로부터 네트워크 단편을 삭제함으로써, 네트워크 단편을 치환함으로써 또는 그렇지 않으면 네트워크 토폴로지를 변화시킴으로써 변화되며, 그리고 이후에 네트워크를 위한 새로운 스코어가 계산된다. 일반적으로 말해서, 만약 상기 스코어가 개선되면, 변화는 유지되며 그리고 만약 상기 스코어가 악화되면 변화는 거부된다. "온도" 파라미터는, 스코어가 유지되도록 악화시키는 일부 지역적 변화들을 허용하는데, 이는 일부 지역 최소점들(local minima)을 회피하는데 있어서 최적화 프로세스를 돕는다. "온도" 파라미터는 최적화/진화 프로세스의 융합(converge)을 허용하기 위하여 시간에 따라 감소된다.

네트워크 추론 프로세스의 전부 또는 일부는 시험 상이(trial different) 네트워크들에 대하여 병렬로 수행될 수 있다. 각각의 네트워크는 분리된 프로세서 상에서 및/또는 분리된 컴퓨터 장치 상에서 병렬로 최적화될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 최적화 프로세스는 병렬로 작동하는 수백 내지 수천의 프로세서들을 결합시키는 슈퍼컴퓨터상에서 수행될 수 있다. 정보는 병렬 프로세서들 상에서 수행되는 최적화 프로세스들 사이에 공유될 수 있다.

상기 최적화 프로세스는 전체 스코어에 대하여 역치 표준을 만족시키는 것에 실패한 앙상블로부터의 여하한 네트워크들을 떨어뜨리는 네트워크 필터를 포함할 수 있다. 떨어진 네트워크는 새로운 초기의 네트워크에 의하여 대체될 수 있다. 또한 "척도 없는(scale free)" 것이 아닌 여하한 네트워크들이 앙상블로부터 떨어질 수 있다. 네트워크들의 앙상블이 최적화되거나 진화된 후, 그 결과물은 생성된 세포 모델 네트워크들의 앙상블로 명명될 수 있으며, 이는 생성된 합의 네트워크로서 집합적으로 지시될 수 있다.

D. 정량적 상관관계 정보의 추출 및 예측을 위한 시뮬레이션

시뮬레이션이 생성된 세포 모델 네트워크들에서 각각의 상관관계에 대한 정량적 파라미터 정보를 추출하는데 사용될 수 있다. (단계 220). 예를 들면, 정량적 정보 추출을 위한 시뮬레이션은 네트워크 내의 각각의 노드를 10배로 동요(perturbing)(증가 또는 감소시킴) 시키는 것 그리고 모델들에서 여타의 노드들 (예컨대, 단백질들)에 대한 사후 분포들을 계산하는 것에 관계될 수 있다. 엔드포인트들은 그룹 당 100 샘플들의 추정 및 0.01 유의 절사 (significance cut-off)로 t-테스트에 의하여 비교된다. t-테스트 통계는 100 t-테스트들의 중앙값이다. 이 시뮬레이션 기술의 사용을 통하여, 예측 강도를 나타내는 AUC (곡선 하 면적) 및 엔트 포인트를 드라이빙하는 노드의 컴퓨터가상실험 규모를 나타내는 배수 변화(fold change)가 네트워크들의 앙상블 내의 각각의 상관관계에 대하여 생성된다.

지역 컴퓨터 시스템의 상관관계 정량화 모듈이 동요들을 수행하기 위하여 그리고 AUC 정보 및 배수 정보를 추출하기 위하여 AI-기초 시스템을 지휘하는데 사용될 수 있다. 추출된 정량적 정보는 부모 노드를 자식(child) 노드에 연결하는 각각의 엣지에 대한 배수 변화 및 AUC를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 커스텀-구축된 R 프로그램이 정량적 정보의 추출에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 생성된 세포 모델 네트워크들의 앙상블은 시뮬레이션을 통하여 조건들의 변화들에 대한 반응들을 예측하기 위하여 사용될 수 있는데, 이는 나중에 웨트-랩(wet-lab) 세포-기초, 또는 동물-기초, 실험들을 통하여 입증될 수 있다.

AI-기초 시스템의 아웃풋은 정량적 상관관계 파라미터들 및/또는 여타의 시뮬레이션 예측들일 수 있다 (222).

E. 미분( differential ) (델타) 네트워크들의 생성

미분 네트워크 생성 모듈은 생성된 세포 모델 네트워크들과 생성된 비교 세포 모델 네트워크들 사이에 미분(델타) 네트워크들을 생성하는데 사용될 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 일부 실시예들에서, 미분 네트워크는 생성된 세포 모델 네트워크들 및 생성된 비교 세포 모델 네트워크 내의 상관관계들의 모든 정량적 파라미터들을 포함한다. 미분 네크워트 내의 각각의 상관관계에 대한 정량적 파라미터들은 비교에 기초한다. 일부 실시예들에서, 미분이 다양한 미분 네트워크들 사이에 수행될 수 있으며, 이는 델타-델타 네트워크라는 용어로 지시될 수 있다. 델타-델타 네트워크의 실시예는 실시예들에 대한 섹션에서 도 26과 관련하여 설명된다. 미분 네트워크 생성 모듈은 PERL로 쓰여진 프로그램 또는 스크립트일 수 있다.

F. 네트워크들의 가시화( Visualization )

네트워크들의 앙상블 및 미분 네트워크들에 대한 상관관계 값들은 네트워크 가시화 프로그램 (예컨대, 복합체 네트워크 분석을 위한 사이토스케이프 개방 소스 플랫폼 및 사이토스케이프 컨소시엄으로부터의 가시화)을 이용하여 가시화될 수 있다. 네트워크들의 가시적 묘사들에서, 각각의 엣지(예컨대, 단백질들을 연결하는 각각의 라인)의 두께는 배수 변화의 강도를 나타낸다. 상기 엣지들은 또한 인과 관계를 지시하는 방향지시기이며, 그리고 각각의 엣지는 연관된 예측 신뢰 수준을 갖는다.

G. 예시적 컴퓨터 시스템

도 17은 AI-기초 정보학 시스템과 통신하기 위하여, 미분 네트워크들을 생성하기 위하여, 네트워크들을 가시화하기 위하여, 데이터를 저장하고 보관하기 위하여, 및/또는 사용자와 상호작용하기 위하여 일부 실시예에서 사용될 수 있는 예시적 컴퓨터 시스템/환경을 도식적으로 묘사한다. 위에서 설명한 바와 같이, AI-기초 정보학 시스템을 위한 계산들은 직접적으로 또는 간접적으로, 상기 예시적 컴퓨터 시스템과 상호작용하는, 수백 또는 수천의 병렬 프로세서들을 갖는 개별적 슈퍼컴퓨터상에서 수행될 수 있다. 이 환경은 연관된 주변 장치들을 갖는 컴퓨터 장치 (100)을 포함한다. 컴퓨터 장치 (100)은 본원에서 교시된 다양한 방법들 또는 방법들의 일부들을 수행하기 위하여 실행형(executable) 코드 (150)를 수행하도록 프로그램 될 수 있다. 컴퓨터 장치 (100)은 저장 장치 (116), 이를테면 하드-드라이브, CD-ROM, 또는 여타의 비-일시적(transitory) 컴퓨터 판독 가능한 미디어를 포함한다. 저장 장치 (116)은 작동 시스템 (118) 및 여타의 관련된 소프트웨어를 저장할 수 있다. 컴퓨터 장치 (100)은 메모리 (106)를 더 포함할 수 있다. 메모리 (106)는 컴퓨터 시스템 메모리 또는 랜덤 액세스 메모리, 이를테면 DRAM, SRAM, EDO RAM, 등등을 포함할 수 있다. 메모리 (106)은 여타의 타입들의 메모리는 물론, 또는 이들의 조합들을 포함할 수 있다. 컴퓨터 장치 (100)는, 저장 장치 (116) 및/또는 메모리 (106)에, 실행형 코드 (150)의 각각의 부분을 실행하고 프로세싱하기 위한 지시들을 저장할 수 있다.

실행형 코드 (150)은 AI-기초 정보학 시스템 (190)와 통신하기 위한, 미분 네트워크들 (예컨대, 미분 네트워크 생성 모듈)을 생성하기 위한, AI-기초 정보학 시스템으로부터 정량적 상관관계 정보 (예컨대, 상관관계 정량화 모듈)를 추출하기 위한 그리고 네트워크들을 가시화하기 위한 (예컨대, 사이토스케이프) 코드를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 컴퓨터 장치 (100)는 직접적으로 또는 간접적으로 AI-기초 정보학 시스템 (190) (예컨대, REFS를 실행하기 위한 시스템)과 통신할 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 장치 (100)는 데이터 파일들 (예컨대, 데이터 프레임들)을 AI-기초 정보학 시스템 (190)으로 네트워크를 통하여 전달함으로써 AI-기초 정보학 시스템 (190)과 통신할 수 있다. 또한, 컴퓨터 장치 (100)은 인터페이스 및 AI-기초 정보학 시스템 (190)에 지시를 제공하는 실행형 코드 (150)를 가질 수 있다.

일부 실시예들에서, 컴퓨터 장치 (100)는 직접적으로 또는 간접적으로 입력 데이터 세트에 대한 데이터를 제공하는 하나 또는 그 이상의 실험 시스템들 (180)과 통신할 수 있다. 데이터를 생성하기 위한 실험 시스템들 (180)은 질량 분석기 기초 단백질체학, 마이크로어레이 유전자 발현, qPCR 유전자 발현, 질량 분석기 기초 대사체군학, 그리고 질량 분석기 기초 지질체학, SNP 마이크로어레이들, 기능적 분석들의 패널, 그리고 여타의 시험관 내(in-vitro) 생물학 플랫폼들 그리고 기술들을 위한 시스템들을 포함할 수 있다.

컴퓨터 장치 (100)은 또한 프로세서 (102)를 포함하며, 메모리 (106)에 저장된 소프트웨어 그리고 시스템 하드웨어, 주변 장치들 및/또는 주변 하드웨어를 제어하기 위한 여타의 프로그램들을 수행하기 위한 하나 또는 그 이상의 추가적인 프로세서(들) (102’)을 포함할 수 있다. 프로세서 (102) 그리고 프로세서(들) (102’) 각각은 단일 코어 프로세서 또는 다중 코어 (104 그리고 104’) 프로세서일 수 있다. 가상화(Virtualization)가 컴퓨터 장치의 인프라 구조 그리고 자원들이 동력학적으로 공유될 수 있도록 컴퓨터 장치 (100)에 사용될 수 있다. 가상화된 프로세서들 또한 실행형 코드 (150) 및 저장 장치 (116) 내의 여타의 소프트웨어와 함께 사용될 수 있다. 가상 기기(virtual machine) (114)가, 프로세스가 다중이 아닌 오직 하나의 컴퓨팅 자원을 사용하는 것으로 보이도록, 다중 프로세서들을 구동하는 프로세스를 취급하기 위하여 제공될 수 있다. 다중 가상 기기들은 또한 하나의 프로세서로 사용될 수 있다.

사용자는 컴퓨터 장치 (100)와 시각적 디스플레이 장치 (122), 이를테면 컴퓨터 모니터를 통하여 상호작용할 수 있는데, 이는 사용자 인터페이스 (124) 또는 여하한 여타의 인터페이스를 표시할 수 있다. 디스플레이 장치 (122)의 사용자 인터페이스 (124)는 디스플레이 미가공(raw) 데이터의 디스플레이, 네트워크들의 가시적 표시, 등등에 사용될 수 있다. 시각적 디스플레이 장치 (122)는 또한 여타의 측면들 또는 예시적 실시예들의 요소들 (예컨대, 저장 장치 (116)를 위한 아이콘)을 디스플레이 할 수 있다. 컴퓨터 장치 (100)은 사용자로부터의 입력을 수용하기 위한 여타의 I/O 장치들 이를테면 키보드 또는 멀티-포인트 터치 인터페이스 (예컨대, 터치 스크린) (108) 그리고 포인팅 장치 (110), (예컨대, 마우스, 트랙볼 및/또는 트랙패드)를 포함할 수 있다. 키보드 (108) 및 포인팅 장치 (110)는 시각적 디스플레이 장치 (122) 및/또는 컴퓨터 장치 (100)에 유선(wired) 및/또는 무선(wireless) 연결로 연결될 수 있다.

컴퓨터 장치 (100)은 네트워크 장치 (126)와, 표준 전화 라인들, LAN 또는 WAN 링크들 (예컨대, 802.11, T1, T3, 56kb, X.25), 브로드밴드 연결들 (예컨대, ISDN, 프레임 중계(Frame Relay), ATM), 무선 연결들, 콘트롤러 에어리어 네트워크 (CAN), 또는 상기 모든 것의 여하한 일부 또는 모두의 조합을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 로컬 영역 네트워크 (LAN), 광역 네트워크 (WAN) 또는 다양한 연결들을 포함하는 인터넷을 통하여, 인터페이스로 연결하기 위한 네트워크 인터페이스 (112) 를 포함할 수 있다. 네트워크 인터페이스 (112)는 빌트-인 네트워크 어댑터, 네트워크 인터페이스 카드, PCMCIA 네트워크 카드, 카드 버스 네트워크 어댑터, 무선 네트워크 어댑터, USB 네트워크 어댑터, 모뎀 또는 컴퓨터 장치 (100)를 커뮤니케이션 및 본원 명세서에서 설명한 작업들을 수행하도록 할 수 있는 여하한 타입의 네트워크와 인터페이스로 연결되도록 하는데 적합한 여하한 여타의 장치를 포함할 수 있다.

더욱이, 컴퓨터 장치 (100)는 여하한 컴퓨터 시스템 이를테면 워크스테이션, 데스크탑 컴퓨터, 서버, 랩탑, 휴대용 컴퓨터 또는 커뮤니케이션이 가능한 그리고 본원 명세서에서 설명한 작업들의 수행을 위하여 충분한 프로세서 능력 및 메모리 용량을 갖는 여타의 형태의 컴퓨팅 또는 텔레커뮤니케이션 장치일 수 있다.

컴퓨터 장치 (100)는 여하한 작동 시스템 (118) 이를테면 여하한 버전의 마이크로소프트 윈도우 작동 시스템들, 상이한 출시본의 유닉스(Unix) 그리고 리눅스(Linux) 작동 시스템들, 매킨토시 컴퓨터들을 위한 여하한 버젼의 MACOS, 여하한 편입된(embedded) 작동 시스템, 여하한 실-시간 작동 시스템, 여하한 개방 소스 작동 시스템, 여하한 독점된 작동 시스템, 모바일 컴퓨터 장치들을 위한 여하한 작동 시스템들, 또는 컴퓨터 장치 상에서 구동될 수 있으며 본원 명세서에서 설명한 작업들을 수행할 수 있는 여하한 여타의 작동 시스템을 구동할 수 있다. 상기 작동 시스템은 네이티브(native) 모드 또는 에뮬레이트(emulated) 모드에서 구동될 수 있다.

IV . 생물학적 시스템을 위한 모델들 그리고 이들의 용도

A. 생물학적 시스템을 위한 모델의 수립

사실상 모든 생물학적 시스템들 또는 프로세스들은 상이한 세포 타입들 및/또는 기관 시스템들 간의 복잡한 상호작용들에 개입된다. 하나의 세포 타입 또는 기관에서 중대한 기능들의 동요는 여타의 상호작용하는 세포들 타입들 그리고 기관들에 대한 2차 효과를 초래할 수 있으며, 그리고 그러한 다운스트림 변화들은 순차로 초기의 변화들로 피드백 될 수 있으며 그리고 추가 합병증들을 일으킬 수 있다. 그러므로, 주어진 생물학적 시스템 또는 프로세스를 그것의 구성요소들, 이를테면 한 쌍의 세포 타입들 또는 기관들 사이의 상호작용들로 해부하며, 그리고 이들 구성요소들 사이의 상호작용들을 체계적으로 탐지하는 것이 생물학적 시스템 또는 프로세스에 대한 좀더 완전하고, 전체적인 시각을 얻기 위하여 유익하다.

따라서, 본원 발명은 생물학적 시스템들을 위한 세포 모델들을 제공한다. 이러한 목적을 위하여, 본 출원인들은 본 발명의 대상 플랫폼 기술에 사용되는 몇몇 예시적 생물학적 시스템들을 위한 세포 모델들을 구축하였다. 본 출원인들은 생물학적 시스템 고유의 인과관계들을 포함하는 합의된 인과 관계 네트워크들을 생성하기 위하여 본원 대상의 발명 플랫폼 기술을 사용하여 세포 모델들로 실험을 수행하였으며, 그리고 이로써 특정의 생물학적 시스템들 또는 프로세스들에 중요한 "조절물질들" 또는 중대한 분자 “드라이버들”을 동정하였다.

상기 플랫폼 기술 및 이의 구성요소들, 예컨대, 커스텀 구축된 세포 모델들 및 세포 모델들로부터 수득된 데이터 세트들,의 하나의 현저한 장점은 생물학적 시스템 또는 프로세스에 대하여 생성된 초기의, "제1 세대” 합의된 인과 관계 네트워크가 시간의 경과, 예컨대, 추가적인 세포 라인들/타입들 및/또는 추가적인 상태들의 도입에 의하여 연속적으로 진화하거나 또는 발전될 수 있다는 것이다. 진화된 세포 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 발전된 또는 진화된 세포 모델로부터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 수집된 상기 새로운 데이터는 이후 "제1 세대" 합의된 인과 관계 네트워크의 생성에 이미 사용된 데이터 세트들에, 더욱 확고한 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여, 도입될 수 있다. 생물학적 시스템에 고유한 새로운 인과 관계들은 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크로부터 동정될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 모델의 진화는 합의된 인과 관계 네트워크들의 진화를 제공하며, 이로써 생물학적 시스템의 조절물질들에 대하여 새로운 및/또는 더욱 신뢰할 수 있는 식견을 제공한다. 이러한 방식으로, 세포 모델들, 세포 모델들로부터의 데이터 세트들, 그리고 플랫폼 기술 방법들을 사용함으로써 세포 모델들로부터 생성된 인과 관계 네트워크들 모두가 상기 플랫폼 기술로부터 수득된 이전의 지식 위에 진화되며 구축할 수 있다.

따라서, 본원 발명은 플랫폼 기술에 사용된 세포 모델들로부터 생성된 합의된 인과 관계 네트워크들을 제공한다. 이들 합의된 인과 관계 네트워크들은 제1 세대 합의된 인과 관계 네트워크들일 수 있으며, 또는 다중 세대 합의된 인과 관계 네트워크들, 예컨대, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 또는 그 이상의 세대의 합의된 인과 관계 네트워크들일 수 있다. 또한, 본원 발명은 플랫폼 기술에 사용된 세포 모델들로부터 생성된 시뮬레이션 된 합의된 인과 관계 네트워크들을 제공한다. 이들 시뮬레이션 된 합의된 인과 관계 네트워크들은 제1 세대 시뮬레이션 된 합의된 인과 관계 네트워크들일 수 있으며, 또는 다중 세대 시뮬레이션 된 합의된 인과 관계 네트워크들, 예컨대, 제2^, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 또는 그 이상의 시뮬레이션 된 세대의 합의된 인과 관계 네트워크들일 수 있다. 본원 발명은 또한 본원 발명의 여하한 합의된 인과 관계 네트워크들로부터 생성된 델타 네트워크들 그리고 델타-델타 네트워크들을 제공한다.

생물학적 시스템 또는 프로세스를 위한 커스텀 구축된 세포 모델은 생물학적 시스템과 연관된 하나 또는 그 이상의 세포들을 포함한다. 생물학적 시스템/프로세스를 위한 모델은 생물학적 시스템의 환경, 예컨대, 암 세포의 생체 내 환경을 시뮬레이션 하기 위하여 생물학적 시스템 또는 프로세스의 특징적 측면을 모방하는 조건들 (예컨대, 세포 배양 조건들)을 창조함으로써 수립된다.

단일 세포 타입에 대립되는, 동일한 또는 상이한 기원의 다중 세포들이 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 그 이상의 상이한 세포 라인들 또는 세포 타입들이 세포 모델에 포함된다. 일 실시예에서, 세포들은 모두 동일한 타입, 예컨대, 모든 유방 암 세포들 또는 식물 세포들이나, 상이한 수립된 세포 라인들, 예컨대, 유방 암 세포들 또는 식물 세포들의 상이한 수립된 세포 라인들 일 수 있다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 세포 라인들 또는 세포 타입들의 범주들이다.

본원 발명의 세포 모델들에 포함될 수 있는 세포 타입들의 예시에는 인간 세포들, 동물 세포들, 포유동물 세포들, 식물 세포들, 효모, 박테리아, 또는 진균들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 세포 모델들의 세포들은 질병 세포들, 이를테면 암 세포들 또는 박테리아 또는 바이러스에 감염된 세포들을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 모델의 세포들은 질병-연관 세포들, 이를테면 당뇨병에 개입된 세포들, 비만 또는 심혈관 질환 상태에 개입된 세포들, 예컨대, 대동맥 평활근 세포들 또는 간세포들을 포함할 수 있다. 통상의 기술자들은 특정의 생물학적 상태/프로세스, 예컨대, 질병 상태/프로세스에 개입된 또는 연관된 세포들, 그리고 본원 발명의 세포 모델에 포함될 수 있는 여하한 그러한 세포들을 인지할 것이다.

본원 발명의 세포 모델들은 하나 또는 그 이상의 "대조구 세포들"을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 대조구 세포는 처치되지 않거나 동요되지 않은 세포일 수 있다. 다른 실시예에서, "대조구 세포"는 정상, 예컨대, 비-질병, 세포일 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 상이한 대조구 세포들이 세포 모델에 포함된다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 대조구 세포 라인들 또는 대조구 세포 타입들의 범주들이다. 일 실시예에서, 대조구 세포들은 모두 동일한 타입이나 그 세포 타입의 상이한 수립된 세포 라인들이다. 일 실시예에서, 대조구로서, 하나 또는 그 이상의 정상, 예컨대, 비-질병, 세포 라인들이 생물학적 상태 또는 프로세스 고유의 단백질들 또는 경로들의 동정을 위하여 세포 모델의 초대 배양 세포들과 유사한 조건들 하에서 배양되거나, 및/또는 동일한 동요에 노출된다.

본원 발명의 커스텀 세포 모델은 또한 생물학적 상태 또는 프로세스의 특징적 측면을 모방하는 조건들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 조건들이 종양 환경 생체 내의 암 세포의, 또는 심혈관 질환 환자의 대동맥 평활근 세포의 조건들에 매우 근접하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 조건들은 스트레스 조건들이다. 다양한 조건들/스트레스 요인들이 본원 발명의 세포 모델들에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 이들 스트레스 요인들/조건들은 세포 시스템들에 대한 "동요", 예컨대, 외부 자극들을 구성할 수 있다. 하나의 예시적 스트레스 조건은 저산소증으로서, 예를 들면, 고형 종양들 내에서 전형적으로 발견되는 상태이다. 저산소증은 선행 기술에 알려진 방법을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들면, 저산소증은 세포 시스템들을 모듈의 인큐베이터 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도될 수 있는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스에 잠기게 할 수 있다. 효과들은, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100μM의 CoQ10), 예정된 기간, 예컨대, 저산소증 처치 24 시간 후에 측정될 수 있다. 마찬가지로, 락틱 애시드 처치는 해당 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 락틱 애시드 유도 스트레스는, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100 μM의 CoQ10), 예정된 시간, 예컨대, 24 시간에, 약 12.5mM의 최종 락틱 애시드 농도에서 조사될 수 있다. 고혈당증은 당뇨병은 물론 암에서 발견되는 조건이다. 대상 세포들을 처치하기 위하여 사용될 수 있는 전형적인 고혈당증 조건은 배지들 내의 글루코오스의 최종 농도가 약 22mM이 되도록 10% 배양 등급 글루코오스를 적합한 배지들에 추가하는 것을 포함할 수 있다. 고지혈증은 예를 들면, 비만 및 심혈관 질환에서 발견되는 상태이다. 고지혈증 조건들은 세포들을 0.15mM 소듐 팔미테이트 함유 배지에서 배양함으로써 제공될 수 있다. 고인슐린혈증은 예를 들면, 당뇨병에서 발견되는 상태이다. 고인슐린혈증 조건들은 세포들을 1000 nM 인슐린 함유 배지에서 배양함으로써 유도될 수 있다.

개별적 조건들이 본원 발명의 커스텀 구축된 세포 모델들에서 개별적으로, 및/또는 서로 조합하여 조사될 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템의 상이한 특징적 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 커스텀 구축된 세포 모델에서 조사될 수 있다. 일 실시예에서, 개별적 조건들 및, 추가로, 생물학적 시스템의 상이한 특징적 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 커스텀 구축된 세포 모델에서 조사될 수 있다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 또는 10 내지 50 사이의 상이한 조건들의 범주들이다.

일단 커스텀 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 "동요들(perturbations)"이 시스템에 적용될 수 있는데, 이를테면 환자들 사이의 유전적 변이, 또는 특정 약물들 또는 전구(pro)-약물들로의 치료/또는 치료하지 않음이다. 도 15D 참조. 세포 모델 시스템에 대한 시스템에 대한 그러한 동요들의 효과들은 다양한 당해 기술분야에 잘-알려진 또는 독점적 수단들을 이용하여, 아래의 섹션 III.B에 설명된 바와 같이 측정될 수 있다.

커스텀 구축된 세포 모델은 동요, 예컨대, "환경의 동요" 또는 "외부 자극 인자"에 노출될 수 있다. “환경의 동요” 또는 “외부 자극 인자”는 세포 환경에 대하여 내인성(예컨대, 세포 환경은 일부 수준들의 자극제를 함유하며, 그리고 동일한 것이 그 수준을 증가시키기 위하여 추가된다)일 수 있거나, 또는 세포 환경에 외인성 (예컨대, 자극제/동요가 수정 전에는 세포 환경에 크게 결여되어 있다)일 수 있다. 세포 환경은 환경의 동요 또는 외부 자극 인자의 추가로부터 도출되는 2차 변화들에 의하여 더욱 수정될 수 있는데, 이는 외부 자극 인자가, 세포 시스템에 의하여 세포 환경으로 분비되는 분자들을 포함하여, 세포 시스템의 세포 아웃풋을 변화시킬 수 있기 때문일 수 있다. 환경의 동요 또는 외부 자극 인자는 세포 기능에 영향을 미치는 여하한 외부적 물리적 및/또는 화학적 자극들을 포함할 수 있다. 이것은 여하한 작은 또는 큰 유기 또는 무기 분자들, 자연의 또는 합성의 화학물질들, 온도 쉬프트, pH 변화, 방사(radiation), 광 (UVA, UVB 등등.), 마이크로파, 초음파, 전류, 변조된(modulated) 또는 변조되지 않은(unmodulated) 자기장들, 등등을 포함할 수 있다. 환경의 동요 또는 외부 자극 인자는 또한 도입된 유전자 변형 또는 돌연변이 또는 유전자 변형/돌연변이를 일으키는 운반체 (예컨대, 벡터)를 포함할 수 있다.

(i) 교차-대화 세포 시스템들

둘 또는 그 이상의 세포 시스템들이 조사되기를 원하는 일부 상황에서, "교차-대화 세포 시스템"은 예를 들면, 제1 세포 시스템의 변경된 세포 환경을, 제2 세포 시스템의 세포 아웃풋에 영향을 미치기 위하여, 제2 세포 시스템과 접촉되도록 함으로써 형성될 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는, "교차-대화 세포 시스템"은 둘 또는 그 이상의 세포 시스템들을 포함하는데, 여기서 하나 이상의 세포 시스템의 세포 환경은 제2 세포 시스템과 접촉되어, 제2 세포 시스템의 하나 이상의 세포 아웃풋은 변화되거나 영향을 받는다. 일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템 내의 세포 시스템들은 서로 직접적으로 접촉된다. 다른 실시예들에서는, 어떠한 세포 시스템들도 서로 직접 접촉하지 않는다.

예를 들면, 일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 트랜스웰(transwell)의 형태로 될 수 있는데, 여기서 제1 세포 시스템은 하나의 삽입물(insert)에서 자라며 그리고 제2 세포 시스템은 대응되는 웰 구획에서 자란다. 두 세포 시스템들은 동일한 또는 상이한 배지들과 접촉할 수 있으며, 그리고 배지들 구성요소들의 일부 또는 모두를 교환할 수 있다. 하나의 세포 시스템에 추가되는 외부 자극 인자는 실질적으로 하나의 세포 시스템에 의하여 흡수되거나 및/또는 여타의 세포 시스템으로 확산될 기회를 갖기 전에 분해될 수 있다. 대안적으로, 외부 자극 인자는 최종적으로 두 세포 시스템들 사이의 평형에 접근하거나 도달할 수 있다.

일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 개별적으로 배양된 세포 시스템들의 형태를 채용할 수 있는데, 여기서 각각의 세포 시스템은 그 자신만의 배지 및/또는 배양 조건들 (온도, CO₂ 함량, pH, 등등.), 또는 유사한 또는 동일한 배양 조건들을 가질 수 있다. 두 세포 시스템들은 예를 들면, 하나의 세포 시스템으로부터의 조절된(conditioned) 배지를 취하고 이것을 별개의 세포 시스템과 접촉하도록 함으로써 접촉될 수 있다. 두 세포 시스템들 사이의 직접 세포-세포 접촉들 또한, 만약 필요하다면, 시행될 수 있다. 예를 들면, 두 세포 시스템들의 세포들은 여하한 포인트에서 만약 필요하다면 공동-배양될 수 있으며, 그리고 상기 공동-배양된 세포 시스템들은 나중에, 예를 들면, 하나 이상의 세포 시스템의 세포들이 분류될 수 있는 마커 또는 표지 (이를테면 안정하게 발현되는 형광 마커 단백질 GFP)를 가지는 경우 FACS 분류(sorting)에 의하여 분리될 수 있다.

마찬가지로, 일부 실시예들에서, 교차-대화 세포 시스템은 단순히 공동-배양될 수 있다. 하나의 세포 시스템의 세포들의 선택적 처치는, 그 세포 시스템의 세포들을, 별개의 세포 시스템의 세포들과 처치된 세포들을 공동-배양으로 배양하기 전에, 먼저 처치함으로써 실행될 수 있다. 공동-배양 교차-대화 세포 시스템 설정은, 예를 들면, 외부 자극 인자로 제1 세포 시스템을 자극한 후에, 제1 세포 시스템의 세포 표면 변화들에 의하여 일어나는 제2 세포 시스템상의 변화를 연구하는 것이 필요한 경우에 유용할 수 있다.

본원 발명의 교차-대화 세포 시스템은 하나의 또는 양쪽 모두의 세포 시스템들의 세포 아웃풋에 대한 특정의 예정된 외부 자극 인자의 영향을 탐색하는데 특히 적합하다. 그러한 자극의 제1 세포 시스템(자극과 직접적으로 접촉하는)에 대한 일차적 효과는 제1 세포 시스템의 외부 자극들과의 접촉 전 및 후의 세포 아웃풋들 (예컨대, 단백질 발현 수준)을 비교함으로써 측정될 수 있는데, 이는 본원 명세서에서, "(현저한) 세포 아웃풋 차별성"으로 지시될 수 있다. 그러한 자극의 제2 세포 시스템에 대한 2차 효과, 이는 제1 세포 시스템의 변경된 세포 환경을 통하여 매개됨 (이를테면 그것의 분비단백체), 또한 마찬가지로 측정될 수 있다. 예를 들면, 제2 세포 시스템의 단백질체에 있어서, 제1 세포 시스템에 외부 자극들 처치가 있는 제2 세포 시스템의 단백질체와 제1 세포 시스템에 외부 자극들 처치가 없는 제2 세포 시스템의 단백질체 사이의 비교가 이루어질 수 있다. 관찰된 여하한 현저한 변화들 (단백질체 또는 여하한 관심 대상의 여타의 세포 아웃풋들)은 "현저한 세포 교차-대화 차별성"으로 지시될 수 있다.

세포 아웃풋 측정에 있어서 (이를테면 단백질 발현), 절대적 발현 양 또는 상대적 발현 수준 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 예를 들면, 제2 세포 시스템의 상대적 단백질 발현 수준을 측정하기 위하여, 제1 세포 시스템에 대한 외부 자극들이 있거나 또는 없는, 제2 세포 시스템의 여하한 주어진 단백질의 양이, 적합한 대조구 세포 라인 그리고 세포 라인들의 혼합물에 비교되며 배수-증가 또는 배수-감소 값으로 주어질 수 있다. 그러한 배수-증가 (예컨대, 적어도 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100 또는 그 이상의 배수 증가) 또는 배수-감소 (예컨대, 적어도 0.95, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 또는 0.05배, 또는 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 미만으로 감소)에 대한 예정된 역치 수준이 현저한 세포 교차-대화 차별성을 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한 범주들의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예컨대, 1.5 내지 5배 사이, 2 내지 10배 사이, 1 내지 2배 사이, 또는 0.9 내지 0.7배 사이의 범주들이며, 이는 본원 발명의 일부로서 의도된 것이다.

본원 명세서 전체에서, 목록으로 제시되는 모든 값들, 예컨대, 이를테면 상기한 것들 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위들의 상한 또는 하한일 수 있다.

심혈관 질환 모델의 측면들을 모방하기 위하여 수립된 하나의 예시적 두-세포 시스템을 설명하기 위하여, 심장 평활근 세포 라인(제1 세포 시스템)이 저산소증 조건 (외부 자극 인자)으로 처리되며, 그리고 신장 세포들을 심장 평활근의 조절된 배지와 접촉시킴으로서 도출되는 신장 세포 라인 (제2 세포 시스템)에서의 단백질체 변화들이 전통적인 정량적 질량 분석기를 이용하여 측정될 수 있다. 이들 신장세포들에서, 적절한 대조구 (예컨대, 저산소증 조건들로 처리되지 않은 유사하게 배양된 심장 평활근 세포들로부터의 조절된 배지와 접촉된 유사하게 배양된 신장 세포들)과의 비교에 기초한, 현저한 세포 교차-대화 차별성이 측정될 수 있다.

모든 관찰되는 현저한 세포 교차-대화 차별성이 생물학적으로 의미 있는 것은 아니다. 본 발명의 대상인 질의적 생물학적 평가가 적용되는 여하한 주어진 생물학적 시스템에 있어서, 일부 (또는 아마도 전부)의 현저한 세포 교차-대화 차별성은 주제가 되는 특이적 생물학적 문제에 대하여 "결정요인(determinative)"일 수 있는데, 예컨대, 질병 상태를 일으키는데 책임이 있거나 (치료적 중재를 위한 잠재적 표적) 또는 질병 상태에 대한 바이오마커 (잠재적 진단 또는 예후 요인)이다.

그러한 결정요인 교차-대화 차별성은 대상 방법의 사용자 측에 의하여 선택될 수 있거나, 또는 생물정보학 소프트웨어 프로그램, 이를테면 DAVID-구동의 비교 경로 분석 프로그램, 또는 KEGG 경로 분석 프로그램에 의하여 선택될 수 있다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 사용되며, 그리고 둘 또는 그 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램들로부터의 합의 결과들이 바람직하다.

본원에서 사용되는, 세포 아웃풋들의 "차별성"은 세포 아웃풋들의 여하한 하나 또는 그 이상의 파라미터들에서의 차이들 (예컨대, 증가된 또는 감소된 수준들)을 포함한다. 예를 들면, 단백질 발현 수준의 측면에 있어서, 두 세포 아웃풋들 사이의 차별성, 이를테면 외부 자극 인자에 의한 처치 전과 후의 세포 시스템과 연관된 아웃풋들, 은 공지된 기술들, 이를테면 질량 분석법에 기초한 분석들 (예컨대, iTRAQ, 2D-LC-MSMS, 등등)에 의하여 측정되고 수량화될 수 있다.

(ii) 암 특이적 모델들

생물학적 시스템 또는 프로세스의 일 실시예는 암이다. 여하한 여타의 복잡화된 생물학적 프로세스 또는 시스템과 같이, 암은 다중의 고유의 측면들로 특징져지는 복잡한 병리학적 상태이다. 예를 들면, 그것의 높은 성장률로 인하여, 많은 암 세포들은 저산소증 상태들에서 성장하고, 상향-제어된 해당 및 감소된 산화적 인산화 대사 경들을 갖도록 적응된다. 그 결과, 암 세포들은 환경의 동요, 이를테면 잠재적 약물로의 치료에 대하여, 동일한 치료에 반응하는 정상 세포에 의한 반응에 비교하여, 상이하게 반응할 수 있다. 따라서, 정상 세포들의 반응들에 비교되는 약물 치료에 대한 암의 고유의 반응들을 해독하는 것이 관심의 대상일 것이다. 이러한 목적을 위하여, 커스텀 암 모델이, 암 세포의 환경, 예컨대, 생체 내의 종양 내, 를 시뮬레이션하기 위하여 적합한 암 세포 라인들을 선택하고 질병 상태 또는 프로세스의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건들을 참고함으로써 수립될 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 조건들은 종양 생체 내의 암 세포의 조건들에 매우 근접하거나, 또는 암 성장의 다양한 측면들을 모방하기 위하여, 암 세포들의 상이한 성장 조건들을 분리함으로써, 선택될 수 있다.

동일한 또는 상이한 기원의 다중 암 세포들 (예를 들면, 암 라인들 PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7)이, 단일 암 세포 타입에 대립함, 암 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 상이한 암 세포 라인들 또는 암 세포 타입들이 암 모델에 포함될 수 있다. 전술한 목록에서 제시되는 모든 값들은, 또한, 본 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 암 세포 라인들 또는 세포 타입들의 범주들이다.

일 실시예에서, 암 세포들은 모두 동일한 타입, 예컨대, 모두 유방 암 세포들이나, 상이하게 수립된 세포 라인들, 예컨대, 상이하게 수립된 유방 암 세포 라인들이다.

암 모델에 포함될 수 있는 암 세포 타입들의 예시들에는, 이하로 제한되는 것은 아니나, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 편평세포암종, 대장암, 췌장암, 갑상선 암, 자궁내막암, 방광 암, 신장암, 고형 종양, 백혈병, 비-호지킨 림프종을 포함한다. 일 실시예에서, 약제-내성 암 세포가 암 모델에 포함될 수 있다. 암 모델에 포함될 수 있는 세포 라인들의 특이적 실시예들은, 이하로 제한되는 것은 아니나, PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7 세포들을 포함한다. 수많은 암 세포 라인들이 선행기술에 공지되며, 그리고 여하한 그러한 암 세포 라인이 본원 발명의 암 모델에 포함될 수 있다.

본원 발명의 세포 모델들은 하나 또는 그 이상의 "대조구 세포들"을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 대조구 세포는 처치되지 않거나 동요되지 않은 암 세포일 수 있다. 다른 실시예에서, "대조구 세포"는 정상, 예컨대, 비-암성, 세포일 수 있다. 수많은 정상, 비-암성(cancerous) 세포 라인들 중 여하한 하나가 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 정상 세포들은 하나 또는 그 이상의 THLE2 그리고 HDFa 세포들이다. 일 실시예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 상이한 정상세포 타입들이 암 모델에 포함된다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 정상 세포 라인들 또는 세포 타입들의 범주들이다. 일 실시예에서, 정상 세포들은 모두 동일한 타입, 예컨대, 모두 건강한 상피 또는 유방 세포들이나, 상이하게 수립된 세포 라인들, 예컨대, 상피 또는 유방 세포들의 상이하게 수립된 세포 라인들이다. 일 실시예에서, 대조구로서, 하나 또는 그 이상의 정상 비-암성 세포 라인들 (예컨대, THLE2 그리고 HDFa)이, 암 고유의 단백질들 또는 경로들을 동정하기 위하여 세포 모델의 암세포들과 같은, 유사한 조건들에서 배양되거나, 및/또는 동일한 동요에 노출된다.

커스텀 암 모델은 또한 암성 상태 또는 프로세스의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 조건들은 종양 환경 생체 내에서 암 세포의 조건들에 매우 근접하거나, 또는 암 세포들의 상이한 성장 조건들을 분리함으로써, 암 성장의 다양한 측면들을 모방하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 세포 배양 조건들은 스트레스 상태들이다.

하나의 그러한 암 "환경", 또는 스트레스 상태, 는 저산소증으로서, 전형적으로 고형 종양 내에서 발견되는 조건이다. 저산소증은 공지된 방법들을 이용하여 세포들에서 유도될 수 있다. 예를 들면, 저산소증은 세포 시스템들을 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도될 수 있는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업적 가스 믹스에 잠기게 할 수 있다. 효과들은, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100 μM의 CoQ10), 예정된 기간, 예컨대, 저산소증 처치 24 시간 후에 측정될 수 있다.

마찬가지로, 세포들의 락틱 애시드 처치는, 생체 내에서 종양 환경에 존재하는 것과 같은, 해당 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 락틱 애시드 유도 스트레스는, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100 μM의 CoQ10), 예정된 시간, 예컨대, 24 시간에, 약 12.5mM의 최종 락틱 애시드 농도에서 조사될 수 있다.

고혈당증은 보통 당뇨병에서 발견되는 조건이다; 그러나 고혈당증 또한 어느 정도 암 성장의 하나의 측면을 모방하는데 이는 많은 암 세포들이 그들의 일차 에너지원으로서 글루코오스에 의존하기 때문이다. 대상 세포들을 전형적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은, 배지들 내의 글루코오스의 최종 농도가 약 22mM이 되도록 10% 배양 등급 글루코오스를 적합한 배지들에 추가하는 것을 포함할 수 있다.

암 성장의 상이한 측면들을 반영하는 개별적 조건들은 커스텀 구축된 암 모델에서 개별적으로 조사될 수 있으며, 및/또는 함께 조합될 수 있다. 일 실시예에서, 암 성장/조건들의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 암 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 암 성장/조건들의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는, 개별적 조건들 및, 추가로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 암 모델에서 조사된다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 또는 10 내지 50 사이의 상이한 조건들의 범주들이다.

일단 커스텀 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 "동요들(perturbations)"이 시스템에 적용될 수 있는데, 이를테면 환자들 사이의 유전적 변이, 또는 특정 약물들 또는 전구(pro)-약물들로의 치료/또는 치료하지 않음이다. 도 15D 참조. 질병 관련 암 세포들, 그리고 질병 관련 정상 대조구 세포들에 대한 효과를 포함하는, 시스템에 대한 그러한 동요들의 효과들은 다양한 당해 기술분야에-알려진 또는 특허된 수단들을 이용하여, 아래의 섹션 III.B에 설명된 바와 같이 측정될 수 있다.

예시적 실험에서, 암 라인들 PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7, 그리고 정상 세포 라인들 THLE2 그리고 HDFa, 은 각각의 고혈당증, 저산소증, 그리고 락틱 애시드-풍부 조건들은 물론 둘 또는 셋의 상기 조건들의 모든 조합들, 그리고 추가로 환경의 동요, 특히 코엔자임Q10으로의 처치와 함께 또는 이것 없는, 조건으로 조절된다. 본원 명세서의 이하에서 열거되는 것은, 암 세포 모델의 암 세포들 및/또는 대조구(예컨대, 정상) 세포들의 처치에 사용될 수 있는, 동요, 코엔자임 Q10 처치가 있거나 없는, 조건들의 그러한 예시적 조합들이다. 여타의 조합들이 수행되는 특정의 질의적 생물학적 평가에 따라 쉽게 공식화될 수 있다.

1. 배지들만

2. 50 μM CTL 코엔자임 Q10

3. 100 μM CTL 코엔자임 Q10

4. 12.5mM 락틱 애시드

5. 12.5mM 락틱 애시드 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

6. 12.5mM 락틱 애시드 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

7. 저산소증

8. 저산소증 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

9. 저산소증 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

10. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드

11. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

12. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

13. 배지들 + 22mM 글루코오스

14. 50 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22mM 글루코오스

15. 100 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22mM 글루코오스

16. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스

17. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

18. 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10

19. 저산소증 + 22mM 글루코오스

20. 저산소증 + 22mM 글루코오스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

21. 저산소증 + 22mM 글루코오스 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

22. 저산소증 +12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스

23. 저산소증 +12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

24. 저산소증 + 12.5mM 락틱 애시드 + 22mM 글루코오스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10

일부 상황들에서, 상이한 암세포들 (예컨대, HepG2 그리고 PaCa2) 사이의 교차 대화 또는 ECS 실험들이 몇몇의 상호 관련된 목적들을 위하여 수행될 수 있다. 교차 대화가 개입된 일부 실시예들에서, 세포 모델들에 수행되는 실험들은 하나의 세포 시스템 또는 개체군 (예컨대, 간세포암 세포 HepG2)의 세포 상태 또는 기능의 조절을, 규정된 처치 조건들 (예컨대, 고혈당증, 저산소증 (ischemia)) 하의 별개의 세포 시스템 또는 개체군(예컨대, 췌장암 PaCa2)에 의하여 측정하기 위하여 설계된다. 전형적인 세팅에 따르면, 제1 세포 시스템/개체군은 외부 자극 인자들, 이를테면 후보 분자 (예컨대, 저(small) 약물 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예컨대, 저산소증, 고 글루코오스 환경)에 의하여 접촉된다. 반응하여, 제1 세포 시스템/개체군은 세포 안과 밖 모두에서 쉽게 검출될 수 있는 변화들을 유도하는 그의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 및/또는 인터액톰을 변화시킨다. 예를 들면, 전사체군의 변화들은 복수의 표적 mRNAs의 전사 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 단백질체의 변화들은 복수의 표적 단백질들의 발현 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 그리고 대사체군의 변화들은 주어진 대사산물들에 대하여 특별히 설계된 분석법들에 의하여 복수의 표적 대사산물들의 수준에 의하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 대사체군 및/또는 단백질체의 위에 참조된 변화들은, 적어도 일부 분리된 대사산물들 또는 단백질들에 대하여, 제2 세포 시스템/ 개체군의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 그리고 인터액톰의 조절을 포함하는, 그들의 제2 세포 시스템/개체군에 대한 효과들에 의하여 또한 측정될 수 있다. 그러므로, 상기 실험들은 제1 세포 시스템/개체군에 의하여 분비되는, 관심 대상의 분자(들)의 상이한 처치 조건들 하의 제2 세포 시스템/개체군에 대한 효과들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 실험들은 또한 예를 들면, 단백질체학의 차별성 스크리닝에 의하여, 제1 세포 시스템으로부터 별개의 세포 시스템으로의 시그날링 (외부 자극 인자 치료에 반응하여)의 결과로서 조절되는 여하한 단백질들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 동일한 실험적 세팅은 또한 역(reverse) 세팅에 적용될 수 있어서, 두 세포 시스템들 사이의 상보적 효과들이 또한 평가될 수 있다. 일반적으로, 이러한 타입의 실험을 위하여, 세포 라인 쌍(pairs)의 선택은 이를테면 기원, 질병 상태 그리고 세포 기능과 같은 요인들에 주로 기초한다.

비록 두-세포 시스템들이 전형적으로 이러한 타입의 실험 세팅에 개입되어 있으나, 유사한 실험들 역시 둘 이상의 세포 시스템들을 위하여, 예를 들면, 분리된 고체 지지체 상에 각각 별개의 세포 시스템을 고정함으로써, 설계될 수 있다.

상기 커스텀 구축된 세포 모델은, 본원 명세서에서 설명한 단계들을 수행함으로써, 최종적으로 생물학적 시스템에서 고유한 인과 관계를 동정하기 위하여 본원 발명의 플랫폼 기술의 단계들의 전체에 걸쳐 수립되고 사용될 수 있다. 통상의 기술자들은, 그러나, 생물학적 프로세스의 초기의, "제1 세대(first generation)" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 사용된 커스텀 구축된 세포 모델이, 예컨대, 추가적인 암 또는 정상 세포 라인들 및/또는 추가적인 암 조건들의 도입에 의하여, 연속적으로 진화하거나 시간에 따라 발전(expand)할 수 있음을 이해할 것이다. 진화된 암 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 데이터가 수집될 수 있다. 발전된 또는 진화된 암 모델로부터, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 수집된 새로운 데이터는, 보다 확고한 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여, "제1 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 앞서 사용된 데이터 세트들에 도입될 수 있다. 암 상태에 고유한 (또는 동요에 대한 암 상태의 반응에 고유한) 새로운 인과 관계들은 이후 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크로부터 동정될 수 있다. 이러한 방식으로, 암 모델의 진화는 합의된 인과 관계 네트워크들의 진화를 제공하며, 이로써 암 상태의 결정요인 드라이버들 (또는 조절물질들)에 대한 새로운 및/또는 더욱 신뢰할 수 있는 식견을 제공한다.

(iii) 당뇨병/비만/심혈관 질환 세포 모델들

생물학적 시스템 또는 프로세스의 여타의 실시예들은 당뇨병, 비만 그리고 심혈관 질환이다. 암에서의 경우와 같이, 당뇨병, 비만 그리고 심혈관 질환의 관련된 질병 상태들은 다중의 고유의 측면들로 특징져지는 복잡화된 병리학적 상태들이다. 당뇨병/비만/ 심혈관질환의 발병기전을 움직이는 단백질들/경로들의 동정이 관심 대상일 것이다. 정상 세포들의 반응들에 비한 약물 치료에 대한 당뇨병/비만/심혈관 질환과 연관된 세포들의 고유의 반응을 해독하는 것 또한 관심 대상일 것이다. 이러한 목적을 위하여, 커스텀 당뇨병/비만/심혈관 모델이, 질병-관련 세포들이 경험하는 환경을 시뮬레이션하기 위하여, 적합한 세포 라인들을 선택하고 상기 질병 상태 또는 프로세스의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건들을 생성함으로써, 수립될 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 조건들은 고혈당증, 고지혈증, 고인슐린혈증, 저산소증 또는 락틱-애시드 풍부 조건들에 매우 근접하도록 선택될 수 있다.

당뇨병/비만/심혈관 질환에 관련된 여하한 세포들이 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에 포함될 수 있다. 당뇨병/비만/심혈관 질환 관련 세포들의 예시에는, 예를 들면, 지방세포들(adipocytes), 근관들(myotubes), 간세포들(hepatocytes), 대동맥 평활근 세포들 (HASMC) 그리고 근위 세뇨관(proximal tubular) 세포들 (예컨대, HK2)이 포함된다. 동일한 또는 상이한 기원의 다중 세포 타입들이, 단일 세포 타입에 대립됨, 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 상이한 세포 타입들이 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에 포함된다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 세포 타입들의 범주들이다. 일 실시예에서, 세포들은 모두 동일한 타입, 예컨대, 모두 지방세포들이나, 하지만 상이하게 수립된 세포 라인들, 예컨대, 상이하게 수립된 지방세포 세포 라인들이다. 당뇨병/비만/심혈관 질환에 개입된 수많은 여타의 세포 타입들이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그리고 여하한 그러한 세포들이 본원 발명의 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에 포함될 수 있다.

본원 발명의 당뇨병/비만/심혈관 질환 세포 모델들은 하나 또는 그 이상의 "대조구 세포들"을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 대조구 세포는 처치되지 않거나 동요되지 않은 질병-관련 세포, 예컨대 고지혈증 또는 고인슐혈증 조건에 노출되지 않은 세포일 수 있다. 다른 실시예에서, "대조구 세포"는 비-질병 관련 세포, 이를테면 상피세포일 수 있다. 수많은 비-질병 관련 세포들 중 여하한 하나가 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 상이한 비-질병 관련 세포 타입들이 상기 세포 모델에 포함된다. 전술한 목록에 제시된 모든 값들은 또한, 본원 발명의 일부로서 의도되는, 범주들의 상한 또는 하한 일 수 있는데, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 5 내지 15 사이의 상이한 비-질병 관련 세포 라인들 또는 세포 타입들의 범주들이다. 일 실시예에서, 상기 비-질병 관련 세포들은 모두 동일한 타입, 예컨대, 모두 건강한 상피 또는 유방 세포들이나, 상이하게 수립된 세포 라인들, 예컨대, 상피 또는 유방 세포들의 상이하게 수립된 세포 라인들이다. 일 실시예에서, 대조구로서, 하나 또는 그 이상의 비-질병 관련 세포 라인들이, 당뇨병/비만/심혈관 질환 고유의 단백질들 또는 경로들을 동정하기 위하여 세포 모델의 질병 관련 세포들과 같은, 유사한 조건들에서 배양되거나, 및/또는 동일한 동요에 노출된다.

커스텀 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델은 또한 당뇨병/비만/심혈관 질환 상태 또는 프로세스의 특징적 측면(이의 병태생리)을 모방하는 세포 배양 조건들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 조건들은 환경 생체 내에서 당뇨병/비만/심혈관 질환에 관련된 세포의 조건들에 매우 근접하거나, 또는 당뇨병/비만/심혈관 질환의 다양한 측면들을 모방하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 세포 배양 조건들은 스트레스 상태들이다.

당뇨병/ 비만/ 심혈관 질환의 병태생리를 나타내는 예시적 상태들에는 예를 들면, 여하한 하나 또는 그 이상의 저산소증, 락틱 애시드 풍부 상태들, 고혈당증, 고지혈증(hyperlimidemia) 그리고 고인슐린혈증이 포함된다. 저산소증은 공지된 방법들을 이용하여 세포들에서 유도될 수 있다. 예를 들면, 저산소증은 세포 시스템들을 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도될 수 있는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업적 가스 믹스에 잠기게 할 수 있다. 효과들은, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100 μM의 CoQ10), 예정된 기간, 예컨대, 저산소증 처치 24 시간 후에 측정될 수 있다.

마찬가지로, 세포들의 락틱 애시드 처치는 해당 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 락틱 애시드 유도 스트레스는, 추가적인 외부 자극 인자들과 함께 그리고 이들 없이 (예컨대, 0, 50, 또는 100 μM의 CoQ10), 예정된 시간, 예컨대, 24 시간에, 약 12.5mM의 최종 락틱 애시드 농도에서 조사될 수 있다. 고혈당증은 당뇨병에서 발견되는 조건이다. 대상 세포들을 전형적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은, 배지들 내의 글루코오스의 최종 농도가 약 22mM이 되도록 10% 배양 등급 글루코오스를 적합한 배지들에 추가하는 것을 포함할 수 있다. 고지혈증은 비만 그리고 심혈관 질환에서 발견되는 조건이다. 고지혈증 조건들은 세포들을 0.15mM 소듐 팔미테이트 함유 배지에서 배양함으로써 제공될 수 있다. 고인슐린혈증은 당뇨병에서 발견되는 조건이다. 고인슐혈증 상태들은 세포들을 1000 nM 인슐린 함유 배지들에서 배양함으로써 유도될 수 있다.

당뇨병/ 비만/ 심혈관 질환의 병태 생리를 나타내는 추가적인 조건들은, 예를 들면, 여하한 하나 또는 그 이상의 염증, 소포체(endoplasmic reticulum) 스트레스), 미토콘드리아의 스트레스 그리고 퍼옥시좀(peroxisomal) 스트레스를 포함한다. 세포들에서 염증-유사 상태를 생성하는 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 염증 조건은 세포들을 TNFalpha 및 또는 IL-6의 존재 하에서 배양함으로써 시뮬레이션 될 수 있다. 소포체 스트레스를 시뮬레이션하는 조건들을 생성하는 방법들 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 소포체 스트레스를 시뮬레이션하는 조건들은 세포들을 탑시가르긴(thapsigargin) 및/또는 투니카마이신(tunicamycin)의 존재 하에 배양함으로써 생성될 수 있다. 미토콘드리아의 스트레스를 시뮬레이션하는 조건들을 생성하는 방법들 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미토콘드리아의 스트레스를 시뮬레이션하는 조건들은 세포들을 라파마이신(rapamycin) 및/또는 갈락토오스(galactose)의 존재 하에서 배양함으로써 생성될 수 있다. 퍼옥시좀의 스트레스를 시뮬레이션 하는 조건들을 생성하는 방법들 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 퍼옥시좀의 스트레스를 시뮬레이션 하는 조건들은 세포들을 아브시직 애시드(abscisic acid) 존재 하에서 배양함으로써 생성될 수 있다.

당뇨병/비만/심혈관 질환의 상이한 측면들을 반영하는 개별적 조건들은 커스텀 구축된 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에서 개별적으로 조사될 수 있으며, 및/또는 함께 조합될 수 있다. 일 실시예에서, 당뇨병/비만/심혈관 질환의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 당뇨병/비만/심혈관 질환의 상이한 측면들을 반영하거나 시뮬레이션하는, 개별적 조건들 및, 추가로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합들이 커스텀 구축된 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델에서 조사된다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 또는 10 내지 50사이의 상이한 조건들의 범주들이다.

일단 커스텀 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 " 동요들(perturbations)"이 상기 시스템에 적용될 수 있는데, 이를테면 환자들 사이의 유전적 변이, 또는 특정 약물들 또는 전구(pro)-약물들로의 치료/또는 치료하지 않음이다. 도 15D 참조. 당뇨병/비만/심혈관 질환 관련 세포들에 대한 효과를 포함하는, 상기 시스템에 대한 그러한 동요들의 효과들은 다양한 당해 기술분야에-알려진 또는 특허된 수단들을 이용하여, 아래의 섹션 III.B에 설명된 바와 같이 측정될 수 있다.

예시적 실험에서, 각각의 지방세포들, 근관들, 간세포들, 대동맥 평활근 세포들 (HASMC) 그리고 근위 세뇨관 세포들 (HK2), 은 각각의 고혈당증, 저산소증, 고지혈증, 고인슐린혈증, 그리고 락틱 애시드-풍부 조건들은 물론 둘, 셋, 넷 그리도 모든 다섯 조건들의 모든 조합들, 그리고 추가로 환경의 동요, 특히 코엔자임Q10으로의 처치와 함께 또는 이것 없는, 조건으로 조절된다. 암 모델의 문맥에서 위에서 설명된 조건들의 예시적 조합들에 추가로, 본원 명세서의 이하에서 열거되는 것은, 당뇨병/비만/심혈관 질환 세포 모델의 당뇨병/비만/심혈관 질환 관련 세포들 (및/또는 대조구 세포들)의 처치에 사용될 수 있는, 동요, 코엔자임 Q10 처치가 있거나 없는, 조건들의 일부 추가적 예시적 조합들이다. 이들은 단지 예시적으로 의도된 것이며, 그리고 통상의 기술자는 당뇨병/ 비만/ 심혈관 질환의 병태생리를 나타내는 전술한 조건들의 여하한 개별적 및/또는 조합이 아웃풋 데이터 세트들 생성하기 위하여 세포 모델에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 여타의 조합들이 수행되는 특정의 질의적 생물학적 평가에 따라 쉽게 공식화될 수 있다.

1. 배지들만

2. 50 μM CTL 코엔자임 Q10

3. 100 μM CTL 코엔자임 Q10

4. 0.15mM 소듐 팔미테이트

5. 0.15mM 소듐 팔미테이트 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

6. 0.15mM 소듐 팔미테이트 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

7. 1000 nM 인슐린

8. 1000 nM 인슐린 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

9. 1000 nM 인슐린 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

10. 1000 nM 인슐린 + 0.15mM 소듐 팔미테이트

11. 1000 nM 인슐린 + 0.15mM 소듐 팔미테이트 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10

12. 1000 nM 인슐린 + 0.15mM 소듐 팔미테이트 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10

일부 상황들에서, 상이한 질병-관련 세포들 (예컨대, HASMC 그리고 HK2 세포들, 또는 간 세포들 그리고 지방세포들) 사이의 교차 대화 또는 ECS 실험들이 몇몇의 상호 관련된 목적들을 위하여 수행될 수 있다. 교차 대화가 개입된 일부 실시예들에서, 세포 모델들에 수행되는 실험들은, 하나의 세포 시스템 또는 개체군 (예컨대, 간 세포들)의 세포 상태 또는 기능의 조절을, 규정된 처치 조건들 (예컨대, 고혈당증, 저산소증, 고지혈증, 고인슐린혈증) 하의 별개의 세포 시스템 또는 개체군(예컨대, 지방세포들)에 의하여 측정하기 위하여 설계된다. 전형적인 세팅에 따르면, 제1 세포 시스템/개체군은, 외부 자극 인자들, 이를테면 후보 분자 (예컨대, 저(small) 약물 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예컨대, 저산소증, 고 글루코오스 환경)에 의하여 접촉된다. 반응하여, 제1 세포 시스템/개체군은, 세포 안과 밖 모두에서 쉽게 검출될 수 있는 변화들을 유도하는, 그의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 및/또는 인터액톰을 변화시킨다. 예를 들면, 전사체군의 변화들은 복수의 표적 mRNAs의 전사 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 단백질체의 변화들은 복수의 표적 단백질들의 발현 수준에 의하여 측정될 수 있으며; 그리고 대사체군의 변화들은 주어진 대사산물들에 대하여 특별히 설계된 분석법들에 의하여 복수의 표적 대사산물들의 수준에 의하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 대사체군 및/또는 단백질체의 위에 참조된 변화들은, 적어도 일부 분리된 대사산물들 또는 단백질들에 대하여, 제2 세포 시스템/ 개체군의 전사체군, 단백질체, 대사체군, 그리고 인터액톰의 조절을 포함하는, 그들의 제2 세포 시스템/개체군에 대한 효과들에 의하여 또한 측정될 수 있다. 그러므로, 상기 실험들은 제1 세포 시스템/개체군에 의하여 분비되는, 관심 대상의 분자(들)의 상이한 처치 조건들 하의 제2 세포 시스템/개체군에 대한 효과들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 실험들은 또한, 예를 들면, 단백질체학의 차별성 스크리닝에 의하여, 제1 세포 시스템으로부터 별개의 세포 시스템으로의 시그날링 (외부 자극 인자 치료에 반응하여)의 결과로서 조절되는 여하한 단백질들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 동일한 실험적 세팅은 또한 역(reverse) 세팅에 적용될 수 있어서, 두 세포 시스템들 사이의 상보적 효과들이 또한 평가될 수 있다. 일반적으로, 이러한 타입의 실험을 위하여, 세포 라인 쌍(pairs)의 선택은 이를테면 기원, 질병 상태 그리고 세포 기능과 같은 요인들에 주로 기초한다.

비록 두-세포 시스템들이 전형적으로 이러한 타입의 실험 세팅에 개입되어 있으나, 유사한 실험들 역시 둘 이상의 세포 시스템들을 위하여, 예를 들면, 분리된 고체 지지체 상에 각각 별개의 세포 시스템을 고정함으로써, 설계될 수 있다.

상기 커스텀 구축된 세포 모델은, 본원 명세서에서 설명한 단계들을 수행함으로써, 최종적으로 당뇨병/비만/심혈관 질환 상태에서 고유한 인과 관계를 동정하기 위하여 본원 발명의 플랫폼 기술의 단계들의 전체에 걸쳐 수립되고 사용될 수 있다. 통상의 기술자들은, 그러나, 암 모델과 마찬가지로, 초기의, "제1 세대(first generation)" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 사용된 커스텀 구축된 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델이, 예컨대, 추가적인 질병-관련 세포 라인들 및/또는 추가적인 질병-관련 조건들의 도입에 의하여, 연속적으로 진화하거나 시간에 따라 발전(expand)할 수 있음을 이해할 것이다. 진화된 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 데이터가 수집될 수 있다. 발전된 또는 진화된 모델로부터, 즉, 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터 수집된 새로운 데이터는, 보다 확고한 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여, "제1 세대" 합의된 인과 관계 네트워크를 생성하기 위하여 앞서 사용된 데이터 세트들에 도입될 수 있다. 당뇨병/비만/심혈관 질환 상태에 고유한 (또는 동요에 대한 당뇨병/비만/심혈관 질환 상태의 반응에 고유한) 새로운 인과 관계들은 이후 "제2 세대" 합의된 인과 관계 네트워크로부터 동정될 수 있다. 이러한 방식으로, 당뇨병/비만/심혈관 질환 모델의 진화는 합의된 인과 관계 네트워크들의 진화를 제공하며, 이로써 당뇨병/비만/심혈관 질환 상태의 결정요인 드라이버들 (또는 조절물질들)에 대한 새로운 및/또는 더욱 신뢰할 수 있는 식견을 제공한다.

B. 질의적 생물학적 평가들을 위한 세포 모델들의 사용

본원 발명에 제공된 방법들 그리고 세포 모델들은 여하한 수의 "질의적 생물학적 평가들"에 사용될 수 있거나, 또는 적용될 수 있다. 질의적 생물학적 평가를 위하여 본원 발명의 방법들을 사용하는 것은 생물학적 시스템의 "조절물질들" 또는 결정요인 세포 프로세스 "드라이버들"의 동정을 수월하게 한다.

본원 명세서에서 사용되는, "질의적 생물학적 평가"는, 환경의 동요 또는 외부 자극 인자에 연관된 생물학적 시스템의 하나 또는 그 이상의 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 "드라이버들," (예컨대, 생물학적 경로의 활성의 증가 또는 감소, 또는 상기 경로의 핵심 멤버들, 또는 상기 경로의 멤버들에 대한 핵심 조절제들), 또는 생물학적 시스템 또는 프로세스에 고유한 고유의 인과 관계의 동정을 포함할 수 있다. 이는 생체 내 동물 모델들 및/또는 시험관 내 조직 배양 실험들을 포함하여, 동정 된 결정요인 세포 프로세스 드라이버들이 환경의 동요 또는 외부 자극 인자에 연관된 다운스트림 사건들에 필요하거나 및/또는 충분한지 여부를 테스트 또는 실증하기 위하여 설계되는 추가적 단계들을 더욱 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 상기 질의적 생물학적 평가는 질병 상태의 진단 또는 단계화이며, 여기서 상기 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버들 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스에서 고유한 교차-대화 차별성 또는 인과 관계들)은 치료적 중재를 위한 대상이 될 수 있는 질병 마커들 또는 치료제 표적들 중 어느 하나를 나타낸다. 본 발명의 대상인 질의적 생물학적 평가는 이론적으로 여하한 질병 상태에 적합하나, 이를테면 종양학/암 생물학, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 그리고 신경학적 상태들 (특히 신경-퇴행성 질환들, 이를테면, 이에 제한되는 것은 아니나, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근축위성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)), 그리고 노화 관련된 신경퇴행성 질환)의 분야에 특히 유용한 것으로 밝혀질 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 약물의 유효성의 결정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성)는 성공적인 약물의 보증마크들(hallmarks)일 수 있으며, 그리고 순차로 동일한 질병 상태를 치료하기 위한 추가적인 에이전트들(agents), 이를테면 MIM들 또는 에피쉬프터들을 동정하기 위하여 사용될 수도 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 감염(예컨대, 박테리아 또는 바이러스 감염)의 예방 또는 치료를 위한 약물 표적들의 동정이며, 여기서 동정 된 결정요인의 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성)는 마커들/인디케이터들(indicators) 또는 감염 상태의 원인이 되는 핵심 생물학적 분자들일 수 있으며, 그리고 순차로 항-감염제들의 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 주어진 질병 프로파일 상에서의 한 에이전트 (agent), 예컨대, 약물, 의 분자 효과의 평가이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성), 은 하나 또는 그 이상의 생물학적 경로들, 또는 그 경로(들)의 핵심 멤버들, 또는 그 경로(들)의 멤버들에 대한 핵심 조절제들 활성의 증가 또는 감소일 수 있으며, 그리고 순차로, 예컨대, 주어진 질병에 대한 그 에이전트의 치료적 유효성을 예측하기 위하여 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 한 에이전트, 예컨대, 약물의, 세포, 조직, 기관 또는 기관에 대한 독성학적 프로파일의 평가이며, 여기서 상기 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성), 은 독성, 예컨대, 세포독성의 인디케이터들 일 수 있으며, 그리고 순차로 그 에이전트의 독성학적 프로파일의 예측 또는 동정에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성), 은 약물 또는 약물 후보의 심장 독성의 인디케이터일 수 있으며, 그리고 순차로 약물 또는 약물 후보의 심장독성학적 프로파일의 예측 또는 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는, 생물학적 무기들, 이를테면 질병을 일으키는 원생동물, 진균들, 박테리아, 프로테스트들, 바이러스들, 또는 톡신들, 에 의한 질병 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약물 표적들의 동정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 교차 대화 차별성), 은 마커들/인디케이터들 또는 상기 질병 또는 장애의 원인이 되는 핵심 생물학적 분자들일 수 있으며, 그리고 순차로 생물방어 에이전트들의 동정에 사용될 수 있다.

일부 실시예들에서, 질의적 생물학적 평가는 항-노화 에이전트, 이를테면 항-노화 화장품을 위한 표적들의 동정이며, 여기서 생물학적 시스템의 동정 된 조절물질들, 예컨대, 결정요인 세포 프로세스 드라이버 (예컨대, 생물학적 시스템 또는 프로세스 고유의 인과 관계들 또는 세포 교차 대화 차별성), 은 노화 프로세스, 특히 피부에서의 노화 프로세스의 마커들 또는 인디케이터들일 수 있으며, 그리고 순차로 동정 항-노화 에이전트들의 동정에 사용될 수 있다.

항-노화 화장품을 위한 표적들을 동정하기 위하여 본원 발명의 방법들에서 사용되는 노화를 위한 하나의 예시적 세포 모델에서, 상기 세포 모델은, 정확히 말하면, 예를 들어 UV 광 (환경의 동요 또는 외부 자극 인자)으로 처리된, 노화 상피 세포, 및/또는 신생아의(neonatal) 세포들, 이들은 또한 선택적으로 UV 광으로 처리됨, 을 포함한다. 일 실시예에서, 노화를 위한 세포 모델은 세포 교차-대화 시스템을 포함한다. 항-노화 화장품을 위한 표적들의 동정을 위하여 수립된 하나의 예시적인 두-세포 교차-대화 시스템에서, 노화 상피 세포 (제1 세포 시스템)는 UV 광 (외부 자극 인자)으로 처리될 수 있으며, 그리고 변화들, 예컨대, 프로테오믹 변화들 및/또는 기능적 변화들이, 신생아의 세포들을 처리된 노화 상피 세포의 조절된 배지와 접촉시킴으로서 도출된 신생아의 세포 (제2 세포 시스템)에서 측정될 수 있는데, 예컨대, 단백질체 변화들이 전통적인 정량적 질량 분석기를 사용하여 측정될 수 있으며, 또는 노화의 고유한 인과 관계가 데이터로부터 생성된 인과 관계 네트워크로부터 동정될 수 있다.

V. 단백질체학 샘플 분석

일부 실시예들에서, 본 발명의 대상 방법은 유사한 특성의 수백 샘플들의 대-규모 고-처리량 정량적 단백질체학 분석법을 사용하며, 세포 아웃풋 차별성의 동정에 필요한 데이터를 제공한다.

이러한 목적에 적합한 수많은 당해 기술 분야에-알려진 기술들이 있다. 하나의 예시적 기술은, 질량 분석기와 조합된 iTRAQ 분석법인데, 이하에서 간단히 설명된다.

iTRAQ 기술로의 상대적 정량화를 위한 참조(reference) 샘플들을 제공하기 위하여, 다중QC 풀들(pools)이 생성된다. 각각의 샘플의 분액들로 구성된, 두 개별적 QC 풀들이 세포 #1 및 세포 #2 샘플들로부터 생성되었다 - 이들 샘플들은 각각 상청액들 그리고 펠렛들(pellets)에 대하여 QCS1 및 QCS2, 그리고 QCP1 및 QCP2로 명명되었다. 두 세포 라인들에 걸친 단백질 농도 비교를 위하여, 전술한 QC 풀들로부터의 세포 펠렛 분액들이 참조 샘플들 (QCP)을 생성하기 위하여 동등한 부피들로 조합된다.

정량적 단백질체학 접근법은 펩티드 동정 그리고 정량화를 위하여 2D-LC MALDI MS/MS 및 8-플렉스 iTRAQ 시약으로의 안정한 동위원소 표지화(labeling)에 기초한다. 이 기술로의 정량화는 상대적이다: 펩티드들 및 단백질들은 참조 샘플에 상대적인 분포 비율들에 할당된다. 다중 iTRAQ 실험들에서의 공통 참조 샘플들은 다중 iTRAQ 실험들에 걸쳐 샘플들의 비교를 수월하게 한다.

이 분석 계획을 실행하기 위하여, 제조사의 제안에 따르면, 여섯 개의 일차 샘플들 그리고 두 개의 대조구 풀(pool) 샘플들, 대조구 풀 샘플들은 113 및 117 시약들로 표지하여, 이 하나의 8-플렉스 iTRAQ 믹스로 조합될 수 있다. 8개의 샘플들의 이 혼합물은 이후 2-차원 액체 크로마토그래피에 의하여 분류될 수 있다; 제 1차원에서 강한 양이온 교환(strong cation exchange) (SCX), 그리고 제2 차원에서 역-상 HPLC. HPLC 용리액(eluent)은 직접적으로 MALDI 플레이트들 상에 분류되며, 그리고 상기 플레이트들은 MDS SCIEX/AB 4800 MALDI TOF/TOF 질량 분석기로 분석된다.

추가적인 정보 없이, 단백질 발현에 있어서 가장 중요한 변화들은 상이한 치료 조건들 하의 동일한 세포 타입들 내의 것들임이 추정된다. 이러한 이유로, 세포#1 및 세포#2로부터의 일차 샘플들은 개별적 iTRAQ 믹스들에서 분석된다. 세포#1 vs. 세포#2 샘플들에서의 단백질 발현의 비교를 촉진하기 위하여, 공통(universal) QCP 샘플들은, 일차 또는 세포 라인 특이적 QC 샘플들 (QC1 그리고 QC2)에 사용되지 않은, 이용할 수 있는 "iTRAQ 슬롯들(slots)"에서 분석된다.

실험실 절차들의 간단한 개관이 본원 명세서에 제공된다.

A. 세포 상청액 샘플들로부터 단백질 추출

세포 상청액 샘플들(CSN)에 있어서, 배양 배지로부터의 단백질들이 배양된 세포들에 의하여 분비된 단백질들 이상으로 크게 과잉으로 존재한다. 이러한 배경을 감소시키기 위한 시도로서, 선행의 잉여(upfront abundant)단백질 고갈(depletion)이 실행되었다. 특이 친화성 칼럼들은 소과 동물(bovine) 또는 말(horse) 혈청 단백질들에 이용할 수 없으므로, 항-인간 IgY14 칼럼이 사용되었다. 이 항체들은 인간 단백질들에 대하여 지향되어(directed) 있으면서, 항체들의 폴리클로날 성질에 의하여 제공되는 광범위한 특이성은 사용되는 세포 배양 배지들에 존재하는 소과 동물 그리고 말과 동물(equine) 단백질들 양쪽 모두의 고갈을 수행할 것으로 기대되었다.

CSN QC 물질의 200-μl 분액이, 유통(flow-through) 물질에서 총 단백질 농도를 측정(바이신코니닉 애시드 (BCA) 분석)하기 위한 연구의 시작 전에, 10-mL IgY14 고갈 칼럼에 적재(load) 된다. 적재 부피는 이후 대략 40μg 총 단백질을 함유하는 고갈된 분획을 얻기 위하여 선택된다.

B. 세포 펠렛들로부터 단백질 추출

세포 #1 및 세포 #2의 분액이 BGM에서 조직 샘플들의 분석에 사용되는 "표준" 용해 버퍼에 용해되며, 그리고 총 단백질 함량이 BCA 분석으로 측정된다. 이들 대표적 세포 용해물들(lysates)의 단백질 함량을 수립한 후, 모든 세포 펠렛 샘플들(섹션 1.1에서 설명된 QC 샘플들을 포함하여)이 세포 용해물들로 가공되었다. 총 단백질 대략 40μg의 용해물의 양들이 가공 작업흐름에 도입되었다.

C. 질량 분석법을 위한 샘플 제조

샘플 제조는 표준 작업 절차들에 따르며 그리고 다음으로 구성한다:

- 단백질들의 환원 및 알킬화

- 역상 칼럼 (세포 펠렛들만)에서 단백질의 청소(clean-up)

- 트립신으로 소화

- TRAQ 표지화

- 강한 양이온 교환 크로마토그래피 - 여섯 분획들의 수집 (Agilent 1200 시스템)

- HPLC 분류 및 MALDI 플레이트들에 표시(spottiing) (Dionex Ulimate3000/Probot 시스템)

D. MALDI MS 및 MS / MS

HPLC-MS는 일반적으로 온라인 ESI MS/MS 전략들을 사용한다. BG 약품은 오프-라인 LC-MALDI MS/MS 플랫폼을 이용하는데, 이는 동일한 샘플을 몇 번이나 주입할 필요 없이, 일차 샘플들에 걸쳐 관찰된 단백질 세트들의 보다 나은 일치성(concordance)을 도출한다. 모든 iTRAQ 믹스들에 걸친 제1 패스 데이터 수집에 수반하여, 펩티드 분획들이 MALDI 표적 플레이트들에 보유되어 있으므로, 샘플들은, 제1 취득 동안에 얻어진 지식으로부터 유도된 표적된 MS/MS 취득(acquisition) 패턴을 이용하여, 두 번째로 분석될 수 있다. 이 방식으로, 최대 모든 동정된 단백질들에 대하여 최대 관찰 빈도를 얻는다. (이상적으로, 각 단백질은 각 iTRAQ 믹스에서 측정되어야 한다).

E. 데이터 가공(프로세싱)

BGM 단백질체학적 작업 흐름 내에서 데이터 가공 과정은, 이를테면 사전 펩티드 동정 그리고 각각의 iTRAQ 믹스에 대하여 개별적으로 완료되는 정량화 (섹션 1.5.1)와 같은 절차들 그리고 이를테면, 상기 프로젝트를 위한 데이터 취득이 완료될 때까지 완료되지 않는, 펩티드들의 단백질들로의 최종 할당 및 단백질들의 최종 정량화와 같은 프로세스들 (섹션 1.5.2)로 분리될 수 있다.

BGM 단백질체학적 작업 흐름 내에서의 주요 데이터 가공 단계들은 다음과 같다:

- Mascot (Matrix Sciences) 데이터베이스 검색 엔진을 이용한 펩티드 동정

- Mascot IDs의 자동화된 조직 내(in house) 검증

- 펩티드의 정량화 및 단백질의 사전 정량화

- 최종 데이터세트의 전문가 큐레이션(curation)

- 자동화된 PVT 도구를 이용하여 각각의 믹스로부터 펩티드들의 단백질들의 공유 세트로의 최종 할당

- 이상치 제거(outlier elimination) 및 단백질들의 최종 정량화

(i) 개별적 iTRAQ 믹스들의 데이터 가공

각각의 iTRAQ 믹스는 작업 흐름을 통하여 가공되므로 MS/MS 스펙트럼들이, 펩티드 그리고 단백질 동정들은 물론 정량화 정보의 초기의 평가를 위한 독점권 있는 BGM 소프트웨어 도구들을 사용하여 분석된다. 이 사전 분석의 결과에 기초하여, 믹스의 각각의 일차 샘플에 대한 작업 흐름의 품질이 BGM 성능 측정기준 (performance metrics)의 세트에 대하여 판단된다. 만약 주어진 샘플 (또는 믹스)이 특정된 최소 성능 측정기준을 통과하지 못하면, 그리고 추가적 물질이 사용 가능하면, 그 샘플은 전체적으로 반복되며 그리고 작업 흐름의 이 제2 실행으로부터의 데이터가 최종 데이터세트에 편입된다.

(ii) 펩티드 동정

MS/MS 스펙트럼들은, 공통 오염(common contaminant) 서열들, 이를테면 돼지(porcine) 트립신,에 의하여 증폭된 인간, 소과 동물, 그리고 말 서열들을 함유하는 Uniprot 단백질 서열 데이터베이스에 대하여 검색되었다. 검색 파라미터들의 세부 사항은, 변형들의 완전한 목록을 포함하여, 아래의 표 3에 제공된다.

Mascot 검색 완료 후, 자동-검증 절차가 특이적 Mascot 펩티드 매치들을 증진 (즉, 검증) 시키기 위하여 사용된다. 유효한 그리고 무효한 매치들 사이의 판별은 예측되는 Mascot 스코어에 비교되는 얻어진 Mascot 스코어 및 1 순위(Rank) 펩티드들과 2순위 펩티드 Mascot 스코어들 사이의 차이에 기초한다. 검증에 요구되는 기준들은, 만약 그 펩티드가 그 iTRAQ 믹스 내의 단일 단백질에 매치되는 몇몇(several) 중 하나라면 또는 만약 그 펩티드가 앞서 검증된 펩타이들의 카탈로그에 존재한다면, 어느 정도 완화된다.

(iii) 펩티드 및 단백질 정량화

각각의 믹스에 대하여 검증된 펩티드들의 세트는 각각의 믹스를 위한 사전 단백질 정량화 측정 기준들의 계산에 사용된다. 펩티드 비율들(ratios)은, 참조 풀의 피크 면적의 최선 표시(the best representation) (QC1 또는 QC2)에 의하여, 각각의 검증된 펩티드에 대한 iTRAQ 표지 (즉, m/ z114, 115, 116, 118, 119, 또는 121)로부터의 피크 면적을 나눔으로써 계산된다. 이 피크 면적은, 양 샘들들이 QC 허용 기준(acceptance criteria)을 통과하는 것을 조건으로, 113 및 117 피크들의 평균이다. 사전 단백질 비율들(preliminary protein ratios)은 그 단백질에 매치되는 모든 "유용한(useful)" 검증된 펩티드들의 중위수 비율(median ratio)을 계산함으로써 측정된다. "유용한" 펩티드들은 완전히 iTRAQ 표지(모든 N-말단이 라이신 또는 PyroGlu 중 하나로 표지된다)되며 그리고 완전히 시스테인 표지(즉, 모든 Cys 잔기들이 카르브아미도메틸 또는 N-말단 Pyro-cmc)로 알킬화된다.

(iv) 취득-후(post-acquisition) 가공(프로세싱)

일단 프로젝트의 매 믹스에 대하여 MS/MS 데이터취득의 모든 패스들이 완료되면, 데이터는, 각각의 일차 샘플로부터의 결과들이 단순화되고 그리고 다른 것에 의미 있게 비교될 수 있도록 하는 것을 겨냥하는, 이하에서 설명되는 세 단계들을 이용하여 대조된다(collated).

(v) 펩티드 서열의 단백질들로의 전체적 할당(Global Assignment)

펩티드 서열들을 단백질 등록 번호들(accession numbers)로의 최종 할당하는 것은 독점된 기술인 단백질 검증 도구(PVT)를 통하여 수행된다. 상기 PVT 절차는 프로젝트에서 동정된 펩티드들의 전체 수집을 기술하기 위하여 최선의, 최소한의 비-중복(non-redundant) 단백질 세트를 결정한다. 이것은 자동화된 절차로서 동종성의 생물 분류(taxonomy)으로부터의 데이터를 다루는데 최적화된 것이다.

상청액 실험들에 대한 단백질 할당들은, 데이터베이스의 혼합된 분류들의 복잡성들을 취급하기 위하여 수동으로 큐레이션되었다. 자동화된 패러다임은 소과 동물 그리고 말 혈청 보충된 배지들에서 성장한 세포 배양들에 대하여 유효하지 않으므로, 광범위한 수동 큐레이션(curation)이 여하한 주어진 단백질 원료의 불확실성을 최소화하기 위하여 필요하다.

(vi) 펩티드 비율들(Peptide Ratios)의 정상화(Normalization)

각각의 샘플에 대한 펩티드 비율들은 Vandesompele et al. 게놈 생물학, 2002, 3(7), research 0034.1-11의 방법에 기초하여 정상화된다. 이 절차는 세포 펠렛 측정들에만 적용된다. 상청액 샘플들에 대하여, 정량적 데이터는, 배지들로부터 나오는 펩티드 동정들에 대한 최대의 기여를 고려하여, 정상화되지 않는다.

(vii) 단백질 비율들의 최종 계산

표준 통계학적 이상치 제거 절차가, 각각의 단백질 중위수 비율 주변으로부터, 로그-변형된(log-transformed) 데이터 세트에서 1.96σ수준을 넘는, 이상치를 제거하는데 사용된다. 이 제거에 과정에 수반하여, 단백질 비율들의 최종 세트가 (다시( re-))계산된다.

VI . 본원 발명의 마커들 및 이들의 용도

본원 발명은, 적어도 부분적으로, 생물학적 시스템, 이를테면 질병 프로세스, 또는 동요, 이를테면 치료 요법제, 에 대한 생물학적 시스템의 반응과 연관된 신규한 바이오마커들의 동정에 기초한다.

특히, 본원 발명은 실시예들에 설명되는 마커들 (이하에서 "마커들" 또는 "본원 발명의 마커들“이라 함)에 관련된다. 본원 발명은 마커들 (이하에서 각각 "마커 핵산들" 그리고 "마커 단백질들"이라 함)로 인코딩되거나 또는 대응되는 핵산들 및 단백질들을 제공한다. 이들 마커들은 질병 상태들의 진단; 질병 상태들의 예측; 다양한 질병 상태들을 위한 약물 표적들 개발; 독성의 존재, 바람직하게는 약물-유도 독성, 예컨대, 심장독성 스크리닝; 독성을 일으키거나 또는 일으킬 위험이 있는 에이전트의 동정; 약물-유도 독성을 감소 또는 방지할 수 있는 에이전트의 동정; 약물-유도 심장 독성의 경감, 감소 또는 방지; 그리고 약물-유도 심장 독성을 예측할 수 있는 마커들의 동정에 특히 유용하다.

"마커"는, 그것의 정상 또는 건강 조직 또는 세포에서의 유전자의 발현 수준으로부터 조직 또는 세포에서의 수정된 발현 수준이 질병 상태 이를테면 암, 당뇨병, 비만, 심혈관 질병, 또는 독성 상태, 이를테면 약물-유도 독성, 예컨대, 심장 독성과 연관되는, 유전자이다. "마커 핵산"은 본원 발명의 마커에 대응되거나 또는 그로부터 인코딩되는 핵산 (예컨대, mRNA, cDNA)이다. 그러한 마커 핵산들은, 본원 발명의 마커들인 여하한 유전자들의 전체 또는 부분적 서열이거나 또는 그러한 서열에 상보적인 서열을 포함하는, DNA (예컨대, cDNA)를 포함한다. 그러한 서열들은 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 예를 들면, NIH government pubmed 웹사이트에서 발견할 수 있다. 마커 핵산들은 또한 본원 발명의 여하한 유전자 마커들의 전체 또는 부분적 서열 또는 그러한 서열의 상보체, 여기서 모든 티미딘(thymidine) 잔기들은 유리딘(uridine) 잔기들로 대체됨, 를 포함하는 RNA를 포함한다. "마커 단백질"은 본원 발명의 마커에 대응되거나 또는 그로 인코딩되는 단백질이다. 마커 단백질은 본원 발명의 여하한 마커 단백질의 전체 또는 부분적 서열을 포함한다. 그러한 서열들은 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 예를 들면, NIH government pubmed 웹사이트에서 발견할 수 있다. "단백질" 및 "폴리펩티드’라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.

"질병 상태 또는 독성 상태 연관된" 체액은, 환자의 체내에서, 육종(sarcoma) 세포들을 접촉하거나 통과하는 또는, 육종 세포들로부터 떨어진 세포들 또는 단백질들이 통과할 수 있는, 액체이다. 예시적 질병 상태 또는 독성 상태 연관된 체액들에는 혈액들(예컨대 전혈, 혈청, 혈소판들이 제거된 혈액)이 포함되며, 그리고 이하에서 더욱 상세히 설명된다. 질병 상태 또는 독성 상태 연관된 체액들은, 다음에 제한되는 것은 아니나, 전혈, 혈소판들이 제거된 혈액, 림프, 전립선액(prostatic fluid), 소변(urine) 및 정액(semen)이다.

"정상(normal)" 수준의 마커의 발현은 질병 상태 또는 독성 상태로 고통 받지 않는 인간 대상 또는 환자의 세포들의 마커의 발현 수준이다.

마커의 "과(over)-발현" 또는 "더 높은(higher) 수준의 발현" 은 발현을 평가하기 위하여 사용되는 분석의 표준 오차보다 큰, 그리고 바람직하게는, 대조구 샘플 (예컨대, 마커 연관된 질병 상태 또는 독성 상태, 예컨대, 암, 당뇨병, 비만, 심혈관질병, 그리고 심장독성을 갖지 않는 건강한 대상으로부터의 샘플)의 마커의 발현 수준, 그리고 바람직하게는, 몇몇 대조구 샘플들에서 마커의 평균 발현 수준, 의 적어도 두 배, 그리고 더욱 바람직하게는 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 배인 테스트 샘플의 발현 수준을 지시한다.

마커의 "더 낮은(lower) 발현 수준 발현"은 대조구 샘플 (예컨대, 마커 연관된 질병 상태 또는 독성 상태, 예컨대, 암, 당뇨병, 비만, 심혈관 질병, 그리고 심장독성을 갖지 않는 건강한 대상으로부터의 샘플)에서의 마커의 발현 수준 그리고 바람직하게는, 몇몇 대조구 샘플들에서의 마커의 평균 발현 수준, 보다 적어도 두 배, 그리고 더욱 바람직하게는 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 배 낮은 테스트 샘플에서의 발현 수준을 지시한다.

“전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사"는, 본원 발명의 마커의 전사 및 정상 전사-후 가공 (예컨대 스플라이싱(splicing))에 의하여 만들어진 성숙한 mRNA의, 만약 있다면, RNA 전사체의, 그리고 RNA 전사체의 역전사, 전부 또는 일부에 상보적인 또는 상동성인 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 an mRNA, hnRNA, a cDNA, 또는 그러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.

"상보적인(complementary)"은 두 핵산 가닥들의 영역들 사이의 또는 동일한 핵산 가닥의 두 영역들 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지시한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제1 영역에 역평행(antiparallel)인 제2 핵산 영역의의 잔기와, 만약 그 잔기가 티민 또는 우라실 이라면, 특이적 수소 결합들 ("염기 쌍(base pairing")을 형성할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 사이토신 잔기는 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와, 만약 그 잔기가 구아닌이라면, 염기쌍을 형성할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 만약, 두 영역들이 역평행 방식으로 정렬되어 있는 경우, 제1 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있으면, 핵산의 제1 영역은 동일한 또는 상이한 핵산의 제2영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제 1부분을 포함하며, 제2 영역은 제2부분을 포함하며, 이로써, 제1 및 제2부분들이 역평행 방식으로 정렬되는 경우, 제1 부분의 적어도 약 50%, 그리고 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 뉴클레오타이드 잔기들이 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기들과 염기쌍을 이룰 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제 1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기들이 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기들과 염기쌍을 이룰 수 있다.

본원 명세서에서 사용되는 "상동성의(Homologous)"는 동일한 핵산 가닥의 두 영역들 사이의 또는 두 상이한 핵산 가닥들 사이의 뉴클레오타이드 서열 유사성을 지시한다. 두 영역들 모두에서 뉴클레오타이드 잔기 위치를 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지하고 있으면, 그 영역들은 그 위치에서 상동이다. 만약 각각의 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기 위치를 동일한 잔기가 차지하고 있다면, 제1영역은 제2 영역에 상동이다. 두 영역들 사이의 상동성(Homology)은 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지하는 두 영역들의 뉴클레오타이드 잔기 위치들의 비율로 표현된다. 예로써, 뉴클레오타이드 서열 5'-ATTGCC-3'을 갖는 영역 그리고 뉴클레오타이드 서열 5'-TATGGC-3'을 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하며 제2 영역은 제2 부분을 포함하는데, 이로써, 각각의 부분들의 뉴클레오타이드 잔기 위치들의 적어도 약 50%, 그리고 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%를 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지한다. 더욱 바람직하게는, 각각의 부분들의 모든 뉴클레오타이드 잔기 위치들을 동일한 뉴클레오타이드 잔기가 차지한다.

"본원 발명의 단백질들"은 마커 단백질들 및 그들의 단편들; 변이체 마커 단백질들 및 그들의 단편들; 마커 또는 변이체 마커 단백질의 적어도 15 아미노산 세그먼트(segment)를 포함하는 펩티드들 및 폴리펩티드들; 그리고 마커 또는 변이체 마커 단백질, 또는 마커 또는 변이체 마커 단백질의 적어도 15 아미노산 세그먼트를 포함하는 융합 단백질들을 포괄한다.

본원 발명은 본원 발명의 마커 단백질들 및 마커 단백질의 단편들과 특이적으로 결합하는 항체들, 항체 유도체들 그리고 항체 단편들을 더욱 제공한다. 본원에서 특히 달리 특정하기 않으면, "항체" 그리고 "항체들"이라는 용어는 자연-발생 형태들의 항체들 (예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE) 그리고 재조합(recombinant) 항체들 이를테면 단쇄(single-chain) 항체들, 키메릭 그리고 인간화된 항체들 그리고 멀티-특이적 항체들은 물론 전술한 모두의 단편들 그리고 유도체들을 광범위하게 포괄하며, 여기서 단편들 그리고 유도체들은 적어도 항원 결합 부위를 갖는다. 항체유도체들은 항체에 (컨쥬게이션된(conjugated) 단백질 또는 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 본원 발명의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, CANX, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 유전자들 (또는 단백질들)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 마커들은 적어도 두, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물, 스물-다섯, 서른 개, 또는 그 이상의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 조합이다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 사이의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)이다.

일 실시예에서, 본원 발명의 마커들은 암에 연관 또는 개입된 유전자들 또는 단백질들이다. 암에 개입된 그러한 유전자들 또는 단백질들은, 예를 들면, HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및/또는 CANX를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본원 발명의 마커들은 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물 또는 그 이상의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 조합이다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 사이의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 범주들이다.

일 실시예에서, 본원 발명의 마커들은 약물-유도 독성과 연관되거나 개입된 유전자들 또는 단백질들이다. 그러한 약물-유도 독성에 개입된 유전자들 또는 단백질들은, 예를 들면, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및/또는 TAZ를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본원 발명의 마커들은 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 가지의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 조합이다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 1 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30 사이의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 범주들이다.

A. 심장독성 연관 마커들

본원 발명은 적어도 부분적으로 약물-유도 심장 독성과 연관된 신규한 바이오마커들의 동정에 기초한다. 본원 발명은 또한, 적어도 부분적으로 코엔자임 Q10이 약물-유도 심장독성을 감소시키거나 방지할 수 있다는 발견에 기초한다.

따라서, 본원 발명은 독성을 일으키거나 일으킬 위험이 있는 에이전트의 동정을 위한 방법들을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 약물 또는 약물 후보이다. 일 실시예에서, 상기 독성은 약물-유도 독성, 예컨대, 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 당뇨병, 비만 또는 심혈관 장애를 치료하기 위한 약물 또는 약물 후보이다. 이들 방법들에서, 한 쌍의 샘플들 (제1 샘플은 약물 치료에 도입되지 않으며, 제2 샘플은 약물 치료에 도입된다)에서의 하나 또는 그 이상의 바이오마커들/단백질들의 양이 평가된다. 제1 샘플에 비교되는 제2 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준의 조절이, 그 약물이 약물-유도 독성, 예컨대, 심장독성을 일으키거나 또는 일으킬 위험이 있다는 것을 지시한다. 일 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 바이오마커들은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본원 발명의 방법들은 통상의 기술자가 약물-유도 심장 독성을 일으키는 위험이 있는 약물을 동정하는데 사용하는 여하한 여타의 방법과 결합하여 실행될 수 있다.

따라서, 일 측면에서, 본원 발명은 약물-유도 독성 (예컨대, 심장독성)을 일으키거나 또는 일으킬 위험이 있는 약물의 동정 방법을 제공하는데, 이는 다음을 포함한다: (i) 약물로의 치료 전에 수득된 제1 세포 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준을; (ii) 약물로 치료 후 수득 된 제2 세포 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준과 비교하는 단계; 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 바이오마커들은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 여기서 제1 샘플에 비교되는 제2 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준의 조절은 그 약물이 약물-유도 독성 (예컨대, 심장독성)을 일으키거나 또는 일으킬 위험이 있다는 것에 대한 지시이다.

일 실시예에서, 상기 약물-유도 독성은 약물-유도 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 세포들은 심혈관 시스템의 세포, 예컨대, 심근세포들이다. 일 실시예에서, 상기 세포들은 당뇨성 심근세포들이다. 일 실시예에서, 상기 약물은 당뇨병, 비만 또는 심혈관 질환 치료를 위한 약물 또는 후보 약물이다.

일 실시예에서, 제1 샘플에 비교되는, 제2 샘플에서 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 모두 열 가지의 바이오마커들의 발현 수준에서의 조절(예컨대, 증가 또는 감소)이 그 약물이 약물-유도 독성을 일으키는지 또는 일으킬 위험이 있는지를 지시한다.

약물-유도 독성을 감소시키거나 또는 방지할 수 있는 에이전트의 동정 방법들이 또한 본원 발명에 의하여 제공된다. 일 실시예에서, 상기 약물-유도 독성은 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 약물은 당뇨병, 비만 또는 심혈관 장애 치료를 위한 약물 또는 약물 후보이다. 이들 방법들에서, 세 샘플들 (제1 샘플은 약물 치료에 도입되지 않으며, 제2 샘플은 약물 치료에 도입되며, 그리고 제3 샘플은 약물 치료 및 에이전트 모두에 도입됨)에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 양이 평가된다. 제1 샘플에 비교되는 제3 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현의 대략 동일한 수준이, 그 에이전트 그 에이전트가 약물-유도 독성, 예컨대, 약물-유도 심장독성을 감소시키거나 또는 방지할 수 있다는 것에 대한 지시이다. 일 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 바이오마커들이 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성된 그룹에서 선택된다.

본원에서 설명한 방법들을 사용하여, 다양한 분자들, 특히 세포막을 통과할 수 있을 정도로 충분히 작은 분자들을 포함하는 분자들이 본원 발명의 마커의 발현 및/또는 활성의 조절, 예컨대, 증가 또는 감소시키는 분자들의 동정을 위하여 스크리닝 될 수 있다. 이렇게 동정된 화합물들이 대상에서 약물-유도 독성을 감소, 경감 또는 예방하기 위하여 대상에 제공될 수 있다.

따라서, 다른 측면에서, 본원 발명은 약물-유도 독성을 감소 또는 예방할 수 있는 에이전트의 동정방법을 제공하는데, 이는 다음을 포함한다: (i) 독성 유도 약물로 치료하기 전에 수득 되는 제 1 세포에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준을 측정하는 단계; (ii) 독성 유도 약물로 치료한 후 수득 되는 제2 세포 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준을 측정하는 단계; (iii) 독성 유도 약물 및 상기 에이전트로 처치된 후에 수득 되는 제3 세포 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준을 측정하는 단계; 그리고 (iv) 제3 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준을 제1 샘플과 비교하는 단계; 여기서 상기하나 또는 그 이상의 바이오마커들은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 그리고 여기서 제1 샘플에 비교하여 제3 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 대략 동일한 발현 수준은 상기 에이전트가 약물-유도 독성을 감소 또는 예방할 수 있다는 것에 대한 지시이다.

일 실시예에서, 상기 약물-유도 독성은 약물-유도 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 세포들은 심혈관 시스템의 세포, 예컨대, 심근세포들이다. 일 실시예에서, 상기 세포들은 당뇨성 심근세포들이다. 일 실시예에서, 상기 약물은 당뇨병, 비만 또는 심혈관 질환의 치료를 위한 약물 또는 후보 약물이다.

일 실시예에서, 제1 샘플에 비교하여 제3 샘플에서 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 모두 열 가지의 바이오마커들의 대략 동일한 발현 수준은 상기 에이전트가 약물-유도 독성을 감소 또는 예방할 수 있다는 지시이다.

본원 발명은, 대상(예컨대, 포유동물, 인간, 또는 비-인간 동물)에게 본원에서 제공된 스크리닝 방법들에 의하여 동정된 에이전트를 투여하고, 이로써 대상에서 약물-유도 심장독성을 감소 또는 예방하는 것을 포함하는, 필요한 대상에서 약물-유도 심장독성을 경감, 감소 또는 예방할 수 있는 방법들을 더욱 제공한다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 심장독성-유도 약물로 이미 처치된 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 심장독성-유도 약물로 대상을 치료하는 것과 동시에 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 심장독성-유도 약물로 대상을 치료하기 전에 대상에게 투여된다.

본원 발명은 코엔자임 Q10을 대상 (예컨대, 포유동물, 인간, 또는 비-인간 동물)에게 투여하고, 이로써 대상에서 약물-유도 심장독성을 감소 또는 예방하는 것을 포함하는, 필요한 대상에서 약물-유도 심장독성을 경감, 감소 또는 예방하는 방법들을 더욱 제공한다. 일 실시예에서, 코엔자임 Q10은 이미 심장독성-유도 약물로 처치된 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 코엔자임 Q10은 심장독성-유도 약물로 대상을 처치함과 동시에 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 코엔자임 Q10은 심장독성-유도 약물로 대상을 처치하기 전에 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 약물-유도 심장 독성은, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성된 그룹에서 선택되는, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 모두 열의 바이오마커들의 발현의 조절과 연관된다. 전술한 목록에서 제시된 모든 값들은 또한, 본 발명의 일부로서 의도된, 범주들의 상한 또는 하한이 될 수 있으며, 예컨대, 1 내지 5, 1 내지 10, 2 내지 5, 2 내지 10, 또는 5 내지 10 사이의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 범주들이다.

본원 발명은 심장독성, 예컨대, 약물-유도 심장 독성에 대한 예측 마커들로서 유용한 바이오마커들 (예컨대, 유전자들 및/또는 단백질들)을 더욱 제공한다. 이들 바이오마커들은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ를 포함한다. 통상의 기술자는, 그러나, 본원에서 설명한 방법들을 사용함으로써, 예컨대, 실시예 3에 기재된 방법들을 수행함으로써, 그러나 심장독성을 유도하는 것으로 공지된 상이함 약물을 이용함으로써, 약물-유도 심장독성을 예측하는 추가적인 바이오마커들을 동정할 수 있을 것이다. 본원 발명의 예시적 약물-유도 심장독성 바이오마커들은 이하에서 더욱 상세히 설명된다.

GRP78 및 GRP75는 또한 글루코오스 반응 단백질들로서 지시된다. 이들 단백질들은 심근세포들의 ER 스트레스(endo/sarcoplasmic reticulum stress)와 연관된다. SERCA, 또는 sarcoendoplasmic reticulum 칼슘 ATPase,는 심장 세포들에서 Ca2+ 항상성(homeostatsis)을 제어한다. 이들 ATPase의 여하한 붕괴는 심장 기능 장애 및 심장 부전에 이르게 할 수 있다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, GRP75 및 GRP78 그리고 이들 주변의 엣지들은 약물 유도 심장 독성의 신규한 예측 인자들이다.

TIMP1는, 또한 TIMP 메탈로프로테아제 억제제 1로서 지시되는데, MMPs와 공동으로 세포외 기질의 리모델링에 개입된다. TIMP1 발현은 심장의 섬유증(fibrosis)과 상호 관련되며, 그리고 혈관 내피 세포들의 저산소증 또한 TIMP1 발현을 유도한다. 본원에서 제공하는 데이터에 기초하면, TIMP1는 신규한 약물 유도 심장 독성의 예측 인자이다.

PTX3는, 또한 펜트락신(Pentraxin) 3로서 지시되는데, C 반응성 단백질들 (CRP)의 패밀리에 속하며 그리고 심장의 염증성 상태의 우수한 마커이다. 그러나 혈장 PTX3는 또한 패혈증(sepsis) 또는 여타의 의학적 상태들에 기인하는 전신적 염증 반응을 대표할 수 있다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, PTX3는 심장 기능 또는 심장 독성의 신규한 마커가 될 수 있다. 추가적으로, 네트워크에서 PTX 3와 연관된 엣지들은 바이오마커들의 신규한 패널을 형성할 수 있다.

HSP76은, 또한 HSPA6로서도 지시되는데, 내피 세포들 그리고 B 림프구들에서 발현되는 것으로 단지 공지되어 있다. 이 단백질의 심장의 기능에 대한 공지된 역할은 없다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, HSP76은 약물 유도 심장 독성의 신규한 예측 인자일 수 있다.

PDIA4, PDIA1은, 또한 단백질 디설파이드 아이소머라아제 패밀리 A 단백질들로서도 지시되는데, GRPs와 같이, ER 스트레스 반응에 연관된다. 심장 기능에 대한 이들 단백질의 공지된 역할은 없다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, 이들 단백질들은 약물 유도 심장 독성에 대한 신규한 예측 인자들일 수 있다.

CA2D1은 또한 칼슘 채널, 전압-의존성(voltage-dependent), 알파 2/델타 서브유닛으로서 지시된다. 상기 전압-의존성 칼슘 채널의 알파-2/델타 서브유닛은 칼슘 전류 밀도(current density) 및 칼슘 채널의 활성화/비활성화 동력학(kinetics)을 제어한다. CA2D1은 심장에서 흥분-수축(excitation-contraction) 커플링에 있어서 중요한 역할을 한다. 심장 기능에 대한 이들 단백질의 공지된 역할은 없다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, CA2D1은 약물 유도 심장 독성의 신규한 예측 인자이다.

GPAT1은 네 개의 공지된 글리세롤-3-포스페이트 아실트렌스퍼라아제 동형체들 중 하나이며, 그리고 미토콘드리아의 외측 멤브레인에 위치하고, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1과의 상보적 제어를 허용한다. GPAT1은 인슐린 및 SREBP-1c 에 의하여 전사적으로 상향 제어되며 그리고 AMP-활성화된 단백질 키나아제로 예민하게 하향 제어되는데, 트리아실글리세롤 합성에서의 역할과 일관된다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, GPAT1은 약물 유도 심장 독성의 신규한 예측 인자이다.

TAZ는, 또한 타파진(Tafazzin)으로서 지시되는데, 심장 및 골격 근육에서 높게 발현된다. TAZ는 카디오리핀(cardiolipin)의 대사에 개입하며 그리고 포스포리피드-라이소포스포리피드 트랜스아실라아제로서 기능한다. 타파진은 미토콘드리아의 내부 멤브레인의 시그니처 지질인, 포스포리피드 카디오리핀 (CL)의 리모델링을 담당한다. 본원에서 제공되는 데이터에 기초하면, TAZ는 약물 유도 심장 독성의 신규한 예측 인자이다.

B. 암 연관된 마커들

본원 발명은, 적어도 부분적으로 암과 연관된 신규한 바이오마크들의 동정에 기초한다. 그러한 암과 연관된 마커들은, 예를 들면, HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및/또는 CANX을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본원 발명의 마커들은 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물 또는 그 이상의 전술한 마커들의 조합이다.

따라서, 본원 발명은 암을 일으키거나 일으킬 위험이 있는 에이전트의 동정을 위한 방법들을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 에이전트는 약물 또는 약물 후보이다. 이들 방법들에서, 한 쌍의 샘플들 (제1 샘플은 약물 치료에 도입되지 않으며, 그리고 제2 샘플은 약물 치료에 도입된다)에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커들/단백질들의 양이 평가된다. 제1 샘플에 비교하여 제2 샘플에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 발현 수준의 조절은, 그 약물이 암을 일으키거나 암을 일으킬 위험이 있다는 것에 대한 지시이다. 일 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 바이오마커들이 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본원 발명의 방법들은 통상의 기술자가 암을 일으킬 수 있는 위험이 있는 약물을 동정하기 위하여 사용하는 여하한 여타의 방법과 결합하여 실시될 수 있다.

일 측면에서, 본원 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 치료 요법의 유효성을 평가하기 위한 방법들을 제공하는데, 이 방법은 이하를 포함한다: 대상에 치료 요법의 적어도 일부분을 투여하기 전의 대상으로부터 수득 되는 제 1 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택됨, 을; 치료 요법의 적어도 일부분을 투여 한 후 대상으로부터 수득된 제2 샘플에 존재하는 하나의 또는 그 이상의 마커들의 발현수준, 과 비교하는 단계, 여기서 제1 샘플에 비교하여 제2 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준의 조절(modulation)은 상기 치료 요법이 대상에서 암의 치료에 효과가 있다는 것에 대한 지시이다.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 체액을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 체액은 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액(cystic fluid), 소변, 기관지 세척(bronchial lavage)에서 수집된 액, 복강 세척(peritoneal rinsing)에서 수집된 액, 그리고 부인과액 (gynecological fluids)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득 된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스(reverse)-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단(cleavage) 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자(enviromental influencer) 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들(cytokines), 화학 요법, 동종 줄기 세포(allogenic stem cell) 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 처치된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 대상이 암으로 고통받는지 여부를 평가하는 방법들을 더욱 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다. ; 그리고 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 대조구 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준과 비교하는 단계, 여기서 대조구 샘플 내의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준에 비교하여 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준의 조절은 대상이 암으로 고통받고 있다는 지시이며, 이로써 대상이 암으로 고통받고 있는지 여부를 평가하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 분석함으로써 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 대상에서 암이 발병하기 쉬운지 여부를 예측하는 방법을 더욱 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 대상으로부터 수득 된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX으로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 그리고 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 대조구 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준과 비교하는 단계, 여기서 대조구 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준에 비교하여 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준의 조절은 대상에서 암이 발병하기 쉽다는 것에 대한 지시이며, 이로써 대상에서 암이 발생하기 쉬운지 여부를 예측하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 대상에서 암의 재발을 예측하는 방법을 더욱 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 그리고 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 대조구 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준과 비교하는 단계, 여기서 대조구 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준에 비교하여 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준의 조절은 암의 재발을 지시한다, 이로써 대상에서의 암의 재발을 예측하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 분석함으로써 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 암을 갖는 대상의 생존을 예측하는 방법을 더욱 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 그리고 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들 발현 수준을 대조구 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준과 비교하는 단계, 여기서 대조구 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준에 비교하여 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준의 조절은 대상의 생존을 지시하며, 이로써 암을 갖는 대상의 생존을 예측하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 분석함으로써 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 대상에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 더욱 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상에 치료 요법의 적어도 일부를 투여하기 전에 대상으로부터 수득된 제1 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준과 치료 요법의 적어도 일부를 투여한 후에 대상으로부터 수득된 제2 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 비교하는 단계, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다, 이로써 대상에서의 암의 진행을 모니터링하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 분석함으로써 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법을 더욱 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 상기 생물학적 샘플을 테스트 화합물과 접촉시키는 단계; 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을, 양의 배수(positive fold) 변화 및/또는 음의 배수(negative fold 변화)로, 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 마커들은 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택된다; 생물학적 샘플 내의 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 적합한 대조구과 비교하는 단계; 그리고 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 음의 배수 변화로 감소시키는 및/또는 생물학적 샘플에 존재하는 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준을 양의 배수 변화로 증가시키는 테스트 화합물을 선택하는 단계, 이로써 대상에서 암을 치료하는 화합물을 동정하는 단계.

일 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액들, 구토물, 타액, 림프, 낭종액, 소변, 기관지 세척에서 수집된 액, 복강 세척에서 수집된 액, 그리고 부인과액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 구성요소이다.

다른 실시예에서, 상기 샘플은 대상으로부터 수득된 조직 또는 이의 구성요소를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 그리고 피부로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.

일 실시예에서, 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 여기서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 분석하는 것은 상기 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 대상 샘플에서 마커의 발현 수준은 샘플에서 단백질 또는 그의 일부를 분석함으로써 측정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 단백질과 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 분석된다.

일 실시예에서, 샘플에서 하나 또는 그 이상의 마커들의 발현 수준은 상기 샘플의, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 반응 분석, 리버스-트랜스크립타아제 PCR 분석, 단일-가닥 구조 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 탐지, 헤테로듀플렉스 분석, 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 원위치(in situ) 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 시퀀싱, 제한효소 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 그리고 이들의 조합들 또는 서브-조합들, 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 분석함으로써 측정된다.

일 실시예에서, 샘플에서 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 분석법, ELISA 그리고 질량 분석기 분석으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 기술을 이용하여 측정된다.

일 실시예에서, 복수의 마커들의 발현 수준이 측정된다.

일 실시예에서, 상기 대상은 환경 영향인자 화합물, 수술, 방사능, 호르몬 치료 요법, 항체 치료 요법, 성장 인자들로의 치료 요법, 사이토킨들, 화학 요법, 동종 줄기 세포 치료 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 치료 요법으로 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경 영향인자 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.

본원 발명은 암을 치료하기 위한 치료 요법의 유효성을 평가하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 시약들 및 암을 치료하기 위한 치료 요법의 유효성을 평가하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 대상이 암으로 고통받고 있는지 여부를 평가하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB,PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 시약들 및 대상이 암으로 고통받고 있는지 여부를 평가하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 대상이 암을 발병하기 쉬운지 여부를 예측하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 시약들 및 대상이 암을 발병하기 쉬운지 여부를 예측하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 대상에서 암의 재발을 예측하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 SPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 평가하는 시약들 및 암의 재발을 예측하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 암의 재발을 예측하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 마커의 발현수준을 측정하는 시약들 및 암의 재발을 예측하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 암을 갖는 대상의 생존을 예측하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 마커의 발현수준을 측정하는 시약들 및 암을 갖는 대상의 생존을 예측하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명은 대상에서 암의 진행을 모니터링하는 키트를 더욱 제공하는데, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 그리고 CANX로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 시약들 및 대상에서 암의 진행을 예측하는 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본원 발명의 키트들은 대상으로부터 생물학적 샘플을 수득하기 위한 수단, 대조구 샘플, 및/또는 환경 영향인자 화합물을 더욱 포함할 수 있다.

하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 수단은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하는 수단 및/또는 수단 샘플에서 단백질 또는 이의 일부를 분석하는 수단을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 키트들은 복수의 마커들의 발현 수준을 측정하는 시약들을 포함한다.

본원 발명의 다양한 측면들은 이하의 서브섹션들에서 더욱 상세히 설명된다.

C. 분리된 핵산 분자들

본원 발명의 하나의 측면은, 마커 단백질 또는 그의 일부를 인코딩하는 핵산들을 포함하는, 분리된 핵산 분자들에 관련된다. 본원 발명의 분리된 핵산들은 또한 마커 핵산 분자들, 그리고 마커 핵산 분자들의 단편들을 동정하기 위한 혼성화 프로브들로서 사용하는데 충분한 핵산 분자들, 예컨대, 마커 핵산 분자들의 증폭 또는 돌연변이를 위한 PCR 프라이머들로서 사용되는데 적합한 것들을 포함한다. 본원에서 사용되는, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자들 (예컨대, cDNA 또는 게놈의 DNA) 그리고 RNA 분자들 (예컨대, mRNA) 그리고 DNA의 유사체들 또는 뉴클레오타이드 유사체들을 사용하여 생성된 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.

"분리된(isolated)" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 원료에 존재하는 여타의 핵산 분자들로부터 구별되는 것이다. 일 실시예에서, "분리된" 핵산 분자는 핵산이 유도되는 유기체의 게놈 DNA에서 핵산을 자연적으로 플랭킹 하는(flank) 서열들(바람직하게는 단백질-인코딩 서열들) (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단들에 존재하는 서열들)이 없다. 예를 들면, 다양한 실시예들에서, 분리된 핵산 분자는, 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA에서 핵산 분자를 자연적으로 플랭킹하는 약 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 뉴클레오타이드 서열들을 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, "분리된" 핵산 분자, 이를테면 cDNA 분자, 는 실질적으로 여타의 세포 물질이, 또는 재조합 기술들로 제조되는 경우 배양 배지가, 없을 수 있으며, 또는 화학적으로 합성되는 경우 실질적으로 화학적 전구체들 또는 여타의 화학물질들이 없을 수 있다. 실질적으로 세포 물질이 없는 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 이종 기원의(heterologous) 핵산 (또한 본원에서 "오염(contaminating) 핵산"으로서 지시됨)을 갖는 생성물들 포함한다.

본원 발명의 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술들 및 본원에서 설명한 데이터베이스 기록들의 서열 정보를 이용하여 분리될 수 있다. 그러한 핵산 서열들의 모두 또는 일부를 이용하여, 본원 발명의 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술들 (예컨대, Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재된)을 이용하여 분리될 수 있다.

본원 발명의 핵산 분자는 템플레이트로서 cDNA, mRNA, 또는 게놈의 DNA를 그리고 표준 PCR 증폭 기술들에 따른 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 이용하여 증폭될 수 있다. 그렇게 증폭된 핵산은 적합한 벡터에 클로닝되고 DNA 서열 분석법으로 특징져질 수 있다. 또한, 본원 발명의 핵산 분자의 전부 또는 일부에 대응되는 뉴클레오타이드들은 표준 합성 기술들에 의하여, 예컨대, 자동화된 DNA 합성기를 이용하여 제조될 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 본원 발명의 분리된 핵산 분자는 마커 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 또는 마커 단백질을 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 주어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 핵산분자는, 주어진 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하여 이로써 안정한 이중구조(duplex)형성할 수 있도록, 주어진 뉴클레오타이드 서열에 충분히 상보적인 것이다.

더욱이, 본원 발명의 핵산 분자는 핵산 서열을 단지 일부를 포함할 수 있는데, 여기서 전장(full length) 핵산 서열은 마커 핵산 또는 마커 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 그러한 핵산들은 예를 들면, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 상기 프로브/프라이머는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드들로서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로, 엄격한(stringent) 상태들 하에서 적어도 약 7, 바람직하게는 약 15, 더욱 바람직하게는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 또는 그 이상의 본원 발명의 핵산의 연속적인(consecutive) 뉴클레오타이드들에 혼성되는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다.

본원 발명의 핵산 분자의 서열에 기초한 프로브들(probes)은 본원 발명의 하나 또는 그 이상의 마커들에 대응되는 전사체들 또는 게놈의 서열들의 검출에 사용될 수 있다. 상기 프로브는, 그에 부착될 수 있는 표지 그룹, 예컨대, 방사성동위 원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자(co-factor),을 포함한다. 그러한 프로브들은, 이를테면 대상으로부터의 세포들의 샘플에서 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 수준들을 측정함으로써, 예컨대, mRNA 수준들을 검출함으로써, 또는 그 단백질을 인코딩하는 유전자가 돌연변이 되었는지 또는 결실되었는지 여부를 측정함으로써, 단백질을 잘못-발현하는(mis-express) 세포들 또는 조직들을 동정하는 진단 테스트 키트의 일부로서 사용될 수 있다.

본원 발명은, 유전자 코드의 퇴보(degeneracy)에 의하여, 마커 단백질을 인코딩하는 핵산들이 뉴클레오타이드 서열로부터 상이하게 된, 그리고 따라서 동일한 단백질을 인코딩하는 핵산 분자들을 더욱 포괄한다.

이 분야의 통상의 기술자들은 아미노산 서열에 있어서의 변화들을 유도하는 DNA 서열 다형성들이 하나의 개체군 (예컨대, 인간 개체군) 내에 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 유전적 다형성들은, 자연의 대립 유전자 변이(allelic variation)에 의하여 개체군 내의 개체들 사이에 존재할 수 있다. 대립 유전자는 주어진 유전 좌위에서 택일적으로 발생하는 유전자들의 그룹의 하나이다. 또한, RNA 발현 수준들에 영향을 주는 DNA 다형성들 또한 존재할 수 있어서, 그 유전자의 전체적 발현 수준에 영향을 줄 수 있다는 (예컨대, 제어 또는 분해에 작용함으로써) 것이 이해될 것이다.

본원에서 사용되는, "대립 유전자 변이체"라는 구절은 주어진 좌위에서 일어나는 뉴클레오타이드 서열 또는 그 뉴클레오타이드 서열에 의하여 인코딩되는 폴리펩티드를 지시한다.

본원에서 사용되는, "유전자" 그리고 "재조합 유전자"라는 용어들은 본원 발명의 마커에 대응되는 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 핵산 분자들을 지시한다. 그러한 자연의 대립 유전자 변이체들은 전형적으로 주어진 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 1-5% 변이가 된다. 택일적 대립 유전자들은 다수의 상이한 개체의 유전자를 씨퀀싱 함으로써 동정될 수 있다. 이것은 다양한 개체들에서 동일한 유전자 좌위를 동정하는 혼성화 프로브들을 이용하여 쉽게 수행될 수 있다. 여하한 그리고 모든 그러한 뉴클레오타이드 변이들 및 도출되는 아미노산 다형성들 또는 자연의 대립 유전자 변이의 결과이며 기능적 활성을 바꾸지 않는 변이들이 본원 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

다른 실시예에서, 본원 발명의 분리된 핵산 분자는 적어도 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 그 이상의 길이의 뉴클레오타이드들이며 그리고 엄격한 조건들 하에서 마커 핵산에 또는 마커 단백질을 인코딩하는 핵산에 혼성화된다. 본원에서 사용되는, "엄격한 조건들 하에서 혼성화"라는 용어는 서로 적어도 60% (65%, 70%, 바람직하게는 75%) 동일한 뉴클레오타이드 서열들이 전형적으로 서로 혼성화 되어 남아있는 혼성화 및 세척 조건들을 설명하는 것으로 의도된다. 그러한 엄격한 조건들은 이 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있으며 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)의 섹션 6.3.1-6.3.6에 기재되어 있다. 엄격한 혼성화 상태들의 바람직한, 비-제한적인 실시예는 6X 소듐 클로라이드/소듐 사이트레이트 (SSC)로 약 45^oC에서의 혼성화, 이후에 0.2X SSC, 0.1% SDS로 50-65^oC에서의 한번 또는 그 이상의 세척들이다.

개체군에 존재할 수 있는 본원 발명의 핵산 분자의 자연-발생 대립 유전자 변이체들 이외에도, 통상의 기술자는 서열 변화들이 돌연변이에 의하여, 이로써 인코딩 되는 단백질의 생물학적 활성을 변경함이 없이 인코딩 되는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 유도함, 도입될 수 있음 또한 이해할 것이다. 예를 들면, "비-필수적" 아미노산 잔기들에서의 아미노산 치환들을 유도하는 뉴클레오타이드 치환들을 만들 수 있다. "비-필수적" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경함이 없이 야생-타입 서열로부터 수정될 수 있는 잔기인 반면, "필수적" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 위하여 필요하다. 예를 들면, 다양한 종의 동족체들 사이에서 보존적(conserved)이지 않은 또는 단지 반-보전적인 아미노산 잔기들은 활성에 비-필수적일 수 있으며 그리고 따라서 수정의 표적이 될 가능성이 높다. 대안적으로, 다양한 종 (예컨대, 쥐과 동물 및 인간)의 동족체들 사이에서 보전적인 아미노산 잔기들은 활성에 필수적일 수 있으며 그리고 따라서 수정의 표적이 될 가능성이 낮다.

따라서, 본원 발명의 별개의 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기들의 변화를 함유하는 변이체 마커 단백질을 인코딩하는 핵산 분자들에 관련된다. 그러한 변이체 마커 단백질들 자연-발생 마커 단백질들과 아미노산 서열이 상이하지만, 생물학적 활성은 유지한다. 일 실시예에서, 그러한 변이체 마커 단백질은 마커 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 40% 동일한, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

변이체 마커 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 분자는 마커 핵산들의 뉴클레오타이드 서열에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 치환들, 부가들 또는 결실들을 도입하여, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 치환들, 부가들, 또는 결실들이 인코딩되는 단백질에 도입되도록 함으로써 창조될 수 있다. 돌연변이들은 표준 기술들, 이를테면 위치-지정 돌연변이유발 그리고 PCR-매개 돌연변이유발에 의하여 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환들은 하나 또는 그 이상의 예측된 비-필수적 아미노산 잔기들에 만들어 진다. "보존적 아미노산 치환"은 그 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄들을 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리들이 이 기술 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리들은 염기성 측쇄들 (예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들 (예컨대, 아스팔틱 애시드, 글루타믹 애시드), 하전 되지 않은 극성 측쇄들 (예컨대, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄들 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄들 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 그리고 방향성 측쇄들 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산들을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이들이 무작위로 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라, 이를테면 포화(saturation) 돌연변이유발에 의하여 도입될 수 있으며, 그리고 도출된 돌연변이체들은 활성을 유지하는 돌연변이체들을 동정하기 위하여 생물학적 활성에 대하여 스크리닝 될 수 있다. 돌연변이유발 후, 인코딩된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있으며 단백질의 활성이 측정될 수 있다.

본원 발명은 안티센스(antisense) 핵산 분자들, 즉, 본원 발명의 센스(sense) 핵산에 상보적인, 예컨대, 이중-가닥 마커 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인 또는 마커 mRNA 서열에 상보적인, 분자들을 포괄한다. 따라서, 본원 발명의 안티센스 핵산은 본원 발명의 센스 핵산에 수소 결합(즉 이와 어닐링(anneal)될) 할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 코딩 가닥, 또는 단지 그의 일부분, 예컨대, 단백질코딩 영역 (또는 오픈 리딩 프레임)의 모두 또는 일부, 에 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 마커 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 가닥의 비-코딩 영역의 전부 또는 일부에 안티센스일 수 있다. 비-코딩 영역들 ("5' 및 3' 번역되지 않은 영역들")은 코딩 영역을 플랭킹 하며 아미노산들로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열들이다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 또는 그 이상의 길이의 뉴클레오타이드들 일 수 있다. 본원 발명의 안티센스 핵산은 당해 기술분야에 공지된 절차들을 사용하는 화학적 합성 및 효소 라이게이션(ligation) 반응 들을 이용하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산 (예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 자연 발생 뉴클레오타이드들 또는 분자들의 생물학적 안정성을 증가시키기 위하여 또는 안티센스 그리고 센스 핵산들 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키기 위하여 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드들을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 예컨대, 포스포로티오에티드(phosphorothioate) 유도체들 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드들이 사용될 수 있다. 안티센스 핵산의 생성에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드들의 예시에는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2- 메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세틱 애시드 (v), 와이부톡신, 수도우라실, 큐에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세틱 애시드 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세틱 애시드 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 그리고 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 대안적으로, 안티센스 핵산은, 내부로 핵산이 안티센스 방향으로 서브-클론 되는 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA가 관심 대상의 표적 핵산에 대하여 안티센스 ?향이 될 것이며, 이하의 서브섹션에서 더욱 상세히 설명됨) 발현 벡터를 이용하여 생물학적으로 제조될 수 있다.

본원 발명의 안티센스 핵산 분자는, 마커 단백질을 인코딩하는 세포 mRNA 및/또는 게놈의 DNA와 혼성화하거나 또는 결합하여, 예컨대, 전사 및/또는 번역을 억제함으로써, 이로써 마커의 발현을 억제하도록, 전형적으로 대상에게 투여되거나 또는 원위치( in situ ) 생성된다. 혼성화는 안정한 듀플렉스를 형성하는 전통적인 뉴클레오타이스 상보성에 의하여, 또는, 예를 들면, DNA 듀플렉스들에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우, 이중 나선의 주요 그루부(groove)에서 특이적 상호작용들을 통하여, 일어날 수 있다. 본원 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예시들은 조직 부위에의 직접 주사 또는 질병 상태 또는 독성 상태 연관된 체액으로 안티센스 핵산의 주입을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자들은 선택된 세포들을 표적하도록 변형되고 이후 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 전신 투여를 위하여, 안티센스 분자들은, 예컨대, 안티센스 핵산 분자들을 세포 표면 수용체들 또는 항원들에 결합하는 펩티드들 또는 항체들에 링크함으로써, 선택된 세포 표면상에서 발현되는 수용체들 또는 항원들에 특이적으로 결합하도록, 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자들은 또한 본원에서 설명하는 벡터들을 이용하여 세포들로 전달될 수 있다. 안티센스 분자들의 충분한 세포 외 농도들을 달성하기 위하여, 안티센스 핵산 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어 하에 배치되어 있는 벡터 구조체들이 바람직하다.

본원 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머(anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산분자는 상보적인 RNA와 특이적 이중-가닥 혼성체들을 형성하는데, 여기서, 보통의 α-유닛들과 반대로, 상기 가닥들은 서로 평행하게 이어진다(run). (Gaultier 등, 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드 (Inoue 등, 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메릭 RNA-DNA 유사체 (Inoue 등, 1987, FEBS Lett . 215:327-330)를 포함할 수 있다.

본원 발명은 또한 라이보자임들(ribozymes)을 포괄한다. 라이보자임들은, 단일-가닥 핵산, 이를테면 mRNA를 절단할 수 있으며, 거기에 상보적 영역을 갖는, 라이보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA 분자들이다. 따라서, 라이보자임들 (예컨대, Haselhoff 및 Gerlach, 1988, Nature 334:585-591에 설명된 것과 같은 해머헤드(hammerhead) 라이보자임들)은 mRNA 전사체를 효소적으로 절단하고 이로써 그 mRNA에 의하여 인코딩되는 단백질의 번역을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 마커 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 특이성을 갖는 라이보자임은 그 마커에 대응되는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 예를 들면, 테트라히메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체가 구성될 수 있는데, 여기서 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 잘라지는 뉴클레오타이드 서열에 상보적이다. (Cech 등의 미국 특허 제4,987,071호; 그리고 Cech 등의 미국 특허 제 5,116,742호 참조). 대안적으로, 본원 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA는 RNA 분자들의 풀 (에컨대, Bartel 그리고 Szostak, 1993, Science 261:1411-1418 참조)로부터 특이적 라이보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다.

본원 발명은 또한 삼중 헬릭스 구조들을 형성하는 핵산 분자들을 포괄한다. 예를 들면, 본원 발명의 마커의 발현은, 표적 세포들 내의 유전자의 전사를 방지하는 삼중 헬릭스 구조체들을 형성하도록 마커 핵산 또는 단백질을 인코딩하는 유전자의 조절 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열들을 (예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서) 표적화함으로써 억제될 수 있다. 일반적으로 Helene (1991) Anticancer Drug Des .6(6):569-84; Helene (1992) Ann . N.Y. Acad . Sci . 660:27-36; 및 Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15 참조.

다양한 실시예들에서, 본원 발명의 핵산 분자는, 예컨대, 안정성, 혼성화, 또는 분자의 가용성을 개선하기 위하여 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 핵산들의 데옥시리보오스 포스페이트 백본은 펩티드 핵산들을 생성하도록 변형될 수 있다 (Hyrup 등, 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23 참조). 본원에서 사용되는, "펩티드 핵산들" 또는 "PNAs"이라는 용어들은 핵산 모방체(mimics), 예컨대, DNA 모방체, 를 지시하는데, 여기서 데옥시리보오스 포스페이트 백본은 수도펩티드 백본으로 대체되며 그리고 단지 네개의 천연의 핵염기들(nucleobases)만이 유지된다. PNAs의 중성의(neutral) 백본은 낮은 이온 강도 조건들 하에서 DNA 및 RNA에 특이적으로 혼성화 하는 것을 허용하기 위한 것으로 보인다. PNA 올리고머들의 합성은 Hyrup 등 (1996), supra; Perry-O'Keefe 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675에 기재된 바와 같은 표준 고체 상 펩티드 합성 프로토콜들을 이용하여 수행될 수 있다.

PNAs는 치료 및 진단 용도들에 사용될 수 있다. 예를 들면, PNAs는, 예컨대, 전사 또는 번역 정지(arrest)를 유도함으로써 또는 복제를 억제함으로써, 유전자 발현의 서열-특이성 조절을 위하여 안티센스 또는 항유전자(antigene) 에이전트들로서 사용될 수 있다. PNAs는 또한, 예컨대, 유전자에서 단일 염기 쌍 돌연변이들의 분석에, 예컨대, PNA 지향(directed) PCR 클램핑(clamping)에 의하여; 여타의 효소들, 예컨대, S1 뉴클레아제, 와 조합하여 사용되는 경우 (Hyrup (1996), supra) 인공적 제한 효소들로서; 또는 DNA 서열 및 혼성화를 위한 프로브들 또는 프라이머들로서(Hyrup, 1996, supra; Perry-O'Keefe 등, 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:14670-675) 사용될 수 있다.

다른 실시예에서, PNAs는, 예컨대, 그들의 안정성 또는 세포 섭취를 증진시키기 위하여, 친지방성 또는 여타의 헬퍼 그룹들을 PNA에 부착함으로써, PNA-DNA 키메라들(chimeras)을 형성함으로써, 또는 리포좀들 또는 여타의 당해 기술분야에 공지된 약물 전달 기술들을 사용함으로써, 변형될 수 있다. 예를 들면, PNA-DNA 키메라들이 생성될 수 있는데, 이는 PNA 및 DNA의 유리한 특성들을 조합할 수 있다. 그러한 키메라들은, PNA 부분이 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공하는 동안, DNA 인식(recognition) 효소들, 예컨대, RNase H 그리고 DNA 폴리머라아제들, 이 DNA 부분과 상호작용하는 것을 허용한다. PNA-DNA 키메라들은 염기 스택킹(base stacking), 핵염기들 사이의 결합의 갯수, 그리고 방향(orientation)을 고려하여 선택된 적합한 길이의 링커들을 이용하여 링크될 수 있다. (Hyrup, 1996, supra) PNA-DNA 키메라들의 합성은 Hyrup (1996), supra, 및 Finn 등 (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들면, DNA 체인은 고체 지지체 상에서 표준 포스포르아미다이트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오사이드 유사체들을 이용하여 합성될 수 있다. 이를테면 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미다이트과 같은 화합물들이 PNA와 DNA의 5' 말단 사이의 링크로서 사용될 수 있다. (Mag 등, 1989, Nucleic Acids Res . 17:5973-88). PNA 모노머들은 이후 5' PNA 세그먼트 및 3' DNA 세그먼트를 갖는 키메릭 분자를 제조하기 위하여 단계 선택(step-wise) 방식으로 커플링된다. (Finn 등, 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 대안적으로, 키메릭 분자들은 5' DNA 세그먼트 및 3' PNA 세그먼트로 합성될 수 있다. (Peterser 등, 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).

다른 실시예들에서, 올리고뉴클레오타이드는 여타의 부가된 그룹들, 이를테면 펩티드들 (예컨대, 생체 내에서 숙주 세포 수용체들의 표적을 위한 ), 또는 세포막(예컨대, Letsinger 등, 1989, Proc . Natl . Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre 등, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Publication No. WO 88/09810 참조) 또는 혈액-뇌 장벽 (예컨대, PCT Publication No. WO 89/10134 참조) 을 통과하는 수송을 촉진시키는 에이전트들, 을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드들은 혼성화-유발(triggered) 분해 에이전트들 (예컨대, Krol 등, 1988, Bio / Techniques 6:958-976 참조) 또는 인터칼레이팅(intercalating) 에이전트들 (예컨대, Zon, 1988, Pharm . Res . 5:539-549 참조)로 변형될 수 있다. 이를 위해, 올리고뉴클레오타이드는 별개의 분자, 예컨대, 펩티드, 혼성화 유발 가교 에이전트, 수송 에이전트, 혼성화-유발 분해 에이전트, 등등, 에 컨쥬게이션 될 수 있다.

본원 발명은 또한 본원 발명의 핵산에 상보적인 하나 이상의 영역을 가지는 분자 비콘(beacon) 핵산들을 포함하며, 따라서 상기 분자 비콘은 샘플에서 본원 발명의 핵산의 존재를 정량하는데 유용하다. "분자비콘" 핵산은 한 쌍의 상보적인 영역들을 포함하며 그리고 형광원(fluorophore) 및 그에 연관된 형광 소광제(fluorescent quencher)를 갖는 핵산이다. 형광원 및 소광제는, 상보적인 영역들이 서로 어닐링 되는 경우, 형광원의 형광은 소광제에 의하여 소광되는 그러한 배열(orientation)로 핵산의 상이한 부분들에 연관된다. 핵산의 상보적인 영역들이 서로 어닐링 되지 않는 경우, 형광원은 보다 낮은 정도로 소광된다. 분자 비콘 핵산들은 예를 들면, 미국 특허 제 5,876,930호에 상세히 설명되어 있다.

D. 분리된 단백질들 및 항체들

본원 발명의 일 측면은 분리된 마커 단백질들 및 그들의 생물학적 활성 부분들은 물론, 마커 단백질 또는 이의 단편에 지향된 항체들을 일으키기 위한 면역원들로서 사용하는데 적합한 폴리펩티드 단편들에 관련된다. 일 실시예에서, 네이티브 마커 단백질은 표준 단백질 정제 기술들을 이용하는 적합한 정제 계획을 이용하여 세포들 또는 조직 공급원들로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 마커 단백질의 전부 또는 세그먼트를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술들로 제조된다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 그러한 단백질 또는 펩티드는 표준 펩티드 합성 기술들을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.

"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분은, 그로부터 단백질이 유래 되는 세포 또는 조직 공급원들로부터의 세포 물질 또는 여타의 오염 단백질들이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체들 또는 여타의 화학 물질들이 실질적으로 없다. "실질적으로 세포 물질이 없는"이라는 언어는, 단백질이 그로부터 분리되거나 재조합적으로 생산되는 세포들의 세포 구성요소들로부터 단백질이 분리되는, 단백질의 제조들을 포함한다. 따라서, 실질적으로 세포 물질이 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (건조 중량으로) 미만의 이종 기원 단백질 (또한 본원에서 "오염 단백질"로서 지시됨)을 포함한다. 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 제조되는 경우, 또한 바람직하게는 실질적으로 배양 배지가 없다, 즉, 배양 배지는 약 20%, 10%, 또는 5% 미만의 단백질 제조물의 부피를 차지한다. 단백질이 화학적 합성으로 제조되는 경우, 바람직하게는 실질적으로 화학적 전구체들 또는 여타의 화학 물질들이 없다, 즉, 단백질의 합성에 개입되는 화학적 전구체들 또는 여타의 화학 물질들로부터 분리된다. 따라서 그러한 단백질의 제조물들은 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량으로) 미만의 관심 대상의 폴리펩타이드 이외의 화학적 전구체들 또는 화합물들을 갖는다.

마커 단백질의 생물학적 활성 부분들은 마커 단백질의 아미노산 서열과 충분히 동일한 또는 이로부터 유도된 아미노산 서열들을 포함하는 폴리펩티드들을 포함하는데, 이는 전장 단백질보다 더 적은 아미노산들을 포함하며, 대응되는 전-장 단백질의 하나 이상의 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분들은 대응되는 전-장 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본원 발명의 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들면, 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산들 길이의 폴리펩티드일 수 있다. 더욱이, 마커 단백질의 여타의 영역들이 결실된 여타의 생물학적 활성 부분들이 재조합 기술들로 제조될 수 있으며 그리고 마커 단백질의 네이티브 형태의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성들에 대하여 평가될 수 있다.

바람직한 마커 단백질들은, 실시예들에 설명된 여하한 유전자들을 인코딩하는 서열들을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열들에 의하여 인코딩된다. 여타의 유용한 단백질들은 이들 서열들 중 하나와 실질적으로 동일하며 (예컨대, 적어도 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 그리고 자연의 대립 유전자 변이 또는 돌연변이유발에 의하여 아미노산 서열은 다르지만 대응되는 자연-발생 마커 단백질의 기능적 활성은 보유한다.

두 아미노산 서열들 또는 두 핵산들의 동일성 퍼센트를 측정하기 위하여, 서열들은 최적의 비교 목적들을 위하여 정렬된다. (예컨대, 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 제2 아미노 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위하여 갭들(gaps)이 도입될 수 있다.). 대응되는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오타이드 위치들에서의 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이드들이 이후 비교된다. 제1 서열에서 하나의 위치가 대응되는 제2 서열에서의 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드로 점유되어 있는 경우, 이 분자들은 그 위치에서 동일하다. 바람직하게는, 두 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 전역 정렬(global alignment)을 이용하여 계산된다. 대안적으로, 두 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 국소 정렬 (local alignment)을 이용하여 계산된다. 두 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 그 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 수의 함수이다. (즉, % 동일성 = 동일한 위치들의 #/위치들의 총 # (예컨대, 중복되는(overlapping) 위치들) x100). 일 실시예에서 두 서열들은 동일한 길이이다. 다른 실시예에서, 두 서열들 동일한 길이가 아니다.

두 서열을 사이의 동일성 퍼센트 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한, 두 서열들의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비-제한적인 실시예는 Karlin 및 Altschul (1993) Proc . Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램들에 편입되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색들은 본원 발명의 핵산 분자들에 대항 상동성의 뉴클레오타이드 서열들을 수득하기 위하여 BLASTN 프로그램, 스코어= 100, 단어길이(wordlength) = 12, 으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색들은 본원 발명의 단백질 분자들에 대한 상동성의 아미노산 서열들을 수득하기 위하여 BLASTP 프로그램, 스코어= 50, 단어길이(wordlength) = 3, 으로 수행될 수 있다. 비교 목적들을 위한 갭이 있는(gapped) 정렬들을 수득하기 위하여, Gapped BLAST라고 불리우는 새로운 버전의 BLAST 알고리즘이 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 설명된 바와 같이 사용될 수 있는데, 이는 프로그램들 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX에서 갭이 있는 국소 정렬을 수행할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast가 분자들 사이의 거리 상관관계들을 탐색하는 반복(iterated) 검색을 수행하도록 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램들을 사용하는 경우, 각각의 프로그램들 (예컨대, BLASTX 그리고 BLASTN)의 디폴트 파라미터들이 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 또 다른 바람직한, 서열들의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비-제한적인 실시예는 Myers 및 Miller, (1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 GCG 서열 alignment 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(version 2.0)에 편입되어 있다. 아미노산 서열들의 비교를 위하여 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표(weight residue table), 갭 길이 벌점(gap length penalty) 12, 그리고 갭 벌점(gap penalty) 4가 사용될 수 있다. 영역들의 국소 서열 유사성 및 정렬을 동정하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 Pearson 및 Lipman (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444-2448에 설명된 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 비교를 위하여 FASTA 알고리즘을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표가 예를 들면, k-tuple 값 2와 사용될 수 있다.

두 서열을 사이의 동일성 퍼센트는, 갭들을 허용하거나 허용하지 않는, 전술한 것들과 유사한 기술들을 이용하여 측정될 수 있다. 동일성 퍼센트 계산에는, 오직 정확한 매치들만이 카운트 된다.

본원 발명은 또한 키메릭 또는 융합 단백질들, 마커 단백질 또는 그의 세그먼트를 포함, 을 제공한다. 본원에서 사용되는, "키메릭 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종 기원의 폴리펩티드 (즉, 마커 단백질 이외의 폴리펩티드)에 작동 가능하게 연결과 마커 단백질의 전부 또는 일부 (바람직하게는 생물학적 활성 부분)를 포함한다. 융합 단백질 내에서, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 상기 마커 단백질 또는 그의 세그먼트 그리고 이종 기원의 폴리펩티드가 서로 프레임 안에(in-frame) 융합되어 있다는 것을 지시하는 것으로 의도된다. 이종 기원의 폴리펩티드는 마커 단백질 또는 세그먼트의 아미노-말단 또는 카르복시실-말단에 융합될 수 있다.

하나의 유용한 융합 단백질은 마커 단백질 또는 세그먼트가 GST 서열들의 카르복실 말단에 융합되어 있는 GST 융합 단백질이다. 그러한 융합 단백질들은 본원 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 촉진시킬 수 있다.

다른 실시예에서, 융합 단백질은 그의 아미노 말단에 이종 기원의 시그날 서열을 함유한다. 예를 들면, 마커 단백질의 네이티브 시그날 서열은 제거되며 그리고 별개의 단백질로부터의 시그날 서열로 대체될 수 있다. 예를 들면, 베큘로바이러스(baculovirus)의 외피(envelope) 단백질의 gp67 분비 서열이 이종 기원의 시그날 서열로서 사용될 수 있다. (Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1992). 진핵생물 이종 기원의 시그날 서열들의 다른 예시들은 멜리틴(melittin) 및 인간 태반 알카라인 포스파타아제의 분비 서열들을 포함한다. (Stratagene La Jolla, California). 또 다른 실시예에서, 유용한 원핵생물 이종 기원의 시그날 서열들은 phoA 분비 시그날 (Sambrook 등, supra) 및 단백질 A 분비 시그날 (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 융합 단백질은, 마커 단백질의 일부 또는 전부가 면역글로불린 단백질 패밀리의 멤버로부터 유래된 서열들에 융합되는, 면역글로불린 융합 단백질이다. 본원 발명의 면역글로불린 융합 단백질들은 약제학적 조성물들에 편입될 수 있으며 그리고, 리간드(가용성의 또는 멤브레인-결합된)와 세포 (수용체)의 표면상의 단백질 사이의 상호작용을 억제하여, 이로써 생체 내 시그날 전달(transduction)을 억제하기 위하여, 대상에게 투여될 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질은 마커 단백질의 동족의(cognate) 리간드의 생체이용률에 영향을 미치기 위하여 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는, 증식성 및 분화성 장애들의 치료 그리고 세포 생존의 조절 (예컨대 촉진 또는 억제에) 모두에, 치료적으로 유용할 수 있다. 더욱이, 본원 발명의 면역글로불린 융합 단백질들은 대상에서 마커 단백질에 대하여 지향된 항체들을 생산하기 위하여 면역원들로서, 리간드들을 정제하기 위하여, 그리고 마커 단백질과 리간드들의 상호작용을 억제하는 분자들을 동정하기 위한 스크리닝 분석들에 사용될 수 있다.

본원 발명의 키메릭 및 융합 단백질들은 표준 재조합 DNA 기술들로 제조될 수 있다. 다른 실시예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기들을 포함하는 전통적인 기술들에 의하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은, 두 연속적인 유전자 단편들 사이의 상보적인 오버행들(overhangs), 이는 뒤이어 키메릭 유전자 서열을 생성하기 위하여 어닐링되고 재-증폭될 수 있음, 을 일으키는, 앵커(anchor) 프라이머들을 이용하여 수행될 수 있다. (예컨대, Ausubel 등, supra 참조). 더욱이, 이미 융합 모이어티를 인코딩하는, 많은 발현 벡터들이 상업적으로 이용 가능하다. (예컨대, GST 폴리펩티드). 본원 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은, 융합 모이어티가 본원 발명의 폴리펩티드에 프레임 안에(in-frame)링크되는, 그러한 발현 벡터로 클로닝 될 수 있다.

시그날 서열은 마커 단백질들의 분비 및 분리를 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다. 시그날 서열들은 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 절단 이벤트들에서 분비 동안에 성숙한 단백질로부터 일반적으로 절단되는, 소수성 아미노산들의 코어에 의하여 특징져진다. 그러한 시그날 펩티드들은, 성숙한 단백질들로부터, 그들이 분비 경로를 통과하면서, 시그날 서열을 절단을 허용하는 프로세싱 부위들을 함유한다. 따라서, 본원 발명은 시그날 서열을 갖는 마커 단백질들, 융합 단백질들 또는 그의 세그먼트들은 물론, 그로부터 시그날 서열이 단백질 분해로 절단되는 그러한 단백질들(즉, 절단 산물들)에 관련된다. 일 실시예에서, 시그날 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 발현 벡터에서 관심 대상 단백질, 이를테면 마커 단백질 또는 이의 세그먼트, 에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 시그날 서열은, 이를테면 그 안으로 발현벡터가 형질전환되는 진핵생물 숙주로부터, 단백질의 분비를 지시하며, 그리고 상기 시그날 서열은 뒤이어 또는 동시에 절단된다. 단백질은 그 다음 선행기술에 공지된 방법들로 세포외 배지로부터 쉽게 정제될 수 있다. 대안적으로, 시그날 서열은 정제를 촉진하는 서열, 이를테면 GST 도메인을 갖는, 서열을 이용하여 관심 대상 단백질로 링크될 수 있다.

본원 발명 또한 마커 단백질들의 변이체들에 관련된다. 그러한 변이체들은 작용제들(모방제들(mimetics)) 또는 길항제들 중 어느 하나로서 작용할 수 있는 변형된 아미노산 서열들을 갖는다. 변이체들은 돌연변이유발, 예컨대, 불연속적 포인트 돌연변이 또는 절삭 돌연변이(truncation), 로 생성될 수 있다. 작용제는 단백질의 자연 발생 형태의 생물학적 활성들의 동일한, 또는 서브세트를 보유할 수 있다. 단백질의 길항제는, 단백질의 자연 발생 형태의 하나 또는 그 이상의 활성들을, 예를 들면, 관심 대상의 단백질을 포함하는 세포 시그날링 캐스캐이드의 다운스트림 또는 업스트림 멤버에의 결합에 경쟁적으로 결합함으로써, 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과들이 제한된 기능의 변이체로 치료함으로써 유도될 수 있다. 단백질의 자연 발생 형태의 생물학적 활성들의 서브세트를 갖는 변이체로 대상을 치료하는 것은 단백질의 자연 발생 형태로 치료하는 것에 비하여 대상에서 더 적은 부작용들을 가질 수 있다.

작용제들(모방제들) 또는 길항제들 중 하나로서 작용하는 마커 단백질의 변이체들은 돌연변이체들, 예컨대, 작용제 또는 길항제 활성을 위한 본원 발명의 단백질의 절삭 돌연변이체들, 의 분자 다양성(combinatorial) 라이브러리들을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 일 실시예에서, 변이체들의 다채로운(variegated) 라이브러리가 핵산 수준에서 분자 다양성 돌연변이 유발에 의하여 생성되며 그리고 다채로운 유전자 라이브러리로 인코딩된다. 변이체들의 다채로운 라이브러리는, 잠재적 단백질 서열들의 축퇴 (degenerate) 세트가 개별적 폴리펩티드들로서, 또는 대안적으로, 더욱 큰 융합 단백질들의 세트로서 (예컨대, 파아지 디스플레이를 위한) 발현할 수 있도록, 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드들의 혼합물을 유전자 서열들로 효소적으로 라이게이션(ligation) 함으로써, 제조될 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 마커 단백질들의 잠재적 변이체들의 라이브러리들를 제조하는데 사용할 수 있는 다양한 방법들이 존재한다. 축퇴 올리고뉴클레오타이드들의 합성 방법들은 해당 분야에 공지되어 있다. (예컨대, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura 등, 1984, Annu. Rev. Biochem.53:323; Itakura 등, 1984, Science 198:1056; Ike 등, 1983 Nucleic acid Res . 11:477 참조).

또한, 마커 단백질의 세그먼트들의 라이브러리들은, 변이체 마커 단백질들 또는 그의 세그먼트들의 스크리닝 및 뒤이은 선택을 위한 폴리펩티드들의 다채로운 집단을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 코딩 서열 단편들의 라이브러리는, 관심 대상의 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 니킹(nicking)이 분자 당 오직 한번만 일어나는 조건들 하에서 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 상기 DNA를, 상이한 닉킹된 산물들로부터의 센스/안티센스 쌍들을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하도록 재생시키고, 재생성된 듀플렉스들로부터 단일 가닥 부분들을 S1 뉴클레아제로 처리함으로써 제거하고, 그리고 도출되는 단편 라이브러리를 발현 벡터에 라이게이션 시킴으로써 생성될 수 있다. 이 방법으로, 발현 라이브러리가, 관심 대상의 아미노 말단 및 단백질의 다양한 크기들의 내부(internal) 단편들을 인코딩할 수 있는 것으로 유도될 수 있다.

포인트 돌연변이들 또는 절삭 돌연변이에 의하여 만들어진 분자 다양성 라이브러리들의 유전자 산물들을 스크리닝 하기 위한, 그리고 선택된 특성을 갖는 유전자 산물들을 위한 cDNA 라이브러리들을 스크리닝 하기 위한 몇몇 기술들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 큰 유전자 라이브러리들을 스크리닝 하기 위한, 고 처리량 분석에 익숙한, 가장 널리 사용되는 기술들은, 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터들로 클로닝하고, 적합한 세포들을 도출되는 벡터들의 라이브러리로 형질전환시키고, 그리고 분자 다양성 유전자들을, 의도된 활성의 검출이 그의 생성물이 검출되었던 유전자를 인코딩하는 벡터의 분리를 촉진시키는 조건들 하에서, 발현시키는 것을 전형적으로 포함한다. 귀납(Recursive) 앙상블 돌연변이유발 (REM), 라이브러리들에서 기능적 돌연변이체들의 빈도를 강화시키는 기술, 이 본원 발명의 단백질의 변이체들을 동정하기 위하여 스크리닝 분석법들과 조합하여 사용될 수 있다. (Arkin 및 Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89:7811-7815; Delgrave 등, 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).

본원 발명의 다른 측면은 본원 발명의 단백질에 지향된 항체들에 관련된다. 바람직한 실시예들에서, 상기 항체들은 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 본원 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 "항체" 및 "항체들"이라는 용어는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분(즉, 그러한 부분은 항원, 이를테면 마커 단백질, 예컨대, 마커 단백질의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유한다.)을 포함하는 면역글로불린 분자들은 물론 그의 단편들 및 유도체들을 지시한다. 본원 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 그 단백질에 결합하나, 샘플, 예컨대, 자연적으로 그 단백질을 함유하는 생물학적 샘플, 내의 여타의 분자들과 실질적으로 결합하지 않는 항체이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예시들은 이에 제한되지는 않으나, 단일-사슬 항체들 (scAb), F(ab) 그리고 F(ab')₂ 단편들을 포함한다.

본원 발명의 분리된 단백질 또는 이의 단편은 항체들의 생성을 위하여 면역원으로서 사용될 수 있다. 전-장 단백질이 사용될 수 있으며 또는, 대안적으로, 본원 발명은 면역원들로서 사용하기 위한 항원성 펩티드 단편들을 제공한다. 본원 발명의 단백질의 항원성 펩티드는 본원 발명의 단백질 중 하나의 아미노산 서열의 적어도 8 (바람직하게는 10, 15, 20, 또는 30 또는 그 이상의) 아미노산 잔기들을 포함하며, 그리고 상기 펩티드에 대항하여 일어난 항체가 상기 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 상기 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포괄한다. 상기 항원성 펩티드에 의하여 포괄되는 바람직한 에피토프들은 단백질의 표면, 예컨대, 친수성 영역들에 위치하는 영역들이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석, 또는 유사한 분석들이 친수성 영역들을 동정하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 분리된 마커 단백질 또는 이의 단편이 면역원으로서 사용된다.

면역원은 전형적으로, 적합한 (즉 면역적격) 대상 이를테면 토끼, 염소, 마우스, 또는 여타의 포유동물 또는 척추동물을 면역시킴으로써 항체들을 제조하기 위하여 사용된다. 적합한 면역원 제조물은 예를 들면, 재조합적으로-발현된 또는 화학적으로-합성된 단백질 또는 펩티드를 함유할 수 있다. 상기 제조물은 보조제, 이를테면 프로인트(Freund)의 완전 또는 불완전 보조제, 또는 유사한 면역자극 에이전트를 더욱 포함할 수 있다. 바람직한 면역원 조성물들은 여타의 인간 단백질들을 함유하지 않는 것들이다. 이를테면, 예를 들면, 본원 발명의 단백질의 재조합 발현을 위하여 비-인간 숙주 세포를 이용하여 제조된 면역원 조성물들이다. 그러한 방식으로, 도출되는 항체 조성물들은 본원 발명의 단백질 이외의 인간 단백질들이 결합되지 않거나 또는 감소된다.

본원 발명은 폴리클로날 그리고 모노클로날 항체들을 제공한다. 본원에서 사용되는, "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"의 용어는 특유의 에피토프와 면역반응 할 수 있는 오직 하나의 종의 항원 결합 부위를 함유하는 항체 분자들의 집단을 지시한다. 바람직한 폴리클로날 그리고 모노클로날 항체조성물들은 본원 발명의 단백질에 대하여 지향된 항체들에 대하여 선택된 것들이다. 특히 바람직한 폴리클로날 그리고 모노클로날 항체 제조물은 하나의 마커 단백질 또는 이의 단편에 대하여 지향된 오직 하나의 항체들을 함유하는 것들이다.

폴리클로날 항체들은 적합한 대상을 본원 발명의 단백질을 면역원으로 하여 면역시킴으로써 제조될 수 있다. 면역된 대상에서 항체 역가(titer)는 표준 기술들에 의하여, 이를테면 고정된 폴리펩티드를 이용하는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 으로 모니터링 될 수 있다. 면역 후 적절한 시간에, 예컨대, 특이적 항체 역가들이 가장 높을 때, 항체-생산 세포들이 대상으로부터 수득될 수 있으며 그리고 표준 기술들, 이를테면 Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497에 최초로 설명된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (see Kozbor 등, 1983, Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기술 (see Cole 등, pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) 또는 트리오마(trioma) 기술들에 의하여 모노클로날 항체들(mAb)을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 하이브리도마들의 제조 기술은 잘 알려져 있다 (일반적으로 Current Protocols in Immunology, Coligan 등 ed., John Wiley & Sons, New York, 1994 참조). 본원 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포들은 관심 대상의 폴리펩티드와 결합하는 항체들에 대하여 하이브리도마 배양 상청액들을 스크리닝함으로써, 예컨대, 표준 ELISA 분석법을 이용하여, 검출된다.

모노클로날 항체-분비 하이브리도마들에 제조에 대안적으로, 본원 발명의 단백질에 대하여 지향된 모노클로날 항체는 재조합 분자 다양성 면역글로불린 라이브러리 (예컨대, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 관심 대상의 폴리펩티드로 스크리닝함으로써 동정되고 분리될 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리들 생성하고 스크리닝하기 위한 키트들은 상업적으로 이용 가능하다. (예컨대, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 제 27-9400-01; 그리고 the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, 카탈로그 번호 제 240612). 추가적으로, 특히 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 적합한 방법들 및 시약들들의 예시는 예를 들면, 미국 특허 제 No. 5,223,409호 ; PCT 공개 공보 제 WO 92/18619호; PCT 공개 공보 제 WO 91/17271호; PCT 공개 공보 제 WO 92/20791호; PCT 공개 공보 제 WO 92/15679호; PCT 공개 공보 제 WO 93/01288호; PCT 공개 공보 제 WO 92/01047호; PCT 공개 공보 제 WO 92/09690호; PCT 공개 공보 제 WO 90/02809호; Fuchs 등 (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay 등 (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse 등 (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths 등 (1993) EMBO J.12:725-734에서 찾을 수 있다.

본원 발명은 또한 본원 발명의 단백질과 특이적으로 결합하는 재조합 항체들을 제공한다. 바람직한 실시예들에서, 상기 재조합 항체들은 마커 단백질 또는 이의 단편과 특이적으로 결합한다. 재조합 항체들은 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 그리고 비-인간 부분들 양쪽 모두, 단일-사슬 항체들 그리고 멀티-특이적 항체들을 포함하여, 키메릭 그리고 인간화된 모노클로날 항체들을 포함한다. 키메릭 항체는, 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래되는, 분자, 이를테면 쥐과 동물 mAb으로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 보존(constant) 영역을 갖는 것들, 이다. (예컨대, Cabilly 등, 미국 특허 제 4,816,567호; 및 Boss 등, 미국 특허 제 4,816,397호를 참조하며, 이들 전체는 본원 명세서에 참조 문헌으로써 편입됨) 단일-사슬 항체들은 항원 결합 부위를 가지며 그리고 단일 폴리펩티드로 구성된다. 이들은 해당 분야에 공지된 기술들, 예를 들면 Ladner et . al 미국 특허 제 4,946,778호 (이들은 본원 명세서에 참조 문헌으로써 전체적으로 편입됨); Bird 등, (1988) Science 242:423-426; Whitlow 등, (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow 등, (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; 그리고 Huston 등, (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88에 개시된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 멀티-특이적 항체들은 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 적어도 두 항원-결합 부위들을 갖는 항체 분자들이다. 그러한 분자들은 해당 분야에 공지된 기술들로, 예를 들면 Segal, 미국 특허 제 4,676,980호 (이의 개시는 전체적으로 본원 명세서에 참조 문헌으로써 편입됨); Holliger 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow 등, (1994) 단백질 Eng. 7:1017-1026 그리고 미국 특허 제 6,121,424호에 기재된 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.

인간화된 항체들은 비-인간 종으로부터의 하나 또는 그 이상의 상보성 결정 영역들 (CDRs) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 분자들이다. (예컨대, Queen, 미국 특허 제 5,585,089호 참조, 이는 본원 명세서에 참조 문헌으로써 전체적으로 편입됨.) 인간화된 모노클로날 항체들은 해당 분야에 공지된 재조합 DNA 기술들로, 예를 들면 PCT 공개 공보 제 WO 87/02671호; 유럽 특허 출원 제 184,187호; 유럽 특허 출원 제 171,496호; 유럽 특허 출원 제 173,494호; PCT 공개 공보 제 WO 86/01533호; 미국 특허 제 4,816,567호; 유럽 특허 출원 제125,023호; Better 등 (1988) Science 240:1041-1043; Liu 등 (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:3439-3443; Liu 등 (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun 등 (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:214-218; Nishimura 등 (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood 등 (1985) Nature 314:446-449; 그리고 Shaw 등 (1988) J. Natl . Cancer Inst . 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi 등 (1986) Bio / Techniques 4:214; 미국 특허 제 5,225,539호; Jones 등 (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan 등 (1988) Science 239:1534; 그리고 Beidler 등 (1988) J. 면역l. 141:4053-4060에 개시된 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.

좀더 구체적으로, 인간화된 항체들은 예를 들면, 내인성의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자들은 발현할 수 없으나 인간 중쇄 및 경쇄 유전자들을 발현할 수 있는 형질전환 마우스들을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 형질전환 마우스들은 선택된 항원, 예컨대, 본원 발명의 마커에 대응되는 폴리펩티드의 전부 또는 일부, 로 보통의 방식으로 면역된다. 상기 항원에 지향된 모노클로날 항체들은 전통적인 하이브리도마 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 형질전환 마우스들에 의하여 정박된(harbored) 인간 면역글로불린 형질전환 유전자들은 B 세포 분화 동안에 재정렬하며, 그리고 뒤이어 클래스 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 경험한다. 따라서, 그러한 기술을 이용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체들을 제조하는 것이 가능하다. 인간 항체들을 제조하기 위한 이 기술들에 대한 개관은, Lonberg 및 Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93 을 참조한다. 인간 항체들 및 인간 모노클로날 항체들을 제조하는 기술 그리고 그러한 항체들을 제조하기 위한 프로토콜들에 대한 상세한 설명은 예컨대, 미국 특허 제 5,625,126호; 미국 특허 제 5,633,425호; 미국 특허 제 5,569,825호; 미국 특허 제 5,661,016호; 그리고 미국 특허 제 5,545,806호를 참조한다. 또한, 이를테면 Abgenix, Inc. (Freemont, CA)와 같은 회사들은 전술한 것과 유사한 기술을 이용하는 선택된 항원에 대하여 지향된 인간 항체들을 제공하는데 참가하고 있을 수 있다.

선택된 에피토프를 인식하는 완전히 인간 기원인 항체(completely human antibody)들이 "안내된 선택(guided seletion)" 이라고 지칭되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예컨대, 쥐과 동물 항체, 가 동일한 에피토프를 인식하는 완전히 인간 기원인 항체의 선택을 안내하는데 사용된다. (Jespers 등, 1994, Bio / technology 12:899-903).

본원 발명의 항체들은 생산 (예컨대, 대상의 혈액 또는 혈청으로부터) 또는 합성 후 분리되며 그리고 잘-알려진 기술들에 의하여 더욱 정제될 수 있다. 예를 들면, IgG 항체들은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 본원 발명의 단백질에 특이적인 항체들은 예컨대, 친화성 크로마토그래피로 선택 또는 (예컨대, 부분적으로 정제된) 또는 정제될 수 있다. 예를 들면, 재조합으로 발현된 그리고 정제된 (또는 부분적으로 정제된) 본원 발명의 단백질은 본원에서 설명한 바와 같이 제조되며, 그리고 고체 지지체 이를테면, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된다. 상기 칼럼은 이후 다수의 상이한 에피토프들에 대하여 지향된 항체들을 함유하는 샘플로부터 본원 발명의 단백질들에 특이성인 항체들을 친화성 정제하기 위하여 사용될 수 있으며, 이로써 실질적으로 정제된 항체 조성물, 즉, 실질적으로 오염 항체들이 없는 것이 조성물이 생성된다. 실질적으로 정제된 항체 조성물은 본 문맥에서 최대한 단지 30% (건조 중량으로)의 본원 발명의 소망하는 단백질 이외의 에피토프들에 지향된 오염 항체들을 함유하는, 그리고 바람직하게는 최대한 20%, 더욱더 바람직하게는 최대한 10%, 그리고 가장 바람직하게는 최대한 5% (건조 중량으로)의 샘플들이 오염 항체들인, 항체 샘플을 의미한다. 정제된 항체 조성물은 조성물 내의 적어도 99%의 항체들이 본원 발명의 소망하는 단백질에 대하여 지향된 것을 의미한다.

바람직한 실시예에서, 본원 발명의 실질적으로 정제된 항체들은 본원 발명의 단백질의 시그날 펩티드, 분비 서열, 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 또는 세포질 도메인 또는 세포질 막에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 실시예에서, 본원 발명의 실질적으로 정제된 항체들은 본원 발명의 단백질의 아미노산 서열들의 세포외 도메인 또는 분비된 서열에 특이적으로 결합한다. 더욱 바람직한 실시예에서, 본원 발명의 실질적으로 정제된 항체들은 마커 단백질의 아미노산 서열들의 세포외 도메인 또는 분비된 서열에 특이적으로 결합한다.

본원 발명의 단백질에 지향된 항체는 표준 기술들, 이를테면 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전법으로 단백질을 분리하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 그러한 항체는 마커의 발현 수준 및 패턴을 평가하기 위하여 마커 단백질 또는 이의 단편 (예컨대, 세포 용해물 또는 세포 상청액에서)을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 항체들은 또한 임상 테스트 절차의 일부로서, 예컨대, 예를 들면, 주어진 치료 요법의 유효성을 측정하기 위하여, 조직들 또는 체액들 (예컨대 질병 상태 또는 독성 상태 연관된 체액에서) 단백질 수준들을 모니터하는데 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 탐지할 수 있는 물질에 커플링된 본원 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체의 사용으로 촉진될 수 있다. 탐지할 수 있는 물질들의 예시들은 다양한 효소들, 보결원자단들(prosthetic groups), 형광 물질들, 발광성 물질들, 생물발광성 물질들, 그리고 방사성 물질들을 포함한다. 적합한 효소들의 예시들은 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적합한 보결원자단 복합체들의 예시들은 스트렙타비딘/비오틴 그리고 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질들의 예시들은 움벨리페론, 플루오레세린, 플루오레세린이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세린, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광성 물질의 예시는 루미놀을 포함하며; 생물발광성 물질들의 예시들은 루시페라아제, 루시페린, 그리고 애큐오린을 포함하며; 그리고 적합한 방사성 물질의 예시들은 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H을 포함한다.

본원 발명의 항체들은 또한 암들을 치료하는 치료 요법제들로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본원 발명의 완전히 인간 기원인 항체들은 특히 암을 갖는, 인간 암 환자들의 치료제로의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체들은 치료제로의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 그러한 치료제 항체는, 치료제 모이어티 이를테면 사이토톡신, 치료 요법제 또는 방사성 금속 이온에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는, 항체 유도체 또는 면역톡신일 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성 에이전트는 세포들에 불리한 여하한 에이전트를 포함한다. 예시들에는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드들, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 그리고 퓨로마이신 그리고 이들의 유사체들 또는 동족체들이 포함된다. 치료 요법제들은, 이에 제한되지 않으나, 항대사체들 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화제들 (예컨대, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 그리고 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스포아미드(cyclothosphamide), 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C, 그리고 시스-디클로로디아민 플래티넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린들 (예컨대, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 그리고 독소루비신), 항생물질들 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에는 액티노마이신), 블레오, 미트라마이신, 그리고 안트라마이신 (AMC)), 그리고 항-세포분열(mitotic) 에이전트들 (예컨대, 빈크리스틴 그리고 빈블라스틴)을 포함한다.

약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료 요법제에 제한적으로 구성되지 않으므로, 본원 발명의 컨쥬게이션된 항체들은 주어진 생물학적 반응을 변경하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질들은 예를 들면, 톡신 이를테면 리보좀-억제 단백질(Better 등, 미국 특허 제 6,146,631호 참조, 이 문헌의 개시는 본원 명세서에 전체적으로 편입된다.), 아브린, 리신 A, 수도모나스 엑소톡신, 또는 디프테리아 톡신; 단백질 이를테면 종양 괴사 인자, .알파-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제; 또는, 생물학적 반응 개질제들(modifiers) 이를테면, 예를 들면, 림포킨들, 인터류킨-1 ("IL-1“), 인터류킨-2 ("IL-2”), 인터류킨-6 ("IL-6“), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 여타의 성장 인자들을 포함할 수 있다.

그러한 치료 모이어티를 항체들에 컨쥬게이팅 하는 기술들은 잘 알려져 있으며, 예컨대, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 24356 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 62353 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 30316 (Academic Press 1985), 그리고 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of AntibodyToxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:11958 (1982)를 참조한다.

따라서, 일 측면에서, 본원 발명은 모두가 본원 발명의 단백질 그리고 바람직하게는, 마커 단백질, 에 특이적으로 결합하는, 실질적으로 정제된 항체들, 항체 단편들 그리고 유도체들을 제공한다. 다양한 실시예들에서, 본원 발명의 실질적으로 정제된 항체들, 또는 그의 단편들 또는 유도체들은 인간, 비-인간, 키메릭 및/또는 인간화된 항체들일 수 있다. 다른 측면에서, 본원 발명은 비-인간 항체들, 항체 단편들 그리고 유도체들을 제공하는데, 이들 모두는 본원 발명의 단백질 그리고 바람직하게는, 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 그러한 비-인간 항체들은 염소, 마우스, 양, 말, 닭, 토끼, 또는 쥐 항체들일 수 있다. 대안적으로, 본원 발명의 비-인간 항체들은 키메릭 및/또는 인간화된 항체들일 수 있다. 또한, 본원 발명의 비-인간 항체들은 폴리클로날 항체들 또는 모노클로날 항체들일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본원 발명은 모두가 본원 발명의 단백질 그리고 바람직하게는, 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체들, 항체 단편들 그리고 유도체들을 제공한다. 상기 모노클로날 항체들은 인간, 인간화된, 키메릭 및/또는 비-인간 항체들일 수 있다.

본원 발명은 또한 탐지 가능한 물질에 컨쥬케이션 된 본원 발명의 항체, 및 사용 설명서들을 함유하는 키트를 제공한다. 본원 발명의 또 다른 측면은 본원 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일 실시예에서, 상기 약제학적 조성물은 본원 발명의 항체 및 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함한다.

E. 예측 의학( Predicive Medicine )

본원 발명은. 진단 분석들, 예후 분석들, 약물유전체학, 그리고 임상 시험들의 모니터링이 예후 (예측적) 목적들을 위하여 사용되어 개체를 예방적으로 처치하는데 사용되는 예측 의학 분야에 관련된다. 따라서, 본원 발명의 하나의 측면은 개체에서 특정 질병 또는 약물-유도 독성이 발생할 위험이 있는지 여부를 측정하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 마커 단백질들 또는 핵산들의 발현 수준을 측정하는, 진단 분석들에 관련된다. 그러한 분석들은 예후 또는 예측적 목적들을 위하여 그로써 장애의 발생 전에 개체를 예방적으로 처치하기 위하여 사용될 수 있다.

본원 발명의 또 다른 측면은, 임상 시험들에서 본원 발명의 마커의 발현 또는 활성에 대한 에이전트들의 영향 (예컨대, 장애 또는 약물-유도 독성을 억제하기 위하여 또는 치료 또는 예방하기 위하여 투여된 약물들 또는 여타의 화합물들 {즉 그러한 치료가 가질 수 있는 여하한 약물-유도 독성 효과들을 이해하기 위하여})을 모니터링 하는 것에 관련된다. 이들 그리고 여타의 에이전트들은 이하의 섹션들에서 더욱 상세하게 설명된다.

F. 진단 분석들

생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 결여를 검출하는 예시적 방법은 테스트 대상으로부터 생물학적 샘플 (예컨대 독성-연관 체액 또는 조직 샘플)을 수득하고, 그리고 생물학적 샘플을 폴리펩티드 또는 핵산 (예컨대, mRNA, 게놈 DNA, 또는 cDNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 에이전트와 접촉시키는 것에 관련된다. 본원 발명의 검출 방법들은 따라서 예를 들면, 시험관 내는 물론 생체 내의 생물학적 샘플에서, mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈 DNA의 검출에 사용될 수 있다. 예를 들면, mRNA의 검출을 위한 시험관 내 기술들은 노던(Northern) 혼성화들 및 원위치( in situ ) 혼성화들을 포함한다. 마커 단백질의 검출을 위한 시험관 내 기술들은 효소 결합 면역흡착 분석들 (ELISAs), 웨스턴 블럿들, 면역침전법 및 면역형광 분석법을 포함한다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관 내 기술은 서던 혼성화들를 포함한다. mRNA의 검출을 위한 생체 내 기술들은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 노던 혼성화들 그리고 원위치( in situ ) 혼성화들을 포함한다. 더욱이, 마커 단백질의 검출을 위한 생체 내 기술들은 단백질 또는 이의 단편에 지향된 표지된 항체를 대상에 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 대상에서의 그것의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술들로 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.

그러한 진단 그리고 예후 분석들의 일반적 원리는 마커, 그리고 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 마커와 프로브가 상호작용하고 결합하도록 적합한 조건들 하에서 그리고 충분한 시간 동안 제조하고, 이로써 반응 혼합물에서 분리 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 것에 관련된다. 이들 분석들은 다양한 방식들로 수행될 수 있다.

예를 들면, 그러한 분석을 수행하기 위한 하나의 방법은 마커 또는 프로브를 고체 상 지지체, 또한 기판(substrate)으로서 지시됨, 위에 앵커링(anchoring) 하고, 그리고 반응 말기에 고체 상 위에 앵커링 된 표적 마커/프로브 복합체들을 검출하는 것에 개입될 것이다. 그러한 방법의 일 실시예에서, 마커의 존재 및/또는 농도가 분석되도록 하기 위한 대상으로부터의 샘플은 담체 또는 고체 상 지지체 위에 앵커링 될 수 있다. 다른 실시예에서, 반대의 상황이 가능한데, 여기서 프로브가 고체 상에 앵커링 되며 그리고 대상으로부터의 샘플이 분석의 앵커링되지 않은 구성요소로서 반응하도록 된다.

분석 구성요소들을 고체 상에 앵커링하기 위한 많은 수립된 방법들이 존재하다. 이들은, 이하로 제한되는 것은 아니나, 비오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 통하여 고정되는 마커 또는 프로브 분자들을 포함한다. 그러한 비오틴화 분석 구성요소들은 해당 분야에 공지된 기술들(예컨대, 비오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 이용하여 비오틴-NHS (N-하이드록시-숙신이미드)로부터 제조되며, 그리고 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 플레이트들의 웰에 고정될 수 있다. (Pierce Chemical). 일부 실시예들에서, 고정된 분석 구성요소들을 갖는 표면들은 먼저 제조되어 저장될 수 있다.

그러한 분석법들을 위한 여타의 적합한 담체들 또는 고체 상 지지체들은 마커 또는 프로브가 속하는 분자의 종류에 결합할 수 있는 여하한 물질을 포함한다. 잘-알려진 지지체들 또는 담체들은 이에 제한되는 것은 아니나, 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라아제, 자연의 그리고 변형된 셀룰로오스들, 폴리아크릴아마이드들, 반려암들, 그리고 마그네타이트를 포함한다.

전술한 접근법들로 분석들을 수행하기 위하여, 비-고정된 구성요소가 고체 상에 부가되고 거기에 제2 구성요소가 앵커링된다. 반응 완료 후, 복합체를 형성하지 않은 구성요소들은, 형성된 여하한 복합체들이 고체 상 위에 고정되어 남아있을 조건들 하에서, 제거된다(예컨대, 세척으로). 고체 상에 앵커링된 마커/프로브 복합체들의 검출은 본원에서 개략되는 다수의 방법들로 수행될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 프로브는, 이것이 앵커링되지 않은 분석 구성요소인 경우, 검출 및 분석을 읽어내기 위한(readout) 목적을 위하여, 직접적으로 또는 간접적으로, 본원에서 설명되고 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘-알려진 탐지할 수 있는 표지들로 표지될 수 있다.

추가의 조작 또는 어느 하나의 구성요소 (마커 또는 프로브)의 표지화 없이, 예를 들면 형광 에너지 수송 기술을 사용하여 (예를 들면, Lakowicz 등, 미국 특허 제 5,631,169호; Stavrianopoulos, 등, 미국 특허 제 4,868,103 참조) 마커/프로브 복합체 형성을 직접적으로 검출하는 것 또한 가능하다. 제1, ‘공여체(donor)’ 분자 상의 형광원 표지가, 적합한 파장의 입사광으로 흥분됨에 따라, 이것의 방출 형광 에너지가 제2 ‘수용체(acceptor)’ 분자 상의 형광 표지에 의하여 흡수될 것이며, 이는 순차로 상기 흡수된 에너지로 인하여 형광을 나타낼 수 있도록, 선택된다. 대안적으로, ‘공여체’ 단백질 분자는 단순히 트립토판 잔기들의 천연의 형광 에너지를 사용할 수 있다. 표지들은, 상이한 파장의 광을 방출해서, ‘수용체’ 분자 표지가 ‘공여체’의 그것으로부터 구별될 수 있는 것으로 선택된다. 표지들 사이의 에너지 전달 효율은 분자들을 분리하는 거리에 연관되므로, 분자들 사이의 공간적 상관관계들이 평가될 수 있다. 분자들 사이에 결합이 일어나는 상황에서, 분석에서‘수용체’ 분자 표지의 형광 방출은 최대여야 한다. FET 결합 사건은 해당 분야에 잘 알려진 표준 형광 강도 검출 수단을 통하여 (예컨대, 형광 강도 측정기를 이용하여) 편리하게 측정될 수 있다.

다른 실시예에서, 마커를 인식하는 프로브의 능력 측정은 어느 쪽의 분석 구성요소(프로브 또는 마커)도 표지화 하지 않고 이를테면 실-시간 생물분자 상호작용 분석 (BIA) 기술을 사용하여 수행될 수 있다. (예컨대, Sjolander, S. 및 Urbaniczky, C., 1991, Anal . Chem . 63:2338-2345 그리고 Szabo 등, 1995, Curr . Opin. Struct . Biol . 5:699-705 참조). 본원 명세서에서 사용되는, "BIA" 또는 "표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)"은 여하한 상호 작용체들(예컨대, BIA코어)을 표지화 하지 않고 실시간으로 생물특이적 상호작용들을 연구하는 기술이다. 결합 표면에서의 매스 내의 변화들 (결합 사건을 나타냄)은 표면 근처의 빛의 굴절률의 변경들을 도출하고 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학적 현상), 탐지할 수 있는, 생물학적 분자들 사이의 실-시간 반응들의 지표로서 사용될 수 있는, 시그날을 도출한다.

대안적으로, 다른 실시예에서, 유사성 진단 그리고 예후 분석들은 액체 상에서의 용질들로서 마커와 프로브로 실시될 수 있다. 그러한 분석에서, 복합체를 형성한 마커와 프로브는 복합체를 형성하지 않은 구성요소들로부터 다음을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 여하한 다수의 표준 기술들에 의하여 분리된다: 분별 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 그리고 면역침전. 분별 원심분리에서, 마커/프로브 복합체들은, 복합체들의 그들의 상이한 크기 및 밀도들에 기초한 상이한 침강 평형에 근거하여, 일련의 원심분리 단계들을 통하여 복합체를 형성하지 않은 구성요소들로부터 분리될 수 있다. (예를 들면, Rivas, G., 및 Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7 참조). 표준 크로마토그래프 기술들 또한 복합체 형성 분자들을 복합체를 형성하지 않은 분자들로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 겔 여과크로마토그래피는 분자들을 크기에 기초하여, 그리고 칼럼 포맷 내에 적합한 겔 여과 수지의 사용을 통하여 분리하는데, 예를 들면, 상대적으로 더 큰 복합체는 상대적으로 더 작은 비-복합체 형성 구성요소들로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 비-복합체 형성 구성요소들에 비하여 마커/프로브 복합체의 상대적으로 상이한 전하 특성들이, 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피 수지들을 사용하여, 복합체들을 비-복합체 형성 구성요소들로부터 복합체들을 구별하는데 사용될 수 있다. 그러한 수지들 및 크로마토그래프 기술들은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. (예컨대, Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit.Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., 그리고 Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525 참조). 젤 전기영동 또한 개별적 복합체 형성 분석 구성요소들을 결합되지 않은 구성요소들로부터 분리하는데 적용될 수 있다. (예컨대, Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999 참조). 이 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체들은 예를 들면 크기 및 전하에 기초하여 분리된다. 전기영동 과정 동안에 상호작용의 결합을 유지하기 위하여, 비-변성화 겔 매트릭스 물질들 및 환원제 결여 조건들이 전형적으로 바람직하다. 특정의 분석 그리고 그의 구성요소들에 적합한 조건들은 해당 분야에 잘 알려져 있을 것이다.

특정의 실시예에서, 마커의 mRNA 수준은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 생물학적 샘플에서 원위치( in situ ) 및 시험관 내 포맷들 모두에 의하여 측정될 수 있다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 대상으로부터 분리된 조직들, 세포들, 생물학적 액체들 그리고 이들의 분리물들은 물론, 대상 내에 존재하는 조직들, 세포들 그리고 액체들을 포함하는 것으로 의도된다. 많은 발현 검출 방법들은 분리된 RNA를 사용한다. 시험관 내 방법들에 있어서, mRNA의 분리에 대하여 선택하지 않는 여하한 RNA 분리 기술은 세포들로부터 RNA의 정제를 위하여 사용될 수 있다. (예컨대, Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999 참조). 추가적으로, 다수의 조직 샘플들은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들 이를테면, 예를 들면, Chomczynski의 단일-단계 RNA 분리 프로세스 (1989, 미국 특허 제 4,843,155호)을 이용하여 쉽게 가공될 수 있다.

분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라아제 연쇄 반응 분석 그리고 프로브 어레이들을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 혼성화 또는 증폭 분석들에 사용될 수 있다. mRNA 수준들의 검출을 위한 하나의 바람직한 진단 방법은 분리된 mRNA를, 검출되는 유전자에 의하여 인코딩되는 mRNA에 혼성화 할 수 있는, 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것에 관련된다. 상기 핵산 프로브는, 예를 들면, 전-장 cDNA, 또는 이의 일부분, 이를테면 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드들 길이 이며 본원 발명의 마커를 인코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 엄격한 조건들 하에서 특이적으로 혼성화하는데 충분한 올리고뉴클레오타이드이다. 본원 발명의 진단 분석들에 사용하기 위한 여타의 적합한 프로브들은 본원 명세서에 기재되어 있다. mRNA의 프로브와의 혼성화는 문제가 된 마커가 발현되고 있다는 것을 지시한다.

하나의 포맷에서, 예를 들면 분리된 mRNA를 아가로오스 겔 상에 주행시키고(running) 그리고 mRNA를 겔로부터 멤브레인, 이를테면 니트로셀룰로오스로 이동시킴으로써, mRNA는 고체 표면에 고정되고 프로브와 접촉된다. 대안적 포맷에서, 예를 들면, Affymetrix 유전자 칩 어레이에서, 프로브(들)이 고체 표면에 고정되고 그리고 mRNA가 프로브(들)와 접촉된다. 통상의 기술자는 본원 발명의 마커들에 의하여 인코딩되는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위하여 공지된 mRNA 검출 방법들을 쉽게 적용할 수 있다.

샘플에서 mRNA 마커의 수준을 측정하는 대안적 방법은, 핵산 증폭 프로세스, 예컨대, RT-PCR (Mullis, 1987, 미국 특허 제 4,683,202호에 설명된 실험 실시예), 리가아제 연쇄 반응 (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88:189-193), 자기부양염기서열복제 (Guatelli 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177), Q-베타 리플리카아제 (Lizardi 등, 1988, Bio/기술6:1197), 롤링 써클 복제 (Lizardi 등, 미국 특허 제 5,854,033호) 또는 여하한 여타의 핵산 증폭 방법에 의함, 이후 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들을 이용하는 증폭된 분자들의 검출이 수반됨, 에 관련된다. 이들 검출 계획들은, 만약 그러한 분자들이 매우 적은 숫자로 존재하는 경우, 핵산 분자들의 검출에 특히 유용하다. 본원에서 사용되는, 증폭 프라이머들은, 유전자의 5’ 또는 3’ 영역들에 어닐링 할 수 있으며 (각각, 플러스 및 마이너스 가닥들, 또는 역으로) 그리고 사이에 짧은 영역을 함유하는 한 쌍의 핵산 분자들로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머들은 약 10 내지 30 뉴클레오타이드들 길이이며 한 영역을 약 50 내지 200 뉴클레오타이드들 길이로 플랭킹한다. 적합한 조건들 하에서 그리고 적합한 시약들로, 그러한 프라이머들은 프라이머들로 플랭킹 된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.

원위치( in situ ) 방법들에 있어서, mRNA는 검출 전에 분리될 필요가 없다. 그러한 방법들에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지된 조직학적 방법들로 제조/가공된다. 이 샘플은 이후 지지체, 전형적으로 유리 슬라이드에 고정되고, 다음에 마커를 인코딩하는 mRNA에 혼성화 할 수 있는 프로브와 접촉된다.

마커의 절대적 발현 수준에 기초한 측정들에 대안으로서, 측정들은 마커의 정상화된 발현 수준에 기초할 수 있다. 발현 수준들은 마커의 절대적 발현 수준을, 그것의 발현을 마커가 아닌 유전자, 예컨대, 구성요소로서 발현되는 하우스키핑(housekeeping) 유전자, 의 발현에 비교함으로써, 교정함으로써 정상화된다. 정상화에 적합한 유전자들은 하우스키핑 유전자들 이를테면 액틴 유전자, 또는 상피 세포-특이적 유전자들을 포함한다. 이 정상화는 하나의 샘플, 예컨대, 환자 샘플, 에서의 발현 수준을 별개의 샘플, 예컨대, 비-질병 또는 비-독성 샘플에 대하여, 또는 상이한 원료로부터의 샘플들 사이에서 비교하는 것을 허용한다.

대안적으로, 발현 수준은 상대적 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대적 발현 수준을 특정하기 위하여, 마커의 발현 수준이, 문제가 되는 샘플에 대하여 발현수준을 측정하기 전에, 정상 대(vs) 질병 또는 독성 세포 분리물들의 10 또는 그 이상의 샘플들, 바람직하게는 50 또는 그 이상의 샘플들에 대하여 측정된다. 다수의 샘플들에서 분석되는 유전자들의 각각의 평균 발현 수준이 측정되며 그리고 이것은 마커의 기저선 발현 수준으로서 사용된다. 테스트 샘플에 대하여 측정된 마커의 발현 수준 (절대적 발현 수준)은 이후 그 마커에 대하여 수득된 평균 발현 값으로 나누어진다. 이것은 상대적 발현 수준을 제공한다.

바람직하게는, 기저선 측정에 사용된 샘플들은 비-질병 또는 비-독성 세포들로부터의 것일 것이다. 세포 원료의 선택은 상대적 발현 수준의 용도에 따라 결정된다. 정상 조직들에서 발견되는 발현을 평균 발현 스코어로서 사용하는 것은 분석되는 마커가 질병 또는 독성 특이적 (정상 세포들에 대하여)인지 여부를 검증하는데 도움이 된다. 또한, 보다 많은 데이터가 축적됨에 따라, 축적된 데이터에 기초한 개선된 상대적 발현값들을 제공하도록 평균 발현 값은 수정될 수 있다. 질병 세포들 또는 독성 세포들로부터의 발현 데이터는 질병 또는 독성 상태의 중증도를 등급화하는 수단을 제공한다.

본원 발명의 다른 실시예에서, 마커 단백질이 검출된다. 본원 발명의 마커 단백질을 검출하기 위한 바람직한 에이전트는 그러한 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 항체이며, 바람직하게는 탐지할 수 있는 표지를 갖는 항체이다. 항체들은 폴리클로날 항체일 수 있으며, 또는 더욱 바람직하게는, 모노클로날 항체일 수 있다. 온전한(intact) 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체 (예컨대, Fab 또는 F(ab')₂)가 사용될 수 있다. "표지된"이라는 용어는, 프로브 또는 항체와 관련하여, 탐지할 수 있는 물질을 프로브 또는 항체에 커플링 (즉, 물리적으로 링크) 함에 의한 프로브 또는 항체의 직접적 표지화는 물론, 직접적으로 표지된 별개의 시약과 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표지화를 포괄하는 것으로 의도된다. 간접적 표지화의 예시는 형광 표지된 2차 항체를 이용한 일차 항체의 검출 그리고 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴으로 DNA 프로브의 말단(end)-표지화를 포함한다.

세포로부터의 단백질들은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들을 이용하여 분리될 수 있다. 사용되는 단백질 분리 방법들은, 예를 들면, 이를테면 Harlow 및 Lane에 설명된 것들 (Harlow 및 Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)일 수 있다.

다양한 포맷들이 샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 여부를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 포맷들의 실시예들은, 이에 제한되지 않으나, 효소 면역분석 (EIA), 방사성면역분석 (RIA), 웨스턴 블럿 분석 그리고 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 포함한다. 통상의 기술자는 공지된 단백질/항체 검출 방법들을 세포들이 본원 발명의 마커를 발현하는지 여부를 측정하는데 사용하기 위하여 쉽게 적용할 수 있다.

하나의 포맷에서, 항체들, 또는 항체 단편들 또는 유도체들은, 발현된 단백질들을 검출하기 위한 방법들 이를테면 웨스턴 블럿들 또는 면역형광 기술들에 사용될 수 있다. 그러한 용도들에서, 항체 또는 단백질들 중 하나를 고체 지지체 상에 고정하는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 고체 상 지지체들 또는 담체들은 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 여하한 지지체를 포함한다. 잘-알려진 지지체들 또는 담체들은 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연의 그리고 변형된 셀룰로오스들, 폴리아크릴아마이드들, 반려암들, 그리고 마그네타이트를 포함한다.

당해 분야의 통상의 기술자는 항체 또는 항원에 결합하기 위한 많은 여타의 적합한 담체들을 알고 있을 것이며, 그리고 그러한 지지체를 본원 발명의 용도를 위하여 적용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 질병 또는 독성 세포들로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 상에 주행될 수 있으며 그리고 고정된 고체 상 지지체 이를테면 니트로셀룰로오스에 고정될 수 있다. 지지체는 이후 적합한 버퍼들로 세척될 수 있으며, 이후에 검출 가능한 표지된 항체로 처치된다. 고체 상 지지체는 이후 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 버퍼로 2회 세척될 수 있다. 고체 지지체 상에 결합된 표지의 양은 전통적 수단으로 검출될 수 있다.

본원 발명은 또한 생물학적 샘플 내의 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포괄한다. 그러한 키트들은 만약 대상이 특정 질환들 또는 약물-유도 독성으로 고통 받고 있거나 또는 발병 위험이 증가되었는지를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 생물학적 샘플 내의 마커 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 에이전트 및 샘플 내의 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하기 위한 수단 (예컨대, 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체, 또는 그 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브)을 포함할 수 있다. 키트들은 또한 상기 키트를 이용하여 수득된 결과를 해석하기 위한 사용 설명서(instructions)을 포함할 수 있다.

항체-기초 키트들의 경우, 상기 키트는, 예를 들면: (1) 마커 단백질에 결합하는 제1 항체 (예컨대, 고체 지지체에 부착된); 및, 선택적으로, (2) 상기 단백질 또는 상기 제1 항체 중 어느 하나에 결합하며 탐지할 수 있는 표지에 컨쥬게이션된 제2, 상이한 항체를 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드-기초 키트들의 경우, 상기 키트는, 예를 들면: (1) 마커 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드, 또는 (2) 마커 핵산 분자의 증폭에 유용한 한 쌍의 프라이머들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 예컨대, 완충제, 방부제, 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 탐지할 수 있는 표지를 검출하기 위한 구성요소들(예컨대, 효소 또는 기질)을 더욱 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 분석되고 테스트 샘플에 비교될 수 있는 대조구 샘플 또는 일련의 대조구 샘플들을 함유할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는 개별적 용기 내에 봉입(enclosed)될 수 있으며 다양한 용기들 전부는 키트를 사용하여 수행된 분석 결과들을 해석하기 위한 설명과 함께 단일 포장으로 될 수 있다.

G. 약물유전체학

본원 발명의 마커들은 또한 약물유전체학적 마커들로서 유용하다. 본원에서 사용되는, "약물유전체학적 마커"는 환자에서 그것의 발현 수준이 특이적 임상적 약물 반응 또는 민감성과 상호 관련되는 목적하는 생화학적 마커이다. (, 예컨대, McLeod 등 (1999) Eur. J. Cancer 35(12): 1650-1652 참조). 약물유전체학적 마커 발현의 존재 또는 용량은 예측되는 환자의 반응 그리고 보다 구체적으로 환자의 질병 또는 독성 세포들의 특정 약물 또는 특정 종류의 약물들로의 치료 요법에 대한 반응에 관련된다. 환자에서 하나 또는 그 이상의 약물유전체학적 마커들의 발현의 존재 또는 용량을 평가함으로써, 환자에게 가장 적합한, 또는 좀 더 큰 성공도를 갖는 것으로 예측되는 약물 치료 요법이 선택될 수 있다. 예를 들면, 환자에서 특이적 종양 마커들에 의하여 인코딩되는 RNA 또는 단백질의 존재 또는 용량에 기초하여, 환자에 존재할법한 특이적 종양의 치료에 최적화된 약물 또는 치료의 과정이 선택될 수 있다. 약물유전체학적 마커들의 사용은 그러므로, 상이한 약물들 또는 치료계획들을 시도해보지 않고, 각각의 암 환자에 가장 적합한 치료를 선택하거나 설계하는 것을 허용한다.

약물유전체학의 다른 측면은 신체가 약물들에 작용하는 방법을 변경하는 유전적 상태들을 다룬다. 이들 약물유전학적 상태들은 드문 결핍들로서 또는 다형성들 중 하나로서 일어날 수 있다. 예를 들면, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제 (G6PD) 결핍은 주요한 임상적 합병증이 산화제 약물들 (항-말라리아제, 설폰아마이드들, 진통제들, 니트로푸란들)의 섭취 및 누에콩(fava beans)의 소비 후의 용혈인 흔한 유전되는 효소병(enzymopathy)이다.

설명을 위한 실시예로서, 약물 대사 효소들의 활성은 약물 작용의 강도 및 기간 모두의 주요한 결정 요인이다. 약물 대사 효소들 (예컨대, N-아세틸트랜스퍼라아제 2 (NAT 2) 그리고 사이토크롬 P450 효소들 CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전적 다형성들의 발견은 왜 일부 환자들은 예측되는 약물 효과들을 얻지 못하거나 또는 표준의 안전한 복용량의 약물을 취한 이후에 과장된 약물 반응 및 심각한 독성을 나타내는지에 대한 설명을 제공하였다. 이들 다형성들은 집단에서 두 표현형들, 심한 대사자(extensive metabolizer) (EM) 그리고 빈약한 대사자(poor metabolizer) (PM), 로 표현된다. PM의 유병률은 상이한 집단들에서 상이하다. 예를 들면, CYP2D6을 코딩하는 유전자는 다형성 정도가 높으며 몇몇 돌연변이들이 PM에서 동정되었고, 이들은 모두 기능적 CYP2D6의 결손을 유도한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 빈약한 대사자들은 그들이 표준 복용량들을 수용하는 경우 상당히 자주 과장된 약물 반응 및 부작용들을 경험한다. 코데인의 그의 CYP2D6-형성 대사산물 몰핀에 의하여 매개되는 진통 효과에 대하여 증명된 바와 같이, 만약 대사산물이 활성 치료제 모이어티라면, PM은 치료 반응을 나타내지 않을 것이다. 여타의 극단적인 경우는 표준 복용량들에 반응을 보이지 않는 울트라-신속 대사자로 불리는 경우들이다. 최근에, 울트라-신속 대사의 분자적 근거가 CYP2D6 유전자 증폭에 의한 것으로 동정되었다.

따라서, 개체에서의 본원 발명의 마커의 발현 수준이 측정될 수 있으며 이로써 그 개체를 위한 치료 또는 예방 치료에 적합한 에이전트(들)을 선택할 수 있다. 또한, 약물유전학 연구는 개체의 약물 반응성 표현형을 동정하기 위하여 약물-대사 효소들을 인코딩하는 다형성 대립 유전자들의 약물유전검사(genotyping)를 적용하는데 사용될 수 있다. 이 지식은, 복용량 또는 약물 선택에 적용되는 경우, 본원 발명의 마커의 발현의 조절물질로 대상을 치료하는 경우 부작용 및 치료 실패를 방지할 수 있으며 따라서 치료 또는 예방 효율을 증진시킬 수 있다.

H. 임상 시험들의 모니터링

본원 발명의 마커의 발현 수준에 대한 에이전트들 (예컨대, 약물 화합물들)의 영향을 모니터링하는 것은 기초 약물 스크리닝 뿐 아니라 임상 시험들에도 적용된다. 예를 들면, 마커 발현에 미치는 에이전트의 유효성은 특정 질환들, 이를테면 암, 당뇨병, 비만, 심혈관 질병, 그리고 심장독성, 또는 약물-유도 독성에 대한 치료를 수용하는 대상들의 임상실험들에서 모니터 될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본원 발명은 다음의 단계들을 포함하는 에이전트 (예컨대, 작용제, 길항제, 펩티드모방제, 단백질, 펩티드, 핵산, 저분자, 또는 여타의 약물 후보)로의 대상의 치료의 유효성을 모니터하는 방법을 제공한다: (i) 에이전트의 투여 전에 대상으로부터 투여-전 샘플을 수득하는 단계; (ii) 투여-전 샘플에서 본원 발명의 하나 또는 그 이상의 선택된 마커들의 발현 수준을 검출하는 단계; (iii) 대상으로부터 하나 또는 그 이상의 투여-후 샘플들 수득하는 단계; (iv) 투여-후 샘플들에서 마커 (들)의 발현수준을 검출하는 단계; (v) 투여-전 샘플에서의 마커(들)의 발현수준을 투여-후 샘플 또는 샘플들에서의 마커(들)의 발현수준과 비교하는 단계; 그리고 (vi) 대상에의 에이전트의 투여를 따라서 수정하는 단계. 예를 들면, 치료 과정 동안에 마커 유전자(들)의 증가된 발현은 효과적이지 않은 투여량 및 투여량 증가의 바람직함을 지시할 수 있다. 역으로, 마커 유전자(들)의 감소된 발현은 효과적인 치료 및 투약량 변화 필요 없음을 지시할 수 있다.

H. 어레이들

본원 발명은 또한 본원 발명의 마커를 포함하는 어레이를 포함한다. 상기 어레이는 그 어레이에서 하나 또는 그 이상의 유전자들의 발현을 분석하는데 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 어레이는 그 어레이에서 유전자들의 조직 특이성을 규명하기 위하여 조직에서 유전자 발현을 분석하는데 사용될 수 있다. 이 방식으로, 약 7600개 까지의 유전자들이 발현에 대하여 동시에 분석될 수 있다. 이것은 하나 또는 그 이상의 조직들에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 배터리(battery)를 나타내기 위하여 개발되는 프로파일을 허용한다.

그러한 정성적 측정 이외에, 본원 발명은 유전자 발현의 정량을 허용한다. 따라서, 조직 특이성뿐만 아니라, 조직에서 유전자들의 배터리의 발현 수준 또한 규명할 수 있다. 따라서, 유전자들은 그들의 본질적(per se ) 조직 발현 그리고 그 조직에서의 발현 수준에 기초하여 그룹화 될 수 있다. 이것은, 예를 들면, 유전자 발현 조직들 사이(between 또는 among)에서의 유전자 발현의 상관관계의 규명에 유용하다. 따라서, 하나의 조직이 동요될 수 있으며 그리고 제2 조직에서의 유전자 발현에 대한 효과가 측정될 수 있다. 이 문맥에서, 생물학적 자극에 반응하는 다른 세포 타입에 대한 하나의 세포 타입의 효과가 측정될 수 있다. 그러한 측정은 예를 들면, 유전자 발현의 수준에서 세포-세포 상호작용의 효과를 알아내는데 유용하다. 만약 하나의 에이전트가 하나의 세포 타입을 치료적으로 처치하기 위하여 투여되나 다른 세포 타입에 대하여 원치 않는 효과를 갖는다면, 본원 발명은 원치 않는 효과의 분자적 근거를 측정하는 분석을 제공하며 그리고 따라서 상쇄(counteracting) 에이전트를 공동 투여하는 기회 또는 그렇지 않으면 원치 않는 효과를 처치할 수 있는 기회를 제공한다. 유사하게, 심지어 단일 세포 타입 내에서, 바람직하지 않은 생물학적 효과들이 분자 수준에서 측정될 수 있다. 따라서, 표적 유전자 이외의 발현에 대한 에이젼트의 효과가 규명되고 상쇄될 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 어레이는 그 어레이에서 하나 또는 그 이상의 유전자들의 발현의 시간 과정을 모니터 하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에서 개시된 바와 같은 다양한 생물학적 문맥들, 예를 들면 약물-유도 독성의 발생, 약물-유도 독성의 진행, 그리고 약물-유도 독성과 연관된 세포 형질전환과 같은 프로세스들, 에서 일어날 수 있다.

상기 어레이는 또한 한 유전자 발현의 동일한 세포 또는 상이한 세포들에서 여타의 유전자들의 발현에 대한 효과를 규명하는데 유용하다. 이것은, 예를 들면, 만약 최후의 또는 다운스트림 표적이 제어될 수 없다면, 치료적 중재를 위한 대체 분자 표적들의 선택을 제공한다.

상기 어레이는 또한 정상 그리고 비정상 세포들에서 하나 또는 그 이상의 유전자의 차별적 발현 패턴들을 규명하는데 유용하다. 이것은 진단 또는 치료적 중재를 위한 분자 표적으로서 작용할 수 있는 유전자들의 배터리를 제공한다.

VII . 샘플 수득 방법

본원 발명의 방법들에서 유용한 샘플들은 본원 발명의 마커를 발현하는 여하한 조직, 세포, 생검 시료, 또는 체액 샘플을 포한한다. 일 실시예에서, 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 구강찰과표본(buccal scrape), 타액, 뇌척수액, 소변, 대변, 또는 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage)일 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 상기 조직 샘플은 질병 상태 또는 독성 상태 샘플이다. 보다 바람직한 실시예들에서, 상기 조직 샘플은 암샘플, 당뇨병 샘플, 비만 샘플, 심혈관 샘플 또는 약물-유도 독성 샘플이다.

신체 샘플들은 예를 들면, 한 지역의 생검 또는 찰과(scraping) 또는 면봉 스왑(swabbing)을 이용하여 또는 체액 흡입을 위한 바늘을 사용하는 것을 포함하는 당해 분야에 공지된 다양한 기술들에 의하여 대상으로부터 수득될 수 있다. 다양한 신체 샘플들을 수집하는 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

본원 발명의 마터를 검출하고 정량하기 위하여 적합한 조직 샘플들은 신선한, 동결된, 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법들에 따라 고정된 것일 수 있다. 적합한 조직 샘플들은 바람직하게는 절개되어 추가의 분석들을 위하여 현미경 슬라이드 상에 배치된다. 대안적으로, 고체 샘플들, 즉, 조직 샘플들, 은 가용화 및/또는 균질화 되고 뒤이어 가용성 추출물로서 분석될 수 있다.

일 실시예에서, 신선하게 수득된 생검 샘플은, 예를 들면, 액체 질소 또는 디플루오로디클로로메탄을 이용하여 동결된다. 동결된 샘플은, 예를 들면, OCT, 를 이용한 절단을 위하여 탑제되고 저온유지장치(cryostat)에서 연속적으로 절단된다. 연속적 절편들은 유리 현미경 슬라이드 상에 수집된다. 면역조직화학적 염색을 위하여 슬라이드들은 절편들이 슬라이드들에 붙어있음을 확실하게 하기 위하여, 예를 들면, 크롬-알룸, 젤라틴 또는 폴리-L-라이신으로 코팅될 수 있다. 다른 실시예에서, 샘플들은 절단전에 고정되고 엠베드(embedded)된다. 예를 들면, 조직 샘플들은, 예를 들면, 포르말린에 고정되고, 연속적으로 탈수되고 그리고, 예를 들면, 파라핀에 엠베드 될 수 있다.

일단 샘플이 수득 되면, 본원 발명의 마커의 검출 및 정량에 적합한 당해 분야에 공지된 여하한 방법이 사용될 수 있다. (핵산 또는 단백질 중 어느 한 수준에서). 그러한 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 그리고, 다음에 제한되는 것은 아니나, 웨스턴 블럿들, 노던 블럿들, 서던 블럿들, 면역조직화학, ELISA, 예컨대, 증폭된 ELISA, 면역침전, 면역형광, 유동 세포 분석법, 면역세포화학, 질량 분석(mass spectrometrometric) 분석법들, 예컨대, MALDI-TOF 그리고 SELDI-TOF, 핵산 혼성화 기술들, 핵산 역 전사 방법들, 그리고 핵산 증폭 방법들을 포함한다. 특정 실시예들에서, 본원 발명의 마커의 발현은 단백질 수준에서, 예를 들면, 이들 단백질들에 특이적으로 결합하는 항체들을 이용하여 검출된다.

샘플들은, 본원 발명의 마커를 항체 결합에 이용 가능하도록 만들기 위하여 변형될 필요가 있을 수 있다. 면역세포화학 또는 면역조직화학 방법들의 특유의 측면에서, 슬라이드들은 사전처리 버퍼로 이동되며 그리고 선택적으로 항원 접근성을 증가시키기 위하여 가열될 수 있다. 사전처리 버퍼에서의 샘플의 가열은 세포들의 지질 이중-층을 신속하게 붕괴시키고 항원들을 항체 결합에 대하여 좀 더 접근 가능하게 (신선한 표본들에서는 그럴 수 있으나, 고정된 표본에서는 일어나는 것은 전형적으로 그렇지 않음) 만든다. "사전처리(pretreatment) 버퍼" 및 "제조(preparation) 버퍼"라는 용어는, 특히 본원 발명의 마커의 항체 결합에 대한 접근성을 증가시킴으로써, 면역 염색을 위한 세포학적 또는 조직학적 샘플들의 제조에 사용되는 버퍼를 지시하기 위하여 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 사전처리 버퍼는 pH-특이적 염 용액, 폴리머, 세척제, 또는 비이온성 또는 이온성 계면활성제 이를테면, 예를 들면, 에틸옥실화된 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 알카노에이트 또는 알콕실레이트 또는 심지어 이들 계면활성제들의 블렌드 또는 심지어 담즙 염의 사용을 포함할 수 있다. 사전처리 버퍼는, 예를 들면, 0.1% 내지 1%의 데옥시콜릭 애시드 용액, 소듐 염, 또는 소듐 라우레스-13-카르복실레이트의 용액(예컨대, 산도판 LS) 또는 그리고 에톡실화된 음이온성 복합체일 수 있다. 일부 실시예들에서, 사전처리 버퍼는 또한 슬라이드 저장 버퍼로서 사용될 수 있다.

당해 분야에 공지된 항원 복구 방법들을 포함하여, 본원 발명의 마커 단백질들을 항체 결합에 좀 더 접근 가능하도록 하는 여하한 방법이 본원 발명의 실시에 사용될 수 있다. 예를 들면, Bibbo, 등 (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, 등 (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, 등 (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11을 참조하며, 각각의 내용의 전체는 본원 발명에 참조문헌으로서 편입된다.

마커 단백질 접근성을 증가시키기 위한 사전 처리 후, 샘플들은 적합한 차단제(blocking agent), 예컨대, 퍼옥시다아제 차단 시약 이를테면 하이드로겐 퍼옥사이드를 이용하여 차단될 수 있다. 일부 실시예들에서, 샘플들은 항체의 비-특이적 결합을 예방하기 위하여 단백질 차단 시약을 이용하여 차단될 수 있다. 단백질 차단 시약은, 예를 들면, 정제된 카세인을 포함할 수 있다. 본원 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 는 이후 샘플과 인큐베이션 된다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는, 환자 샘플에서 본원 발명의 마커 단백질 상의 다중 에피토프들의 검출에 의하여 좀 더 정확한 예측 또는 진단이 일부 경우에서 수득될 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 특정의 실시예들에서, 본원 발명의 마커의 상이한 에피토프들에 지향된 적어도 두 항체들이 사용된다. 하나 이상의 항체가 사용되는 경우, 이들 항체들은 개별적 항체 시약들로서 순차적으로 또는 항체 칵테일로서 동시에 단일 샘플에 추가될 수 있다. 대안적으로, 각각의 개별적 항체는 동일한 환자로부터의 분리된 샘플에 추가되고, 도출되는 데이터가 모아질(pooled)수 있다.

항체 결합을 검출하는 기술들은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 본원 발명의 마커에 대한 항체 결합은, 항체 결합 수준 그리고, 따라서, 마커 단백질 발현의 수준에 대응하는 탐지할 수 있는 시그날을 생성하는 화학적 시약들의 사용을 통하여 검출될 수 있다. 본원 발명의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법들 중 하나에서, 항체 결합은, 표지된 폴리머에 컨쥬게이션 된 2차 항체의 사용을 통하여 검출된다. 표지된 폴리머들의 예시는, 다음에 제한되지 않으나, 폴리머-효소 컨쥬게이트체들(conjugates)을 포함한다. 이들 복합체들에서 효소들은 전형적으로 항원-항체 결합 부위에서 색원체(chromogen)의 공탁(deposition), 이로써 관심 대상의 바이오 마커의 발현 수준에 대응하는 세포 염색을 도출함, 을 촉매하는데 사용된다. 특히 관심이 있는 효소들은, 다음에 제한되지 않으나, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 그리고 알카라인 포스파타아제 (AP)를 포함한다.

본원 발명의 하나의 특유의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법에서, 항체 본원 발명의 마커에의 항체의 결합은 2차 항체에 컨쥬게이션된 HRP-표지된 폴리머의 사용을 통하여 검출된다. 항체 결합은 또한, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들에 결합하는 종-특이적 프로브 시약, 그리고 종 특이적 프로브 시약에 결합하는 HRP에 컨쥬게이션된 폴리머의 사용을 통하여 검출될 수 있다. 슬라이드들은 여하한 크로마겐, 예컨대, 크로마겐 3,3-디아미노벤지딘 (DAB)을 이용하여 항체 결합에 대하여 염색되며, 그리고 이후 헤마톡실린 그리고, 선택적으로, 청화(bluing) 에이전트 이를테면 암모늄 하이드록사이드 또는 TBS/트윈-20으로 대비염색(counterstained) 된다. 여타의 적합한 크로마겐들은, 예를 들면, 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC)을 포함한다. 본원 발명의 일부 측면들에서, 슬라이드들은 세포 염색, 예컨대, 형광 염색 (즉, 마커 발현)을 평가하기 위하여 세포검사 기사 및 병리학자에 의하여 현미경적으로 검사된다. 대안적으로, 샘플들은 자동화된 현미경을 통하여 또는 양성 염색 세포들의 동정을 촉진시키는 컴퓨터 소프트웨어의 도움을 받아 사람에 의하여 검사될 수 있다.

항체 결합의 검출은 항-마커 항체들을 탐지할 수 있는 물질에 커플링 함으로써 촉진될 수 있다. 탐지할 수 있는 물질들의 예시들은 다양한 효소들, 보결원자단들, 형광 물질들, 발광성 물질들, 생물발광성 물질들, 그리고 방사성 물질들을 포함한다. 적합한 효소들의 예시들은 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적합한 보결원자단 복합체들의 예시들은 스트렙타비딘/비오틴 그리고 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질들의 예시들은 움벨리페론, 플루오레세린, 플루오레세린이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세린, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광성 물질의 예시는 루미놀을 포함하며; 생물발광성 물질들의 예시들은 루시페라아제, 루시페린, 그리고 애큐오린을 포함하며; 그리고 적합한 방사성 물질의 예시들은 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³H을 포함한다.

본원 발명의 일 실시예에서 동결된 샘플들은 위에서 설명한 바와 같이 제조되며 그리고 뒤이어 예를 들면, Tris-버퍼된 식염수 (TBS)를 이용하여, 적합한 농도로 희석된 본원 발명의 마커들에 대한 항체들로 염색될 수 있다. 일차 항체들은 슬라이드들을 비오틴화된 항-면역글로불린에서 인큐베이션 함으로써 검출될 수 있다. 이 시그날은 선택적으로 증폭될 수 있으며 그리고 항원의 디아미노벤지딘 침전을 이용하여 가시화될 수 있다. 더욱이, 슬라이드들은 세포를 가시화하기 위하여 예를 들면, 헤마톡실린으로 선택적으로 대비염색될 수 있다.

다른 실시예에서, 고정된 그리고 엠베딩된 샘플들은 본원 발명의 마커에 지항된 항체로 염색되며 그리고 위에서 설명한 바와 같이 동결된 절편들에 대하여 대비염색된다. 또한, 샘플들은 항체 염색을 가시화하기 위하여 시그날을 증폭하기 위한 에이전트들로 선택적으로 처리될 수 있다. 예를 들면, 비오티닐-티라미드 퍼옥시다아제-촉매된 공탁(deposition), 이는 순차로 퍼옥시다아제-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (촉매된 시그날 증폭 (CSA) 시스템, DAKO, Carpinteria, CA)과 반응됨, 이 사용될 수 있다.

조직-기초 분석들 (즉, 면역조직화학)은 본원 발명의 마커의 검출 및 정량에 바람직한 방법들이다. 일 실시예에서, 본원 발명의 마커의 존재 또는 결여는 면역조직화학으로 측정될 수 있다. 일 실시예에서, 면역조직화학적 분석은, 마커가 부족한 세포들이 염색되지 않도록, 항-마커 항체의 저 농도들을 사용한다. 다른 실시예에서, 본원 발명의 마커의 존재 또는 결여는, 마커 단백질이 부족한 세포들이 심하게 염색되도록 항-마커 항체의 고 농도를 이용하는 면역조직화학적 방법을 이용하여 측정된다. 염색되지 않는 세포들은 돌연변이된 마커를 함유하여 항원으로 인식할 수 있는 마커 단백질 생성하는데 실패하거나, 또는 마커 수준들을 제어하는 경로들의 조절장애로 마커 단백질의 무시할 만 한 지속적 발현이 도출된 세포들이다.

당해 분야의 통상의 기술자는 본원 발명의 방법들의 실시에 사용된 특정 항체의 농도는 결합 시간, 본원 발명의 마커에 대한 항체의 특이성 수준, 그리고 샘플 제조 방법, 과 같은 요인들에 따라 달라진다는 것을 인식할 것이다. 더욱이, 다중 항체들이 사용되는 경우, 요구되는 농도는 샘플 에 적용되는 항체들의 순서, 예컨대, 칵테일로서 동시에 또는 개별적 항체 시약들로서 순차적으로, 에 영향을 받을 수 있다. 더욱이, 본원 발명의 마커에 대한 항체의 결합을 가시화하기 위한 검출 화학은 또한 노이즈 비율(noise ratio)에 대하여 바람직한 시그날을 생성하기 위하여 최적화되어야 한다.

본원 발명의 일 실시예에서, 단백질체학적 방법들, 예컨대, 질량 분석, 이 본원 발명의 마커 단백질들의 검출 및 정량에 사용된다. 예를 들면, MALDI-TOF MS(matrix-associated laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 생물학적 샘플, 이를테면 혈청, 의 단백질-결합 칩에의 적용과 관련된 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) (Wright, G.L., Jr., 등 (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., 등(2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., 등 (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., 등 (2002) 359:572; Adam, B.L., 등 (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., 등 (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., 등 (2001) Cancer Res 61:6029)가 PY-Shc 및/또는 p66-Shc 단백질들을 검출 및 정량하기 위하여 사용될 수 있다. 질량 분석 방법들은 예를 들면, 미국 특허 제5,622,824호, 제5,605,798호 그리고 제5,547,835호에 설명되어 있으며, 각각의 전체 내용은 본원 명세서에 참조 문헌으로 편입된다.

다른 실시예들에서, 본원 발명의 마커의 발현은 핵산 수준에서 검출된다. 발현을 평가하기 위한 핵산-기초 기술들은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 그리고 예를 들면, 대상으로부터의 샘플 내의 마커 mRNA의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 많은 발현 검출 방법들은 분리된 RNA를 이용한다. mRNA의 분리에 대하여 선택하지 않는 여하한 RNA 분리 기술은 본원 발명의 마커를 발현하는 세포들로부터 RNA의 정제에 사용될 수 있다. (예컨대, Ausubel 등, ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York)참조). 추가적으로, 다수의 조직 샘플들은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들, 이를테면, 예를 들면, Chomczynski의 단일-단계 RNA 분리 프로세스 (1989, 미국 특허 제 4,843,155호)을 이용하여 쉽게 가공될 수 있다.

"프로브"라는 용어는 본원 발명의 마커, 예를 들면, 뉴클레오타이드 전사체 및/또는 단백질, 에 선택적으로 결합할 수 있는 여하한 분자를 지시한다. 프로브들은 당해분야의 기술자들에 의하여 합성될 수 있거나, 또는 적합한 생물학적 제조물로부터 유도될 수 있다. 프로브들은 표지 되도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브들로서 사용될 수 있는 분자들의 예시는, 다음에 제한되지 않으나, RNA, DNA, 단백질들, 항체들, 그리고 유기 분자들을 포함한다.

분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석들, 폴리머라아제 연쇄 반응 분석들 그리고 프로브 어레이들을 포함하나 이에 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석들에 사용될 수 있다. mRNA 수준들의 검출 방법의 하나는 분리된 mRNA를 마커 mRNA에 혼성화 할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것에 관련된다. 핵산 프로브는 예를 들면, 전-장 cDNA, 또는 그의 일부, 이를테면 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드들 길이의 올리고뉴클레오타이드이며 그리고 충분한 마커 게놈의 DNA에 엄격한 조건들 하에서 특이적으로 혼성화하는데 충분한 것들 일 수 있다.

일 실시예에서, mRNA는, 예를 들면 분리된 mRNA을 아가로오스 겔에 주행시키고 겔로부터 mRNA를 멤브레인, 이를테면 니트로셀룰로오스에 이동시킴으로써, 고체 표면에 고정되고 프로브와 접촉된다. 대안적 실시예에서, 프로브(들)은 , 예를 들면, Affymetrix 유전자 칩 어레이에서, 고체 표면상에 고정되고 mRNA는 프로브(들)과 접촉된다. 통상의 기술자는 마커 mRNA의 수준 검출을 위하여 공지된 mRNA 검출 방법들을 쉽게 적용할 수 있다.

샘플에서 마커 mRNA의 수준 측정을 위한 대안적 방법은 예컨대, RT-PCR (Mullis, 1987, 미국 특허 제 4,683,202호에 설명된 실험 실시예), 리가아제 연쇄 반응 (Barany (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:189-193), 자기부양염기서열복제 (Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 리플리카아제 (Lizardi 등 (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 써클 복제 (Lizardi 등, 미국 특허 제 5,854,033호) 또는 여하한 여타의 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 프로세스, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술들을 이용한 증폭된 분자들의 검출이 수반됨, 에 관련된다. 이들 검출 계획은 특히 핵산 분자들의 검출에, 만약 그러한 분자들이 매우 적은 수로 존재한다면, 유용하다. 본원 발명의 특정 측면들에서, 마커 발현은 정량적 형광발생 RT-PCR (즉, TaqMan^TM 시스템)으로 평가된다. 그러한 방법들은 전형적으로 본원 발명의 마커에 특이성인 올리고뉴클레오타이드 프라이머들의 쌍들을 사용한다. 공지된 서열에 특이성인 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 설계하는 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

본원 발명의 마커의 발현 수준들은 멤브레인 블럿 (이를테면 혼성화 분석 이를테면 노던, 서던, 도트, 그리고 이와 유사한 것들에 사용되는) 또는 마이크로웰들, 샘플 튜브들, 겔들, 비드들(beads) 또는 섬유들 (또는 결합된 핵산들을 포함하는 여하한 고체 지지체)을 이용하여 모니터 될 수 있다. 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 그리고 제5,445,934호를 참조하며, 이들은 본원에 참조 문헌으로 편입된다. 마커 발현의 검출은 또한 용액 내 핵산 프로브들을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

본원 발명의 일 실시예에서, 마이크로어레이들은 본원 발명의 마커의 발현을 검출하는데 사용된다. 마이크로어레이들은 특히 상이한 실험들 사이의 재현성 때문에 이 목적을 위하여 잘 연구되어 있다. DNA 마이크로어레이들은 다수의 유전자들의 발현 수준들의 동시 측정을 위한 하나의 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고체 지지체에 부착되는 캡쳐 프로브들의 재생 가능한 패턴으로 구성된다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이 상의 상보적인 프로브들에 혼성화 되고 이후 레이져 스캐닝으로 검출된다. 어레이 상의 각각의 프로브에 대한 혼성화 강도들이 측정되고 상대적 유전자 발현 수준들을 나타내는 정량적 값으로 전환된다. 미국 특허 제 6,040,138호, 제5,800,992호 그리고 제6,020,135호, 제6,033,860호, 그리고 제6,344,316호를 참조하며, 이들은 본원에서 참조로서 편입된다. 고-밀도 올리고뉴클레오타이드 어레이들이 샘플에서 다수의 RNA들의 유전자 발현 프로파일을 측정하는데 특히 유용하다.

마커의 양들, 및/또는 본원 발명의 마커의 양들의 수학적 상관관계가, 질병 상태 또는 독성 상태에 대하여 치료되는 대상에서, 질병 상태, 예컨대 암, 당뇨병, 비만, 심혈관질환, 또는 독성 상태, 예컨대, 약물-유도 독성 또는 심장독성, 의 재발 위험, 질병 상태 또는 독성 상태에 대하여 치료되는 대상의 생존, 질병 상태 또는 독성 상태가 공격적인지 여부, 본원 발명의 방법들을 사용하여, 질병 상태 또는 독성 상태, 그리고 이와 유사한 상태들을 치료하기 위한, 치료요법의 유효성을 계산하는데 사용될 수 있으며, 이는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 회귀 분석 방법들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 회귀 모델들은, 다음에 이에 제한되지 않으나, CART (예컨대, Hill, T, 그리고 Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (예컨대, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수, 정규 및 로그 정규 (예컨대,www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 로지스틱 (예컨대,www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), 매개변수, 비-매개변수, 세미-매개변수 (예컨대,www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형 (예컨대, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), 또는 부가 (예컨대,www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 회귀 분석은 마커의 양들을 포함한다. 다른 실시예에서, 회귀 분석은 마커 수학적 상관관계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 마커의 양, 및/또는 마커 수학적 상관관계들의 회귀 분석은 추가적인 임상 및/또는 분자 공-변량들(co-variates)을 포함할 수 있다. 그러한 임상 공-변량들은 이에 제한되지 않으나, 노드의 상태(nodal status), 종양 단계, 종양 등급, 종양 크기, 치료 치료계획, 예컨대, 화학 요법 및/또는 방사선 치료 요법, 임상적 결과 (예컨대, 재발, 질병-특이적 생존, 치료 요법 실패), 및/또는 진단 후 시간, 치료 요법의 개시 후 시간, 및/또는 시간 치료의 완료 후 시간의 함수로서의 임상 결과를 포함한다.

VIII . 키트들

본원 발명은 또한 질병 상태, 예컨대 암, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 또는 독성 상태, 예컨대, 약물-유도 독성 또는 심장독성, 질병 상태 또는 독성 상태의 재발, 또는 질병 상태 또는 독성 상태에 대하여 치료된 대상의 생존을 예측하기 위한 조성물들 및 키트들을 제공한다. 이들 키트들은 하나 또는 그 이상의 다음을 포함한다: 본원 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 탐지할 수 있는 항체, 본원 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 탐지할 수 있는 항체, 염색을 위한 대상 조직 샘플들을 수득 및/또는 제조하기 위한 시약들, 그리고 사용 설명서.

본원 발명의 상기 키트들은 본원 발명의 방법들을 수행하는데 유용한 추가적인 구성요소들을 선택적으로 포함할 수 있다. 예시로서, 상기 키트들은 상보적인 핵산들의 어닐링에 또는 항체의, 이것이 특이적으로 결합하는, 단백질과의 결합에 적합한 액체들 (예컨대, SSC 버퍼), 하나 또는 그 이상의 샘플 구획들, 본원 발명의 수행 방법을 설명하는 지시물 그리고 조직 특이적 대조구들/표준들을 포함할 수 있다.

IX . 스크리닝 분석들

본원 발명의 표적들은 이에 제한되는 것은 아니나, 본원에서 열거된 유전자들 및/또는 단백질들을 포함한다. 본원에서 출원인에 의하여 설명된 실험들의 결과들에 기초하여, 질병 상태 또는 독성 상태에서 조절되는 핵심 단백질들은, 세포 골격 구성요소들, 전사 요인들, 세포자멸 반응, 펜토오스 포스페이트 경로, 생합성 경로, 산화 스트레스 (pro-oxidant), 멤브레인 변형들, 그리고 산화적 인산화 대사를 포함하는, 상이한 경로들 또는 분자들의 그룹들과 연관되거나 또는 분류될 수 있다. 따라서, 본원 발명의 일 실시예에서, 마커는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, CANX, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 유전자들 (또는 단백질들)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 마커는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 그리고 TAZ로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 유전자들 (또는 단백질들)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 마커들은 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물, 스물-다섯, 서른, 또는 그 이상의 전술한 유전자들 (또는 단백질들)의 조합이다.

동정된 마커들의 조절물질의 동정에 유용한 스크리닝 분석들은 이하에서 설명된다.

본원 발명은 또한, 본원 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 질병 상태 또는 독성 상태의 치료 또는 예방에 유용한, 조절물질들, 즉, 후보 또는 테스트 화합물들 또는 에이전트들 (예컨대, 단백질들, 펩티드들, 펩티드모방제들, 펩토이드들(peptoids), 저분자들 또는 여타의 약물들), 의 동정을 위한 방법들 (또한 본원에서 "스크리닝 분석들"으로 지시됨)을 제공한다. 그러한 분석들은 전형적으로 본원 발명의 마커와 하나 또는 그 이상의 분석 구성요소들 사이의 반응을 포함한다. 여타의 구성요소들은 테스트 화합물 자체이거나, 또는 테스트 화합물들과 본원 발명의 마커의 천연 결합 파트너의 조합이다. 이를테면 본원에서 설명된 것들과 같은 분석들을 통하여 동정된 화합물들은, 예를 들면, 질병 상태 또는 독성 상태의 공격성의 조절, 예컨대, 억제, 호전, 치료, 또는 예방에 유용할 수 있다.

본원 발명의 스크리닝 분석들에 사용되는 테스트 화합물들은 천연의 및/또는 합성 화합물들의 시스템 라이브러리들을 포함하는, 여하한 입수 가능한 원료로부터 수득 될 수 있다. 테스트 화합물들은 또한, 다음을 포함하는, 당해 기술분야에 공지된 분자 다양성 라이브러리 방법들에서 여하한 수많은 접근법들에 의하여 수득될 수 있다: 생물학적 라이브러리들; 펩토이드(peptoid) 라이브러리들 (펩티드들의 기능성을 가지나, 효소 분해에 저항성이나 그럼에도 불구하고 생활성을 유지하는 신규한, 비-펩티드 백본을 갖는 분자들의 라이브러리들); 예컨대, Zuckermann 등, 1994, J. Med . Chem. 37:2678-85 참조); 공간적으로 접근할 수 있는(addressable) 병렬 고체 상 또는 용액 상 라이브러리들; 디콘볼류션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법들; '하나의- 비드 하나의-화합물' 라이브러리 방법; 그리고 친화성 크로마토그래피 선택을 이용하는 합성 라이브러리 방법들. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근법들은 펩티드 라이브러리들에 제한되나, 여타의 네 접근법들은 펩티드, 비-펩티드올리고머 또는 화합물들의 저분자 라이브러리들에 적용될 수 있다. (Lam, 1997, AntiCancer Drug Des. 12:145).

분자 라이브러리들은 합성 방법들의 예시들은 당해 기술분야, 예를 들면 이하에서 발견될 수 있다: DeWitt 등 (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90:6909; Erb 등 (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:11422; Zuckermann 등 (1994). J. Med . Chem .37:2678; Cho 등 (1993) Science 261:1303; Carrell 등 (1994) Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2059; Carell 등 (1994) Angew . Chem . Int. Ed . Engl .33:2061; 그리고 Gallop 등 (1994) J. Med . Chem . 37:1233.

화합물들의 라이브러리들은 용액에 (예컨대, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), 또는 비드들에 (Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩들에 (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및/또는 포자들에, (Ladner, USP 5,223,409), 플라스미드들에 (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파아지에 (Scott 및 Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al , 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol . Biol . 222:301-310; Ladner, supra .) 제공될 수 있다.

본원 발명의 스크리닝 방법들은 질병 상태 세포 또는 독성 상태 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 단계 및 세포에서 본원 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 본원 발명의 마커의 발현 및/또는 활성은 본원에서 설명된 바와 같이 측정될 수 있다.

다른 실시예에서, 본원 발명은, 본원 발명의 마커 또는 그의 생물학적 활성 부분들의 기질들인 스크리닝 후보 또는 테스트 화합물들에 대한 분석들을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본원 발명은 본원 발명의 마커 또는 그의 생물학적 활성 부분들에 결합하는 후보 또는 테스트 화합물들을 스크리닝하기 위한 분석들을 제공한다. 마커에 직접적으로 결합하는 테스트 화합물의 측정은, 예를 들면, 화합물의 마커에 대한 결합이 복합체 내의 표지된 마커 화합물의 검출에 의하여 측정될 수 있도록 화합물을 방사성동위 원소 또는 효소적 표지와 커플링시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 화합물들 (예컨대, 마커 기질들)은 ¹³¹I, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³H로, 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있으며, 그리고 방사성동위 원소는 방사성 방출을 직접적으로 카운팅하거나 또는 신틸레이션(scintillation) 카운팅에 의하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 분석 구성요소들은 예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타아제, 또는 루시페라아제로 효소적으로 표지될 수 있으며, 그리고 효소 표지는 적합한 기질의 생성물로의 전환에 의하여 측정될 수 있다.

본 발명은 전술한 스크리닝 분석들로 동정된 신규한 에이전트들에 더욱 관련된다. 따라서, 적합한 동물 모델에서 본원에서 설명된 바와 같이 동정된 에이전트를 더욱 사용하는 것은 본원 발명의 범위 내이다. 예를 들면, 본원에서 설명한 바와 같이 동정된 본원 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 에이전트는 동물 모델에서 그러한 에이전트로의 치료의 유효성, 독성, 또는 부작용들을 측정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에서 설명된 바와 같이 동정된 에이전트는 동물 모델에서 그러한 에이전트의 작용 메커니즘을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 전술한 스크리닝 분석들에 의하여 동정 된 신규한 에이전트들의 위에서 설명한 바와 같은 치료를 위한 용도들에 관련된다.

본원 발명의 실시예

실시예 1: 암 합의 및 시뮬레이션 네트워크들의 구축을 위한 플랫폼 기술의 사용

이 실시예에서, 위에서 상세히 설명된 플랫폼 기술이 커스텀 구축된 시험관 내 암 모델로부터 수득된 테이터를 통합하고, 이로써 암의 발병기전을 추진하는 신규한 단백질들/경로들을 동정하는데 사용되었다. 이 분석으로부터 도출된 관련 맵들이 암 치료 표적들은 물론 암 연관된 마커들의 진단/예후를 제공하였다.

연구 설계는 도 18에 도시되어 있다. 간단히, 두 암 세포 라인들(PaCa2, HepG2) 및 하나의 정상 세포 라인 (THLE2)이 암 세포들이 생체 내에서 경험하는 환경을 시뮬레이션하는 일곱 조건들 중 하나에 도입되었다. 특히, 세포들은 고혈당 조건, 저산소증 조건, 락틱 애시드 조건, 고혈당 + 저산소증 조합 조건, 고혈당 + 락틱 애시드 조합 조건, 저산소증 + 락틱 애시드 조합 조건, 또는 고혈당 + 저산소증 + 락틱 애시드 조합 조건에 노출되었다. 상이한 조건들이 다음과 같이 창조되었다:

--고혈당 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 함유 배지에 배양함으로써 창조되었다.

--저산소증 조건은 세포들을 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기게 되는 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)에 배치함으로써 유도되었다.

--락틱 애시드 조건은 세포들을 12.5 mM 락틱 애시드 함유 배지들에서 배양함으로써 창조되었다.

--고혈당 + 저산소증 조합 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 함유 배지에 배양하고 상기 세포들이 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기게 하는 모듈라 인큐베이터 챔버 내에 배치됨으로써 창조되었다.

--고혈당 + 락틱 애시드 조합 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 및 12.5 mM 락틱 애시드 함유 배지에서 배양함으로써 창조되었다.

--저산소증 + 락틱 애시드 조합 조건은 세포들을 12.5 mM 락틱 애시드 함유 배지에서 배양하고 상기 세포들이 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기는 모듈라 인큐베이터 챔버에 배치됨으로써 창조되었다.

--고혈당 + 저산소증 + 락틱 애시드 조합 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 및 12.5 mM 락틱 애시드 함유 배지에서 배양하고, 상기 세포들이 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기게 되는 모듈라 인큐베이터 챔버 내에 배치됨으로써 창조되었다.

전술한 세포들을 포함하는 상기 세포 모델, 여기서 상기 세포들은 전술한 각각의 조건에 노출되었음, 은 추가적으로 상기 세포들을 코엔자임 Q10으로 처리함에 의한 환경의 동요에 노출시킴으로써 조사된다. 특히, 상기 세포들은 코엔자임 Q10의 0, 50μM, 또는 100μM에서 처리되었다.

각각의 조건을 갖는 그리고 각각의 코엔자임 Q10 처치된 각각의 세포 라인에 대한 세포 샘플들은 물론 배지들 샘플들은 치료 후, 치료 24시간 및 48 시간 후를 포함하는 다양한 시간들에 수집되었다.

또한, 두 상이한 암 세포들, PaCa2 및 HepG2 세포들 사이의 교차 대화 실험들이 수행되었는데, 여기서 PaCa2 및 HepG2 세포들은 공동-배양되었다. 이 공동-배양 접근법은 세포외 분비 단백체 (ECS) 실험으로 지시된다. 제1 세포 시스템 (PaCa2)은 먼저 트랜스웰 타입 성장 챔버의 웰들의 삽입물들(inserts)에 씨딩 되었다. 여섯 웰 플레이트들이 좀 더 나은 통계학적 분석이 가능하도록 사용되었다. 제1 세포 시스템이 삽입물들에 씨딩 된 시간에, 삽입물들은 개별적 6-웰 플레이트에 배치되었다. 제2 세포 시스템 (HepG2)은 일차 트레이 위에 씨딩 되었다. 제1 세포 시스템을 함유하는 삽입물 트레이 함유 및 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이는 37˚C에서 하룻밤 동안 인큐베이션 되었다. 각각의 세포 시스템들은 특이적 세포 특이적 배지들에서 성장되었다.(여기서 대안적으로, 각각의 세포 시스템들은 두 세포타입들 모두의 성장을 지지하도록 적용된 배지에서 성장될 수 있다.) 제2 일에, 예정된 처치가 배지들의 교환에 의하여 주어졌다. 특히, 제1 세포 시스템 함유 삽입물들은 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이 내로 배치되었다. 상기 트레이는 이후 예정된 시간, 24 시간 또는 48 시간 동안 인큐베이션 되었다. 사본(Duplicate) 웰들이 동일한 조건으로 수립되었으며, 그리고 세포들은 2D 분석을 위하여 충분한 물질을 산출하도록 모아졌다(pooled). 배지들 (1 ml 분액), 삽입물들로부터의 세포들 그리고 일차 트레이의 웰들로부터의 세포들이 개별적 샘플들로서 수확되었다. 실험들은 더 나은 통계학적 분석 능력을 제공하기 위하여 삼중으로 실행되었다.

교차-대화 실험들은 또한 "배지들 교환(swap)" 실험들에 의하여 실행되었다. 특히, 배양된 배지들 또는 제1 세포 시스템 (PaCa2)으로부터의 "분비 단백체"가 동요 또는 위에서 설명한 바와 같은 조건으로 한 후 24시간 또는 48시간 후에 수집되었으며 그리고 이후 제2 세포 시스템 (HepG2)에 24-48 시간 동안 추가되었다. 최종 배양된 배지들 또는 제2 세포 시스템으로부터의 "분비단백체"가 이후 수집되었다. 모든 최종 분비 단백체들은 단백질체학 분석에 도입된다.

정량적 단백질체학에 의한 총 세포 단백질 발현 내의 변화의 i프로파일링은, 전술한 상세한 설명에 기재된 기술들을 이용하여 각각의 상태에서 그리고 각각의 "환경의 동요" , 즉, 코엔자임 Q10 치료, 를 갖는 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 세포 그리고 배지들 샘플들에 대하여 수행되었다. 정량적 단백질체학에 의한 총 세포 단백질 발현 내의 변화의 i프로파일링은 각각의 처치로 각각의 상태에서 각각의 공동-배양된 세포 라인에 대하여 수집된 세포 그리고 배지들 샘플들에 대하여 마찬가지로 수행되었다.

또한, 암, 정상 세포들 그리고 코엔자임 Q10 동요가 있거나 또는 없는 그리고 각각의 상태에 노출된 교차-대화 실험들에서의 세포들의 생물에너지학 프로파일링이 제조사에서 추천한 바와 같이 필수적으로 씨호스 분석기를 사용하여 생성되었다. OCR (산소 소모율) 및 ECAR (세포외 산성화율)이 씨호스 배양 플레이트에 대하여 푸쉬하는 카트리지로 생성된 7㎕ 챔버 내의 전극들에 의하여 기록되었다.

각각의 동요를 갖는 그리고 각각의 상태에서 각각의 세포 라인 (교차-대화 실험들에서의 세포들 포함)에 대하여 수집된 단백질체학 데이터, 그리고 각각의 동요를 갖는 그리고 각각의 상태에서의 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 생물에너지학 프로파일링 데이터가 모두 입력되었으며 REFS™ 시스템으로 프로세스 되었다. Paca2, HepG2, THLE2 그리고 교차-대화 실험들에 대한 미가공(raw) 데이터가 이후 표준화된 명명법(nomencalture)를 이용하여 조합되었다. 15%보다 많은 단백질체학 데이터 누락을 갖는 유전자들은 여과 제거되었다. 데이터 대체 전략(imputation strategy)이 개발되었다. 예를 들면, 리플리케이트들 내 에러 모델(a within replicates error model)이 실험 조건들로부터의 데이터를 리플리케이트들(replicates)로 대체(imput)하기 위하여 사용되었다. 10 네이버들(neighbors)에 기초한 K-NN 알고리즘이 리플리케이트들이 없는 데이터를 대체하는데 사용되었다. 상이한 REFS™ 모델들이, 표현형 데이터에 링크된, 세 생물학적 시스템들 모두 함께에 대하여, 단지 Paca2 시스템에 대하여, 또는 단지 HepG2 시스템에 대하여 구축되었다.

시뮬레이션 네트워크들에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각각의 엣지에 대한 곡선하면적 및 배수 변화들이 R 프로그래밍 언어를 이용하는 커스텀-구축된 프로그램에 의하여 추출되었는데, 여기서 상기 R 프로그래밍 언어는 통계학적 컴퓨터 계산 및 그래픽을 위한 c개방 소스 소프트웨어 환경이다.

R 프로그램으로부터의 아웃풋은 합의 네트워크의 가시적 표현을 생성하기 위하여, 개방 소스 프로그램인 사이토스케이프에 입력되었다.

구축된 모든 모델들 중에서, 70% 단편 빈도(frequency)에서 예시적 단백질 상호작용 REFS 합의 네트워크가 도 21에 도시된다.

도 21에 나타난 합의 네트워크 내의 각각의 노드는, 본 발명의 상세한 설명에서 전술한 바와 같이, REFS™를 이용하여 시뮬레이션 네트워크를 생성하기 위하여 LDHA의 발현을 4-배수로 증가 또는 감소시킴으로써 시뮬레이션 되었다.

도 21에 나타난 예시적 합의 네트워크에서 높은 수준으로 PARK7와 연관된 노트들(notes)에서 PARK7 및 단백질들에 대한 시뮬레이션 된 LDHA 발현 변화의 효과가 조사되었다. 두 암 세포 라인들, 즉, PaCa2 및 HepG2에서 LDHA 시뮬레이션에 반응성인 단백질들이 REFS™를 이용하여 동정되었다. (도22 참조). 숫자들은 특정의 단백질 발현 수준 배수 변화들을 나타낸다.

상기 방법을 이용하여 동정된 단백질 연결들(connections)을 검증하기 위하여, 시뮬레이션 네트워크에서 LDHA에 직접적으로 근접하는(proximity) 것으로 동정된 마커들이 전술한 공개 문헌들에 기초하여 실험 아웃풋들과 네트워크들 사이의 분자 연관(linkage)을 측정하기 위하여 신경망(neural) 네트워크들을 사용하는 소프트웨어 프로그램인 IPA에 입력되었다. IPA 프로그램의 아웃풋은 도 23에 도시되는데, 여기서 회색 형태들의 마커들이 플랫폼에 의하여 생성된 시뮬레이션 네트워크에서 LDHA에 즉각적으로 근접하는 것으로 동정되었으며 그리고 채워지지 않은 형태들의 마커들은 전술한 공개 문헌들에 의하여 공지된 기술에 기초하는 IPA에 의하여 동정된 연결들이다.

질의적 생물학 플랫폼 기술으로부터의 아웃풋에서 동정된 마커들 (도 21에 도시됨), 즉 DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1 그리고 CANX는 IPA 생성된 네트워크(도 23에 도시됨) 내에서 잘-알려진 암마커들 이를테면 TP53 그리고 PARK7에 연결되는 것으로 관찰되었다. 질의적 생물학 플랫폼의 사용에 의하여 동정된 인자들이 과학적 문헌들에 공개된 공지된 인자들과 연결성을 공유한다는 사실은 질의적 생물학 플랫폼의 사용에 의하여 창조된 네트워크의 정확성을 검증하였다. 추가로, 질의적 생물학 플랫폼 아웃풋들의 사용에 의하여 창조된 LDHA 서브-네트워크 내의 네트워크 연관성은, 분자 단위체들 사이의 연관이 상호작용하는 노드들 사이에 기능적 지향성을 제공하지 않는 IPA 네트워크와는 반대로, 각각의 인자의 지향적 영향(directional influence)의 존재를 증명하였다. 따라서, 데이터 생성, 통합을 위하여 비편향 접근법을 그리고 시뮬레이션 및 미분 네트워크 분석이 수반되는 컴퓨터 작업(computational) 모델을 창조하기 위한 역공학을 사용함으로써, 본원의 질의적 생물학 발명 플랫폼은, 질병 병태생리학의 수립되어 있는 과학적 이해들과 조화를 이루는, 암 병태생리학에서 지금까지 공지되지 않는 메커니즘들의 이해를 가능하게 한다.

도 19는 CoQ10 치료의, i프로파일링으로부터의 단백질 발현 데이터에 기초한 다운스트림 노드들 (pubmed 단백질 등록 번호들은 도 19에 열거되어 있음)에 대한 효과를 나타낸다. 단백질 등록 번호 P00338는 LDHA이다. 단백질체학 데이터의 Wet lab 검증이 HepG2 세포들에서의 LDHA 발현에 대하여 수행되었다. (도20 참조). 도 20에 도시된 바와 같이, LDHA 발현 수준들은 HepG2가 50 μM CoQ10 또는 100 μM CoQ10로 24 또는 48 시간 동안 처리된 경우 감소되었다.

잘 알려진 암 마커들 TP53, Bcl-2, Bax 그리고 Caspase3에 대하여, SKMEL 28 세포들에서 이들 마커들의 발현 수준에 대한 CoQ10 처치 효과의 wet lab 검증이 수행되었다. (도 24 및 도 25 참조).

실시예 2: 암 델타-델타 네트워크를 구축하기 위한 플랫폼 기술의 적용

이 실시예에서, 위에서 상세히 설명된 플랫폼 기술이 커스텀 구축된 시험관 내 암 모델로부터 수득된 데이터를 통합하며, 그리고 이로써 암의 발병 기전을 구동하는 신규한 단백질들/경로들을 동정하기 위하여 사용되었다. 이 분석으로부터 도출된 관련 맵들은 암 치료 표적들은 물론 암과 연관된 진단/예후 마커들을 제공하였다.

간단히, 네 암 라인들 (PaCa2, HepG2, PC3 그리고 MCF7) 그리고 두 정상 세포들 라인들 (THLE2 그리고 HDFa)이 생체 내 암 세포들에 의하여 경험되는 환경을 시뮬레이션하는 다양한 조건들에 도입되었다. 특히, 세포들은 개별적으로 각각의 고혈당 조건들, 저산소 조건들 그리고 락틱 애시드 처치에 노출되었다. 예를 들면, 고혈당 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 함유 배지에 배양함으로써 창조되었다. 저산소 조건은 세포들을 모듈라 인큐베이터 챔버 (MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)내에 배치함으로써 유도되었는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기게 되었다. 락틱 애시드 처치를 위하여, 각각의 세포 라인은 0 또는 12.5 mM 락틱 애시드로 처치되었다. 세포들을 각각의 세 전술한 조건들에 개별적으로 노출시키는 것 이외에, 세포들은 또한 상기 조건들의 둘 또는 셋 모두의 조합에 노출되었다. (즉, 고혈당 및 저산소 조건들; 고혈당 조건 및 락틱 애시드; 저산소 조건 및 락틱 애시드; 그리고, 고혈당 및 저산소 조건들 그리고 락틱 애시드).

전술한 세포들을 포함하는 세포 모델, 여기서 각각의 타입의 세포는 전술한 각각의 조건에 노출됨, 은 추가적으로 세포들을 코엔자임 Q10로 처리함으로써 "환경의 동요"에 노출시킴으로서 “조사(interrogated)”되었다. 특히, 상기 세포들은 코엔자임 Q10의 0, 50 μM 또는 100 μM에서 처치되었다.

코엔자임 Q10 처치가 있고 그리고 없는, 각각의 조건 (또는 조건들의 조합)에 노출된 각각의 세포 라인에 대한, 세포 샘플들은 물론 세포들로부터의 분비단백체를 함유하는 배지들 샘플들이 치료 후 24 시간 그리고 48 시간을 포함하는, 치료후 다양한 시간에 수집되었다.

또한, 두 상이한 암 세포들, PaCa2 및 HepG2 세포들 사이의 교차 대화 실험들이 수행되었는데, 여기서 PaCa2 및 HepG2 세포들은 공동-배양되었다. 이 공동-배양 접근법은 세포외 분비단백체 (ECS) 실험으로 지시된다. 제1 세포 시스템 (PaCa2)은 트랜스웰 타입 성장 챔버의 웰의 삽입물들에 씨딩되었다. 여섯 웰 플레이트들이 일반적으로 보다 나은 통계학적 분석을 가능하게 하기 위하여 사용되었다. 삽입물들에 제1 세포 시스템을 씨딩할 때, 삽입물들은 개별적 6-웰플레이트에 배치되었다. 제2 세포 시스템(HepG2)은 일차 트레이에 씨딩되었다. 제1 세포 시스템을 함유한 삽입물들을 함유하는 6-웰 플레이트, 그리고 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이는 37˚C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 되었다. 각각의 세포 시스템들은 그들의 각각의 세포 특이적 배지들에서 성장되었다. (여기서 대안적으로, 각각의 세포 시스템들은 두 세포 타입들 모두의 성장을 뒷받침하도록 적용된 배지에서 성장될 수 있다.) 제2 일에, 예정된 처치가 배지들 교환에 의하여 주어졌다. 특히, 제1 세포 시스템을 함유하는 삽입물들 및 제1 세포 시스템의 각각의 배지들은 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이 및 제2 세포 시스템의 각각의 배지들 내로 배치되었다. 그러나, 모든 경우의 공동-배양에서, 공동-배양된 세포들은, 공동-배양에 앞서 제1일 동안, 개별적이기는 하지만, 동일한 "암 조건" (예컨대, 고혈당증, 저산소증, 락틱 애시드, 또는 이들의 조합들)에 노출되었다. 즉, 삽입물 내의 제1 세포 시스템 그리고 트레이 내의 제2 세포 시스템은 “공동배양(coculture)” 정렬로 이동되기 전에 동일한 조건에 노출되었다. 상기 트레이는 이후 예정된 시간, 예컨대, 24 시간 또는 48시간, 동안 인큐베이트 되었다. 중복적(Duplicate) 웰들이 동일한 조건들로 설정되었으며, 그리고 세포들은 뒤이은 단백질체학 분석을 위하여 충분한 물질을 산출하기 위하여 모아졌다. 분비단백체 (1 ml 분액) 함유 배지들, 삽입물들로부터의 세포들 그리고 일차 트레이의 웰들로부터의 세포들이 개별적 샘플들로서 수확되었다. 실험들은 보다 나은 통계학적 분석 능력을 제공하기 위하여 삼중으로 실행되었다.

교차-대화 실험들 또한 "배지들 스왑(swap)" 실험들에 의하여 실행되었다. 특히, 제1 세포 시스템(PaCa2)으로부터의 배양된 배지들 또는 "분비단백체"가 동요 및/또는 조건화 이후 24 시간 또는 48 시간 후에 수집되었으며 그리고 이후 24-48 시간 동안 제2 세포 시스템에 부가되었다. 제2 세포 시스템으로부터의 최종 배양된 배지들 또는 "분비단백체"가 이후 수집되었다. 모든 최종 분비단백체들이 단백질체학 분석에 도입되었다.

세포 시스템을, 전술한 바와 같은 "암 조건들", 동요 (즉, 코엔자임 Q10 치료), 및/또는 공동-배양 실험으로부터의 짝지은 세포의 분비단백체에서 생성된 조건들, 에 노출 시킨 후, 세포들의 반응이 이후 세포 시스템으로부터의 다양한 판독들(readouts)에 의하여 분석되었다. 상기 판독들은 단백질체학 데이터, 특히 세포내 단백질 발현은 물론 세포 배양 배지들로 분비되는 단백질들, 그리고 기능적 데이터, 특히 세포 생물에너지학을 포함한다.

정량적 단백질체학에 의한 총 세포 단백질 발현에서의 변화의 i프로파일링이 전술한 상세한 설명에 기재된 기술들을 이용하여, "환경의 동요" , 즉, 코엔자임 Q10 처치가 있거나 없는, 각각의 조건 (또는 조건들의 조합)에 노출된 각각의 세포 라인 (정상 그리고 암 세포 라인들)에 대하여 수집된 세포 그리고 배지들 샘플들에 대하여 수행되었다.

또한, "환경의 동요" , 즉, 코엔자임 Q10 치료, 가 있거나 또는 없는, 각각의 조건(또는 조건들의 조합)에 노출된 각각의 세포 라인 (정상 그리고 암 세포 라인들)의 생물에너지학 프로파일링이, 제조사에 의하여 추천되는 바와 같이 필수적으로 씨호스 분석기를 사용하여 수행되었다. 산소 소모율(OCR) 그리고 세포외 산성화율 (ECAR)이, 씨호스 배양 플레이트에 대하여 푸쉬하는(pushing) 카트리지에 의하여 생성된 7㎕ 챔버 내의 전극들에 의하여 기록되었다.

각각의 조건(들)에서의 그리고 각각의 동요가 있는/없는 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 단백질체학 데이터, 그리고 각각의 조건(들)에서 그리고 각각의 동요가 있는/없는 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 생물에너지학 프로파일링 데이터가 이후 REFS™ 시스템으로 프로세스되었다. "복합 암 동요 (composite cancer perturbed) 네트워크"가, 각각이 각각의 특이적 조건(및 조건들의 조합)에 노출되었던, 그리고 또한 동요 (CoQ10)에 노출되었던 모든 암 세포 라인으로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. "복합 암 비동요(perturbed) 네트워크"가, 각각이 동요 없이(CoQ10 없이) 없이 각각의 특이적 조건(및 조건들의 조합)에 노출되었던 모든 암 세포 라인으로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 마찬가지로, "복합 정상 동요 네트워크"가, 각각이, 각각의 특이적 조건 (및 조건들의 조합)에 노출되었던, 그리고 추가적으로 동요 (CoQ10)에 노출된 모든 정상 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. “복합 정상 비동요 네트워크"가, 각각이 , 동요 없이(CoQ10 없이) 각각의 특이적 조건(및 조건들의 조합)에 노출되었던 모든 정상 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다.

다음으로, "시뮬레이션 복합 네트워크들" (또한 본원에서 "시뮬레이션 네트워크들"로서 지시됨)이 REFS™를 이용하여 전술한 각각의 네 복합 네트워크들에 대하여 생성되었다. 이를 달성하기 위하여, 주어진 합의 복합 네트워크 내의 각각의 노드가, 전술한 상세한 설명에서 기재한 바와 같이, REFS™를 이용하여 시뮬레이션 네트워크들을 생성하기 위하여 (10-배수로 증가 또는 감소시킴으로써) 시뮬레이션 되었다.

시뮬레이션 네트워크들에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각각의 엣지에 대한 곡선하 면적 및 배수 변화들이 R 프로그래밍 언어를 이용하는 커스텀-구축된 프로그램으로 추출되었는데, 여기서 상기 R 프로그래밍 언어는 통계학적 컴퓨터 계산 및 그래픽을 위한 개방 소스 소프트웨어 환경이다.

최종적으로, 델타 네트워크들이 생성되었는데, 여기서 상기 델타 네트워크들은 두 시뮬레이션 복합 네트워크들 사이의 차별성을 나타낸다. 상기 델타 네트워크들은 시뮬레이션복합 네트워크들로부터 생성되었다. 코엔자임 Q10에 반응한 암 vs. 정상 차별성 네트워크(델타-델타 네트워크)를 생성하기 위하여, 연속적인 비교 단계들이 도 26에 도시된 바와 같이, PERL 프로그래밍 언어를 사용하는 커스텀 구축된 프로그램에 의하여 수행되었다.

먼저, 암 처치되지 않은(untreated) (T0) 그리고 암 처치된(treated) (T1) 네트워크들이 R 프로그램을 이용하여 비교되었으며, 그리고 고유의 암 처치된 T1 네트워크들이 분리되었다. (도 26에서 진한 회색의 초승달 형태 참조). 이것은 암 T1 ∩ (교집합) 암 T0 "델타" 네트워크를 나타낸다. 이 델타 네트워크 내의 단백질 상호작용 / 연관성들은 코엔자임 Q10 처치에 대한 고유의 암 반응을 나타내는 것으로 보여질 수 있다.

유사하게, 정상 처치되지 않은 (T0) 그리고 정상 처치된 (T1) 네트워크들이 R 프그로램을 이용하여 비교되었으며, 그리고 상기 고유의 정상 처치되지 않은 T1 네트워크들이 분리되었다. (도 26에서 밝은 회색의 초승달 형태 참조). 이것은 정상 T1 ∩ 정상 T0 "델타" 네트워크를 나타낸다. 이 델타 네트워크 내의 단백질 상호작용들 / 연관성들은 코엔자임 Q10 처치에 대한 고유의 정상 세포 반응을 나타내는 것으로서 보여질 수 있다.

마지막으로, 고유의 암 T1 네트워크들 (도 26의 진한 회색 초승달 형태 참조) 그리고 고유의 정상 T1 네트워크들 (도 26의 밝은 회색 초승달 형태 참조)이 R 프로그램을 이용하여 비교되었으며, 그리고 코엔자임 Q10에 반응하는, 암 단독의 고유한, 그리고 정상 세포들에 존재하지 않는 네트워크들이 생성되었다 (도 26 참조). 단백질 상호작용들 / 연관성들의 수집은 코엔자임 Q10 처치에 따라 정상세포에 존재하지 않는 암 세포들 내의 공유의 경로들을 나타낸다. 이 단백질 상호작용들/연관성들의 집합은 "델타-델타 네트워크"라고 불리는데, 이는 암 세포들로부터의 차별성(미분, differential) 맵과 정상 대조구 세포들로부터의 차별성(미분) 맵의 비교로부터 생성된 차별성 맵(미분)이기 때문이다.

PERL 및 R 프로그램들로부터의 아웃풋이 델타-델타 네트워크의 가시적 표현을 생성하기 위하여, 개방 소스 프로그램인 사이토스케이프에 입력되었다.

본원에서 설명한 방법을 이용하여 동정된 델타-델타 네트워크들은 암 치료를 위한 표적들의 동정에 매우 유용하다. 예를 들면, 도 27에 제공된 델타-델타 네트워크에 따르면, 단백질 A가 OCR3(산화적 인산화를 위한 측정)을 억제하며 그리고 ECAR3(해당을 위한 측정)를 증진시킨다. 이 상호작용이 암 세포들에서 고유하므로(델타-델타 네트워크가 코엔자임 Q10 처치에 따른 정상 세포들에서 통상적으로 존재하는 여하한 상호작용들을 제거하기 때문), 단백질 A의 발현 억제는 암 대사 경로의 보증 마크인 해당-기초 에너지 대사를 감소시키며, 그리고 세포들을 정상 세포들과 좀 더 밀접하게 연관된 표현형인 산화적 인산화-기초 에너지 대사 쪽으로 쉬프트 할 것으로 기대된다. 따라서, 코엔자임 Q10 및 단백질 A 억제제를 이용하는 조합 치료 요법은, 적어도 부분적으로 암 세포의 에너지 대사 프로파일을 정상 세포와 닮은 쪽으로 쉬프팅함으로써, 암을 치료하는데 효과적일 것으로 기대된다.

본원 발명의 질의적 생물학 플랫폼 기술의 장점이 실질적인 실시예를 이용하여 더욱 설명되는데, 여기서 인과(casual) 네트워크들로부터 유도된 서브-네트워크가 전술한 공개 문헌들에 기초하여 실험 아웃풋들과 네트워크들 사이의 분자 연관(linkage)을 측정하기 위하여 신경망(neural) 네트워크들을 사용하는 소프트웨어 프로그램인 IPA를 이용하여 분자 네트워크에 비교되었다. 질의적 생물학 플랫폼을 이용하여 생성된 PARK7를 함유하는 인과 서브-네트워크 (도 29 참조)가 실질적인 실시예로서 사용된다. 질의적 생물학 플랫폼으로부터의 PARK7 네트워크의 모든 분자 시그니처들이 공지된/존재하는 문헌 증거에 기초하여 네트워크를 생성하기 위하여 IPA로 편입되었다. 질의적 생물학 아웃풋과 IPA의 사용으로 생성된 것 사이의 네트워크 아웃풋들이 이후 비교되었다.

질의적 생물학 플랫폼 기술 (도 29에 도시됨)로부터의 아웃풋에 의하여 동정된 여섯 마커들, 즉 도 27-29의 A, B, C, X, Y 그리고 Z,가 IPA 생성된 네트워크 (도 28) 내에서 TP53에 연결되는 것으로 관찰되었다. 여섯 마커들 중에서, A, B 그리고 C가 암은 물론 HSPA1A/HSPA1B에 연관된 것으로 문헌에 보고되었다. X, Y 그리고 Z는 암 상태의 "허브들" 또는 핵심 드라이버들로 동정되었으며, 그리고 그러므로 신규한 암 마커들로서 동정되었다. 또한, MIF1 및 KARS가 또한 암 상태의 "허브들" 또는 핵심 드라이버들로서 동정되었으며, 그리고 그러므로 신규한 암 마커들로서 동정되었다. 상기 질의적 생물학 플랫폼의 사용으로 동정된 인자들이 과학적 문헌들에 공개된 공지된 인자들과 연결성(connectivity)을 공유한다는 사실은 상기 질의적 생물학 플랫폼의 사용으로 창조된 네트워크의 정확성을 검증하였다. 추가로, 질의적 생물학 플랫폼 아웃풋들 (도 29에 도시)의 사용에 의하여 창조된 PARK7 서브-네트워크 내의 네트워크 연관성은, 분자 단위체들 사이의 연관이 상호작용하는 노드들 사이에 기능적 지향성을 제공하지 않는 IPA 네트워크(도 28에 도시됨)와는 반대로, 각각의 인자의 지향적 영향의 존재를 증명하였다. 더욱이, 질의적 생물학 플랫폼으로부터의 아웃풋들(도 29에서 점선으로 도시됨)은 PARK7를 통하여 잠재적 메커니즘에 이르도록 하는 이들 구성요소들의 연관성을 증명하였다. 단백질 C, 단백질 A 그리고 PARK7의 여타의 노드들이 암 대사의 핵심 드라이버들인 것으로 관찰되었다. (도 27)

본원 실시예에의하여 입증된 바와 같이, 데이터 생성, 통합을 위하여 비편향 접근법을 그리고 시뮬레이션 및 미분 네트워크 분석이 수반되는 컴퓨터 작업(computational) 모델을 창조하기 위한 역공학을 사용함으로써, 본원의 질의적 생물학 발명 플랫폼은, 질병 병태생리학의 수립되어 있는 과학적 이해들과 조화를 이루는, 암 병태생리학에서 지금까지 공지되지 않는 메커니즘들의 이해를 가능하게 한다.

실시예 3: 당뇨병/비만/ 심혈관 질환 델타-델타 네트워크 구축을 위한 플랫폼 기술 적용

이 실시예에서, 위에서 상세히 설명된 플랫폼 기술이 커스텀 구축된 당뇨병/비만/심혈관 질환 (CVD) 모델로부터 수득된 데이터를 통합하며, 그리고 당뇨병/비만/CVD의 발병 기전을 구동하는 신규한 단백질들/경로들을 동정하기 위하여 사용되었다. 이 분석으로부터 도출된 관련 맵들은 당뇨병/비만/CVD 치료 표적들은 물론 당뇨병/비만/CVD과 연관된 진단/예후 마커들을 제공하였다.

다섯 가지의 일차 인간 세포 라인들, 이른바 지방세포들, 근관들, 간세포들, 대동맥 평활근 세포들 (HASMC), 그리고 근위 세뇨관 세포들 (HK2)이 생체 내 이들 질병-관련 세포들에 의하여 경험되는 환경을 시뮬레이션하는 다섯 조건들 중 하나에 도입되었다. 특히, 각각의 다섯 세포 라인들은 각각의 다음의 조건들에 개별적으로 노출되었다: 고혈당 조건들, 고지혈증 조건들, 고인슐혈증 조건들, 저산소증 조건들 그리고 락틱 애시드에의 노출. 고혈당 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 함유 배지에 배양함으로써 유도되었다. 고지혈증 조건은 세포들을 0.15 mM 소듐 팔미테이트 함유 배지들에 배양함으로써 유도되었다. 고인슐혈증 조건은 세포들을 1000 nM 인슐린 함유 배지들에 배양함으로써 유도되었다. 저산소 조건은 세포들을 모듈라 인큐베이터 챔버 (MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)내 에 배치함으로써 유도되었는데, 이는 5% CO₂, 2% O₂ 그리고 93% 질소를 함유하는 산업 가스 믹스로 잠기게 되었다. 각각의 세포 라인은 또한 0 또는 12.5 mM 락틱 애시드로 처치되었다.

추가로, 교차 대화 실험들이 두 상이한 세포들의 쌍들, HASMC (세포 시스템1) 및 HK2 세포들 (세포 시스템 2) 또는 간 세포들 (세포 시스템1) 및 지방세포들 (세포 시스템 2)사이에 수행되었는데, 여기서 상이 쌍을 이룬 세포들은 공동-배양되었다. 이 공동-배양 접근법은 세포외 분비단백체 (ECS) 실험으로 지시된다. 제1 세포 시스템 (예컨대, HASMC)은 먼저 트랜스웰 타입 성장 챔버의 웰의 삽입물들에 씨딩되었다. 여섯 웰 플레이트들이 일반적으로 보다 나은 통계학적 분석을 가능하게 하기 위하여 사용되었다. 삽입물들에 제1 세포 시스템을 씨딩할 때, 삽입물들은 개별적 6-웰플레이트에 배치되었다. 제2 세포 시스템(예컨대, HK2)은 일차 트레이에 씨딩되었다. 제1 세포 시스템을 함유한 삽입물 트레이, 그리고 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이는 37˚C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 되었다. 각각의 세포 시스템들은 그들의 각각의 세포 특이적 배지들 에서 성장되었다. (여기서 대안적으로, 각각의 세포 시스템들은 두 세포 타입들 모두의 성장을 뒷받침하도록 적용된 배지에서 성장될 수 있다.) 제2 일에, 예정된 처치가 배지들 교환에 의하여 주어졌다. 특히, 제1 세포 시스템을 함유하는 삽입물들은 제2 세포 시스템을 함유하는 일차 트레이 내로 배치되었다. 상기 트레이는 이후 예정된 시간, 예컨대, 24 시간 또는 48시간, 동안 인큐베이트 되었다. 중복적(Duplicate) 웰들이 동일한 조건들로 설정되었으며, 그리고 세포들은 2D 분석을 위하여 충분한 물질을 산출하기 위하여 모아졌다. 배지들 (1 ml 분액), 삽입물들로부터의 세포들 그리고 일차 트레이의 웰들로부터의 세포들이 개별적 샘플들로서 수확되었다. 실험들은 보다 나은 통계학적 분석 능력을 제공하기 위하여 삼중으로 실행되었다.

교차-대화 실험들 또한 "배지들 스왑(swap)" 실험들에 의하여 실행되었다. 특히, 제1 세포 시스템, HASMC으로부터의 배양된 배지들 또는 "분비단백체" 가 동요 및/또는 조건화(conditioning) 이후 24 시간 또는 48 시간 후에 수집되었으며 그리고 이후 24-48 시간 동안 제2 세포 시스템, (지방세포 Adipoctes),에 부가되었다. 제2 세포 시스템으로부터의 최종 배양된 배지들 또는 "분비단백체"가 이후 수집되었다. 모든 최종 분비단백체들이 단백질체학 분석에 도입되었다.

전술한 세포들을 포함하는 세포 모델, 여기서 세포들은 전술한 각각의 조건에 노출됨, 은 추가적으로 세포들을 코엔자임 Q10로 처리함으로써 “환경의 동요”에 노출시킴으로서 “조사(interrogated)”되었다. 특히, 상기 세포들은 코엔자임 Q10의 0, 50 μM 또는 100 μM에서 처치되었다.

각각의 세포 라인, 조건 그리고 코엔자임 Q10 처치에 대한 세포 샘플들이 치료 후 24 시간 그리고 48 시간을 포함하는, 치료 후 다양한 시간에 수집되었다. 특정 세포들에 대한 그리고 특정 조건들 하의, 배지들 샘플들 또한 수집되고 분석되었다.

정량적 단백질체학에 의한 총 세포 단백질 발현 내의 변화의 i프로파일링은 전술한 상세한 설명에 기재된 기술들을 이용하여 각각의 조건에서 그리고 각각의 "환경의 동요" , 즉, 코엔자임 Q10 치료, 를 갖는 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 세포 그리고 배지들 샘플들에 대하여 수행되었다.

각각의 동요를 갖는 그리고 각각의 조건에서 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 단백질체학 데이터, 그리고 각각의 동요를 갖는 그리고 각각의 조건에서의 각각의 세포 라인에 대하여 수집된 생물에너지학 프로파일링 데이터가 이후 REFS™ 시스템으로 프로세스 되었다. 복합 동요 네트워크가 동요(CoQ10)에 노출된 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크는 동요 없는 (CoQ10 없는) 동일한 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증)에 대한 모든 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 유사하게, 복합 동요 네트워크가 동요(CoQ10)에 노출된 제2, 대조구 조건 (예컨대, 정상 혈당)에 대한 모든 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크가 동요 없는 (CoQ10 없는) 동일한 제2, 대조구 조건 (예컨대, 정상 혈당)에 대한 모든 세포 라인들로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다.

위에 설명된 합의 복합 네트워크들 내의 각각의 노드가, 전술한 상세한 설명에서 기재한 바와 같이, REFS™를 이용하여 시뮬레이션 네트워크들을 생성하기 위하여 (10-배수로 증가 또는 감소시킴으로써) 시뮬레이션 되었다.

시뮬레이션 네트워크들에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각각의 엣지에 대한 곡선하 면적 및 배수 변화들이 R 프로그래밍 언어를 이용하는 커스텀-구축된 프로그램으로 추출되었는데, 여기서 상기 R 프로그래밍 언어는 통계학적 컴퓨터 계산 및 그래픽을 위한 개방 소스 소프트웨어 환경이다.

델타 네트워크들은 시뮬레이션복합 네트워크들로부터 생성되었다. 코엔자임 Q10에 반응한 당뇨병/비만/심혈관 질환 조건 vs. 정상 조건 미분 네트워크(델타-델타 네트워크)를 생성하기 위하여, 비교 단계들이 도 30에 도시된 바와 같이, PERL 프로그래밍 언어를 사용하는 커스텀 구축된 프로그램에 의하여 수행되었다.

특히, 도 30에 도시된 바와 같이, 치료 T1는 코엔자임 Q10 처치를 지시하고 NG 및 HG는 조건들로서 정상 그리고 고혈당증을 지시한다. NG∩HG 델타 네트워크에서 NG로부터의 고유의 엣지들이 HG∩HGT1 델타 네트워크에서 HGT1의 고유의 엣지들과 비교되었다. NG 및 HGT1의 교집합에서의 엣지들은 T1로 NG로 회복된 HG 엣지들이다. T1로 NG로 회복된 HG 엣지들은 NG∩HG 델타 네트워크 상에서 겹쳐졌다. (도 31에서 더욱 진한 색 원들)

특히, 정상 혈상 (NG) 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵과 고혈당증 (HG) 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵이 정상 혈당 조건의 고유의 엣지들을 생성위하여 커스텀-제조된 Perl 프로그램을 이용하여 비교되었다. 코엔자임 Q10 처치 없는(HG) 고혈당증 조건의 시뮬레이션 된 복합 맵 과 코엔자임 Q10 처치 있는(HGT1) 고혈당증 조건의 시뮬레이션 된 맵 이, 커스텀-제조된 Perl 프로그램을 사용하여 코엔자임 Q10 처치 있는(HGT1) 고혈당증 조건의 고유의 엣지들을 생성하기 위하여 비교되었다. 정상 혈당 조건 (NG)로부터의 고유의 엣지들과 코엔자임 Q10 치료 (HGT1)가 있는 고혈당증 조건로부터의 고유의 엣지들의 교집합에서의 엣지들이 Perl 프로그램을 이용하여 동정되었다. 이들 엣지들은 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고혈당증 조건로부터 정상 혈당 조건로 회복되는 요인들/네트워크들을 나타낸다. 코엔자임 Q10 처치로 정상으로 회복된 고혈당 엣지들의 델타-델타 네트워크는 정상혈당 ∩ 고혈당증 델타 네트워크 상에서 겹쳐졌다. 겹쳐진 네트워크들의 샘플이 도 31에 도시된다. 도 31은 코엔자임 Q10에 반응하는 예시적 당뇨병/비만/심혈관 질환 조건 vs. 정상 조건 미분 네트워크 (델타-델타 네트워크)이다. 도 31에서 좀 더 진한 색의 원들은 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고혈당증 조건로부터 정상 혈당 조건로 회복된 동정된 엣지들이다. 도 31에서 좀 더 밝은 색 원들은 동정된 고유의 정상 (hypercemia) 엣지들이다.

PERL 및 R 프로그램들로부터의 아웃풋이 델타-델타 네트워크의 가시적 표현을 생성하기 위하여, 개방 소스 프로그램인 사이토스케이프에 입력되었다.

고혈당증 vs. 정상 혈당조건에 대한 전술한 실험들과 유사하게, 코엔자임 Q10 처치 없는 고지혈증 조건의 시뮬레이션 된 복합 네트워크 (전술한 모든 당뇨병/비만/심혈관-관련된 세포들로부터의 데이터 조합)와 엔자임 Q10 처치가 있는 고지혈증 조건의 시뮬레이션 된 복합 네트워크 (전술한 모든 당뇨병/비만/심혈관-관련된 세포들로부터의 데이터 조합)를 Perl 프로그램을 이용하여 코엔자임 Q10 처치한 고지혈증 조건의 고유의 엣지들을 생성하기 위하여 비교하였다. 정상 지혈 조건로부터의 고유의 엣지들과 코엔자임 Q10 처치를 한 고지혈증 조건로부터의 고유의 엣지들의 교집한 내의 엣지들이 Perl 프로그램을 이용하여 동정되었다. 이들 엣지들은 코엔자임 Q10의 처치에 의하여 고지혈증 조건로부터 정상 지혈 조건로 회복된 요인들/네트워크들을 나타낸다. 코엔자임 Q10 처치로 정상으로 회복된 고지혈증 엣지들의 델타-델타 네트워크는 정상 지혈 ∩ 고지혈증 델타 네트워크상에서 겹쳐진다. 겹쳐진 네트워크들의 샘플은 도 32에 도시된다. 도 32에서 좀 더 진한 색 원들이 코엔자임Q10의 처치에 의하여 고지혈증 조건로부터 정상 지혈 조건로 회복된 동정된 엣지들이다. 도 323에서 좀 더 밝은 색 원들이 동정된 고유의 정상 지혈 엣지들이다. FASN은 고지혈증을 정상 지혈 조건로 회복시키는 코엔자임 Q10의 효과를 조절하는 시그날링 경로의 하나의 중요한 요인으로서 동정되었다.

지방산 신타아제-지방산 합성 효소들 이를테면 FASN은 인간 대사 변경들 이를테면 비만, 인슐린 저항성 또는 이상지방혈증의 거의 모든 측면들에 관련되어 있다. FASN 억제제들은, 비록 분자 메커니즘들이 공지되어 있지는 않으나, 비만의 치료를 위한 선구 분자들로서 제안되고 있다. (Mobbs 등 2002). 세룰레닌(Cerulenin) 및 합성 화합물 C75- FASN 억제제들은 음식 흡수 감소에 효과를 가지며 체중 손실을 일으키는 것으로 나타났다. (Loftus 등 2000).

FASN이 도 32에 도시된 바와 같이 당뇨병에서 정상 상태로 회복시키는 코엔자임 Q10의 효과를 조절하는 시그날링 경로에서 하나의 중요한 요인으로서 본원에서 설명한 플랫폼 기술에 의하여 동정되었다는 사실은, 이 델타-델타 네트워크의 정확성을 입증하였다. 그러므로, 이 델타-델타 네트워크에서 동정된 여타의 신규한-인자들은 추가의 조서를 위한 잠재적 치료제 요인들 또는 약물 표적들일 것이다.

실시예 4: 약물 유도 심장독성의 모델을 구축하기 위한 플랫폼 기술의 적용

이 실시예에서, 위에서 상세히 설명된 플랫폼 기술이 커스텀 구축된 심장독성 모델로부터 수득된 데이터를 통합하며, 그리고 약물들의 발병기전/ 독성을 구동하는 신규한 단백질들/경로들을 동정하기 위하여 사용되었다. 이 분석으로부터 도출된 관련 맵들은 독성 바이오마커들을 제공하였다.

건강한 심장에서, 수축 기능은 지방산 그리고 탄수화물 산화의 균형에 의존한다. 비-지방 조직 (심장 및 간)에서의 섭취, 활용, 세포기관 생성(biogenesis) 및 분비의 만성 불균형이 미토콘드리아의 손상 및 기능 장애의 중심에 있으며 약물 유도 심장독성에 핵심적 역할을 하는 것으로 생각된다. 여기서 본 출원인들은 특히 세포 생물에너지학 그리고 미토콘드리아의 멤브레인 기능을 관찰하는 단백질 및 지질 시그니처들을 기능적 엔드(end) 포인트 분석들과 조합하는 시스템들의 접근법을 설명한다. 과도한 지방산 그리고 고혈당증으로 보충된 당뇨성 그리고 정상 심근세포들을 포함하는 시험관 내 모델들이, 독성의 시그니처들 그리고 잠재적 메커니즘들을 창조하기 위하여 약물들의 패널로 처리되었다. 본 출원인들은 (i) 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자들의 발현을 조절하는 전사 네트워크들의 조절장애; (ii) 당뇨성 심근세포들에서 GPAT1 및 타파진(taffazin)의 유도 이로써 미토콘드리아의 멤브레인에서 처음부터 포스포리피드 합성 및 리모델링 개시; 그리고 (iii) 섭취, 지방산 산화 그리고 ATP 합성에 영향을 주는, 당뇨성 심근세포들에서 변경된 지방산의 운명을 포함하는, 다양한 수준들에서 에너지 대사 구성요소를 혼란시킴으로써 미토콘드리아의 불안정화함에 있어서의 약물들의 다양한 효과들을 입증하였다. 또한, 본 출원인들은 wet lab 생물학 그리고 AI 기초 데이터 탐색 플랫폼의 능력을 베이지안 모델들에 기초한 캐쥬얼 네트워크의 생성을 위하여 조합하였다. 정상 세포 기능의 손실에 대하여 원인이 되는 단백질들 그리고 지질들의 네트워크들이 세포 보호 메커니즘들로부터의 약물 유도 독성의 메커니즘들을 구별하는데 사용되었다. 이 신규한 접근법은, 변경된 표현형을 정정하는 보다 안전한 치료학의 개발을 가능하게 하면서, 독성의 메커니즘을 이해하는 강력한 새로운 도구로서 역할을 할 것이다.

인간 심근세포들이생체 내에서 질병-관련 세포들에 의하여 경험되는 당뇨성 환경을 시뮬레이션하는 조건들에 도입되었다. 특히, 상기 세포들은 고혈당 조건들 및 고지혈증 조건들에 노출되었다. 고혈당 조건은 세포들을 22 mM 글루코오스 함유 배지들에 배양함으로써 유도되었다. 고지혈증 조건은 세포들을 1mM L-카르니틴, 0.7mM 올레익 애시드 그리고 0.7mM 리놀레익 애시드 함유 배지들에 배양함으로써 유도되었다.

전술한 세포들을 포함하는 세포 모델, 여기서 상기 세포들은 전술한 각각의 조건에 노출되었음, 은 세포들을 심장독성을 일으키는 것으로 공지된 당뇨성 약물 (T), 레스큐 분자 (R) 또는 당뇨성 약물과 레스큐 분자 양쪽 모두 (T+R)로 처치함으로써 "환경의 동요"에 노출시킴으로써 추가적으로 "조사(interrogated)" 되었다. 특히, 상기 세포들은 당뇨성 약물로 또는 레스큐 분자 코엔자임 Q10의 0, 50μM, 또는 100μM로 또는 당뇨성 약물 및 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치되었다.

각각의 동요 처치된 각각의 조건으로부터의 세포 샘플들은 치료 후 6 시간을 포함하는, 치료 후 다양한 시간에 수집되었다. 특정 조건들 하의, 배지들 샘플들 또한 수집되고 분석되었다.

정량적 단백질체학에 의한 총 세포 단백질 발현 내의 변화의 i프로파일링은 전술한 상세한 설명에 기재된 기술들을 이용하여 각각의 조건 그리고 각각의 "환경의 동요" , 즉, 당뇨성 약물 치료, 코엔자임 Q10 치료 또는 양쪽 모두에 대하여 수집된 세포 그리고 배지들 샘플들에 대하여 수행되었다. 전사 프로파일링 실험들은 Biorad cfx-384 증폭 시스템을 이용하여 수행되었다. 데이터 수집 (Ct) 후, 대조구에 비교한 최종 배수 변화가 δCt 방법을 이용하여 제조사의 프로토콜에 개략된 바와 같이 측정되었다. 지질체학 실험들은 질량 분석기를 이용하여 수행되었다. 기능적 분석들 이를테면 산소 소모율 OCR은 제조사에 의하여 추천되는 바와 같이 필수적으로 씨호스 분석기를 사용하여 측정되었다. OCR은 씨호스 배양 플레이트에 대하여 푸쉬하는 카트리지로 생성된 7㎕ 챔버 내의 전극들에 의하여 기록되었다.

도 35에 도시된 바와 같이, 당뇨성 심근세포들 (고혈당 그리고 고지혈증으로 조절된 심근세포들)에서 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자들의 전사 네트워크 그리고 발현은 동요 그리고 비동요 치료들 사이에 비교되었다. 특히, 전사 네트워크와 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자들의 발현의 데이터가 당뇨성 약물로 처치된 당뇨성 심근세포들(T) 그리고 처치되지 않은 당뇨성 심근세포들 샘플들 (UT) 사이에 비교되었다. 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자들의 전사 네트워크 그리고 발현의 데이터가 당뇨성 약물 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치된 당뇨성 심근세포들 (T+R) 그리고 처치되지 않은 당뇨성 심근세포들 샘플들 (UT) 사이에서 비교되었다. 처치되지 않은 당뇨성 심근세포들로부터의 데이터에 비교할 때, 어떤 유전자들의 발현 및 전사는 당뇨성 심근세포들이 당뇨성 약물로 처치되는 경우 변경되었다. 레스큐 분자 코엔자임 Q10은 당뇨성 약물의 독성 효과를 후퇴시키고 유전자 발현 그리고 전사를 정상화하는 것으로 입증되었다.

도 36A에 도시된 바와 같이, 심근세포들은 정상혈당 (NG) 또는 고혈당 (HG) 조건 중 어느 하나에 배양되었고 당뇨성 약물 단독 (T) 또는 당뇨성 약물 및 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 (T+R) 처치되었다. 각각의 조건 그리고 각각의 처치에 대한 GPAT1 그리고 TAZ의 단백질 발현 수준들이 웨스턴 블럿팅으로 테스트되었다. GPAT1 및 TAZ 모두는 고혈당증 조절된 그리고 당뇨성 약물 처치된 심근세포들에서 상향조절되었다. 고혈당증 조절된 심근세포들이 당뇨성 약물 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치되는 경우, GPAT1 및 TAZ의 상향조절된 단백질 발현 수준은 정상화되었다.

도 37A에 도시된 바와 같이, 미토콘드리아의 산소 소모율 (%) 실험들이 고혈당증 조절된 심근세포들 샘플들에 대하여 수행되었다. 고혈당증 조절된 심근세포들은 처치되지 않거나 (UT), 심장독성을 일으키는 것으로 공지된 당뇨성 약물로 처치 (T1), 심장독성을 일으키는 것으로 공지된 당뇨성 약물로 처치 (T2), 당뇨성 약물 T1 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치(T1+R), 또는 당뇨성 약물 T2 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치(T2+R) 중 어느 하나로 처치되었다. 처치되지 않은 대조구 샘플들에 비교하면, 미토콘드리아의 OCR은 고혈당증 조절된 심근세포들이 당뇨성 약물 T1 또는 T2로 처치된 경우 감소되었다. 그러나, 미토콘드리아의 OCR는 고혈당증 조절된 심근세포들이 당뇨성 약물 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두(T1 + R, 또는 T2 + R)로 처치되는 경우 정상화 되었다.

도 37B에 도시된 바와 같이, 미토콘드리아 ATP 합성 실험들이 고혈당증 조절된 심근세포들 샘플들에 대하여 수행되었다. 고혈당증 조절된 심근세포들은 처치되지 않거나 (UT), 당뇨성 약물로 처치 (T), 또는 당뇨성 약물 그리고 레스큐 분자 코엔자임 Q10 양쪽 모두로 처치 (T+R) 중 어느 하나로 처치되었다. 처치되지 않은 대조구 샘플들과 비교하면, 미토콘드리아의 ATP 합성은 고혈당증 조절된 심근세포들이 당뇨성 약물 (T)로 처치된 경우 억제되었다.

도 38에 도시된 바와 같이, 수집된 단백질체학 데이터에 기초하여, 약물 치료에 의하여 하향 조절된 단백질들은 GO 용어들로 주석을 달았다. 미토콘드리아의 에너지 대사에 개입된 단백질들은 고혈당증 조절된 심근세포들이 심장독성을 일으키는 것으로 공지된 당뇨성 약물로 처치되는 경우 하향조절되었다.

각각의 조건 그리고 각각의 동요에 대하여 수집된 단백질체학, 지질체학, 전사 프로파일링, 기능적 분석들, 그리고 웨스턴 블럿팅 데이터는 이후 REFS™ 시스템으로 프로세스되었다. 복합 동요 네트워크들이 각각의 동요 (예컨대, 당뇨성 약물, CoQ10, 또는 양쪽 모두)에 노출된 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증, 또는 고지혈증)로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크들이 동요 없는 (처치되지 않은) 동일한 하나의 특이적 조건 (예컨대, 고혈당증, 또는 고지혈증)로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 마찬가지로, 복합 동요 네트워크들이 각각의 동요 (예컨대, 당뇨성 약물, CoQ10, 또는 양쪽 모두)에 노출된 제2, 대조구 조건 (예컨대, 정상 혈당)에 대하여 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다. 복합 비동요 네트워크들은 동요 없는 (처치되지 않은) 동일한 제2, 대조구 조건 (예컨대, 정상혈당)로부터 수득된 조합된 데이터로부터 생성되었다.

전술한 합의 복합 네트워크들 내의 각각의 노드는 전술한 상세한 설명에서 기재한 바와 같이, REFS™를 이용하여 시뮬레이션 네트워크들을 생성하기 위하여 (10-배수로 증가 또는 감소시킴으로써) 시뮬레이션 되었다.

시뮬레이션 네트워크들에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각각의 엣지에 대한 곡선하 면적 및 배수 변화들이 R 프로그래밍 언어를 이용하는 커스텀-구축된 프로그램으로 추출되었는데, 여기서 상기 R 프로그래밍 언어는 통계학적 컴퓨터 계산 및 그래픽을 위한 개방 소스 소프트웨어 환경이다.

델타 네트워크들은 시뮬레이션복합 네트워크들로부터 생성되었다. 당뇨병에 반응하는 약물유도 독성 조건 vs. 정상 조건 미분 네트워크(델타 네트워크)를 생성하기 위하여, 비교 단계들이 도 39에 도시된 바와 같이, PERL 프로그래밍 언어를 사용하는 커스텀 구축된 프로그램에 의하여 수행되었다.

특히, 도 39에 도시된 바와 같이, UT는 고혈당증 조건에서 처치되지 않은 대조구 심근세포들의 단백질 발현 네트워크들을 지시한다. 처치 T는 고혈당증 조건에서 당뇨성 약물 처치된 심근세포들의 단백질 발현 네트워크들을 지시한다. UT∩T 델타 네트워크에서 T로부터의 고유의 엣지들은 도 40에 제공된다.

특히, 고혈당증 조건에서 처치되지 않은 심근세포들의 시뮬레이션 된 복합 맵과 고혈당증 조건에서 당뇨성 약물 처치된 심근세포들의 시뮬레이션 된 복합 맵이 커스텀-제조된 Perl 프로그램을 이용하여 고혈당증 조건에서 당뇨성 약물 처치된 심근세포들의 고유의 엣지들을 생성하기 위하여 비교되었다. PERL 및 R 프로그램들로부터의 아웃풋이 델타-델타 네트워크의 가시적 표현을 생성하기 위하여, 개방 소스 프로그램인 사이토스케이프에 입력되었다. 도 40에 도시된 바와 같이, 이 네트워크는, 고혈당증 조건에서의 심근세포들/ 심장독성(cardiotox) 모델에서 처치되지 않은 것에 대한(vs) 당뇨성 약물에 의하여 구동되는 델타 네트워크들을 나타낸다.

도 40에 도시된 약물 유도 독성 조건 vs. 정상 조건 차별성 네트워크로부터, 약물 유도 심장독성의 병태생리를 구동하는, 이를테면 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1.단백질들이 동정되었다. 이들 단백질들은 여타의 심장독성 유도 약물들의 동정을 위한 바이오마커들로서 기능할 수 있다. 이들 단백질들은 또한 심장독성을 경감시키는 에이전트들의 동정을 위한 바이오마커들로서 기능할 수 있다.

이 실시예에서 설명된 실험들은, 약물 치료에 노출된 당뇨성 심근세포들에서의 동요된 멤브레인 생물학 및 유리 지방산의 변경된 운명이 약물 유도 독성의 중심 특성임을 나타낸다는 것을 입증한다. 데이터 통합 그리고 네트워크 생물학은 심장독성의 이해를 증진시키고 심장독성을 예측할 수 있는 신규한 바이오마커들의 동정을 허용한다.

참고 문헌으로의 편입

본원 명세서에서 전체 내용 중에서 인용하는 모든 인용된 참고 문헌들(논문, 특허, 출원, 및 웹사이트 포함)의 내용들, 그리고 그 안에 인용된 문헌들도, 여기 본원 명세서에 그들 전체로서 명시적으로 포함될 수 있다. 본원 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술분야에 잘 알려진 단백질 포뮬레이션의 전통적인 기술들을 사용할 것이다.

균등 범위

본원 발명은 그의 발명적 사상 또는 필수적 특징들로부터 벗어남이 없이 여타의 특정 형태들로서 실시될 수 있다. 전술한 실시예들은 그러므로 본원 발명을 설명된 것으로 제한하기보다는 모든 측면에서 설명을 위한 것으로 고려되어야 한다. 본원 발명의 범위는 따라서 전술한 설명이 아닌 첨부된 청구범위에 의하여 지시되며, 청구항들과 균등한 수단 및 범위 내의 모든 변화들은 그러므로 본원에 포용되는 것으로 의도된다.

Claims (44)

1. 다음을 포함하는 생물학적 시스템의 조절물질(modulator) 동정 방법:
   (1) 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포 내의 복수의 유전자들의 발현 수준들을 나타내는 제1데이터 세트를 수득하는 단계;
   (2) 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포들의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제2데이터 세트를 수득하는 단계;
   (3) 제1 컴퓨터 시스템을 사용하여 상기 제1 데이터 세트 및 상기 제2 데이터 세트에 단독으로 기초하여 상기 복수의 유전자들의 상기 발현 수준들 그리고 상기 기능적 활성 또는 세포 반응과 관련된 제1 인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않으며, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
   i) 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트에 기초하여 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
   ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
   iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;
   (4) 상기 제1컴퓨터 시스템과 통신하는 제2컴퓨터 시스템을 통하여 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과 관계 네트워크 모델로부터 차별적인(differential) 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계;및
   (5) 상기 생물학적 시스템 고유의 인과 관계를 생성된 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터, 상기 제1컴퓨터 시스템과 통신하는 상기 제2컴퓨터 시스템을 통하여, 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로서 동정됨.
2. 다음을 포함하는 질병 프로세스의 조절물질의 동정 방법:
   (1) 질병 관련 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내는 제1데이터 세트를 수득하는 단계;
   (2) 상기 질병 관련 세포 내의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제2데이터 세트를 수득하는 단계;
   (3) 제1컴퓨터 시스템을 사용하여 상기 제1 데이터 세트 그리고 제2 데이터 세트에 단독으로 기초하여 상기 복수의 유전자들의 발현 수준들 그리고 상기 기능적 활성 또는 세포 반응과 관련된 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트 이외의 여하한 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않음, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
   i) 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트에 기초하여 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
   ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
   iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;
   (4) 상기 제1컴퓨터 시스템과 통신하는 제2컴퓨터 시스템을 통하여, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과 관계 네트워크 모델로부터 차별적인 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계;및
   (5) 생성된 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터, 상기 제2컴퓨터 시스템을 통하여 상기 질병 프로세스 고유의 인과 관계를 동정하는 단계, 여기서 상기 고유의 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 질병 프로세스의 조절 물질로서 동정됨.
3. 제1항에 있어서, 상기 조절물질은 상기 생물학적 시스템을 자극 또는 촉진함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조절물질은 상기 생물학적 시스템을 억제함을 특징으로 하는 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 질병 프로세스는 암, 당뇨병, 비만 또는 심혈관 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 편평세포암종, 대장암, 췌장암, 갑상선 암, 자궁내막암, 방광 암, 신장암, 고형 종양, 백혈병, 비-호지킨 림프종, 또는 약제-내성 암인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 조절물질은 상기 질병 프로세스를 자극 또는 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제2항에 있어서, 상기 조절물질은 상기 질병 프로세스를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 조절물질은 에너지 대사 경로를 특히 질병 세포들에서 해당 경로(glycolytic pathway)로부터 산화적 인산화 경로(oxidative phosphorylation pathway) 쪽으로 전환(shift) 시키는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대조구 세포 데이터는 대조구 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내는 제1대조 데이터 세트와 상기 대조구 세포의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제2대조 데이터 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 제1대조 데이터 세트를 수득하는 단계와 상기 제2대조 데이터 세트를 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제10항에 있어서,
    상기 (5)단계 전에, 상기 제2컴퓨터 시스템을 통하여, 상기 제1대조 데이터 세트 그리고 상기 제2대조 데이터 세트에 단독으로 기초하여 상기 대조구 세포의 상기 복수의 유전자들의 발현 수준들 그리고 상기 기능적 활성 또는 세포 반응과 관련된 제2인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 제2인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1대조 데이터 세트 그리고 상기 제2대조 데이터 세트 이외의 여하한 공지된 생물학적 상관관계들에 기초하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 삭제
14. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 시스템에 연관된 상기 세포는 시험관 내(in vitro) 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제2항에 있어서,
    상기 질병 연관 세포는 시험관 내(in vitro) 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제10항에 있어서,
    상기 대조구 세포는 시험관 내(in vitro) 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 시스템에 연관된 상기 세포는 환경의 동요에 도입되며, 상기 대조세포 데이터가 얻어진 대조구 세포는 상기 환경의 동요에 도입되지 않은 동일한 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제2항에 있어서,
    상기 질병 연관 세포는 환경의 동요에 도입되며, 상기 대조세포 데이터가 얻어진 대조구 세포는 상기 환경의 동요에 도입되지 않은 동일한 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환경의 동요는 에이전트(agent)와의 접촉, 배양 조건 변화, 도입된 유전자 변형(genetic modification)/돌연변이, 그리고 유전자 변형/돌연변이를 일으키는 운반체(vehicle) (예컨대, 벡터) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제2항에 있어서,
    상기 질병 연관 세포의 시험관 내 배양은 상기 질병 프로세스의 특징적 측면을 나타내며,
    상기 질병 프로세스의 상기 특징적 측면은 저산소증(hypoxia) 조건, 고혈당증(hyperglycemic) 조건, 락틱 애시드 풍부(lactic acid rich) 배양 조건, 또는 이들의 조합들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 데이터 세트는 상기 복수의 유전자들의 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의, 지질체학(lipidomics) 데이터, 대사체군학(metabolomics) 데이터, 전사체학(transcriptomics) 데이터, 그리고 단일뉴클레오타이드다형성 (SNP) 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 데이터 세트는 하나 또는 그 이상의, 생물에너지학 프로파일링 (bioenergetics profiling), 세포 증식, 세포자멸사(apoptosis), 세포기관 기능(organellar function), ATP(adenosine triphosphate) 수준, ROS(reactive oxygen species) 수준, OXPHOS(oxidative phosphorylation) 수준, OCR(oxygen consumption rate) 수준 및 ECAR(extra cellular acidification) 수준 중 적어도 하나 이상을 나타내는 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 삭제
25. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 컴퓨터 시스템은 다음을 수행하는 정보학 플랫폼을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 상기 제1 컴퓨터 시스템을 통해 베이지안 단편 열거 프로세스를 통해 입력 데이터에 기초하여 네트워크 단편의 세트를 창조하고;
    (b) 상기 제1 컴퓨터 시스템을 통해 시험 네트워크의 앙상블을 창조하며, 여기서 각 시험 네트워크는 상기 네트워크 단편의 세트의 서로 다른 서브세트로부터 만들어진다;
    (c) 상기 제1 컴퓨터 시스템을 통해 합의된 관계 네트워크인 진화된 시도 네트워크의 앙상블을 생산하기 위해 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키며, 여기서, 상기 정보학 플랫폼은 병렬적으로 상기 시험 네트워크의 진화를 위한 다중프로세서를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제25항에 있어서,
    상기 정보학 플랫폼은 통계학적 절사점(statistical cut-off point)을 적용하지 않고 상기 제1 데이터 세트 그리고 상기 제2 데이터 세트로부터의 모든 데이터 입력을 수용하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델 내에서 하나 또는 그 이상의 인과 관계들의 예측을 위한 신뢰 수준을 제공하기 위하여, 입력 데이터에 기초하여 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 컴퓨터가상실험(in silico) 시뮬레이션이 채용되며, 여기서 상기 입력 데이터는 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트 내의 상기 데이터의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    분자 및 세포 기술을 채용하여 상기 동정된 고유의 인과 관계를 검증하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2컴퓨터 시스템으로 비교 세포로부터 얻어진 데이터에 기초하여 제2 차별적인 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계; 및
    상기 제2컴퓨터 시스템을 통해, 상기 차별적인 인과 관계 네트워크와 상기 비교 세포로부터 얻어진 데이터에 기반한 상기 제2 차별적인 인과 관계 네트워크에 기초한 델타-델타 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제29항에 있어서,
    상기 비교세포는 정상 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 생물학적 시스템의 조절물질을 동정하는 방법에 있어서,
    (1) 제1 컴퓨터 시스템을 이용하여, 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 얻어진 제1데이터 세트와 제2데이터 세트로부터 제1인과관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 모델은 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포를 포함하며, 여기서 상기 제1데이터 세트는 상기 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내고 상기 제2데이터 세트는 상기 세포의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트 외에는 어떠한 공지의 생물학적 관계에 기초하지 않으며, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
    i) 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트에 기초하여 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
    ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
    iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;;
    (2) 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과 관계 네트워크 모델로부터 제2컴퓨터 시스템을 통해 차별적인 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계;
    (3) 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터 상기 생물학적 시스템 내에서 고유한 인과 관계를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통해 동정하는 단계, 여기서 상기 고유 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로 동정된다;를 포함하며
    이에 의해 상기 생물학적 시스템의 조절물질이 동정되는 방법.
32. 생물학적 시스템의 조절물질을 동정하는 방법에 있어서,
    (1) 제1컴퓨터 시스템을 통해, 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 생성된 제1인과관계 네트워크 모델을 제공하는 단계, 여기서 상기 모델은 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포를 포함하며, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
    i) 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
    ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
    iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;;
    (2) 제2컴퓨터 시스템을 통해, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과관계 네트워크 모델로부터 차별적 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계와;
    (3) 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터, 상기 생물학적 시스템 내의 고유한 인과 관계를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통해 동정하는 단계, 여기서 상기 고유 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 생물학적 시스템의 조절물질로 동정된다;를 포함하며
    이에 의해 상기 생물학적 시스템의 조절물질이 동정되는 방법.
33. 제32항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 생물학적 시스템을 위한 상기 모델로부터 얻어진 제1데이터 세트와 제2데이터 세트로부터 생성되고, 여기서, 상기 제1데이터 세트는 상기 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내고 상기 제2데이터 세트는 상기 세포의 기능활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트외에는 어떠한 공지의 생물학적 관계에 기초하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 질병 프로세스의 조절물질을 동정하는 방법에 있어서,
    (1) 제1 컴퓨터 시스템을 이용하여, 질병 모델로부터 얻어진 제1데이터 세트와 제2데이터 세트로부터 제1인과관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 질병 모델은 질병 연관된 세포를 포함하며, 여기서 상기 제1데이터 세트는 상기 질병 연관 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내고 상기 제2데이터 세트는 상기 질병 관련 세포 내의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트 외에는 어떠한 공지의 생물학적 관계에 기초하지 않으며, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
    i) 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트에 기초하여 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
    ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
    iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;;
    (2) 제2컴퓨터 시스템을 통하여, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과 관계 네트워크 모델로부터 차별적인 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계;
    (3) 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터 상기 질병 프로세스 내에서 고유한 인과 관계를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통하여 동정하는 단계, 여기서 고유 인과 관계와 연관되는 유전자는 상기 질병 프로세스의 조절물질로 동정된다;를 포함하며
    이에 의해 상기 질병 프로세스의 조절물질이 동정되는 방법.
35. 질병 프로세스의 조절물질을 동정하는 방법에 있어서,
    (1) 제1컴퓨터 시스템을 통하여, 상기 질병 프로세스를 위한 질병 모델로부터 생성된 제1인과관계 네트워크 모델을 제공하는 단계, 여기서 상기 질병 모델은 질병 연관된 세포를 포함하며, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계는,
    i) 네트워크 단편의 세트 내의 각 네트워크 단편에 대한 베이지안 확률 스코어를 결정하는 단계와;
    ii) 시험 네트워크의 앙상블을 생성하는 단계와, 여기서 각 시험 네트워크는 네트워크 단편의 세트의 다른 서브세트로부터 마련되고;
    iii) 합의된 관계 네트워크를 형성하는 진화된 시험 네트워크의 앙상블을 산출하는 지역 변환을 통해 각 시험 네트워크를 진화시키는 단계를 포함한다;;
    (2) 제2컴퓨터 시스템을 통하여, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델과 대조구 세포 데이터에 기초한 제2인과관계 네트워크 모델로부터 차별적 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계와;
    (3) 상기 차별적인 인과 관계 네트워크로부터, 상기 질병 프로세스 내의 고유한 인과 관계를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통해 동정하는 단계, 여기서 상기 고유 인과 관계와 연관된 유전자는 상기 질병 프로세스의 조절물질로 동정된다;를 포함하며
    이에 의해 상기 질병 프로세스의 조절물질이 동정되는 방법.
36. 제35항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 질병 프로세스를 위한 상기 질병 모델로부터 얻어진 제1데이터 세트와 제2데이터 세트로부터 생성되고, 여기서, 상기 제1데이터 세트는 상기 질병 관련 세포 내의 복수의 유전자의 발현 수준을 나타내고 상기 제2데이터 세트는 상기 질병 관련 세포의 기능활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1데이터 세트와 상기 제2데이터 세트 외에는 어떠한 공지의 생물학적 관계에 기초하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 삭제
38. 제1항, 제2항, 제31항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은,
    상기 제1컴퓨터 시스템을 통해, 상기 합의된 관계 네트워크 내에서의 각 관계의 지향성에 관한 정보를 얻기 위해 다른 노드에의 영향을 관찰하면서 상기 합의된 관계 네트워크 내의 각 노드에 시뮬레이션된 자극을 인가하는 단계와;
    상기 제1컴퓨터 시스템을 통해, 상기 제1인과 관계 네트워크 모델을 얻기 위해 상기 합의된 관계 네트워크에 각 관계의 지향성에 대한 얻어진 정보를 인가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 삭제
40. 제1항, 제2항, 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2컴퓨터 시스템을 이용하여, 상기 생성된 차별적인 인과 관계 네트워크의 그래픽적 표시를 디스플레이하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제1항, 제2항, 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생성된 차별적인 인과 관계 네트워크의 표시를 상기 제2컴퓨터 시스템에 접근가능한 저장장치에 상기 제2컴퓨터 시스템에 의해 저장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제1항, 제2항, 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 차별적인 인과관계네트워크는,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델에는 존재하나 상기 제2인과 관계 네트워크 모델에는 결여된 관계 또는 상기 제2인과 관계 네트워크 모델에는 존재하나 상기 제1인과 관계 네트워크 모델에는 결여된 관계 및
    상기 제2인과 관계 네트워크 모델 내에서보다 상기 제1인과 관계 네트워크 모델 내에서 정량적 파라미터 정보에서 하나 이상의 차이를 가지는 관계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제1항, 제2항, 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 차별적인 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계는,
    i) 상기 제1인과관계 네트워크 모델 및 상기 제2인과관계 네트워크 모델 중 선택된 하나 내에서의 두 개 노드 사이의 각 관계에 대하여, 다른 인과관계 네트워크 모델이 동일한 두 개 노드 사이의 관계를 포함하고 있는지를 판단하고, 상기 다른 인과관계 네트워크 모델이 동일한 두 개 노드 사이의 관계를 포함하고 있다면 다른 인과관계 네트워크 모델 내에서의 동일한 두 개 노드 사이 간의 관계가 상기 선택된 인과 관계 네트워크 모델에서 보다 정량적 파라미터 정보에서 하나 이상의 차이를 가지고 있는지를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통해 판단하는 단계;및
    ii) 상기 선택된 인과 관계 네트워크 모델에는 존재하고 상기 다른 인과 관계 네트워크 모델에는 결여된 상기 관계와 상기 제2인과 관계 네트워크 모델 내에서보다 상기 제1인과 관계 네트워크 모델 내에서 정량적 파라미터 정보에서 하나 이상의 차이를 가지는 상기 관계를 포함하는 상기 차별적인 인과 관계 네트워크를 상기 제2컴퓨터 시스템을 통해 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제42항에 있어서,
    상기 정량적 파라미터 정보에서 하나 이상의 차이는 상기 관계의 지향성 또는 상기 관계의 강도의 정량적 규모인 것을 특징으로 하는 방법.
    

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