KR102012675B1 - 베타-세크레타제(BACE)의 억제제로서 유용한 3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민 유도체 - Google Patents

베타-세크레타제(BACE)의 억제제로서 유용한 3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-부위 아밀로이드 절단 효소, BACE, BACE1, Asp2 또는 메맙신2(memapsin2)로도 알려진 베타-세크레타제의 억제제로서 신규 3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이와 같은 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 이와 같은 화합물 및 조성물을 제조하는 방법, 및 베타-세크레타제가 관여하는 장애, 예를 들어 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 노쇠(senility), 치매, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매의 예방 및 치료를 위한 상기 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
[화학식 I]

Description

베타-세크레타제(BACE)의 억제제로서 유용한 3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민 유도체{3,4-DIHYDRO-PYRROLO[1,2-a]PYRAZIN-1-YLAMINE DERIVATIVES USEFUL AS INHIBITORS OF BETA-SECRETASE(BACE)}
본 발명은 베타-부위 아밀로이드 절단 효소, BACE, BACE1, Asp2 또는 메맙신2(memapsin2)로도 알려진 베타-세크레타제의 억제제로서 신규 3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이와 같은 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 이와 같은 화합물 및 조성물을 제조하는 방법, 및 베타-세크레타제가 관여하는 장애, 예를 들어 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 노쇠(senility), 치매, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매의 예방 및 치료를 위한 상기 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(AD)은 노화와 관련된 신경변성 질환이다. AD 환자는 인지 결핍 및 기억 상실뿐만 아니라 불안과 같은 행동상의 문제를 겪는다. AD에 걸린 사람들의 90% 초과는 이 장애의 산발성 형태를 가지며, 이러한 사례 중 10% 미만은 가족성 또는 유전성이다. 미국에서 65세의 사람 10명 중 약 1 명이 AD를 가지며, 85세의 사람들은 매 2명 중 1명이AD에 걸린다. 초기 진단으로부터 평균 기대 수명은 7년 내지 10년이며, AD 환자는 매우 고비용의 노인 원호 생활 시설(assisted living facility)에서 또는 가족 구성원에 의해 광범위한 관리를 필요로 한다. 고령 인구수가 증가함에 따라, AD에 대한 의학적 관심이 증가하고 있다. AD에 현재 이용가능한 치료법은 단지 질환의 증상을 치료하는 것이며, 인지 특성을 개선하기 위해 아세틸콜린에스테라제 억제제를 포함할 뿐만 아니라, 이 병과 관련된 행동상의 문제를 제어하기 위해 항불안제 및 항정신병제도 포함한다.
AD 환자의 뇌에서 특징적인 병리학적 특성은 타우(tau) 단백질의 과인산화에 의해 생성되는 신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle) 및 베타-아밀로이드 1-42(Abeta 1-42) 펩티드의 응집에 의해 형성되는 아밀로이드 플라크이다. Abeta 1-42는 올리고머를 형성한 다음, 원섬유를 형성하고, 궁극적으로는 아밀로이드 플라크를 형성한다. 올리고머 및 원섬유는 특히 신경독성인 것으로 여겨지며, AD와 관련된 대부분의 신경학적 손상을 일으킬 수 있다. Abeta 1-42의 형성을 예방하는 제제는 AD 치료용 질환 조절제(disease-modifying agent)가 될 잠재성을 갖는다. Abeta 1-42는 770개의 아미노산으로 구성된 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 생성된다. Abeta 1-42의 N-말단이 베타-세크레타제(BACE)에 의해 절단된 다음, 감마-세크레타제가 C-말단을 절단한다. 감마-세크레타제는 Abeta 1-42 외에도 또한 주된 절단 생성물인 Abeta 1-40뿐만 아니라 Abeta 1-38 및 Abeta 1-43도 유리시킨다. 이러한 Abeta 형태들 또한 응집하여 올리고머 및 원섬유를 형성할 수 있다. 따라서, BACE의 억제제는 Abeta 1-42뿐만 아니라 Abeta 1-40, Abeta 1-38 및 Abeta 1-43의 형성도 예방할 것으로 예상이며, AD 치료에서 잠재적인 치료제가 될 것이다.
본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 호변이성체 또는 입체이성체 형태, 또는 이의 부가 염 또는 용매화물에 관한 것이며,
[화학식 I]
Figure 112013076880625-pct00001
상기 식에서,
R1, R2, R3은 독립적으로 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 수소, C1-3알킬, 메톡시메틸, C3-6사이클로알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 호모아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
X1, X2, X3, X4는 독립적으로 C(R5) 또는 N이되, 단 이들 중 2개 이하는 N을 나타내고; R5는 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 결합 또는 -NHCO-이고;
Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이며;
여기서 호모아릴은 페닐이거나 또는 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 치환된 페닐이고;
헤테로아릴은 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 피리다질, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 옥사졸릴 및 옥사디아졸릴(각각은 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실례로는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 상기 기술한 화합물 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물이 있다. 본 발명의 실례로는 상기 기술한 화합물 중 임의의 것과 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합함으로써 제조되는 약제학적 조성물이 있다. 본 발명의 실례로는 상기 기술한 화합물 중 임의의 것과 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 제조 방법이 있다.
본 발명의 예시에는 치료를 필요로 하는 개체에게 상기 기술한 화합물 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 베타-세크레타제 효소에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법이 있다.
본 발명의 추가의 예시에는 베타-세크레타제 효소의 억제를 필요로 하는 개체에게 상기 기술한 화합물 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 베타-세크레타제 효소를 억제하는 방법이 있다.
본 발명의 일례는 치료를 필요로 하는 개체에게 상기 기술한 화합물 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 노쇠, 치매, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 및 베타-아밀로이드 관련 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애, 바람직하게는 알츠하이머 질환을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 예는 치료를 필요로 하는 개체에게서 (a) 알츠하이머 질환, (b) 경증 인지 장애, (c) 노쇠, (d) 치매, (e) 루이 소체 치매, (f) 다운 증후군, (g) 뇌졸중 관련 치매, (h) 파킨슨 질환 관련 치매 및 (i) 베타-아밀로이드 관련 치매를 치료하는데 있어서 사용하기 위한 상기 기술한 화합물 중 임의의 것이다.
본 발명은 이상에서 정의된 화학식 I의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물에 관한 것이다. 화학식 I의 화합물은 베타-세크레타제 효소(베타-부위 절단 효소, BACE, BACE1, Asp2 또는 메맙신 2로도 알려짐)의 억제제이며, 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 노쇠, 치매, 뇌졸중 관련 치매, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 파킨슨 질환 관련 치매 및 베타-아밀로이드 관련 치매, 바람직하게는 알츠하이머 질환, 경도 인지 장애 또는 치매, 더 바람직하게는 알츠하이머 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 일 실시 형태에서, R1, R2, R3은 독립적으로 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는 수소, C1-3알킬, C3-6사이클로알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 호모아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
X1, X2, X3, X4는 독립적으로 C(R5) 또는 N이되, 단 이들 중 2개 이하는 N을 나타내고; R5는 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 결합 또는 -NHCO-이고;
Ar이 호모아릴 또는 헤테로아릴이며;
여기서 호모아릴은 페닐이거나 또는 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 치환된 페닐이고;
헤테로아릴은 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 피리다질, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 옥사졸릴 및 옥사디아졸릴(각각은 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
이의 부가 염 또는 용매화물이다.
본 발명의 일 실시 형태에서, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1 - 3알킬로부터 선택되고;
X1, X2, X3, X4는 독립적으로 C(R5)이며, 여기서 각각의 R5는 수소 및 할로로부터 선택되고;
L은 결합 또는 -NHCO-이며;
Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이고;
여기서 호모아릴은 페닐이거나 또는 할로, 시아노, C1 - 3알킬, C1 - 3알킬옥시 및 폴리할로-C1 - 3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 치환된 페닐이며;
헤테로아릴은 피리딜, 피리미딜 및 피라지닐(각각은 할로, 시아노, C1 - 3알킬, C1 - 3알킬옥시 및 폴리할로-C1 - 3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
이의 부가 염 또는 용매화물이다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에서, R1, R2 및 R3은 수소이고;
X1은 CF이며;
X2, X3, X4는 CH이고;
L은 결합 또는 -NHCO-이며; Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이고;
여기서 호모아릴은 클로로로 치환된 페닐이며;
헤테로아릴은 피리딜 및 피리미딜(각각은 클로로, 플루오로, 시아노, 메틸 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
이의 부가 염 또는 용매화물이다.
또 다른 실시 형태에서, R4로 치환된 탄소 원자는 R 배치를 갖는다.
본 발명의 일 실시 형태에서, R1 및 R3은 수소이고,
R2는 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이며;
R4는 메틸 또는 디플루오로메틸이고;
X1은 CH 또는 CF이며;
X2, X3 및 X4는 CH이고;
L은 -NHCO-이며;
Ar은 5-클로로피리딘-2-일, 5-시아노피리딘-2-일, 5-플루오로피리딘-2-일, 5-시아노-3-플루오로오로피리딘-2-일, 5-메톡시피라진-2-일 또는 1-디플루오로메틸피라졸-3-일이거나; 또는
이의 부가 염 또는 용매화물이다.
정의
“할로”는 플루오로, 클로로 및 브로모를 나타낼 것이고; “C1-3알킬”은 1개, 2개 또는 3개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 포화 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸, 1-프로필 및 2-프로필을 나타낼 것이며; “C1-3알킬옥시”는 C1-3알킬이 앞에 정의된 바와 같은 것인 에테르 라디칼을 나타낼 것이고; “모노할로C1-3알킬 및 폴리할로C1-3알킬”은 1개, 2개, 3개의 또는 가능한 경우 더 많은 앞에 정의된 바와 같은 할로 원자로 치환된, 앞에 정의된 바와 같은 C1-3알킬을 나타낼 것이며; “모노할로C1-3알킬옥시 및 폴리할로C1-3알킬옥시”는 모노할로C1-3알킬 및 폴리할로C1-3알킬이 앞에 정의된 바와 같은 것인 에테르 라디칼을 나타낼 것이고; “C3-6사이클로알킬”은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 나타낼 것이며; “C3-6사이클로알칸디일”은 사이클로프로판디일, 사이클로부탄디일, 사이클로펜탄디일 및 사이클로헥산디일과 같은 2가 라디칼을 나타낼 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체(subject)"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상이거나 또는 이들의 대상이 되어 왔던 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 사람을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 치료 중인 질환 또는 장애의 증상의 완화를 포함하는, 연구자, 수의사, 의학 박사 또는 기타 다른 임상의에 의해 추구되는 조직계, 동물 또는 사람에게서 생물학적 또는 의약적 반응을 이끌어내는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물"은 명시된 양의 명시된 성분들을 포함하는 생성물뿐만 아니라, 명시된 양의 명시된 성분들의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물도 포함하는 것으로 의도된다.
이상 및 이하에서, 용어 “화학식 I의 화합물”은 이의 부가 염, 용매화물 및 입체이성체를 포함하는 것으로 의미된다.
이상 또는 이하에서, 용어 “입체이성체” 또는 “입체화학적으로 이성체인 형태”는 상호교환가능하게 사용된다.
화학식 I의 화합물은 화학식 I-1의 화합물과 동적 평형 상태로 공존한다.
Figure 112013076880625-pct00002
본 발명은 순수한 입체이성체로서 또는 둘 이상의 입체이성체의 혼합물로서 화학식 I의 화합물의 모든 입체이성체를 포함한다.
거울상이성체는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 입체이성체이다. 한 쌍의 거울상이성체의 1:1 혼합물이 라세미체 또는 라세미 혼합물이다. 부분입체이성체(diastereomer 또는 diastereoisomer)는 거울상이성체가 아닌 입체이성체이며, 즉 이들은 거울상으로서 관련되어 있지 않다. 화합물이 이중 결합을 함유한다면, 치환체는 E 또는 Z 배치일 수 있다. 화합물이 이치환된 사이클로알킬 기를 함유한다면, 치환체는 시스 또는 트랜스 배치일 수 있다. 따라서, 본 발명은 거울상이성체, 부분입체이성체, 라세미체, E 이성체, Z 이성체, 시스 이성체, 트랜스 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
절대 배치는 칸-인골드-프렐로그 체계(Cahn-Ingold-Prelog system)에 따라 명시된다. 비대칭 원자에서의 배치는 R 또는 S에 의해 명시된다. 절대 배치가 알려지지 않은 분해된 화합물은 이들이 평면 편광을 회전시키는 방향에 따라 (+) 또는 (-)로 지정될 수 있다.
특정 입체이성체가 정해질 때, 이는 상기 입체이성체에 기타 다른 이성체가 실질적으로 없음을, 즉 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 더욱 더 바람직하게는 5% 미만, 특히 2% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 1% 미만으로 회합되어 있음을 의미한다. 따라서, 화학식 I의 화합물이, 예를 들어 (R)로 명시될 때, 이는 그 화합물에 (S) 이성체가 실질적으로 없음을 의미하고; 화학식 I의 화합물이, 예를 들어 E로 명시될 때, 이는 그 화합물에 Z 이성체가 실질적으로 없음을 의미하며; 화학식 I의 화합물이, 예를 들어 시스로 명시될 때, 이는 그 화합물에 트랜스 이성체가 실질적으로 없음을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물에 대한 결정질 형태 중 일부는 다형체로 존재할 수 있으며, 그러한 형태가 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 게다가, 본 발명의 화합물 중 일부는 물과 용매화물(즉, 수화물), 또는 일반적인 유기 용매와 용매화물을 형성할 수 있으며, 이와 같은 용매화물은 또한 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
의약으로 사용하기 위하여, 본 발명의 화합물의 염은 비독성 "약제학적으로 허용가능한 염"을 말한다. 그러나, 기타 다른 염이 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조에 유용할 수 있다. 화합물의 적합한 약제학적으로 허용가능한 염에는, 예를 들어 화합물의 용액을 염산, 황산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 탄산 또는 인산과 같은 약제학적으로 허용가능한 산의 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있는 산 부가 염이 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물이 산성 부분(acidic moiety)을 가질 경우, 이의 적합한 약제학적으로 허용가능한 염은 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염; 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 염; 및 적합한 유기 리간드와 함께 형성된 염, 예컨대 4차 암모늄 염을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염의 제조에 사용될 수 있는 대표적인 산은 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아실화 아미노산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, L-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, (+)-캄포르산, 캄포르설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시-에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, D-글루코론산, L-글루탐산, 베타-옥소-글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산, 락토비온산, 말레산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 석신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로메틸설폰산 및 운데실렌산을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용가능한 염의 제조에 사용될 수 있는 대표적인 염기는 암모니아, L-아르기닌, 베네타민, 벤자틴, 수산화칼슘, 콜린, 디메틸에탄올아민, 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)-에탄올, 에탄올아민, 에틸렌-디아민, N-메틸-글루카민, 하이드라바민, 1H-이미다졸, L-리신, 수산화마그네슘, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 피페라진, 수산화칼륨, 1-(2-하이드록시에틸)-피롤리딘, 2차 아민, 수산화나트륨, 트리에탄올아민, 트로메타민 및 수산화아연을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물의 화학명은 화학 초록 서비스(Chemical Abstracts Service)에 의해 동의된 명명 규칙에 따라 생성하였다.
A. 최종 화합물의 제조
실험 절차 1
화학식 I에 따른 최종 화합물은 열적 조건(예: 반응 혼합물을 60℃ 내지 90℃에서, 예를 들어 4시간 내지 100시간 동안 가열함) 하에서 적합한 반응 불활성 용매(예: 물 또는 메탄올) 중에서 수행되는 반응인 반응식 1에 따라 화학식 II의 중간 화합물을 암모니아의 적절한 공급원(예: 염화암모늄 또는 암모니아수)과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 반응식 1에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의된다.
[반응식 1]
Figure 112013076880625-pct00003

실험 절차 2
추가적으로, 화학식 I-a에 따른 최종 화합물(여기서, L은 -NHCO-임)은 열적 조건(예: 반응 혼합물을 25℃에서, 예를 들어 2시간 동안 가열함) 하에서 축합제(예: 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드)의 존재 하에 적합한 반응 불활성 용매(예: 디클로로메탄) 중에서 수행되는 반응인 반응식 2에 따라 화학식 III-a의 중간 화합물을 화학식 IV의 중간체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 반응식 2에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의된다.
[반응식 2]
Figure 112013076880625-pct00004

실험 절차 3
화학식 I-b에 따른 최종 화합물(여기서, L은 결합임)은 열적 조건(예: 반응 혼합물을 80℃에서, 예를 들어 20시간 동안 가열하거나, 또는 반응 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 150℃에서, 예를 들어 10분 내지 30분 동안 가열함) 하에서 적합한 염기(예: 탄산칼륨), Pd 착물 촉매(예: 테트라키스(트리페닐-포스핀)팔라듐(0))의 존재 하에 적합한 반응 불활성 용매 또는 불활성 용매의 혼합물(예: 1,4-디옥산/에탄올) 중에서 수행되는 반응인 반응식 3에 따라 화학식 III-b의 중간 화합물을 화학식 V의 중간체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 반응식 3에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의되고, W는 할로이다. R6 및 R7은 수소 또는 알킬일 수 있거나, 또는 이들은 함께, 예를 들어 화학식 -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- 또는 -C(CH3)2C(CH3)2-의 2가 라디칼을 형성할 수 있다.
[반응식 3]
Figure 112013076880625-pct00005

상술한 제조에서의 다수의 중간체 및 출발 물질은 상기 또는 유사한 화합물을 제조하는 당업계에 공지된(art-known) 방법에 따라 제조할 수 있는 공지된 화합물이며, 일부 중간체는 새로운 물질이다. 다수의 이와 같은 제조 방법을 이하에서 더 상세하게 설명할 것이다.
B. 중간 화합물의 제조
실험 절차 4
화학식 III-a에 따른 중간체는 반응식 4에 따라 당업계에 공지된 부흐발트-하르트위그(Buchwald-Hartwig) 유형 커플링 절차 및 이에 이어진 산성 가수분해에 따라 화학식 III-b의 상응하는 중간 화합물로부터 제조할 수 있다. 상기 커플링은 열적 조건(예: 반응 혼합물을 100℃에서, 예를 들어 2시간 동안 가열함) 하에서 적합한 염기(예: 나트륨 tert-부톡사이드), Pd 착물 촉매(예: 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0))의 존재 하에 적합한 반응 불활성 용매(예: 톨루엔) 중에서 화학식 III-b의 중간 화합물을 벤조페논 이민으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 이어서, 열적 조건(예: 25℃에서, 예를 들어 1시간 동안) 하에서 적합한 반응 불활성 용매(예: 이소프로필 알코올) 중에서 화학식 VI의 생성된 중간 화합물을 강산(예: 염산)으로 처리함으로써 화학식 III-a의 중간 화합물로 변환시킨다. 대안적으로, 화학식 III-a의 중간체는 열적 조건(예: 반응 혼합물을 110℃에서 25시간 동안 가열함) 하에서 반응 불활성 용매(예: DMSO) 중에서 아지드화나트륨, 구리를 위한 리간드(예: N, N' -디메틸-에틸렌디아민), 적합한 염기(예: 탄산나트륨)의 존재 하에 구리 촉매 커플링에 의해 화학식 III-b의 중간체로부터 출발하여 1단계로 수득할 수 있다. 반응식 4에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의되고, W는 할로이다.
[반응식 4]
Figure 112013076880625-pct00006

실험 절차 5
화학식 VII에 따른 중간체는 반응식 5에 따라 당업계에 공지된 니트로의 아미노로의 환원(nitro-to-amino reduction) 절차에 따라 화학식 VIII-c의 상응하는 중간체로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 환원은 수소 분위기 하에서 그리고 적절한 촉매(예: 차콜 상의 팔라듐)의 존재 하에 반응물을 교반하거나 이를 유동 반응기로 통과시킴으로써 수행할 수 있다. 적합한 용매는, 예를 들어 물, 알칸올(예: 메탄올, 에탄올 등), 에스테르(예: 에틸 아세테이트 등)이다. 상기 환원 반응의 속도를 향상시키기 위하여, 반응 혼합물의 온도 및/또는 압력을 상승시키는 것이 유리할 수 있다. 촉매 독(예: 티오펜 등)을 반응 혼합물에 첨가함으로써 반응물 및 반응 생성물 내의 특정 작용기의 원치 않는 추가의 수소화를 방지할 수 있다. 반응식 5에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의된다.
[반응식 5]
Figure 112013076880625-pct00007

실험 절차 6
화학식 III-a의 중간 화합물은 반응식 6에 따라 화학식 VII의 중간 화합물로부터 제조할 수 있다. 상기 전환은 편리하게 열적 조건(예: 반응 혼합물을 80℃에서, 예를 들어 72시간 동안 가열함) 하에서 상기 중간체를 암모니아 공급원(예: 염화암모늄 및 에탄올성 암모니아)으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 반응식 6에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의된다.
[반응식 6]
Figure 112013076880625-pct00008

실험 절차 7
화학식 IX의 중간체(여기서, L은 -NHCO-임)는 열적 조건(예: 반응 혼합물을 25℃에서, 예를 들어 3시간 동안 가열함) 하에서 축합제(예: 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드)의 존재 하에 적합한 반응 불활성 용매(예: 메탄올) 중에서 수행되는 반응인 반응식 7에 따라 화학식 VII의 중간 화합물을 화학식 IV의 중간체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 반응식 7에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의된다.
[반응식 7]
Figure 112013076880625-pct00009

실험 절차 8
화학식 III-b 및 III-c의 중간 화합물은 일반적으로 하기의 반응식 8 및 반응식 9에 나타낸 반응 단계에 따라 제조할 수 있다.
[반응식 8]
Figure 112013076880625-pct00010
A: 티오아미드의 아미딘으로의 전환
A': 메틸티오의 아미노로의 전환
B: 황의 메틸화
C: 아미드의 티오아미드로의 전환(티오화)
D: 환화
E: 임의의 N 보호기의 제거
상기 반응식 8에서의 아미딘 유도체는 편리하게 당업계에 공지된 티오아미드의 아미딘으로의 전환 절차에 따라 상응하는 티오아미드 유도체로부터 제조할 수 있다(반응 단계 A). 상기 전환은 편리하게는 열적 조건(예: 반응 혼합물을 60℃ 내지 90℃에서, 예를 들어 6시간 내지 100시간 동안 가열함) 하에서 적합한 반응 불활성 용매(예: 물 또는 메탄올 등) 중에서 상기 티오아미드를 암모니아 공급원(예: 염화암모늄 또는 암모니아수)으로 처리함으로써 수행할 수 있다. 유사한 조건 하에서, 또한 메틸화 중간체 VIII-b 및 중간체 VIII-c를 원하는 아미딘으로 전환시킬 수 있다(반응 단계 A'). 중간체 VIII-b 및 중간체 VIII-c는 편리하게 열적 조건(예: 실온에서 3시간 동안) 하에서 염기(예: 탄산칼륨) 및 메틸화제(예: 메틸 요오다이드)의 존재 하에, 적합한 용매(예: 아세톤) 중에 용해된 상응하는 티오아미드로부터 출발하여 제조할 수 있다(반응 단계 B).
상기 반응식 8에서의 티오아미드 유도체는 당업계에 공지된 티오화 절차에 따라 아미드 유도체로부터 제조할 수 있다(반응 단계 C). 상기 전환은 편리하게는 열적 조건(예: 반응 혼합물을 50℃ 내지 100℃에서, 예를 들어 24시간 동안 가열함) 하에서 적합한 염기(예: 피리딘)의 존재 하에 반응 불활성 용매(예: 테트라하이드로푸란 또는 1,4-디옥산 등) 중에서 상기 아미드를 티오화제(예: 오황화인 또는 2,4-비스-(4-메톡시-페닐)-1,3-디티아-2,4-디포스페탄 2,4-디설파이드[라웨슨 시약])로 처리함으로써 수행할 수 있다.
상기 반응식 8에서의 화학식 XI-b 및 화학식 XI-c의 아미드 유도체는 당업계에 공지된 환화 절차에 따라 화학식 XII-b 및 화학식 XII-c의 상응하는 중간 화합물로부터 제조할 수 있다(반응 단계 D). 상기 환화는 편리하게 55℃ 내지 100℃에서 반응의 완료를 보장하는 기간 동안 적합한 반응 용매(예: 에탄올 등) 중에서 화학식 XII-b 및 화학식 XII-c의 중간 화합물을 적합한 염기(예: 칼륨 아세테이트 또는 나트륨 메톡사이드)로 처리함으로써 수행할 수 있다.
상기 반응식 8에서의 화학식 XII-b 및 화학식 XII-c의 중간 화합물은 화학식 XIII-b 및 화학식 XII-c의 상응하는 중간 화합물로부터 당업계에 공지된 공정에 따라 보호기의 제거를 수행함으로써 제조할 수 있다.
실험 절차 9
[반응식 9]
Figure 112013076880625-pct00011
F: 알킬화
G: 옥사티아졸리딘 산화
H: 옥사티아졸리딘 형성
상기 반응식 9서 화학식 XIII-b및 화학식 XIII-c에 따른 중간체는 당업계에 공지된 알킬화 절차에 따라 화학식 XV-b및 화학식 XV-c의 상응하는 중간 화합물(여기서, Z1은 아민의 보호기(예: tert-부톡시카르보닐 기)임)로부터 제조할 수 있다(반응 단계 F). 상기 알킬화는 편리하게 저온(예: 0℃)에서 30분 동안, 그리고 나서 온화한 고온(예: 100℃)에서 24시간 내지 100시간 동안, 또는 예를 들어 반응 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 130℃에서, 예를 들어 30분 내지 45분 동안 가열하여, 적합한 불활성 용매(예: N,N-디메틸 포름아미드 또는 디메톡시설폭사이드) 중에서 적합한 염기(예: 탄산나트륨 또는 탄산세슘)의 존재 하에 XV-b XV-c를 각각 화학식 XIV의 상응하는 중간 화합물로 처리함으로써 수행할 수 있다.
상기 반응식 9에서 화학식 XV-b 및 화학식 XV-c에 따른 중간체는 당업계에 공지된 산화 절차에 따라 화학식 XVI-b 및 화학식 XVI-c의 중간 화합물을 반응시킴으로써 제조할 수 있다(반응 단계 G). 상기 산화는 편리하게 온화한 고온(예: 25℃)에서, 예를 들어 2시간 동안 염화루테늄(III)의 존재 하에 적합한 불활성 용매(예: 아세토니트릴/물) 중에서 화학식 XVI-b 및 화학식 XVI-c의 상응하는 중간 화합물을 산화제(예: 과요오드산나트륨)로 처리함으로써 수행할 수 있다.
상기 반응식 9에서의 화학식 XVI-b 및 화학식 XVI-c에 따른 중간체는 당업계에 공지된 설파미데이트 형성 절차에 따라 화학식 XVII-b 및 화학식 XVII-c의 중간 화합물을 반응시킴으로써 제조할 수 있다(반응 단계 H). 상기 변환은 편리하게 저온(예: -40℃)에서, 예를 들어 30분 동안, 그리고 나서 온화한 고온(예: 25℃)에서, 예를 들어 24시간 내지 72시간 동안 적합한 반응 불활성 용매(예: 아세토니트릴) 중에서 염기(예: 피리딘)의 존재 하에 화학식 XVII-b 및 화학식 XVII-c의 상응하는 중간 화합물을 염화티오닐로 처리함으로써 수행할 수 있다.
Z1이 아민의 보호기(예: tert-부톡시카르보닐 기)인 화학식 XVII-b 및 화학식 XVII-c의 중간 화합물은 일반적으로 문헌에 기재된 당업계에 공지된 스트레커(Strecker) 유형 절차에 따라 제조할 수 있다.
실험 절차 10
화학식 XVIII의 중간 화합물(여기서, Q는 할로 또는 니트로임)은 열적 조건(예: 25℃에서, 예를 들어 4일 동안) 하에서 메틸화제(예: 트리메틸-옥소늄 테트라플루오로보레이트)의 존재 하에 적합한 반응 불활성 용매(예: 디클로로메탄) 중에서 수행되는 반응인 반응식 14에 따라 화학식 XI-b 또는 화학식 XI-c의 중간 화합물로부터 제조할 수 있다. 이어서, 중간체 XVIII은 열적 조건(예: 반응 혼합물을 80℃에서, 예를 들어 36시간 동안 가열함) 하에서 암모니아 공급원(예: 염화암모늄 및 에탄올성 암모니아)과 반응시킴으로써 아미딘 III-b 및 아미딘 III-c로 추가로 전환시킬 수 있다. 반응식 10에서, 모든 변수는 화학식 I에서와 같이 정의되고, Q는 할로 또는 니트로이다.
[반응식 10]
Figure 112013076880625-pct00012
약리학
본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 BACE를 억제하며, 따라서 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애(MCI), 노쇠, 치매, 루이 소체 치매, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다발성 경색 치매, 다운 증후군, 파킨슨 질환 관련 치매 및 베타-아밀로이드 관련 치매의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 일반 화학식 I에 따른 화합물, 이의 입체이성체 형태 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염 또는 용매화물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 AD, MCI, 노쇠, 치매, 루이 소체 치매, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다발성 경색 치매, 다운 증후군, 파킨슨 질환 관련 치매 및 베타-아밀로이드 관련 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 병태(condition)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 일반 화학식 I에 따른 화합물, 이의 입체이성체 형태 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염 또는 용매화물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이상에서 언급된 질환 병태 중 임의의 하나의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서의 일반 화학식 I에 따른 화합물, 이의 입체이성체 형태 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 염기 부가 염 또는 용매화물의 용도에 관한 것이다.
화학식 I의 화합물의 유용성의 관점에서, 이상에서 언급된 질환 중 임의의 하나를 앓고 있는 온혈 동물(사람을 포함함)을 치료하는 방법 및 이상에서 언급된 질환 중 임의의 하나를 앓게 될 온혈 동물(사람을 포함함)을 예방하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 온혈 동물(사람을 포함함)에게 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성체 형태, 이의 약제학적으로 허용가능한 부가 염 또는 용매화물의 유효량을 투여, 즉 전신 또는 국소 투여, 바람직하게는 경구 투여하는 것을 포함한다.
치료방법은 또한 일일 1회 내지 4회 섭취의 요법(regimen)으로 활성 성분을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료방법에서, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게 투여 전에 제형화된다. 본원에서 이하에 기재되는 바와 같이, 익히 공지되고 용이하게 입수가능한 성분들을 사용하여 공지된 절차에 의해 적합한 약제학적 제형이 제조된다.
알츠하이머 질환 또는 이의 증상을 치료 또는 예방하기에 적합할 수 있는 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 병용 요법은 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 추가의 치료제를 함유하는 단일 약제학적 투약 제형을 투여하는 것뿐만 아니라, 화학식 I의 화합물 및 각각의 추가의 치료제를 그 자체의 별개의 약제학적 투약 제형으로 투여하는 것도 포함한다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물 및 치료제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투약 조성물로 함께 환자에게 투여할 수 있거나, 또는 각각의 제제를 별개의 경구 투약 제형으로 투여할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 베타-세크레타제의 억제가 유익한 질환, 예를 들어 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 노쇠, 치매, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 및 베타-아밀로이드 관련 치매를 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화학식 I에 따른 화합물의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
활성 성분은 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 그것을 약제학적 조성물로서 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 담체 또는 희석제는 조성물의 기타 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에 대해 유해하지 않다는 의미에서 “허용가능”해야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 제약 분야에서 익히 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 활성 성분으로서의 기본 형태 또는 부가 염 형태의 특정 화합물의 치료학적 유효량을 약제학적으로 허용가능한 담체와 친밀한 혼합물 형태로 배합하는데, 이때 상기 담체는 투여에 요구되는 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 바람직하게, 이들 약제학적 조성물은 바람직하게 경구, 경피 또는 비경구 투여와 같은 전신 투여에 적합하거나, 또는 흡입, 코 스프레이, 점안액을 통하거나 크림, 겔, 샴푸 등을 통한 국소 투여에 적합한 단일 투약형이다. 예를 들어, 조성물을 경구 투약형으로 제조시, 통상의 약제학적 매질 중 임의의 것이 사용될 수 있는데, 예를 들어 현탁액, 시럽, 엘릭서제 및 용액과 같은 경구 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알코올 등이거나, 또는 분말, 환제, 캡슐 및 정제의 경우에는 전분, 당, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 고체 담체이다. 투여 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구 투약 단위 형태를 나타내는데, 이 경우에 고체 약제학적 담체가 확실히 사용된다. 비경구 조성물의 경우, 담체는 통상적으로 멸균수를 적어도 아주 많이 포함하겠지만, 예를 들어 용해성을 돕기 위해 기타 다른 성분이 포함될 수 있다. 예를 들어, 담체가 식염수 용액, 글루코스 용액 또는 식염수 및 글루코스 용액의 혼합물을 포함하는 주사용 용액을 제조할 수 있다. 주사용 현탁액을 또한 제조할 수 있는데, 이 경우에는 적절한 액체 담체, 현탁화제 등이 사용될 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물에서, 담체는 임의로 침투 향상제 및/또는 적합한 습윤제를 포함하는데, 이때 이들은 임의로 작은 비율의 임의의 성질의 적합한 첨가제와 배합되며, 이 첨가제는 피부에 대해 어떠한 상당한 해로운 효과도 일으키지 않는다. 상기 첨가제는 피부에 대한 투여를 용이하게 할 수 있고/있거나 원하는 조성물을 제조하는 데 도움이 될 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방법으로, 예를 들어 경피 패치로서, 스폿-온(spot-on)으로서, 또는 연고로서 투여할 수 있다.
상기 언급된 약제학적 조성물을 투여 용이성 및 투약의 균일성을 위하여 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원의 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 투약 단위 형태는 단일 투약형으로서 적합한 물리적 개별 단위를 말하는데, 이때 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 성분을 함유한다. 이와 같은 투약 단위 형태의 예는 정제(스코링 또는 코팅된 정제를 포함함), 캡슐, 환제, 분말 패킷, 웨이퍼, 주사용 용액 또는 현탁액, 차 스푼으로 하나의 양(teaspoonful), 큰 스푼으로 하나의 양(tablespoonful) 등, 및 이들의 분리된 다중 회분(segregated multiple)이다.
투여의 정확한 투약 및 빈도는 사용되는 화학식 I의 특정 화합물, 치료될 특정 병태, 치료될 병태의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중, 성별, 장애의 범위 및 일반적인 신체적 상태뿐만 아니라 개인이 취하고 있을 수 있는 기타 다른 투약물에 좌우되며, 이는 당업자에게 익히 공지된 바와 같다. 더욱이, 상기 일일 유효량은 치료되는 개체의 반응에 따라 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 따라 감소 또는 증가될 수 있음이 명백하다.
투여 방식에 따라, 약제학적 조성물은 0.05중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%의 활성 성분, 및 1중량% 내지 99.95중량%, 바람직하게는 30중량% 내지 99.9중량%, 더 바람직하게는 50중량% 내지 99.9중량%의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 것이며, 모든 백분율은 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.
본 발명의 화합물은 경구, 경피 또는 비경구 투여와 같은 전신 투여; 또는 흡입, 코 스프레이, 점안액을 통하거나 크림, 겔, 샴푸 등을 통한 국소 투여에 사용할 수 있다. 화합물은 바람직하게 경구 투여된다. 투여의 정확한 투약 및 빈도는 사용되는 화학식 I의 특정 화합물, 치료될 특정 병태, 치료될 병태의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중, 성별, 장애의 범위 및 일반적인 신체적 상태뿐만 아니라 개인이 취하고 있을 수 있는 기타 다른 투약물에 좌우되며, 이는 당업자에게 익히 공지된 바와 같다. 더욱이, 상기 일일 유효량은 치료되는 개체의 반응에 따라 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 따라 감소 또는 증가될 수 있음이 명백하다.
단일 투약형을 생성하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 화학식 I의 화합물의 양은 치료되는 질환, 포유류 종 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 그러나, 일반적 지침으로서 본 발명의 화합물에 적합한 단위 용량은, 예를 들어 바람직하게 0.1mg 내지 약 1000mg의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 바람직한 단위 용량은 1mg 내지 약 500mg이다. 더 바람직한 단위 용량은 1mg 내지 약 300mg이다. 더욱 더 바람직한 단위 용량은 1mg 내지 약 100mg이다. 이와 같은 단위 용량은 70kg 성인에 대한 총 투여량이 투여당 개체의 체중 1kg당 0.001mg 내지 약 15mg의 범위에 있도록 일일 1회 초과, 예를 들어 일일 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회로 투여될 수 있지만, 바람직하게는 일일 1회 또는 2회이다. 바람직한 투약량은 투여당 개체의 체중 1kg당 0.01mg 내지 약 1.5mg이며, 이와 같은 요법은 수 주 또는 수 개월, 그리고 일부 경우에는 수 년 동안 연장될 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준이 사용되는 특정 화합물의 활성; 치료될 개인의 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성별 및 식이; 투여 시기 및 경로; 배설률; 이전에 투여해 온 기타 다른 약물; 및 치료를 받고 있는 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것임을 이해할 것이며, 이는 당업자가 잘 이해하고 있는 바와 같다.
당업자에게 명백한 바와 같이 일부 경우에는 이들 범위 밖의 투약량을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 또한, 임상의 또는 치료 의사는 개별 환자 반응과의 연관하에 치료법을 시작, 중단, 조정 또는 종료하는 방법 및 시기를 알 것임을 주목한다.
하기의 실시예는 본 발명의 범주를 예시하고자 하지만 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실험 부분
이하, 용어 “AcOH”는 아세트산을 의미하고, “AcOEt”는 에틸 아세테이트를 의미하며, “DCM”은 디클로로메탄을 의미하고, “DIPE”는 디이소프로필에테르를 의미하며, “DMF”는 N,N-디메틸포름아미드를 의미하고, “DMSO”는 디메틸설폭사이드를 의미하며, “Et2O”는 디에틸에테르를 의미하고, “Et3N”은 트리에틸아민을 의미하며, “EtOH”는 에탄올을 의미하고, “MeCN”은 아세토니트릴을 의미하며, “DCE”는 1,2-디클로로에탄을 의미하고, “MeOH”는 메탄올을 의미하며, “m.p.”는 융점을 의미하고, “rac”는 라세미 화합물을 의미하며, “Rt”는 체류 시간을 의미하고, “THF”는 테트라하이드로푸란을 의미하며, “K2CO3”는 탄산칼륨을 의미하고, “NH3”는 암모니아를 의미하며, “NH4Cl”은 염화암모늄을 의미하고, “HCl”은 염산을 의미하며, “Na2SO4”는 황산나트륨을 의미하고, “NaHCO3”는 중탄산나트륨을 의미하며, “KHSO4”는 황산수소칼륨을 의미하고, “MgSO4”는 황산마그네슘을 의미하며, “H2O”는 물을 의미하고, “TFA”는 트리플루오로아세트산을 의미하며, “sat.”는 포화를 의미하고, “aq.”는 수성을 의미하며, “min”은 분을 의미하고, “Pd2(dba)3”는 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)을 의미하며, “Pd(PPh3)4”는 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 의미하고, “BINAP”는 2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-바이나프틸을 의미하며, “TBAF”는 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 의미하고, “NaH”는 수소화나트륨을 의미하며, “DDQ”는 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논을 의미하고, “DBU”는 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔을 의미한다.
마이크로파 보조 반응(microwave assisted reaction)은 단일 모드 반응기, EmrysTM 옵티마이저(Optimizer) 마이크로파 반응기(Personal Chemistry A.B., 현재는 Biotage) 내에서 수행하였다.
수소화 반응은 ThalesNano Nanotechnology Inc.로부터의 연속 유동 수소화기 H-CUBE® 내에서 수행하였다.
박층 크로마토그래피(TLC)는 시약 등급 용매를 사용하는 실리카 겔 60 F254 플레이트(Merck) 상에서 수행하였다. 개방 컬럼 크로마토그래피는 표준 기술 하에서 실리카 겔(입자 크기 60Å, 메시 = 230 내지 400)(Merck) 상에서 수행하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피는 Merck로부터의 바로 접속가능한 카트리지를 사용하여, Armen Instrument로부터의 SPOT 또는 LAFLASH 시스템 상에서의 불규칙한 실리카 겔(입자 크기 15μm 내지 40μm)(정상층 일회용 플래시 컬럼) 상에서 수행하였다.
선광도(optical rotation)는 나트륨 램프를 이용하여 Perkin-Elmer 341 편광계 상에서 측정하고 다음과 같이 기록하였다: [α]°(λ, c g/100ml, 용매, T℃).
A. 중간체의 제조
실시예 A1
중간체 A1의 제조
Figure 112013076880625-pct00013
트리메틸실릴시아나이드(20g, 200mmol)를 NH3/MeOH(400mL) 중 3-브로모-아세토페논(20g, 100mmol) 및 NH4Cl(11g, 200mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4일 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 중에서 증발시키고 잔류물을 AcOEt(100mL) 중에 흡수시켰다. 고형물을 여과해내고, 여과액을 진공 중에서 증발시켜 중간체 A1(20g, 86% 수율)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A2
중간체 A2의 제조:
Figure 112013076880625-pct00014
중간체 A1(20g, 88.9mmol)을 HCl/MeOH(500mL) 중에 용해시켰다. 이 혼합물을 4일 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시킨 후, AcOEt(100mL) 및 H2O(100mL)를 첨가하고, 이 혼합물을 AcOEt(2 x 100mL)로 추출하였다. 합한 수성층을 NH3 수용액을 사용하여 pH = 8로 염기성화하고 AcOEt(5 x 100mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하며, 용매를 진공 중에서 증발시켜 오일로서 중간체 A2(10.6g, 46% 수율)를 수득하였다.
실시예 A1 및 실시예 A2에 기재된 합성 절차에 따라 하기의 중간체를 제조하였다:
실시예 A3
중간체 A3의 제조:
Figure 112013076880625-pct00015
rac-2-아미노-2-(3-니트로-페닐)-프로피오니트릴로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 석유 에테르 중의 AcOEt, 1/10로부터 1/4까지)를 행하여 중간체 3(63% 수율)을 수득하였다.
실시예 A4
중간체 A4의 제조:
Figure 112013076880625-pct00016
수소화알루미늄리튬(THF 중 1M; 22mL, 22mmol)을 -15℃에서 THF(200mL) 중 중간체 A2(7.5g, 29.1mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 1시간 동안 서서히 0℃로 가온되게 두었다. 추가 THF(150mL)를 첨가하고, Na2SO4의 포화 용액을 더 이상의 수소가 형성되지 않을 때까지 적가하였다. 무수 Na2SO4를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반되게 하였다. 이 혼합물을 규조토 상에서 여과하고, THF로 세척하며, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조(crude) 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 NH3의 7M 용액, 0/100으로부터 3/97까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 오일로서 중간체 A4(5.70g, 85% 수율)를 수득하였다.
실시예 A5
중간체 A5의 제조:
Figure 112013076880625-pct00017
수소화붕소나트륨(16.3g, 429.4mmol)을 MeOH(500mL) 중 중간체 A3(48.3g, 214.7mmol)의 교반 용액에 일부씩 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 NaHCO3의 포화 수용액을 사용하여 pH = 9가 될 때까지 염기성화하고, AcOEt(3 x 200mL)로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하며, 용매를 진공 중에서 증발시켜 중간체 A5(30.26g, 72% 수율)를 수득하였다.
실시예 A6
중간체 A6의 제조:
Figure 112013076880625-pct00018
벤조일 클로라이드(4.66mL, 32.6mmol)를 0℃에서 포화 NaHCO3(10mL) 및 THF(10mL)의 혼합물 중 중간체 A4(5g, 21.73mmol)의 교반 용액에 일부씩 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 10분 동안 그리고 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 얼음/H2O 조(bath) 중에서 냉각시키고, KHSO4를 사용하여 pH = 1 내지 2로 교반하면서 산성화하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 AcOEt로 추가로 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 20/80까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 무색 오일로서 중간체 A6(7.8g, 98% 수율)을 수득하였다.
실시예 A7
중간체 A7의 제조:
Figure 112013076880625-pct00019
건조 MeCN(20mL) 중 중간체 A6(8g, 21.9mmol)의 용액을 질소 분위기 하에서, -40℃로 냉각된 건조 MeCN(100mL) 중 염화티오닐(4.01mL, 54.9mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 피리딘(8.84mL, 109.8mmol)을 첨가하기 전에 반응 혼합물을 -40℃에서 60분 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고 14시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 Et2O로 처리하고, 고형물을 여과해내며, 여과액을 진공 중에서 농축시켜 담황색 오일로서 중간체 A7(8g, 89% 수율)을 수득하였다. 이 생성물을 추가 정제 없이 그 다음 반응에 사용하였다.
실시예 A8
중간체 A8의 제조:
Figure 112013076880625-pct00020
염화루테늄(III)(41mg, 0.195mmol)을 0℃에서 MeCN/H2O(1:1)(210mL) 중 중간체 A7(8g, 19.5mmol)의 혼합물에 첨가한 후, 과요오드산나트륨(6.26g, 29.25mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 AcOEt로 희석하고, 규조토를 통해 여과하며, AcOEt로 세척하였다. H2O 및 AcOEt를 여과액에 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 담황색 오일로서 중간체 A8(8g, 96% 수율)을 수득하였다.
실시예 A9
중간체 A9의 제조:
Figure 112013076880625-pct00021
디-tert-부틸디카르보네이트(10g, 45.87mmol)를 0℃에서 포화 NaHCO3(50mL) 및 THF(50mL)의 혼합물 중 중간체 A5(3g, 15.29mmol)의 교반 용액에 일부씩 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 10분 동안 그리고 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 얼음/H2O 조 중에서 냉각시키고, KHSO4를 사용하여 pH = 1 내지 2로 교반하면서 산성화하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 AcOEt로 추가로 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 100/0까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 담황색 오일로서 중간체 A6(4.5g, 99% 수율)을 수득하였으며, 이때 이 오일은 방치시에 고화하였다.
실시예 A10
중간체 A10의 제조:
Figure 112013076880625-pct00022
건조 MeCN(20mL) 중 중간체 A9(4.5g, 15.18mmol)의 용액을 질소 분위기 하에서, -40℃로 냉각된 건조 MeCN(80mL) 중 염화티오닐(2.771mL, 37.96mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 피리딘(6.12mL, 75.93mmol)을 첨가하기 전에 반응 혼합물을 -40℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 Et2O로 처리하였다. 고형물을 여과해내고, 여과액을 진공 중에서 농축시켜 오일로서 중간체 A10(4.8g, 92% 수율)을 수득하였다. 이 생성물을 추가 정제 없이 그 다음 반응에 사용하였다.
실시예 A11
중간체 A11의 제조:
Figure 112013076880625-pct00023
염화루테늄(III)(29.5mg, 0.14mmol)을 0℃에서 MeCN/H2O(1:1)(100mL) 중 중간체 A10(4.8g, 14.02mmol)의 혼합물에 첨가한 후, 과요오드산나트륨(4.5g, 21.03mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 AcOEt로 희석하고, 규조토를 통해 여과하며, AcOEt로 세척하였다. H2O 및 염수를 여과액에 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 담황색 오일로서 중간체 A11(4.9g, 97% 수율)을 수득하였다.
실시예 A9 내지 실시예 A11에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A12를 제조하였다:
실시예 A12
중간체 A12 (R)-[3-(tert-부틸옥시카르보닐)-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-메틸-[1,1,3]옥사티아졸리딘-2,2-디옥사이드의 제조
Figure 112013076880625-pct00024
(R)-[3-(tert-부틸옥시카르보닐)-4-(5-브로모-2-플루오로페닐)-4-메틸-[1,1,3]옥사티아졸리딘-2-옥사이드(14.5g, 36.79mmol)로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)를 행하여 백색 고형물로서 중간체 A12(11.6g, 77% 수율)를 수득하였다.
실시예 A13
중간체 A13의 제조:
Figure 112013076880625-pct00025
탄산세슘(3.06g, 9.83mmol)을 실온에서 MeCN(16mL) 중 중간체 A8(2g, 4.69mmol) 및 1H-피롤-2-카르복실산 에틸 에스테르(763mg, 6.1mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 130℃에서 30분 동안 가열하였다. 이 혼합물을 DCM으로 희석하고, H2O로 세척하였다. 유기상을 분리하고, H2O(10mL)로 처리하며, DCM(2 x 10mL)으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 무색 오일로서 중간체 A13(1.7g, 77% 수율)을 수득하였다.
실시예 A14
중간체 A14의 제조:
Figure 112013076880625-pct00026
삼불화붕소-디에틸 에테레이트(4.53mL, 36.1mmol)를 밀봉관 내에서 0℃에서 중간체 A13(1.7g, 3.61mmol)에 첨가한 후, 에탄티올(8.01mL, 108.2mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온되게 하고, 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM 중에 용해시키며, 포화 NaHCO3로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 50/50까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 무색 오일로서 중간체 A14(950mg, 78% 수율)를 수득하였다.
실시예 A15
중간체 A15의 제조:
Figure 112013076880625-pct00027
MeOH 중 나트륨 메톡사이드 25중량%(1.284mL, 5.36mmol)를 실온에서 MeOH(8mL) 중 중간체 A14(950mg, 2.82mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 55℃에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 NH4Cl의 포화 수용액으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 백색 고형물로서 중간체 A15(850mg, 99% 수율)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A16
중간체 A16의 제조:
Figure 112013076880625-pct00028
오황화인(940mg, 4.23mmol)을 피리딘(7mL) 중 중간체 A15(860mg, 2.82mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 110℃에서 38시간 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 조 생성물을 짧은 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 100/0까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 황색 고형물로서 중간체 A16(830mg, 92% 수율)을 수득하였다.
실시예 A17
중간체 A17의 제조:
Figure 112013076880625-pct00029
메틸 요오다이드(0.267mL, 4.296mmol) 및 K2CO3(0.59g, 4.296mmol)를 아세톤(10mL) 중 중간체 A16(690mg, 2.15mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 조 생성물을 DCM(25mL) 및 H2O(25mL) 중에 흡수시켰다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 50/50까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 담황색 고형물로서 중간체 A17(700mg, 97% 수율)을 수득하였다.
실시예 A18
중간체 A18의 제조:
Figure 112013076880625-pct00030
NH4Cl(447mg, 8.35mmol)을 EtOH 중 NH3의 2M 용액(39.67mL, 79.34mmol) 중 중간체 A17(700mg, 2.09mmol)의 현탁액에 첨가하고, 이 혼합물을 90℃에서 24시간 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 EtOH 중 NH3의 2M 용액(20mL, 40mmol) 중에 현탁시켰다. NH4Cl(447mg, 8.35mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 90℃에서 2일 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM에 현탁시키며, H2O로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; MeOH 중 NH3의 7M 용액/DCM, 0/100으로부터 20/80까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 담황색 고형물로서 중간체 A18(550mg, 86% 수율)을 수득하였다.
실시예 A19
중간체 A19의 제조:
Figure 112013076880625-pct00031
탄산세슘(2.73g, 8.37mmol)을 MeCN(16mL) 중 중간체 A11(1.5g, 4.186mmol) 및 1H-피롤-2-카르복실산 에틸 에스테르(681mg, 5.441mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 130℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 수성 HCl(1N)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 무색 오일로서 중간체 A19(1.5g, 89% 수율)를 수득하였다.
실시예 A20
중간체 A20의 제조:
Figure 112013076880625-pct00032
HCl(9.295mL, 37.181mmol, 1,4-디옥산 중 4M)을 중간체 A19(1.5g, 3.718mmol)에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM 중에 현탁시키며, NaHCO3의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 중간체 A20(1.1g, 97% 수율)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 반응 단계에 사용하였다.
실시예 A21
중간체 A21의 제조:
Figure 112013076880625-pct00033
MeOH 중 나트륨 메톡사이드 25중량%(0.909mL, 3.99mmol)를 실온에서 MeOH(10mL) 중 중간체 A20(1.1g, 3.63mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 NH4Cl의 포화 수용액으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; AcOEt)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시키며, 생성된 잔류물을 DIPE와 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 중간체 A21(650g, 66% 수율)을 수득하였다.
실시예 A22
중간체 A22의 제조:
Figure 112013076880625-pct00034
오황화인(799mg, 3.59mmol)을 피리딘(10mL) 중 중간체 A21(650mg, 2.4mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 조 생성물을 짧은 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 100/0까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 황색 고형물로서 중간체 A22(535mg, 78% 수율)를 수득하였다.
실시예 A23
중간체 A23의 제조:
Figure 112013076880625-pct00035
메틸 요오다이드(0.232mL, 3.724mmol) 및 K2CO3(0.515g, 3.724mmol)를 아세톤(10mL) 중 중간체 A22(535mg, 1.86mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 조 생성물을 DCM(25mL) 및 H2O(25mL) 중에 흡수시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 DCM(3 x 25mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하며, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 50/50까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 담황색 고형물로서 중간체 A23(490mg, 87% 수율)을 수득하였다.
실시예 A24
중간체 A24의 제조:
Figure 112013076880625-pct00036
EtOH(28mL) 중 중간체 A23(490mg, 1.626mmol)의 용액을 H-Cube 반응기(1mL/분, 30mm Pd/C 5% 카트리지, 전체 H2 모드, 실온, 2 사이클수) 내에서 수소화하였다. 이어서, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7M NH3, 0/100으로부터 10/90까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 무색 오일로서 중간체 A24(100mg, 23% 수율)를 수득하였다.
실시예 A25
중간체 A25의 제조:
Figure 112013076880625-pct00037
NH4Cl(78.8mg, 1.474mmol)을 EtOH 중 NH3의 2M 용액(7mL, 14mmol) 중 중간체 A24(100mg, 0.368mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 80℃에서 3일 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM 중에 현탁시키며, H2O로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; MeOH 중 NH3의 7M 용액/DCM, 0/100으로부터 20/80까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 담황색 고형물로서 중간체 A25(80mg, 90% 수율)를 수득하였다.
실시예 A26
중간체 A26의 제조:
Figure 112013076880625-pct00038
5-클로로-피리딘-2-카르복실산(172mg, 1.09mmol)을 MeOH(5mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(330mg, 1.19mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(5mL) 중 중간체 A24(270mg, 0.995mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헵탄 중의 AcOEt, 50/50)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 백색 고형물로서 중간체 A26(200mg, 49% 수율)을 수득하였다.
실시예 A27
중간체 A27의 제조:
Figure 112013076880625-pct00039
탄산세슘(18.27g, 56.06mmol)을 실온에서 MeCN(40mL) 중 중간체 A12(11.5g, 28.01mmol) 및 1H-피롤-2-카르복실산 에틸 에스테르(4.56g, 36.44mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고 나서, 이를 마이크로파 조사 하에서 130℃에서 30분 동안 가열하였다. 이 혼합물을 DCM으로 희석하고, H2O로 세척하였다. 유기상을 건조시키고(Na2SO4), 여과하며, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM/헵탄, 90/10)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 끈적끈적한 고형물로서 중간체 A27(10.7g, 83% 수율)을 수득하였다.
실시예 A28
중간체 A28의 제조:
Figure 112013076880625-pct00040
HCl(15mL, 60mmol, 1,4-디옥산 중 4M)을 중간체 A27(9.5g, 20.864mmol)에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켜 중간체 A28(10g, 불순물이 섞임, 122% 수율)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 반응 단계에 사용하였다.
실시예 A29
중간체 A29의 제조:
Figure 112013076880625-pct00041
MeOH 중 나트륨 메톡사이드 25중량%(15.714mL, 68.93mmol)를 실온에서 MeOH(30mL) 중 중간체 A28(950mg, 2.82mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 60℃에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 잔류물을 NH4Cl의 포화 수용액으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 AcOEt, 0/100으로부터 20/80까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 백색 고형물로서 중간체 A29(1.5g, 18% 수율)를 수득하였다.
실시예 A30
중간체 A30의 제조:
Figure 112013076880625-pct00042
트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트(2.56g, 17.33mmol)를 실온에서 DCM(5mL) 중 중간체 A29(1.4g, 4.33mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 희석하고 나서, NaHCO3의 차가운 포화 수용액으로 처리하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 황백색(off-white) 고형물로서 중간체 A30(910mg, 62% 수율)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 반응 단계에 사용하였다.
실시예 A31
중간체 A31의 제조:
Figure 112013076880625-pct00043
NH4Cl(577mg, 10.79mmol)을 EtOH 중 NH3의 2M 용액(5mL, 10mmol) 중 중간체 A30(910mg, 2.7mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 밀봉관 내에 넣고 80℃에서 36시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, NH4Cl(432mg, 8.1mmol) 및 EtOH 중 NH3의 2M 용액(5mL, 10mmol)을 첨가하며, 이 혼합물을 밀봉관 내에 넣고 80℃에서 36시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, NH4Cl(432mg, 8.1mmol) 및 EtOH 중 NH3의 2M 용액(5mL, 10mmol)을 첨가하며, 이 혼합물을 밀봉관 내에 넣고 80℃에서 48시간 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM에 현탁시키며, H2O(4mL 내지 5mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성된 조 생성물을 DCM 중에 흡수시키고, 침전된 고형물을 여과해내어 백색 고형물로서 중간체 A31(458mg, 53% 수율)을 수득하였다.
실시예 A32
중간체 A32의 제조:
Figure 112013076880625-pct00044
나트륨 tert-부톡사이드(0.329g, 3.43mmol)를 톨루엔(8.7mL) 중 중간체 A31(0.41g, 1.143mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반하고 나서, rac-BINAP(0.213g, 0.343mmol) 및 Pd2(dba)3(105mg, 0.114mmol)를 실온에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 이 혼합물을 수 분 동안 질소로 플러싱하고 나서, 벤조페논 이민(0.383mL, 2.286mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 이 혼합물을 H2O로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 NH3의 7M 용액, 0/100으로부터 50/50까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 조 물질을 수득하였으며, 이를 HCl(6mL, 36mmol, 이소프로필 알코올 중 6M) 중에 용해시키고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 DCM 중에 흡수시키고, 이소프로필 알코올 및 고체 NaHCO3를 첨가하며, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 고형물을 여과해내고, 여과액을 진공 중에서 증발시켜 끈적끈적한 오일로서 중간체 A32(400mg, 136% 수율)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 반응 단계에 사용하였다.
실시예 A33
중간체 A33의 제조:
Figure 112013076880625-pct00045
MeCN(150mL) 중 중간체 A12(7.5g, 18.281mmol) 및 메틸 4-플루오로-1H-피롤-2-카르복실레이트(2.9g, 20.263mmol)의 혼합물에 실온에서 DBU(5.5mL, 36.814mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 용매를 거의 증발시키고, 잔류물을 DCM 중에 용해시키며, 0.5M HCl로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 DCM(100mL) 중에 용해시키고, TFA(15mL)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 이 혼합물을 포화 Na2CO3를 사용하여 염기성화하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 1/99까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 황백색 고형물로서 중간체 A33(4.78g, 70% 수율)을 수득하였다.
실시예 A34
중간체 A34의 제조:
Figure 112013076880625-pct00046
실시예 A15에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A33으로부터 중간체 34를 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 1/99까지)를 행하여 황백색 고형물로서 중간체 A34(4.3g, 98% 수율)를 수득하였다.
실시예 A35
중간체 A35의 제조:
Figure 112013076880625-pct00047
오황화인(14g, 63.021mmol)을 THF(150mL) 중 중간체 A34(4.3g, 12.604mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 70℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고, THF로 세척하였다. 여과액을 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 담황색 고형물로서 중간체 A35(3.65g, 81% 수율)를 수득하였다.
실시예 A36
중간체 A36의 제조:
Figure 112013076880625-pct00048
tert-부틸하이드로퍼옥사이드(70%, 5.406mL, 38mmol)를 MeOH 중 7N NH3(40mL) 중 중간체 35(1.350g, 3.779mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 부분 증발시키고, 잔류물을 DCM으로 처리하며, 희석된 Na2CO3 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 NH3의 7M 용액, 0/100으로부터 2/98까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 황색 고형물로서 중간체 A36(990mg, 77% 수율)을 수득하였다.
실시예 A37
중간체 A37의 제조:
Figure 112013076880625-pct00049
톨루엔(20mL)을 실온에서 질소 하에서 중간체 A36(400mg, 1.176mmol), Pd2(dba)3(0.108g, 0.118mmol), BINAP(0.22g, 0.353mmol) 및 나트륨 tert-부톡사이드(0.203g, 2.177mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 수 분 동안 질소로 플러싱하고 나서, 벤조페논 이민(0.359mL, 2.352mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 이 혼합물을 H2O로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 1/99까지 5/95까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 황색 포말로서 중간체 A37(440mg, 85% 수율)을 수득하였다.
실시예 A38
중간체 A38의 제조:
Figure 112013076880625-pct00050
HCl(H2O 중 37%; 500μL, 16.182mmol)을 이소프로판올(20mL) 중 중간체 A37(920mg, 2.089mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고 나서, 진공 중에서 농축시키고, 이소프로판올의 25mL 중에 재용해시켰다. 이어서, NaHCO3를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 여과하고, 여과액을 진공 중에서 농축시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 1/99로부터 10/90까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 황백색 포말로서 중간체 A38(470mg, 81% 수율)을 수득하였다.
실시예 A39
중간체 A39의 제조:
Figure 112013076880625-pct00051
염화옥살릴(5.175mL, 61.16mmol)을 질소 분위기 하에서 -78℃에서 DCM(103mL) 중 DMSO(4.668mL, 65.2mmol)의 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, N-boc-트랜스-4-하이드록시-l-프롤린 메틸 에스테르(10g, 40.77mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 -40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, Et3N(17mL, 122mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온으로 서서히 가온되게 하고 밤새 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 10% 시트르산 용액으로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하며, 진공 중에서 농축시켜 갈색 오일로서 중간체 A39(10g)를 수득하였다. 이 조 물질을 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A40
중간체 A40의 제조:
Figure 112013076880625-pct00052
(트리플루오로메틸)트리메틸실란(8.768g, 61.663mmol)을 0℃에서 THF(114mL) 중 중간체 A39(10g)의 용액에 첨가한 후, TBAF(THF 중 1M, 2.47mL, 247mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 가온되게 두고, 18시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 포화 수성 NH4Cl로 켄칭(quench)하였다. 이 혼합물을 15분 동안 교반하고 나서, TBAF(THF 중 1M, 5mL, 5mmol)를 첨가하고, 이 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 Et2O로 추출하였다. 합한 유기상을 H2O 및 염수 용액으로 세척하고 나서, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하며, 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; AcOEt 중의 헵탄, 0/100으로부터 90/10까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 중간체 A40(7.8g, 61% 수율)을 수득하였다.
실시예 A41
중간체 A41의 제조:
Figure 112013076880625-pct00053
염화티오닐(14.352mL, 196.633mmol)을 피리딘(188mL) 중 중간체 A40(7.7g, 24.579mmol)에 첨가하였다. 이 혼합물을 질소 하에서 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 H2O로 켄칭하고 나서, Et2O로 추출하였다. 유기층을 HCl 1M, NaHCO3 포화 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; AcOEt 중의 헵탄, 0/100으로부터 80/20까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 황색 오일로서 중간체 A41(4.6g, 63% 수율)을 수득하였다.
실시예 A42
중간체 A42의 제조:
Figure 112013076880625-pct00054
DDQ(16.607g, 73.16mmol)를 디옥산(45mL) 중 중간체 A41(7.2g, 24.385mmol)에 첨가하였다. 이 혼합물을 85℃에서 104시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 여과해내고, 여과액을 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헵탄 중의 DCM, 40/60)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 갈색을 띤 페이스트로서 중간체 A42(4g, 85% 수율)를 수득하였다.
실시예 A43
중간체 A43의 제조:
Figure 112013076880625-pct00055
DBU(2.85mL, 19mmol)를 MeCN(40mL) 중 중간체 A12(6.07g, 14.84mmol) 및 중간체 A42(2g, 10.356mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 90℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응물을 DCM으로 희석하고, HCl 1N 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 끈적끈적한 고형물로서 중간체 A43(4.6g, 59% 수율)을 수득하였다.
실시예 A44
중간체 A44의 제조:
Figure 112013076880625-pct00056
실시예 A20 내지 실시예 A23에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A43으로부터 중간체 A44를 제조하였다. 이 화합물을 후속 반응을 위한 조 물질로서 사용하였으며, 수율은 정량적인 것으로 가정하였다.
실시예 A45
중간체 A45의 제조:
Figure 112013076880625-pct00057
이 반응은 3개의 배치로 구성하였다. 물질의 총량을 기록한다. NH3(EtOH 중 2M, 47mL, 94mmol)를 중간체 A44(2.3g, 5.46mmol) 및 NH4Cl(2.315g, 43.7mmol)에 첨가하였다. 이 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 170℃에서 45분 동안 가열하고 나서, 진공 중에서 농축시켰다. 추가 45mL의 NH3(EtOH 중 2M)를 첨가하고, 이 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 170℃에서 45분 동안 가열하였다. 이 혼합물을 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 조 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 3/97까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 중간체 A45(2.1g, 99% 수율)를 수득하였다.
실시예 A37 및 실시예 A38에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A46을 제조하였다:
실시예 A46
중간체 A46의 제조:
Figure 112013076880625-pct00058
중간체 A45로부터 제조하였다. DCM을 사용하여 조 반응 혼합물로부터 화합물을 침전시켰다(89% 수율).
실시예 A9 내지 실시예 A11에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A47을 제조하였다:
실시예 A47
중간체 A47의 제조:
Figure 112013076880625-pct00059
카르밤산, N-[1-(5-브로모-2-플루오로페닐)-2,2-디플루오로-1-(하이드록시메틸)에틸]-, 1,1-디메틸에틸 에스테르로부터 제조하였다. 조 생성물을 헵탄과 함께 분쇄하고, 여과하였다. 회색 고형물을 DCM 중에 용해시키고, 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 백색 고형물로서 중간체 A47(78% 수율)을 수득하였다.
실시예 A48
중간체 A48의 제조:
Figure 112013076880625-pct00060
NaH(광유 중 60% 분산액, 269mg, 6.723mmol)를 질소 하에서 0℃에서 DMF(20mL) 중 메틸 2-피롤카르복실레이트(841mg, 6.723mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고 나서, DMF(10mL) 중 중간체 A47(2g, 4.482mmol)의 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NH4Cl로 켄칭하고, AcOEt로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 오일로서 중간체 A48(2.2g, 100% 수율)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A20에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A49를 제조하였다:
실시예 A49
중간체 A49의 제조:
Figure 112013076880625-pct00061
중간체 A48로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헵탄 중의 AcOEt, 0/100으로부터 15/85까지)를 행하여 중간체 A49(100% 수율)를 수득하였다.
실시예 A50
중간체 A50의 제조:
Figure 112013076880625-pct00062
트리메틸알루미늄(톨루엔 중 2M; 4.47mL, 8.9mmol)을 밀봉관 내에서 0℃에서 THF(20mL) 중 중간체 A49(1.75g, 4.47mmol)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 플라스크에 부으며, 0℃에서 냉각시키고, 황산나트륨 10수화물로 켄칭하였다. 이 혼합물을 15분 동안 교반하고 나서, 여과하고, 여과액을 진공 중에서 증발시켜 고형물로서 중간체 A49(1.657g, 103% 수율)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A16에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A51을 제조하였다:
실시예 A51
중간체 A51의 제조:
Figure 112013076880625-pct00063
중간체 50으로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 05/95까지)로 행하여 담황색 고형물로서 중간체 A51(52% 수율)을 수득하였다.
실시예 A52
중간체 A52의 제조:
Figure 112013076880625-pct00064
NH3 수용액(7mL)을 MeOH 중 7N NH3(7mL) 중 중간체 A51(700mg, 1.866mmol)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 밀봉관 내에서 90℃에서 21시간 동안 가열하였다. 이어서, 용매를 증발시키고, 추가의 수성 NH3 및 MeOH 중 7N NH3를 첨가하였다. 이 혼합물을 90℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 03/97까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 중간체 A52(464mg, 69% 수율)를 수득하였다.
실시예 A37 및 실시예 A38에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A53을 제조하였다:
실시예 A53
중간체 A53의 제조:
Figure 112013076880625-pct00065
중간체 A52로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 10/90까지)를 행하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 중간체 A53(69% 수율)을 수득하였다.
실시예 A54
중간체 A54의 제조:
Figure 112013076880625-pct00066
한 방울의 AcOH를 실온에서 DCE(80mL) 중 2-아미노-2-(5-브로모-2-플루오로페닐)-1,3-프로판디올(4.2g, 15.9mmol) 및 트리에틸 오르토프로피오네이트(3.52mL, 17.5mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 80℃에서 90분 동안 가열하고 나서, 수성 포화 Na2CO3로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 오일(4.63g)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A55
중간체 A55의 제조:
Figure 112013076880625-pct00067
NaH(광유 중 60% 분산액, 735mg, 18.4mmol)를 질소 하에서 0℃에서 DMF(40mL) 중 중간체 A54(4.63g, 15.3mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고 나서, 메틸 요오다이드(1.91mL, 30.65mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하고 나서, 수성 포화 NH4Cl로 켄칭하고, 헵탄으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 오일로서 중간체 A55(4.73g)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A56
중간체 A56의 제조:
Figure 112013076880625-pct00068
HCl(H2O 중 6M, 40mL) 중 중간체 A55(4.95g, 15.7mmol)의 용액을 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 이어서, 용매를 증발시켜 오일로서 중간체 A56(4.3g)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그 다음 단계에 사용하였다.
실시예 A9 내지 실시예 A11, 실시예 A43, 실시예 A20, 실시예 A50, 실시예 A35, 실시예 A36에 기재된 합성 절차에 따라 중간체 A57을 제조하였다:
실시예 A57
중간체 A57의 제조:
Figure 112013076880625-pct00069
중간체 A56으로부터 제조하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 5/95까지)를 행하여 중간체 A57(68% 수율)을 수득하였다.
실시예 A58
중간체 A58의 제조:
Figure 112013076880625-pct00070
요오드화구리(84mg, 0.41mmol)를 DMSO(13mL) 중 중간체 A57(617mg, 1.47mmol), 아지드화나트륨(242mg, 3.67mmol), N, N' -디메틸에틸렌디아민(142μL, 1.32mmol) 및 Na2CO3(447mg, 4.41mmol)의 현탁액에 첨가하고, 반응물을 탈기하였다. 이 혼합물을 110℃에서 25시간 동안 가열하고 나서, 1M HCl로 켄칭하고, 수층을 NH4OH로 염기성화하며, AcOEt(3x)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(MgSO4), 여과하며, 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카; DCM 중의 MeOH 중 NH3의 7N 용액, 0/100으로부터 5/95까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 중간체 A58(480mg, 92% 수율)을 수득하였다.
최종 화합물의 제조
실시예 B1
화합물 1 rac-3-메틸-3-(3-피리미딘-5-일-페닐)-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민의 제조
Figure 112013076880625-pct00071
Pd(PPh3)4(57mg, 0.049mmol)를 밀봉관 내에서 1,4-디옥산(4mL) 및 EtOH(0.4mL)의 혼합물 중 중간체 A18(300mg, 0.99mmol), 피리미딘-5-보론산(367mg, 2.96mmol) 및 K2CO3(409mg, 2.96mmol)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 마이크로파 조사 하에서 150℃에서 30분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 이 혼합물을 H2O로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 짧은 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; MeOH 중 NH3의 7M 용액/DCM, 0/100으로부터 3/97까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 고형물을 수득하였으며, 이를 Et2O와 함께 분쇄하고, 초음파 처리하며, 여과하고, 50℃에서 진공 중에서 건조시켜 고형물을 수득하였으며, 이를 역상 HPLC(80%의 H2O 중 0.1% TFA 용액, 20% MeCN으로부터 0%의 H2O 중 0.1% TFA 용액, 100% MeCN까지의 구배)로 추가로 정제하여 고형물로서 화합물 1(90.3mg, 22% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.74 (s, 3 H), 4.40 (d, J=13.6 Hz, 1 H), 5.03 (d, J=13.4 Hz, 1 H), 6.26 (dd, J=4.2, 2.5 Hz, 1 H), 7.19 (dd, J=4.2, 1.4 Hz, 1 H), 7.31 (t, J=1.6 Hz, 1 H), 7.45 (br. d, J=8.1 Hz, 1 H), 7.54 (t, J=7.9 Hz, 1 H), 7.75 (br. d, J=7.9 Hz, 1 H), 7.91 (br. s, 1 H), 8.38 (br. s., 1 H), 9.16 (s, 2 H), 9.21 (br. s, 1 H), 9.22 (s, 1 H), 10.23 (br. s, 1 H).
실시예 B2
화합물 2 rac-3-(3',5'-디클로로-바이페닐-3-일)-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-1-일아민의 제조
Figure 112013076880625-pct00072
Pd(PPh3)4(30.4mg, 0.026mmol)를 밀봉관 내에서 1,4-디옥산(4mL) 및 EtOH(0.4mL)의 혼합물 중 중간체 A18(160mg, 0.526mmol), 2,3-디클로로페닐-보론산(120.4mg, 0.631mmol) 및 K2CO3(218mg, 1.58mmol)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 60℃에서 18시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 이 혼합물을 H2O 및 NH4Cl(포화 수용액)로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 짧은 컬럼 크로마토그래피(DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 3/97까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 진공 중에서 농축시켜 고형물을 수득하였으며, 이를 DIPE와 함께 분쇄하고, 여과하며, 50℃에서 진공 중에서 건조시켜 고형물로서 화합물 2(136mg, 70% 수율)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1.56 (s, 3 H), 4.11 (br. s, 2 H), 4.05 (d, J=12.4 Hz, 1 H), 4.10 (d, J=12.7 Hz, 1 H), 6.18 (dd, J=3.8, 2.6 Hz, 1 H), 6.43 (dd, J=3.8, 1.4 Hz, 1 H), 6.75 (dd, J=2.3, 1.4 Hz, 1 H), 7.32 (t, J=1.7 Hz, 1 H), 7.36 - 7.42 (m, 2 H), 7.43 (d, J=1.7 Hz, 2 H), 7.53 (dt, J=6.9, 1.9 Hz, 1 H), 7.65 - 7.71 (m, 1 H).
실시예 B3
화합물 3 rac-5-클로로-피리딘-2-카르복실산[3-(1-아미노-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00073
NH4Cl(94mg, 1.75mmol)을 EtOH 중 NH3의 2 M 용액(8.23mL) 중 중간체 A26(180mg, 0.44mmol)의 현탁액에 첨가하고, 이 혼합물을 80℃에서 6일 동안 가열하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 DCM 중에 현탁시키며, H2O로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; MeOH 중 NH3의 7M 용액/DCM, 0/100으로부터 10/90까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 백색 고형물로서 화합물 3(28mg, 17% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1.56 (s, 3 H), 2.96 (br. s., 2 H), 4.06 (d, J=12.7 Hz, 1 H), 4.14 (d, J=13.3 Hz, 1 H), 6.17 (dd, J=3.8, 2.6 Hz, 1 H), 6.46 (dd, J=3.8, 1.2 Hz, 1 H), 6.75 (dd, J=2.3, 1.4 Hz, 1 H), 7.30 (br. d, J=7.8 Hz, 1 H), 7.35 (t, J=8.1 Hz, 1 H), 7.68 - 7.73 (m, 1 H), 7.88 (dd, J=8.4, 2.3 Hz, 1 H), 7.91 (t, J=1.7 Hz, 1 H), 8.25 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 8.57 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 9.86 (br. s., 1 H).
실시예 B4
화합물 4 rac-5-메톡시-피라진-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00074
5-메톡시-피라진-2-카르복실산(56.4mg, 0.36mmol)을 MeOH(4mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(111mg, 0.4mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(2mL) 중 중간체 A25(80mg, 0.33mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 Et2O와 함께 분쇄하고 나서, 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헵탄 중의 AcOEt, 50/50)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 백색 고형물로서 화합물 4(65mg, 52% 수율)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.36 (s, 3 H), 4.03 (s, 3 H), 3.99 - 4.11 (m, 2 H), 6.06 (br. s., 2 H), 6.02 (dd, J=3.5, 2.6 Hz, 1 H), 6.52 (dd, J=3.5, 1.2 Hz, 1 H), 6.87 (t, J=1.7 Hz, 1 H), 7.26 (t, J=7.8 Hz, 1 H), 7.28 - 7.33 (m, 1 H), 7.72 (dt, J=7.5, 1.7 Hz, 1 H), 8.02 (br. s, 1 H), 8.43 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 8.90 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 10.33 (br. s., 1 H).
실시예 B5
화합물 5 (R)-5-클로로-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00075
5-클로로-피리딘-2-카르복실산(122mg, 0.774mmol)을 MeOH(4mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(214mg, 0.774mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(3mL) 중 중간체 A32(200mg, 0.774mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 90분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 저온조 내에서 진공 중에서 농축시키고 나서, 이를 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 2/98까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 Et2O와 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 화합물 5(65mg, 21% 수율)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1.56 (s, 3 H), 4.20 (br. d, J=12.7 Hz, 1 H), 4.28 (br. d, J=12.4 Hz, 1 H), 4.59 (br. s., 2 H), 6.16 (dd, J=3.5, 2.6 Hz, 1 H), 6.43 (br. d, J=2.6 Hz, 1 H), 6.74 - 6.78 (m, 1 H), 7.06 (dd, J=11.7, 8.8 Hz, 1 H), 7.79 (dd, J=6.9, 2.6 Hz, 1 H), 7.87 (dd, J=8.4, 2.3 Hz, 1 H), 8.02 (ddd, J=9.0, 4.0, 3.2 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 8.56 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 9.82 (br. s., 1 H).
실시예 B6
화합물 6 (R)-5-시아노-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00076
5-시아노-피리딘-2-카르복실산(115mg, 0.774mmol)을 MeOH 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(214mg, 0.774mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH 중 중간체 A32(200mg, 0.774mmol)의 용액을 첨가하였다(MeOH의 총량 4mL). 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 저온조 내에서 진공 중에서 농축시키고 나서, 이를 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(MgSO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 2/98까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 Et2O와 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 화합물 7(110mg, 37% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1.57 (s, 3 H), 4.21 (br. d, J=12.1 Hz, 1 H), 4.28 (br. d, J=12.7 Hz, 1 H), 4.37 (br. s., 1 H), 6.16 (dd, J=3.8, 2.6 Hz, 1 H), 6.43 (dd, J=3.8, 1.2 Hz, 1 H), 6.77 (dd, J=2.5, 1.3 Hz, 1 H), 7.08 (dd, J=11.7, 8.8 Hz, 1 H), 7.83 (dd, J=6.9, 2.9 Hz, 1 H), 8.01 (ddd, J=8.7, 4.0, 2.9 Hz, 1 H), 8.18 (dd, J=8.1, 2.0 Hz, 1 H), 8.40 (dd, J=8.1, 0.6 Hz, 1 H), 8.85 (br. d, J=1.2 Hz, 1 H), 9.85 (br. s., 1 H).
실시예 B7
화합물 7 (R)-5-플루오로-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-7-플루오로-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00077
5-플루오로-피리딘-2-카르복실산(123mg, 0.869mmol)을 MeOH(4mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(240mg, 0.869mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(2mL) 중 중간체 A38(200mg, 0.724mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 4/96까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 헵탄과 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 화합물 8(196mg, 68% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.41 (s, 3 H), 3.98 (br. d, J=12.7 Hz, 1 H), 4.10 (br. d, J=12.5 Hz, 1 H), 6.16 (br. s., 2 H), 6.41 (d, J=1.6 Hz, 1 H), 6.94 (dd, J=3.4, 2.0 Hz, 1 H), 7.16 (dd, J=12.0, 8.8 Hz, 1 H), 7.75 (ddd, J=8.8, 4.2, 2.8 Hz, 1 H), 7.97 (td, J=8.7, 2.8 Hz, 1 H), 8.11 (dd, J=7.5, 2.7 Hz, 1 H), 8.21 (dd, J=8.8, 4.6 Hz, 1 H), 8.73 (d, J=2.8 Hz, 1 H), 10.51 (br. s, 1 H).
실시예 B8
화합물 8 (R)-5-메톡시-피라진-2-카르복실산 [3-(1-아미노-7-플루오로-3-메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00078
5-메톡시-피라진-2-카르복실산(134mg, 0.869mmol)을 MeOH(4mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(240mg, 0.869mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(2mL) 중 중간체 A38(200mg, 0.724mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 Na2CO3의 포화 용액 및 H2O로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH 중 7N NH3, 0/100으로부터 4/96까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 헵탄과 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 화합물 8(213mg, 71% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.41 (s, 3 H), 3.97 (br. d, J=12.9 Hz, 1 H), 4.02 (s, 3 H), 4.09 (br. d, J=12.5 Hz, 1 H), 6.12 (br. s., 2 H), 6.40 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 6.93 (dd, J=3.2, 1.8 Hz, 1 H), 7.15 (dd, J=12.0, 8.8 Hz, 1 H), 7.72 (ddd, J=8.8, 4.2, 3.0 Hz, 1 H), 8.12 (dd, J=7.4, 2.8 Hz, 1 H), 8.41 (d, J=1.4 Hz, 1 H), 8.87 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 10.40 (br. s, 1 H).
실시예 B9
화합물 9 (R)-5-시아노-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-메틸-7-트리플루오로메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00079
5-시아노-피리딘-2-카르복실산(82mg, 0.551mmol)을 MeOH(3mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(168mg, 0.606mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(2mL) 중 중간체 A46(200mg, 0.551mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온하고, 18시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 저온조 내에서 진공 중에서 농축시키고 나서, 이를 포화 Na2CO3 용액으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 4/96까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 이 화합물을 Et2O와 함께 분쇄하여 혼합물을 수득하였으며, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 4/96까지)로 재정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 불순한 분획을 수득하였으며, 이를 C18 Sunfire(30 x 100 5um)(이동상: 80%의 H2O 중 0.1% TFA 용액, 20% MeCN으로부터 0%의 H2O 중 0.1% TFA 용액, 100% MeCN 까지의 구배) 상에서 RP HPLC로 정제하여 백색 고형물로서 화합물 9(121.3mg, 39% 수율)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.79 (s, 3 H), 4.50 (br. d, J=13.6 Hz, 1 H), 4.92 (br. d, J=13.3 Hz, 1 H), 7.31 (dd, J=11.8, 8.7 Hz, 1 H), 7.51 (br. s, 1 H), 7.86 - 7.93 (m, 2 H), 7.95 (br. s, 1 H), 8.25 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 8.58 (dd, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H), 8.87 (br. s., 1 H), 9.20 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 9.55 (br. s., 1 H), 10.67 (br. s., 1 H), 10.99 (br. s, 1 H).
실시예 B10
화합물 10 (R)-1-디플루오로메틸-1H-피라졸-3-카르복실산 [3-(1-아미노-3-메틸-7-트리플루오로메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00080
1-디플루오로메틸-1H-피라졸-3-카르복실산(31mg, 0.193mmol)을 MeOH(3mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(59mg, 0.212mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, MeOH(2mL) 중 중간체 A46(70mg, 0.193mmol, 유리 염기를 생성하기 위해 MeOH 중 NH3로 사전 처리됨)을 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다.
이 혼합물을 저온조 내에서 진공 중에서 농축시키고 나서, 이를 포화 Na2CO3 용액으로 처리하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키며(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 4/96까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켰다. 이 화합물을 Et2O와 함께 분쇄하여 백색 고형물로서 화합물 10(56mg, 62% 수율)을 생성하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.40 (s, 3 H), 4.13 (br. d, J=13.0 Hz, 1 H), 4.29 (br. d, J=12.7 Hz, 1 H), 6.25 (br. s., 2 H), 6.87 (br. s, 1 H), 7.01 (d, J=2.3 Hz, 1 H), 7.16 (dd, J=11.8, 9.0 Hz, 1 H), 7.59 (br. s, 1 H), 7.63 - 7.69 (m, 1 H), 7.92 (t, J=58.7 Hz, 1 H), 8.05 - 8.10 (m, 1 H), 8.41 (d, J=2.3 Hz, 1 H), 10.34 (s, 1 H).
실시예 B11
화합물 11 rac-5-메톡시-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-디플루오로메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드, 화합물 12 (R*)-5-메톡시-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-디플루오로메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드, 및 화합물 13 (S*)-5-메톡시-피리딘-2-카르복실산 [3-(1-아미노-3-디플루오로메틸-3,4-디하이드로-피롤로[1,2-a]피라진-3-일)-4-플루오로-페닐]-아미드의 제조
Figure 112013076880625-pct00081
5-메톡시-피라진-2-카르복실산(130mg, 0.841mmol)을 MeOH(4mL) 중 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(233mg, 0.841mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고 나서, 0℃로 냉각시키고, MeOH(4mL) 중 중간체 A53(225mg, 0.765mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고 나서, 포화 Na2CO3로 처리하고, 수 분 동안 교반하였다. 용매를 농축시키고, H2O를 첨가하며, DCM/MeOH(9:1)의 혼합물로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 조 생성물을 DCM과 함께 분쇄하고, 여과하여 화합물 11의 제1 배치를 수득하였다. 여과액을 증발시키고, 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; DCM 중의 MeOH, 0/100으로부터 7/93까지)로 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 화합물 11의 제2 배치를 수득하였으며, 이를 이전의 것과 합하였다. 이 라세미 화합물을 CHIRALCEL(OD-H 5μm, 250 x 20mm)(이동상: 60% CO2, 40% EtOH] 상에서 키랄 SFC로 정제하여 화합물 12(57mg, 17% 수율)(1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 4.02 (s, 3 H) 4.28 (br. d, J=13.0 Hz, 1 H) 4.61 (br. d, J=13.0 Hz, 1 H) 6.01 (dd, J=3.3, 2.7 Hz, 1 H) 6.16 (t, J=55.5 Hz, 1 H) 6.40 (br. s., 2 H) 6.53 (d, J=2.6 Hz, 1 H) 6.98 (br. s, 1 H) 7.11 - 7.19 (m, 1 H) 7.73 - 7.78 (m, 1 H) 8.11 (dd, J=7.1, 2.7 Hz, 1 H) 8.41 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.87 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 10.42 (br. s, 1 H)) 및 화합물 13(72mg, 21% 수율)을 수득하였으며, 이때 화합물 13에 대한 1H NMR 스펙트럼은 화합물 12의 것과 일치하였다.
Figure 112013076880625-pct00082
Figure 112013076880625-pct00083
화합물 번호 1, 9, 15 및 20은 트리플루오로아세테이트 염(.CF3COOH)으로서 수득하였다.
C. 분석 부분
LCMS
본 발명의 화합물의 (LC)MS 특성화를 위해, 하기의 방법을 사용하였다.
일반적 절차 A
UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography, 초고성능 액체 크로마토그래피) 측정은 샘플러 오거나이저(sampler organizer), 탈기기(degasser)를 갖춘 2원 펌프, 4 컬럼 오븐, 다이오드-어레이 검출기(DAD) 및 각각의 방법에서 명시된 바와 같은 컬럼을 포함하는 Acquity UPLC(Waters) 시스템을 사용하여 수행하였다. MS 검출기에는 전기분무 이온화 공급원을 구성하였다. 질량 스펙트럼은 0.08초의 채널간 지연을 사용하여 0.1초에 100회 내지 1000회 스캐닝함으로써 단일 사중극자 SQD 검출기(Waters)에서 획득하였다. 모세 바늘 전압(capillary needle voltage)은 3.0kV였다. 콘 전압(cone voltage)은 양성 이온화 모드에 대해서는 25V이고, 음성 이온화 모드에 대해서는 30V였다. 공급원 온도는 140℃로 유지하였다. 질소를 네뷸라이저 가스로 사용하였다. 데이터 획득은 MassLynx-Openlynx 소프트웨어로 수행하였다.
방법 1:
일반적 절차 A에 추가하여: MS 검출기로 분배(split)되지 않고서 50℃에서 1.0ml/분의 유량으로 Agilent로부터의 RRHD Eclipse Plus-C18(1.8μm, 2.1 x 50mm)에서 역상 UPLC를 수행하였다. 사용된 구배 조건은 95% A(H2O/MeCN 95/5 중 6.5 mM NH4AcO), 5% B(MeCN)로부터, 3.8분 내에 40% A, 60% B까지, 4.6분 내에 5% A, 95% B까지, 5.0분까지 유지하는 것이다. 주입 부피 2.0μL.
일반적 절차 B
HPLC 측정은 탈기기를 갖춘 펌프(4원 또는 2원), 오토샘플러, 컬럼 오븐, 다이오드-어레이 검출기(DAD) 및 각각의 방법에서 명시된 바와 같은 컬럼을 포함하는 HP 1100(Agilent Technologies) 시스템을 사용하여 수행하였다. MS 검출기(SQD, TOF)에는 전기분무 이온화 공급원을 구성하였다. 질소를 네뷸라이저 가스로 사용하였다. 공급원 온도는 140?로 유지하였다. 데이터 획득은 MassLynx-Openlynx 소프트웨어로 수행하였다.
B1: 0.08초의 채널간 지연을 사용하여 0.1초에 100회 내지 1000회 스캐닝함으로써 단일 사중극자 SQD 검출기에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 모세 바늘 전압은 3.0kV였다. 콘 전압은 양성 이온화 모드에 대해서는20V이고, 음성 이온화 모드에 대해서는 30V였다.
B2: 0.3초의 체류 시간(dwell time)을 사용하여 0.5초에 100회 내지 750회 스캐닝함으로써 TOF(Time of Flight, 비행 시간형) 검출기에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 모세 바늘 전압은 양성 이온화 모드에 대해서는 2.5kV이고, 음성 이온화 모드에 대해서는 2.9kV였다. 콘 전압은 양성 및 음성 둘 모두의 이온화 모드에 대해서 20V였다. Leucine-Enkephaline이 고정 질량 교정(lock mass calibration)에 사용된 표준 물질이었다.
방법 2:
일반적 절차 B1에 추가하여: 60℃에서 1.0mL/분의 유량으로 Agilent로부터의 Eclipse Plus-C18 컬럼(3.5μm, 2.1 x 30mm)에서 역상 HPLC를 수행하였다. 사용된 구배 조건은 95% A(H2O/MeCN 95/5 중 6.5mM NH4AcO), 5% B(MeCN/ MeOH 1/1)로부터, 5.0분 내에 100% B까지, 5.15분까지 유지, 그리고 5.30분에서 초기 조건으로 평형화하되 7.0분까지 평형화하는 것이다. 주입 부피 2μL.
방법 3:
일반적 절차 B2에 추가하여: 60℃에서 1.0mL/분의 유량으로 Agilent로부터의 Eclipse Plus-C18 컬럼(3.5μm, 2.1 x 30mm)에서 역상 HPLC를 수행하였다. 사용된 구배 조건은 95% A(H2O/MeCN 95/5 중 6.5mM NH4AcO), 5% B(MeCN/MeOH 1/1)로부터, 5.0분 내에 100% B까지, 5.15분까지 유지, 그리고 5.3분에서 초기 조건으로 평형화하되 7.0분까지 평형화하는 것이다. 주입 부피 2μL.
방법 4:
일반적 절차 B2에 추가하여: 60℃에서 1.0ml/분의 유량으로 Agilent로부터의 Eclipse Plus-C18 컬럼(3.5μm, 2.1 x 30mm)에서 역상 HPLC를 수행하였다. 사용된 구배 조건은 95% A(H2O/MeCN 95/5 중 6.5mM NH4AcO), 5% B(MeCN)(0.2분 유지)로부터, 3.0분 내에 100% B까지, 3.15분까지 유지, 그리고 3.3분에서 초기 조건으로 평형화하되 5.0분까지 평형화하는 것이다. 주입 부피 2μL.
일반적 절차 C:
LC 측정은 탈기기를 갖춘 2원 펌프, 오토샘플러, 다이오드-어레이 검출기(DAD) 및 하기의 각각의 방법에서 명시된 바와 같은 컬럼을 포함하는 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography, 초고성능 액체 크로마토그래피) Acquity(Waters) 시스템을 사용하여 수행하였으며, 이때 컬럼은40℃의 온도로 유지한다. MS 검출기에는 전기분무 이온화 공급원을 구성하였다. 질량 스펙트럼은 0.1초의 스캔간 지연을 사용하여 0.2초에 100회 내지 1000회 스캐닝함으로써 삼중 사중극자 Quattro 검출기(Waters)에서 획득하였다. 모세 바늘 전압은 3kV이고, 공급원 온도는 130℃로 유지하였다. 콘 전압은 양성 및 음성 이온화 모드에 대해서 20V였다. 질소를 네뷸라이저 가스로 사용하였다. 데이터 획득은 MassLynx-Openlynx 소프트웨어(Waters)로 수행하였다.
방법 5:
일반적 절차에 추가하여: 0.343ml/분의 유량으로 Waters Acquity BEH(가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드) 페닐-헥실 컬럼(1.7μm, 2.1 x 100mm)에서 역상 UPLC를 수행하였다. 2개의 이동상(이동상 A: 95% 7mM NH4AcO/5% MeCN; 이동상 B: 100% MeCN)을 사용하여 84.2% A 및 15.8% B(0.49분 동안 유지)로부터, 2.18분 내에 10.5% A 및 89.5% B까지, 1.94분 동안 유지, 그리고 0.73분 내에 초기 조건으로 되돌아옴, 0.73분 동안 유지하는 구배 조건을 실시하였다. 2ml의 주입 부피를 사용하였다.
융점
값은 피크값 또는 용융 범위이며, 이 분석 방법과 일반적으로 관련된 실험상의 불확실성을 갖고서 얻어진다.
Mettler FP81HT / FP90 또는 FP62 장치
다수의 화합물에 대하여, Mettler FP62 또는 Mettler FP81HT/FP90 장치에서 개방 모세관 내에서 융점을 결정하였다. 1℃/분, 3℃/분, 5℃/분 또는 10℃/분의 온도 구배를 이용하여 융점을 측정하였다. 최대 온도는 300℃였다. 융점은 디지털 표시장치로부터 판독하였다.
다수의 화합물에 대하여, Shanghai Precision and Scientific Instrument Co. Ltd.로부터 구매한 WRS-2A 융점 장치를 이용하여 융점(m.p.)을 결정하였다. 0.2℃/분 내지 5.0℃/분의 선형 승온 속도를 이용하여 융점을 측정하였다. 기록값은 융용 범위이다. 최대 온도는 300℃였다.
분석 데이터 - Rt는 체류 시간(단위: 분)을 의미하고, [M+H]+는 화합물의 양성자화된 질량을 의미하며, 방법은 (LC)MS에 사용된 방법을 말한다.
화합물 번호 R t [M+H] + 방법 융점
1 0.83 304 1 87.2℃FP81HT/FP90)
2 2.62 370 1 162.6℃(FP81HT/FP90)
3 1.83 380 1 n.d.
4 1.57 377 1 221℃(FP81HT/FP90)
5 2.81 398 3 197.3℃(FP62)
6 2.27 389 4 180℃(FP81HT/FP90)
7 1.68 400 1 197℃(FP81HT/FP90)
8 1.64 413 1 211℃(FP81HT/FP90)
9 2.09 457 1 150.2℃(FP62)
10 2.23 471 1 204.1℃(FP62)
11 2.51 431 5 252.7℃(FP81HT/FP90)
12 2.50 431 5 n.d.
13 2.50 431 5 n.d.
14 1.97 418 1 224.9℃(FP81HT/FP90)
15 1.98 475 1 242.4℃(FP62)
16 1.38 386 1 n.d.
17 1.78 400 1 174℃(FP81HT/FP90)
18 2.08 454 1 n.d.
19 2.91 450 2 >300℃(FP62)
20 1.84 436 1 n.d.
21 1.81 436 1 n.d.
22 2.15 438 1 160.6℃(FP62)
23 2.37 504 1 227℃(FP62)
24 2.26 493 1 n.d.
25 2.28 480 1 n.d.
26 2.09 501 1 n.d.
27 2.22 493 1 126.1℃(FP81HT/FP90)
28 2.21 493 1 121.8℃(FP81HT/FP90)
29 2.21 480 1 134.7℃(FP81HT/FP90)
30 2.22 480 1 137.6℃(FP81HT/FP90)
31 2.52 501 5 253.5℃(FP81HT/FP90)
32 2.54 501 5 250℃(FP81HT/FP90)
n.d.은 결정되지 않음을 의미함
SFC - MS 방법:
SF - MS 방법을 위한 일반적 절차 :
SFC 측정은 이산화탄소(CO2) 및 변형제(modifier) 전달용 듀얼 펌프 유체 제어 모듈(FCM-1200), CTC Analytics 자동 액체 샘플러, 컬럼을 실온으로부터 80℃까지 가열하기 위한 TCM-20000 열 제어 모듈을 포함하는, Berger instrument로부터의 분석 SFC 시스템을 사용하여 수행하였다. 최대 400bar를 견디는 고압 유동 셀을 장치한 Agilent 1100 UV 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하였다. 컬럼으로부터의 유동은 MS 분광계로 분배하였다. MS 검출기에는 대기압 이온화 공급원을 구성하였다. Waters ZQ 질량 분광계에 대한 이온화 파라미터는 코로나 9μa, 공급원 온도 140℃, 콘 30V, 프로브 온도 450℃, 추출기 3V, 탈용매화 가스 400L/시(hr), 콘 가스 70L/시이었다. 질소를 네뷸라이저 가스로 사용하였다. 데이터 획득은 Waters-Micromass MassLynx-Openlynx 데이터 시스템으로 수행하였다.
방법 1:
일반적 절차에 추가하여: 3.0mL/분의 유량으로 35℃에서 CHIRALCEL OD-H DAICEL 컬럼(5μm, 4.6 x 250mm)에서 SFC에서의 키랄 분리를 수행하였다. 이동상은 CO2, 40% EtOH(+ 0.3% iPrNH2)이며, 이는 정조성 모드(isocratic mode)에서 7분 유지된다.
방법 2:
일반적 절차에 추가하여: 3.0mL/분의 유량으로 35℃에서 CHIRALPAK AD-H DAICEL 컬럼(10μm, 4.6 x 250mm)에서 SFC에서의 키랄 분리를 수행하였다. 이동상은 CO2, 15% EtOH, 15% 이소프로판올(+ 0.3% iPrNH2)이며, 이는 정조성 모드에서 7분 유지된다.
분석 SFC 데이터 - Rt는 체류 시간(단위: 분)을 의미하고, [M+H]+는 화합물의 양성자화된 질량을 의미하며, 방법은 거울상이성체적으로 순수한 화합물의 SFC/MS 분석에 사용된 방법을 말한다.
화합물 번호 R t [M+H] + UV 면적% 방법 이성체 용리 순서*
12 2.34 431 100 1 A
13 3.18 431 100 1 B
31 1.80 501 100 2 A
32 2.64 501 100 2 B
*A는 용리되는 첫 번째 이성체를 의미한다. B는 용리되는 두 번째 이성체를 의미한다.
선광도:
나트륨 램프를 갖춘 Perkin-Elmer 341 편광계에서 선광도를 측정하고 다음과 같이 기록하였다: [α]λ t℃(c g/100mL, 용매).
분석 데이터 - 거울상이성체적으로 순수한 화합물에 대한 선광도 값
화합물 번호 α D (°) 파장
( nm ) 		농도
w/v % 		용매 온도
(℃)
5 103.6 589 0.45 DMF 20
6 91.4 589 0.47 DMF 20
7 84.7 589 0.63 DMF 20
8 104.0 589 0.53 DMF 20
9 111.7 589 0.53 DMF 20
12 198.0 589 0.26 DMF 20
13 -207.5 589 0.86 DMF 20
15 108.7 589 0.55 DMF 20
16 -24.4 589 0.54 DMF 20
17 -28.3 589 0.53 DMF 20
18 -45.4 589 0.56 DMF 20
27 -142 589 0.5 DMF 20
28 134.2 589 0.48 DMF 20
29 130.1 589 0.49 DMF 20
30 -110.7 589 0.5 EtOH 20
31 -109.8 589 0.48 DMF 20
32 107.9 589 0.47 DMF 20
약리학적 실시예
본 발명에서 제공된 화합물은 β-부위 APP 절단 효소 1(BACE1)의 억제제이다. 아스파르트산 프로테아제인 BACE1의 억제는 알츠하이머 질환(AD)의 치료에 관련있는 것으로 여겨진다. β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터의 β-아밀로이드 펩티드(Aβ)의 생성 및 축적은 AD의 발현 및 진행에서 핵심 역할을 하는 것으로 여겨진다. Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의해 각각 Aβ 도메인의 N-말단 및 C-말단에서 순차적 절단을 행함으로써 생성된다.
화학식 I의 화합물은 효소 활성을 억제하는 능력에 의해 실질적으로 BACE1에 효과를 가질 것으로 예상된다. 이와 같은 화합물, 더 특히 화학식 I에 따른 화합물의 확인에 적합한, 하기에 기재된 SKNBE2 세포에서의 생화학적 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 기반 검정 및 세포 알파리사(αlisa) 검정을 사용하여 시험되는 이와 같은 억제제의 거동이 표 1에 나타나 있다.
생화학적 FRET 기반 검정
이 검정은 형광 공명 에너지 전달 에너지(FRET) 기반 검정이다. 이 검정을 위한 기질은 아밀로이드 전구체 단백질(APP) β-세크레타제 절단 부위의 ‘스웨디시(Swedish)’ Lys-Met/Asn-Leu 돌연변이를 함유하는 APP 유래 13개의 아미노산 펩티드이다. 이 기질은 또한 2개의 형광단(fluorophore)을 함유한다: (7-메톡시-쿠마린-4-일) 아세트산(Mca)은 320nm에서 여기 파장 및 405nm에서 방출 파장을 갖는 형광 공여체이고, 2,4-디니트로페닐(Dnp)은 독점적인 켄처(quencher) 수용체이다. 이들 2개의 기 사이의 거리는 광 여기시에, 공여체 형광 에너지가 공명 에너지 전달을 통해 수용체에 의해 상당히 켄칭되도록 선택되었다. BACE1에 의한 절단시, 형광단 Mca는 켄칭 기 Dnp로부터 분리되어 공여체의 전체 형광 수율을 회복시킨다. 형광의 증가는 단백질 분해의 속도와 선형적으로 관련되어 있다(Koike H et al . J. Biochem . 1999, 126, 235-242).
간략하게 말하면, 384 웰 포맷 내에서, 1μg/ml의 최종 농도의 재조합 BACE1 단백질을 화합물의 부재 또는 존재 하에 인큐베이션 완충액(40mM 시트르산염 완충액 pH 5.0, 0.04% PEG, 4% DMSO) 내의 10μm 기질과 함께 실온에서 120분 동안 인큐베이션한다. 그 다음에, T=0 및 T=120(320nm에서 여기 및 405nm에서 방출)에서의 형광 측정에 의해 단백질 분해의 양을 직접 측정한다. 결과는 T120 내지 T0 사이의 차이로서 RFU로 표현한다. 제곱법의 최소합에 의해 %제어min 대 화합물 농도의 도표에 최상의 적합(best-fit) 곡선을 피팅한다. 이로부터 IC50 값(활성의 50% 억제를 일으키는 억제 농도)을 얻을 수 있다.
LC = 낮은 제어 값의 중앙값
= 낮은 제어: 효소가 없는 상태의 반응
HC = 높은 제어 값의 중앙값
= 높은 제어: 효소가 있는 상태의 반응
%효과 = 100 - [(샘플 - LC) / (HC - LC) * 100]
%제어 = (샘플/HC) * 100
%제어min = (샘플 - LC) / (HC - LC) * 100
하기의 예시된 화합물을 본질적으로 상기에 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기의 활성을 나타내었다:
화합물 번호 생화학적 FRET 기반 검정
pIC 50
1 4.92
2 5.43
3 6.87
4 6.63
5 7.43
6 7.71
7 7.38
8 7.48
9 7.47
10 7.32
11 6.97
12 7.43
13 4.74
14 6.76
15 7.44
16 7.31
17 7.17
18 7.08
19 6.75
20 6.99
21 7.02
22 6.65
23 6.74
24 5.50
25 5.30
26 5.54
27 <4.3
28 5.72
29 5.69
30 4.46
31 <4.3
32 5.76
SKNBE2 세포에서의 세포 알파리사 검정
2개의 알파리사 검정에서는, 사람 신경아세포종 SKNBE2 세포의 배지 내에서 생성되고 이로 분비되는 Aβtotal 및 Aβ42의 수준을 정량한다. 이 검정은 야생형 아밀로이드 전구체 단백질(hAPP695)을 발현하는 사람 신경아세포종 SKNBE2를 기반으로 한다. 화합물을 희석하고 이들 세포에 첨가하며, 18시간 동안 인큐베이션하고 나서, Aβ42 및 Aβtotal의 측정을 실시한다. Aβtotal 및 Aβ42를 샌드위치 알파리사로 측정한다. 알파리사는 Aββtotal 및 Aβ42를 각각 검출하기 위한, 스트렙타비딘 코팅 비드에 부착된 바이오티닐화된 항체 AbN/25 및 항체 Ab4G8 또는 cAb42/26이 접합된 수용체 비드를 사용하는 샌드위치 검정이다. Aβtotal 또는 Aβ42의 존재시, 비드는 밀접해진다. 공여체 비드의 여기는 일중항 산소 분자의 방출을 유발시키고, 이러한 산소 분자의 방출은 수용체 비드에서 에너지 전달의 캐스케이드를 촉발시켜 그 결과 광 방출이 일어난다. 1시간 인큐베이션 후에 광 방출을 측정한다(650nm에서 여기 및 615nm에서 방출).
제곱법의 최소합에 의해 %제어min 대 화합물 농도의 도표에 최상의 적합 곡선을 피팅한다. 이로부터 IC50 값(활성의 50% 억제를 일으키는 억제 농도)을 얻을 수 있다.
LC = 낮은 제어 값의 중앙값
= 낮은 제어: 알파리사에서 바이오티닐화된 Ab 없이, 화합물 없이 사전 인큐베이션된 세포
HC = 높은 제어 값의 중앙값
= 높은 제어: 화합물 없이 사전 인큐베이션된 세포
%효과 = 100 - [(샘플 - LC) / (HC - LC) * 100]
%제어 = (샘플/HC) * 100
%제어min = (샘플 - LC) / (HC - LC) * 100
하기의 예시된 화합물을 본질적으로 상기에 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기의 활성을 나타내었다:
화합물 번호 SKNBE2 세포에서의 세포 알파리사 검정
Aβ42
pIC 50 		SKNBE2 세포에서의 세포 알파리사 검정
Aβ total
pIC 50
1 5.4 5.41
2 5.35 5.37
3 7 7.02
4 6.96 7.03
5 8.53 8.55
6 8.8 8.85
7 8.18 8.25
8 8.66 8.69
9 7.92 7.97
10 7.87 7.9
11 7.96 8.02
12 7.85 7.9
13 5.63 5.62
14 7.43 7.45
15 8.03 8.05
16 7.69 7.71
17 7.49 7.47
18 7.50 7.51
19 7.18 7.20
20 7.62 7.63
21 7.83 7.79
22 7.31 7.32
23 7.12 7.11
24 6.30 6.35
25 6.04 6.07
26 6.30 6.27
27 <5 <5
28 6.53 6.52
29 6.32 6.33
30 <5 <5
31 <5 <5
32 6.54 6.53
생체내 효능의 입증
본 발명의 Aβ 펩티드 저하제는 사람과 같은 포유류에서 AD를 치료하는 데 사용될 수 있거나, 대안적으로 마우스, 래트 또는 기니 피그와 같은 것이지만 이들로 한정되지 않는 동물 모델에서 효능을 입증하는 데 사용될 수 있다. 이러한 포유류는 AD로 진단되지 않을 수 있거나, AD에 대한 유전적 소인을 가지지 않을 수 있지만, AD에 걸린 사람에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 Aβ를 과다생산하여 마침내는 이를 침착시키도록 형질전환(transgenic)된 것일 수 있다.
Aβ 펩티드 저하제는 임의의 표준 방법을 이용하여 임의의 표준 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, Aβ 펩티드 저하제는 경구 또는 주사로 취해지는 액체, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. Aβ 펩티드 저하제는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액(CSF) 또는 뇌에서 Aβ 펩티드 수준을 상당히 감소시키기에 충분한 임의의 용량으로 투여될 수 있다.
Aβ42 펩티드 저하제의 급성 투여가 생체 내에서 Aβ42 펩티드 수준을 감소시킬 것인지의 여부를 결정하기 위하여, 비형질전환 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트를 사용하였다. Aβ 펩티드 저하제로 처리된 동물을 처리되지 않거나 비히클로 처리된 동물과 비교 조사하고, 가용성 Aβ42 및 전체 Aβ의 뇌 수준을 표준 기술, 예를 들어 ELISA를 사용하여 정량하였다. 처리 기간은 수 시간(h)으로부터 수 일까지 달랐으며, 일단 효과 개시의 시간적 경과를 확립할 수 있으면, Aβ42 저하 결과에 기초하여 이를 조정하였다.
생체 내 Aβ42 저하를 측정하기 위한 통상적인 프로토콜을 나타내지만, 이는 검출가능한 Aβ 수준을 최적화하기 위해 사용될 수 있는 많은 변형 방법 중 하나일 뿐이다. 예를 들어, Aβ 펩티드 강하 화합물을 20% 하이드록시프로필 β 사이클로덱스트린 중에서 제형화하였다. Aβ 펩티드 저하제를 밤새 절식시킨 동물에 단일 경구 용량(p.o.) 또는 단일 피하 용량(s.c.)으로 투여하였다. 일정 시간, 통상 2시간 또는 4시간(표 7에 나타냄) 후, 동물을 희생시키고 Aβ42 수준을 분석하였다.
단두하고 방혈시켜 EDTA 처리된 수집관에 혈액을 수집하였다. 혈액을 4℃ 에서 10분 동안 1900g으로 원심분리하고, 혈장을 회수하여 나중의 분석을 위하여 급속 냉동시켰다. 두개골과 후뇌로부터 뇌를 제거하였다. 소뇌를 제거하여 좌측 반구와 우측 반구를 분리하였다. 좌측 반구는 시험 화합물 수준의 정량적 분석을 위하여 -18℃에서 보관하였다. 우측 반구는 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액으로 헹구고, 드라이 아이스 상에서 즉시 냉동시켜서 생화학적 검정을 위하여 균질화시킬 때까지 -80℃에서 보관하였다.
비형질전환 동물로부터의 마우스 뇌를, 예를 들어 뇌 0.158g에 대해 조직 1그램당 8 배 부피의 0.4% DEA(디에틸아민)/50mM NaCl 함유 프로테아제 억제제(Roche-11873580001 또는 04693159001) 중에 재현탁시키고, 0.4% DEA 1.264ml를 첨가하였다. 모든 샘플을 20초 동안 6m/s로 용해 매트릭스 D(MPBio #6913-100)를 사용하여 FastPrep-24 시스템(MP Biomedicals)에서 균질화하였다. 균질물을 221.300 x g으로 50분 동안 원심분리하였다. 이어서, 생성된 고속 상청액을 새로운 에펜도르프관으로 옮겼다. 상청액의 9부를 0.5M Tris-HCl(pH 6.8) 1부로 중화시키고 Aβtotal 및 Aβ42를 정량화하는 데 사용하였다.
뇌 균질물의 가용성 분획 내의 Aβtotal 및 Aβ42의 양을 정량화하기 위하여, 효소 결합 면역흡착 검정(Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)을 사용하였다. 간략하게 말하면, 표준물(합성 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 희석액, Bachem)을 최종 농도 범위 10000pg/ml 내지 0.3pg/ml로 하여, Ultraculture 중의 1.5ml 에펜도르프관 내에서 준비하였다. 샘플 및 표준물을 Aβ42 검출을 위해 HRPO 표지 N-말단 항체, 그리고 Aβtotal 검출을 위해 바이오티닐화된 중간 도메인(mid-domain) 항체 4G8과 동시 인큐베이션(co-incubate)하였다. 이어서, 접합체/샘플 또는 접합체/표준물의 혼합물 50μl를 항체 코팅 플레이트(캡처 항체는 Aβ42 검출을 위해 Aβ42의 C-종결 말단, 항체 JRF/cAβ42/26을, 그리고 Aβtotal 검출을 위해 Aβ의 N-종결 말단, 항체 JRF/rAβ/2를 선택적으로 인식함)에 첨가하였다. 이 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 항체-아밀로이드 복합체를 형성시켰다. 이 인큐베이션 및 후속의 세척 단계 후, 제조업체의 사용설명서에 따라 Quanta Blu 형광발생성 퍼옥시다제 기질(Pierce Corp., 미국 일리노이주 록포드 소재)을 첨가하여 Aβ42 정량화를 위한 ELISA를 종료하였다. 10분 내지 15분 후 판독을 수행하였다(여기 320nm/방출 420nm).
Aβtotal의 검출을 위해, 스트렙타비딘-퍼옥시다제-접합체를 첨가하고, 60 분 후 추가 세척 단계 후, 제조업체의 사용설명서에 따라 Quanta Blu 형광발생성 퍼옥시다제 기질(Pierce Corp., 미국 일리노이주 록포드 소재)을 첨가하였다. 10분 내지 15분 후 판독을 수행하였다(여기 320nm/방출 420nm).
이 모델에서는, 처리되지 않은 동물과 비교하여 Aβ42의 저하율이 20% 이상인 것이 유리할 것이다.
하기의 예시된 화합물을 본질적으로 상기에 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기의 활성을 나타내었다:
화합물 번호 Ab42(%제어)_평균 Abtotal(%제어)_평균 용량 투여 경로 투여 후 시간
7 73 99 30mg/kg p.o. 4시간
p.o.는 경구를 의미함.

Claims (13)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 호변이성체 또는 입체이성체 형태, 또는 이의 부가 염 또는 용매화물:
    [화학식 I]
    Figure 112019036833760-pct00084

    상기 식에서,
    R1, R2, R3은 독립적으로 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 수소, C1-3알킬, 메톡시메틸, C3-6사이클로알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 호모아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    X1, X2, X3, X4는 독립적으로 C(R5) 또는 N이되, 단 이들 중 2개 이하는 N을 나타내고; R5는 수소, 할로, 시아노, C1-3알킬, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬 및 C3-6사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    L은 결합 또는 -NHCO-이고;
    Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이며;
    여기서 호모아릴은 페닐이거나 또는 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 치환된 페닐이고;
    헤테로아릴은 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 피리다질, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 옥사졸릴 및 옥사디아졸릴(각각은 할로, 시아노, C1-3알킬, C1-3알킬옥시, 모노할로-C1-3알킬 및 폴리할로-C1-3알킬, 및 모노할로-C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1-3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1 - 3알킬로부터 선택되고;
    X1, X2, X3, X4는 독립적으로 C(R5)이며, 여기서 각각의 R5는 수소 및 할로로부터 선택되고;
    L은 결합 또는 -NHCO-이며;
    Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이고;
    여기서 호모아릴은 페닐이거나 또는 할로, 시아노, C1 - 3알킬, C1 - 3알킬옥시 및 폴리할로-C1 - 3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 치환된 페닐이며;
    헤테로아릴은 피리딜, 피리미딜 및 피라지닐(각각은 할로, 시아노, C1 - 3알킬, C1-3알킬옥시 및 폴리할로-C1 - 3알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 부가 염 또는 용매화물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1, R2 및 R3은 수소이고;
    X1은 CF이며;
    X2, X3, X4는 CH이고;
    L은 결합 또는 -NHCO-이며;
    Ar은 호모아릴 또는 헤테로아릴이고;
    여기서 호모아릴은 클로로로 치환된 페닐이며;
    헤테로아릴은 피리딜 및 피리미딜(각각은 클로로, 플루오로, 시아노, 메틸 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 부가 염 또는 용매화물.
  4. 제1항에 있어서, R4로 치환된 탄소 원자는 R 배치를 갖는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R1 및 R3은 수소이고, R2는 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이며;
    R4는 메틸 또는 디플루오로메틸이고;
    X1은 CH 또는 CF이며;
    X2, X3 및 X4는 CH이고;
    L은 -NHCO-이며;
    Ar은 5-클로로피리딘-2-일, 5-시아노피리딘-2-일, 5-플루오로피리딘-2-일, 5-시아노-3-플루오로오로피리딘-2-일, 5-메톡시피라진-2-일 또는 1-디플루오로메틸피라졸-3-일인, 화합물 또는 이의 부가 염 또는 용매화물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 치매 또는 다운 증후군의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  7. 약제학적으로 허용가능한 담체를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 치료학적 유효량과 친밀하게 혼합하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 치매 또는 다운 증후군의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머 질환, 경도 인지 장애, 치매 또는 다운 증후군의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는, 알츠하이머 질환(AD), 경도 인지 장애, 치매 또는 다운 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애의 치료 또는 예방용 약제.
  10. 제6항에 있어서, 치매가 노인성 치매(senility), 루이 소체 치매, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 치매가 노인성 치매(senility), 루이 소체 치매, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매를 포함하는 것인 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 치매가 노인성 치매(senility), 루이 소체 치매, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매를 포함하는 것인 화합물.
  13. 제9항에 있어서, 치매가 노인성 치매(senility), 루이 소체 치매, 뇌졸중 관련 치매, 파킨슨 질환 관련 치매 또는 베타-아밀로이드 관련 치매를 포함하는 것인 약제.
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