KR102002918B1

KR102002918B1 - 석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102002918B1
Application number: KR1020180171041A
Authority: KR
Inventors: 백문기; 김은영; 어서린; 이대우; 김다애; 선우철
Original assignee: 주식회사 신세계인터코스코리아; (주)더마랩
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-07-23

Abstract

본 발명은 석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 석류를 가수분해 추출함으로써 피부 보습 및 주름개선 활성이 우수한 석류 저분자 펩타이드를 함유하는 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

Description

석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing hydrolyzed extract of Pomegranate}

본 발명은 석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 석류를 가수분해 추출하여 피부 보습 및 주름개선 활성이 우수한 저분자 펩타이드 함유 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

인간의 피부는 외부 환경인 물리적, 화학적인 자극으로부터 보호해주는 역할을 하는데, 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개의 층으로 구분되어져 있다. 피부는 인체의 보유하고 있는 약 65~70%의 수분이 체외로 증발되는 것을 조절해준다. 표피의 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하고 인체의 최외각에 존재하여 체내로부터의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단한다. 이러한 각질층을 구성하고 있는 세포에는 수용성 성분인 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하여 피부가 유연성을 나타내도록 작용함은 물론 적절한 수분을 유지할 수 있도록 돕는다.

주름은 특정 방향으로 근육이 오랜 기간 동안 반복하여 움직임으로써 형성되는데, 연령, 외부환경, 자외선 조사 등에 영향을 받는다. 이러한 인자에 의한 피부 세포의 손상은 여러 가지 노화 현상을 일으키는데 진피 매트릭스를 구성하는 콜라겐, 엘라스틴의 생성 및 분해가 원활하지 못해 매트릭스의 견고성이 떨어져 피부의 탄력이 떨어지고 주름이 생성된다.

한편, 엘라스타제(Elastase)는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴(Elastin)을 분해하는 효소인데, 콜라겐과 엘라스틴 같은 결합 조직을 지지하고 구성하는 단백질을 포함한 모든 단백질들을 가수 분해한다. 엘라스타제류의 단백질 분해효소는 다행핵 백혈구와 췌장 이외에도 혈소판, 단핵 백혈구, 거식세포 환경의 배지 그리고 평활근 세포들에서도 확인되었다. 백혈구 엘라스타제는 세린 프로티나아제(Serine proteinase)에 속한다. 즉, 효소의 1차 배열에서 195번 위치에 있는 세린(Serine)잔기의 수산화기가 기질의 발린(Valine)이나 알라닌(Alanine)의 a 탄소(a-carbonyl)를 공격하는 핵친화적인 그룹으로 작용한다. 반면, 섬유아세포 엘라스타제는 활성자리에 금속 이온을 포함하는 메탈로프로티나아제(Metalloproteinase)에 속한다. 다행핵 백혈구의 엘라스타제 활성의 일부는 보체, 림프구의 활성화등과 같이 생체에 유용하게 작용하기도 하지만, 과다한 엘라스타제 활성은 피부에 해롭게 작용한다.

본 발명자들은 피부 보습 증진 및 주름 개선 등의 피부개선효과가 있는 천연물을 선별하고 연구하는 과정에서 석류를 특정 방법으로 가수분해 추출하여 얻어지는 석류 추출물이 활성성분으로서의 석류 저분자 펩타이드를 다량 함유함으로써 우수한 보습 유지 및 주름 개선 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 제2016-0124450호 (2016.10.28) (0002) 대한민국 공개특허 제2009-0047916호 (2009.05.13)

본 발명은 석류의 가수분해 추출물을 함유하여 우수한 피부 보습 증진 및 주름 개선 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 우수한 피부 보습 증진 및 주름 개선 효과를 나타내는 석류 가수분해 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 석류 가수분해 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 석류 가수분해 추출물은 석류 추출물을 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 가수분해하여 제조되는 것이며, 더욱 바람직하게는 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 순차 가수분해하여 제조되는 것임을 특징으로 한다.

상기 석류 가수분해 추출물은 분자량 3,000 Da 이하의 석류 저분자 펩타이드를 함유하는 것임을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 한다. 또한 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선용임을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 (A) 석류 추출물을 제조하는 단계;

(B) b1)상기 석류 추출물에 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 7~9로 보정하고, 알칼레이즈(Alcalase)를 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계;

b2) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 3~4로 보정하고, 비스코자임(Viscozyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계;

b3) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 5~7로 보정하고, 플레버자임(Flavourzyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계; 및

(C) 반응 완료 후 반응액을 3~5일간 실온에서 방치하여 침전물을 여과하고 농축시키는 단계를 포함하는 석류 가수분해 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 (A) 단계의 석류 추출물은 석류의 과피, 과육 또는 그 혼합물의 열수 추출물이거나, 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매에 의한 용매 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 석류 가수분해 추출물은 석류 저분자 펩타이드를 다량 함유하여 우수한 엘라스타제 저해 활성 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과, 보습 관련 인자 발현 증가 효과, MMP-1 생성 억제 효과를 나타내므로 보습 및 주름개선의 항노화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 석류 가수분해 추출물의 분자량 분포 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 석류 가수분해 추출물에 함유된 석류 저분자 펩타이드의 아미노산 조성 분석결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

석류(Punica granatum)는 석류나무과(Punicaceae)에 속하는 다년생 낙엽활엽소교목으로, 열매는 지름 6~8cm에 둥근 모양이다. 단단하고 노르스름한 껍질이 감싸고 있으며, 과육 속에는 많은 종자가 있다. 한방에서 약재로 쓰이며 동맥경화, 설사, 무좀 등에 쓰인다.

석류피(石榴皮)는 석류(Punica granatum L.)의 익은 열매의 껍질을 말린 것이다. 가을에 열매가 익은 다음 따서 쪼개어 씨와 속을 버리고 햇볕에 말린다. 맛은 시고 떫으며 성질은 따뜻하고 독이 있다. 석류과피(石榴果皮), 석류각(石榴殼)이라고 불리기도 한다. 석류피에는 Tannins, Piperidine alkaloids, Pelletierine, Pseudopelletierine 등이 함유된 것으로 알려져 있다. 한의학에 따르면 설사, 이질, 자궁 부정 출혈, 장출혈, 대하증, 유정(遺精), 탈항 등 질환에 탕제,산제 형태로 만들어 먹는다. 외용약으로 쓸 때는 가루 내서 뿌리거나 가루를 기초(약)제에 개어 바른다.

펩타이드는 다양한 조합의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 중합물을 형성하고 있는 것으로, 일반적으로 2∼50개 아미노산이 결합되어져 있고 분자량 10,000이하의 것을 말한다. 아미노산의 결합수에 따라 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드로 분류되어지며, 폴리펩타이드는 10개 이상 다수의 아미노산으로 구성되어있는 펩타이드를 말한다.

본 발명에 따르면, 석류 가수분해 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 석류 가수분해 추출물은 석류 추출물을 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 가수분해하여 제조되는 것이며, 더욱 바람직하게는 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 순차 가수분해하여 제조되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 석류 가수분해 추출물은 다음과 같은 방법에 의하여 제조된다.

(A) 석류 추출물을 제조하는 단계; (B) b1)상기 석류 추출물에 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 7~9로 보정하고, 알칼레이즈(Alcalase)를 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계; b2) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 3~4로 보정하고, 비스코자임(Viscozyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계; b3) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 5~7로 보정하고, 플레버자임(Flavourzyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계; 및 (C) 반응 완료 후 반응액을 3~5일간 실온에서 방치하여 침전물을 여과하고 농축시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 석류 가수분해 추출물을 제조한다.

구체적으로는, 먼저, 석류를 열수 추출하거나, 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 석류 추출물을 제조한다. 바람직하게는 추출용매로서 정제수를 10~100배 중량을 사용하여 열수추출한다. 석류 추출물의 제조에는 석류의 과피, 과육 또는 과피와 과육의 혼합물을 사용할 수 있다.

위의 방법으로 석류를 추출한 뒤 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 가수분해하여 가수분해 추출물을 제조한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 석류추출물을 가수분해효소로서 알칼레이즈(Alcalase) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 적정 pH인 pH 7~9로 보정한다. 알칼레이즈(Alcalase)를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~55 ℃에서 100~200 rpm으로 2~6 시간 동안 반응시켜 효소 가수분해한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 가수분해효소로서 비스코자임(Viscozyme)을 사용하는 경우에는 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 적정 pH인 pH 3~4로 보정한다. 비스코자임(Viscozyme)을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~55 ℃에서 100~200 rpm으로 2~6 시간 동안 반응시켜 효소 가수분해한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 가수분해효소로서 플레버자임(Flavourzyme)을 사용하는 경우에는 그 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 적정 pH인 pH 5~7로 보정한다. 플레버자임(Flavourzyme)을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~55 ℃에서 100~200 rpm으로 2~6 시간 반응시켜 효소 가수분해한다.

가장 바람직하게는 상기 세 가지 효소 가수분해를 순차적으로 실시하여 가수분해물을 제조한다. 위의 반응액을 3~5 일간 실온에서 방치하여 침전물을 여과하고, 농축하여 석류 가수분해 추출물을 제조한다.

이와 같이 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme), 플레버자임(Flavourzyme)으로 순차 효소 반응시켜 제조되는 석류 가수분해추출물에는 분자량 3,000 Da 이하의 석류 저분자 펩타이드가 다량 함유되어 있는 것을 확인하였다(시험예 9). 상기 석류 저분자 펩타이드는 Serine 외 13종의 아미노산으로 구성되어 있으며, Serine의 조성 비율이 가장 높은 것으로 확인되었다(시험예 10).

위와 같은 석류 저분자 펩타이드를 함유하는 본 발명의 석류 가수분해추출물은 석류 열수 추출물에 비하여 엘라스타제 저해 활성 효과(시험예 2), 콜라겐 생합성 촉진 효과(시험예 3), 보습 관련 인자 발현 증가 효과(시험예 4), MMP-1 생성 억제 효과(시험예 5), 피부 주름 개선 효과(시험예 6)에 있어서 우수하게 나타났다.

상기 석류 가수분해 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10.0 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 파운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 석류 열수 추출물의 제조

석류의 과피와 과육 혼합물을 정제수로 세척한 뒤 건조하고, 추출용매로서 정제수 20배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 반응액을 3 일간 실온에서 방치하여 침전물을 300 메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

실시예 1: 석류 알칼레이즈(Alcalase) 가수분해 추출물의 제조

위의 방법으로 추출한 뒤 가수분해효소로서 알칼레이즈(Alcalase) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 7~9로 보정하였다. 알칼레이즈(Alcalase) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200rpm으로 2~6 시간 동안 반응시켰다.

실시예 2: 석류 비스코자임(Viscozyme) 가수분해 추출물의 제조

위의 방법으로 추출한 뒤 가수분해효소로서 비스코자임(Viscozyme) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 3~4로 보정하였다. 비스코자임(Viscozyme) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200 rpm으로 2~6 시간 동안 반응시켰다.

실시예 3: 석류 플레버자임(Flavourzyme) 가수분해 추출물의 제조

위의 방법으로 추출한 뒤 가수분해효소로서 플레버자임(Flavourzyme) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 5~7로 보정하였다. 플레버자임(Flavourzyme) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200rpm으로 2~6시간 동안 반응시켰다.

실시예 4: 석류 복합가수분해 추출물의 제조

위의 방법으로 추출한 뒤 가수분해효소로서 알칼레이즈(Alcalase) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 7~9로 보정하였다. 알칼레이즈(Alcalase) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200rpm으로 2~6시간 동안 반응시켰다.

위의 방법으로 반응시킨 뒤 가수분해효소로서 비스코자임(Viscozyme) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 3~4로 보정하였다. 비스코자임(Viscozyme) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200rpm으로 2~6시간 동안 반응시켰다.

위의 방법으로 반응시킨 뒤 가수분해효소로서 플레버자임(Flavourzyme) 활성을 위해 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 5~7로 보정하였다. 플레버자임(Flavourzyme) 1 중량%를 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50℃에서 200rpm으로 2~6시간 동안 반응시켰다.

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포 농도로 접종하여, 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 실시예 1 내지 4 및 제조예 1을 시료농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24 시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl] - 2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후 (3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.

세포생존율(%) = B/A x 100

A: 대조군의 흡광도

B: 시료첨가군의 흡광도

시료 사용 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율(%)
시료 사용 농도 (㎍/㎖)	제조예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4
0	100	100	100	100	100
50	100	100	100	100	100
100	100	100	100	100	100
500	100	100	100	100	100
1000	97.5	98.1	98.4	98.2	97.9

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 4 및 제조예 1 시료 모두 500㎍/㎖ 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았으며 사용 농도가 1000㎍/㎖에서는 세포 생존율이 감소하였으나 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 엘라스타제 제어 활성 확인

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

엘라스틴을 포함하는 한천배지에 엘라스타제만을 적가하는 한편, 실시예 1 내지 4 및 제조예 1의 농도가 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5% 되는 용액을 시료로 하여 엘라스타제와 함께 적가하여 배지 상에 나타나는 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 시료의 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 Retinol crystal을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다. 상기 시험결과를 하기의 표 2에 나타내었다.

시료농도 (%)	Halo diameter (cm)
시료농도 (%)	제조예１	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	Elastase	Retinol crystal
0.01	1.8	1.7	1.8	1.5	1.3	1.8	0.9
0.05	1.6	1.5	1.8	1.4	1.1
0.10	1.4	1.2	1.7	1.2	1.0
0.50	1.4	1.1	1.5	1.2	0.9

헤일로 직경(Halo diameter)이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 4 및 제조예 1을 처리했을 때 헤일로 직경(halo diameter)이 감소하는 것으로 엘라스타제 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 실시예의 가수분해추출물 시료를 처리했을 때, 제조예의 열수추출물 시료를 처리했을 때 보다 더 우수한 엘라스타제 억제효과를 나타내었으며, 그 중에서도 실시예 4의 석류 복합가수분해 추출물에서 가장 우수한 엘라스타제 억제 효과를 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진 효과 확인

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 하기 식에 따라 계산하였으며, 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A x 100

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 양

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 양

시료 농도 (㎍/㎖)	procollagen 발현율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	제조예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4
0	3.51	3.85	3.10	4.85	10.97
50	25.48	31.04	34.35	37.68	48.47
100	38.51	45.97	47.65	62.43	78.43
500	59.44	61.82	78.53	94.21	125.58
1000	78.57	78.57	151.47	160.03	182.53

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 열수 추출물에 비하여 실시예의 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme), 플레버자임(Flavourzyme) 효소 가수분해물이 더 우수한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내었으며, 3가지 가수분해효소를 순차적으로 적용한 실시예 4의 석류 가수분해추출물에서 가장 우수한 콜라겐 생합성 촉진 효과를 나타내었다.

시험예 4: 보습 관련 인자 발현 증가 효과 확인

CCD-986Sk 세포를 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18 시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 Hyaluronan Synthase-3(HAS-3)의 발현 증가율을 확인하였다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

HAS-3 발현 증가율(%) = B/A x 100

A: 대조군 HAS-3 발현 양

B: 시료 HAS-3 발현 양

시료명	처리농도(w/v%)	HAS-3 증가율(%)
제조예 1	0.1	84.1
실시예 1	0.1	84.5
실시예 2	0.1	83.9
실시예 3	0.1	85.1
실시예 4	0.1	91.0
Hyaluronic Acid	0.1	87.7

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme), 플레버자임(Flavourzyme) 가수분해 효소를 순차적으로 적용한 추출물인 실시예 4에서 가장 우수한 HAS-3 증가율을 나타내었다.

시험예 5: MMP-1 생성억제효과 확인

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하였다. MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다. 하기 식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

MMP-1 생성억제율(%) = [1-(B/A)] x 100

A : 대조군의 MMP-1의 양

B : 실험군의 MMP-1의 양

시료 농도 (㎍/㎖)	MMP-1 생성 억제율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	제조예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	TGF-β
50	15.6	14.5	14.7	16.4	38.6	43.5
100	24.3	21.4	25.5	24.8	60.4	66.5
500	36.3	33.7	41.0	40.2	73.8	75.7
1000	49.4	50.2	57.2	55.8	90.1	94.2

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 가수분해추출물에서 더 높은 MMP-1 생성 억제율을 나타내었다. 실시예 4에서 MMP-1 생성 억제율이 가장 높았으며 대조군 TGF-β와 유사할 정도로 우수한 효과를 나타내었다.

제형예 1 및 비교예 1: 석류 가수분해 추출물을 함유하는 세럼의 제조

하기의 표 6의 조성과 같이, 상기 석류 가수분해 추출물(실시예 4)을 함유하거나 함유하지 않은 세럼을 제조하여 각각 제형예 1과 비교예 1로 하였다.

원료	함량(중량%)
원료	제형예 1	비교예 1
석류 가수분해 추출물(실시예 4)	1.0	-
밀납	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5	0.5
미네랄 오일	10.0	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0	1.0
스테아린산	1.5	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0	1.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
카르복시폴리머	0.1	0.1
트리에탄올아민	0.1	0.1
페녹시에탄올	적량	적량
정제수	To 100	To 100

제형예 2 및 비교예 2: 석류 가수분해 추출물을 함유하는 크림의 제조

하기 표 7의 조성과 같이, 상기 석류 가수분해 추출물(실시예 4)을 함유하거나 함유하지 않은 크림을 제조하여 각각 제형예 2와 비교예 2로 하였다.

원료	함량(중량%)
원료	제형예 2	비교예 2
석류 가수분해 추출물(실시예 4)	1.0	-
시어버터	2.0	2.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8	0.8
미네랄 오일	10.0	10.0
디메치콘	3.0	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0	1.0
세테아릴알코올	2.0	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0	1.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
카르복시폴리머	0.25	0.25
트리에탄올아민	0.25	0.25
페녹시에탄올	적량	적량
정제수	To 100	To 100

시험예 6: 피부주름 개선 효과 확인

본 발명의 석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부주름 개선 효과를 건강한 30세에서 50세의 여성 40명을 대상으로 측정하였다. 먼저, 4개 그룹으로 나누고, A 그룹에는 제형예 1을, B 그룹에는 제형예 2를, C 그룹에는 비교예 1을, D 그룹에는 비교예 2의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 3개월간 도포하였다. 3개월 후 주름의 개선 정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

피험자의 설문은 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판단하였으며 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 9에 나타내었다.

시료	개선 없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
제형예 1	1	1	4	4
제형예 2	-	2	3	5
비교예 1	7	3	-	-
비교예 2	6	3	1	-

시료	주름 밀도 감소율(%)
제형예 1	44
제형예 2	49
비교예 1	11
비교예 2	12

상기 표 8 및 9로부터 석류 가수분해 추출물(실시예 4)을 함유한 제형예 1 및 2의 피부주름 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.

시험예 7: 피부 안전성 시험

본 발명의 석류 가수분해 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 안전성을 확인하기 위하여 과거 피부자극에 과민 반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20~30대 여성 20명을 대상으로 인체 피부첩포시험을 하였다. 우선 시험 부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 제형예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2의 물질을 15㎍씩 핀챔버(Finn chamber, 100x 10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후, 시험대상자의 전박(forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24 시간 동안 첩포하고, 첩포를 제거한 후, 펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시 후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경(8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부 반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG, International Contact Dermatitis Research Group)의 규정에 따라 판정하였다. 하기 식에 따라 평균피부반응도(mean response rate)를 계산하고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

평균피부반응도 = (A x B x 100 x 1/2) x [3(최대점수) x n]

(A: 점수 B: 반응 수 n: 총 피검자 수)

* 피부 반응의 평가 기준 및 점수

시험물질	1시간 후			24시간 후			반응도(%) (n=20)
시험물질	±	+	++	±	+	++	반응도(%) (n=20)
제형예 1	-	-	-	-	-	-	0.00
제형예 2	-	-	-	-	-	-	0.00
비교예 1	-	-	-	-	-	-	0.00
비교예 2	-	-	-	-	-	-	0.00

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 석류 가수분해 추출물(실시예 4)을 함유하는 화장료 조성물에서 피부자극이 나타나지 않아 피부 안전성이 우수함을 확인하였다.

시험예 8: 제형의 안정성 시험

상기 본 발명의 석류 가수분해 추출물을 함유한 화장료 조성물에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다. 실내(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰하며, 안정성을 확인하였다. 제형의 변색 및 변취, 분리정도를 평가하였고 결과를 하기 표 11에 기재하였다.

<제형 안정 등급>

0: 변화 없음, 1: 미세한 변화, 2: 변화, 3: 극심한 변화

구 분	제형의 안정성
	제형예 1			제형예 2			비교예 1			비교예 2
	25℃	4℃	50℃	25℃	4℃	50℃	25℃	4℃	50℃	25℃	4℃	50℃
변색	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
변취	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 제형예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2 모두 45℃와 4℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고, 석류 가수분해 추출물이 제형 내에서 안정한 상태로 존재함을 알 수 있다.

시험예 9: 분자량 분포 확인

상기 실시예 4에서 제조된 석류 가수분해 추출물의 분자량 분포 확인을 위해 ㈜한국고분자 시험연구소에서 GPC(Gel permeation chromatograph, EcoSEC HLC-8320, Tosoh)를 이용하여 분석하였다. 용해시킨 시료를 투과시켜 컬럼 안에 분자 크기 차이에 따라 분리한다. 분자 크기가 큰 것은 겔 표면의 다공으로의 침투가 적기 때문에 작은 분자보다 빨리 컬럼 속을 이동하여 용출된다. 분자 사이즈 별로 용출시켜 RI(굴절률)의 차이나 UV(작용기의 흡수)를 이용하여 분자량을 확인한다. 이 때 사용된 GPC의 조건은 검출기: RI-detector, 전개용매: 0.1M NaNO₃, 컬럼 : 2 x TSKgel GMPWxl + TSKgel G2500PWxl (7.8 x 300 mm), 온도 : 40 ℃, 유속 : 1 mL/min, 주입양 : 100 uL, 3 mg/mL, 표준물질 : PEG/PEO 이다. 분석 결과를 도 1과 표 12에 나타내었다.

Peptide size	Relative content(%)	Peak No.
≤ 349 Da	37.7	5
349 ~ 525 Da	7.8	4
525 ~ 722 Da	10.7	3
722 ~ 1,190 Da	14.1	2
1,190 ~ 2,628 Da	29.7	1
계	100	-

상기 표 12의 결과에서 보는 바와 같이, 석류 가수분해 추출물(실시예 4)에는 분자량 3,000 Da 이하의 저분자 펩타이드가 함유되어 있음을 알 수 있다.

시험예 10: 아미노산 조성 확인

상기 석류 저분자 펩타이드의 아미노산 조성을 확인하기 위해 강릉 원주대학교에서 Amino acid analyzer(L-8800, L-8900 High Speed Amino acid analyzer, Hitachi사)를 이용하여 분석하였다. 단백질을 산(6N HCl) 가수분해한 시료를 이온교환수지 컬럼에 통과시킨다. 이때 다양한 pH와 이온 강도를 가진 buffer가 컬럼을 흐르면서 각종 아미노산들이 분리되고, 고온의 reaction coil에서 ninhydrin과 반응하여 발색 화합물이 형성된다. 형성된 화합물은 검출기(UV/VIS Detector)에서 흡광도를 측정하여 각각의 아미노산들을 정성 및 정량한다. 이 때 분석조건은 검출기 : UV (570nm, 440nm), 컬럼 : Ion exchange (4.6mmㅧ60mm), 온도 : 57~62℃ (Column oven temp.), 135℃(Reaction coil temp.), 유속 : 0.4mL/min (Pump 1), 0.35mL/min (Pump 2), 주입양 : 20 uL이다. 분석 결과를 도 2와 표 13에 나타내었다.

Amino Acids	Relative content(%)	Peak No.
Serine	13.3	3
Aspartic acid	12.9	1
Alanine	11.5	6
Valine	11.3	7
Threonine	10.1	2
Glycine	8.7	5
Tyrosine	6.9	11
Leucine	6.4	10
Glutamic acid	5.3	4
Lysine	4.4	12
Isoleucine	3.5	9
Metionine	2.0	8
Histidine	1.9	13
Arginine	1.8	14
계	100	-

상기 표 13의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 석류 저분자 펩타이드는 Serine 외 13종의 아미노산으로 구성되어 있으며, Serine의 조성 비율이 13.3%로 가장 높았다.

Claims

석류 추출물을 알칼레이즈(Alcalase), 비스코자임(Viscozyme) 및 플레버자임(Flavourzyme)으로 순차 가수분해하여 제조되는 것으로서, 분자량 3,000 Da 이하의 석류 저분자 펩타이드를 함유하는 석류 가수분해 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(A) 석류의 과피, 과육 또는 그 혼합물을 열수추출하여 석류 추출물을 제조하는 단계;
(B) b1)상기 석류 추출물에 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 7~9로 보정하고, 알칼레이즈(Alcalase)를 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계;
b2) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 3~4로 보정하고, 비스코자임(Viscozyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계;
b3) 상기 효소반응 완료 후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0)와 수산화나트륨 버퍼(sodium hydroxide buffer, pH 10.0)를 가하여 pH 5~7로 보정하고, 플레버자임(Flavourzyme)을 가하여 50~55℃에서 100~200rpm으로 2~6시간 반응시키는 단계; 및
(C) 반응 완료 후 반응액을 3~5일간 실온에서 방치하여 침전물을 여과하고 농축시키는 단계를 포함하는 석류 가수분해 추출물의 제조방법.
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