KR101971243B1 - 4'-o-메틸알피눔 이소플라본을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 상기 피부 미백용 조성물은 α-MSH에 의해 유발되는 멜라닌 생성을 억제하고, 활성 산소 라디칼을 제거하여 미백 효과를 가진다.

Description

4'-O-메틸알피눔 이소플라본을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 {Composition for Whitening Skin Comprising 4'-O-Methylalpinum Isoflavone or Pharmaceutically Acceptable Salt Thereof}

본 발명은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

멜라닌은 흑갈색을 띄는 색소로 일정량 이상의 자외선을 흡수하여 자외선의 침투를 차단, 체온을 유지하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 멜라닌의 생성과 분포는 자외선이나 신호전달물질 등의 내외부적 요인의 조절을 통해 수행되며, 이는 피부의 색을 결정하기도 한다. 멜라닌은 자외선 차단 및 물리화학적 외부 독성물질로부터 피부를 보호하는 순기능이 있으나, 멜라닌이 과잉 생성되게 되면 기미, 주근깨, 과색소침착, 피부노화와 같은 문제를 야기한다는 문제점도 있다.

이러한 멜라닌은 멜라닌 형성 세포 (멜라노사이트, melanocyte)의 내부에 존재하는 멜라노좀 (melanosome)에서 멜라닌 생합성 과정의 중요 효소인 티로시나아제 (tyrosinase)의 연속적인 산화반응을 통해 생성되는데, 피부의 색소 침착은 멜라노사이트에서 표피에 있는 각질형성세포로 멜라노좀이 이동하며 발생한다. 티로시나아제는 멜라닌 합성 과정에서 티로신을 3,4-디하이드록시 페닐알라닌 (DOPA)으로, DOPA를 DOPA 퀴논으로 산화시키는 작용을 한다.

종래의 피부 미백용 성분으로 사용되던 합성 항산화제인 아스코르브산 (ascorbic acid), 누룩산 (kojic acid) 및 알부틴과 같은 성분들은 티로시나아제를 억제하여 효과적인 미백제로 화장품에 널리 사용되고 있다. 다만 누룩산이나 알부틴의 경우 뛰어난 미백 효과에도 불구하고, 제품의 안전성이 낮다는 문제점을 가지고 있다. 일반적으로 천연 식물 추출물은 합성 항산화제보다 높은 안전성을 가지며, 항염증 작용, 자외선 흡수 및 피부 보습 작용 뿐 아니라, 엘라스타아제 (elastase), 콜라게나아제 (collagenase) 등의 효소 억제, 활성산소 소거 및 티로사나아제 억제 등의 다양한 효과를 나타내며, 피부 건강을 증진시키고 보호하는데 도움을 준다.

본 발명의 목적은 안정성이 높으면서도, 미백 효과가 뛰어난 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 α-MSH에 의하여 유발되는 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 달성하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 다른 피부 미백용 성분, 예컨대 아스코르브산, 누룩산 또는 알부틴 중 선택되는 하나 이상을 함께 포함하는 것인 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 이러한 피부 미백용 조성물을 포함하는 피부 외용제를 제공한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 4'-O-메틸알피눔 이소플라본은 활성 산소 라디칼을 제거하고, 농도 의존적으로 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성을 억제하여 기존의 알부틴 등의 피부 미백 성분과 비교하여 더 월등한 피부 미백 효과를 가진다.

도 1은 알피눔 이소플라본 및 본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본의 악성흑색종 세포 (도 1A) 및 각질화 세포 (도 1B)에 대한 세포 독성을 비교한 것이다.
도 2는 알부틴 및 BHA와 본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본의 슈퍼옥사이드 라디칼 제거 효과를 측정, 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본이 농도 의존적으로 활성 산소를 제거한다는 것을 확인한 것이다.
도 4는 알부틴 및 본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정, 비교한 것이다.
도 5는 알부틴 및 본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본의 세포 내 티로시나아제 활성을 측정, 비교한 것이다.

본 발명의 발명자들은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본이 α-MSH에 의하여 유발되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있다는 것을 실험적으로 증명하였으며, 이러한 멜라닌 생성 억제 기전에는 4'-O-메틸알피눔 이소플라본의 항산화 효과 및 티로시나아제에 대한 활성 억제가 관여한다는 점을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서는 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 4'-O-메틸알피눔 이소플라본은 하기 [화학식 1]의 구조를 갖는다:

[화학식 1]

.

본 발명의 조성물에 포함되는 4'-O-메틸알피눔 이소플라본은 활성 산소 라디칼을 제거하는 효과를 가지며, α-MSH에 의해 유발되는 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 갖는다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 4'-O-메틸알피눔 이소플라본외에도 미백 효과를 갖는 다른 성분을 포함할 수 있으며, 그 예로는 아스코브르산, 누룩산 및 알부틴 등이 있다. 이외에도 미백 효과를 갖고 인체에 해를 입히지 않는 어떠한 성분도 사용할 수 있다.

본 발명에서는, 본 발명의 따른 피부 미백용 조성물을 포함하는 피부 외용제를 제공한다.

본 발명의 피부 외용제는 외용산제, 외용액제, 연고제, 크림제, 겔제, 경고제, 드레싱제, 패취제 및 스프레이제로 이루어지는 군에서 선택되는 제형으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제는 본 발명의 미백 효과를 저해하지 않는 범위 내에서, 사용 및 취급이 용이하도록 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제, 착색제, 안정화제, 착향제, 계면활성제, 유분, 보습제, 알코올, 점증제, 산화방지제, pH 조절제, 또는 자외선 차단제 등을 추가로 함유할 수 있다.

또한 본 발명에서는 본 발명의 따른 피부 미백용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워시 등과 같은 세정제 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이 경우 상기 화장료 조성물은 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 착색제, 보존제, 항산화제, 소포제, 항균제, 항재침착제, 효소, 식물 또는 미네랄 오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물, 왁스 등을 포함하는 부형제를 함유할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

실험예

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

통계학적 처리

모든 통계학적 비교는 one way ANOVA test를 통하여 이루어졌고 군간 비교에는 Dunnett test를 이용하였으며, Prism 5 (Ver. 5.01, GraphPad Software Inc., CA, USA)이 사용되었다. 연구의 결과는 평균±표준편차의 형태로 표기 되었으며, P 값이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

재료

생쥐 유래 악석흑생종 세포인 B16F10세포와 인간 유래 각질화세포인 HaCaT세포는 한국세포주은행 (서울, 한국)에서 구매하여 사용하였으며, 동결상태에서 구매된 세포를 해동하여 배양하였고, 2주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 상기 세포는 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)을 함유한 둘베코수정이글배지 (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium, DMEM)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 세포 생존율 측정 실험

세포 생존율은 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. 측정방법을 간단히 요약하면, 먼저 악성흑색종 세포와 각질화세포를 24 well-plate에 5×10⁴ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때 까지 배양하였다. 다음날 4'-O-메틸알피눔 이소플라본과 알피눔 이소플라본을 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 다음 최대 20㎍/㎖까지 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, MTT 용액을 첨가하고 4시간 동안 방치한 다음, 570 nm 파장에서 측정하였다.

그 결과 4'-O-메틸알피눔 이소플라본은 악성흑색종 세포 (B16F10 cells, A)와 인간 유래 각질화세포 (HaCaT cells, B) 모두에서 심한 세포독성을 발견할 수 없었으나, 알피눔 이소플라본의 경우 세포독성이 관찰되었으며, 인간의 정상세포에서 더 심한 세포독성이 관찰되었다. 알피눔 이소플라본의 LD₅₀은 악성흑색종 (암세포)에서 19.419㎍/㎖, 각질화세포 (정상세포)에서 14.957㎍/㎖이었다. 따라서, 이하 연구는 상대적으로 저농도에서도 세포독성을 가지고 있는 알피눔 이소플라본을 제외하고 4'-O-메틸알피눔 이소플라본만을 이용하여 진행하였다. 4’-O-메틸알피눔 이소플라본과 알피눔 이소플라본의 악성흑색종 세포에 대한 세포 독성 실험 결과는 도 1A로, 인간 유래 각질화세포에 대한 결과는 도 1B로 표시하였다.

실험예 2. 슈퍼옥사이드 라디칼 (superoxide radical) 소거 효과 측정

슈퍼옥사이드 라디칼 소거 효과는 크산틴/크산틴 옥시다아제 (xanthine/xanthine oxidase) 반응에서 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼을 니트로블루 테트라졸륨 (nitroblue tetrazolium test, NBT)으로 검출하는 방법을 통해 측정하였다. 500mM의 Na₂CO₃ 완충액 (pH 10.2), 3mM 크산틴, 3mM EDTA, 0.72mM NBT에 각 농도별로 시료를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 크산틴 옥시다아제 (2units/ml)를 첨가하여 37℃에서 25분간 추가로 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 알부틴 및 3-t-부틸-4-하이드록시아니솔 (BHA)을 사용하였다. 그 결과 동일 농도에서 대조군으로 사용된 알부틴이나 BHA에 비해 4’-O-메틸알피눔 이소플라본이 더 우수한 슈퍼옥사이드 라디칼 제거 효과를 나타내었으며, 이를 도 2로 도시하였다.

실험예 3. 세포 내 활성 산소 (ROS) 측정

세포를 24 well-plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때 까지 배양하였다. 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고 페놀 레드-프리 (phenol red-free) DMEM 배지로 교체하고, 시료를 각 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 리포다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 100ng/ml을 각 well에 첨가한 후 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후 carboxy-H₂DCF-DA 100μM/well 첨가하고 30분간 37 ℃에서 반응시켰다. 반응 후 인산완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 이용하여 2번 세척하고, PBS를 재 첨가하여 시간 별로 형광 플레이트 리더 (fluorescence plate reader)를 이용하여 형광을 측정하였다 (excitation/emission 파장 : 475nm/530nm). 그 결과 4'-O-메틸알피눔 이소플라본이 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였음을 확인하였고, 이를 도 3으로 도시하였다.

실험예 4. 멜라닌 생성량 측정

악성흑색종 세포를 6 well-plate에 3×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 페놀 레드-프리 (phenol red-free) DMEM 배지로 교체한 후, 각 농도별로 시료를 첨가하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 α-MSH 200nM을 각 well에 첨가하고, 48시간 동안 추가로 배양하였다. 48시간 후 배지를 수거하여 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 알부틴을 악성흑색종 세포에 처리하여 사용하였다. 그 결과 4’-O-메틸알피눔 이소플라본이 농도 의존적으로 α-MSH에 의한 멜라닌 생성을 억제하였으며, 동일 농도의 알부틴보다 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 그 결과를 도 4로 도시하였다.

실험예 5. 세포 내 티로시나아제 활성 측정

멜라닌 생성량에 미치는 영향과 동일한 방법으로 α-MSH 200nM로악성흑색종 세포를 자극하였다. 48시간 후 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. Triton X-100이 1% 첨가된 50mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 13,000 rpm, 10분간 원심 분리하여 상등액을 모으고 BCA법으로 단백질을 정량하였다. 동일 농도의 상등액에 2mg/ml L-DOPA를 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 알부틴을 악성흑색종 세포에 처리하여 사용하였다. 그 결과 4’-O-메틸알피눔 이소플라본이 농도 의존적으로 α-MSH에 의한 티로시나아제 활성을 억제하였으며, 동일 농도의 알부틴보다 우수한 효과를 보인다는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 5로 도시하였다.

상술한 바와 같이, 시험관 내 및 세포 내에서 4’-O-메틸알피눔 이소플라본의 항산화 효과를 관찰한 결과 우수한 항산화 효과가 관찰되었으며, 특히 슈퍼옥사이드 라디칼의 제거 효과에서는 양성 대조군으로 사용된 알부틴이나 BHA보다 더 우수한 효과를 나타내었다. 또한 α-MSH에 의한 멜라닌 생성과 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과 농도 의존적으로 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성을 억제하였으며, 동일 농도의 알부틴보다 우수한 효과를 보였다.

이러한 결과는 4’-O-메틸알피눔 이소플라본이 항산화 효과를 발휘함으로써 티로사나아제의 활성을 억제하고, 궁극적으로 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백용 조성물로 사용되기에 적합하다는 점을 시사한다.

Claims (5)

1. 4'-O-메틸알피눔 이소플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물로서,
   상기 미백은 α-MSH(α-Melanocyte-Stimulating Hormone)에 의하여 유발되는 멜라닌 생성을 억제하여 달성되는 것인 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 아스코르브산, 누룩산 및 알부틴으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 피부 미백용 성분을 더 포함하는 것인 피부 미백용 화장료 조성물.
4. 제1항 또는 제3항의 피부 미백용 화장료 조성물을 포함하는 화장품용 피부 외용제.
5. 삭제

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