KR102300737B1

KR102300737B1 - 알피늄이소플라빈 가용화 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102300737B1
Application number: KR1020190175715A
Authority: KR
Inventors: 신대환; 조민정
Original assignee: 주식회사 셀젠텍
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-09-13
Also published as: KR20210083485A

Abstract

본 발명은 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone) 가용화 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약물 전달용 조성물 또는 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 mPEG-b-PLA의 회합으로 이루어진 고분자 마이셀을 사용함으로써 알피늄이소플라본을 효과적으로 가용화시킬 수 있다. 알피늄이소플라본은 난용성 물질로써 수층에는 거의 존재하지 않고 마이셀 내에 봉입됨으로써 가용화되게 된다. 이러한 방식으로 난용성 물질인 알피늄이소플라본은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 알피늄이소플라본의 효과적인 투여를 가능하게 한다. 또한 본 발명의 조성물은 마이셀 안에 있는 알피늄이소플라본이 서방출 효과를 갖는바, 이러한 서방출 효과는 약물이 체내에서 오래 머물 수 있는 것을 가능하게 한다. 또한 본 발명의 조성물은 독성이 없는 것으로 확인되어 부형제에 따른 독성을 고분자를 사용함으로써 줄일 수 있는 이점이 있다.

Description

알피늄이소플라빈 가용화 조성물 및 이의 용도{A Composition for Solubilizing Alpinumisoflavone and Uses Thereof}

본 발명은 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone) 가용화 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 수난용성 약물인 알피늄이소플라빈을 특정 고분자 중합체에 봉입하여 마이셀을 형성함으로써 물에 대한 용해도를 개선시킨 가용화 조성물 및 상기 알피늄이소플라빈 가용화 조성물의 의약품, 식품, 화장품 소재로의 용도에 관한 것이다.

알피늄이소플라본(Alpinumisoflavone)은 피라노이소플라본 (pyranoisoflavone)이며 꾸찌뽕 나무(Cudrania tricuspidata)의 미성숙과에서 추출한 주요 생물 활성물질 중 하나이다. 알피늄이소플라본은 골 보호, 항 박테리아, 에스트로겐, 항전이, 죽상 보호, 항산화 및 항암 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한 다양한 논문에서 알피늄이소플라본이 시험 관내 및 생체 내 항암 활성을 갖는다는 것이 보고되어 있다.

일반적으로 알피늄이소플라본은 크레모포어 이엘 (Cremophor EL)과 에탄올의 5:5 혼합액에 82 mg/mL, 에탄올에 32 mg/mL 의 용해도를 보이며, 물에서의 용해도가 약 0.000178 mg/mL인 수난용성 약물이다. 그리하여 위에 언급된 다양한 약리학적 유용성에도 불구하고 이 약물의 물에 대한 낮은 용해도와 적합한 제형 연구 부족과 같은 일부 제한 때문에 알피늄이소플라본의 전임상 및 임상에서의 사용은 제한되어 있다.

난용성 약물은 화합물의 구조상 소수성 부위를 포함하고 있어 물에 잘 녹지 않는 약물을 의미하며, 난용성으로 인해 그 실용성이 제한되는 경우가 많다. 예를 들어, 신약으로 개발되는 약물 중 약 41% 이상이 난용성으로 인하여 중도에 포기되고 있으며, 미국 약전(US Pharmacopeia)에 등재된 약물의 약 ⅓이상이 난용성 약물로 분류되고 있다.

이러한 난용성 약물을 사용하기 위해서는 난용성을 해결하기 위한 부가적인 물질이 첨가되어야 하나, 부가되는 물질의 독성으로 인하여 사용이 제한되는 사례가 다수 보고되고 있다. 예컨대, 일반적으로 난용성 물질을 수용화하기 위해서는 유화제를 이용한 유화, 리포좀을 이용한 포집 등이 널리 이용되고 있는데, 인체에서 유래되지 않은 이물질의 혼입과 물리적 불안정성 등으로 인해 사용이 제한되고 있는 실정이다.

따라서 난용성 소재인 알피늄이소플라본의 의약품, 식품 및 화장품과 같은 산업 분야에 응용에 있어 기온, 보관 장소 및 기간에 따른 변질을 막고, 장기간 안정성을 확보하여, 균질화된 수용액 상태를 유지하기 위한 노력은 필수적이며, 이는 지나치게 많은 유화제, 안정제 및 부형제 포함하지 않고 수행되어질 필요성이 있다.

그러나, 현재까지 난용성 소재인 알피늄이소플라본을 의약품, 식품 및 화장품으로 응용하기 위하여 수용화하거나 생체 내 흡수율을 높이기 위한 연구는 전무한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 알피늄이소플라본의 물에 대한 용해성을 개선시킬 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체 마이셀을 사용하여 알피늄이소플라본을 효과적으로 가용화시킬 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명에서는 난용성 약물의 담체로 사용될 수 있는 다양한 중합체(mPEG-b-PLA, Pluronics® F127 및 Soluplus®)에 알피늄이소플라본을 적용한 결과, Pluronics^® F127 또는 Soluplus^®를 사용하여 제조된 마이셀은 침강 또는 비정상적인 조건으로 인하여 검출되지 않거나, 높은 다분산지수 (PDI)를 갖는 다중 분포를 나타내어, 알피늄이소플라본에 적용하는데 적합하지 않은 것으로 나타났다. 반면에, mPEG-b-PLA를 사용하여 제조된 마이셀의 경우 알피늄이소플라본의 로딩 효율이 우수하며, 25nm 내지 35nm의 균일한 입자크기를 갖는바, 알피늄이소플라본의 용해도 및 전달을 위한 최적화할 수 있는 담체임을 최초로 규명하였다.

한국등록특허 제10-1905010호

따라서 본 발명의 목적은, 난용성 소재인 알피늄이소플라빈이 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선된 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 난용성 소재인 알피늄이소플라빈이 물에 대한 용해도가 효과적으로 개선된 알피늄이소플라빈 가용화 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone); 및 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체를 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알피늄이소플라빈은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알피늄이소플라빈은 상기 고분자 중합체가 형성하는 마이셀 내부에 봉입될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이셀은 평균 입자 직경이 25 내지 35nm일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알피늄이소플라빈은 상기 고분자 중합체가 형성하는 마이셀 내부에 봉입됨으로써 가용화될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 간(liver) 또는 신장(kidney) 조직에 선택적일 수 있다.

또한, 본 발명은 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone)이 봉입된 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 알피늄이소플라빈 가용화 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 수난용성 약물인 알피늄이소플라빈이 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이셀은 25nm 내지 35nm의 입자크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물을 화장품 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 약물 전달용 조성물 또는 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 mPEG-b-PLA의 회합으로 이루어진 고분자 마이셀을 사용함으로써 알피늄이소플라본을 효과적으로 가용화시킬 수 있다. 알피늄이소플라본은 난용성 물질로써 수층에는 거의 존재하지 않고 마이셀 내에 봉입됨으로써 가용화되게 된다. 이러한 방식으로 난용성 물질인 알피늄이소플라본은 수층에 녹아들 수 있게 하여 물을 이용한 정맥 주사제로 개발될 수 있다. 정맥 주사는 경구 투여 제형에 비하여 간 초회통과효과를 회피할 수 있어 불필요한 약물의 손실을 줄일 수 있으며, 경구 투여 제형에 비하여 생체이용률 또한 높일 수 있어 동일한 양의 약물로 높은 효과를 기대할 수 있는 효과적인 투여 방법이므로 이러한 제형의 개발은 알피늄이소플라본의 효과적인 투여를 가능하게 한다. 또한 본 발명의 조성물은 마이셀 안에 있는 알피늄이소플라본이 서방출 효과를 갖는바, 이러한 서방출 효과는 약물이 체내에서 오래 머물 수 있는 것을 가능하게 한다. 또한 본 발명의 조성물은 독성이 없는 것으로 확인되어 부형제에 따른 독성을 고분자를 사용함으로써 줄일 수 있는 이점이 있다.

특히, 본 발명에서는 다양한 고분자 중합체(mPEG-b-PLA, Pluronics^® F127 및 Soluplus^®) 중 mPEG-b-PLA를 사용하여 제조된 마이셀의 경우에서만 알피늄이소플라본의 로딩 효율이 우수하며, 25nm 내지 35nm의 균일한 입자크기를 갖는바, 알피늄이소플라본의 용해도 및 전달을 위한 최적화할 수 있는 담체임을 최초로 규명하였다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 조성물은 간(liver) 또는 신장(kidney) 조직에 선택적인 것으로 나타나, 간이나 신장을 주로 표적하는 약물로 개발될 경우 보다 효율적인 제제가 될 것으로 예상된다.

도 1은 저장 용액(stock solution) 및 생물학적 샘플에서 알피늄이소플라빈 및 제니스테인(내부표준)의 대표적인 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 박막 수화방법(thin-film hydration method)을 이용하여 알피늄이소플라빈이 로딩된 중합체 마이셀의 제조 과정을 간략하게 보여주는 모식도이다.
도 3은 꾸지뽕 나무의 미성숙(덜익은) 열매에서 추출한 알피늄이소플라빈의 분리 및 핵자기공명(NMR) 이미지 분석 결과이다.
도 4는 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀, 알피늄이소플라빈 로딩된 Soluplus^® 마이셀 및 알피늄이소플라빈 로딩된 Pluronics^® F127 마이셀의 대표적인 입자 분포 프로파일을 나타낸 것이다.
도 5는 37℃에서 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 Cremophor EL^®/EtOH 용액의 실험 관내 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6은 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈을 랫트에 정맥 내 투여한 후 알피늄이소플라빈의 혈장 농도 시간 프로파일을 나타낸 것이다.
도 7은 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈을 랫트에 정맥 내 투여한 후 8시간 이내에 각 조직(간, 신장, 폐, 비장, 심장, 근육)에서 알피늄이소플라빈의 평균 농도 시간 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 DPBS 대조군, 100% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인알피늄이소플라빈, 50% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈, 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈, 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 각각의 시료를 랫트에 여러번 주사한 후 그룹별 랫트의 체중 변화를 측정한 것이다(0일, 4일 및 8일차에 투여). 8a는 상대적인 일일 체중 변화를 측정하여 나타낸 것이며, 8b는 Kaplan-Meier plot을 사용한 생존률을 나타낸 것이다. 붉은 화살표는 시료의 정맥 주사 시점을 가리킨다.

본 발명은 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone); 및 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체를 포함하는, 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone)은 이소플라빈의 일종인 피라노이소플라본(pyranoisoflavone)이며 해동피, 고삼 또는 꾸찌뽕 나무 미성숙과 등에서 추출될 수 있는 플라보노이드계 화합물로서, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

<화학식 1>

상기 알피늄이소플라본 화합물은 골 보호, 항 박테리아, 에스트로겐, 항전이, 죽상 보호, 항산화 및 항암 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한 다양한 논문에서 알피늄이소플라본이 시험 관내 및 생체 내 항암 활성을 갖는다는 것이 보고되어 있다.

상기 화학식으로 표시되는 알피늄이소플라본 화합물은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수 있으며, 또는, 꾸찌뽕 나무 미성숙과 등에서 직접 추출하여 사용할 수도 있다.

상기 화학식으로 표시되는 알피늄이소플라본 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 상기의 화학식의 구조를 갖는 알피늄이소플라본 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체는 친수성 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 소수성 성분인 폴리 락틱 액시드 (poly lactic acid, PLA)의 중합 고분자인 mPEG-b-PLA의 회합으로 이루어지며, 약물을 담지할 수 있는 담체 또는 약물을 전달할 수 있는 운반체(carrier)로서 역할을 한다.

상기, mPEG-b-PLA는 단일 분자이지만 이 물질이 물에 용해되어 특정 농도 (critical micelle concentration, CMC)를 넘어서게 되면 구형의 마이셀을 형성한다. 마이셀이 형성되면, 친수성 부분인 껍질(shall)과 소수성 부분인 핵(core)이 형성된다. 친수성 부분인 껍질은 고분자의 친수성 부분인 PEG로 이루어져 있으며 소수성 부분인 핵은 고분자의 소수성 부분인 PLA로 구성된다.

본 발명의 약물 전달용 조성물은 난용성 물질인 알피늄이소플라본이 PEG-b-PLA 고분자 마이셀의 수층이나 친수성 부분에 거의 존재하지 않고, 소수성 부분인 핵에 분포함으로써 마이셀 내에 봉입되게 되는 방식으로 가용화가 이루어지게 된다.

본 발명은 마이셀의 제조 방법으로 thin-film hydration method를 사용하였다. 간략하게는, 알피늄이소플라본을 mPEG-b-PLA 고분자와 함께 아세토니트릴에 녹인 후, 이를 둥근바닥플라스트에 옮겨 회전식 증발기를 사용하여 섭씨 60℃에서 10분간 증발시켜 얇은 필름막을 만들었다. 이렇게 제조된 필름막에 증류수를 첨가하여 30분동안 수화(hydration)시켜 맑은 마이셀 용액을 만들었다. 상기 마이셀 용액을 원심분리한 후 상층액만을 취하고 셀룰로오스 필터에 여과하여 무균화함과 동시에 침전되는 물질을 제거하여 수화되지 않은 불순물을 제거하였다.

상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 마이셀은 평균 입자 직경이 25nm 내지 35nm일 수 있다. 참고로, 마이셀의 입자 크기가 100nm 미만인 경우 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있기 때문에, 이에 따라 체순환이 연장될 수 있다. 따라서, 본 발명의 마이셀은 입자크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는바, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물(알피늄이소플라본)의 생체이용률을 높일 수 있다.

본 발명에서는 상기 약물 전달용 조성물을 랫트에 정맥 주사하는 경우 주요기관(간, 신장, 폐, 비장, 심장, 근육) 중 간과 신장에서 두드러지게 높은 수준의 양으로 축적되는 것을 확인하였는바, 본 발명의 약물 전달용 조성물은 간(liver) 또는 신장(kidney) 조직에 선택적일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 약물 전달용 조성물, 및 수성 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되, 여기서 상기 조성물은 정맥 투여용으로 제조될 수 있다. 수성 운반체는 예를 들어 식염수(saline) 또는 수성 탄수화물 용액(aqueous carbohydrate solution)을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "가용화"라 함은, 계면활성제와 같은 물질의 존재에 의해 물에 잘 녹지 않는 물질의 용해도가 증가하는 현상을 의미한다.

본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 수난용성 약물인 알피늄이소플라빈이 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선되는 특징을 갖는다.

본 발명의 상기 마이셀은 25nm 내지 35nm의 입자크기를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 마이셀은 입자크기가 충분히 작아 망상내피계에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있는바, 체내에 오래 머무를 수 있어, 전달하고자 하는 약물(알피늄이소플라본)의 생체이용률을 높일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

알피늄이소플라빈 화합물은 골 보호, 항박테리아, 에스트로겐, 항전이, 죽상 보호, 항산화 및 항암 효과 등이 있는 것으로 보고되어 있다.

따라서 본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 특정 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물에만 한정되는 것이 아니라, 상기의 효과를 얻고자 하는 약제에 추가적인 유효성분으로써 이용될 수 있다. 예를 들면, 골 보호, 항박테리아, 에스트로겐, 항전이, 죽상 보호, 항산화 및 항암에 유용한 조성물로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 정맥 주사용 액제가 좋다. 특히, 본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 마이셀에 봉입된 난용성 알피늄이소플라빈이 서서히 방출됨에 따라 서방형 의약품으로 활용이 가능하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류에 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 식품 조성물일 수 있으며, 그 용도에 있어서 특별한 제한은 없고, 모든 종류의 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 화합물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물을 건강음료 조성물로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01 내지 0.20g, 바람직하게는 약 0.04 내지 0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

알피늄이소플라빈 화합물은 항박테리아 및 항산화 효과를 제공하는바, 본 발명의 알피늄이소플라빈 가용화 조성물은 화장료 조성물은 항균, 미백 및 피부개선 등의 용도로 이용할 수 있다.

이에, 본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로서 알피늄이소플라빈 가용화 조성물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 그 제형화에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등으로 제형화 될 수 있다. 이러한 화장품은 수성 비타민, 유성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 등의 통상의 성분들을 포함할 수 있으며, 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 유효성분으로서 알피늄이소플라빈 가용화 조성물 이외의 다른 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수도 있다. 예컨대 항산화제, 자외선 차단제, 각질층 박리제, 계면활성제, 항료, 색소, 방부제, pH 조정제, 킬레이트제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

재료 및 시약

메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(D,L-락타이드)(mPEG[4k]-b-PLA [2.2k])는 Advanced Polymer Materials Inc.(Montreal, QC, Canada)에서 구입하였다. Soluplus®는 BASF(Ludwigshafen, Rhineland-Palatinate, Germany)로부터 구입하였다. 에탄올(EtOH) 및 아세토니트릴(ACN)은 Fisher Scientific Ltd. (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 증류수(DW)는 Tedia(Fairfield, OH, USA)로부터 구입하였다. 메탄올(MeOH)은 Honeywell Burdick 및 Jackson(Ulsan, Korea)에서 구입하였다. 제니스테인은 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)에서 구입하였다. Pluronics® F127, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 Cremophor EL®은 Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 시약은 분석 등급 이상을 사용하였다.

꾸지뽕나무( Cudrania tricuspidata ) 미성숙 열매 수집 및 알피늄이소플라본(Alpinumisoflavone) 분리

미성숙(덜익은) 꾸지뽕 나무 열매는 대한민국 청주 충북대학교의 허브 정원에서 수집하였으며 천연 제품에 대한 전문가인 이미경 교수에 의해 확인하였다. 알피늄이소플라본(Alpinumisoflavone)은 이전에 보고된 방법을 사용하여 열매로부터 추출하였다(Jo, Y.H.; Kim, S.B.; Liu, Q.; Do, S.G.; Hwang, B.Y.; Lee, M.K. Comparison of pancreatic lipase inhibitory isoflavonoids from unripe and ripe fruits of Cudrania tricuspidata. PLoS ONE 2017, 12, e0172069.).

간략하게는, 꾸지뽕 나무 미성숙 열매 2.8 kg을 분쇄하고 75% 에탄올로 2회 추출하고, 이후 에탄올 추출물 (508.2 g)을 물에 현탁시킨 후 극성이 증가하는 용매로 연속적으로 분배하여 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 (n-BuOH) 분획물을 순차적으로 얻었다. 디클롤로메탄 분획물(CF, 44.6g)을 세파덱스 LH-20에 적용하고 메탄올로 용리하여 11 개의 하위 분획물(CF1-CF11)을 수득하였다. 이중 CF7 분획물을 n-헥산:디클로로메탄 (1 : 1) 용매로부터 재결정화하여 알피늄이소플라본(6.6g)을 얻었다.

고속액체크로마토그래피 분석

본 실험에서 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 분석으로부터 수득된 샘플에서의 알피늄이소플라본의 농도는 Waters 2695 분리 모듈 및 Waters 2996 포토 다이오드 어레이가 장착된 Waters 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하여 측정하였다. The Fortis C18 크로마토그래피 컬럼 (5um, 4.6 × 250 mm)을 사용하였으며, 분석 동안 30℃에서 유지하였다. 알피늄이소플라본 및 제니스테인(내부 표준)은 아세토니크릴/물(70:30, v/v)로 구성된 이동상을 갖는 등용매 모드를 사용하여 용출하였다. 샘플 주입 볼륨은 10uL이었으며, 유동 속도는 이동상에서 1.0mL/min이었다. 제니스테인과 알피늄이소플라본의 체류 시간은 각각 3.4 분과 12.7 분이었으며, 피크 면적을 표준 곡선과 비교하여 농도를 계산하였다(도 1 참조).

알피늄이소플라본 용해도 측정

증류수 또는 대표적인 가용화제에서 알피늄이소플라본의 용해도를 이전에 보고된 방법을 사용하여 측정하였다.

간략하게는, 물 및 Cremophor EL^®/EtOH 혼합물(Taxol^®에서 상업적으로 사용되는 대표적인 가용화제)에서 알피늄이소플라본의 용해도를 측정하기 위해, 포화될 때까지 알피늄이소플라본을 1mL 물, 100% EtOH, 50% Cremophor EL^®/50% EtOH 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액을 볼텍싱하고 5분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였다. 이후, 상청액을 0.2㎛ 재생 셀룰로오스 필터(Corning Inc., Corning, NY, USA)를 사용하여 여과하였다. 여과된 투명한 용액을 100배 희석하고 10uL을 HPLC 시스템에 주입하여 용해도를 측정하였다.

알피늄이소플라본-로딩된 마이셀

알피늄이소플라본이 로딩된 고분자 마이셀은 박막 수화 방법을 사용하여 다양한 고분자로 제조되었다.

간략하게는, 6mg 알피늄이소플라본 및 다양한 양의 중합체 (Pluronics^® F127 또는 mPEG(4k)-b-PLA[2.2k])를 1mL 아세토니트릴에 용해시켰다. Soluplus^®의 경우, 6mg의 알피늄이소플라본 및 다양한 양의 Soluplus^®를 0.8mL 메탄올/0.4mL 아세토니트릴의 혼합물에 용해시켰다. 약물-폴리머 혼합물을 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 회전증발기(EYELA, Bohemia, NY, USA)를 60℃에서 10분 동안 감압하에 용매를 증발시켜 박막을 수득하였다. 용매를 완전히 증발시킨 후, 필름을 1 mL 증류수로 30분 동안 수화(hydration)시켜 투명한 마이셀 용액을 수득하였다. 상기 과정을 통해 수득한 마이셀 용액을 13,000 rpm (Hanil Science lnc., Gimpo, Korea)에서 5 분간 원심분리한 후 상층액만을 취하여 멸균 재생 셀룰로오스 필터(0.2 um pore size)를 사용하여 여과하였으며, 동시에 침전되는 물질을 제거하여 수화되지 않은 불순물을 제거하였다(도 2 참조).

마이셀의 물리화학적 특징

알피늄이소플라본이 로딩된 마이셀의 입자 크기는 동적광산란광도계(Dynamic light scattering, DLS)(Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 사용하여 측정하였다. 제조된 마이셀 용액을 측정 전에 10배 희석하였다. 알피늄이소플라본이 로딩된 마이셀의 약물 로딩(DL, %) 및 캡슐화 효율(EE, %)은 HPLC 분석을 통해 측정하였으며, 다음 방정식을 이용하여 계산하였다.

DL% = (마이셀 단위의 약물 중량/공급 중합체 및 약물의 중량)×100

EE% = (마이셀 내 약물의 무게/공급 약물의 무게)×100

각 샘플 분석의 결과는 3 개의 개별 실험의 평균±표준편차(SD)로서 나타내었다.

인 비트로( In Vitro ) 방출 에세이

마이셀에서 알피늄이소플라본의 시험관내(In Vitro) 방출 거동을 336시간에 걸쳐 평가하였다. 이때, 방출 매질(release medium)로서 포스페이트 완충식염수(PBS, pH 7.4)를 이용한 투석법을 사용하여 평가하였다.

간략하게는, 대조군으로서 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀(5mg/mL) 및 대조군인 알피늄이소플라본 용액(Cremophor EL^®:EtOH, 50:50, v/v에 용해된 5mg) 샘플을, pre-wetted dialysis membrane bag (MWCO 20 kD)에 삽입하였다. 상기 pre-wetted dialysis membrane bag은 묶은 후, 37℃의 핫 플레이트 교반기 상에서 2.0L 방출 미디엄에 넣었다. 방출 미디엄을 8, 48, 120, 168, 216 및 288 시간 후에 새로운 배지로 교체하였다. 미리 결정된 시간 간격 (0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 168, 240 및 336 h)에서, 20L의 샘플을 수집하고, 아세토니크릴로 10배 희석한 다음, HPLC 분석을 통해 알피늄이소플라본의 농도를 측정하였다.

약물동태 연구

모든 동물 실험은 충북대학교(CBNUR-1141-17, 2017년 10월 24일) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다. 수컷 Sprague-Dawley 랫트(7 주령)는 Orient Bio Inc.(Seongnam, Korea)에서 구입하여 모든 동물 실험에 사용하였다. 랫트는 물과 음식에 자유롭게 접근할 수있는 통풍 케이지에 보관하였다. 각 그룹별 랫트는 25% Cremophor EL^®/EtOH(AIF solution)에 알피늄이소플라본(20 mg/kg) 용량 및 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀을 정맥 주사하였다. 독성에도 불구하고 Cremophor EL^®/EtOH는 알피늄이소플라본 용액의 가용화제로 사용되었다. 정맥 투여 후 5, 15, 30, 60, 120 및 240 분 후에 래트의 안와정맥총(Retro-Orbital plexus)으로부터 혈액 샘플을 수득하고, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 혈장 샘플을 수득하였으며, 이를 즉시 동결시키고 분석할 때까지 -70℃에 보관하였다. 약동학적 분석을 위해 비구획적 모델을 사용하여 각 제형에서 알피늄이소플라본의 혈중농도-시간곡선하면적(concentration-time curve, AUC), 총 청소율(total clearance, CL_t), 겉보기 분포 용적(apparent volume of distribution, V_d), 초기 혈액 농도(initial blood concentration, C₀)와 같은 상대적인 파라미터를 계산하였다.

생체내 분포 연구

생체 분포 연구는 다양한 제형을 쥐에 정맥 주사한 후 수행되었다. 정맥 주사 후 8시간이 경과하였을 때, 랫트는 이산화탄소(CO₂)를 사용하여 안락사시키고 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 근육 조직을 해부하였다. 조직 샘플을 식염수로 세척하고, 종이 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하고, 무게를 측정한 다음, 분석할 때까지 약 -70℃에서 보관하였다.

HPLC 분석을 위한 생물 시료의 전처리

동결된 생물학적 샘플을 실온에서 해동시켰다. 혈장 샘플의 200㎕ 분취량을 메탄올로 추출하고 50㎕의 제니스테인(내부표준)을 첨가한 후, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 재생 셀룰로스 필터(0.2 um pore size)를 통해 여과하고 10 uL의 시료를 분석을 위해 HPLC 시스템에 주입하였다. 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 근육 샘플에서 알피늄이소플라본의 양은 균질화 방법을 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 조직을 테프론 패슬(Teflon pestle)을 갖는 glass Potter-Elvehjem-type homogenizer로 균질화하였다. 메탄올로 200uL의 20% 균질액을 추출한 후, 상청액 중의 알피늄이소플라본의 농도를 상기에서 언급한 HPLC 분석 방법으로 측정하였다.

인 비보( In Vivo ) 독성 에세이

5개의 마우스 그룹 (그룹당 n = 3)을 사용하여 생체 내 독성을 평가하였다. 각 그룹의 래트는 Dulbecco’s phosphate-buered saline(DPBS, 대조군), 알피늄이소플라본(20 mg/kg)이 포함된 100% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 알피늄이소플라본(20 mg/kg)이 포함된 50% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 알피늄이소플라본(20 mg/kg)이 포함된 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액, 및 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀(20 mg/kg)을 정맥 주사하였다. 모든 그룹의 체중 변화는 2일에 1회 총 14일 동안 모니터링하였다. 알피늄이소플라본 용액 및 마이셀 주사는 0일, 4일 및 8일에 수행되었다. 제형의 독성은 체중 감소(10 % 초과), 비정상적인 행동, 불편의 징후 또는 사망으로 정의되었다. 체중 변화를 정규화하여 백분율로 표시하였다. 독성 시험에서 병이 많은 것으로 판단 된 쥐를 안락사시켰다.

통계분석

모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 분산 파라미터는 평균±표준오차(SE)로 표현하였다. 스튜던트 t- 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였고, p <0.05 또는 <0.01 (각각 95 % 및 99 % 신뢰 수준)에서 통계학적 유의성이 있는 것으로 평가되었다.

2. 결과

알피늄이소플라본 분리 및 동정

미성숙(덜익은) 꾸지뽕나무 열매로부터 추출한 알피늄이소플라본 화합물은 하기와 같이 동정되었다: yellow crystal; UV (MeOH) λ_max: 226, 282 nm; ESI-MS m/z 337 [M+H]⁺; ¹H-NMR (MeOH-d₄, 400 MHz) H 8.19 (1H, s, H-2), 7.50 (2H, dd, J = 8.8, 2.0 Hz, H-20, 6’), 6.97 (2H, dd, J = 8.8, 2.0 Hz, H-30, 50), 6.81 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-1”), 6.47 (1H, s, H-8), 5.84 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-2”), 1.59 (6H, s, H-4”, 5”) ppm (도 3 참조).

알피늄이소플라본의 용해도 측정

하기 표 1은 Cremophor EL^®/EtOH(5:5, v/v), Cremophor EL/EtOH(0:10, V/V)에서 물에 대한 용해도를 나타낸 것이다. 수중(in water) 알피늄이소플라본의 측정된 용해도는 0.178±0.121 ug/mL에 불과하여 수용해성이 불량함을 확인하였다. 대표적인 가용화제(Cremophor EL^®/EtOH(5:5, v/v))에서 알피늄이소플라본의 용해도는 82.143±9.989 ㎎/㎖로 나타나, 가용화제를 사용함으로써 용해도가 두드러지게 증대되는 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 용해 부형제의 독성은 정맥 주사 제형을 디자인할때는 문제가 된다.

용매별 알피늄이소플라본 화합물의 용해도

용매	알피늄이소플라본 용해도(μg/ml)
DW	0.178±0.121
Cremophor EL^®/EtOH (5:5, v/v)	82,143±9989
Cremophor EL^®/EtOH (0:10, v/v)	32,500±6802

알피늄이소플라본-로딩된 마이셀의 물리화학적 특성

다양한 중합체(mPEG-b-PLA, Pluronics^® F127 및 Soluplus^®)를 사용하여 제조된 알피늄이소플라본-로딩된 마이셀 각각의 EE(%), DL(%) 및 입자 직경을 측정하였다. 본 발명의 마이셀 제제의 입자 크기는 동적광산란광도계(Dynamic light scattering, DLS)로 측정하였다. 측정을 위해 마이셀 용액을 10배 희석하여 측정을 시행하였다.

그 결과 하기 표 2 및 도 4에서 나타낸 바와 같이, 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 및 알피늄이소플라본-로딩된 Pluronics^® F127 마이셀은 상대적으로 높은 캡슐화 효율(EE, 39.5-81.0%) 및 약물 로딩(DL, 2.24-4.59 %) 값을 보인 반면, 알피늄이소플라본-로딩된 Soluplus^® 마이셀의 값은 매우 낮게 나타났다(알피늄이소플라본 농도, <0.1 mg/mL). 한편, DLS 분석에서, 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀의 평균 입자 직경은 28.0-34.1nm 인 반면, Pluronics^® F127 또는 Soluplus^®를 사용하여 제조된 다른 마이셀은 침강 또는 비정상적인 조건으로 인하여 검출되지 않거나, 높은 다분산지수 (PDI)를 갖는 (> 0.5) 다중 분포를 나타내었다. 마이셀의 <100 nm 입자 크기는 망상내피계(RES)에 의한 식균 작용 및 흡수를 피할 수 있으며, 이에 따라 체순환을 연장시킨다. 높은 캡슐화 효율(EE) 및 약물 로딩(DL) 값 및 적절한 입자 직경을 고려하여, 알피늄이소플라본의 가용화를 위해 mPEG-b-PLA 중합체가 가장 적합한 것으로 나타났다. mPEG-b-PLA 중합체를 135mg 및 150 mg의 양으로 사용하는 경우 캡슐화 효율(EE), 약물 로딩(DL) 및 입자 크기에서 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이에, 부형제의 예상치 못한 영향을 최소화하기 위해, mPEG-b-PLA 중합체는 135 mg의 양으로, 알피늄이소플라본은 6 mg의 양으로 고정하여 마이셀을 제조하였으며, 이는 추가의 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 연구에서 사용되었다.

알피늄이소플라본-로딩된 마이셀의 특징(n=3, 평균±표준편차(SD))

제형	중합체 양 (mg)	AIF 양 (mg)	AIF 최종농도 (mg/ml)	캡슐화 효율 (EE%)	약물 로딩 (DL %)	입자 크기 (nm)	다분산지수 (PDI)
AIF-loaded Pluronics^®F127 micelle	100	6	4.63 ±0.08	77.2 ±1.4	4.37 ±0.08	1385 ±430	0.45 ±0.21
	135	6	4.86 ±0.50	81.0 ±8.4	4.59 ±0.47	9993 ±8616	0.60 ±0.36
	150	6	4.52 ±0.02	75.4 ±0.3	4.27 ±0.02	1102 ±1170	0.59 ±0.45
AIF-loaded Soluplus^® micelle	100	6	0.01 ±0.01	0.24 ±0.23	0.01 ±0.01	138 ±143	0.39 ±0.18
	135	6	0.01 ±0.00	0.09 ±0.05	0.01 ±0.00	N.D.^a	N.D.^a
	150	6	0.06 ±0.09	0.94 ±1.45	0.05 ±0.08	78.7 ±6.0	0.02 ±026
AIF-loaded mPEG-b-PLA micelle	100	6	2.37 ±2.16	39.5 ±36.0	2.24 ±2.04	28.0 ±1.8	0.15 ±0.05
	135	6	4.39 ±0.09	73.1 ±1.4	4.14 ±0.08	34.1 ±1.8	0.21 ±0.02
	150	6	4.50 ±0.15	74.9 ±2.5	4.24 ±0.14	31.2 ±5.5	0.21 ±0.01

^aN.D., not detectable.

인 비트로( In Vitro ) 약물 방출 프로파일

알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라본의 약물 용출 정도를 시험관 수준에서 측정하였다. pH 7.4의 PBS를 이용한 용출 시험을 체온과 같은 섭씨 37℃에서 336시간까지 시행하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라본(이하 간략하게 ‘알피늄이소플라본 용액’이라 약칭함)의 약물 방출은 6시간이 경과했을 때 각각 32%, 63%에 도달하였다. 336 시간에는, 알피늄이소플라본 용액에서는 84.6%의 알피늄이소플라본이 방출되었고, 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀의 경우 알피늄이소플라본이 67.3%가 방출되었는데, 상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀이 Cremophor EL^®/EtOH 용액에 용해된 알피늄이소플라본 용액보다 더욱 천천히 약물 방출이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 mPEG-b-PLA 마이셀 담체가 난용성 약물인 알피늄이소플라본을 가용화시킬 뿐만 아니라 약물의 빠른 방출을 제한하는 것을 보여주는 것이며, 이는 아마도 소수성 약물과 중합체의 소수성 세그먼트의 분자간 상호 작용에 기인한 것으로 보인다.

랫트에서 알피늄이소플라본의 약물동태학

알피늄이소플라본-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 또는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에서 녹인 알피늄이소플라빈을 랫트에 정맥 주사한 후 시간에 따른 혈중 농도 변화를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 또는 알피늄이소플라빈 용액의 정맥 주사 후 알피늄이소플라빈의 혈장 농도가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 알피늄이소플라빈 용액 주사 후 4 시간이 경과한 시점에 알피늄이소플라빈 혈장 농도는 검출한계(limitation of detection, LOD)보다 낮은 것으로 나타났으나(미검출), 본 발명의 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀을 주사한 경우에는 4시간이 경과한 시점에도 상기 약물의 농도가 여전히 검출되는 것으로 나타났다. 본 발명 마이셀의 긴 순환 시간 및 알피늄이소플라빈의 지속적인 방출이 혈액에서 상기 약물의 장시간 보유에 기여하는 것을 알 수 있었다.

비구획 모델을 사용하여 약동학적 파라미터를 계산하였다. 그 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 알피늄이소플라빈이 mPEG-b-PLA 마이셀 내에 캡슐화될 때, 알피늄이소플라빈의 총 청소율(total clearance, CL_t) 및 겉보기 분포 용적(apparent volume of distribution, V_d) 값이 감소되는 것으로 나타났다. 혈중농도-시간곡선하면적(concentration-time curve, AUC) 및 생체 이용률(BA, %) 값은 알피늄이소플라빈 용액보다 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀에서 유의하게 더 높은 것으로 나타났다(* p <0.05). 이러한 결과는, 본 발명의 mPEG-b-PLA 마이셀이 혈액 순환 시간을 유의적으로 증가시키고 알피늄이소플라빈의 혈장 청소율을 감소 시키는 것을 나타내는 것이다.

알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 25%　Cremophor EL^®/EtOH 혼합용액에 녹인 알피늄이소플라본의 정맥 주사 후 알피늄이소플라빈의 약물동태학적 파라미터

Parameters	AIF in 25% Cremophor EL^®/EtOH Solution	AIF-Loaded mPEG-b-PLA Micelle
AUC^a(min·μg·mL^-1)	326±168	876±103^*
C_O ^b(μg·mL^-1)	1.89±0.63	7.86±1.79
CL_t ^c(mL·kg^-1·min)	94.6±56.1	23.1±2.7
V_d ^d(mL·kg^-1)	13903±5274	2940±867
BA^e(%)	100±51	269±18^*

^aAUC, area under the curve; ^bC0, plasma concentration at time 0; ^cCLt, total clearance; ^dVd, volume of distribution; BA^e, bioavailability, * p < 0.05.

랫트에서 마이셀의 생체 내 분포

알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 또는 25% Cremophor EL®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈 정맥 주사 후 8시간이 경과하였을 때, 주요 기관에서 알피늄이소플라빈의 약물 양을 측정하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 약물 용액을 정맥 주사한 후 각각의 조직에서 알피늄이소플라빈(ug/g)의 양은 간> 신장> 폐> 심장> 비장> 근육의 순서로 감소한 반면, 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀을 주사한 후 간 > 신장> 폐> 비장> 심장> 근육 조직의 순서로 감소되었다. 이러한 결과를 통해, 알피늄이소플라빈 용액 및 mPEG-b-PLA 마이셀 둘 다 알피늄이소플라빈 양이, 망상내피계(RES) 관련 기관인 간에서 높은 것을 확인할 수 있었다. 그러나 신장과 같은 비 망상내피계(RES) 장기에서도 상당량의 알피늄이소플라빈이 축적되는 것으로 나타나, 이전 연구에서 제안한 것처럼 마이셀의 조직 특이성이 RES 시스템의 의한 흡수에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다. 전반적으로, mPEG-b-PLA 마이셀은 알피늄이소플라빈의 비히클로서 역할을 하며, 간, 신장 및 폐와 같은 주요 기관에서의 약물 양이 단순히 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈을 투여한 군보다 상대적으로 더 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 본 발명의 마이셀이 혈액에서 긴 순환 시간을 갖는 것에 기인한 것으로 보인다. 이를 통해 본 발명의 제제가 간이나 신장을 주로 표적하는 약물로 개발될 경우 보다 효율적인 제제가 될 것으로 예상된다.

인 비보( in vivo ) 독성 에세이

본 실험에서는 생체 내에서 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 또는 Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈의 독성을 평가하였다. DPBS(Dulbecco’s phosphate-buered saline)를 대조군으로 사용하였으며, 100% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈, 50% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈, 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈 및 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀을 랫트에 여러 번 주사한 후 그룹별 랫트의 체중 변화를 측정하였다.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 50% Cremophor EL^®/EtOH 또는 25% Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈으로 처리된 실험군의 래트는 대조군에서보다 시간 경과에 따른 체증 증가가 감소하는 것으로 나타났다. 이는 희석한 후에도 가용화제로 사용된 Cremophor EL^®/EtOH가 여전히 독성이 있음을 보여준다. 반면에, 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 그룹에서 랫트의 평균 체중은 대조군과 유사한 수준으로 증가하는 것으로 나타나, 독성이 없음을 확인할 수 있었다(도 8a 참조). 한편, 100 % Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈으로 처리된 실험군의 래트는 정맥주사 직후에 모두 사망하였는데, 이는 상기 가용화제의 치명적 독성을 나타내는 것이다(도 8b 참조). 또한, 50 % Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈으로 처리된 그룹에서, 모든 래트는 투여 후 8 일에 가용화제의 누적 독성으로 인해 사망하였다. 이에 반해, DPBS (대조군), 알피늄이소플라빈-로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀 및 25 % Cremophor EL^®/EtOH 용액에 녹인 알피늄이소플라빈으로 처리된 그룹의 래트는 2 주 동안 100% 생존율을 나타냈다. 상기와 같은, 모든 독성 데이터는 본 발명의 mPEG-b-PLA 마이셀이 가용화를 위해 사용되는 경우, 랫트에 알피늄이소플라빈을 여러번에 걸쳐 정맥 주사할지라도 심각한 독성이 없는 것을 가리킨다.

결론적으로 본 발명에서는 알피늄이소플라빈을 이용한 정맥주사 제형을 디자인했다. 이를 위해 꾸찌뽕나무의 미성숙(덜익은) 열매의 주요 화합물인 알피늄이소플라빈을 추출하고 mPEG-b-PLA 고분자 마이셀을 이용한 액체 투여 제형의 제조 및 가용화 방법을 개발하였다. 또한, 알피늄이소플라빈 로딩된 mPEG-b-PLA 마이셀의 물리 화학적, 약동학적 및 독성 특성을 시험 관내 및 생체 내에서 평가하였다. 나노 크기의 입자 및 제제의 느린 방출 프로파일은 전신 투여 후 약물의 혈액 순환을 연장시켜 알피늄이소플라빈의 생체 이용률을 증가시켰다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

AIF: Alpinumisoflavone
mPEG-b-PLA: methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(d,l-lactide)
DPBS: Dulbecco’s phosphate-buered saline

Claims

알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone); 및
메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체를 포함하는 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알피늄이소플라빈은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
<화학식 1>
제1항에 있어서,
상기 알피늄이소플라빈은 상기 고분자 중합체가 형성하는 마이셀 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 마이셀은 평균 입자 직경이 25nm 내지 35nm인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 알피늄이소플라빈은 상기 고분자 중합체가 형성하는 마이셀 내부에 봉입됨으로써 가용화되는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 간(liver) 또는 신장(kidney) 조직에 선택적인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
알피늄이소플라빈(Alpinumisoflavone)이 봉입된 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체 마이셀을 유효성분으로 포함하는, 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 수난용성 약물인 알피늄이소플라빈이 메틸-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(d,l-락티드) 고분자 중합체에 봉입됨으로써 물에 대한 용해도가 개선되는 것을 특징으로 하는 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.
제7항에 있어서,
상기 마이셀은 25nm 내지 35nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는, 알피늄이소플라빈 가용화 조성물.