KR101967894B1

KR101967894B1 - 잎새버섯 폐배지로 흰점박이 꽃무지를 사육하는 방법

Info

Publication number: KR101967894B1
Application number: KR1020170031760A
Authority: KR
Inventors: 정영철; 변재국; 유경태; 유경은
Original assignee: 변재국; 정영철; 유경태
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2019-04-10
Also published as: KR20180104894A

Abstract

본 발명은 특허출원 제10-2015-0164777호의 방법으로 잎새버섯을 재배하고 남는 폐배지를 이용하여 흰점박이꽃무지 사육용 발효 사료배지를 제조하여 이를 이용하여 사육한 흰점박이 꽃무지에 대한 것이다. 본 발명의 흰점박이꽃무지 사육방법에 따르면 사육에 요구되는 비용이 절감되는 동시에 잎새버섯에 고유한 항암 및 면역활성 성분이 전환된 흰점박이꽃무지를 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

잎새버섯 폐배지로 흰점박이 꽃무지를 사육하는 방법{BREEDING PROCESS FOR PROTAETIA BREVITARSIS USING THE WASTE MEDIUM COLLECTED AFTER CULTIVATING GRIFOLA FRONDOSA}

본 발명은 잎새버섯 폐배지를 활용한 흰점박이 꽃무지 사육 방법 및 이와 같이 사육한 흰점박이 꽃무지를 포함하는 항암 및 면역증진 기능성 식품에 대한 것이다.

꽃무지류(Protaetia spp.)는 딱정벌레목 풍뎅이과에 속하는 곤충 종(種)으로서, 상기 꽃무지류의 구체적인 예로는 잔꽃무지, 참꽃무지, 검정꽃무지, 홀쭉꽃무지, 풀색꽃무지, 넓적꽃무지, 범꽃무지, 참넓적꽃무지, 점박이꽃무지, 애초록꽃무지, 흰점박이꽃무지, 만주점박이꽃무지, 큰자색호랑꽃무지 등이 있다.

흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)는 딱정벌레목(目), 풍뎅이과(科), 꽃무지아과(亞科)에 속하는 크기 17-24 ㎝의 식식성(植食性) 곤충으로서, 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 및 시베리아 동부 지역에 서식하며, 5월에서 10월에 걸쳐 1-2년에 1회 발생한다고 알려져 있다.

흰점박이꽃무지의 유충을 흔히 "굼벵이"라고 하는데 이 유충은 동의보감 등의 한방 의서에 등장할 정도로 그 약용적 가치가 매우 높다. 특히 어혈을 풀어주고 혈액순환을 개선시키며 간기능을 강화시키는 작용을 한다. 흰점박이 꽃무지 풍뎅이의 유충은 유기물이 풍부한 부식성의 토양과 건초더미 등에서 서식하며, 3령의 성숙유충 상태로 월동하는 것으로 알려져 있다. 과거에는 흰점박이 꽃무지 풍뎅이 유충을 초가집의 지붕 등에서 쉽게 발견할 수 있었으나 현재는 시골에서조차 초가집을 찾아볼 수 없고, 농약 등 각종 오염물질의 남용으로 인하여 유충을 쉽게 발견할 수 없는 실정인데 그 수요는 오히려 과거에 비하여 대폭 늘어난 추세이어서 그 수요를 충족시키지 못하는 실정에 있다.

특허출원 제10-2011-42451호에는 알로에베라를 함유하는 사료를 이용한 흰점박이꽃무지의 사육방법과 간질환에 대한 효능에 대해 공개되어 있고, 특허출원 제10-2005-90539호에는 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 스미티(Bacillus smithii)를

포함하는 흰점박이꽃무지 사료용 미생물 발효 촉진제를 사용하여 제조된 사료를 이용한 흰점박이꽃무지의 사육방법이 공개되어 있다.

본 발명자는 특허출원 제10-2015-0164777호를 통해 잎새버섯을 재배하고 남는 폐배지를 이용하여 흰점박이꽃무지 사육용 사료를 제조하면 비용이 절감되는 동시에 잎새버섯에 고유한 항암 및 면역활성 성분이 전환된 흰점박이꽃무지를 얻을 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허출원번호 제10-2005-90539호 대한민국 특허출원번호 제10-2011-42451호 대한민국 특허출원번호 제10-2015-0164777호

본 발명은 잎새버섯을 재배한 후 얻어지는 폐배지를 사용한 흰점박이꽃무지 사육방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

나아가, 본 발명은 잎새버섯의 항암 및 면역활성 성분이 생 전환된 흰점박이꽃무지 성충을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 흰점박이꽃무지 사육방법(도1)은,

(i) 대한민국 특허출원 제10-2015-0164777호에 따른 잎새버섯 재배방법에 따라 잎새버섯을 생육시킨 후 잎새버섯을 수확하고 남은 폐배지를 과립형태로 수집하는 단계로서,

구체적으로 상기 폐배지는, 참나무 톱밥 95~99중량%와 밀기울 1~5중량%를 혼합하여 배지를 제조하는 제1단계; 제1단계에서 제조한 배지를 입구크기가 6.2±0.5cm인 850±50CC의 병에 0.75~0.8g/1cc 충진하는 제2단계; 배지가 충진된 재배용 병을 105±5℃에서 70±10분 1차 살균한 후 120±10℃에서 110±10분 2차 살균하는 제3단계; 재배용 병의 심부 온도가 10℃ 이하로 되도록 냉각하는 제4단계; 재배용 병에 잎새버섯 종균을 1~5g 접종하는 제5단계; 배양실에서 배양하되, 초기 10±2일은 25~30℃, 중기 10±2일 23~25℃, 후기 10±2일 20~22℃로 유지하는 한편, 초기 10±2일 이후에는 병을 각각 분리하여 빛을 쪼이면서 배양하는 제6단계; 생육실에서 생육시키되, 병마개를 제거한 후 초기 2±1일은 19±2℃, 그 이후 13±3일간은 17±2℃로 유지하는 한편 습도는 초기 4±1일은 90±5%, 중기 5±2일은 80±5%, 후기 6±2일은 60±5%로 하면서 생육시키는 제7단계를 거친 후 생육된 잎새버섯을 수확한 다음 남은 배지 과립을 취하는 것을 특징으로 하는 폐배지수집단계;

(ii) 상기 폐배지 수집단계에서 수집된 폐배지를 자연상태에 3~4m로 쌓아 대기에 노출시켜 자연발효 시키는 단계로서, 평균온도 10 내지 -10℃의 겨울철에는 30일, 평균온도 10-20℃의 봄 및 가을에는 20일, 평균온도 20-30℃의 여름철에는 15일동안 실외에 정치 발효시키는 실외 발효 사료배지의 제조단계;

(iii) 상기 폐배지 수집단계에서 수집된 폐배지를 실내에 3~4m로 쌓아 온도 25~30℃, 습도 60~80% 조건에서 10일동안 정치 발효시키는 실내 발효 사료배지의 제조단계;

(iv) 실외 발효 사료배지에 흰점박이 꽃무지 알을 부화하도록 한 다음, 30~50일 경과 후 0.5±0.2cm 정도 길이로 성장한 유충을 수집하는 단계; 및

(v) 실외 발효 사료배지로부터 수집된 유충 100~200마리를 30±10cm x 60±10cm 및 높이 20±10cm의 용기에 실내발효 사료배지와 골고루 혼합하여 실온에서 10~15일간 사육하여 흰점박이 꽃무지 성충을 얻는 단계를 포함한다.

단계 (i)에서 수집된 잎새버섯 폐배지는 잎새버섯 재배 전의 당초 배지 무게 대비 약 30%가 줄어들지만, 영양분(주로 섬유소)은 60%이상 함유되어 있으면서 잎새버섯 균사가 생산하는 섬유소 분해효소(cellulase)에 의해 톱밥의 섬유소가 저분자로 전환되어 흰점박이 꽃무지가 생육을 위한 에너지원으로 이용이 용이 할 뿐만 아니라이 폐배지에는 잎새버섯 균사의 항암면역증진물질(β-glucan)이 함유되어 있어 흰점박이 꽃무지에 이 물질이 전환됨으로써 잎새버섯 폐배지를 활용한 사료배지로부터 사육된 흰점박이 꽃무지 성충은 항암 및 면역증진을 위한 기능성 식품으로 이용될 수 있다.

또한, 상기 잎새버섯 폐배지는 흰점박이 꽃무지의 사육용 발효사료의 준비를 위한 발효시간을 현저히 단축시켜주어 흰점박이 꽃무지 대량 사육에 시간과 공간적인 효율을 높이는 효과가 있다. 상세하게는 일반적으로 잎새버섯 재배전의 참나무 톱밥 배지를 상기 동일한 실외 조건에서 자연 발효시 90일 이상, 상기 동일한 실내 조건에서 발효시는 40일 이상 소요되는데 비해, 잎새버섯 수확 후 수집한 폐배지의 참나무 톱밥은 잎새버섯 균사가 생산하는 섬유소 분해효소에 의해 1차 발효가 일어났기 때문에 발효시간을 2~3배 줄일 수 있는 장점이 있고, 이런 특징은 대량 사육시에 시간과 공간에 이점이 있어 흰점박이 꽃무지의 가격 경쟁력 우위를 점하는데 기여한다.

본 발명의 사육방법에 따라 수확된 흰점박이 꽃무지 성충은 체내에 항암면역증진성분인 베타글루칸을 전환하여 포함하고 있으므로 항암 및 면영기능 증진용 기능성 식품조성물 또는 의약품의 첨가 원료로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품조성물은 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 및 식품 첨가제 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 차, 주스, 엑기스 파우치 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 발효대사체 및 복합조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 액상, 분말 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 식품 첨가물로 사용시에 원료에 대하여 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 잎새버섯 재배 후 버려지는 폐배지를 활용하여 영양적으로 유리한 흰점박이꽃무지 사료로 활용할 수 있어 환경 보호 및 흰점박이 꽃무지 재배 비용을 낮추는 효과가 있다. 또한, 잎새버섯 재배용 원료는 참나무 톱밥 95%과 밀기울 5% 혼합물로서 모두 유기농 소재이므로 무독성·친환경 소재를 사용하여 흰점박이 꽃무지를 사육할 수 있는 환경이 제공되며, 특히, 폐배지는 일반 사육용 배지에 비해 약 1/10 가격으로 매우 저렴하다는 장점이 강조될만하다.

도 1는 잎새버섯 폐배지를 발효시킨 발효사료배지에서의 흰점박이 꽃무지의 사육과정을 보여주는 도면이고,
도 2는 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 추출물의 대식세포 식작용에 대한 영향을 보여주는 그래프이며,
도 3은 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 추출물의 대식세포 활성화와 관련하여 사이토카인 발현능 실험 결과를 보여주는 도면으로, 도3a는 IL-1β의 발현능에 대한 영향을 보여주는 결과 그래프이고, 도 3b는 IL-6의 발현능에 대한 영향을 보여주는 결과 그래프이며, 도 3c는 TNF-α의 발현능에 대한 영향을 보여주는 결과 그래프이며,
도 4는 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 추출물의 농도에 따른 대식세포 활성화 관련 IL-1β의 발현능에 대한 영향을 보여주는 결과 그래프이며,
도 5는 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 추출물의 자연살해세포(NK cell) 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명의 흰점박이 꽃무지 성충의 제조

특허출원 제10-2015-0164777호 (발명의명칭: 잎새버섯의 속성 병 재배방법)에 개시된 방법에 따라, 잎새버섯 배지(참나무톱밥 95%, 밀기울 5%)에 종균을 접종하여 45일간 생육한 다음 수확하고 남은 과립 형태의 폐배지를 탈병하여 모은다.

폐배지 일부를 자연상태에 4m로 쌓아 노출시켜 자연발효를 시킨다. 외부 온도 20~30℃에서 15일간 발효시켰다.

폐배지 나머지는 실내에서 4m로 쌓아 온도 30℃, 습도 80%로 유지시켜 10일간 발효시켰다.

실외 발효된 배지에 흰점박이 꽃무지 성충으로 하여금 알을 부화시키도록 한 다음 자연 생장 시켰다. 30일 후 0.5±0.2cm 정도로 성장한 어린 곤충들 약 200마리를 채집하여 실내발효 배지 용기 (크기 30cm x 60cm, 높이 20cm)에 골고루 혼합하여 실온에서 15일간 사육하였고 2~3cm의 성충이 된 것을 확인하여 수확하였다.

실험예 1 : 잎새버섯 폐배지로 사육된 흰점박이 꽃무지의 면역증진 활성

(1) 실험군과 대조군의 제조

실시예 1에서 수확한 성충을 동결건조한 다음, 70% 에탄올을 원료 대비 10배 가하여 실온에서 24시간 환류 추출한 것을 여과, 감압농축한 후 동결건조하여 면역증진 활성 시험을 위한 실험군으로 사용하였다(GFP).

대조군으로서 일반 사료로 사육한 흰점박이 꽃무지 성충을 수확하여 동결건조한 다음, 70% 에탄올을 원료 대비 10배 가하여 실온에서 24시간 환류 추출한 것을 여과, 감압농축한 후 동결건조하여 면역증진 활성 시험을 위한 실험군으로 사용하였다(NFP).

(2) 대식세포 식작용 활성도

각각 대식세포주인 RAW264.7에 상기 실험군과 대조군을 각각 100μg/ml 농도로 처리한 후, FITC로 표식된 E.coli particle과 배양한 다음, 대식세포의 식작용 활성을 대식세포 내부에 포집된 FITC-Ecoli particle의 양을 형광을 이용하여 측정하였다. LPS를 양성 대조군으로 하였을 때 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지(GFP)에서 유의적인 대식세포의 식작용이 증가하였으나, 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지(NFP)에서는 식작용이 낮게 나타났다 (도 2).

(3) 대식세포 활성화와 사이토카인 발현능

잎새버섯 폐배지와 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지의 에탄올 추출물의 대식세포의 활성화와 관련한 각종 사이토카인의 유전자 발현능 조사는 대식세포주의 RAW264.7 세포에 실험군과 대조군 시료를 각각 50μg/ml의 농도를 처리하여 세포로부터 total RNA를 분리 및 cDNA를 제조하여 대식세포의 활성화와 관련되는 대표적인 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현을 real-time PCR을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물은 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현능에서 모두 유의적인 증가를 보인 반면에 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지에서는 유의적인 증가가 없거나 낮게 나타났다(도 3a, 도 3b, 도 3c).

그리고 상기 두 시료를 농도별로 처리하여 대식세포 활성화와 관련한 사이토카인 발현에 대한 영향을 조사한 결과 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지 사료에서 농도의존적으로 IL-1β의 발현이 증가하였으나, 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지에서는 발현능이 감소하였다(도 4).

(4) 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지의 자연살해(NK)세포 활성화 조사

마우스에서 비장을 적출하여 파쇄한 세포 혼탁액을 300×g에서 5분간 원심분리한 후 적혈구 용혈액으로 적혈구를 제거하여 비장세포를 분리하였다.

비장세포에 각 시료의 100μg/ml 농도로 24시간 처리하고, 비장세포와 YAC-1세포 (effector- to - target)의 비가 50:1, 100:1이 되도록 Calcein-AM으로 형광염색된 YAC-1 세포를 넣은 후 4시간 동안 배양하였다.

양성대조군으로 LPS를 사용하여 실험한 결과, 잎새버섯 폐배지에서 사육한 흰점박이 꽃무지에서는 자연살해세포의 활성이 증가하였으나, 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지에서는 잎새버섯 폐배지로 사육한 흰점박이 꽃무지에 비하여 자연살해세포 활성이 낮게 나타났다(도 5).

GFP 잎새버섯 폐배지로 사육한 본 발명의 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물
NFP 일반사료로 사육한 흰점박이 꽃무지 에탄올 추출물

Claims

(i) 참나무 톱밥 95~99중량%와 밀기울 1~5중량%를 혼합하여 배지를 제조하는 제1단계; 제1단계에서 제조한 배지를 입구크기가 6.2±0.5cm인 850±50cc의 병에 0.75~0.8g/1cc 충진하는 제2단계; 배지가 충진된 재배용 병을 105±5℃에서 70±10분 1차 살균한 후 120±10℃에서 110±10분 2차 살균하는 제3단계; 재배용 병의 심부 온도가 10℃ 이하로 되도록 냉각하는 제4단계; 재배용 병에 잎새버섯 종균을 1~5g 접종하는 제5단계; 배양실에서 배양하되, 초기 10±2일은 25~30℃, 중기 10±2일 23~25℃, 후기 10±2일 20~22℃로 유지하는 한편, 초기 10±2일 이후에는 병을 각각 분리하여 빛을 쪼이면서 배양하는 제6단계; 생육실에서 생육시키되, 병마개를 제거한 후 초기 2±1일은 19±2℃, 그 이후 13±3일간은 17±2℃로 유지하는 한편 습도는 초기 4±1일은 90±5%, 중기 5±2일은 80±5%, 후기 6±2일은 60±5%로 하면서 생육시키는 제7단계를 거친 후 생육된 잎새버섯을 수확하고 남은 폐배지를 과립형태로 수집하는 잎새버섯 폐배지 수집 단계;

(ii) 상기 폐배지 수집단계에서 수집된 폐배지를 자연상태에 3~4m로 쌓아 대기에 노출시켜 자연발효 시키는 단계로서, 평균온도 10 내지 -10℃의 겨울철에는 30일, 평균온도 10-20℃의 봄 및 가을에는 20일, 평균온도 20-30℃의 여름철에는 15일동안 실외에 정치 발효시키는 실외 발효 사료배지의 제조단계;

(iii) 상기 폐배지 수집단계에서 수집된 폐배지를 실내에 3~4m로 쌓아 온도 25~30℃, 습도 60~80% 조건에서 10일동안 정치 발효시키는 실내 발효 사료배지의 제조단계;

(iv) 실외 발효 사료배지에 흰점박이 꽃무지 알을 부화하도록 한 다음, 30~50일 경과 후 0.5±0.2cm 정도 길이로 성장한 유충을 수집하는 단계; 및

(v) 실외 발효 사료배지로부터 수집된 유충 100~200마리를 30±10cm x 60±10cm 및 높이 20±10cm의 용기에 실내발효 사료배지와 골고루 혼합하여 실온에서 10~15일간 사육하여 흰점박이 꽃무지 성충을 얻는 단계를 포함하는 흰점박이 꽃무지 사육 방법.
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