KR101966435B1 - 헤파리노이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤파리노이드의 제조방법을 공개한 것으로서, 콘드로이틴황산 나트륨염을 원료로 하여 술폰화 반응 후처리를 거쳐 헤파리노이드를 취득하는 단계를 포함하여 구성되고, 상기 술폰화 반응에서 사용하는 용제는 포름아미드이고, 사용하는 술폰화제는 유리 삼산화황, 발연 황산 또는 피리딘 삼산화황이다. 본 발명에 따른 상기 헤파리노이드의 제조방법은 합성 공법이 간단하고 생산 조작의 제어가 쉬우며 생산 설비에 특수한 요구가 없고 제품의 분자량 범위가 안정적이며 물리화학적 지표를 품질표준범위 내로 제어할 수 있는 동시에 제품의 수율이 높아 대규모 공업화 생산에 적합한 장점이 있다.

Description

헤파리노이드의 제조방법

본 발명은 의약 기술 분야에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 약품 헤파리노이드의 제조방법에 관한 것이다.

헤파리노이드란 헤파린과 유사한 물질로서, 화학적 구조상 헤파린과 일정한 정도로 유사하고 항혈액응고 활성을 가지는 산성 뮤코다당류 물질이다. 항혈전 형성, 항염증, 진통, 상처의 혈액 순환 개선, 삼출물 흡수, 수종 및 부종 치유, 조직 수복 촉진 등 작용을 가진다. 임상적으로는 혈관 색전, 정맥류, 표재성 정맥염, 림프절염, 유선염 및 반흔 연화에 사용된다.

종래에 이미 공개된 헤파리노이드 관련 발명 특허가 있는바, 예를 들면 일본 특허 문헌(JP, S47-30167)은 진한 황산을 술폰화제로 사용하여 저온 조건하에서 콘드로이틴황산과 피리딘 속에서 반응시킴으로써 헤파리노이드를 제조하는 방법이고, 일본 특허 문헌(JP, S59-133201)은 진한 황산 및 클로로설폰산을 술폰화제로 사용하여 콘드로이틴황산에 대한 구조적 변경을 통하여 제조하는 방법이다. 상기와 같은 방법들은 모두 대량의 진한 황산을 사용하고 산 소모량이 크기 때문에, 생산 설비에 대한 부식이 심각하고 폐액의 처리가 어려워 환경 보호에 이롭지 못하고, 생산 공정의 키 포인트를 제어하기 어려우며 취득한 산물의 분자량 범위가 안정적이지 못하기 때문에 제품의 활성 등 성능 지표도 제어하기 어렵게 된다.

유럽 특허 문헌(EP1634893)은 클로로설폰산을 술폰화제로 사용하여 포름아미드 용제에서 반응시켜 헤파리노이드를 제조하는 방법을 공개하였다. 비록 상기 제조방법에 따른 헤라피노이드의 대다수 물리화학적 지표를 제어하기 쉽지만 "총 질소량" 지표는 표준 범위 안으로 제어하기 어렵고 또한 클로로설폰산은 위험물로서 물과 접촉하면 바로 폭발하기 때문에 운송 및 저장에 이롭지 못하고, 반응 과정 중 열량를 방출할 뿐만 아니라 대량의 연기가 생성되기 때문에 생산 조작에 있어서 대형 안전사고의 위험이 있다. 또한, 출원인이 상기 문헌에 따른 방법을 중복 실행할 때, 생산물의 수율이 비교적 낮고 생산 원가가 비교적 높기 때문에 대규모의 공업화 생산에 적합하지 않았다.

종래 기술의 부족을 해결하기 위하여, 본 발명은 종래 기술 중에 존재하는 결함을 개선하여 환경 친화적이고 제품의 수율이 높은 헤파리노이드의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 목적을 달성하기 위하여, 본 발명이 제공하는 주요한 기술적 방안은 다음과 같은 단계를 포함하여 구성된다.

헤파리노이드의 제조방법에 있어서, 콘드로이틴황산 나트륨염을 원료로 하여 술폰화 반응 후처리를 거쳐 헤파리노이드를 취득하는 단계를 포함하여 구성되고, 상기 술폰화 반응에서 사용하는 용제는 포름아미드이고, 사용하는 술폰화제는 유리 삼산화황(기체 상태 또는 액체 상태), 발연 황산 또는 피리딘 삼산화황이다.

상기 후처리 과정은 통상적으로 침전 잡질 제거, 이온교환수지 탈염, 감압 농축 아민 제거, 과산화수소 탈색 및 냉동 건조 과정을 거쳐 헤파리노이드를 취득한다.

더 나아가서, 상기 제조방법은 하기와 같은 단계를 포함하여 구성된다.

(1) 술폰화 반응: 콘드로이틴황산 나트륨염을 5~10배 체적의 포름아미드에 용해시키고 술폰화제를 투입하여 0~80℃ 온도하에서 3~12시간 동안 반응시킨 다음, 유기 용제를 투입하여 반응을 중지시키고 가만히 놓아두어 침강시켜 침전물을 수집한다;

(2) 침전 잡질 제거: 단계 (1)을 통하여 취득한 침전물을 10~20% W/V 농도의 수용액으로 조제하고 수용액의 pH값을 6~8로 조절한 다음 2~3배 체적량의 유기 용제를 투입하여 침전시키고; 이어서 침전물을 20~40% W/V 농도의 수용액으로 조제하고 2~3배 체적량의 유기 용제를 투입하여 침전시켜 침전물을 수집한다;

(3) 이온교환수지 탈염: 단계 (2)를 통하여 최종으로 취득한 침전물을 10~30% W/V 농도의 수용액으로 조제한 다음 순차적으로 강산성 양이온교환수지, 강알칼리성 음이온교환수지를 통과시켜 이온교환 탈염을 실행하고, pH값이 4 이하인 부분을 수집한 다음 수집액의 pH값을 6.5~7.5로 조절한다;

(4) 감압 농축 아민 제거: 단계 (3)을 통하여 취득한 수집액을 35~45℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 유기 용제를 증발시킨 다음, pH값을 10.5~12로 조절하고 45~55℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 일부분 물을 제거하는 동시에 잔류된 유기 용제를 증발시켜 농축액을 취득한다;

(5) 과산화수소 탈색 및 냉동 건조: 단계 (4)를 통하여 취득한 농축액의 pH값을 10~12로 조절하고 과산화수소 탈색을 거친 다음 시스템의 pH값을 6~7로 조절하고 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드를 취득한다.

상기 헤파리노이드의 제조방법에 있어서, 사용하는 원료 콘드로이틴황산은 돼지, 소의 연골 조직으로부터 취득하고 제품은 나트륨염의 형식으로 존재한다. 구매 업체는 가흥항걸생물제약유한공사, 절강오흥생물과기유한공사, 사전패오생물제약유한공사, 산동익보생물제품유한공사, 제남성림생물공정유한공사 등이 있다.

상기 단계 (1)에 있어서, 반응 온도는 바람직하게 0~60℃이고, 반응 시간은 바람직하게 3~6시간이다. 바람직하게는, 단계 (1)에 있어서, 상기 술폰화제가 피리딘 삼산화황인 경우, 술폰화 반응 온도는 45~55℃이고 반응 시간은 3.5~4.5시간이다. 상기 술폰화제가 발연 황산인 경우, 술폰화 반응 온도는 20~30℃이고 반응 시간은 5~6시간이다. 상기 술폰화제가 유리 삼산화황(기체 상태 또는 액체 상태)인 경우, 술폰화 반응 온도는 0~10℃이고 반응 시간은 2.5~3.5시간이다. 상기와 같은 기술적 방안을 사용하는 경우, 대량의 황산을 사용할 필요가 없어 환경 보호 압력이 작을 뿐만 아니라 제품의 최종 수율을 향상시킬 수 있는바, 종래 기술에 비하여 수율 향상 효과가 10%를 초과할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 술폰화제는 피리딘 삼산화황이고, 상기 기술적 방안을 사용할 때 수율이 더욱 좋은바 95% 이상까지 도달할 수 있으며, 조작이 간단하고 후처리가 편리한 장점이 있다. 바람직하게는, 단계 (1)에 있어서, 반응을 중지시키기 위한 유기 용제는 메탄올, 에탄올, 아세톤 중의 적어도 한가지이다.

본 발명에 있어서, 단계 (2)의 침전 잡질 제거 과정에서 주로 수용액 중의 과잉 황산을 제거하는 동시에 잔류한 포름아미드를 더 제거하게 된다. 단계 (2)에 있어서, 상기 유기 용제는 메탄올, 에탄올, 아세톤 중의 적어도 한가지이다.

더욱 바람직하게는, 단계 (1) 및 단계 (2)에 있어서, 상기 유기 용제는 동일한바 모두 아세톤이다.

단계 (3)에 있어서, 상기 강산성 양이온교환수지, 강알칼리성 음이온교환수지와 콘드로이틴황산의 체적질량비는 2~6ml/g이다. 상기 강산성 양이온교환수지는 강산성(스티렌계, 아크릴산계, 페놀계, 에폭시계, 비닐피리딘계, 요소포름알데히드계) 양이온교환수지를 선택할 수 있고, 상기 강알칼리성 음이온교환수지는 강알칼리성(스티렌계, 아크릴산계, 페놀계, 에폭시계, 비닐피리딘계, 요소포름알데히드계) 음이온교환수지를 선택할 수 있다.

바람직하게는, 상기 강산성 양이온교환수지, 강알칼리성 음이온교환수지와 콘드로이틴황산의 체적질량비는 3~4ml/g이다. 상기 강산성 양이온교환수지는 바람직하게 강산성 스티렌계 양이온교환수지이고, 상기 강알칼리성 음이온교환수지는 바람직하게 강알칼리성 스티렌계 음이온교환수지이다.

바람직하게는, 단계 (3)에 있어서, 수집액의 pH값을 7±0.2로 조절한다. 상기 단계는 주로 제품 중에 혼입된 염을 제거하고 염소 함량을 낮추기 위한 것이다.

더욱 바람직하게는, 단계 (4)에 있어서, 감악 농축을 통하여 유기 용제를 증발시킨 다음, 알칼리성 물질로 pH값을 11.5±0.2로 조절한다. 상기 단계에 있어서, 농축 과정에서, 농축전 체적의 2/3~3/4 체적까지 농축시킨다. 상기 단계는 주로 유기 용제를 제거하기 위한 것이다.

바람직하게는, 단계 (5)에 있어서, 단계 (4)를 통하여 취득한 농축액의 pH값을 11.0±0.5로 조절한다.

본 발명에 있어서, pH값을 조절하기 위하여 사용되는 알칼리성 물질은 20~30%의 수산화나트륨 수용액이다. 산은 황산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 헤파리노이드의 제조방법은 합성 공법이 간단하고 생산 조작의 제어가 쉬우며 생산 설비에 특수한 요구가 없고 제품의 분자량 범위가 안정적이며 물리화학적 지표를 품질표준범위 내로 제어할 수 있는 동시에 제품의 수율이 높아 대규모 공업화 생산에 적합한 장점이 있다.

이하, 구체적인 실시예를 참조하여 더 나아가서 본 발명의 실현 방법을 설명하고자 한다. 하지만 하기 실시예는 본 발명을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명에 대한 한정이 아니다.

실시예 1:

(1) 100g의 콘드로이틴황산 나트륨염(가흥항걸생물제약유한공사, EP7.0 표준)을 1000ml의 포름아미드에 용해시키고 150g의 피리딘 삼산화황 고체를 투입한 다음, 50℃까지 가열하고 4시간 동안 교반하여 반응시킨 다음, 2000ml의 아세톤을 투입하여 반응을 중지시키고 가만히 놓아두어 침강시켜 침전물을 수집하였다;

(2) 상기 침전물을 800ml의 정제수로 용해시킨 다음, 질량분율이 30%인 NaOH 수용액으로 시스템의 pH값을 7±0.5로 조절하고, 2배 체적량의 아세톤을 투입하여 침전시킨 다음; 이어서 침전물을 400ml의 정제수로 용해시킨 다음, 2배 체적량의 아세톤을 투입하여 침전시켜 침전물을 수집하였다.

(3) 상기 침전물을 800ml의 정제수로 용해시킨 다음, 순차적으로 400ml의 강산성 양이온교환수지(상해개평수지유한공사, 모델명: 001×7), 400ml의 강알칼리성 음이온교환수지(상해개평수지유한공사, 모델명: 201×7)를 통과시켜 이온교환 탈염을 실행하고, pH값이 4 이하인 부분을 수집한 다음 질량분율이 30%인 NaOH 수용액으로 수집액의 pH값을 7±0.2로 조절하였다.

(4) 상기 수집액을 40℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 잔류한 아세톤을 증발시키고, 이어서 질량분율이 30%인 NaOH 수용액으로 나머지 액체의 pH값을 11.5±0.2로 조절하고, 50℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 약 400ml의 농축액까지 농축시켰다.

(5) 단계 (4)를 통하여 취득한 농축액에 질량분율이 30%인 과산화수소 수용액 20ml를 투입하고, 30%의 NaOH로 시스템의 pH값을 11.0±0.5로 조절한 다음, 30℃에서 1~2시간 탈색하고, 황산으로 시스템의 pH값을 6.5±0.5로 조절한 다음 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 98g를 취득하였다. 질량에 의하여 수율을 계산할 때, 총 수율은 98%이였다.

실시예 2:

100g의 콘드로이틴황산 나트륨염을 900ml의 포름아미드에 용해시키고 질량분율이 60%인 발연 황산 160ml을 천천히 한방울씩 추가한 다음, 20~30℃로 온도를 제어하여 6시간 동안 교반하여 반응시킨 다음, 1800ml의 아세톤을 투입하여 반응을 중지시키고 가만히 놓아두어 침강시켜 침전물을 수집하였다;

후처리는 실시예 1의 방법에 따라 실행하였고, 최종적으로 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 95g를 취득하였고, 총 수율은 95%이였다.

실시예 3:

100g의 콘드로이틴황산 나트륨염을 950ml의 포름아미드에 용해시키고 교반하면서 천천히 삼산화황 기체를 주입하였으며, 0~10℃로 온도를 제어하여 3시간 동안 보온 반응시킨 다음, 1900ml의 아세톤을 투입하여 반응을 중지시키고 가만히 놓아두어 침강시켜 침전물을 수집하였다;

후처리는 실시예 1의 방법에 따라 실행하였고, 최종적으로 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 95g를 취득하였고, 총 수율은 95%이였다.

본 발명의 실시예 1~3에 따라 제조된 헤파리노이드 제품의 주요한 물리화학적 지표는 다음과 같았다.

외관: 흰색 또는 옅은 황백색의 분말

pH: 6.0~7.5

비선광도: -11.7°~-14.7°

건조 무게 감량: ≤6%

강열 잔여물: 38%~48%

전기 이동: 1.07~1.16

총 질소량: 1.6%~2.0%

특성 점도: 0.09~0.18

유기 황산염기: 25.8%~37.3%

유리 유황: ≤13%

D-글루쿠론산: 19%~24%

히알루로니다아제: 14%~29%

총 염소: <0.178%

비교예 1:

동일한 몰중량의 클로로설폰산으로 실시예 1 중의 피리딘 삼산화황을 대체하고 동일한 단계에 따라 후속 반응을 진행하여 최종적으로 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 83g를 취득하였는바, 그 수율 83%는 본 발명의 실시예 1에서의 수율보다 많이 낮은 수준이였다.

비교예 2:

동일한 몰중량의 삼산화황으로 실시예 1 중의 피리딘 삼산화황을 대체하고 동일 체적의 피리딘으로 포름아미드를 대체하였으며, 동일한 단계에 따라 후속 반응을 진행하여 최종적으로 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 73g를 취득하였는바, 그 수율 73%는 본 발명의 실시예 1에서의 수율보다 많이 낮은 수준이였다.

비교예 3:

실시예 1 중의 단계 (3)을 생략한 이외, 기타 단계는 실시예 1과 동일하게 진행하여 최종적으로 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드 100g을 취득하였으나 염소 함량이 0.178%를 초과하여 제품의 물리화학적 지표 요구를 만족시킬 수 없었다.

상기 내용은 본 발명의 구체적인 실시방법일 뿐, 본 발명의 보호범위를 이에 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 기술 분야에 숙련된 기술자는 본 발명에서 공개된 기술적 범위 내에서 변화 또는 치환 가능한 것을 쉽게 생각해낼 수 있는바, 이는 모두 본 발명의 보호범위 내에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 청구항에서 정의한 보호범위를 기준으로 하여야 한다.

Claims (10)

1. 콘드로이틴황산 나트륨염을 원료로 하여 술폰화 반응 후처리를 거쳐 헤파리노이드를 취득하는 단계를 포함하여 구성되고, 사용하는 술폰화제는 유리 삼산화황(기체 상태 또는 액체 상태), 발연 황산 또는 피리딘 삼산화황인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법에 있어서, 위 단계는 구체적으로
   (1) 콘드로이틴황산 나트륨염을 5~10배 체적의 포름아미드에 용해시키고 술폰화제를 투입하여 0~80℃ 온도하에서 3~12시간 동안 반응시킨 다음, 유기 용제를 투입하여 반응을 중지시키고 가만히 놓아두어 침강시켜 침전물을 수집하는 단계;
   (2) 단계 (1)을 통하여 취득한 침전물을 10~20% W/V 농도의 수용액으로 조제하고 수용액의 pH값을 6~8로 조절한 다음 2~3배 체적량의 유기 용제를 투입하여 침전물을 분리시키고; 이어서 침전물을 20~40% W/V 농도의 수용액으로 조제하고 2~3배 체적량의 유기 용제를 투입하여 침전물을 수집하는 단계;
   (3) 단계 (2)를 통하여 최종으로 취득한 침전물을 10~30% W/V 농도의 수용액으로 조제한 다음 순차적으로 강산성 양이온교환수지, 강알칼리성 음이온교환수지를 통과시켜 이온교환 탈염을 실행하고, pH값이 4 이하인 부분을 수집한 다음 수집액의 pH값을 6.5~7.5로 조절하는 단계;
   (4) 단계 (3)을 통하여 취득한 수집액을 35~45℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 유기 용제를 증발시킨 다음, pH값을 10.5~12로 조절하고 45~55℃까지 가열하여 감압 농축을 통하여 일부분 물을 제거하는 동시에 잔류된 유기 용제를 증발시켜 농축액을 취득하는 단계; 및
   (5) 단계 (4)를 통하여 취득한 농축액의 pH값을 10~12로 조절하고 과산화수소 탈색을 거친 다음 시스템의 pH값을 6~7로 조절하고 냉동 건조를 통하여 헤파리노이드를 취득하는 단계; 를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   단계 (1)에 있어서 반응 온도는 0~60℃이고 반응 시간은 3~6시간인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 술폰화제가 피리딘 삼산화황인 경우, 술폰화 반응 온도는 45~55℃이고 반응 시간은 3.5~4.5시간이며; 상기 술폰화제가 발연 황산인 경우, 술폰화 반응 온도는 20~30℃이고 반응 시간은 5~6시간이며; 상기 술폰화제가 유리 삼산화황(기체 상태 또는 액체 상태)인 경우, 술폰화 반응 온도는 0~10℃이고 반응 시간은 3.0~3.5시간인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 술폰화제는 피리딘 삼산화황인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,
   단계 (1)에 있어서 반응을 중지시키기 위한 유기 용제는 메탄올, 에탄올, 아세톤 중의 적어도 한가지인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
8. 제1항에 있어서,
   단계 (2)에 있어서 침전용의 유기 용제는 메탄올, 에탄올, 아세톤 중의 적어도 한가지인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 콘드로이틴황산 나트륨염 1g당 강산성 양이온교환수지 및 강알칼리성 음이온교환수지는 각각 2~6ml/g인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 강산성 양이온교환수지는 강산성 스티렌계 양이온교환수지이고, 상기 강알칼리성 음이온교환수지는 강알칼리성 스티렌계 음이온교환수지인 것을 특징으로 하는 헤파리노이드의 제조방법.