JP6486554B2 - ヘパリノイドの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は医薬品の技術分野に属し、特に生化学的薬物であるヘパリノイドの製造方法に関する。
ヘパリノイドは、ヘパリンと類似する物質であり、化学構造がヘパリンとある程度で類似しており、抗凝固活性を有する酸性ムコ多糖類である。抗血栓形成、消炎、鎮痛、患部での血液循環の改善、滲出液吸収、水腫や浮腫の治療、組織修復促進等の役割を果たす。臨床上、血管塞栓、静脈瘤、表在静脈炎、リンパ節炎、乳腺炎や瘢痕軟化に適用できる。
従来、ヘパリノイドについての発明特許の文献は報道されたことがあり、たとえば、日本特許文献（ＪＰ、Ｓ４７−３０１６７）には、濃硫酸をスルホン化剤として、低温下でコンドロイチン硫酸とピリジンにおいて反応させてヘパリノイドを製造し、日本特許文献（ＪＰ、Ｓ５９−１３３２０１）には、濃硫酸とクロロスルホン酸の混合酸をスルホン化剤として、コンドロイチン硫酸に構造修飾を行う製造方法が採用されている。これら方法のいずれも、はるかに過剰な濃硫酸を使用し、酸使用量が大きいため、生産装置への腐食が深刻であり、廃液の処理が困難であり、環境に悪く、さらに、生産プロセスでの重点は制御しにくく、得られた生成物の分子量範囲が不安定で、したがって、製品の活性等の性能指標の制御も困難になる。
欧州特許文献（ＥＰ１６３４８９３）において、クロロスルホン酸をスルホン化剤として、ホルムアミド溶剤において反応させてヘパリノイドを製造する方法が報道されており、該方法で製造されたヘパリノイドの大部分の物理的および化学的指標は制御しやすいものの、「全窒素」の指標は標準範囲内に制御しにくく、かつクロロスルホン酸は危険品で、水と接触すると爆発してしまい、輸送や貯蔵に不利であり、反応過程で放熱して大量の煙を発生させるため、生産操作時に安全上のリスクが高い。また、出願人が上記文献による方法を再現する時、生成物の収率は低く、生産コストは高く、そのため、大規模な工業的生産に適していない。
従来技術の欠点に対し、本発明の目的は、従来技術に存在する欠陥を改良して、環境に優しくて、かつ製品の収率が高いヘパリノイドの製造方法を提供することにある。
本発明は、上記のような目的を達成するために、主に下記の技術構成を提供するものである。具体的には、ヘパリノイドの製造方法であって、コンドロイチン硫酸を原料として、スルホン化反応、後処理により、上記ヘパリノイドを得るステップを含み、上記スルホン化反応において、ホルムアミドを溶剤として用いて、遊離三酸化硫黄（気体又は液体）、発煙硫酸又はピリジン三酸化硫黄をスルホン化剤として用いる、製造方法である。
上記後処理過程は一般的に、沈殿による不純物除去、イオン交換樹脂による脱塩、減圧濃縮による脱アミン、過酸化水素による脱色及び凍結乾燥の過程を経てヘパリノイドを得ることを含む。
さらに、上記製造方法は、以下のステップを含む。
（１）スルホン化反応：コンドロイチン硫酸をその体積に対して５〜１０倍のホルムアミドに溶解して、スルホン化剤を加え、０〜８０℃の温度で撹拌しながら３〜１２時間反応させて、次に有機溶剤を加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集する、
（２）沈殿による不純物除去：ステップ（１）で得られた沈殿物を濃度１０〜２０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、水溶液のｐＨ値を６〜８に調整し、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて沈殿させ、次に、沈殿物を濃度２０〜４０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて沈殿させ、沈殿物を収集する、
（３）イオン交換樹脂による脱塩：ステップ（２）で最終的に得られた沈殿物を濃度１０〜３０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂を用いて順にイオン交換を行って脱塩し、ｐＨ値が４未満の画分を収集して、次に収集液のｐＨ値を６．５〜７．５に調整する、
（４）減圧濃縮による脱アミン：ステップ（３）で得られた収集液を３５〜４５℃に加熱して、減圧濃縮させて有機溶剤を蒸発除去し、次にｐＨ値を１０．５〜１２に調整して、４５〜５５℃に加熱し、減圧濃縮させて一部の水を除去するとともに残留された有機溶剤を除去し、濃縮液を得る、
（５）過酸化水素による脱色及び凍結乾燥：ステップ（４）で得られた濃縮液のｐＨ値を１０〜１２に調整して、過酸化水素で脱色した後、系のｐＨ値を６〜７に調整して、凍結乾燥させてヘパリノイドを得る。
（１）スルホン化反応：コンドロイチン硫酸をその体積に対して５〜１０倍のホルムアミドに溶解して、スルホン化剤を加え、０〜８０℃の温度で撹拌しながら３〜１２時間反応させて、次に有機溶剤を加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集する、
（２）沈殿による不純物除去：ステップ（１）で得られた沈殿物を濃度１０〜２０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、水溶液のｐＨ値を６〜８に調整し、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて沈殿させ、次に、沈殿物を濃度２０〜４０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて沈殿させ、沈殿物を収集する、
（３）イオン交換樹脂による脱塩：ステップ（２）で最終的に得られた沈殿物を濃度１０〜３０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂を用いて順にイオン交換を行って脱塩し、ｐＨ値が４未満の画分を収集して、次に収集液のｐＨ値を６．５〜７．５に調整する、
（４）減圧濃縮による脱アミン：ステップ（３）で得られた収集液を３５〜４５℃に加熱して、減圧濃縮させて有機溶剤を蒸発除去し、次にｐＨ値を１０．５〜１２に調整して、４５〜５５℃に加熱し、減圧濃縮させて一部の水を除去するとともに残留された有機溶剤を除去し、濃縮液を得る、
（５）過酸化水素による脱色及び凍結乾燥：ステップ（４）で得られた濃縮液のｐＨ値を１０〜１２に調整して、過酸化水素で脱色した後、系のｐＨ値を６〜７に調整して、凍結乾燥させてヘパリノイドを得る。
上記ヘパリノイドの製造方法において、使用される原料であるコンドロイチン硫酸は豚、牛の軟骨組織に由来し、製品はナトリウム塩として存在する。メーカーは嘉興恒傑生物製薬有限公司、浙江澳興生物科技有限公司、四川貝奥生物製薬有限公司、山東益宝生物製品有限公司、済南盛林生物工程有限公司等の公司を含む。
上記ステップ（１）において、反応温度は好ましくは０〜６０℃、反応時間は好ましくは３〜６時間である。好ましくは、ステップ（１）において、上記スルホン化剤がピリジン三酸化硫黄である場合、スルホン化反応の温度は４５〜５５℃で、反応時間は３．５〜４．５時間である。上記スルホン化剤が発煙硫酸である場合、スルホン化反応の温度は２０〜３０℃で、反応時間は５〜６時間である。上記スルホン化剤が遊離三酸化硫黄（気体又は液体）である場合、スルホン化反応の温度は０〜１０℃で、反応時間は２．５〜３．５時間である。上記技術構成によれば、大量の硫酸を使用せずに済んで、環境への負荷を削減させると同時に、製品の最終収率を向上させ、従来技術に比べて、収率を１０％以上向上させる。より好ましくは、上記スルホン化剤はピリジン三酸化硫黄であり、該技術構成によれば、収率は更に高くなり、最高では９５％以上に達し、かつ操作しやすく、後処理は容易である。好ましくは、ステップ（１）において、反応を停止する有機溶剤はメタノール、エタノール、アセトンのうちの少なくとも１種である。
本発明において、沈殿による不純物除去のステップ（２）は、主に水溶液における余分な硫酸を除去すると同時に、残留されたホルムアミドをさらに除去するためである。ステップ（２）において、上記有機溶剤はメタノール、エタノール、アセトンのうちの少なくとも１種である。
より好ましくは、ステップ（１）とステップ（２）において、上記有機溶剤は同じであり、いずれもアセトンとする。
上記ステップ（３）において、上記強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂の体積とコンドロイチン硫酸の質量との比率は２〜６ｍｌ／ｇである。上記強酸性カチオン交換樹脂として、強酸性（スチレン系、アクリル系、フェノール系、エポキシ系、ビニルピリジン系、尿素ホルムアルデヒド系）カチオン交換樹脂、上記強塩基性アニオン交換樹脂として、強塩基性（スチレン系、アクリル系、フェノール系、エポキシ系、ビニルピリジン系、尿素ホルムアルデヒド系）アニオン交換樹脂が使用可能である。
好ましくは、上記強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂の体積とコンドロイチン硫酸の質量との比率は３〜４ｍｌ／ｇである。上記強酸性カチオン交換樹脂は好ましくは強酸性スチレン系カチオン交換樹脂、上記強塩基性アニオン交換樹脂は好ましくは強塩基性スチレン系アニオン交換樹脂である。
好ましくは、ステップ（３）において、収集液のｐＨ値は７±０．２に調整される。該ステップでは、主に製品に混入した塩を除去し、塩素含有量を低下させる。
好ましくは、ステップ（４）において、減圧濃縮させて有機溶剤を蒸発除去し、次にアルカリでｐＨを１１．５±０．２に調整する。該ステップでは、濃縮時、濃縮前の体積の２／３〜３／４になるまで濃縮させる。該ステップは主に有機溶剤を除去するためである。
好ましくは、ステップ（５）において、ステップ（４）で得られた濃縮液のｐＨ値は１１．０±０．５に調整される。
本発明において、ｐＨを調整するためのアルカリは２０〜３０％水酸化ナトリウム水溶液である。酸として硫酸等を使用することができる。
本発明の上記ヘパリノイドの製造方法は、合成プロセスがシンプルで、生産操作の制御が容易であり、生産装置に対して特殊な要件がなく、製品の分子量範囲が安定し、物理的および化学的指標が品質標範囲に制御されると同時に、製品の収率が高く、大規模な工業的生産に適している。
以下、具体的な実施例をもって本発明の実施形態をより説明するが、以下の実施例は本発明を理解しやすくするもので、本発明を制限するものではない。
実施例１
（１）コンドロイチン硫酸（嘉興恒傑生物製薬有限公司製、ＥＰ７．０標準）１００ｇをホルムアミド１０００ｍｌに溶解して、ピリジン三酸化硫黄固体１５０ｇを加え、５０℃に加熱して、撹拌しながら４時間反応させ、次にアセトン２０００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
（２）上記沈殿物を精製水８００ｍｌで溶解して、濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液を用いて系のｐＨ値を７±０．５に調整し、その体積に対して２倍のアセトンを加えて沈殿させ、次に、沈殿物を精製水４００ｍｌで溶解して、その体積に対して２倍のアセトンを加えて沈殿させ、沈殿物を収集した。
（３）上記沈殿物を精製水８００ｍｌで溶解して、強酸性カチオン交換樹脂（上海開平樹脂有限公司製、型番：００１×７）４００ｍｌ、強塩基性アニオン交換樹脂（上海開平樹脂有限公司製、型番：２０１×７）４００ｍｌを用いて順にイオン交換を行って脱塩し、ｐＨ値が４未満の画分を収集して、次に濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液で収集液のｐＨ値を７±０．２に調整した。
（４）上記収集液を４０℃に加熱して、減圧濃縮させて残留されたアセトンを蒸発除去し、次に濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液で残りの液体のｐＨ値を１１．５±０．２に調整し、５０℃に加熱して、濃縮液約４００ｍｌになるまで減圧濃縮させた。
（５）ステップ（４）で得られた濃縮液に濃度３０質量％の過酸化水素水溶液２０ｍｌを加えて、３０％のＮａＯＨで系のｐＨ値を１１．０±０．５に調整し、３０℃で撹拌しながら１〜２時間脱色し、硫酸で系のｐＨ値を６．５±０．５に調整して、凍結乾燥させてヘパリノイド９８ｇを得て、質量収率換算で、全収率は９８％であった。
（１）コンドロイチン硫酸（嘉興恒傑生物製薬有限公司製、ＥＰ７．０標準）１００ｇをホルムアミド１０００ｍｌに溶解して、ピリジン三酸化硫黄固体１５０ｇを加え、５０℃に加熱して、撹拌しながら４時間反応させ、次にアセトン２０００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
（２）上記沈殿物を精製水８００ｍｌで溶解して、濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液を用いて系のｐＨ値を７±０．５に調整し、その体積に対して２倍のアセトンを加えて沈殿させ、次に、沈殿物を精製水４００ｍｌで溶解して、その体積に対して２倍のアセトンを加えて沈殿させ、沈殿物を収集した。
（３）上記沈殿物を精製水８００ｍｌで溶解して、強酸性カチオン交換樹脂（上海開平樹脂有限公司製、型番：００１×７）４００ｍｌ、強塩基性アニオン交換樹脂（上海開平樹脂有限公司製、型番：２０１×７）４００ｍｌを用いて順にイオン交換を行って脱塩し、ｐＨ値が４未満の画分を収集して、次に濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液で収集液のｐＨ値を７±０．２に調整した。
（４）上記収集液を４０℃に加熱して、減圧濃縮させて残留されたアセトンを蒸発除去し、次に濃度３０質量％のＮａＯＨ水溶液で残りの液体のｐＨ値を１１．５±０．２に調整し、５０℃に加熱して、濃縮液約４００ｍｌになるまで減圧濃縮させた。
（５）ステップ（４）で得られた濃縮液に濃度３０質量％の過酸化水素水溶液２０ｍｌを加えて、３０％のＮａＯＨで系のｐＨ値を１１．０±０．５に調整し、３０℃で撹拌しながら１〜２時間脱色し、硫酸で系のｐＨ値を６．５±０．５に調整して、凍結乾燥させてヘパリノイド９８ｇを得て、質量収率換算で、全収率は９８％であった。
実施例２
コンドロイチン硫酸１００ｇをホルムアミド９００ｍｌに溶解して、濃度６０質量％の発煙硫酸１６０ｍｌをゆっくり滴下し、温度を２０〜３０℃に制御して撹拌しながら６時間反応させ、次にアセトン１８００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
後処理は実施例１と同様であり、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品９５ｇは得られ、全収率は９５％であった。
コンドロイチン硫酸１００ｇをホルムアミド９００ｍｌに溶解して、濃度６０質量％の発煙硫酸１６０ｍｌをゆっくり滴下し、温度を２０〜３０℃に制御して撹拌しながら６時間反応させ、次にアセトン１８００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
後処理は実施例１と同様であり、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品９５ｇは得られ、全収率は９５％であった。
実施例３
コンドロイチン硫酸１００ｇをホルムアミド９５０ｍｌに溶解して、撹拌しながら三酸化硫黄ガスをゆっくり導入し、温度を０〜１０℃に制御して保温して３時間反応させ、次にアセトン１９００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
後処理は実施例１と同様であり、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品９５ｇは得られ、全収率は９５％であった。
コンドロイチン硫酸１００ｇをホルムアミド９５０ｍｌに溶解して、撹拌しながら三酸化硫黄ガスをゆっくり導入し、温度を０〜１０℃に制御して保温して３時間反応させ、次にアセトン１９００ｍｌを加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集した。
後処理は実施例１と同様であり、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品９５ｇは得られ、全収率は９５％であった。
本発明の実施例１−３で製造されたヘパリノイド製品の主な物理的および化学的指標は以下のとおりである。
外観：白色又は黄白色粉末
ｐＨ：６．０〜７．５
比旋光度：−１１．７°〜−１４．７°
乾燥減量：≦６％
強熱残分：３８％〜４８％
電気泳動：１．０７〜１．１６
全窒素：１．６％〜２．０％
固有粘度：０．０９〜０．１８
有機硫酸根：２５．８％〜３７．３％
遊離硫黄：≦１３％
Ｄ−グルクロン酸：１９％〜２４％
ヒアルロニダーゼ：１４％〜２９％
全塩素：＜０．１７８％
外観：白色又は黄白色粉末
ｐＨ：６．０〜７．５
比旋光度：−１１．７°〜−１４．７°
乾燥減量：≦６％
強熱残分：３８％〜４８％
電気泳動：１．０７〜１．１６
全窒素：１．６％〜２．０％
固有粘度：０．０９〜０．１８
有機硫酸根：２５．８％〜３７．３％
遊離硫黄：≦１３％
Ｄ−グルクロン酸：１９％〜２４％
ヒアルロニダーゼ：１４％〜２９％
全塩素：＜０．１７８％
比較例１
実施例１のピリジン三酸化硫黄を同じモル量のクロロスルホン酸に変更する以外、同じステップに従って後続反応を行い、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品８３ｇは得られ、収率は８３％であり、本発明の実施例１の収率よりも遥かに低かった。
実施例１のピリジン三酸化硫黄を同じモル量のクロロスルホン酸に変更する以外、同じステップに従って後続反応を行い、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品８３ｇは得られ、収率は８３％であり、本発明の実施例１の収率よりも遥かに低かった。
比較例２
実施例１のピリジン三酸化硫黄を同じモル量の三酸化硫黄、溶剤としてホルムアミドを等体積のピリジンに変更する以外、同じステップに従って後続反応を行い、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品７３ｇは得られ、収率は７３％であり、本発明の実施例１の収率よりも遥かに低かった。
実施例１のピリジン三酸化硫黄を同じモル量の三酸化硫黄、溶剤としてホルムアミドを等体積のピリジンに変更する以外、同じステップに従って後続反応を行い、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品７３ｇは得られ、収率は７３％であり、本発明の実施例１の収率よりも遥かに低かった。
比較例３
実施例１のステップ（３）を省略する以外、残りのステップは実施例１と同様に行われ、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品１００ｇは得られたが、塩素含有量は０．１７８％を超え、製品の物理的および化学的指標に対する要件を満たせない。
実施例１のステップ（３）を省略する以外、残りのステップは実施例１と同様に行われ、最後に凍結乾燥させてヘパリノイド製品１００ｇは得られたが、塩素含有量は０．１７８％を超え、製品の物理的および化学的指標に対する要件を満たせない。
以上は、本発明の具体的な実施形態に過ぎず、本発明の保護範囲はそれに制限されず、当業者が本発明で開示された技術的範囲を脱逸せずに想到し得る変化又は置換はいずれも、本発明の保護範囲に属する。従って、本発明の保護範囲は特許請求の範囲による保護範囲に準じる。
Claims (10)
- ヘパリノイドの製造方法であって、
コンドロイチン硫酸を原料として、スルホン化反応、後処理により、前記ヘパリノイドを得るステップを含み、前記スルホン化反応において、ホルムアミドを溶剤として用いて、遊離三酸化硫黄、発煙硫酸又はピリジン三酸化硫黄をスルホン化剤として用い、
前記後処理は、沈殿による不純物除去、イオン交換樹脂による脱塩、減圧濃縮による脱アミン、過酸化水素による脱色及び凍結乾燥のステップを含む、製造方法。 - コンドロイチン硫酸をその体積に対して５〜１０倍のホルムアミドに溶解して、スルホン化剤を加え、０〜８０℃の温度で撹拌しながら３〜１２時間反応させて、次に有機溶剤を加えて反応を停止し、静置して沈降させて、沈殿物を収集するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた沈殿物を濃度１０〜２０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、水溶液のｐＨ値を６〜８に調整し、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて、沈殿物を分離し、次に、沈殿物を濃度２０〜４０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、その体積に対して２〜３倍の有機溶剤を加えて、沈殿物を収集するステップ（２）と、
ステップ（２）で最終的に得られた沈殿物を濃度１０〜３０％Ｗ／Ｖの水溶液に調製して、強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂を用いて順にイオン交換を行って脱塩し、ｐＨ値が４未満の画分を収集して、次に収集液のｐＨ値を６．５〜７．５に調整するステップ（３）と、
ステップ（３）で得られた収集液を３５〜４５℃に加熱して、減圧濃縮させて有機溶剤を蒸発除去し、次にｐＨ値を１０．５〜１２に調整して、４５〜５５℃に加熱し、減圧濃縮させて一部の水を除去するとともに残留された有機溶剤を除去し、濃縮液を得るステップ（４）と、
ステップ（４）で得られた濃縮液のｐＨ値を１０〜１２に調整して、過酸化水素で脱色した後、系のｐＨ値を６〜７に調整して、凍結乾燥させてヘパリノイドを得るステップ（５）と、を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘパリノイドの製造方法。 - 使用される原料であるコンドロイチン硫酸は豚、牛の軟骨組織に由来し、製品はナトリウム塩として存在することを特徴とする請求項２に記載のヘパリノイドの製造方法。
- ステップ（１）において、反応温度は０〜６０℃で、反応時間は３〜６時間であることを特徴とする請求項２に記載のヘパリノイドの製造方法。
- 前記スルホン化剤がピリジン三酸化硫黄である場合、スルホン化反応の温度は４５〜５５℃で、反応時間は３．５〜４．５時間であり、前記スルホン化剤が発煙硫酸である場合、スルホン化反応の温度は２０〜３０℃で、反応時間は５〜６時間であり、前記スルホン化剤が遊離三酸化硫黄である場合、スルホン化反応の温度は０〜１０℃で、反応時間は２．５〜３．５時間であることを特徴とする請求項４に記載のヘパリノイドの製造方法。
- 前記スルホン化剤はピリジン三酸化硫黄であることを特徴とする請求項５に記載のヘパリノイドの製造方法。
- ステップ（１）において、反応を停止する有機溶剤はメタノール、エタノール、アセトンのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項２に記載のヘパリノイドの製造方法。
- ステップ（２）において、沈殿用有機溶剤はメタノール、エタノール、アセトンのうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項２に記載のヘパリノイドの製造方法。
- 前記強酸性カチオン交換樹脂、強塩基性アニオン交換樹脂の体積とコンドロイチン硫酸の質量との比率は２〜６ｍｌ／ｇであることを特徴とする請求項２に記載のヘパリノイドの製造方法。
- 前記強酸性カチオン交換樹脂は強酸性スチレン系カチオン交換樹脂で、前記強塩基性アニオン交換樹脂は強塩基性スチレン系アニオン交換樹脂であることを特徴とする請求項９に記載のヘパリノイドの製造方法。
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