CN102363775B - 一种纯化腈水解酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种纯化腈水解酶的制备方法，属于腈水解酶的制备方法。本发明以市售粗腈水解酶为原料，经预处理、超滤分级、冷冻干燥的简单工艺，制备出纯化腈水解酶产品。本发明的方法简单，使用常规的简单设备，操作简易控制，生产安全，便于推广应用；在生产过程中，反应条件温和，能耗低，充分利用物料资源，无排放，有利于环保；生产出的产品纯度高，活性高，稳定性好，能满足制备高附加值产品的要求。采用本发明制备出的产品可广泛应用于医药、化工、材料、农业等行业中。
Description
一.技术领域
本发明属于腈水解酶的纯化技术领域，具体涉及一种以市售粗腈水解酶为原料，纯化得到高纯度腈水解酶的方法。
二.背景技术
腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，广泛应用于化学工业、食品和农业。用腈水解酶实现腈基的水解，其优势不仅在于反应条件温和、环境友好，重要的是可以实现一般化学反应所不具有的手性选择性。但是，市售的腈水解酶纯度低，含有大量多糖、杂蛋白等杂质，常用作饲料添加剂和食品添加剂，很难满足制备高附加值产品(如医药、化工等)需要高纯度酶的条件，严重限制了腈水解酶的应用。因此，制备出高纯度腈水解酶产品，达到制备高附加值产品的要求具有重要的意义。
现有纯化腈水解酶的方法，例如《安徽农业科学》2010年38卷11期的“木聚糖酶的超滤纯化方法研究”一文，公开的方法是：以木聚糖酶为原料，经过适当稀释后，用不同分子量超滤柱进行超滤，或木聚糖酶不经稀释，直接进行超滤，在超滤过程中添加柠檬酸缓冲剂进行稀释。该方法的主要缺点：①没有对木聚糖酶原料进行预处理，利用率低，生产出的产品纯度低，不能满足制备高附加值产品的要求；②生产出的产品没有进行后期添加保护剂处理，干燥时酶活力损失大，产品的催化效率低。
三.发明内容
本发明的目的是针对现有纯化腈水解酶方法的不足之处，提供一种纯化腈水解酶的方法，具有工艺简单，设备简单易得，操作步骤实用，节约能源，无有害物质排放，产品纯度高、活性高、稳定性好，资源综合利用率高等特点。
本发明的机理是：利用超滤对粗酶进行预处理，除掉亲水性大分子杂质；利用纳滤技术，让小分子杂质滤过而保留并浓缩目标物；利用在酶浓缩液中加入冻干保护剂，使酶的活性部位被得到保护，防止酶在冻干过程中失活或活性降低。
实现本发明的目的技术方案是：一种纯化腈水解酶的方法，以市售粗腈水解酶为原料，经预处理、超滤分级、纳滤浓缩、冷冻干燥的简单工艺，制备出纯化腈水解酶产品。其具体方法步骤如下：
(1)制备预处理液
以市售的粗腈水解酶为原料，按照粗腈水解酶的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)比为1∶80～120的比例，先将粗腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌混合均匀后，再搅拌溶解20～30分钟。然后将溶解液泵入真空抽滤机中，进行真空抽滤，分别收集抽滤滤过液和抽滤渣。对于收集的抽滤滤过液(即制备出预处理液)，用于下一步的处理；对于收集的抽滤渣，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂。其中，缓冲溶液为pH 8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH 9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或pH 9.18的硼砂-水缓冲溶液。
(2)制备超滤液
第(1)步完成后，将第(1)步收集的抽滤滤过液泵入截留分子量为50～60KDa的超滤器中，在0.05～0.2MPa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的8～12％为止，分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液。在收集的第一次超滤截留液中，加入去离子水，补充至原体积，再0.05～0.2MPa下，再进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的8～12％为止，分别收集第二次超滤液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤截留液，因含有丰富的蛋白质，干燥后用作饲料添加剂；对于收集的第二次超滤滤过液，与收集的第一次超滤滤过液合并，就制备出超滤液，用于下一步处理。
(3)制备纳滤浓缩液
第(2)步完成后，将第(2)步合并的第一、二次超滤滤过液泵入截留分子量为400～600Da的纳滤器中，再在0.2～0.4MPa下，进行纳滤分离，直至第一次纳滤截留液的体积减少至原体积的30～40％时为止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液。在收集的纳滤截留液中，加入去离子水补充至原体积，再在0.2～0.4MPa下，再进行第二次纳滤分离，直到第二次纳滤截留液的体积减少至原体积的15～25％为止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液。对于收集的第二次纳滤滤过液，因含有丰富的矿质元素、氨基酸等营养物质，与收集的第一次纳滤滤过液合并，浓缩后作饲料添加剂；对于收集的第二次纳滤截留液(即为纳滤浓缩液)，用于下一步的处理。
(4)制备纯化腈水解酶冻干粉
第(3)步完成后，按照0.3～0.8％蔗糖溶液∶第(3)步收集的第二次纳滤截留液的体积比为1∶25～50的比例，先将蔗糖溶液加入到第二次纳滤截留液中，搅拌均匀后，再放置于-16～-20℃温度下，预冻3～6小时，接着再放置于冷冻干燥机中，在30～60Pa真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～36小时，就制备出纯化腈水解酶冻干粉。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
(1)本发明方法能有效除去粗腈水解酶中的多糖、杂蛋白、小分子矿质、氨基酸等杂质，产品中腈水解酶的活性高达36U，与腈水解酶粗品原料相比较，纯化倍数达到5.14，纯化效率高，产品的纯度高，活性高，稳定性好，质量好，能满足制备高附加值产品。
(2)本发明在生产过程中，反应条件温和，能耗低，脱除的杂蛋白等均回收利用于配制动物饲料添加剂，不排放。这不但有利于环境保护，还降低生产成本，提高了资源的综合利用率。
(3)本发明在生产过程中，方法简单，主要使用抽滤、超滤及冻干机常规设备，不涉及昂贵的设备及仪器，因而生产设备简单，操作简便且易于控制，因此生产安全又降低生产成本，便于推广应用。
采用本发明方法制备出的产品可广泛应用于医药、农业、化工、材料等行业中。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种纯化腈水解酶的方法，具体方法步骤如下：
(1)制备预处理液
以市售的粗腈水解酶为原料，按照粗腈水解酶的质量(g)∶缓冲溶液的体积(mL)比为1∶80的比例，先将粗腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌混合均匀后，再搅拌溶解20分钟。然后将溶解液泵入真空抽滤机中，进行真空抽滤，分别收集抽滤滤过液和抽滤渣。对于收集的抽滤滤过液(即制备出预处理液)，用于下一步的处理；对于收集的抽滤渣，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂。其中，缓冲溶液为pH 8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液。
(2)制备超滤液
第(1)步完成后，将第(1)步收集的抽滤滤过液泵入截留分子量为50KDa的超滤器中，在0.05MPa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的8％为止，分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液。在收集的第一次超滤截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在0.05MPa下，再进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的8％为止，分别收集第二次超滤液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤截留液，因含有丰富的蛋白质，干燥后用作饲料添加剂；对于收集的第二次超滤滤过液，与收集的第一次超滤滤过液合并，就制备出超滤液，用于下一步处理。
(3)制备纳滤浓缩液
第(2)步完成后，将第(2)步合并的第一、第二次超滤滤过液泵入截留分子量为400Da的纳滤器中，再在0.2MPa下，进行纳滤分离，直至第一次纳滤截留液的体积减少至原体积的30％时为止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液。在收集的纳滤截留液中，加入去离子水补充至原体积，再在0.2MPa下，再进行第二次纳滤分离，直到第二次纳滤截留液的体积减少至原体积的15％为止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液。对于收集的第二次纳滤滤过液，因含有丰富的矿质元素、氨基酸等营养物质，与收集的第一次纳滤滤过液合并，浓缩后作饲料添加剂；对于收集的第二次纳滤截留液(即为纳滤浓缩液)，用于下一步的处理。
(4)制备纯化腈水解酶冻干粉
第(3)步完成后，按照0.3％蔗糖溶液∶第(3)步收集的第二次纳滤截留液的体积比为1∶25的比例，先将蔗糖溶液加入到第二次纳滤截留液中，搅拌均匀后，再放置于-16℃温度下，预冻3小时，接着再放置于冷冻干燥机中，在30Pa真空度、-50℃温度下，进行冷冻干燥24小时，就制备出纯化腈水解酶冻干粉。
实施例2
一种纯化腈水解酶的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，粗腈水解酶的质量∶缓冲溶液的体积比为1g∶100mL，搅拌溶解25分钟，其中，缓冲溶液为pH 9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液。
第(2)步中，超滤器的截留分子量为55KDa，超滤压力为0.1MPa，第一次超滤至超滤液体积减少至原体积的10％为止，第二次超滤至超滤液截留体积减少至原体积的10％为止。
第(3)步中，纳滤器的截留分子量为500Da，纳滤压力为0.3MPa，第一次纳滤截留液体积减少至原体积的35％时为止，第二次纳滤截留液体积减少至原体积的20％为止。
第(4)步中，0.5％蔗糖溶液∶第(3)步收集的第二次纳滤截留液的体积比为1∶35，对置于冻干瓶中的加入蔗糖溶液的第二次超滤截留液，在-18℃温度下，预冻4.5小时，在45Pa真空度、-55℃温度下，进行冷冻干燥30小时。
实施例3
一种纯化腈水解酶的方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，粗腈水解酶的质量∶缓冲溶液的体积比为1g∶120mL，搅拌溶解30分钟，其中，缓冲溶液为pH 9.18的硼砂-水缓冲溶液。
第(2)步中，超滤器的截留分子量为60KDa，超滤压力为0.2MPa，第一次超滤至超滤液体积减少至原体积的12％为止，第二次超滤至超滤液截留体积减少至原体积的12％为止。
第(3)步中，纳滤器的截留分子量为600Da，纳滤压力为0.4MPa，第一次纳滤截留液体积减少至原体积的40％时为止，第二次纳滤截留液体积减少至原体积的25％为止。
第(4)步中，0.8％蔗糖溶液∶第(3)步收集的第二次纳滤截留液的体积比为1∶50，对置于冻干瓶中的加入蔗糖溶液的第二次超滤截留液，在-20℃温度下，预冻6小时，在60Pa真空度、-60℃温度下，进行冷冻干燥36小时。
Claims (1)
1.一种纯化腈水解酶的方法，其特征在于具体方法步骤如下：
(1)制备预处理液
以市售的粗腈水解酶为原料，按照粗腈水解酶的质量∶缓冲溶液的体积比为1g∶80～120mL的比例，先将粗腈水解酶加入到缓冲溶液中，搅拌混合均匀后，再搅拌溶解20～30分钟，然后将溶解液泵入真空抽滤机中，进行真空抽滤，分别收集抽滤滤过液和抽滤渣，其中，缓冲溶液为pH 8.0的硼砂-氯化钙缓冲溶液或pH 9.0的硼砂-氯化钾缓冲溶液或pH 9.18的硼砂-水缓冲溶液；
(2)制备超滤液
第(1)步完成后，将第(1)步收集的抽滤滤过液泵入截留分子量为50～60KDa的超滤器中，在0.05～0.2MPa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的8～12％为止，分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，在收集的第一次超滤截留液，加入去离子水，补充至原体积，在0.05～0.2MPa下，再进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液体积减少至原体积的8～12％为止，分别收集第二次超滤液和第二次超滤截留液，并合并第一次超滤滤过液和第二次超滤滤过液；
(3)制备纳滤浓缩液
第(2)步完成后，将第(2)步合并的第一、二次超滤滤过液泵入截留分子量为400～600Da的纳滤器中，再在0.2～0.4MPa下，进行纳滤分离，直至第一次纳滤截留液的体积减少至原体积的30～40％时为止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，在收集的纳滤截留液中，加入去离子水补充至原体积，在0.2～0.4MPa下，再进行第二次纳滤分离，直到第二次纳滤截留液的体积减少至原体积的15～25％为止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液；
(4)制备纯化腈水解酶冻干粉
第(3)步完成后，按照0.3～0.8％蔗糖溶液∶第(3)步收集的第二次纳滤截留液的体积比为1∶25～50的比例，先将蔗糖溶液加入到第二次纳滤截留液中，搅拌均匀后，再放置于-16～-20℃温度下，预冻3～6小时，接着再放置于冷冻干燥机中，在30～60Pa真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～36小时。
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