KR101868128B1 - 인플루엔자 a rna-의존성 rna 폴리머라제의 저분자 저해제 - Google Patents

Abstract

인플루엔자 A 바이러스의 치료 및 예방에 특히 효과적인 항바이러스성 조성물 및 방법이 고려된다. 또한 항바이러스성 특성을 갖는 저분자 화합물을 동정하는, 특히 다른 인플루엔자 A 구성성분에 독립적인 포유동물 세포에서의 인플루엔자 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 활성을 검출하는 것과 관련된 것으로서의 세포 분석이 공개된다. 바람직한 분석은 정상적인 세포 활성에 지장을 주지 않는 바이러스 증식 저해제를 식별하도록 한다.

Description

인플루엔자 A RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 저분자 저해제{SMALL MOLECULE INHIBITORS OF INFLUENZA A RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE}

본 발명의 분야는 항바이러스 화합물 및 조성물이다.

인플루엔자 A 바이러스는 (-)-센스 RNA 바이러스의 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae) 바이러스 패밀리의 구성원이다. 인플루엔자 A 바이러스 게놈은 11개 단백질을 인코딩하는 8개 단편(segment) 또는 염색체로 구성된다. 감염이 일어나는 동안, 바이러스-인코딩된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RdRP)는 (-)-나선 RNA를 (+)-나선 전령(messenger) RNA 및 게놈 복제를 위한 주형으로서의 역할을 하는 전장 상보적 게놈 RNA (또는 cRNA) 세트로 전환시킨다. (+) 나선 전령 RNA로부터 발현된 바이러스 단백질은 감염을 일으키거나 또는 바이러스 복제, 증폭을 끝내는 과정, 조립, 및 상기 감염 주기를 반복하는 개시적 8개 (-) 나선 염색체를 함유하는 바이러스 입자(particle)의 방출을 촉진시키는 일을 수행한다.

인플루엔자 A 게놈의 전사 및 복제와 관련된 과정은 수십년간 조사 중에 있다. 모든 인플루엔자 A 계열(계절성 H1N1, "돼지" H1N1, H3N2, 및 "조류" H5N1를 포함)의 모든 8개 염색체는 별개로 특이적인 단백질을 인코딩하는 서열의 단백질-코딩 부분 옆에 배치되는 동일한 5' 및 거의 동일한 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 실험적 결과는 상기 UTR이 프로모터 요소로서 RdRP에 의해서 인식된다는 것과 두 구성성분 모두 바이러스 유전자 발현 및 복제에 중요하다는 것을 증명한다. 따라서, 상기 바이러스 폴리머라제 및 이것의 관련된 UTR RNA 리간드는 바이러스 생존 주기를 제어하는 것으로 생각되고 치료적 조정을 위해 중요한 표적이다.

바이러스 복제에 대한 그러한 상대적으로 상세한 지식에도 불구하고, 최근에 존재하면서 임상적으로 입증된 항-인플루엔자 A 치료적 분자는 바이러스 코팅 단백질인 뉴라미니다제(Neuraminidase; NA) 및 매트릭스 2(M2)의 두 표적 분류 중 하나를 저해하는 저분자로 제한된다. NA는 비리온 및 숙주 세포 수용체 단백질로부터 말단 시알산 잔기를 잘라버리는 글리코시드 가수분해 효소 (또한 시알리다제로 알려진 것으로서, N- 또는 O-연결된 뉴라민산은 총괄적으로 시알산이라 불림)의 넓은 분류에 속한다. 인플루엔자 A 감염이 일어나는 동안, NA 활성은 기도의 점액 분비를 통한 바이러스 수송에 관여할 뿐만 아니라 복제 부위인 감염된 세포로부터 분비된 바이러스의 생화학적 분리/방출에 관여하여 근처의 건강한 세포를 감염시킬 수 있다. 최근에, 오셀타미비르 (상품명 타미플루®) 및 자나미비르 (상품명 레렌자®)는 NA의 저해를 통해 인플루엔자 감염의 치료를 위한 두 가지 임상적으로 입증된 약제인 반면, 라니나미비르 (이나비르) 및 페라미비르는 최근에 차세대 인플루엔자 NA 저해제로서 임상시험의 후기 단계에 있다.

NA와 달리, 인플루엔자 M2는 바이러스 구조적 단백질인, 매트릭스 (또는 M)을 인코딩하는 mRNA의 대체적인 스플라이싱에 의해서 생산된다. 감염에서 가장 매우 풍부한 바이러스 단백질 중 하나이면서 바이러스 코팅 단백질 및 리보뉴클레오단백질 입자가 결합하는 스캐폴드로서 역할을 하는 M과 반대로, M2는 비리온에 극미한 양으로 존재하고 복제에서 중요한 단계인 바이러스성 탈각(uncoating) 및 엔도솜적 구획으로부터 세포적 세포질로의 탈출을 가능하게 하는 이온 채널로서 역할을 한다. M2의 임상적으로 입증된 저해제는 아만타딘 (상품명 심메트렐®) 및 리만타딘 (상품명 플루마딘®)을 포함한다.

NA 및 M2 저해제는 인플루엔자 바이러스 감염 주기에서 결정적인 단계의 저분자 저해제 컨셉의 성공적인 증거이다. 그러나 이들의 초기 성공에도 불구하고, 약물 내성을 보이는 바이러스 변이체의 등장으로 인해 NA 및 M2 저해제 둘 모두를 사용하여 인플루엔자 감염을 치료하는데 최근 도전에 부딪쳤다. 예를 들어, 타미플루에 대한 바이러스 내성의 증거는 2009 유행병⁵, H3N2⁶, H5N1⁷, 및 2008년에 내성이 순환하는 단리체의 99.6%에 존재했던 계절적 H1N1⁸를 포함하여 수많은 임상적으로 관련된 인플루엔자 A 단리체에서 보고되었다. 자나미비르에 대한 인플루엔자 A 내성이 아직 보고되지 않아야 함에도 불구하고, 이 제제에 내성인 인플루엔자 B 바이러스 단리체의 보고⁹는 인플루엔자 감염을 치료하는데 광범위하게 사용하는 경우 이 약물에 대한 내성이 보다 만연한 장래 가능성을 나타낼 수 있으나, 이 연구에서 설명된 상기 내성 바이러스가 상기 가능성을 상당히 줄이는 HA 단백질에서 추가적인 보상적 돌연변이를 얻었다. M2 저해제에 관하여, 질병 통제 예방 센터는 2009년 가을 동안 거의 모든 순환적 H3N2 및 유행성 H1N1 바이러스 단리체가 아만타딘에 대해 내성이라는 것을 보여주었다¹⁰.

불행하게도, 감시적 노력은 듀얼 오셀타미비르/아다만탄 저항 단리체¹¹의 최근 등장을 확인하였는데, 이는 또한 다른 중요한 바이러스 표적을 표적하는 추가적인 저분자 저해제의 발견 및 활용의 필요성을 나타낸다. 따라서, 치료 내성 바이러스 변이체를 덜 생산할 것으로 보이는 새롭거나 및/또는 개선된 항 바이러스제를 제공할 필요성이 여전히 있다. 특히, 바이러스 복제, 및 특히 RNA-바이러스 복제에 요구되는 필수적이고 보존적인 구조를 표적하는 약물 또는 약물 조성물을 갖는 것이 바람직할 것이다.

본 발명자들은 인플루엔자 A의 감염적 생존 주기를 방해하고, 바이러스 복제를 가장 방해할 것 같은 다양한 조성물 및 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 또한 바이러스 감염 (및 특히 RNA 바이러스에 의한 바이러스 감염)의 치료를 위한 그러한 화합물의 용도 및/또는 바이러스 감염 (및 특히 RNA 바이러스에 의한 바이러스 감염)을 치료하는 약물의 제조를 위한 그러한 화합물의 용도를 고려한다.

본 발명의 일 양상에서, 선택된 화합물은 항바이러스 특성을 제공한다. 특히 바람직한 화합물 (A0435)은 두 가지 상이한 혈청형(serotype)의 바이러스를 대표하는 세 가지 상이한 인플루엔자 A 계열을 활용하는 인 비트로 바이러스성 증식 시스템에서 평가되었고, 저 μM 농도에서 모든 세가지 바이러스를 저해하여 숙주 세포가 바이러스-유도된 세포변성(cytopathic) 효과 (CPE)를 보이는 것을 방지하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과에 일치하여, 특정 화합물, 특히 A0435는 또한 인플루엔자 A의 생감염 (live infection) 포유동물 모델에서 항바이러스 활성을 보여주었다.

예를 들어, 본 발명에서 검토되는 화합물은 화학식 I에 따른 구조를 가질 것이다.

[화학식 I]

상기 식에서,

X 및 Y는 독립적으로 O, S, 또는 NR이고,

R, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 저급 알킬, 선택적으로 치환된 저급 알케닐, 또는 NR1R2, OH, 또는 할로겐이고;

Q는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.

특히 바람직한 화합물에서, 상기 식에서 X 및 Y는 산소이거나, 및/또는 R1 및 R2는 독립적으로 에틸, 메틸, 또는 트리플루오로메틸이거나, 및/또는 R1 및 R2는 독립적으로 에틸, 메틸, 또는 트리플루오로메틸이거나, 및/또는 R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나, 및/또는 R5는 저급 알킬이거나, 및/또는 Q는 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 피리디닐이다.

다른 예에서, 본 발명에서 검토되는 화합물은 또한 화학식 II에 따른 구조를 가질 수 있다.

[화학식 II]

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 할로겐 또는 알콕시기이고;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이거나, 또는 함께 5- 또는 6-원 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고;

R₅는 H, 치환된 포화 알킬, 또는 저급 지방족 단편에 의해 -NH-에 연결된 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;

X는 독립적으로 C, CH, 또는 헤테로원소이다.

특히 바람직한 화합물은 상기 식에서, R₂는 F 또는 Cl이거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 독립적으로 에톡시, 메톡시, 또는 트리플루오로메톡시이거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 함께 5-원 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 함께 6-원 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하거나, 및/또는 R₅는 페닐에 의해서 선택적으로 치환된, 저급 알킬 또는 치환된 피리디닐이거나, 및/또는 R₅는 H인 것을 포함한다.

게다가, 본 발명자들은 또한 항바이러스 특성을 갖는 저분자 화합물을 동정하는 세포 분석을 위한 구성성분 및 방법을 발견하였다. 특히 바람직한 양상에서, 상기 분석은 다른 인플루엔자 A 구성성분에 독립적인 포유동물 세포에서 인플루엔자 A RNA-의존적 RNA 폴리머라제 활성을 검출할 수 있도록 하고, 정상적인 세포 활성에 지장을 주지 않는 바이러스성 증식 저해제를 동정할 수 있도록 한다.

본 발명의 다양한 대상, 특징, 양상 및 이점은 본 발명의 바람직한 구체예의 하기의 상세한 설명으로부터 보다 명확해질 것이다.

RdRP-기반 리포터 시스템을 활용하는 새로이 개발된 극-민감성 세포 기반 분석에 기반하여, 몇가지 화합물(예를 들어, A0435 및 A0439)가 명백히 보존된 바이러스 표적(특히 바이러스성 증식 및/또는 유전자 발현 기관)에 대하여 상당히 항-바이러스 활성을 갖는 것으로 발견되었다.

세포 기반 분석 시스템을 이용하여 RdRP 활성의 신규한 저분자 저해제의 고출력 동정을 할 수 있도록, 본 발명자들은 인플루엔자 RdRP 서브유닛 단백질(PB2, PB1, 및 PA 및 부수적인 NP 단백질) 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한 리포터 RNA를 코딩하는 구조물의 판넬을 생성하였고, 전형적인 분석 시스템은 도 1에 도식적으로 기재되어 있다. 상기 리포터 RNA를 인코딩하는 구조물은 마우스 RNA 폴리머라제 I 프로모터 발현 카세트를 활용하여 적당한 바이러스성 RNA 도메인 옆에 배치된 반딧불 루시퍼라제를 인코딩하는 안티-센스 RNA의 전사를 유도하도록 디자인되었다. 이 구조물들의 마우스 B16-F10 세포로의 형질주입은 모든 다섯개 플라스미드(예를 들어, PA, PB1, PB2, NP, 및 RNA 폴리머라제 I-유래 루시퍼라제 RNA 구조물을 인코딩하는)로 형질도입된 세포에서의 강력한 신호를 보여주었으나, 도 2에서 설명된 바와 같이 이 구성성분 중 임의의 하나가 제거될 때나 UTR-기반 프로모터 요소가 없는 리포터 RNA의 존재에서 발현이 검출되지 않았다. 인간 발현 카세트 및 상이한 바이러스 혈청형을 이용한 동일한 접근은 이전에 보고된바 있다².

특히 바람직한 변형에서, 여섯개의 구조물은 바이러스성 비-구조적 1 (NS1) 단백질의 발현을 유도하는데 동시적으로 포함된다. NS1 및 NS2는 상기 인플루엔자 A 바이러스의 8개 단편에 의해 인코딩되는 상호적(alternate) mRNA 스플라이스 아형(isoform)이다. NS1은 바이러스 RNA 합성의 조절을 포함하고 바이러스 단백질 번역³을 증가시키는 바이러스 감염이 일어나는 동안 광범위한 다양한 기능을 수행하는 반면 NS2는 숙주 세포 핵으로부터 바이러스 RNA 방출(export)에 중요하다⁴. 본 발명자들은 NS1의 발현이 운동학적 연구에서 상기 시스템의 배경 "노이즈"를 변경하지 않고 대략 10배의 신호적 세기의 증폭을 유발한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 잠재적 저해제의 첨가에 대한 바람직한 기대 시간이 검출가능한 리포터 활성의 등장 전에 형질주입 DNA/리포솜 복합체 (또는 "리포플렉스")의 제거 후 첫번째 6시간 내에 있다는 것을 발견하였다. 민감도에서의 증가를 설명하는 예시적 데이터가 도 3으로 보여진다.

물론, 본 발명은 도면 및 하기의 설명에 보여지는 바와 같은 특이적인 구성요소에 제한될 필요는 없으나 하나 이상의 변형된 핵산을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 RdRP 서브유닛 단백질은 상이한 바이러스로부터일 수 있거나, 및/또는 약물 내성 돌연변이 계열을 반영하거나 또는 다양한 추가의 이점을 부여하기 위해 변형될 수 있다. 유사하게, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라제에 제한될 필요는 없으나, 임의의 다른 리포터 유전자 또는 시스템일 수 있다. 따라서, 상기 신호는 최적의 신호 (발광, 형광, 퀸칭(quenching) 등), 화학적으로 인식가능한 신호 (예를 들어, 프로테아제 활성 또는 항원 생성을 통함), 및/또는 생물학적 신호 (예를 들어, 세포 사멸, 또는 표현형 변화)로서 생성될 수 있다. 유사하게, 상기 핵산은 형질주입을 위한 하나의 핵산에 적어도 부분적으로 통합될 수 있거나, 또는 세포가 상기 RdRP 서브유닛 단백질을 발현시키기 위해 일시적이거나 영구적으로 형질주입(세포주 또는 트란스유전자로서)될 수 있다.

특정 구성에 관계없이, 생물학적 스크린으로서, 그러한 분석 시스템을 사용하여 크고 다양한 화학적 라이브러리가 용이하게 얻어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 동시적인 카운터 스크린으로서, 본 발명자들은 특이적으로 바이러스 RdRP를 저해하는 화합물과 포유동물 유전자 전사를 비특이적으로 저해하거나 및/또는 어떤 결과든 바람직하지 않은 하류 독성의 지시일 수 있는 인간 세포에서의 일반적인 세포 사멸 경로를 대안적으로 활성화시키는 화합물을 동정하기 위해 세포 사멸-활성화된 리포터 구조물을 활용하여 분리된 리포터 시스템에서 상기 동일한 스크린된 시료를 평가하였다.

이러한 분석 및 검색 조건을 이용하여, 본 발명자들은 그 중에서도 저분자 A0435를 확인하였다 (도 4a, b 참조). 상기 분석 시스템 상에서의 A0435의 용량 적정 연구는 약 3μM의 50% 저해 농도(IC50)를 증명하였고, 상기 카운터-스크린 분석에 의해 제공된 연속적인 유전자 발현의 정도상에 눈에 띄는 저해적 영향이 없었다 (도 4c 참조). 두번째로, 구조적으로 유사한 화합물인 A0439가 또한 리포터 분석에서 테스트되었고 비록 IC50이 약 5μM지만 (도 5 a, b 참조) 상기 리포터 시스템의 유사한 저해를 보이는 것으로 보였고 침전 때문에 더 높은 용량에서 독성이 증가되었다.

물론 피라졸로피리미딘(또는 하기의 표 1에서 보여지는 바와 같은 유사한 구조)을 포함하는 스캐폴드를 갖는 수많은 다른 화합물이 또한 적절해 보였고, 그러한 스캐폴트는 하기에 설명된 바와 같은 다양한 치환기를 포함할 것이 이해될 것이다. 가장 바람직하게는, 특히 화합물 A0435 및 A439에 대해, 피라졸로피리미딘 코어 (또는 대안적인 스캐폴드)가 알콕시아릴 또는 디알콕시아릴 모이어티를 포함할 것이고, 이는 추가로 선택적으로 치환될 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 화합물에서, 하나 이상의 산소 원자는 또한 일차, 이차, 또는 삼차 아민, 또는 황 또는 셀레늄 원자로 대체될 수 있다. 보다 전형적으로, 상기 아릴은 페닐 또는 헤테로아릴 (바람직하게는 질소 헤테로원소)이다. 이처럼, 상기 에틸피리딘 모이어티는 임의의 알킬헤테로아릴 또는 알킬아릴으로 대체될 수 있고, 상기 피라졸로피리미딘 코어에서의 알킬 모이어티 중 하나 또는 둘 모두는 치환된 알킬, 헤테로아릴로 대체될 수 있고, 또는 상기 두개의 알킬기가 고리를 형성할 수 있다. 그러나 현저하게는 상기 스캐폴드에서의 몇몇 위치는 저해 활성에서 수반되는 손실 또는 상당한 감소 없이 변형되지 않을 수 있거나 및/또는 표 1에 나열된 화합물로부터 쉽게 알 수 있는 바와 같이 독성이 증가될 수 있다.

예를 들어, 적절한 대안적인 화합물은 화학식 I에 따른 구조를 가질 것이다.

[화학식 I]

상기 식에서,

X 및 Y는 독립적으로 O, S, 또는 NR이고,

R, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 저급 알킬, 선택적으로 치환된 저급 알케닐, 또는 NR1R2, OH, 또는 할로겐이고;

Q는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 검토되는 화합물에서 X 및 Y는 산소이거나, 및/또는 R1 및 R2는 독립적으로 에틸, 메틸, 또는 트리플루오로메틸이다. R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬, 및 특히 각각 메틸 및 에틸인 것이 더 일반적으로 바람직하다. 훨씬 더 바람직한 양상에서 R5는 저급 알킬 (및 특히 에틸)이거나, 및/또는 Q는 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 피리디닐이다. 특히 바람직한 화합물은 하기에 추가로 보여지는 바와 같이 A0435 및 A0439를 포함한다.

마찬가지로, 하기에 더 상세한 바와 같이, 추가적으로 본 발명에서 검토되는 화합물은 또한 화학식 II에 따른 구조를 가질 수 있다.

[화학식 II]

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 할로겐 또는 알콕시기이고;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이거나, 또는 함께 5- 또는 6-원 시클로알킬 또는 헤테로 시클릭고리를 형성하고;

R₅는 H, 치환된 포화 알킬, 또는 저급 지방족 단편에 의해 -NH-에 연결된 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤티로아릴이고;

X는 독립적으로 C, CH, 또는 헤테로원소이다.

특히 바람직한 화합물은 R₂는 F 또는 Cl이거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 독립적으로 에톡시, 메톡시 또는 트리플루오로메톡시이거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 함께 5-원 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하거나, 및/또는 R₁ 및 R₂는 함께 6-원 시클로알킬 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하거나, 및/또는 R₅는 페닐에 의해서 선택적으로 치환된, 저급 알킬 또는 치환된 피리디닐이거나, 및/또는 R₅는 H인 것을 포함한다.

인 비트로에서 A0435 및 A0439의 상기 항바이러스성 잠재력을 추가로 평가하기 위해, 살아있는(live) MDCK-개조된 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 바이러스의 추가 전 1시간 동안 지시된 농도의 화합물과 함께 MDCK 세포를 프리-인큐베이션하였다. 18 내지 20시간 인큐베이션 후, 상등액을 수집하여 닭 적혈구 세포 헤마글루틴화 분석을 이용하여 성공적인 바이러스성 복제를 나타내는 바이러스성 헤마글루티닌 활성의 존재를 평가하였다. 이러한 타입의 분석에서, 헤마글루티닌 활성은 U-모양 웰의 바닥 상에 침전된 적혈구 세포에 의해서 형성된 특징적인 붉은색 "버튼(button)"의 부재를 발생시킨다. 흥미롭게도, A0435는 >4 μM 농도에서 상당한 항바이러스성 활성을 보여준 반면, A0435는 도 6 a,b로 부터 볼 수 있는 바와 같이 상기 논의된 형질주입 저해 실험에서 관찰된 값과 일치하여 >7.5 μM에서 동일한 활성을 보였다. 상기 A0435의 관찰된 항바이러스성 활성이 다른 바이러스 단리체/혈청형으로 확장시킬지 결정하기 위하여 유사한 인비트로 감염 실험을 수행하자, 인플루엔자 A/WS/1933 (H1N1) 및 H3N2 혈청형 A/Aichi/2/68 바이러스를 이용시, 이들이 A0435에 의해 또한 유의하게 저해되었으며, 그 결과를 도 7 a 및 b로 나타내었다. 약물 개발에 동등하게 중요한 것으로서, 도 8 a, b 및 c로부터 알 수 있는 바와 같이 살아있는 바이러스에 감염된 세포는 인플루엔자 A 감염의 특징인 세포 변성 효과의 흔적을 거의 보이지 않았다. 이러한 결과와 일치하여, 본 발명자들은 도 9 a 및 b에서 알 수 있는 바와 같이 넓은 범위의 농도에 걸쳐 A0435가 간-유래의 HepG2 세포 및 일차성 근위 세뇨관 상피 세포 (또는 RPTEC)에 의해서 제공되는 것과 같은 독성의 전통적인 세포 모델에서 내성이 좋은 것을 발견하였다.

이러한 결과에 힘입어, 본 발명자들은 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34의 치사량 50%의 두 배 (2×LD50)로 감염된 동물에서 생감염(live infection)과 싸우는 A0435의 항바이러스 효능을 측정하는 연구를 개시하였다. 도 10에서 보여지는 바와 같이, 3.17 mg/kg 투여용법 그룹에서 감염 후 7일 째에 3/5의 동물이 생존하였고, 1 mg/kg 용량에서 2/5의 동물이 생존하였고, 담체(1xPBS, 3% W/V 마우스 혈청 알부민)만 주사한 경우 0/5의 동물이 생존하였다.

결과적으로, 본 발명에서 검토되는 화합물은 도 1에서 예시적으로 보여지는 바와 같이 저해 분석에서 확인할 수 있는 모든 것들을 포함한다. 더 바람직하게는, 그러한 화합물이 10 μM 이하, 보다 더 바람직하게는 1 μM 이하, 가장 바람직하게는 100 nM 이하의 IC50을 가질 것이고, 상기에 측정된 바와 같이 그 IC50에서 명백한 독성을 갖지 않을 것이다. 따라서, 본 발명에서 검토되는 화합물을 확인하는 방법은 도 1의 분석 시스템이 저해적 화합물에 대한 화합물 라이브러리를 스크린하기 위해 채용되는 단계를 포함할 것이다. 후보 화합물 (전형적으로 10 μM 이하의 IC50을 가짐)이 확인되면, 그러한 화합물은 SAR을 알아내어 더 높은 효능, 감소된 독성, 및/또는 증가된 생체이용률을 갖는 화합물을 생산하기 위해 추가로 변형된다.

게다가 본 명세서에서 고려된 화합물은 전구약물로서 제조될 수 있는 것을 상기해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "전구약물(prodrug)"은 본 발명에서 고려된 화합물의 변형을 의미하고, 상기 변형된 화합물은 (상기 변형된 화합물과 비교하여) 더 적은 약리 활성을 보이며, 상기 변형된 화합물은 표적 세포 (예를 들어, B-세포) 또는 표적 기관/해부학적 구조 (예를 들어, 관절) 내에서 상기 변형된 형태로 되돌아가도록 전환된다. 예를 들어, 상기 활성 약물이 안전상 전신 투여하기에 너무 독성일 경우, 또는 상기 검토되는 화합물이 소화관 또는 다른 구획 또는 세포에 의해 저조하게 흡수될 때, 또는 표적에 도달하기 전에 신체에서 상기 검토되는 화합물이 분해될 때 고려된 약물을 전구약물로 전환하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 화합물은 수많은 방식으로 변형될 수 있고, 특히 바람직한 변형은 하나 이상의 약동학적 및/또는 약력학적 파라미터를 개선시키는 것을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 치환기가 혈청에서 더 높은 AUC를 달성하기 위해 첨가되거나 대체될 수 있다.

반면에, 증가된 용해도가 바람직한 경우 친수성기가 첨가될 수 있다. 추가로, 본 발명에서 검토되는 화합물이 가수분해 될 수 있는 (또는 그 반대로 절단되거나) 하나 이상의 결합을 함유하는 경우, 반응 생성물이 또한 특별히 고려될 수 있다. 본 발명에서 검토되는 화합물이 해당 전구약물 형태로의 전환에 대한 예시적인 적절한 프로토콜을 본 명세서에 참조로서 통합된 Kenneth B. Sloan (ISBN: 0824786297)에 의한 "Prodrugs (Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs)" 및 Bernard Testa, Joachim M. Mayer (ISBN: 390639025X)에 의한 "Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry, and Enzymology"에서 찾을 수 있다. 게다가, 특히 본 발명에서 검토되는 화합물이 상기 화합물이 대사될 때 (예를 들어, 가수분해, 수화, 글루쿠로닌화 등) 더 높은 활성을 가지는 경우, 검토되는 화합물의 대사체가 특별히 본 명세서에서 또한 고려될 것을 이해할 것이다.

추가적으로, 본 발명에서 검토되는 화합물이 하나 이상의 다른 약학적으로 활성인 성분과 함께 조합될 수 있고 (인 비보 또는 약제학적 제형 또는 투여 용법), 특히 고려된 다른 성분은 다양한 항바이러스제 (및 특히 바이러스 복제, 세포 도입, 및/또는 바이러스성 단백질 조립을 저해하거나 감소시키는 것들), 다양한 면역조절제 (및 특히 다양한 인터페론으로서 예를 들어, 타입 I, 타입 II, 및/또는 타입 III), 및/또는 항-염증제 (예를 들어, 스테로이드 및 NSAIDS) 등을 포함할 것으로 생각된다. 두번째 약학적으로 활성인 성분의 농도는 전형적으로 단독(stand-alone) 투여로 추천되는 용량이거나 바람직하게는 그 이하이나, 더 높은 농도가 또한 본 명세서의 용도로 적절할 것으로 보인다.

따라서, 본 발명에서 고려되는 약학 조성물은 특히 본 발명에서 검토되는 화합물 (및 추가적인 약학적으로 활성인 성분)이 적절한 담체와 함께 제공되는 것을 포함할 것이고, 바람직하게는 상기 검토되는 화합물은 유기체 및/또는 표적 기관에서의 바이러스성 증식을 바이러스 감염에 관련된 질병의 징후 또는 증상을 감소시키고 보다 바람직하게는 치료하는데 효과적인 정도로 감소시키는데 효과적인 농도에서 존재한다. 상이한 관점에서 보면, 고려된 화합물은 바이러스 감염, 및 특히 RNA 바이러스 (및 구체적으로 인플루엔자 바이러스)에 의한 바이러스 감염을 치료하는데 효과적인 양으로 조성물 중에 존재한다.

예를 들어, 본 발명에서 검토되는 화합물(및 특히 A0435/A043)로의 치료를 위해 적절한 바이러스 감염은 RNA 바이러스(및 특히 음성 나선 RNA 바이러스), 및 구체적으로는 인플루엔자 A에 가장 가까이 닮은 바이러스에 의한 감염에 의해서 생산되는 것이다. 따라서, 고려되는 바이러스는 인플루엔자 B (A0435에 의해서 저해될 수 있는 바와 같이 본 발명자들에 의해서 확인됨), 및 인플루엔자 C를 포함한다. 본 발명에서 검토되는 화합물에 의한 치료에 적합한 계통발생학적으로 관련된 추가적인 바이러스는 파라믹소바이러스과 [뉴캐슬병 바이러스; 헨드라 바이러스; 니파 바이러스; 우역(rinderpest) 바이러스; 센다이 바이러스; 소 파라인플루엔자 바이러스 3; 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3; 홍역 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스 2, 4a, 및 4b; 메타뉴모바이러스; 호흡기 합포체성(syncytial) 바이러스를 포함], 랍도바이러스과 [포유동일 감염성 수포성 구내염 바이러스 및 광견병 바이러스; 식물 감염성인 스트로우베리 주름 시토랍도바이러스, 상추 괴저성 황색 바이러스, 시노돈 백화 줄무늬 바이러스, 옥수수(Maize) 모자이크 바이러스, 노던 시리얼 모자이크 바이러스, 난초 반점(fleck) 바이러스, 쌀 황색 얼룩 바이러스, 방가지똥(sonchus) 황색 네트 바이러스 및 타로 맥 백화 바이러스; 물고기 감염성인 히람 랍도바이러스, 감염성 조혈성 괴사 바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 가물치 바이러스 뿐만 아니라 소 임시열 바이러스 및 애들레이드 리버 바이러스를 포함]; 필로바이러스과 [출혈성 에볼라바이러스 및 마르부르크 바이러스를 포함] 및 보르나바이러스를 포함한다. 본 발명자들은 이러한 바이러스를 서포트할 실질적인 데이터를 갖고 있지 않으나, RSV-기반 발현 시스템이 이러한 바이러스의 적절성을 결정짓는데 사용될 수 있고, 그러한 시스템은 과도한 실험 없이 PHOSITA에 의해서 만들어질 수 있다는 것을 상기해야 한다.

따라서 구체적인 용도 및 구조에 의존하여, 본 발명에 따른 상기 화합물이 단일 용량 당 1 마이크로그램 내지 1000밀리그램, 보다 전형적으로 10 마이크로그램 내지 500 밀리그램, 및 가장 전형적으로는 50 마이크로그램 내지 500 밀리그램의 양으로 상기 조성물 중에 존재하는 것이 이해될 것이다. 따라서, 인 비보 또는 인 비트로에서 검토되는 화합물의 바람직한 농도는 일반적으로 0.1 nM 내지 500 μM, 보다 전형적으로는 50 nM 내지 400 μM, 및 가장 전형적으로는 100 nM 내지 200 μM일 것이다.

게다가, 모든 제형이 본 명세서의 용도에 적절할 것으로 보이고 특히 경구 또는 비경구 제형을 포함한다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 경구 투여를 위해, 고려되는 조성물은 정제, 캡슐, 현탁액, 또는 액체의 형태일 수 있다. 상기 약학 조성물은 바람직하게는 특정 양의 활성 성분을 함유하는 투여용법 단위의 형태로 만들어진다. 그러한 투여용법 단위의 예는 정제 또는 캡슐이다. 상기 활성인 성분은 또한 조성물로서 주사함으로써 투여될 수 있는데, 예를 들어 염수(saline), 덱스트로스 또는 물이 적절한 담체로서 이용될 수 있다. 특히 바람직한 양상에서, 상기 제형은 국소 투여, 에어로졸을 통한 투여, 및 척수관 투여에 적절할 것이 이해될 것이다. 결과적으로, 특히 바람직한 제형은 국소적 스프레이 또는 적가(drop) 투여 또는 틴크로서의 적용을 위한 불활성 수성 용액이다. 대체적으로, 적절한 국소 제형은 크림, 연고, 폼, 로션, 일루션 등을 포함한다. 게다가, 상기 화합물이 척수관 투여(예를 들어, 척수 외상의 치료에서)를 위해 제형화되는 경우, 상기 화합물이 주사가능한 용액, 현탁액 또는 일루션으로서 제조되는 것이 바람직하다. 다른 고려되는 제형에서, 본 발명에서 검토되는 화합물은 에어로졸 전달을 위해 제형화 (예를 들어, 미분화, 분산가능한 담체상에 코팅, 세분화된 용매에 용해 등)될 수 있다.

상기 특정 제형 및 담체는 화합물의 특이적인 용도 및 타입에 적어도 부분적으로 의존할 것이 이해될 것이다. 당업계에 알려진 다양한 방식의 약물 제형이 있고, 이들 모두 본 명세서의 용도에 적절할 것으로 보인다 (예를 들어, Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form by Mark Gibson; Informa HealthCare, ISBN: 1574911201; or Advanced Drug Formulation Design to Optimize Therapeutic Outcomes by Robert O. Williams, David R. Taft, and Jason T. McConville; Informa HealthCare; ISBN: 1420043870 참조).

본 발명의 화합물 및/또는 조성물로 질병 증세를 치료하기 위해 투여된 치료적으로 활성인 화합물의 양 및 용법은 연령, 몸무게, 성별 및 개체의 의학적 상태, 질병의 심각성, 투여 경로 및 빈도, 및 채용된 특정 화합물을 포함한 다양한 인자에 의존하므로, 매우 다양할 수 있다. 그러나, 특히 적절한 양은 상기에 제공되어 있고, 따라서 약 0.001 (심지어 그 이하) 내지 100 mg/kg 몸무게, 바람직하게는 약 0.01 및 약 50 mg/kg 몸무게 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg 몸무게의 하루 용량이 허용될 수 있다. 전형적으로, 하루 용량은 하루에 1회 내지 4회 용량으로 투여될 수 있다.

치료 또는 예방 목적으로, 본 발명에서 검토되는 화합물은 일반적으로 지시된 투여경로에 적당한 하나 이상의 부형제와 조합된다. 경구로 투여되는 경우, 상기 화합물은 락토스, 수크로스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 알킬 에스테르, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 옥시드, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 젤라틴, 아카시아검, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 및/또는 폴리비닐 알코올과 함께 혼합되어 편리한 투여를 위해 정제 또는 캡슐화될 수 있다. 그러한 캡슐 또는 정제는 히드록시프로필-메틸 셀루로스 중에 활성 화합물의 분산으로 제공되는 바와 같이 제어된-방출형 제제를 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 수성 또는 비수성 등장 멸균 주사 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 용액 및 현탁액은 경구 투여를 위한 제형으로의 용도를 위해 언급된 하나 이상의 담체 또는 희석제를 갖는 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조될 수 있다. 상기 화합물은 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 콩유, 면실유, 피넛오일, 참기름, 벤질 알코올, 염화나트륨 및/또는 다양한 완충액 중에 용해될 수 있다. 다른 부형제 및 투여 방식이 약제학 분야에 광범위하게 잘 알려져 있다.

도 1은 인플루엔자 A 리포터 분석 구조물의 도시한 것이다.
도 2는 루시퍼라제 분석에서 구성성분의 요건을 나타내는 그래프이다.
도 3은 루시퍼라제 분석에서 발현의 증대에 대한 예시적 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 4A는 예시적 화합물에 의한 리포터 시스템의 특이적인 저해를 보여주는 고출력 스크린으로부터의 미가공 데이터의 도시한 것이고, 도 4B는 상기 예시적 화합물의 구조를 나타내고, 도 4C는 상기 예시적 화합물에 대한 상기 리포터 시스템의 용량 반응을 설명하는 그래프이다.
도 5A는 다른 예시적 화합물의 구조를 설명하고, 도 5B는 도 5A의 상기 예시적 화합에 대한 리포터 시스템의 용량 반응을 설명하는 그래프이다.
도 6A는 예시적 화합물을 이용한 헤마글루틴화 분석의 사진이고, 도 6B는 상기 동일한 분석에서의 상기 예시적 화합물에 대한 용량 반응을 설명하는 사진이다.
도 7A 및 7B는 예시적 화합물을 사용한 선택된 세포에서의 바이러스성 증식의 저해를 설명하는 사진이다.
도 8A 내지 8C는 예시적 화합물에 의한 선택된 세포에서의 세포 변성 효과의 저해를 설명하는 사진이다.
도 9A 및 9B는 예시적 화합물을 이용하여 선택된 세포에서의 세포독성 활성을 설명하는 사진이다.
도 10은 예시적 화합물을 이용하여 생감염에 따른 생존에서의 증가를 설명하는 사진이다.

물질 및 방법

세포 기반 리포터 분석: RdRP의 저해를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 생물학에 기반된 마우스 세포-기반 분석 시스템을 변경하였다. 이 시스템을 생성시키기 위하여, PA, PB1, PB2, NP, 및 NS1을 인코딩하는 바이러스 유전자를 유전자-특이적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34 바이러스 cDNA 주형의 리버스 전사효소-폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR)에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 순차적으로 RNA 폴리머라제 II 발현 카세트를 활용하여 포유동물 발현 벡터 (pVAX)로 클로닝하고, 상기 삽입물의 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. RNA 폴리머라제 I-의존성 발현 카세트를 생성시키기 위해, 마우스 45S rRNA 전사 개시 부위의 상류 255 bp 서열로부터 얻은 RNA 폴리머라제 I 프로모터 서열을 이어서 다중 클로닝 사이트로 연결시키고, 공개된 보고서¹²와 동일한 방식으로 오버랩핑 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의해 생성되고 pBluescript로 클로닝된 33bp 마우스 RNA 폴리머라제 I 말단 서열로 연결시켰다. 그런 다음 pPolI로 불리는 이 구조물을 다중 클로닝 사이트 내로 절단시켜 방향적으로 5'UTR/루시퍼라제/3'UTR로 연결하여 pPolI-Luc를 생성하였다. 상기 pPolI-Luc-DelUTR (즉, UTR이 결실됨) 및 pPolI-GFP (UTR를 가지지만 루시퍼라제 대신 녹색 형광 단백질을 인코딩함) 구조물을 유사한 방식으로 생성하였다.

형질주입을 마우스 B16-F10 흑색종 세포 및 상기 시스템 활성을 확인하기 위하여 제조사의 지침에 따라 시판 형질주입 시약을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 2㎍의 플라스미드 (에를 들어, PA, PB1, PB2, NP, 및 pPolI-Luc를 인코딩하는 각 구조물 400ng)를 대수적으로 분열하는 흑색종 세포에 첨가하기 전에 15㎕ 시약으로 복합체화 시켰다. 형질주입 복합체를 4시간 후에 제거하고 다른 지시가 없으면, 루시퍼라제 활성을 형질주입 후 20시간 째에 분석하였다. NS1을 포함하는 실험은 플라스미드 DNA 총량이 2 ㎍로 고정되어 남아 있으나 여섯개 플라스미드를 필요로 하기 때문에 각 플라스미드의 333ng만이 사용되는 유사한 방식으로 수행하였다.

바이러스 및 인 비트로 바이러스 증식; 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/WSN/1933(H1N1), 및 A/Aichi/2/68(H3N2)을 개의 MDCK 세포에서 증식시켰다. 감염 전날에, MDCK 세포를 10% V/V 태아 소 혈청으로 보충된 Dulbecco 변형 이글 배지 (D-MEM) 중에 플레이팅하고 다음 날에 70 내지 90% 콘플루언스가 되는 농도에서 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션하였다. 감염 당일에, 세포를 완전한 DMEM/7.5% BSA/25mM HEPES/(2ug/mL) TPCK-트립신을 이용하여 3회 세척하고, 바이러스를 희석시켰다.

A0435 저해 연구: B16-F10 형질주입 시스템을 포함하는 연구를 위해, 세포를 DNA/지방 복합체의 제거 후 5시간 동안 회복되도록 하고 지정된 양의 A0435를 첨가하였다. 루시퍼라제 발현을 14시간 후에 결정하였다. 바이러스 증식의 억제를 포함하는 연구를 위하여, 세포는 지정된 양의 A0435를 받았고 30분 후 바이러스 제제를 첨가하고 2시간 동안 감염되도록 한 다음 상기 바이러스 제제를 제거하고 상기 수득된 세포에서 비결합한 바이러스를 씻어내고 상기 배지를 상응하는 양의 A0435로 교체하였다.

헤마글루틴화 분석: 헤마글루틴 분석을 하기와 같이 수행하였다.

요약하여, 첫 감염 18 내지 20시간 후, 상등액을 다른 지시가 없으면 U-바닥 웰에 1:1 비율로 (V/V) 0.50% 닭 적혈구 세포와 함께 인큐베이션하고 반응물을 사진으로 모니터링하였다.

인 비보 생존 연구: 5 Balb/C (연령/성별) 마우스 그룹을 연구 시작 전에 몸무게를 측정하고 3% w/v 마우스 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충 염수 중에 3.17, 1, 또는 0 mg/kg의 용량으로 A0435를 함유하는 제형으로 꼬리 기저에 정맥 주사하였다. 4시간 후, 이 마우스들을 마취하여 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34의 2xLD50으로 비강 감염(challenge)시켰다. 동일한 용량의 A0435를 개시 용량 투여 후 24 시간 및 48시간 째에 투여하고, 동물 몸무게를 매일 모니터링하였다. 생존한 동물은 이들의 개시 몸무게의 70% 이상을 유지하는 것들로 정의하였다.

참고자료

1) Fields Virology 5th edition. Edited by David M Knipe and Peter M Howley, Lippincott-Raven, Philadelphia, USA, 2007.

2) Lutz A, Dyall J, Olivo PD, Pekosz A. Virus-inducible reporter genes as a tool for detecting and quantifying influenza A virus replication. J Virol Methods. 2005 Jun; 126(1-2):13-20.

3) Hale BG, Randall RE, Ortin J, Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. J Gen Virol. 2008 Oct; 89(Pt 10):2359-76.

4) Robb NC, Smith M, Vreede FT, Fodor E. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome. J Gen Virol. 2009 Jun; 90(Pt 6):1398-407.

5) "Update on oseltamivir resistance to influenza H1N1 (2009) viruses". World Health Organization (WHO). December 15, 2010.

6) Kiso M, Mitamura K; Sakaitagawa Y, Shiraishi K, Kawakami C, Kimura K, Hayden F, Sugaya N, Kawaoka Y. (2004). Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. The Lancet 364: 759-765

7) Le M, Kiso M, Someya K, Sakai T, Nguyen H, Nguyen H, Pham D, Ngyen H, Yamada S, Muramoto Y, Horimoto T, Takada A, Goto H, Suzuki T, Suzuki Y, Kawaoka Y. Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus. Nature 2005, 437(7062): 1108

8) Dharan NJ, Infections with oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) virus in the United States. JAMA, 2009. 301(10): p. 1034-41.

9) Gubareva LV, Matrosovich MN, Brenner MK, Bethell RC, Webster RG. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus. J Infect Dis. 1998 Nov; 178(5):1257-62.

10) http://www.cdc.gov/flu/weekly/weeklyarchives2008-2009/weekly35.htm

11) Sheu TG, Fry AM, Garten RJ, Deyde VM, Shwe T, Bullion L, Peebles PJ, Li Y, Klimov AI, Gubareva LV. Dual resistance to adamantanes and oseltamivir among seasonal influenza A(H1N1) viruses: 2008-2010. J Infect Dis. 2011 Jan 1; 203(1):13-7.

12) Neumann G, Zobel A, Hobom G. RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA molecules. Virology. 1994 Jul; 202(1):477-9.

따라서, 인플루엔자 A RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 저분자 저해제의 특이적인 구체예 및 적용을 공개하였다. 그러나 당업계 숙련된 자에게 이미 기재된 것들 외에 더 많은 변형이 본 명세서에 발명적 컨셉을 벗어나지 않고 가능할 것이라는 것이 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상에 의해서만 제한되지 않는다.

Claims (43)

1. 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 화학식 I에 따른 화합물을 포함하는 바이러스 감염 치료용 약학 조성물:
   [화학식 Ⅰ]
   

   

   
   상기 식에서, X 및 Y는 O이고;
   R₃, 및 R₄는 독립적으로 메틸, 또는 에틸이고;
   R₅는 에틸렌이고;
   R₁, 및 R₂는 독립적으로 에틸 또는 메틸이고;
   Q는 페닐 또는 피리디닐이고, 상기 페닐은 메틸로 치환될 수 있고; 및
   상기 화합물을 필요로 하는 환자에 투여될 때 상기 화합물은 상기 환자에서 RNA 바이러스의 바이러스성 증식을 감소시키는데 효과적인 양으로 존재한다.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 Ⅲ의 A0435 또는 하기 화학식 Ⅳ의 A0439인 약학 조성물.
   [화학식 Ⅲ]
   

   

   
   [화학식 Ⅳ]
   

   

   .
9. 청구항 1에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 약학 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로 화학식 II에 따른 화합물을 포함하는 바이러스 감염 치료용 약학 조성물:
    [화학식 II]
    

    

    
    상기 식에서, R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 할로겐, 또는 메톡시이고;
    R₃ 및 R₄는 독립적으로 메틸 또는 에틸이거나, 또는 함께 5- 또는 6-원(membered) 시클로알킬 고리를 형성하고;
    R₅는 에틸렌에 의해 -NH- 에 연결되는 페닐 또는 피리디닐이고; 및
    X는 N이다.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 R₂는 F 또는 Cl인 약학 조성물.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 R₁ 및 R₂는 독립적으로 메톡시인 약학 조성물.
16. 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서, 상기 R₃ 및 R₄는 함께 5-원 시클로알킬 고리를 형성하는 약학 조성물.
17. 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서, 상기 R₃ 및 R₄는 함께 6-원 시클로알킬 고리를 형성하는 약학 조성물.
18. 삭제
19. 삭제
20. 청구항 13에 있어서, 상기 화합물을 필요로 하는 환자에 투여될 때 상기 화합물이 상기 환자에서 바이러스의 바이러스성 증식을 감소시키는데 효과적인 양으로 존재하는 약학 조성물.
21. 청구항 20에 있어서, 상기 바이러스는 RNA 바이러스인 약학 조성물.
22. 청구항 21에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 약학 조성물.
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