CN106232119B - A型流感rna-依赖性rna聚合酶的小分子抑制剂 - Google Patents

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Abstract

考虑在治疗和预防A型流感病毒中尤其有效的抗病毒组合物和方法。还呈现细胞测定以识别具有抗病毒性质的小分子化合物，特别是其涉及独立于其他A型流感成分检测哺乳动物细胞中的A型流感RNA‑依赖性RNA聚合酶活性。优选的测定允许识别不破坏正常细胞活性的病毒复制抑制剂。

Description

A型流感RNA-依赖性RNA聚合酶的小分子抑制剂
发明领域
本发明的领域为抗病毒化合物和组合物。
背景
A型流感病毒为(-)-义RNA病毒的正粘病毒科病毒家族的成员。所述A型流感病毒基因组包含编码11种蛋白的8个节段或染色体1。在感染期间，病毒编码的RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRP)将(-)-链RNA转化成(+)链信使RNA和一组充当用于基因组复制的模板的全长互补基因组RNA(或cRNA)。由(+)链信使RNA表达的病毒蛋白从事建立感染和促进病毒复制的任务，即终止于含有初始8个(-)-链染色体的病毒粒子的扩增、装配和释放的过程，其重复感染周期。
数十年来，与A型流感基因组的转录和复制相关的方法一直处于研究中。每种A型流感毒株(包括季节性H1N1、“猪”H1N1、H3N2和“鸟类”H5N1)的所有八个染色体包含在序列的蛋白编码部分侧面的相同的5’和几乎相同的3’未翻译区域(UTRs)，所述序列的蛋白编码部分否则编码不同的蛋白。实验结果证明UTR通过RdRP识别为启动子元件，且两种组分对病毒基因表达和复制是关键的。因此，认为病毒聚合酶及其同源物UTR RNA配体控制病毒生命周期，且为治疗干预的关键靶标。
尽管有病毒复制的这些相对详细的知识，但是目前存在且临床批准的抗A型流感治疗分子限于抑制病毒外壳蛋白的两个靶标种类之一的小分子：神经氨酸酶(NA)和基质2(M2)。NA属于广泛类型的糖苷水解酶(由于N-或O-连接的神经氨酸统称为唾液酸，因此还称为唾液酸酶)，其将末端唾液酸残基从病毒粒子和宿主细胞受体蛋白裂开。在A型流感感染期间，NA活性涉及到通过呼吸道的粘液分泌物的病毒运送以及分泌性病毒从充当复制位点的感染的细胞生物化学分离/洗脱中，从而使得能够感染附近的健康细胞。当前，奥司他韦(商品名Tamiflu®)和扎那米韦(商品名Relenza®)为用于通过抑制NA治疗流感感染的两种临床批准的药物，而拉尼娜米韦(laninamivir)(Inavir)和帕拉米韦当前作为下一代流感NA抑制剂处于临床试验的后期。
与NA不同，流感M2通过编码病毒结构蛋白、基质(或M)的mRNA的交替剪接产生。与为感染中最高度充足的病毒蛋白之一，且充当病毒外壳蛋白和核糖核蛋白粒子与其结合的支架的M相反，M2在病毒粒子中以微小的量存在且充当离子通道，其使得病毒能够脱壳且从内体室逃逸到细胞的细胞质中，这为复制中的关键步骤。M2的临床批准的抑制剂包括金刚烷胺(商品名Symmetrel®)和金刚烷乙胺(商品名FlμMadine®)。
NA和M2抑制剂充当流感病毒感染周期中关键步骤的成功的概念验证的小分子抑制剂。尽管其早期成功，然而，通过出现呈现抗药性的病毒变异体，NA和M2抑制剂两者的使用最近在治疗流感感染中碰到了挑战。例如，已经有文件证明，在许多临床相关的A型流感分离物，包括2009大流行病5、H3N26、H5N17和季节性H1N18(其中在2008年，抗性存在于99.6%的循环分离物)中，存在病毒对达菲(Tamiflu)的抗性的证据。尽管还有待报道A型流感对扎那米韦的抗性，但是B型流感病毒分离物对这种药物的抗性的报道9可以说明在广泛用于治疗流感感染之后，对这种药物存在未来更多的流行性抗性的可能性，尽管该研究中所述的抗性病毒在HA蛋白中获得另外的代偿性突变，这应当显著降低这种可能性。关于M2抑制剂，疾病控制和预防中心指出在2009年的秋天期间，几乎所有的循环H3N2和大流行性H1N1病毒分离物对金刚烷胺具有抗性10。
令人遗憾地，监视努力还已经识别最近出现的奥司他韦/金刚烷双重抗性分离物11，这指示需要发现和利用靶向其他关键病毒靶标的另外小分子抑制剂。因此，对提供新的和/或改进的抗病毒药物仍存在需要，这些药物较少可能产生治疗抗性的病毒变异体。具体而言，合乎需要的是具有以下的药物或药物组合物：其靶向病毒复制，尤其是RNA-病毒复制所需要的必需和保守的结构。
发明概述
本发明人已经发现干扰A型流感的感染生命周期且最可能干扰病毒复制的各种组合物和方法。因此，发明人还考虑这类化合物用于治疗病毒感染(且尤其是RNA病毒的病毒感染)的用途和/或这类化合物用于制备治疗病毒感染(且尤其是RNA病毒的病毒感染)的药物的用途。
在本发明主题的一方面，提供了具有抗病毒性质的选择的化合物。特别优选的化合物(A0435)在体外病毒传播系统中，利用代表两种不同的病毒血清型的三个不同的A型流感毒株评估，发现在低μM浓度下抑制所有三种病毒，且避免宿主细胞显示病毒诱导的细胞病变效应(CPE)。与这些结果一致，某些化合物，且尤其是A0435，还在A型流感的活的感染哺乳动物模型中证明了抗病毒活性。
例如，所考虑的化合物将具有根据式I的结构
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式I
其中X和Y独立为O、S或NR，其中R、R1、R2、R3、R4和R5独立为H、任选被取代的低级烷基、任选被取代的低级烯基或NR1R2、OH或卤素；且其中Q为任选被取代的芳基或任选被取代的杂芳基。在尤其优选的化合物中，其中X和Y为氧，和/或R1和R2独立为乙基、甲基或三氟甲基，和/或R1和R2独立为乙基、甲基或三氟甲基，和/或R3和R4独立为低级烷基，和/或R5为低级烷基，和/或Q为任选被取代的苯基或任选被取代的吡啶基。
在另一个实施例中，所考虑的化合物还可以具有根据式II的结构
Figure DEST_PATH_IMAGE006
式II
其中R1和R2独立为H、卤素或烷氧基；其中R3和R4独立为H、低级烷基或一起形成5或6元环烷基或杂环；其中R5为H、被取代的饱和烷基或通过低级脂族片段连接到-NH-的任选被取代的芳基或杂芳基；且其中X独立为C、CH或杂原子。尤其优选的化合物包括其中R2为F或Cl，和/或其中R1和R2独立为乙氧基、甲氧基或三氟甲氧基，和/或其中R1和R2一起形成5元环烷基或杂环，和/或其中R1和R2一起形成6元环烷基或杂环，和/或其中R5为低级烷基，该低级烷基任选被苯基或取代的吡啶基取代，和/或其中R5为H的那些。
而且，本发明人还发现了用于细胞测定以识别具有抗病毒性质的小分子化合物的组分和方法。在尤其优选的方面，该测定允许独立于其他A型流感成分检测哺乳动物细胞中的A型流感RNA-依赖性RNA聚合酶活性，且允许识别不破坏正常细胞活性的病毒复制的抑制剂。
本发明的各种目的、特征、方面和优点将从本发明的优选实施方案的以下详述而变得更加显而易见。
附图简述
图1为A型流感报告基因测定构建物的示意图。
图2为指示荧光素酶测定中的组分要求的图。
图3为描述在荧光素酶测定中表达增强的例示性结果的图。
图4A为来自高通量筛选的原始数据的示意图，该高通量筛选通过例示性化合物证明报告基因系统的特异性抑制，图4B描述例示性化合物的结构，且图4C为说明报告基因系统对例示性化合物的剂量响应的图。
图5A描述另一个例示性化合物的结构，且图5B为说明报告基因系统对图5A的例示性化合物的剂量响应的图。
图6A为使用例示性化合物的血凝测定照片，且图6B为说明相同测定中例示性化合物的剂量响应的照片。
图7A和7B为说明使用例示性化合物，病毒传播在选择的细胞中受到抑制的照片。
图8A-8C为说明通过例示性化合物，细胞病变效应在选择的细胞中受到抑制的照片。
图9A和9B为说明在选择的细胞中，使用例示性化合物的细胞毒活性的图。
图10为说明活的感染在使用例示性化合物之后存活率提高的图。
详述
根据利用基于RdRP的报告基因系统的基于新开发的超灵敏细胞的测定，发现了一些化合物(例如A0435和A0439)，这些化合物具有抵抗明显保守的病毒靶标(最可能是病毒复制和/或基因表达机构)的显著抗病毒活性。
为了能够使用基于细胞的测定系统来高通量识别RdRP活性的新小分子抑制剂，本发明人产生一组编码流感RdRP亚单位蛋白(PB2、PB1和PA以及辅助NP蛋白)和用于在哺乳动物细胞中表达的报告基因RNA的构建物，且在图1中示意性描述典型的测定系统。编码报告基因RNA的构建物设计成利用小鼠RNA聚合酶I启动子表达盒，以驱使编码侧面与合适的病毒RNA域连接的萤火虫荧光素酶的反义RNA的转录。这些构建物转染到小鼠B16-F10细胞中证明在用所有五种质粒(例如，编码PA、PB1、PB2、NP和RNA聚合酶I-驱使的荧光素酶RNA构建物)转染的细胞中的稳健信号，但当除去任何这些成分时或如图2中所说明的那样，在缺乏基于UTR的启动子元件的报告基因RNA存在的情况下，没有可检测的表达。使用人表达盒和不同的病毒血清型的类似方法在先前业已报道2。
在一种特别优选的修饰中，同时包括驱使病毒非结构1(NS1)蛋白的表达的第六构建物。NS1和NS2为通过A型流感病毒的节段8编码的交替的mRNA剪接同工型。NS1在病毒感染期间表现各种各样的功能，包括调节病毒RNA合成和增强病毒蛋白翻译3，而NS2对从宿主细胞核输出的病毒RNA关键4。本发明人发现NS1的表达导致信号强度放大了约十倍，而不改变动力学研究中系统(图3)的背景“噪声”。本发明人还发现加入潜在抑制剂的优选的时间窗口在出现可检测的报告基因活性之前，除去转染DNA/脂质体复合物(或“脂质体复合物(lipoplexes)”)之后的最初6小时内。说明灵敏度提高的例示性数据在图3中显示。
当然，应当认识到本发明的主题不必限制于如图中所示和下文描述的特定组分，但可以包括一种或多种修饰的核酸。例如，RdRP亚单位蛋白可以来自不同的病毒，和/或可以突变以反映抗药的突变体毒株或赋予各种其他优点。同样，报告基因不必限制于荧光素酶，但可以为任何其他报告基因或系统。因此，信号可以作为光信号(发光、荧光、猝灭等)，作为可化学识别信号(例如，经由蛋白酶作用或抗原产生)，和/或作为生物信号(例如，细胞死亡或表型变化)产生。同样，多个核酸可以至少部分整合为单个核酸，以便转染，或细胞可以瞬时或永久地转染(作为细胞系或转基因)以表达RdRP亚单位蛋白。
不管具体的构型，应当认识到作为生物筛选使用这种测定系统，可以容易询问大且不同的化学库。作为同时的反筛选，本发明人利用细胞死亡-激活的报告基因构建物评估在分开的报告基因系统中相同的筛选样品，以在特定性抑制病毒RdRP的化合物和非特定性抑制哺乳动物基因转录和/或交替地激活人细胞中的共同细胞死亡途径的那些之间进行区分，在人细胞中任一结果可以指示不合乎需要的下游毒性。
使用这些测定和检索标准，本发明人其中识别小分子A0435(参见图4a、b)。基于测定系统的A0435的剂量滴定研究证明约3μM的50%抑制浓度(IC50)，且不存在对通过反筛选测定提供的组成型基因表达的水平的可见抑制影响(参见图4c)。还在报告基因测定中测试第二结构类似的化合物A0439，且发现虽然具有约5μM的IC50(参见图5a、b)和在较高剂量下由于沉淀而提高的毒性，但是显示报告基因系统的类似抑制。
当然，应当认识到具有包括吡唑并嘧啶(或如下表1中所示的类似结构)的骨架的许多其他化合物也认为是合适的，其中这种骨架将包括如下所述的各种取代基。最优选地，且特别针对化合物A0435和A439，考虑吡唑并嘧啶核(或备选的骨架)将包括可以被进一步任选取代的烷氧基芳基或二烷氧基芳基部分。在这种化合物中，至少一个氧原子还可以被伯胺、仲胺或叔胺或被硫或硒原子替代。最通常，芳基为苯基或杂芳基(优选具有氮杂原子)。同样，乙基吡啶部分可以被任何烷基杂芳基或烷基芳基替代，且在吡唑并嘧啶核的一个或两个烷基部分可以被取代的烷基、杂芳基置换或该两个烷基可以形成环。显著地，然而，在骨架的一些位置不能在不伴随损失或显著降低抑制作用和/或提高毒性的情况下被修饰，这由表1中所列出的化合物而易于显而易见。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
例如，合适的备选化合物将具有根据式I的结构
Figure DEST_PATH_IMAGE016
式I
其中X和Y独立为O、S或NR，其中R、R1、R2、R3、R4和R5独立为H、任选被取代的低级烷基、任选被取代的低级烯基或NR1R2、OH或卤素；且其中Q为任选被取代的芳基或任选被取代的杂芳基。更优选地，X和Y在所考虑的化合物中为氧，和/或R1和R2独立为乙基、甲基或三氟甲基。还一般优选的是R3和R4独立为低级烷基，且分别尤其是甲基和乙基。在仍进一步优选的方面，R5为低级烷基(且尤其是乙基)，和/或Q为任选被取代的苯基或任选被取代的吡啶基。特别优选的化合物包括如下文进一步显示的A0435和A0439。
同样，且如下文进一步详细描述，另外考虑的化合物还可以具有根据式II的结构
Figure DEST_PATH_IMAGE018
式II
其中R1和R2独立为H、卤素或烷氧基；其中R3和R4独立为H、低级烷基或一起形成5或6元环烷基或杂环；其中R5为H、被取代的饱和烷基或通过低级脂族片段连接到-NH-的任选被取代的芳基或杂芳基；且其中X独立为C、CH或杂原子。尤其优选的化合物包括其中R2为F或Cl，和/或其中R1和R2独立为乙氧基、甲氧基或三氟甲氧基，和/或其中R1和R2一起形成5元环烷基或杂环，和/或其中R1和R2一起形成6元环烷基或杂环，和/或其中R5为低级烷基，该低级烷基任选被苯基或取代的吡啶基取代，和/或其中R5为H的那些。
为了进一步体外评估A0435和A0439的抗病毒潜力，在加入活的MDCK衔接的A型流感/波多黎各(Puerto Rico)/8/34(H1N1)病毒之前，MDCK细胞与指定浓度的化合物一起预孵育1小时。在18-20小时孵育之后，收集上清液，并使用鸡血红细胞血凝测定来评估指示成功的病毒复制的病毒血凝素活性的存在。在这种类型的测定中，血凝素活性导致在U形孔的底部不存在通过沉淀的血红细胞形成的特性红“扣形物”。有趣的是，根据上文讨论的转染抑制实验中观察到的值(可以从图6a、b看到)，A0435证明在浓度>4μM具有显著的抗病毒活性，而A0439证明在>7.5μM具有类似活性。为了确定A0435的观察到的抗病毒活性是否扩展到其他病毒分离物/血清型，类似体外感染实验使用还由A0435显著抑制的A型流感/WS/1933(H1N1)和H3N2血清型A/Aichi/2/68病毒进行，且结果在图7a、b中显示。对药物开发具有相等重要性的是，用活病毒感染的细胞证明几乎没有到没有A型流感感染的细胞病变效应特征信号，如从图8 a、b、c显而易见的。与这些结果一致，本发明人发现在可从图9 a、b取得的宽浓度范围内，A0435在毒性的传统细胞模型，例如通过肝脏来源的HepG2细胞和原发性肾近端小管上皮细胞(或RPTEC)提供的那些中很好的耐受。
受这些结果所鼓励，本发明人开始研究以测量在用两倍致死剂量50%(2×LD50)的A型流感/波多黎各/8/34感染的动物中，在抵抗活的感染中，A0435的抗病毒效力。如图10中所证明，在3.17mg/kg剂量组中，3/5动物在感染后第7天幸免于感染，在1mg/kg剂量，2/5动物存活，而当只用媒介物(1×PBS，3% W/V小鼠血清白蛋白)注射时，0/5动物存活。
因此，所考虑的化合物包括可以在如图1中例示性显示的抑制测定中识别的所有那些。最优选地，这种化合物将具有等于或小于10μM，甚至更优选等于或小于1μM，且最优选等于或小于100nM的IC50，且在如上测量的IC50下将不具有明显的毒性。因此，鉴别所考虑化合物的方法将包括其中图1的测定系统用于筛选抑制性化合物的化合物库的步骤。一旦鉴别候选化合物(通常具有等于或小于10μM的IC50)，这种化合物可被进一步修饰以确定SAR，且产生具有较高效能、降低的毒性和/或提高的生物利用度的化合物。
而且，应当注意文中所考虑的化合物可以作为前药制备。文中所用的术语“前药”是指所考虑的化合物的修饰形式，其中所修饰的化合物呈现较小的药理学活性(如与修饰的化合物相比)，且其中所修饰的化合物在靶细胞(例如，B-细胞)或靶器官/解剖结构(例如，关节)内转化回到修饰的形式。例如，在活性药物对安全的全身给药来讲过于毒性时，或在所考虑的化合物被消化道或其他室或细胞较差地吸收时，或在到达其靶标之前身体将所考虑的化合物分解时，所考虑的化合物转化成前药可以有用。因此，应当认识到根据本发明主题的化合物可以许多方式修饰，且尤其优选的修饰包括改善一个或多个药代动力学参数和/或药效学参数的那些。例如，一个或多个取代基可以加入或替换以在血清中达到较高的AUC。
另一方面，且尤其在需要提高的溶解度时，可以加入亲水基团。还另外，在所考虑的化合物包含一个或多个可以被水解(或以其他方式断裂)的键时，还明显地考虑反应产物。用于将所考虑的化合物转化成相应的前药形式的例示性合适方案可以在Kenneth B.Sloan (ISBN: 0824786297)的“Prodrugs (Drugs and the Pharmaceutical Sciences: aSeries of Textbooks and Monographs”和Bernard Testa，Joachim M. Mayer (ISBN:390639025X)的“Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry,Biochemistry, and Enzymology”中发现，两者均通过引用结合到文中。而且，尤其在当所述化合物被代谢(例如水解、羟基化、葡糖醛酸化等)时所考虑的化合物具有较高活性时，应当认识到在文中还明显考虑所考虑化合物的代谢物。
另外，考虑所考虑的化合物可以与至少一种其他药物活性成分组合(体内或在药物制剂或给药方案中)，且尤其考虑的其他成分包括各种抗病毒药物(且特别是抑制或降低病毒复制、细胞侵袭和/或病毒蛋白装配的那些)、各种免疫调节药物(且尤其是各种干扰素，例如类型I、类型II和/或类型III)，和/或抗炎药物(例如，类固醇和NSAIDS)等。第二药物活性成分的浓度通常为单独给药所推荐的那些或优选低于单独给药所推荐的那些，然而，还认为较高浓度适合文中的用途。
因此，所考虑的药用组合物将尤其包括其中所考虑的化合物(和另外的药物活性成分)用合适载体提供的那些，其中所考虑的化合物优选以有效降低有机体和/或靶器官中的病毒传播到一定程度、有效降低且更优选治疗与病毒感染相关疾病的征兆和症状的浓度存在。从不同角度来看，所考虑的化合物以有效治疗病毒感染且尤其是RNA病毒(且特别是流感病毒)的病毒感染的量存在于组合物中。
例如，适用于用所考虑的化合物(且尤其是A0435/A0439)治疗的病毒感染为通过用RNA病毒(且尤其是负链RNA病毒)感染产生的那些，且特别是具有与A型流感最接近的类似性的那些病毒。因此，所考虑的病毒包括流感B(其已经由本发明人确定为可通过A0435抑制)，和流感病毒C。适用于用所考虑的化合物治疗的种系发生相关的另外的病毒包括单股反链病毒目家族，其包括副粘液病毒[包括新城疾病病毒；亨得拉病毒；尼帕病毒；牛瘟病毒；麻疹病毒；仙台病毒；牛副流感病毒3；人副流感病毒1和3；腮腺炎病毒；副流感病毒2、4a和4b；偏肺病毒；呼吸道合胞病毒]；弹状病毒科[包括哺乳动物感染性疱疹性口炎病毒和狂犬病病毒；植物感染性草莓皱缩病毒、莴苣坏死黄化病毒、狗牙根萎黄病条纹病毒、玉米花叶病毒、北方禾谷花叶病毒、兰花斑点病毒、水稻黄矮病病毒、苦苣菜黄网病毒和Taro veinchlorosis病毒；鱼感染性牙鲆弹状病毒、感染性造血组织坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒，和鳢弹状(Snakehead)病毒以及牛流行热病毒和阿德莱德河病毒]；丝状病毒科[包括埃波拉出血热病毒和马尔堡病毒]和玻那病毒属。虽然本发明人没有真实数据来支持这些病毒，但是应当注意基于RSV的表达系统可以用于确定这些病毒的适用性，且这种系统可以通过PHOSITA，无需过度的实验制备。
取决于具体的用途和结构，因此考虑根据本发明主题的化合物以1微克-1000毫克、更通常10微克-500毫克且最通常50微克-500毫克/单个剂量单位的量存在于组合物中。因此，优选所考虑的化合物的体内或体外浓度将一般为0.1nM-500μM，更通常50nM-400μM，且最通常100nM-200μM。
而且，应当认识到所有制剂被认为适合文中的用途，且尤其包括口服和胃肠外制剂。例如，对于口服给药，所考虑的组合物可以为片剂、胶囊、悬浮液或液体形式。药用组合物优选以包含特定量的活性成分的剂量单位的形式制备。这种剂量单位的实例为片剂或胶囊。活性成分还可以通过作为组合物注射给予，在所述组合物中例如盐水、葡萄糖或水可以用作合适载体。在尤其优选的方面，考虑制剂适用于局部给药、经由气溶胶给药和鞘内给药。因此，尤其合适的制剂可以为用于局部喷雾或液滴给药或作为酊剂施加的无菌水溶液。或者，合适的局部制剂包括乳膏、软膏、泡沫、洗剂、乳液等。而且，在化合物配制用于鞘内给药(例如，在脊椎损伤的治疗中)时，优选化合物作为可注射的溶液、悬浮液或乳液制备。在还进一步考虑的制剂中，所考虑的化合物可以配制用于气溶胶递送(例如，微粉化、涂布到可分散载体上，溶解在可雾化的溶剂中等)。
应当认识到具体制剂和载体的选择将至少部分取决于具体用途和化合物的类型。存在本领域已知的药物制剂的许多方式，且认为所有那些适合文中的用途(参见例如，Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A Practical Guide fromCandidate Drug Selection to Commercial Dosage Form, Mark Gibson; InformaHealthCare, ISBN: 1574911201; 或Advanced Drug Formulation Design to OptimizeTherapeutic Outcomes, Robert O. Williams, David R. Taft, 和Jason T.McConville; Informa HealthCare; ISBN: 1420043870)。
给予的治疗活性化合物的量和用本发明的化合物和/或组合物治疗疾病病症的剂量方案取决于各种因素，包括年龄、重量、受试者的性别和医疗条件、疾病的严重性、给药的途径和频率和所采用的具体化合物，因此可以广泛变化。然而，在上文提供尤其合适的量，且可以因此允许约0.001(或甚至更少)-100mg/kg体重、优选约0.01-约50mg/kg体重且最优选约0.1-20mg/kg体重的每日剂量。通常，每日剂量可以每日1-4个剂量给予。
对于治疗或预防目的，所考虑的化合物通常与一种或多种适用于指定给药途径的赋形剂组合。如果口服给药，所述化合物可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和钙盐、明胶、阿拉伯树胶、藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，且随后压片或封囊以方便给药。这种胶囊或片剂可以包含受控释放制剂，所述制剂可以活性化合物在羟丙基-甲基纤维素中的分散体提供。用于胃肠外给药的制剂可以为水性或非水性等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。这些溶液和悬浮液可以由无菌粉末或颗粒制备，这些粉末或颗粒具有提及在口服给药的制剂中使用的一种或多种载体或稀释剂。可以将所述化合物溶解在水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠和/或各种缓冲液中。其他赋形剂和给药模式在制药领域是公知且广泛已知的。
材料和方法:
细胞基报告基因测定：为了识别RdRP的抑制剂，本发明人将基于病毒生物学的基于小鼠细胞的测定系统工程化。为了形成该系统，编码PA、PB1、PB2、NP和NS1的病毒基因通过A型流感/波多黎各/8/34病毒cDNA模板的反转录酶-聚合酶链反应(或RT-PCR)，使用基因特定性寡核苷酸扩增。随后利用RNA聚合酶II表达盒将所得PCR产物克隆到哺乳动物表达载体(pVAX)中，且通过DNA测序验证插入物的序列。为了产生RNA聚合酶I-依赖性表达盒，源自小鼠45S rRNA转录起始位点的255bp序列上游的RNA聚合酶I启动子序列连接到多个克隆位点，所述克隆位点的后面是33bp小鼠RNA聚合酶I终止序列，所述终止序列通过PCR使用重叠寡核苷酸产生且以与公开的报道12类似的方式克隆到pBluescript中。随后使该构建物(称为pPolI)在多个克隆位点内消化并定向连接到5’UTR/荧光素酶/3’UTR，由此产生pPolI-Luc。pPolI-Luc-DelUTR(即具有缺失的UTR)和pPolI-GFP(其具有UTR但编码绿荧光蛋白而不是荧光素酶)构建物以类似方式产生。
转染使用小鼠B16-F10黑素瘤细胞和市售的转染试剂按照制备商的建议来进行，以证实系统的活性。概要地，在加到对数分割的黑素瘤细胞之前使2μg质粒(例如各自为400ng的编码PA、PB1、PB2、NP和pPolI-Luc的构建物)与15μL试剂复合。转染复合物在4小时之后除去且除非另有说明，否则在转染后20小时测定荧光素酶活性。涉及NS1的实验以类似方式进行，其中质粒DNA的总量在2μg下保持固定，但由于需要六种质粒只使用333ng各质粒。
病毒和体外病毒传播：A型流感/波多黎各/8/34(H1N1)、A/WSN/1933(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)在犬MDCK细胞中传播。在感染前的当天，将MDCK细胞平板接种在用10%V/V胎牛血清补充的Dulbecco氏改良的eagle培养基(D-MEM)中，并在37℃下在5% CO2下在将在第二天产生70-90%汇合的密度下孵育。在感染当天，在接受病毒稀释液之前，细胞使用完整的DMEM/7.5% BSA/25mM HEPES/(2ug/mL)TPCK-胰蛋白酶洗涤三次。
A0435抑制研究：对于涉及B16-F10转染系统的研究，在除去DNA/脂质复合物之后，加入指定量的A0435之前，细胞允许回收5小时。荧光素酶表达在14小时之后确定。对于涉及抑制病毒增殖的研究，在加入病毒制剂之前，细胞接受指定量的A0435 30分钟，这允许在除去之前感染2小时和洗涤掉未结合病毒的受体细胞以及用相应量的A0435替换培养基。
血凝测定：血凝测定如下进行。概要地，在起始感染之后的18-20小时，除非另有说明，否则在U-底部孔中，以1:1比率(V/V)，上清液与0.50%鸡血红细胞一起孵育，且反应用照相监控。
体内存活研究：在开始研究之前，称量5 Balb/C小鼠(年龄/性别)的组的重量，并用含有3.17、1或0mg/kg剂量的A0435(在含有3% w/v小鼠血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中)的制剂在尾的基部静脉内注射。4小时之后，在麻醉下，用2×LD50的A型流感/波多黎各/8/34，这些小鼠接受经鼻内的挑战。在起始剂量给予之后，相同剂量的A0435给予24和48小时，并每日监控动物重量。存活动物定义为保持其起始重量的70%或更多的那些。
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因此，业已公开了A型流感RNA-依赖性RNA聚合酶的小分子抑制剂的具体实施方案和应用。然而，对本领域技术人员来讲应当显而易见的是除了业已描述的那些以外，更多的修改是可能的，而不偏离文中的发明概念。因此，除了在所附权利要求的精神以外，发明主题不受限制。

Claims (9)

1.一种用于治疗流感病毒的药用组合物，所述组合物包含：
与药学上可接受的载体组合的选自以下的化合物：
2-(3,4-二甲氧基苯基)-6-乙基-5-甲基-N-[2-(吡啶-2-基)乙基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；
6-乙基-2-(4-氟苯基)-5-甲基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；
N-(3,4-二甲氧基苯乙基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-6-乙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；
2-(3,4-二甲氧基苯基)-6-乙基-5-甲基-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；
2-(4-氟苯基)-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)-5,6,7,8-四氢吡唑并[5,1-b]喹唑啉-9-胺；
2-(4-氯苯基)-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)-5,6,7,8-四氢吡唑并[5,1-b]喹唑啉-9-胺；和
2-(3,4-二甲氧基苯基)-N-(2-(吡啶-3-基)乙基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]吡唑并[1,5-a]嘧啶-8-胺，
其中所述流感病毒为A型流感病毒。
2.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为2-(3,4-二甲氧基苯基)-6-乙基-5-甲基-N-[2-(吡啶-2-基)乙基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺。
3.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为2-(3,4-二甲氧基苯基)-6-乙基-5-甲基-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺。
4.权利要求1-3中任一项的药用组合物，其中所述组合物还包含第二抗病毒药物。
5.权利要求4的药用组合物，其中所述第二抗病毒药物为抑制病毒复制的药物。
6.权利要求4的药用组合物，其中所述第二抗病毒药物为干扰素。
7.权利要求1-6中任一项的药用组合物在制备用于治疗具有流感病毒的病毒感染的药物中的用途，其中所述化合物以在所述化合物给予至有需要的患者时，有效降低患者中流感病毒的病毒传播的量存在，其中所述流感病毒为A型流感病毒。
8.一种化合物，所述化合物选自：
6-乙基-2-(4-氟苯基)-5-甲基-N-(2-(吡啶-2-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺；和
2-(3,4-二甲氧基苯基)-N-(2-(吡啶-3-基)乙基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]吡唑并[1,5-a]嘧啶-8-胺。
9.权利要求8的化合物在制备用于治疗流感病毒的病毒感染的药物中的用途，其中所述流感病毒为A型流感病毒。
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