KR101776192B1 - 샘플과 연관된 폴리뉴클레오티드의 식별 - Google Patents

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KR101776192B1
KR101776192B1 KR1020137031535A KR20137031535A KR101776192B1 KR 101776192 B1 KR101776192 B1 KR 101776192B1 KR 1020137031535 A KR1020137031535 A KR 1020137031535A KR 20137031535 A KR20137031535 A KR 20137031535A KR 101776192 B1 KR101776192 B1 KR 101776192B1
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윌리엄 에이치. 로빈슨
얀 총 탄
제레미 소콜로브
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 명세서는 단일 샘플과 같은 샘플들을 시퀀싱, 분석, 활용하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 또한 본 명세서는 샘플로부터 2 이상의 서열을 함께 매칭하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 또한 본 명세서는 관심 분자(molecules of interest)를 발현 및 스크리닝하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다.

Description

샘플과 연관된 폴리뉴클레오티드의 식별{IDENTIFICATION OF POLYNUCLEOTIDES ASSOCIATED WITH A SAMPLE}
관련 출원들에 대한 언급
본 출원은 2011년 4월 28에 출원된 미국 가출원(U.S. provisional patent application) No. 61/517,976, 2011년 8월 24일에 출원된 미국 가출원 No. 61/575,652, 2012년 2월 16일에 출원된 미국 가출원 No. 61/599,870, 2012년 3월 8일에 출원된 No. 61/608,571에 관련된 것이며; 상기 명세서는 모든 목적에서 그 전문이 본 명세서에 참조 인용된다.
연방정부 지원 연구 또는 개발에 대한 설명
본 발명은 미국 국립 보건원(U.S. National Institutes of Health)의 국립 심폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute)에 의해 수여된 N01-HV-28183 NHLBI 프로테오믹스 센터(Proteomics Center) 및 N01-HV-00242 NHLBI 프로테오믹스 센터의 지원 하에 정부와 함께 만들어 졌다. 정부는 본 발명에 특정한 권리를 가진다.
서열 목록
본 출원은, 인쇄된 서류 사본 대신에, CD-R을 통해서 제출된 “매우 긴(lengthy)” 서열 목록을 함유하고, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조 인용된다. 2012년 4월 25일에 기록된 상기 CD-R은 각각 “CRF,” “카피 1 - 서열 목록 부분, “ “카피 2 - 서열 목록 부분” 및 “카피 3 -서열 목록 부분,”으로 표지하고, 각각은 20786PCT_CRF_Sequencelising.EXE (138,571,776 bytes)으로 명명된 오직 하나의 자체-복원 파일을 함유하며, 이는 추후에 하나의 압축되지 않은 20786PCT_CRF_Sequencelisting.TXT (795,566,080 bytes)로 명명된 ASCII 텍스트 파일을 함유한다.
인간 소스들로부터 치료적 단일클론 항체들을 생산하는 것은 생물학적 및 기술적으로 도전적이다. 지금까지, 인간 하이브리도마들을 생성하는 것, 인간 면역글로불린들을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스들의 사용, 및 인간 면역글로불린 파지 디스플레이 라이브러리들의 사용을 포함하는 여러가지 접근법들이 기재되었다.
그들의 마우스 대응체(counterparts)와 다른 인간 골수종(myeloma) 융합 파트너들(fusion partners)은 하이브리도마를 생성하는데 비효율적이기 때문에 인간 하이브리도마들은 생성하기 어려울 수 있다. 인간 하이브리도마들은 또한 연장된 배양 이후에 자발적으로 발현된 항체 유전자들을 잃는 경향을 가진다. 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 형질전환은 B세포들을 불멸화시키나, 모든 EBV-형질전환된 B세포들 중에서 극히 적은 분획들만이 친화성 성숙되고 또는 표적 항원을 인식한다. 하이브리도마들의 생성은 전형적으로 치료적 단일클론 항체들을 수득하는 많은 스크린(large screens)들을 포함한다. 현재 U.S. F.D.A.에 의해 승인된 치료적 단일클론 항체들 중 아무것도 인간 하이브리도마들의 생성 또는 B세포들의 EBV 형질전환을 통해 생성되지 않았으며, 이는 기술적 어려움과 도전들은 이러한 방법에 의해 제기되어야 한다는 것을 증명한다.
인간 항체 서열들의 파지 디스플레이 라이브러리들은 치료적 인간 단일클론 항체들을 생산하기 위한 다른 방법을 나타낸다. 이 방법은 인간 항체 헤비- 및 라이트-체인 서열들을 함께 무작위적으로 발현하는 재조합 DNA 기술을 활용하여 표적 항원에 결합하는 조합들을 위한 스크리닝을 가능하게 한다. 그러나, 이 전략은 친화성-성숙된 항체들을 생성하지 못하고, 이 방법으로 생성된 항체들은 보통 낮은 친화성 및 결합력(avidity)으로 항원에 결합한다. 연속적인 성숙화 및 선택/스크리닝 단계들은 그런 뒤 높은-친화성 항체들을 생성하는데 필요하게 된다.
치료적 인간 단일클론 항체들을 생성하는 또 다른 방법은 인간 항체 레파토리를 가지는 트랜스제닉 마우스들을 생성하거나 사용하는 것에 의하는 것이다. 면역화 되었을 때, 이러한 마우스들은 면역화하는 항원들을 표적으로 하는 항체들을 생성하고, 그런 뒤 하이브리도마들은 치표적 인간 단일클론 항체들의 생산을 위해서 생성될 수 있다. 이러한 트렌스제닉 마우스들은 등록상표가 붙은 것이고(proprietary) 인간 항체들을 생성하는 것에 흔히 이용가능하지 않다.
따라서 본 발명자들은 힘들고 시간-소비적인 항체의 인간화의 필요 또는 대규모 스크린들을 수행하는 필요를 회피하면서 예를 들어, 매우 많은 수의 친화성-성숙된 인간 항체들을 생산할 수 있는 조성물들, 키트들, 및 방법들에 대한 필요가 있음을 식별하였다. 본 명세서에 기재된 이러한 조성물들, 키트들, 및 방법들은 이 필요들을 다룬다. 또한, 본 명세서에 기재된 조성물들, 키트들, 및 방법들은 인간 항체 공간(human antibody space) 밖에서도 광범위하게 적용가능하며 예를 들어, 단일 샘를로부터 유래되고 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리내에 존재하는 둘 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 서로 매칭하는 것을 포함하는 몇 개의 서로 다른 적용들로 사용될 수 있다.
요약
본 명세서는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B 세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 하나 이상의 식별 부위를 포함하고, 제1부위는 제2부위와 커플링된 것인 조성물을 개시한다.
어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 직경이 8μm 이상인 활성화 인간 B 세포로부터 분리된 IgG 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VDJ 부위를 포함하고, 상기 면역글로불린 부위의 5’ 말단은 식별 부위의 3’ 말단과 커플링된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 조성물은 클론 패밀리(clonal family)에 포함되는 것이다.
어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B 세포로부터 분리된 것이고, 상기 B 세포는 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B 세포로부터 분리된 것이고, 상기 B 세포는 형질아세포(plasmablast)이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B 세포로부터 분리된 것이고, 상기 B 세포는 단일 B 세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B 세포로부터 분리된 것이고, 상기 B 세포는 단일 활성화 B 세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B 세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 대상(subject)의 혈액에 위치하는 단일 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 인간 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 기억(memory) B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 형질세포(plasma cell)이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 항원-특이적 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 포유류의 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 인간 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 마우스의 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 질병 또는 질환을 가진 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 질병 또는 질환으로부터 회복되거나 또는 회복하고 있는 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 하나 이상의 관심 항원을 투여한 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 하나 이상의 관심 항원 및 보조제(adjuvant)를 투여한 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 혈액에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 골수에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 지라에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 하나 이상의 림프절에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 림프조직에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 내장(gut)에 위치하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 직경이 약 8-20μm 인 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 직경이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20μm 초과인 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 면적(area)이 약 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 350 μm2 초과인 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 부피가 약 250, 268, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 4000 μm3 초과인 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 10% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 15% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 20% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 면역글로불린을 분비할 수 있는 활성화 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 세포 주기의 갭 1(G1), 합성(S), 갭 2(G2), 또는 세포분열(M)기에 있는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 세포 주기의 갭 0(G0)기에 있지 않은 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 휴지 B 림프구의 1.2x FSC 평균 보다 큰 FSC를 가지는 것을 특성으로 하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 인간 단핵구의 0.7-1.15x FSC 평균을 FSC 평균으로 가지는 것을 특성으로 하는 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD19 양성 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD38 양성 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD27 양성 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD20 음성 B세포로부터 분리된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD19+CD20-CD27+CD38하이(hi) B세포로부터 분리된 것이다.
어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위의 5’말단은 식별 부위의 3’말단과 커플링 된다.
어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VDJ 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VJ 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 V, D, 및/또는 J부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 헤비 및/또는 라이트체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 IgG, IgM, IgD, IgE, 또는 IgA 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 길이가 약 200-2000 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 길이가 200미만, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 또는 2000초과 뉴클레오티드이다.
어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 복수의 식별 부위들을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 복수의 식별 부위들을 포함하며, 상기 각 복수의 식별 부위는 별개의 서열을 가진다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 하나 이상의 샘플 식별 부위 및 하나 이상의 플레이트 식별 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 면역글로불린 부위의 서열과는 별개의 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 약 2-100 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100 초과 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 2-1,000 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 100 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 인접한 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 비-인접, 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위의 서열 길이는 면역글로불린 부위의 서열 길이보다 작다.
어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 제3부위를 더 포함할 수 있고, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함하고, 상기 제3부위는 제1부위와 제2부위의 사이에 위치한다. 어떤 측면에서, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함하고, 상기 제3부위는 그것의 3’ 말단에 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 2-100 뉴클레오티드 길이이고 면역글로불린 부위 서열과는 별개의 서열을 가지는 것이며, 상기 어댑터 부위는 그것의 3’ 말단에 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함하고 샘플의 식별 부위의 3’ 및 면역글로불린 부위의 5’에 위치하고, 상기 면역글로불린 가변 부위는 초돌연변이화 되고 순수한 B세포의 생식(germline) 서열과는 다른 것이다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 용기에 존재한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 조성물은 용기에 존재한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 조성물은 복수의 웰(wells)들을 포함하는 단일 플레이트의 단일 웰에 존재한다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 조성물들의 라이브러리(library) 내에 있으며, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 제1부위 및 제2부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하며, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링된 것이고, 상기 각 식별 부위 o의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리에 존재하는 다른 식별 부위들의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이고, 상기 라이브러리에 있는 복수의 가변 면역글로불린 부위들의 뉴클레오티드 서열은 80-99% 이상의 서열 상동성(sequence identity)공유한다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 복수의 뉴클레오티드 조성물을 포함하는 라이브러리에 포함된 것이고, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하며, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리에의 각 독립된 용기에 존재하는 다른 식별 부위들의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물 라이브러리로서, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하고, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리의 각 독립된 용기에 존재하는 다른 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 복수의 폴리뉴클레오티드는 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 복수의 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하며 제2부위는 식별 부위를 포함하고, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리에 존재하는 다른 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이며, 상기 복수의 2 이상의 가변 면역글로불린 부위는 80-99% 이상의 서열 상동성을 공유하는 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 폴리뉴클레오티드의 클론 패밀리를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 패밀리의 각 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하며 제2부위는 식별 부위를 포함하고, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 패밀리에 존재하는 다른 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이며, 상기 패밀리의 각 가변 면역글로불린 부위는 80-99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 것인 라이브러리이다. 어떤 측면에서, 상기 라이브러리는 복수의 클론 패밀리들을 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 패밀리의 각 서열이 식별 부위와 커플링 된 면역글로불린 서열의 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 상기 각 식별 부위는 다른 식별부위와 별개의 것이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 서열은 헤비 체인 면역글로불린 서열을 포함한다. 상기 면역글로불린 서열은 라이트 체인 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 서열은 헤비 체인 및 라이트 체인 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 하나 이상의 식별 부위는 라이트 체인 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 하나 이상의 식별 부위는 헤비 체인 면역글로불린 서열을 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 본 명세서에 기재된 2 이상의 클론 패밀리의 세트이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 본 명세서에 기재된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 클론 패밀리의 세트이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 면역글로불린 서열의 클론 패밀리로서, 상기 패밀리의 각 서열은 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 커플링 된 것인 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 서열은 헤비 체인 면역글로불린 서열을 포함하고 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드 서열은 라이트 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 서열은 라이트 체인 면역글로불린 서열을 포함하고 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드 서열은 헤비 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 각각이 V, D, 및/또는 J 부위를 가지고 각각이 식별 부위와 커플링 된 복수의 면역글로불린 서열을 수득하는 단계; 및 클론 패밀리를 생산하기 위해 상기 복수의 면역글로불린 서열로부터 2 이상의 서열을 그룹핑(grouping)하는 단계로서, 상기 클론 패밀리의 각 서열은 V, D, 및/또는 J 부위를 갖는 생식 면역글로불린 서열 또는 V, D, 및/또는 J 부위를 갖는 동일한 생식 면역글로불린 서열의 돌연변이형(mutated version)인 단계; 를 포함하는 면역글로불린 서열의 클론 패밀리를 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 각 인식 부위는 다른 인식 부위와는 별개의 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 각각이 V, D, 및/또는 J 부위를 가지고 각각이 식별 부위와 커플링 된 복수의 면역글로불린 서열을 수득하는 단계로서, 상기 각 식별 부위는 다른 식별 부위와는 별개의 것인 단계; 하나 이상의 식별 부위를 제거하는 단계; 및 클론 패밀리를 생산하기 위해 상기 복수의 면역글로불린 서열로부터 2 이상의 서열을 그룹핑하는 단계로서, 상기 클론 패밀리의 각 서열은 V, D, 및/또는 J 부위를 갖는 생식 면역글로불린 서열 또는 V, D, 및/또는 J 부위를 갖는 동일한 생식 면역글로불린 서열의 돌연변이형(mutated version)인 단계; 를 포함하는 면역글로불린 서열의 클론 패밀리를 생산하는 방법이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제1식별 부위와 커플링 된 제1cDNA를 선택하는 단계; 및 각 cDNA와 커플링 된 식별 부위와 상동성을 근거로 제2cDNA를 식별하는 단계; 를 포함하는 제1식별 부위와 커플링 된 제2cDNA를 식별하는 방법이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제2뉴클레오티드 서열 상의 3’ 테일(tail)를 생산하는 방법으로서, 상기방법은 제1뉴클레오티드 서열을 수득하는 단계; 및 제1뉴클레오티드 서열을 50℃미만에서 주형 전환 활성(template switching activity)을 가지는 열에 안정한 RNase H- 역전사 효소와 접촉시키는 단계; 를 포함하며, 상기 접촉시키는 단계는 3’ 테일 및 제2뉴클레오티드 서열을 생산하는 것인 방법이다. 어떤 측면에서, 상기 제1뉴클레오티드 서열은 약 50 oC 미만, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 또는 42oC 미만에서 접촉된다. 어떤 측면에서, 상기 제1뉴클레오티드 서열은 42oC에서 접촉된다. 어떤 측면에서, 상기 제1뉴클레오티드 서열은 45.5oC에서 접촉된다. 어떤 측면에서, 상기 전사효소는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV) RNase H- 역전사 효소이다. 어떤 측면에서, 상기 전사효소는 수퍼스크립트 III(SuperScript III)이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제1서열과 관련되고 각각이 제1 식별 부위와 커플링 된 복수의 서열을 수득하는 단계로서, 상기 각 제1 식별 부위는 동일하고, 상기 하나 이상의 복수의 서열은 자연적으로 발생하는 서열과 별개의 것인 단계; 및 복수의 서열을 비교하여 관심 제1 서열의 자연적으로 발생하는 서열을 결정하는 단계; 를 포함하는 관심 제1서열의 자연적으로 발생하는 서열을 결정하는 방법이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 서열은 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 서열은 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 서열들은 각각 제2 식별 부위와 커플링 된 것이고 각각의 제2 식별 부위는 동일하다. 어떤 측면에서, 상기 관심 제1 서열은 면역글로불린 서열이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 서열들은 면역글로불린 서열이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제1부위 및 제2부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 상기 제1부위는 B세포-유래 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하고, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링 된 것인 조성물이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물 라이브러리로서, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 B세포-유래 가변 면역글로불린 부위 및 식별 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 가변 면역글로불린 부위는 식별 부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리의 각각의 독립된 용기에 존재하는 다른 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제1 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계로서, 상기 제1부위는 대상과 연관된 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하는 것인 단계; 및 제1부위를 제2부위에 커플링하는 것에 의해 제1부위 및 제2부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 제2부위는 식별 부위를 포함하는 것인 단계; 를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 대상과 연관된 B세포를 수득하는 단계 및 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해 상기 세포를 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해 대상과 연관된 B세포를 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해 대상과 연관된 B세포를 용해시킨 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 흐름세포측정기(flow cytometer)를 사용하여 B세포를 수득하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 미세유동장치(microfluidic device)를 사용하여 B세포를 수득하는 단계를 포함한다.
어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위 부위는 직경이 8 μm 이상인 활성화 인간 B세포로부터 분리된 IgG 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VDJ 부위를 포함하고, 상기 면역글로불린 부위의 5’ 말단은 식별 부위의 3’말단과 커플링 된다. 어떤 측면에서, 상기 조성물은 클론 패밀리에 포함된다.
어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 형질아세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 단일 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 단일 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 대상의 혈액에 위치하는 단일 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 인간 활성화 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 기억 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 형질 세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 B세포로부터 분리된 것이고, 상기 B세포는 항원-특이적 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 포유류의 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 인간 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 마우스 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 질병 또는 질환을 가진 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 질병 또는 질환으로부터 회복되거나 또는 회복하고 있는 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 항원을 투여한 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 관심 항원 및 보조제를 투여한 대상으로부터 얻어진 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 혈액에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 골수에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 지라에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 하나 이상의 림프절에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 림프조직에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 대상의 내장(gut)에 위치하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 직경이 약 8-20μm인 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 직경이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20μm 초과인 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 면적(area)이 약 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 350 μm2 초과인 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 부피가 약 250, 268, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 4000 μm3 초과인 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 10% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 15% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 크기에서 콘트롤 휴지 B세포(control resting B cell)의 정중 직경(median diameter)에 비해 20% 이상의 직경을 가지는 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 면역글로불린을 분비할 수 있는 활성화 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 세포 주기의 갭 1(G1), 합성(S), 갭 2(G2), 또는 세포분열(M)기에 있는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 세포 주기의 갭 0(G0)기에 있지 않은 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 휴지 B 림프구의 1.2x FSC 평균 보다 큰 FSC를 가지는 것을 특성으로 하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 인간 단핵구의 0.7-1.15x FSC 평균을 FSC 평균으로 가지는 것을 특성으로 하는 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD19 양성 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD38 양성 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD27 양성 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD20 음성 B세포로부터 분리된다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 단일 CD19+CD20-CD27+CD38하이(hi) B세포로부터 분리된다.
어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위의 5’말단은 식별 부위의 3’말단과 커플링 된다.
어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VDJ 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 VJ 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 V, D, 및/또는 J부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 헤비 및/또는 라이트체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 IgG, IgM, IgD, IgE, 또는 IgA 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 가변 면역글로불린 부위는 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3 면역글로불린 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 길이가 약 200-2000 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 면역글로불린 부위는 길이가 200미만, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 또는 2000초과 뉴클레오티드이다.
어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 복수의 식별 부위들을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 복수의 식별 부위들을 포함하며, 상기 각 복수의 식별 부위는 별개의 서열을 가진다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 하나 이상의 샘플 식별 부위 및 하나 이상의 플레이트 식별 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 면역글로불린 부위의 서열과는 다른 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 약 2-100 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100 초과 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 2-1,000 뉴클레오티드이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 길이가 100 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 인접한 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 비-인접, 비-부호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 식별 부위의 서열 길이는 면역글로불린 부위의 서열 길이보다 작다.
어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 제3부위를 더 포함할 수 있고, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함하고, 상기 제3부위는 제1부위와 제2부위의 사이에 위치한다. 어떤 측면에서, 상기 제3부위는 어댑터 부위(adaptor region)를 포함하고, 상기 제3부위는 그것의 3’ 말단에 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 측면에서, 상기 식별 부위는 2-100 뉴클레오티드 길이이고 면역글로불린 부위 서열과는 다른 서열을 가지는 것이며, 상기 어댑터 부위는 그것의 3’ 말단에 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함하고 샘플의 식별 부위의 3’ 및 면역글로불린 부위의 5’에 위치하고, 상기 면역글로불린 가변 부위는 초돌연변이화 되고 순수한 B세포의 생식 서열과는 다른 것이다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 용기에 존재한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 조성물들은 용기에 존재한다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 조성물들은 복수의 웰(well)을 포함하는 단일 플레이트의 단일 웰에 존재한다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 조성물들의 라이브러리(library)에 있으며, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 제1부위 및 제2부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하며, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링된 것이고, 상기 각 식별 부위 o의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리에 존재하는 다른 식별 부위들의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이고, 상기 라이브러리에 있는 복수의 가변 면역글로불린 부위들의 마지막 뉴클레오티드 서열은 80-99% 이상의 서열 상동성(sequence identity)공유한다.
어떤 측면에서, 상기 조성물은 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들을 포함하는 라이브러리(library)에 포함되며, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1부위 및 제2부위를 포함하고, 상기 제1부위는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고 제2부위는 식별 부위를 포함하며, 상기 제1부위는 제2부위와 커플링된 것이고, 상기 각 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리에 존재하는 다른 식별 부위들의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 대상과 연관된 B세포를 수득하는 단계; 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하는 세포로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계; 및 가변 면역글로불린 부위를 식별 부위에 커플링 하는 것에 의해 가변 면역글로불린 부위 및 식별 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 단계; 를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 방법이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 대상과 연관된 B세포-유래 가변 면역글로불린 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및 가변 면역글로불린 부위를 식별 부위에 커플링 하는 것에 의해 가변 면역글로불린 부위 및 식별 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 단계; 를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 B세포를 수득하는 단계 및 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해 상기 세포를 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해 B세포를 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드를 받는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 하나 이상의 대상으로부터 수득된 복수의 샘플과 연관된 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 발현된 B세포 가변 면역글로불린 부위를 포함하고, 상기 각 샘플은 B세포와 연관되고, 상기 각 샘플과 연관된 각 폴리뉴클레오티드는 독립된 용기에 존재하는 것인 단계; 및 폴리뉴클레오티드를 식별 부위에 커플링하는 것에 의해 복수의 폴리뉴클레오티드 및 식별 부위로부터 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 각 식별 부위의 서열은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드와 커플링 된 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 를 포함하는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 복수의 B세포를 수득하는 단계 및 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하기 위해 상기 세포를 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하기 위해 복수의 B세포를 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 하나 이상의 대상으로부터 수득된 복수의 샘플과 연관된 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 B세포-유래 가변 면역글로불린 부위를 포함하고, 상기 각 샘플과 연관된 각 폴리뉴클레오티드는 독립된 용기에 존재하는 것인 단계; 및 폴리뉴클레오티드를 식별 부위에 커플링 하는 것에 의해 복수의 폴리뉴클레오티드 및 식별 부위로부터 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 2이상의 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 각 식별 부위의 서열은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드와 커플링 된 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 를 포함하는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 조성물을 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 복수의 B세포를 수득하는 단계 및 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하기 위해 상기 세포를 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하기 위해 복수의 B세포를 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물 라이브러리로서, 상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고, 상기 각 조성물은 cDNA 부위의 3’ 말단에서 뉴클레오티드 C를 포함하는 단일 샘플-유래 cDNA 부위 및 어댑터 부위와 커플링 된 샘플 식별 부위를 포함하는 샘플 식별-어댑터 부위를 포함하고, 상기 각 샘플 식별-어댑터 부위의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리의 독립된 용기에 존재하는 다른 샘플 식별-어댑터 부위의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과는 별개의 것이고, 상기 어댑터 부위는 어댑터 부위의 3’ 말단에 뉴클레오티드 G를 포함하고, 상기 샘플 식별-어댑터 부위는 C 및 G 사이에 결합하는 것에 의해 cDNA 부위에 부착되는 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 cDNA 부위는 DNA 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 cDNA 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 cDNA 부위는 3’ 말단에 하나 이상의 C를 포함하고 상기 어댑터 부위는 3’ 말단에 하나 이상의 G를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 및 단일 샘플-유래 cDNA 부위를 포함하고, 상기 샘플 식별 부위의 3’ 말단은 어댑터 부위의 5’ 말단과 커플링 된 것이고, 상기 cDNA 부위는 어댑터 부위의 3’ 말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻어진 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻어진 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것이며, 상기 샘플 식별 부위는 이중 가닥인 것인 라이브러리이다. 어떤 측면에서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 복수의 샘플 식별 부위를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 단일 샘플의 앰프리콘 부위(amplicon region), 어댑터 부위, 샘플 식별 부위, 및 범용 프라이머 (universal primer)부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’ 말단은 샘플 식별 부위의 5’ 말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’ 말단은 어댑터 부위의 5’ 말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위에 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 것이고, 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 상기 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리.
어떤 측면에서, 상기 앰프리콘 부위의 5’말단은 어댑터 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 서열 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 모든 인간 유전자 엑손과 완전히 상보적이진 않으며, 상기 범용 프라이머 부위는 어댑터 부위를 방해하지 않는 최소의 2차 구조를 갖는다. 어떤 측면에서, 상기 범용 프라이머 부위는 서열 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함한다. 어떤 측면에서, 어떤 측면에서, 상기 앰프리콘 부위는 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 상기 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 1 이상의 뉴클레오티드 차이가 난다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 상기 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 2 이상의 뉴클레오티드 차이가 난다. 어떤 측면에서, 상기 샘플 식별 부위는 길이가 10 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 샘플 식별 부위는 길이가 1 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 각 샘플 식별 부위의 서열은 표 2 및 7으로부터 선택된다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터 부위의 서열은 그 3’말단에 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 앰프리콘 부위는 면역글로불린 헤비 체인 앰프리콘 서열, 면역글로불린 라이트 체인 앰프리콘 서열, T 세포 수용체 알파 앰프리콘 서열, 또는 T 세포 수용체 베타 앰프리콘 서열을 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-3’을 포함하고, 상기 A는 범용 프라이머 부위이고, 상기 B는 샘플 식별 부위이고, 상기 C는 어댑터 부위이고, 상기 D는 단일 샘플의 앰프리콘 부위이며, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 상기 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻어진 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 어댑터 부위, 샘플 식별 부위, 및 범용 프라이머 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위에 작동적으로 커플이 된 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 앰프리콘 부위의 5’말단은 어댑터 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 서열 5’-A-B-C-D-3’을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 A는 범용 프라이머 부위이고, 상기 B는 샘플 식별 부위이고, 상기 C는 어댑터 부위이고, 상기 D는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위인 폴리뉴클레오티드이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 제1 플레이트 식별 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 및 어댑터 부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 플레이트 식별 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브버리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개의 것이다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 1 이상의 뉴클레오티드 차이가난다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 2 이상의 뉴클레오티드 차이가 난다. 어떤 측면에서, 상기 제1 플레이트 식별 부위는 길이가 10 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 표 3 및 6으로부터 선택된다. 어떤 측면에서, 상기 제1 플레이트 식별 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위의 5’말단은 어댑터 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 제2 플레이트 식별 부위, 제1 시퀀싱 부위, 및 제2 시퀀싱 부위를 더 포함하고, 상기 제2 플레이트 식별 부위의 5’말단은 앰프리콘 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 시퀀싱 부위의 3’말단은 제1 플레이트 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제2 시퀀싱 부위의 5’말단은 제2 플레이트 식별 부위의 3’말단과 커플링 된다. 어떤 측면에서, 상기 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 각 폴리뉴클레오티드 상의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 동일하다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과는 별개의 것이다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과는 1 이상의 뉴클레오티드 차이가 난다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플의 제1 세트로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과는 2 이상의 뉴클레오티드 차이가 난다. 어떤 측면에서, 상기 제2 플레이트 식별 부위는 길이가 10 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 상기 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 표3 및 6으로부터 선택된다. 어떤 측면에서, 상기 제1 시퀀싱 부위는 GAGAGACTGACAGCGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제2 시퀀싱 부위는 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-E-3’을 포함하고, 상기 A는 플레이트 식별 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브버리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 제1 플레이트 식별 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 및 어댑터 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 플레이트 식별 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 제1 플레이트 식별 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위의 5’말단은 어댑터 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 제2 플레이트 식별 부위, 제1 시퀀싱 부위, 및 제2 시퀀싱 부위를 더 포함하고, 상기 제2 플레이트 식별 부위의 5’말단은 앰프리콘 부위의 3’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 시퀀싱 부위의 3’말단은 제1 플레이트 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제2 시퀀싱 부위의 5’말단은 제2 플레이트 식별 부위의 3’말단과 커플링 된 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 서열 5’-A-B-C-D-E-3’을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 A는 플레이트 식별 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위인 폴리뉴클레오티드이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 제1 제한 자리 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 및 제2 제한 자리 부위를 포함하는 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 제한 자리 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 제2 제한 자리 부위는 앰프리콘 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 동일한 것이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻어진 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻어진 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 제1 제한 자리 부위는 하나 이상의 제한 자리를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제1 제한 자리 부위는 NheI, XhoI, BstBI, EcoRI, SacII, BbvCI, PspXI, AgeI, ApaI, KpnI, Acc65I, XmaI, BstEII, DraIII, PacI, FseI, AsiSI 및 AscI으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제한 자리를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제2 제한 자리 부위는 하나 이상의 제한 자리를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제2 제한 자리 부위는 NheI, XhoI, BstBI, EcoRI, SacII, BbvCI, PspXI, AgeI, ApaI, KpnI, Acc65I, XmaI, BstEII, DraIII, PacI, FseI, AsiSI 및 AscI으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제한 자리를 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 제한 자리 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위이 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 어댑터 부위의 3’말단은 앰프리콘 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위의 3’말단은 제2 제한 자리 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-E-F-3’을 포함하고, 상기 A는 제1 제한 자리 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위이고, 상기 F는 제2 제한 자리 부위이며, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 것이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 제1 제한 자리 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 및 제2 제한 자리 부위를 포함하는 벡터 내에 삽입을 위한 폴리뉴클레오티드로서, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 제한 자리 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 제2 제한 자리 부위는 앰프리콘 부위와 작동적으로 커플링 된 것인 폴리뉴클레오티드이다.
어떤 측면에서, 상기 제1 제한 자리 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 어댑터 부위의 3’말단은 앰프리콘 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위의 3’말단은 제2 제안 자리 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 서열 5’-A-B-C-D-E-F-3’를 포함하는 벡터 내에 삽입을 위한 폴리뉴클레오티드로서, 상기 A는 제1 제한 자리 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위이고, 상기F는 제2 제한 자리 부위인 폴리뉴클레오티드이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 및 어댑터 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 어댑터 분자로서, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것인 분자이다. 어떤 측면에서, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 범용 프라이머 부위 및 플레이트 식별 부위를 포함하며, 상기 플레이트 식별 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위의 5’말단과 커플링 된 것인 폴리뉴클레오티드 프라이머이다. 어떤 측면에서, 상기 범용 프라이머 부위는 CACGACCGGTGCTCGATTTAG를 포함하고, 상기 프라이머는 시퀀싱 부위를 더 포함하고, 상기 시퀀싱 부위의 3’말단은 플레이트 식별 부위의 5’말단과 커플링 된다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 어떤 측면에서, 상기 벡터는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 벡터는 pEE6.4 및 pEE12.4로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 본 명세서에 기재된 벡터 또는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 숙주 세포이다. 어떤 측면에서, 상기 숙주세포는 CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO-S 세포, NS0 세포, dhfr- 인 CHO 세포, CHO-dhfr-, DUKX-B11 CHO 세포, 및 DG44 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 하나 이상의 대상으로부터 수득된 복수의 샘플과 연관된 복수의 cDNA들을 포함하는 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 cDNA는 복수의 샘플에 있는 단일 샘플과 연관된 것이고, 상기 각 샘플과 연관된 각 cDNA는 독립된 용기에 존재하는 것인 단계; 및 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 각 샘플과 연관된 cDNA에 어댑터 분자를 첨가하는 단계로서, 상기 어댑터 분자는 샘플 식별 부위 및 어댑터 부위를 포함하고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 각 어댑터 분자의 샘플 식별 부위의 서열은 라이브러리의 각 cDNA에 첨가되는 다른 어댑터 분자들의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 를 포함하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 라이브러리의 각 cDNA의 3’말단에 어댑터 부위의 3’말단을 부착하도록 하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계는 복수의 샘플을 수득하는 단계 및 cDNA 라이브러리를 준비하기 위해 샘플을 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터 분자는 범용 프라이머 부위를 더 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된다. 어떤 측면에서, 상기 각 cDNA 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드와 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 각 샘플은 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 세포는 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 B세포는 형질아세포, 기억B세포, 또는 형질세포이다. 어떤 측면에서, 상기 각 샘플은 복수의 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계는 cDNA 라이브러리를 준비하기 위해 복수의 샘플을 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 cDNA 라이브러리를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터는 역전사 반응 동안 생성되는 cDNA의 3’테일에 어댑터를 어닐링하는 것에 의해 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 각 cDNA는 하나 이상의 C 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 C는 각 cDNA의 3’ 말단에 위치하고, 상기 어댑터 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 G는 어댑터 부위의 3’말단에 위치하고, 상기 어댑터 부위는 G 및 C 사이에 결합하는 것을 통하여 각 cDNA에 부착된다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터 분자는 단일-가닥이고, 상기 방법은 효소가 어댑터 분자를 이중-가닥으로 만들게 하는 것에 의해 어댑터 분자를 각 cDNA 내로 통합하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터 분자는 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 MMLV H- 역전사 효소에 의해 각 cDNA 안으로 통합된다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드가 포함된 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위를 포함하는 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과 별개의 것인 단계; 및 시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위한 프라이머 세트로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 증폭하는 단계로서, 상기 시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드는 제1 시퀀싱 부위, 제1 플레이트 식별 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 및 제2 시퀀싱 부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 플레이트 식별 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 제1 시퀀싱 부위는 관심 폴리뉴클레오티드의 5’말단에 위치하고, 상기 제2 시퀀싱 부위는 관심 폴리뉴클레오티드의 3’말단에 위치하는 것인 단계; 를 포함하는 시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 454 시퀀싱으로 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 SMRT 시퀀싱으로 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 SOLiD 시퀀싱으로 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 SOLEXA 시퀀싱으로 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 tSMS 시퀀싱으로 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 프라이머 세트는 표 1 및 5에 나타낸 프라이머로부터 선택된다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 시험관 내에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드와 연관된 데이터세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터세트는 복수의 폴리뉴클레오티드에 대한 시퀀싱 데이터를 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위를 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드상의 샘플 식별 부위는 단일 샘플에게 특유의 것이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 및 데이터세트를 분석하여 폴리뉴클레오티드를 동일한 샘플 식별 부위와 서로 매칭하는 단계로서, 상기 매치는 폴리뉴클레오티드가 동일 샘플로부터 비롯된 것임을 보여주는 것인 단계; 를 포함하는 시퀀싱 데이터를 분석하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드는 제1 플레이트 식별 부위를 더 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드 상의 샘플 식별 부위 및 각 제1 플레이트 식별 부위의 각 조합은 단일 샘플에 특유한 것이고, 상기 단일 샘플의 제1세트로부터 얻어진 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 얻어진 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개의 것이며, 상기 방법은 데이터세트를 분석하여 폴리뉴클레오티드를 동일한 샘플 식별 부위 및 동일한 제1 플레이트 식별 부위와 서로 매칭는 단계로서, 상기 두 부위간의 매치는 폴리뉴클레오티드가 동일 샘플로부터 비롯된 것임을 보여주는 것인 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이터세트를 수득하는 단계는 복수의 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계 및 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하여 데이터세트를 실험적으로 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이터세트를 수득하는 단계는 데이터세트를 실험적으로 결정하기 위해 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 데이터세트를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이서세트는 전기적 저장 매체 상에 저장된다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플은 단일 세포이다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플은 단일 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플은 단일 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 단일 샘플은 복수의 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 클로닝을 위한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 선택하는 단계를 더 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드와 연관된 데이터세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터세트는 복수의 폴리뉴클레오티드에 대한 시퀀싱 데이터를 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위를 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드상의 샘플 식별 부위는 단일 샘플에게 특유의 것이고 그리하여 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드를 별개의 단일 샘플과 연관시키고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 데이터세트로부터 제1 단일 샘플과 연관된 관심 제1 폴리뉴클레오티드를 선택하는 단계; 및 관심 제1 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위를 근거로 제1 단일 샘플 내의 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 단계; 를 포함하는 관심 제1 폴리뉴클레오티드의 선택을 근거로 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드는 제1 플레이트 식별 부위를 더 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드 상의 각 샘플 식별 부위 및 각 제1 플레이트 식별 부위의 각 조합은 단일 샘플에 특유한 것이고, 상기 단일 샘플의 제1세트로부터 얻어진 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플의 제1세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 얻어진 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개의 것이며, 상기 방법은 관심 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위 및 샘플 식별 부위를 근거로 제1 단일 샘플 내의 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제1 단일 샘플은 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제1 단일 샘플은 복수의 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제1 단일 샘플은 B세포를 포함하고, 상기 관심 제1 폴리뉴클레오티드는 항체 헤비 체인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 관심 제2 폴리뉴클레오티드는 항체 라이트 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 제1 단일 샘플은 B세포를 포함하고, 상기 관심 제1 폴리뉴클레오티드는 항체 라이트 체인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 관심 제2 폴리뉴클레오티드는 항체 헤비 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이터세트를 수득하는 단계는 복수의 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계 및 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱하여 실험적으로 데이터세트를 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이터세트를 수득하는 단계는 데이터세트를 실험적으로 결정하기 위해 복수의 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 데이터세트를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 데이터세트는 전기적 저장 매체 상에 저장된다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드가 포함된 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위를 포함하는 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드 내의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 라이브러리의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과 별개의 것인 단계; 및 클로닝을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위한 프라이머 세트로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 증폭하는 단계로서, 상기 클로닝을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드는 제1 제한 자리 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위, 및 제2 제한 자리 부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 제1 플레이트 식별 부위는 범용 프라이머 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것이고, 상기 제1 제한 자리 부위는 관심 폴리뉴클레오티드의 5’말단에 위치하고, 상기 제2 제한 자리 부위는 관심 폴리뉴클레오티드의 3’말단에 위치하는 것인 단계; 를 포함하는 클로닝을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 시험관 내에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 및 단일 샘플로부터 얻은 앰프리콘 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계로서, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’말단과 커플링 된 것이고, 상기 앰프리콘 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 된 것인 단계; 및 관심 분자를 생산하는데 충분한 환경에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 를 포함하는 관심 분자를 생산하는 방법이다. 어떤 측면에서, 상기 숙주세포를 수득하는 단계는 시험관 내에서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 숙주세포를 수득하는 단계는 숙주세포를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 관심 분자는 단백질이다. 어떤 측면에서, 상기 관심 분자는 항체이다. 어떤 측면에서, 상기 관심 분자는 인간 단일클론 항체이다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 관심 분자를 수집하는 단계를 더 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 본 명세서에 기재된 숙주세포, 벡터, 폴리뉴클레오티드 라이브러리 또는 폴리뉴클레오티드, 및 사용설명서를 포함하는 키트이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 (a) 복수의 cDNA 분자를 제공하는 단계; (b) 물리적으로 관심 cDNA 분자를 링크하는(linking) 단계; 및 (c) 물리적 링크(linkage) 이전, 도중, 또는 이후의 관심 cDNA들에 바코드 서열을 추가하는 단계; 를 포함하는 복수의 관심 비-인접 폴리뉴클레오티드 서열을 링크(linking) 또는 바코딩(barcoding)하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 물리적 링크는 라이게이션(ligation)에 의한 것이다. 어떤 측면에서, 상기 물리적 링크는 재조합에 의한 것이다. 어떤 측면에서, 상기 물리적 링크는 중복-확장 서열(overlap-extension sequence)을 사용하는 것을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 물리적으로 링크된 cDNA들의 하나 이상의 말단에 위치한다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 물리적으로 링크된 cDNA들 사이에 위치한다. 어떤 측면에서, 상기 라이게이션은 호환 가능한 말단의 어닐링 및 라이게이션에 의해서 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 호환 가능한 말단은 제한 자리이다. 어떤 측면에서, 상기 라이게이션은 블런트 말단 라이게이션(blunt end ligation)에 의해 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 중복-확장 서열은 중복-확장 테일을 포함하는 프라이머를 사용하는 증폭 과정 중에 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 중복-확장 서열은 중복-확장 테일을 포함하는 프라이머를 사용하는 역전사 과정 중에 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 중복-확장 서열은 역전사 반응 중에 생성되는 cDNA의 3’ 테일에 어댑터를 어닐링하는 것에 의해 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 라이게이션에 의해 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 라이게이션은 호환 가능한 말단의 어닐링 및 라이게이션에 의해서 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 호환 가능한 말단은 제한 자리이다. 어떤 측면에서, 상기 라이게이션은 바코드 서열을 포함하는 어댑터의 블런트 말단 라이게이션에 의해 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 사용하는 증폭 반응의 과정 중에 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 사용하는 역전사 반응 과정중에 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 바코드 서열은 역전사 반응 중에 생성되는 cDNA의 3’ 테일에 어댑터를 어닐링하는 것에 의해 추가된다. 어떤 측면에서, 상기 cDNA의 3’말단은 하나 이상의 C 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 어댑터의 3’말단은 하나 이상의 G 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 어댑터는 C 및 G 사이에 결합하는 것을 통해 각 cDNA에 부착된다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터는 단일-가닥이고, 상기 방법은 효소가 어댑터를 이중-가닥으로 만들게 하는 것에 의해 어댑터를 각 cDNA내로 통합하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 어댑터는 MMLV H- 역전사 효소에 의해 각 cDNA 안으로 통합된다. 어떤 측면에서, 상기 중복-확장 서열은 바코드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 헤비 및 라이트 체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (d) 물리적 링크 이전, 도중, 또는 이후에 시퀀싱 부위를 관심 cDNA들에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 시퀀싱 부위는 어댑터로 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (e) 넥스트젠(NextGen) 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 물리적으로 링크된 관심 cDNA 분자들을 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 454 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SMRT 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLiD 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLEXA 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 tSMS 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 cDNA 분자들은 6웰 이상, 12웰 이상, 24웰 이상, 48웰 이상, 96웰 이상, 384웰 이상, 1536웰 이상, 또는 그 이상의 웰을 가지는 플레이트에 함유된 단일 샘플로부터 얻은 것이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 cDNA 분자들은 각각이 96웰 이상을 가지는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 또는 그 이상의 개수의 플레이트에 함유된 단일 샘플로부터 얻은 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 (a) 샘플들을 복수의 용기로 분배하는 단계;(b) 샘플로부터 얻은 주형을 사용하여 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 단계로서, 상기 합성은 바코드 서열의 첨가를 야기하는 것인 단계;(c) 단계(b)에서 합성된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 링크를 생기게 하는 단계; 를 포함하는 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 복수의 샘플을 링크 및 바코딩하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 각 샘플은 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 세포는 B세포이다. 어떤 측면에서, 상기 B세포는 형질아세포, 기억B세포, 또는 형질세포이다. 어떤 측면에서, 각 샘플은 복수의 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 헤비 및 라이트 체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 합성은 RT-PCR 증폭을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 RT-PCR 증폭은 단일 단계 내에서 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드의 링크는 중복-확장 프라이머를 사용하는 RT-PCR 증폭 과정 중에 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (d) 바코드 서열 첨가 또는 링크 이전, 도중, 또는 이후에 시퀀싱 부위를 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 시퀀싱 부위는 어댑터로 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (e) 넥스트젠(NextGen) 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 링크된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 시퀀싱 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 454 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SMRT 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLiD 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLEXA 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 tSMS 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 샘플들은 6웰 이상, 12웰 이상, 24웰 이상, 48웰 이상, 96웰 이상, 384웰 이상, 1536웰 이상, 또는 그 이상의 웰을 가지는 플레이트에 함유된 단일 샘플로부터 얻은 것이다. 어떤 측면에서, 상기 복수의 샘플들은 각각이 96웰 이상을 가지는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 200개, 500개, 또는 그 이상의 개수의 플레이트에 함유된 단일 샘플로부터 얻은 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 (a) 하나 이상의 분리된 세포를 수득하기 위해 세포들을 복수의 용기로 분배하는 단계; (b) 분리된 하나 이상의 세포로부터 얻은 주형을 사용하여 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계로서, 상기 증폭은 바코드 서열의 첨가를 야기하는 것인 단계; (c) 단계(b)에서 증폭된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 링크를 생기게 하는 단계; 를 포함하는 복수의 관심 비-인접 폴리뉴클레오티드 서열을 링크 및 바코딩하는 방법이다.
어떤 측면에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 헤비 및 라이트 체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 증폭은 RT-PCR 증폭을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 RT-PCR 증폭은 단일 단계 내에서 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 관심 폴리뉴클레오티드의 링크는 중복-확장 프라이머를 사용하는 RT-PCR 증폭 과정 중에 수행된다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (d) 바코드 서열 첨가 또는 링크 이전, 도중, 또는 이후에 시퀀싱 부위를 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 시퀀싱 부위는 어댑터로 첨가된다. 어떤 측면에서, 상기 방법은 (e) 넥스트젠(NextGen) 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 링크된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 시퀀싱 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 454 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SMRT 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLiD 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 SOLEXA 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 넥스트젠 시퀀싱 플랫폼은 tSMS 시퀀싱이다. 어떤 측면에서, 상기 하나 이상의 세포들은 6웰 이상, 12웰 이상, 24웰 이상, 48웰 이상, 96웰 이상, 384웰 이상, 1536웰 이상, 또는 그 이상의 웰을 가지는 플레이트에 함유된 것이다. 어떤 측면에서, 상기 하나 이상의 세포들은 각각 96웰 이상을 가지는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 또는 그 이상의 개수의 플레이트에 함유된 것이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-3’을 포함하고, 상기 A는 샘플 식별 부위(바코드 서열)이고, 상기 B는 단일 샘플로부터 얻은 제1 cDNA 부위이고, 상기 C는 링커 부위(linker region)이고, 상기 D는 동일한 단일 샘플로부터 얻은 제2 cDNA 부위이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-3’을 포함하고, 상기 A는 단일 샘플로부터 얻은 제1 cDNA 부위이고, 상기 B는 링커 부위(linker region)부위이고, 상기 C는 동일한 단일 샘플로부터 얻은 제2 cDNA 부위이고, 상기 D는 샘플 식별 부위(바코드 서열)이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
또한 본 명세서에 기재된 것은 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-3’을 포함하고, 상기 A는 단일 샘플로부터 얻은 제1 cDNA 부위이고, 상기 B는 샘플 식별 부위(바코드 서열)를 포함하는 링커 부위(linker region)부위이고, 상기 C는 동일한 단일 샘플로부터 얻은 제2 cDNA 부위이고, 상기 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 라이브러리이다.
어떤 측면에서, 상기 제1 cDNA 부위는 항체 헤비 체인을 포함하고 제2 cDNA 부위는 항체 라이트 체인을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 라이브러리는 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10000이상, 30000이상, 10,000이상, 30,000이상, 100,000이상, 300,000이상, 1,000,000이상, 3,000,000이상, 10,000,000이상, 30,000,000이상, 또는 그 이상의 멤버(members)를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 라이브러리는 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10,000이상, 30,000이상, 또는 그 이상의 세포 샘플의 전체 전사체의 유전자를 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 라이브러리는 개체의 혈액 내에 존재하는 1이상, 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 1000이상, 10,000이상, 100,000이상, 1,000,000이상, 10,000,000이상, 100,000,000이상, 또는 그 이상의 서로 다른 항체 종들을 포함한다. 어떤 측면에서, 상기 항체는 형질아세포, 형질세포, 기억B세포, 긴시간-생존하는 형질세포(long-lived plasma cells), 다른 B 계통 세포(B lineage cell) 또는 그들의 조합에 의해 발현된다.
이 것들 및 다른 특징, 측면, 및 이점은 하기 설명, 및 첨부된 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이고, 도면은:
도 1. B세포 분화. 성숙하고 순수한 B세포는 CD19+이고, 림프절, 및 지라와 같은 2차 림프 조직(secondary lymphoid tissues) 내의 항원적 대항(antigenic challenge)에 대해 증식 및 분화하기 위해 활성화 될 수 있다. 이들은 소포 외 집중 부위(extra-follicular foci) 또는 종자중심(germinal centers) 내에서 증식 및 분화한다. 소포 외 집중 부위에서 분화하는 B세포는 분화하여 전형적으로 짧은시간-생존하는 형질세포가 되고 보통 그들이 비롯된 2차 림프 조직에 있게된다. 종자 중심에서 B세포는 분화하여 추후의 항원적 대항을 통해 분화하도록 더 자극될 수 있는 기억 B세포, 또는 긴시간-생존하는 형질세포가 되는 잠재성을 가지고 있는 형질아세포가 될 수 있다. 이러한 형질아세포는 순환기로 들어갈 수 있고 골수(bone marrow), 점막 조직(mucosal tissues)(IgA+ 형질세포에 대한) 및 염증 조직(inflamed tissue)과 같은 긴시간-생존하는 형질세포가 있는 다양한 조직들로 수송된다. 몇몇 통과성 형질세포(transiting plasma cells)는 또한 혈액에 존재한다. 상기 언급된 모든 세포 타입은 또한 혈액의 순환에서 발견될 수 있다.
도 2. 단일 분류된 세포로부터 얻은 페어링된 유전자의 고 처리(high-throughput) 시퀀싱, 클로닝 및 발현의 도식. 목적하는 세포 개체군(cell populations)은 그들의 세포 표면 마커들의 발현에 근거하여 96-웰 PCR 플레이트들로 단일 세포 분류된다. 역전사 중에, 바코드된(샘플-IDs) DNA 어댑터 분자들은 MMLV H- 역전사 효소의 주형-전환 성질을 활용하여 합성된 1st 가닥 cDNA상으로 첨가된다. 그런 뒤 각 플레이트에서 얻은 RT 생산물을 개별적으로 모으고, 특정한 앰프리콘 부위(앰프리콘들)을 증폭하기 위해 PCR 2라운드(2 rounds)를 수행한다. PCR을 앰프리콘에 플레이트 식별 부위(플레이트-IDs)를 첨가하기 위해 5’ 측면 바코드를 갖는 프라이머로 행한다. 그런 뒤 앰프리콘을 454 시퀀싱으로 보낸다(a). 수득된 서열들은 서열 어셈블리(sequence assembly) 이전에 플레이트-IDs 및 샘플-IDs에 의한 서브세트(subset)이다. 동일한 세포에서 얻은 앰프리콘들을 플레이트-IDs 및 샘플-IDs를 사용하여 서로 페어링하고 목적하는 클론들을 클로닝 및 발현을 위해서 선택한다(b). 특정한 앰프리콘은 특정한 앰프리콘의 샘플-ID 에 대해 상보적인 클로닝 프라이머를 사용하는 것에 의하여 앰프리콘의 모아진 각 플레이트로부터 증폭될 수 있다. 클로닝 프라이머는 또한 제한 자리 부위(RS)를 첨가하고, 그런 뒤 하류 발현(downstream expression) 및 스크리닝을 위해 포유류 발현 벡터(mammalian expression vectors) 속으로 클론을 삽입하는데 사용된다. 상기 예시에서, 항체에 대해 부호화 하는 면역글로불린(Ig) 헤비 및 라이트 체인 유전자들이다. 그런 뒤 발현된 항체들은 하류 스크리닝을 위해 사용될 수 있다(c). 5’RS 및 3’RS : 각각 5’ 및 3’ 제한 자리. HC 및 LC : 각각 헤비체인 및 라이트 체인.
도 3. Ig 앰프리콘에 샘플-IDs 및 플레이트-IDs를 첨가하는 PCR 및 역전사의 도식. 역전사(RT)를 MMLV H- 역전사 효소인 수퍼스크립트 II 또는 수퍼스크립트 III으로 수행한다. 이러한 전사효소는 3’ 테일링(tailing) 활성을 가지고 한쌍의 시토신을 새롭게 합성된 1st 가닥 cDNAs의 3’말단에 첨가한다. -GGG로 끝나는 올리고뉴클레오티드(어댑터 부위)는 이것에 염기-페어을 보완할 수 있고 그런 뒤 역전사효소는 주형을 올리고뉴클레오티드로 전환하고 전사를 계속하고, cDNA의 3’말단에 대한 샘플-ID 어댑터의 추가를 야기한다(a). 샘플-ID 어댑터가 5’ 불변 서열(invariable sequence)(범용 프라이머 부위)을 함유하고 있으므로, 이 서열에 상보적인 포워드 프라이머는 추후의 PCRs을 위해 사용될 수 있다. 1st PCR을 Fw 롱 프라이머1, Fw 쇼트 프라이머1 및 GSP1로 행하였다. Fw 롱 프라이머1은 앰프리콘 내에 추가되는, 454시퀀싱을 위한 454 티타늄 프라이머 A 및 플레이트-ID 바코드를 함유하는 5’ 측면 부위를 가진다. Fw 쇼트 프라이머1은 GSP1 프라이머와 유사한 Tm을 가지고 PCR의 효율을 약간 증가시키기 위해 포함되었다. 각 GSP1(유전자-특이적 프라이머 1)은 상보적 유전자 특이적 서열을 가지고 특이적 유전자를 증폭하기 위해 사용되었다. 여기에서, 유전자-특이적 프라이머는 이러한 유전자를 증폭하는 카파 및 람다 라이트 체인 및 감마 헤비 체인을 위한 것이다. 프라이머를 위한 서열들을 나타냈다(b). 2차 PCR은 네스티드 PCR(nested PCR)이며 Fw 프라이머2, 롱 GSP2 프라이머 및 RV 프라이머2로 행하였다. 프라이머를 위한 서열들을 나타냈다. 롱 GSP2 프라이머는 앰프리콘 내에 추가되는, 454시퀀싱을 위한 454 티타늄 프라이머 B 및 플레이트-ID 바코드를 함유하는 5’ 측면 부위를 가진다. 롱 GSP2 프라이머는 다시 카파 및 람다 라이트 체인 및 감마 헤비 체인을 증폭한다. RV 프라이머2는 Fw 프라이머2와 유사한 Tm을 가지고 PCR 효율을 약간 증가시키기 위해 포함되었다. 프라이머를 위한 서열들을 나타냈다. RT 및 2 PCRs 후에, 각 앰프리콘은 96-웰 플레이트 상에서 그것의 위치를 결정하는 샘플-ID, 각각이 앰프리콘을 특정한 단일 세포-분리 96-웰 플레이트로부터 온 것이라고 식별하는, 두개의 동일한 플레이트-IDs, 및 454 시퀀싱을 위한 454 티타늄 프라이머 A 및 B를 가지게 된다.
도 4. 시퀀싱 및 클로닝 프라이머를 사용한 단일-세포 분리 B세포의 성공적인 증폭. 단일-세포 분리 B세포의 96-웰 플레이트를 도 1 및 도 2내의 도식에 나타낸 대로 역전사하고, 모으고, 증폭하였다. 카파 라이트 체인, 람다 라이트 체인, 및 감마 헤비 체인에 대한 밴드(bands)를 예상되는 크기에서 아가로스 겔 상에 시각화 하였다: 카파 및 람다에 대해 ~600bp 및 감마에 대해 ~700bp(a). 5’말단으로부터 얻은 감마 헤비 체인의 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)의 DNA 크로마토그램은 모아진 플레이트에 대한 다중 샘플-IDs에 상응하는 ‘가변’ 서열을 나타내었다(b). 3’말단 으로부터 얻은 카파 라이트 체인의 생어 시퀀싱은 불변 부위 후에 다중 라이트 체인과 상응하는 VJ 접합(junction)에서 시작하는 ‘가변’ 서열을 나타내었다(c). 웰 A1에 특이적인 클로닝 프라이머 페어를 카파 라이트 체인을 증폭하는데 사용하였다. 생어 시퀀싱은 (c)와 대조적으로 나타났고, 오직 하나의 깨끗한 서열만이 증폭되었다(d). 모든 결과는 다른 증폭된 면역글로불린 유전자들을 대표한다. M: 100bp DNA 래더(ladder), K: 카파 라이트 체인, L: 람다 라이트 체인, G: 감마 헤비 체인.
도 5. CCP+ RA환자들은 질병 활성과 연관이 있고 항-시트룰린 항체들을 분비하는 말초 혈액 형질아세포들 백분율들을 가진다 (CCP+ RA patients have peripheral blood plasmablasts percentages that correlated with disease activity and secreted anti-citrulline autoantibodies). 형질아세포는 CD19+CD20-CD27+CD38++이고 먼저 CD3-상에 게이팅되고 그런 뒤 (a)에 나타낸 대로 게이팅되었다. 말초 혈액을 동의를 얻은 RA 환자들로부터 수득하였고 형질아세포를 총 PBMCs의 백분율로 표시하였다. 만-휘트니 검정(Mann-Whitney test)은 CCP- RA 환자들보다 CCP+ RA환자들이 상당히 높은(p<0.05) 형질아세포 백분율을 가진다는 것을 나타내었다(b). 형질아세포 백분율은 선형 회귀로 CCP+ 환자들에서 임상 질병 활성 지수(clinical disease activity index, CDAI)와 상당히 관련되어 있다. 선형 회귀를 데이터세트의 정규성을 달성하기 위해 형질아세포의 백분율을 로그(log)로 변환하여 수행하였다(c). CCP+ 형질아세포들을 또한 모의-분류를 하였거나 또는 형질아세포들의 >95% 제거로 형질아세포-제거 분류를 겪게하였고 (d) 10% FBS로 보충된 RPMI에서 7일동안 배양하였다. 상등액을 취하고 루미넥스(Luminex)로 항-시트룰린화 펩티드(anti-citrullinated peptide) 반응성을 분석하였다. 각 펩티드에 대항하는 항체 반응성에 대한 평균 형광강도를 펩티드 반응성으로 표시하였다(e).
도 6. 중화 항체에 대한 클론의 스크리닝 및 선택을 위한 전략. 페어링된 LC 및 HC 항체 서열을 454-시퀀싱된 앰프리콘의 생물정보 분석으로부터 수득하였고 그들의 LC 및 HC V(D)J 용도에 근거하여 클론 패밀리들로 그룹핑하였다. 각 클론 패밀이 내에서 가장 높은 빈도로 발생하는 클론(들)은 선택적으로 클로닝되고, 발현되고, ELISA를 사용하여 관심 대상 항원에 결합하는지 스크린될 것이다. 결합 항체(binding antibodies)를 분비하는 전체 클론 패밀리로부터 얻은 대표적인 클론(들)은 그런 뒤 복제되고 중화 항체의 스크리닝을 위해 발현될 것이다. 각 항체 다이어그램(diagram)은 클론을 나타낸다.
도 7. 개별적인 인간 대상으로부터 유래된 클론 패밀리 및 면역글로불린 헤비 체인 V(D)J 서열의 특성화. 혈액을 하기 상태인 사람으로부터 수득하였다: (i) 만성적 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 골수염(osteomyelitis)인 사람으로 항생제를 섭취하지 않았으나(불이행으로 인하여) 그의 면역 시스템이 감염을 효과적으로 억제하고 항생제 없이 수개월 동안 전격 감염(fulminant infection)을 억제하는 사람; (ii) 집중 치료실로 이송되고 어그레시브(aggressive) 정맥 주사의 항생제 치료를 필요로 하는 급성 또는 전격 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균혈증(bacteremia)을 가진 사람; (iii) 만성 활성 류머티스성 관절염(chronic active rheumatoid arthritis, RA)(질병활성점수(disease activity scores, DAS)>5)을 가지는 3명의 사람; (iv) 3가 인플루엔자 백신(trivalent influenza vaccine)(Fluzone, Sanofi)을 맞은 후 7일된 사람; 및 (v) 사망할 것으로 예상되나 화학요법으로 장기적인 비-진행 상태(long-term non-progression)가 되는 전이성 폐 샘암종(metastatic lung adenocarcinoma)을 가진 사람. 모든 경우에, 인간 환자들은 활성화 면역 반응을 나타내는, 그들의 말초 혈액 형질아세포 수준(1.6-6% 범위의 형질아세포[CD20-CD19+CD38++CD27+]에 있는 말초 혈액 B세포, 정상 인간의 수준은 0.01-0.02%의 말초 혈액 B세포)에서 상승을 나타낸다. 형질아세포는 96-웰 플레이트 내로 분류된 단일-세포이고, 발현된 면역글로불린 cDNA의 바코딩 및 454 시퀀싱을 도 2 및 3에 기재된 대로 수행하였다. 생물정보 분석을 개별적인 형질아세포에 의해 발현된 헤비 및 라이트 면역글로불린들을 페어링 하기 위해 사용하였다. 개별적인 환자들에 대한 헤비 체인 V(D)J 용도의 퍼센트의 파이 차트 다이어그램(Pie chart diagrams)을 제시하였고-각각의 쐐기꼴(wedge)은 별개의 헤비 체인 V(D)J 서열 재배열을 발현하는 형질아세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 8. 인간 대상으로부터 얻은 면역글로불린 헤비 체인 V(D)J 서열들의 클러스터링(clustering)은 클론 패밀리 및 클론 서브패밀리를 입증한다. 표 7에 기재된 연구에서 생성된 면역글로불린 헤비 체인 서열 데이터세트를 프로그램 클러스탈(program Clustal)을 사용하여 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 하였다. 계층적 클러스터링은 각 개별적인 인간에서 항체 반응을 나타내는 진화계통수(evolutionary trees)를 산출하였다.
도 9. 모든 앰프리콘 및 하류 유틸리티(downstream utility)에 샘플-IDs 및 플레이트-IDs를 첨가하기 위한 PCR 및 RT의 도식. 단일 세포들 또는 다중 세포들을 포함하는 개별적인 샘플들을 웰들 내에서 독립적으로 역전사 시킨다. 역전사는 이전에 기재된바와 같이 샘플-ID 및 5’ 범용 프라이머 부위를 모든 1st 가닥 cDNA에 첨가한다. 플레이트의 모든 웰들로부터 얻은 cDNA를 모으고 2 라운드들의 PCR을 겪게한다. 1st PCR은 포워드 프라이머들로서 Fw 롱 프라이머 1, Fw 쇼트 프라이머1을 사용하고 454 시퀀싱을 위한 454 티타늄 프라이머 A를 서열의 5’말단에 첨가한다. Fw 쇼트 프라이머1은 GSP1 프라이머와 유사한 Tm 을 가지고 PCR 의 효율을 약간 증가시키기 위해 포함되었다. 각 GSP1 프라이머는 유전작 특이적 서열을 가지고 그 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있다. 프라이머들을 위한 서열들을 나타낸다. 어떤 유전자가 증폭되는지와 무관하게, 포워드 프라이머들은 불변으로 남는다는 것을 유의한다(b). 제 2 PCR은 네스티드 PCR이다. Fw 프라이머 2는 포워드 프라이머이고, 리버스 프라이머들은 롱 GSP2 프라미어 및 Rv 프라이머 2이다. 롱 GSP2는 유적자 특이적이고 오직 특이적 유전자만을 증폭한다. 이것은 또한 454 시퀀싱을 위한 454 티타늄 프라이머 B 및 플레이트-ID를 앰프리콘의 3’말단에 첨가한다. RV 프라이머2는 Fw 프라이머2와 유사한 Tm을 가지며 PCR 효율을 약간 증가시키기위해 포함되었다. 프라이머들을 위한 서열들을 나타낸다. RT 및 2 PCRs후에, 모든 플레이트들로부터 얻은 앰프리콘들을 모으고 454-시퀀싱 한다. 플레이트-IDs 및 샘플-IDs의 조합은 동일한 샘플로부터 비롯된 서열들의 식별을 가능하게 한다. 이는 다중 샘플들 간의 비교를 가능하게 한다. 동일한 오리진으로부터 얻은 서열들은 또한 T-세포 수용체 및 IgM, IgE 및 IgA와 같은 다른 Ig 이소타입들과 같은 오리지날 세포들로부터 얻은 정확한 단백질을 수득하는 페어들로 발현될 수 있다(c).
도 10. 면역글로불린 헤ㅁ비 및 라이트 체인들의 역전사(RT_GSPs)를 위한 유전자-특이적 프라이머들. RT-GSPs를 헤비 및 라이트 체인 유전자들의 역전사에서 프라이머들로서 올리고(dT) 대신에 사용하였다. cDNA를 그런 뒤 PCR에 의해 증폭시켰고 아가로오스 겔 상에 시각화하였다. RT-GSP 프라이머들 레인들 1-4에서 각각 IgKC_v3(a), IgLC_v5, IgLC_v6, IgLC_v7 및 IgLC_v8 (b), 레인들 1-4에서 각각 IgHGC_v10, IgHGC_v11, IgHGC_v13 및 IgGC_v15 (c) 및 IgHGC_v16 (d). 프라이머 이름들에서 KC, LC 및 GC는 각각 카파 체인, 람다 체인 및 감마 헤비 체인에 특이적인 프라이머인 것을 나타낸다. 겔 사진들 내의 백색 밴드들은 비-관련 레인들이 노출된 곳을 나타낸다.
도 11. 어댑터 부위 서열들. RNA를 3’종단 말단에 어댑터 부위 및 범용 프라이머 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드들과 함께 역전사시켰다. cDNA를 그런뒤 범용 프라이머 부위를 포워드 프라이머로서 그리고 유전자-특이적 서열들을 리버스 프라이머로서 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 생산물들을 아가로오스 겔 상에서 시각화하였다. 어댑터 부위들은 G (a), 레인 1 및 2에서 각각 GGGGG 및 rGrGrG로 구성된다(b). rG는 DNA 뉴클레오티드들 대신 RNA 뉴클레오티드들을 나타낸다.
도 12. 범용 프라이머 서열들. RNA를 3’종단 말단에 어댑터 부위 및 범용 프라이머 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드들과 함께 역전사시켰다. cDNA를 그런 뒤 범용 프라이머 부위에 대해 상보적인 포워드 프라이머 및 유전자 특이적 서열에 대해 상보적인 리버스 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. Univ_seq_4 (a), univ_seq_5 (b) 및 univ_seq_f (c). 겔 사진들 내의 수직의 백색 밴드들은 비-관련 레인들이 노출된 곳을 나타낸다. 그렇지 않으면 레인들은 동일한 겔 사진에 속한다.
도 13. 1st PCR 반응을 위한 유전자-특이적 프라이머 서열들. 유전자-특이적 리버스 프라이머들은 제1 PCR 반응에서 서열들의 증폭에 사용되었다. 1st PCR 반응 또는 추후의 2nd 네스티드 PCR 생산물들을 아가로오스 겔 상에서 러닝시키고(were run) 시각화하였다. 사용된 리버스 프라이머들은 레인들 1-3상에서 각각 IgKC_v4, IgLC_v5, IgHGC_v13 (a), 레인들 1-3 상에서 각각 K_GSP1, L_GSP1, G_GSP1 (b), 레인들 1-2 상에서 각각 K_GSP1c, L_GSP1c (c), 레인들 1-2 상에서 각각 G_GSP1 (d), L_GSP1d, G_GSP1g (e), 레인들 1-4 상에서 각각 G_GSP1h, G_GSP1k, L_GSP1f, L_GSP1g (f), 레인들 1-8 상에서 각각 G_GSP1d (g) L_GSP1h-o (h), 레인들 1-6 상에서 각각 G_GSP1m-q 및 G_GSP1t (i)이다. 프라이머의 이름들에서 K, L 및 G는 각각 카파, 람다 및 감마 면역글로불린 불변 부위들에 특이적인 프라이머인 것을 나타낸다. 각 겔은 레인 마커와 함께 왼쪽 상에서 출발하고 샘플 레인들이 뒤따른다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다.
도 14. 2nd PCR 반응을 위한 유전자-특이적 서열들. 유전자-특이적 서열들을 2nd PCR 반응의 서열들의 증폭에서 사용하였다. PCR 생산물들을 아가로오스 겔 상에서 러닝시켰고 시각화 하였다. 사용된 리버스 프라이머들은 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2, L_GSP2, G_GSP2 (a), 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2v2a, K_GSP2v2b, L_GSP2v2 (b), 레인들 1-4에서 각각 K_GSP2v2c, K_GSP2v2c, G_GSP2v2c1, G_GSP2v2c2 (c), 레인들 1-3 에서 각각 K_GSP2v2d-f (d), 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2v2g, L_GSP2v2d and G_GSP2b (e)이다. 프라이머 이름들 내의 K, L, G는 그들이 각각 카파, 람다 및 감마 면역글로불린 불변 부위들에 대해 특이적인 것임을 나타낸다. 각 겔은 레인 마커와 함께 왼쪽 상에서 출발하고 샘플 레인들이 뒤따른다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다.
도 15. 폴리뉴클레오티드 서열들의 링크된 페어를 식별하는 바코드 서열들의 잠재적 위치들. 도식들은 두 개의 핵산 절편들, A 및 B(예를 들어, 두 개의 cDNAs)의 물리적 링크를 설명한다. 바코드(BC)는 말단들 중 어느 하나, 또는 말단들 모두, 또는 A 및 B를 링크하는 서열 내의 어느 곳으로도 첨부된다. 일 구현예에서, A 및 B는 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인 서열들을 나타낸다.
도 16. 중복-확장 테일들의 서로 다른 타입들. 굵은 라인은 유전자 특이적 서열에 상응하고 얇은 라인은 중복되는 테일에 상응된다. 표시된 바와 같이, 중복은 전적으로 프라이머 서열의 중복 때문일 수 있고 또는 그 밖의 유전자 특이적 서열을 갖는 부분적인 또는 총 중복 때문일 수 있다. 표시된 바와 같이, 중복은 또한 바코드 서열을 함유할 수 있다. 구조들 I, II, 및 III은 중복들의 잠재적인 위치들을 나타낸다.
도 17. 항체 라이트 및 헤비 체인들의 링크된 페어에 대한 외부적 바코드의 도식 개관(Schematic overview). 역전사 반응의 생산물을 나타냈다. LC 유전자 특이적 PCR 프라이머는 바코드, 시퀀싱 프라이머 자리, 및 제한 자리(RE1)를 함유하고 이러한 요소들이 생성된 PCR 생산물의 3’말단에 첨가되어 지도록 가능케한다. 중복-확장들을 가지고 제한 자리(RE3)를 인코딩하는 LC 및 HC에 특이적인 프라이머들을 나타냈다. 시퀀싱 프라이머 자리 및 제한 자리(RE2)를 함유하는 HC에 특이적인 리버스 프라이머를 또한 나타냈다. 앰프리콘은 하나의 말단에서 바코드를 갖는것으로 나타낸 링크된 구조를 갖는 핵산을 야기한다.
도 18. 항체 라이트 및 헤비 체인들의 링크된 페어에 대한 내부적 바코드 첨가의 도식 개관. 올리고(dT) 프라이머들을 사용하는 mRNAs의 역전사가 원인인 cDNAs를 연결하는 바코드 서열들 및 확장 중복을 함유하는 어댑터들을 사용하는 방법을 나타냈다. 나타낸 방법은 역전사 효소의 3’ 테일링 및 주형 전환 활성들의 장점을 취하여 연결되어야 할 cDNAs에 중복-확장 서열들을 첨가한다. 이 예시에서, 어댑터들 중 하나는 연결되어야 할 cDNAs 중 하나에 바코드 및 중복-확장 서열 둘 모두를 첨가하며, 그 반면 연결되어야 할 다른 cDNA에는 오직 중복-확장 서열만이 첨가된다. 증폭 후에, 링크된 cDNAs 사이에 하나의 바코드 서열을 지니는 링크된 구조가 생성된다.
도 19. 범용 서열 중복-확장을 사용하는 항체 라이트 및 헤비 체인들의 링크된 페어에 대한 두 개의 내부적 바코드들의 첨가의 도식 개관. 올리고(dT) 프라이머들을 사용하는 mRNAs의 역전사가 원인인 cDNAs를 연결하는 바코드 및 범용 서열 둘 모두를 함유하는 어댑터들을 사용하는 방법을 나타냈다. 이 예시에서, 범용 서열에 대한 PCR 프라이머들은 연결되어야 할 각 cDNAs에 중복-확장 서열을 첨가한다. 나타낸 증폭 도식 이후에, 링크된 cDNAs 사이에 두 개의 바코드들을 지니는 링크된 구조가 생성된다.
도 20. 중복-확장 어댑터들을 사용하는 항체 라이트 및 헤비 체인들의 링크된 페어에 대한 두 개의 내부적 바코드들의 첨가의 도식 개관. 유전자 특이적 프라이머들(GSP)을 사용하는 mRNAs의 역전사가 원인인 cDNAs를 연결하는 중복-확장 서열 및 바코드 둘 모두를 함유하는 어댑터들을 사용하는 방법을 나타냈다. 이 예시에서, 각 cDNAs에 첨가된 어댑터들 상의 중복 확장 서열들은 어닐링에 의해 cDNAs의 연결을 가능하게 한다. 나타낸 증폭 도식 이후에, 링크된 cDNAs 사이에 두 개의 바코드들을 지니는 링크된 구조가 생성된다.
도 21. 역전사 중에 주형-전환 첨가된 어댑터들과 결합하는 바코드된 GPSs의 사용. RT를 총 PBMC RNA 및 univ_seq_2 주형-전환 올리고 및 IgKC_v3 GSP (레인 1-2) 및 제1 부분이 고정된_ PCR3 서열이고, 마지막 8bp가 바코드인 추가적인 5’플랭킹 서열을 갖는 IgLC_v5 GSP (레인 3-4)과 함께 수행하였다. RT 반응의 부분표본들을 추후의 PCR 반응들에서, 5’ 프라이머로서 5’ VK (레인 1) or VL (레인 3) 프라이머 또는 Univ_seq_2 (레인 2 및 4), 및 3’ 프라이머로서 고정된_ PCR3과 함께 사용하였다. 라인들 2 및 4내의 PCR 생산물을 도말표본(smear)으로서 러닝시켰으며, 이는 바코드된 GSPs 는 RT 반응에서 비-특이적이며, 주형-전환 첨가된 어댑터들과 함께 사용에 적절하지 않다는 것을 나타낸다.
도 22. 96-웰 안에서 단일 세포들의 흐름 세포측정법 분류를 위한 게이팅 도식. 형질아세포들은 CD19+CD20-CD27+CD38++로 정의된다. 단일 PBMCs를 그들의 FSC 및 SSC 프로파일(나타내지 않음)에 근거하여 제1 게이트 온 하였다. 생존 CD19+ B세포들을 그런 뒤 게이트온 하였고(왼쪽 패널), CD20- B세포들까지 더 좁혔고(왼쪽에서 2nd 패널), CD27+CD38++세포들로 정제하였다. 이로부터, IgG+ 형질아세포들은 세포 표면 IgG를 발현시키지 않으므로, IgG+ 형질아세포들을 IgA- 및 IgM- 로 정의하였다. 이 개체군을 96-웰 플레이트들 안에서 단일 세포 분류하였다.
도 23. 형질아세포들은 면역학적 대항을 겪은 사람들에게 존재한다. 형질아세포들은 대표적인 건강한 기증자에서 말초 혈액 B세포들의 0.15%를 구성했고, 감염(스태필로코커스 아우레우스 및 클로스트리디움 디시필리 감염들), 암(이필리무맙으로 치료에 의해서 >4년 동안 비-진행자였던 전이성 흑색종을 가지는 환자들 및 폐의 전이성 샘암종을 가지는 화학치료법을 받은 후에 >3년 동안 장기적 비-진행자였던 환자), 및 백신화(인플루엔자 바이러스 백신을 맞는것(receipt))을 포함하는 다양한 면역학적 대항들을 겪은 사람들에서는 0.5%-16.4%의 범위였다. 이는 형질아세포들이 활성화 체액성 반응을 특성화하는 항체 레파토리들의 고처리 시퀀싱을 위한 개별적인 형질아세포들의 분리를 위해 관심 면역 반응들을 시작하는 대상들의 범위로부터 상승되고 수득될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 24. 발현된 재조합 항체들은 순간적인 트렌스펙션들에서 2-3주 동안 분비되었다. 도 2에 개설된 것과 같이, 페어링된 헤비 및 라이트 체인 면역글로불린 cDNA를 PCR에 의해 클로닝시켰고 48-웰 스케일에서 293T 세포들 안으로 공동-트렌스펙션하였다. 상층액들을 하루 걸러 18일 동안 수집하였다. 항-인간 IgG ELISA를 수집된 상층액들에서 분비된 항체들의 양을 결정하는데 수행하였고, 공동-트렌스펙션체들의 패널의 상층액 내에서 항체들의 농도를 그래프화하였다. 분비는 9일 째에 최고치에 도달하는 경향을 보이고 18에서 점점 상당히 적어진다.
도 25. 인플루엔자 백신화된 인간으로부터 얻은 페어링된 항체 헤비 체인(HC) 및 라이트 체인(LC)은 상보성 결정 부위(complement determining regions, CDRs)들에 걸쳐서 변이를 나타낸다.
도 25a: 독감 항체들의 부분 계통수. 헤비 및 라이트 체인들의 페어링 이후에, 다중 서열 정렬을 헤비 체인을 위해서 생성하고, 또 다른 다중 서열 정렬을 라이트 체인을 위해서 생성하였다. 다중 서열 정렬들 둘 모두를 디폴트 파라미터들을 사용하여 Clustalw2 2.1를 사용해 생성하였다. 두 정렬들을 함게 연쇄시키고(concatenated) CLC Sequence Viewer v. 6.5.2 에서 100개의 부트스트랩 모사체(replicates)들을 갖는 인접 연결 방법을 사용하여 나무를 제작하는데 사용한다. 도 25b: 독감-백신화된 환자로부터 얻은 클론 패밀리를 위한 헤비 체인 CDRs. 도면에서 서열 목록의 서열 이름들에 상응하는 식별자들은 다음과 같고: 51.A11.1 = NA.51.11.A11.1.454.heavy.3.nb-aa, 49.A08.1 = NA.49.8.A08.1.454.heavy.3.nb-aa, 51.D07.1은 프레임 1내의 NA.51.40.D07.1.454.heavy.3.nb를 번역하는 것에 의해 수득되는 아미노산 서열이다. 도 25c: 독감-백신화된 환자로부터 얻은 클론 패밀리를 위한 라이트 체인 CDRSs. 도면에서 서열 목록의 서열 이름들에 상응하는 식별자들은 다음과 같다: 51.A11.1 = NA.51.11.A11.1.454.light.4.nb-aa, 49.A08.1 = NA.49.8.A08.1.454.light.4.nb-aa, 51.D07.1 = NA.51.40.D07.1.454.light.4.zerom50-aa.
도 26: 재조합 항-인플루엔자 항체들은 플루존 인플루엔자 바이러스 백신에 결합했다.
도 7에 기재된 인플루엔자 백신화된 인간들에 대해 생성된 헤비 및 라이트 체인 항체 레파토리 데이터세트의 진화계통수의 분석(도 8)은 식별된 클론 패밀리들의 대표적인 항체들을 선택하는데 수행하였다. 두 개의 클론 패밀리들 모두들뿐만 아니라 여러 개의 단항(singlet) 가지들 대표하는 선택된 항체들 헤비 및 라이트 체인들을 PCR에 의해 클로닝하였고 293T 세포들 안으로 공동-트렌스팩션하였다(도 2에 개설된 것으로서), 그리고 상층액들을 도 24에 기재되어 있는 대로 트렌스펙션체(transfectants)들 로부터 수집하였다. 재조합 항체들을 그런 뒤, ELISA 플레이트상에 코팅된 플루존 백신을 갖는 ELISA에 의해 플루존 인플루엔자 바이러스 백신(Sanofi)에 대한 반응성 여부를 테스트하였다. 재조합 인플루엔자 바이러스 항체들을 ELISA 플레이트 내에서 100ng/ml에서 배양하였고, 홀스래ㄷ쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)(HRP)-접합된 항-인간 IgG 항체를 항체 결합을 탐지하는데 사용하였다. TMB 기질 반응을 산 중단(acid stop)으로 냉각하기 전에 30분 동안 수행하게 하였다. 식별된 클론 패밀리들을 대표하는 다중 재조합 항체들은 인플루엔자 바이러스 백신에 결합했으나, 반면 다른 클론 패밀리들의 대표적인 재조합 항체들 및 “죽은 말단들(dead ends)”은 인플루엔자 백신에 결합하지 않았다.
도 27. 클론 패밀리들의 대표적인 재조합 항-인플루엔자 항체들은 피코몰 친화성(picomolar affinities)으로 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌들에 결합한다. ELISA검정법에서 인플루엔자 백신에 결합했던(도 26) 플루존-백신화된 인간(도 7)로부터 얻은 클론 패밀리들의 대표적인 재조합 항-인플루엔자 바이러스 항체들을 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기(instrument)(ProteOn System, Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 테스트하였고 인플루엔자 헤마글루티닌(백신에 존재하는 H3N2 A/Perth/16/2009 및 H1N1 A/California/07/2009 스트레인들 둘 모두)에 대한 그들의 결합친화성들을 결정하였다. 재조합 항-인플루엔자 바이러스 항체들을 EDAC-NHS 화학법을 사용하여 표면에 결합시키고, H3N2 퍼스(Perth) 및 H1N1 캘리포니아(California) 헤마글루티닌들을 독립적으로 리간드들로서 테스트하였고 분석물(analyte)로서 헤마글루티닌을 갖는다. Ka 컬럼은 온-레이트(on-rates)를 나타내고, Kd 컬럼은 오프-레이트(off-rates) 그리고 KD는 해리상수(dissociation constant)를 나타낸다. 다중 재조합 항체들은 피코몰 친화성으로 H3N2 퍼스 또는 H1N1 캘리포니아 헤마글루티닌 모두에 결합했다.
도 28. 미세중화 검정법에서 재조합 항-인플루엔자 항체들은 인플루엔자 바이러스 감염성을 중화한다. 플루존 ELISA 상에서 반응성을 나타내는 6개의 항체들(도 26)을 H1N1 California/07/2009 인플루엔자 바이러스 스트레인 및 H3N2 A/Perth/16/2009 인플루엔자 바이러스 스트레인, 플루존 백신 내의 3개의 인플루엔자 바이러스 스트레인들 중 2개를 사용하는 미세중화 검정법에서 테스트하기 위해 임상대행기관(contract research organization, CRO) Virapur, LLC, (San Diego, CA)로 보냈다. 6개의 재조합 항체들 중에서 5개가 미세중화 검정법에서 인플루엔자 바이러스를 중화했고, 마이크로그람 퍼 밀리리터 수준들 및 아마 서브-마이크로그람 퍼 밀리리터 농도들에서 감염성을 예방했다. 재조합 항체 F21은 H3N2 퍼스를 중화했고, 이것이 ELISA 검정법에서 플루존에 결합했음에도 불구하고 사용되었던 헤마글루티닌 분석물의 농도가 탐지될 수 있는 결합에 비해 너무 낮았기 때문에 이는 SPR 분석(도 27)에서 결합을 보이지 않았을 것이다.
도 29. 흐름 세포측정법에 의해 고정된 S. 아우레우스 에 결합된 재조합 항- 스태필로코커스. 아우레우스 항체들. 만성 스태필로코커스. 아우레우스 골수염(도 7에 기재된 것으로서)을 조절했던(항생제들 없이) 인간으로부터 생성된 헤비 및 라이트 체인 항체 레파토리의 진화계통수의 분석(도 8)은 식별된 클론 패밀리들의 대표적인 항체들의 선택을 가능하게 했다. 두 개의 클론 패밀리들 모두들뿐만 아니라 여러 개의 단항(singlet) 가지들 대표하는 선택된 항체들 헤비 및 라이트 체인들을 PCR에 의해 클로닝하였고 293T 세포들 안으로 공동-트렌스팩션하였다(도 2에 개설된 것으로서), 그리고 상층액들을 도 24에 기재되어 있는 대로 트렌스펙션체(transfectants)들 로부터 수집하였다. 그런 뒤 재조합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들을 고정된 S. 아우레우스에 대한 반응성 여부를 테스트하였다. 사용된 2차 항체는 FITC-접합된 마우스 항-인간 IgG였고, 샘플들을 BD LSR II 또는 LSR Fortessa상에서 분석하였다. 양성 염색의 백분율을 나타내고, 이는 음성 대조군들로서 2 개의 항-인플루엔자 항체들을 갖는다. 단백질 A가 2o 항체의 이소타입인 마우스 IgG2에 약하게 결합하므로, 2o 항체 단독으로는 백그라운드를 넘는 결합을 야기하지 않았다. 백그라운드 상에서 관찰된 염색은 단백질 A를 발현하는 S. 아우레우스의 우드 스트레인(Wood strain)의 작은 백분율에 대한 재조합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들의 결합 때문이다. (a). 흐름 세포측정법 플롯들(plots)은 두 개의 양성 결합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들, S6 및 S11을 위해서 이소타입-매칭된 음성 대조군 항-인플루엔자 항체들과 함께 나타낸다(b). S. 아우레우스에 대한 항-스태필로코커스. 아우레우스의 결합 수준은 사용된 항체의 양에 비례하였다. 검고 굵은 라인은 10ug/ml의 항체의 농도를 나타내고, 검은 점선 라인은 5ug/ml이고, 회색 점선 라인은 1ug/ml 이다(c).
도 30. 항- 스태필로코커스. 아우레우스 항체들은 S. 아우레우스 콜로니 형성 유닛들의 숫자를 감소시킨다. 연속적으로 희석되고 5% 트립티카아제 소이 아가(trypticase soy agar, TCA) 혈액 아가 플레이트들 상에서 하룻밤동안 성장시키기 전에, 재조합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들을 보체 소스(complement source)로서 아기 래빗 혈청과 결합하여 S. 아우레우스와 함께 배양하였다. 콜로니 형성 유닛들(CFJs)를 그런 뒤 계산하고 그래프화 하였다. 두개의 재조합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들(Ab-a 및 Ab-b)은 스태필로코커스. 아우레우스의 사멸을 야기했고 따라서 CFU/ml의 숫자를 감소시켰다.
도 31. 만성 스태필로코커스. 아우레우스 감염에 대한 효과적인 면역 반응을 시작하는 인간으로부터 생성된 재조합 항- 스태필로코커스. 아우레우스 항체들의 S. 아우레우스 항원 표적들의 식별. 단백질 용해물(lysate)을 임상 스태필로코커스. 아우레우스 분리주(isolate)로부터 생성하였다. 만성 스태필로코커스. 아우레우스 골수염 감염의 진행을 예방하였던 면역 반응을 시작하는 인간으로부터 얻은 항체 레파토리 내에서 식별된 클론 패밀리들의 대표적인 재조합 항-스태필로코커스. 아우레우스 항체들을 스태필로코커스. 아우레우스 Spa- 임상 분리주로부터 얻은 단백질들을 면역침전하는데 사용하였다. 면역침전물(immunoprecipitates)들을 SDS-PAGE에 의해서 분리하였고, 식별된 밴드들을 잘라내었고, 도면에 존재하는 면역침전된 단백질들을 식별하는데 질량 분석기(Agilent XCT-Plus ion trap mass spectrometer)를 사용하였다.
도 32. 전이성 폐 샘암종을 갖고 장기적인 비-진행자인 인간으로부터 얻은 항-폐 샘암종 항체들의 발생. 화학요법 후에 장기적인 비-진행자가 되었고 전이성 폐 샘암종을 가지는 인간은 지속적으로(persistently) 상승된 혈액 형질아세포들을 나타냈고, 이는 지속적으로 활성화된 면역 반응을 나타낸다(도 7). 환잗르의 말초 형질아세포들을 분류하였고, 항체 레파토리를 시퀀싱하였고, 클론 패밀리들의 대표적인 항체들(도 8)을 클로닝시키고 재조합적으로 발현시켰다. 식별된 클론 패밀리들 중 하나의 대표적인 것인, 발현된 재조합 항체들 중 하나는, 면역조직화학적 염색에서 비의존성(independent) 폐 샘암종에 결합했다. 그런 뒤 조직 검정법들을 이 항체의 반응성을 더 특성화하기 위해 사용하였다. 다중 비의존성 폐 샘암종, 편평상피세포 암종 및 건강한 폐 조직을 함유하는 조직 검정법들을 100ug/ml의 F(ab) 고트 항-인간 항체들로 하룻밤동안 블로킹하였다. 슬라이드들을 음성대조군으로서 항-인플루엔자 항체 또는 항-폐 샘암종 항체들로 염색하였고, 벡터 레드(Vector Red)로 시각화하였다. 슬라이드들을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색하였다. 헤마톡실린 블루 색깔을 포토샵(Photoshop)을 이용하여 제거하였고 그리하여 이미지에서 핵들(nuclei) 및 벡터 레드(레드) 염색만이 더 어두운 회색으로 나타난다. 이 재조합 항체는 테스트된 5개의 비의존성 폐 샘암종 조직 샘플들(조직 검정법에 함유된) 중 4개에 결합했으나, 폐 편평상피 세포 암종 또는 건강한 폐 조직에는 결합하지 않았다.
도 33. 식별된 항-폐 샘암종 항체(도 32)는 폐 샘암종 세포주의 표면에 결합한다. 재조합 항-폐 샘암종 항체(도 32)는 폐 샘암종 세포주 H1650의 표면을 강하게 염색했고, 오직 신장 상피세포 및 폐 편평상피 종양 세포주들의 낮은-수준 염색만을 나타냈다. 이 항-폐 샘암종 항체는 제2 폐 샘암종 세포주(H2009)에는 결합하지 않았고, 이는 면역조직화학법으로 테스트된 5개의 비의존성 폐 샘암종 조직 샘플들 중 4개에 이 항체가 결합했다는 우리의 관찰과 일치한다(도 32).
도 34. 류머티즘성 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 환자들로부터 얻은 류머티즘성 인자 항체들의 생성. RA를 가지는 인간들로부터 생성된 항체 레파토리들의 진화계통수들 내에서 식별된 클론 패밀리들의 대표적인 재조합 항체들(도 8)을 선택하였고, 클로닝 하고 재조합적으로 발현시켰다. RA환자들롭루터 유래된 재조합 항체들을 직접 ELISA에서 1차 항체(primary antibody)로서 사용하였고 항-인간 IgG-HRP를 2차 항체로서 사용하였고, TMB기 기질로 결합을 시각화하였다. 재조합 항체들 RA2 및 RA3은 반응성을 나타냈고, 따라서 류머티즘성 인자 항체들을 나타낸다.
도 35. RA 환자들로부터 얻은 항-CCP 및 항-히스톤 2A 항체들의 생성. 활동적인 질병들을 갖는 RA 환자들로부터 생성된 추가적인 재조합 항체들을 히스톤 2A ELISA 및 사이클릭-시트룰린화 펩티드(cyclic-citrullinated peptide, CCP) ELISA(CCP2 ELISA 키트[Axis Shield]를 사용)를 사용하여 특성화하였다. 재조합 항체들을 125ug/ml에서 사용하였다. 패널(a)는 히스톤 2A ELISA, 및 히스톤 2A에 결합된 다중 재조합 항체들로부터 얻은 결과들을 나타낸다. 패널(b)는 CCP2 ELISA, 및 양성 반응성을나타내는 여러 개의 재조합 항체들로부터 얻은 결과들을 나타낸다. 항-CCP2 ELISA는 하나의 혈청반응음성 및 2개의 혈청반응양성 대조군들을 포함한다. 두 검정법 모두에 대해, 판독(readout)으로서 흡광도를 기록하였다. 백그라운드(점선 라인) 상의 흡광도 값들을 양성이 되도록 고려하였다.
도 36. 활동적인 RA 환자들로부터 얻은 항-히스톤 2A 항체들의 생성을 증명하는 확증적인 비의존적 실험. RA 환자 진화계통수들로부터 유래된 재조합 항체들(도 8 및 도 35)을 히스톤 2A ELISA 검정법에서 더욱 테스트하였다. 항체들을 도 35에서 사용된 것인 30ug/ml에서, 4-배 낮은 농도로 사용하였다. 판독으로서 흡광도를 기록하였다. 백그라운드 상의 흡광도 값들을 양성이 되도록 고려하였다.
도 37. RA 항원 검정법들을 사용하는 항-히스톤 및 항-시트루린화 단백질 항체들의 식별. RA 환자들로부터 유래된 항체들을 자연적 및 시트룰린화 단백질들 및 펩티드들의 스펙트럼을 함유하는 RA 항원 검정법을 조사하는데 사용하였다. Cy-3-표지된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 배양한 후에, 재조합 항체 결합을 Axon Instruments GenePix 마이크로어레이 스캐너(microarray scanner)로 스캐닝하는 것에 의해 수량화 하였다. 반응성을 히트맵(heatmap)으로 디스플레이 한다. RA 로부터 유래된 재조합 항체들은 여러 개의 별개인 시트룰린화 또는 자연적 항체들에 결합했다.
도 38. 퍼시픽 바이오사이언스즈 시퀀싱(Pacific Biosciences sequencing)은 IgG 헤비 체인 앰프리콘의 완전한-길이의 시퀀싱 리드들을 제공한다. 플레이트 44로부터 얻은 IgG 헤비 체인 앰프리콘들을 SMRT시퀀싱을 위해 퍼시픽 바이오사이언스즈에 제공하였다. 선택된 웰들에 상응하는 바코드들을 가지는 환형 공통 서열(circular consensus sequence, CCS)의 숫자를 나타낸다.
도 39. 혈액 형질아세포들을 식별하는 대체적인 세포 표면 마커들 및 다른 세포성 특징들의 사용. 형질아세포들은 다양한 세포 표면 마커들 및/도는 세포성 특징들을 통해 식별되고 분류될 수 있다. 패널(a)는 형질아세포들이 휴지 B 세포들 보다 더 높은 전방 산란(FSC)을 나타낸다는 것을 입증한다. 형질아세포들을 CD19+CD20-CD27+CD38hi 염색에 근거하여 식별하였으며, 이러한 결과들은 B세포들(회색)이 형질아세포들(검은색)보다 더 작다는 것을 입증한다. 패널 (b)는 FSC와 결합된 항-CD19염색의 사용이 72% 형질아세포들을 포함하는 B세포들의 개체군을 식별한다는 것을 입증한다. 패널 (c)는, CD19+ B 세포들의 개체군에 대해 (세포들을 CD19 양성의 존재로서 사전-게이팅하였다), 측방 산란(SSC) 및 FSC가 37% 형질아세포들을 함유하는 B세포들의 개체군을 식별하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 패널(d-f)은 CD19+ B 세포 개체군 내에서 형질아세포들을 식별하는 여러가지 접근법들을 나타낸다. FSChi 세포들을 게이팅 온(Gating on)하는 것은 37% 순도의 형질아세포들을 제공한다(c). FSChiCD20- 세포들을 게이팅 온 하는 것은 형질아세포들에서 71% 순도를 제공했다(d). FSChiCD38+ 세포들을 게이팅 온 하는 것은 형질아세포들에서 80% 순도를 제공했다(e). FSChiCD27+ 세포들을 게이팅 온 하는 것은 형질아세포들에서 44% 순도를 제공했다(f).
도 40. 인간 블라스팅 B세포들(형질아세포들)은 휴지 B세포들보다는 크지만 평균적으로 단핵구들보다는 작다. 단항 단핵구들(Singlet monocytes), B세포들, 및 형질아세포들을 게이팅하였고 측방- 및 전방-산란 파라미터들로 비교하였다. 단핵구들을 그들의 특징적인 FSC 및 SSC 프로파일에 의해 정의하였고, CD19-CD3-로서 정의했다. B세포들을 CD19+CD20+로서 정의하였다. 형질아세포들을 CD19+CD20-CD27+CD38++ 로서 정의하였다. FCS-A(전방 산란 면적) 및 SSC-A(측방 산란 면적) 축들 상에 세포들을 나타냈다(a). FSC-W(전방 산란 너비) 및 SSC-W(측방 산란 폭) 축들 상에 세포들을 나타냈다(b). 형질아세포들의 FSC-A, SSC-A, FSC-W, SSC-W의 정중을 휴지 B세포들 또는 단핵구들의 그것으로 나누었으며 세포 타입들 간에 크기 관계를 나타내는 비율(ratio)을 수득한다(c). 형질아세포들의 20th 백분위수의 FSC-A, SSC-A, FSC-W, SSC-W의 정중을 휴지 B세포들 또는 단핵구들의 정중으로 나누었으며 세포 타입들 간에 크기 관계를 나타내는 비율(ratio)을 수득하였고 상기 80% 이상의 형질아세포들은 비율보다 크다(d). 오류 바들은 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 41. 현미경 검사에 의해 휴지 B세포들과 비교된 인간 형질아세포들의 크기. 형질아세포들 및 휴지 B세포들을 각각 CD19+CD20-CD27+CD38++ 및 CD19+CD20+ 로서 분류하였다. 세포들을 그런뒤 200x에서 올림푸스 현미경(Olympus microscope)을 사용하여 이미지화 하였다. 세포 면적을 이미지제이(ImageJ)를 사용하여 결정하였고 직경= 2 x 반지름(radius)이고, 부피가 4/3 x πr3 로 정의되는 것인 면적(area)=π x r2를 사용하여 직경을 결정하였다. 오류 바들은 4분위수 범위(inter-quartile range)를 나타낸다. ≥8uM 또는 ≥50uM2 또는 ≥268uM3의 컷-오프는 96%의 형질아세포들을 포함할 것이고 92%의 휴지 B세포들을 제외할 것이다.
도 42. 수퍼스크립트 III은 50 o C 이하의 온도에서 주형 전환 활성을 가진다. rGrGrG로 끝나는 어댑터를 사용하는 상기 레인들에 나타난 온도들을 사용하여 역전사(RT)를 90분 동안 수행하였고, 1 라운드의 PCR을 3’프라이머로서 GAPDH GAPDH를 사용하여(서열 ATGGTTCACACCCATGACG) 수행하였다. 보여지는 바와 같이, 어댑터 상에 첨가하는 주형 전환 활성은 55oC에서는 보여질 수 없으며, 주형 전환 활성은 최소 50oC에서부터 가장 높게는 42oC에 까지 증가하며, ~450bp에서 밴드의 밝기에 의해 나타낸 것으로서, 가장 낮은 온도를 테스트하였다. 마커는 100bp 마커이다. 수퍼스크립트 III은 RNAse H 활성의 손실을 야기하는 특이적 돌연변이체를 가지고, 또한 내열성을 증가시키는폴리머라아제 도메인을 만들었던 돌연변이체를 가지고 50oC의 RT 온도에서 220분의 반감기를 갖는 MMLV 역전사효소들이다. 더 높은 내열성을 위해 조작된 다른 MMLV H- 효소들도 비슷한 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
도 43: 인간 카파, 람다 및 감마 불변 부위들을 위한 추가적인 프라이머들. 이러한 프라이머들을 1st PCR을ㅇ ㅟ해서 사용하였고, 그런 뒤 2nd PCR을 표 1의 프라이머들을 사용하여 수행하였고 PCR 생산물들을 2% 아가로오스 겔 상에서 분리하였고 이미지를 취하였다. 1st PCR을 위해서 사용된 프라이머들은 각각 카파 GPS1, 카파 GSP1e, 카파 GSP1f, 람다 GSP1, 람다 GSP1x 및 람다 GSP1y이다. 서열들은 표 10에 있다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다.
도 44. 다른 인간 불변 부위들 및 유전자들을 위한 추가적인 프라이머들. 1st 및 2nd PCR을 수행하였고 생산물들을 2% 아가로오스 겔 상에서 러닝시켰고 이미지화 하였다. 레인들은 왼쪽에서부터: 마커, 뮤, 알파 불변 부위들, TCR 알파(a) 및 마커, TCR 베타 (b)이다. 사용된 프라이머들 및 서열들은 표 10에 있다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다.
도 45. 마우스 유전자들을 위한 추가적인 프라이머들. 1 st 및 2 nd PCR을 수행하였고 생산물들을 2% 아가로오스 겔 상에서 러닝시켰고 이미지화 하였다. 레인들은 왼쪽에서부터: 마커, 카파, 람다, 람다, 람다, 람다 라이트 체인들 및 뮤 헤비 체인이다. 4 개의 람다 레인들은 사용된 프라이머들의 이 조합을 가진다: 마우스_람다_GSP1a 와 마우스_람다_GSP2a, 마우스_람다_GSP1a 와 마우스 _람다_GSP2b, 마우스_람다_GSP1b 와 마우스_람다_GSP2a, 및 마우스_람다_GSP1b 와 마우스_람다 GSP2a (a). 마커 및 알파 헤비 체인(b). 감마1, 2a, 2c 헤비 체인들과 각각 mo_g12_GSP2d 및 mo_g12_GSP2e를 사용하는 2nd PCR, 마커(c). 마커, 감마 3 헤비 체인과 각각 mo_g3_GSP2d, mo_g3_GSP2e 를 사용하는 2nd PCR 그 뒤에 이어 감마 2b 헤비 체인과 각각 mo_g2b_GSP2d, mo_g2b_GSP2e를 사용하는 2nd PCR (d). 마커, TCR 알파 (e). 마커, TCR 베타(f). 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다.
도 46. HL-60 뉴트로필 세포주에 의한 S. 아우레우스 의 항- S. 아우레우스 항체-매개된 사멸. 다양한 재조합 항-S. 아우레우스 항체들을(스태필로코커스 1, 스태필로코커스 4, 스태필로코커스 6, 스태필로코커스 7, 스태필로코커스 9, 스태필로코커스 12)를 4oC에서S. 아우레우스와 함께 30분 동안 배양하였고, 비-결합된 항체들을 씻어낸 후에, S. 아우레우스를 활성화 HL-세포들 및 아기 래빗 보체들과 함께 45분동안 37oC에서 배양하였다. 세포들을 그런 뒤 두번 세척하고 세포 밖 박테리아들을 연속적으로 5% TSA 혈액 아가 플레이트들 상에서 플레이팅(plated on)하였고, 하룻밤동안 배양하였으며, 콜로니 형성 유닛들(CFUs)을 계산하였다. 재조합 항체들 스태필로코커스 6, 스태필로코커스 9, 스태필로코커스 12는 20% 보다 큰 S. 아우레우스의 사멸을 유도한다.
조성물
폴리뉴클레오티드
어떤 측면에서, 조성물은 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어“폴리뉴클레오티드(들)”은 DNA 분자 및 RAN 분자 및 그들의 유사체(예를 들어, 뉴클레오티드 유사체를 사용하거나 핵산 화학법을 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA)와 같은 핵산을 나타낸다. 목적하는 대로, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 기술분야에서-알려진(art-recognized) 핵산 화학법을 사용하는 것과 같이 인공적으로 또는 예를 들어, 폴리머라아제를 사용하는 것과 같이 효소적으로 준비될 수 있으며, 원한다면, 변형(modified)될 수 있다. 전형적인 변형은 메틸화, 바이오티닐화, 및 다른 기술분야에서-알려진 변형을 포함한다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 원하는 곳에서 탐지가능한 모이에티(detectable moiety)에 링크될 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함할 수 있다.
“G,” “C,” “A,” “T” 및 “U” 각각은 일반적으로 각각, 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘을 함유하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 그러나, 용어“리보뉴클레오티드” 또는 “뉴클레오티드”는 또한 변형된 뉴클레오티드 또는 서로게이트(surrogate) 치환 모이에티를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 치환 모이에티를 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 페어링(base pairing) 성질들을 실질적으로 바꾸지 않으면서 다른 모이에티들로 치환될 수 있다는 것은 통상의 기술자(skilled person)가 잘 알고있다. 예를 들어, 제한 없이, 그것의 염기로서 이노신(inosin)을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드들과 염기 페어링을 할 수 있다. 이런 이유로, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드들은 뉴클레오티드 서열 내에서 예를 들어, 이노신을 함유하는 뉴클레오티드로 치환 될 수 있다. 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 어느곳에서든 아데닌 및 시토신은 각각 표적 mRNA와 G-U 워블 염기 페어링(Wobble base pairing)을 형성하기 위해, 구아닌 및 우라실로 치환될 수 있다. 이러한 치환 모이에티들을 포함하는 서열들은 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 적합하다.
다르게 나타내지 않는 한, 본 명세서에서, 제2 뉴클레오티드 서열과 관계된 제1 뉴클레오티드 서열을 기재하곤 할 때, 사용된 용어 “상보적(complementary)”은 통상의 기술자에게 이해되는 것으로서, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하여 특정한 조건에서 제2 뉴클레오티드 서열과 2중 구조(duplex structure)를 혼성화하고 형성하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 이러한 조건은 엄격한 조건 일 수 있고, 엄격한 조건은: 400 mM의 NaCl, 40 mM의 PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12-16 시간 동안 50oC 또는 70oC 뒤이어 세척하는 것을 포함할 수 있다. 유기체의 내부에서 마주칠 수도 있는 생리적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건은 적용할 수 있다. 통상의 기술자는 혼성화된 뉴클레오티드들의 최종적인 적용에 따라서 두 서열들의 상보성 시험에 가장 적합한 조건의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
상보적 서열들은 길이 또는 하나 또는 두 뉴클레오티드 서열의 길이의 부분에서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 지역에 대한 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 부위의 염기 페어링을 포함한다. 이러한 서열들은 본 명세서에서 서로에 대하여 “상보적” 으로서 나타낼 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 제2 서열에 대하여 “실질적으로 상보적(substantially complementary)”으로 나타낼 수 있는 제1 서열에서는, 두 서열이 상보적이거나, 또는 그들이 하나 이상을 함유 할 수 있으나, 일반적으로 염기-페어링된(base-paired) 부위 내에서 약 5, 4, 3, 또는 2개 이상으로 염기 페어들(base pairs)이 불일치되지는 않는다. 불일치된 염기 페어들을 가진 두 개의 서열들에서, 두 개의 뉴클레오티드 서열들이 염기-페어링을 통해서 서로 결합되어 있는 동안에는 그 서열들은 “실질적으로 상보적”인 것으로 고려된다.
본 명세서에서 사용된, “상보적”인 서열들은 또한 그들의 혼성화하는 능력에 대한 상기 구현예들이 실현되는 한에 있어서는, 비-왓슨크릭 염기 페어들(non-Watson-Crick base pairs) 및/또는 비-자연적 및 변형된 뉴클레오티드들로부터 형성된 염기 페어들을 포함하거나, 또는 그것으로부터 전적으로 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기 페어들은 G:U 워블 또는 훙스테인(Hoogstein) 염기 페어링을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
2이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서, 용어인 퍼센트 “상동성”은 하기에 기재된 서열 비교 알고리즘(예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 통상의 기술자가 사용할 수 있는 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 시각적 검사로 측정한 것으로서 최대 유사성에 대해 비교하고 배열했을 때, 동일한 뉴클레오티드들 또는 아미노산 잔기들의 특정한 백분율을 가지고 있는 둘 이상의 서열 또는 서브서열(subsequence)을 나타낸다. 적용에 따라, 퍼센트 “상동성”은 예를 들어, 기능적 도메인(functional domain)과 같은 비교되는 서열의 부위에 걸쳐 존재할 수 있고, 또는 대안적으로, 비교되는 두 개의 서열들의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 비교되는 실험 서열에 대해서 기준 서열의 역할을한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 실험 및 기준 서열들은 컴퓨터에 입력되고, 서브서열 좌표가 지정되고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 서열 비교 알고리즘은 그런 뒤 지정된 프로그램 파라미터에 근거하여 기준 서열에 관한 실험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 상동성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 배열은 예를 들어, 지역적 상동성 알고리즘(local homology algorithm of Smith ＆ Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 상동성 배열 알고리즘(homology alignment algorithm of Needleman ＆ Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), 유사성 방법에 대한 검색(search for similarity method of Pearson ＆ Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 시행 (Wisconsin Genetics Software Package 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 by 시각적 검사 (일반적으로 Ausubel et al., infra를 인용한다) 에 의하여 수행 될 수 있다.
퍼센트 서열 상동성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한 예시는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석들을 수행하기 위한 소프트웨어는 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information)의 웹사이트를 통해서 공개적으로 이용가능하다.
동일한 서열들은 하나 또는 두 뉴클레오티드 서열들의 전체 길이에 걸쳐 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 100% 상동성인 제1 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 서열들은 본 명세서에서 서로에 대하여“완전히 동일한”것으로서 나타낼 수 있다. 그러나, 어떤 측면에서, 본 명세서에서 제2 서열에 대하여 “실질적으로 동일한” 것으로 나타내는 제1서열에서는, 두 서열들이 완전히 상보적일 수 있고, 또는 그들이 하나 이상을 가질 수 있으나, 일반적으로 배열 상에서 5, 4, 3, 또는 2 이상의 뉴클레오티드가 불일치되지는 않는다. 어떤 측면에서, 본 명세서에서 제2 서열에 대하여 “실질적으로 동일한” 것으로서 나타내어지는 제1 서열에서는, 두 서열들은 완전히 상보적일 수 있으며, 또는 그들은 서로 약 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 것일 수 있다.
본 명세서에서 제2 서열의 상동성에 대하여 “별개의(distinct)” 것으로서 나타내어지는 제1 서열에서는, 두 서열들이 배열 상에서 하나 이상의 불일치된 뉴클레오티드를 가진다. 어떤 측면에서, 별개인 서열들은 배열 상에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 또는 그 이상의 불일치하는 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 어떤 측면에서, 별개인 서열들은 서로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 미만으로 동일한 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 본 명세서에서 제2 서열에 대하여 “별개의” 것으로서 나타내어지는 제1 서열에서는, 두 서열들이 실질적으로 또는 완전히 동일한 서열들을 가질 수 있으나, 대신 서열들 내에서 서로 다른 변형 패턴에 근거하여 다른 하나와 서로 다르다. 이러한 변형들은 예를 들어, 메틸화와 같이 일반적으로 본 발명의 기술분야에 알려져 있다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리 내에 존재할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 각 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 폴리뉴클레오티드는 단일 샘플로부터 유래된 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 단일 샘플은 B세포와 같은 단일 세포를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열들을 설명하기 위해 통상적인 표기법을 사용한다: 단일-가닥 뉴클레오티드의 왼쪽 말단은 5’-말단이며; 이중-가닥 뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5’-방향을 나타낸다. 초기 RNA 전사에 대한 뉴클레오티드들의 5’에서 3’첨가의 방향은 전사 방향을 나타낸다. mRNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥은 “코딩 가닥(coding strand)”으로 나타내고; 그 DNA 로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 가지는 DNA상에 있고 RNA 전사의 5’부터 5’-말단에 위치하는 서열들은 “상류 서열(upstream sequences)”으로 나타내고; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥 상에 있고 부호화 RNA 전사의 3’부터 3’말단인 서열들은 “하류 서열(downstream sequences)”로 나타낸다.
“메신저 RNA” 또는 “mRNA” 용어는 인트론이 없고 폴리펩트드로 번역될 수 있는 RNA를 나타낸다.
“cDNA” 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태에서 mRNA와 상보적이거나 동일한 DNA를 나타낸다.
“앰프리콘” 용어는 예를 들어, RT-PCR과 같은 핵산 증폭 반응의 증폭된 생산물을 나타낸다.
“혼성화(hybridize)” 용어는 상보적 핵산과 서열 특이적인 비-공유 결합 상호작용을 나타낸다. 혼성화는 핵산 서열의 모든 또는 부분에서 발생할 수 있다. 통상의 기술자는 핵산 두가닥(nucleic acid duplex), 또는 혼성체(hybrids)의 안정성은 Tm에 의해 결정될 수 있다는 것을 알 것이다. 혼성화 조건에 관한 추가적인 안내(Additional guidance)는: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6 및 : Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3 에서 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용된, “부위(region)”는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 인접한 부분을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 부위들의 예들은 식별 부위, 샘플 식별 부위, 플레이트 식별 부위, 어떤 측면에서, 및 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 부위들을 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 2미만, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 또는 그 이상의 부위들을 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 부위들은 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 부위들은 작동적으로 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 부위들은 물리적으로 커플링 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, “가변 부위”는 재조합 이벤트(recombination event)로부터 발생한 가변 뉴클레오티드 서열을 내며, 이는 예를 들어 면역글로불린의 V, J, 및/또는 D 부위 또는 활성화 T세포 또는 활성화 B세포와 같은 관심 T세포 또는 B세포로부터 분리된 T 세포 수용체 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, “B세포 가변 면역글로불린 부위”는 B세포로부터 분리된 가변 면역글로불린 뉴클레오티트 서열을 나타낸다. 예를 들어, 가변 면역글로불린 서열은 기억 B세포, 활성화 B세포, 또는 형질아세포와 같은 관심 B세포로부터 분리된 면역글로불린 서열의 V, J, 및/또는 D 부위를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “식별 부위”는 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 추후(later) 식별을 위해 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 커플링 할 수 있는 뉴클레오티드 서열 라벨(label)(예를 들어, 특유한 바코드 서열)을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 “면역글로불린 부위”는 항체의 하나 또는 두 개의 체인들(헤비 및 라이트)로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열의 인접한 부분을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 “어댑터 부위”는 제1 뉴클레오티드 서열을 제2 뉴클레오티드 서열에 커플링하는 링커를 나타낸다. 어떤 측면에서, 어댑터 부위는 링커로 작용하는 뉴클레오티드 서열의 인접한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터 부위는 서열 GGG를 가질 수 있으며 GGG 및 CCC 사이에 결합하는 것을 통해 제1 서열을 제2 서열에 커플링 한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 샘플 식별-어댑터 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 어댑터 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 범용 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 앰프리콘 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 플레이트 식별 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 플레이트 식별 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 플레이트 식별 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제한 자리 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 제한 자리 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 제한 자리 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 시퀀싱 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 시퀀싱 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 시퀀싱 부위를 포함할 수 있다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 복수의 임의의 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 제1 식별 부위 및 제2 식별 부위는 동일하거나 실질적으로 동일하다. 어떤 측면에서, 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위는 별개의 것이다. 어떤 측면에서, 식별 부위는 가변 면역글로불린 부위와 커플링 된다.
어떤 측면에서 부위의 서열은 PCR 반응 내에서 프라이머 또는 프로브에 대해 표적 서열의 역할을 하기에 충분한 길이 이상일 것이다. 어떤 측면에서, 부위는 1 내지 5000 염기 페어들 초과의 길이 일 수 있다. 예를 들어, 부위는 길이가 예를 들어, 2-30 뉴클레오티드들인 1-10,000 뉴클레오티드들로부터 온 것일 수 있으며, 그들 사이의 모든 서브-범위(sub-ranges)를 포함한다. 비-제한 예들로서, 부위는 1-30 뉴클레오티드들, 1-26 뉴클레오티드들, 1-23 뉴클레오티드들, 1-22 뉴클레오티드들, 1-21 뉴클레오티드들, 1-20 뉴클레오티드들, 1-19 뉴클레오티드들, 1-18 뉴클레오티드들, 1-17 뉴클레오티드들, 18-30 뉴클레오티드들, 18-26 뉴클레오티드들, 18-23 뉴클레오티드들, 18-22 뉴클레오티드들, 18-21 뉴클레오티드들, 18-20 뉴클레오티드들, 19-30 뉴클레오티드들, 19-26 뉴클레오티드들, 19-23 뉴클레오티드들, 19-22 뉴클레오티드들, 19-21 뉴클레오티드들, 19-20 뉴클레오티드들, 20-30 뉴클레오티드들, 20-26 뉴클레오티드들, 20-25 뉴클레오티드들, 20-24 뉴클레오티드들, 20-23 뉴클레오티드들, 20-22 뉴클레오티드들, 20-21 뉴클레오티드들, 21-30 뉴클레오티드들, 21-26 뉴클레오티드들, 21-25 뉴클레오티드들, 21-24 뉴클레오티드들, 21-23 뉴클레오티드들, 또는 21-22 뉴클레오티드들로부터 온 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 부위는 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 또는 그 이상의 뉴클레오티드들 일 수 있다. 어떤 측면에서, 부위는 그 길이가 50 미만, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 또는 1000 뉴클레오티드 초과일 수 있다. 어떤 측면에서, 부위는 그 길이가 1000 미만, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 4000-5000, 5000-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000, 9000-10000, 또는 10000 뉴클레오티드 초과일 수 있다. 어떤 측면에서, 부위는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드의 둘 이상의 뉴클레오티드들, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 또는 그 이상의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.
용어“샘플”은 대상(예를 들어, 포유류 대상, 동물 대상, 인간 대상, 또는 비-인간 동물대상)으로부터 얻은 RNA, DNA, 단일 세포 또는 다중 세포 또는 세포의 단편(fragments) 또는 체액의 부분표본(aliquot)을 포함할 수 있다. 샘플들은 원심분리, 정맥천자(venipuncture), 채혈(blood draw), 배설물(excretion), 스와빙(swabbing), 사정(ejaculation), 마사지(massage), 생체검사(biopsy), 침 흡인(needle aspirate), 세척 샘플(lavage sample), 찰과표본(scraping), 외과적 절개(surgical incision), 레이저 캡처 현미해부(laser capture microdissection), 구배 분리(gradient separation), 또는 중재적시술(intervention), 또는 기술분야에 달려진 다른 방법들을 포함하는 현재 알려지거나 나중에 개발되는 모든 방법을 사용하여 통상의 기술자에 의해 선택 될 수 있다. 샘플들은 또한 관심 샘플과 연관된 것으로 알려져 있는 하나 이상의 마커(markers)를 사용하여 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 샘플들은 또한 세포 분리(cell sorting) 및 FACS와 같은 본 기술 분야에 알려진 방법들을 사용하여 선택될 수 있다. 더욱이 샘플 선택 방법들의 예는 하기 실시예란(Examples section)에 기재되어 있다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 샘플로부터 유래되거나 그와 연관된 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 부위는 단일 샘플로부터 유래되거나 그와 연관된 것일 수 있다. 어떤 측면에서, cDNA 부위는 단일 샘플로부터 유래되거나 그와 연관된 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 앰프리콘 부위는 단일 샘플로부터 유래되거나 그와 연관된 것일 수 있다. “단일 샘플”은 단일 소스(single source)로부터 얻은 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 샘플을 포함한다. 어떤 측면에서, 단일 소스는 특정한 시점 또는 대상 또는 세포의 플라스크 또는 세포의 플레이트와 같은 특정한 위치에서 얻은 샘플을 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 제1 시점에 제1 대상으로부터 얻은 것이며 제2 단일 샘플은 제1 시점과는 별개인 제2 시점에서 제1 대상으로부터 얻은 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 제1 위치의 제1 대상으로부터 얻은 것이며 제2 샘플은 제1 위치와는 별개인 제2 위치의 제1 대상으로부터 얻은 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 어떤 시점에 제1 대상으로부터 얻은 것이며 제2 단일 샘플은 어떤 시점에 제2 대상으로부터 얻은 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 어떤 위치의 제1 대상으로부터 얻은 것이고 제2 샘플은 어떤 위치의 제2 대상으로부터 얻은 것이다. 일 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 B세포로부터 유래된 mRNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 B세포로부터 유래된 cDNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 구현예에서, 단일 샘플은 96-웰 또는 384-웰의 단일 웰로 분류된 하나 이상의 B세포로부터 유래된 mRNA를 포함한다. 샘플들은 일반적으로 원핵 세포(들)(예를 들어, 박테리아 세포(들)), 진핵 세포(들)(예를 들어, 포유류 및 효모 세포(들)), 또는 바이러스 또는 파지와 같은 유전 물질의 다른 소스들로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용된 “포유동물(mammal)” 또는 “포유류(mammalian)”라는 용어는 인간 및 비-인간인 것 모두를 포함하고 인간, 비-인간 영장류, 개(canines), 고양이(felines), 쥐(murines), 소(bovines), 말(equines), 및 돼지(porcines)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 어떤 측면에서, 본 발명의 방법은 96웰 이상, 384웰 이상, 1536웰 이상, 또는 그 이상의 웰들을 갖는 플레이트 내의 단일 샘플들에 적용될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 각각 96웰 이상을 갖는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 10개, 15개, 20개, 30개, 또는 그 이상의 플레이트들 내의 단일 샘플들에 적용될 수 있다.
어떤 측면에서, 5’ 어댑터 부위 서열 및/또는 샘플 식별 부위는 Ig 유전자들에 첨가되는 것뿐 아니라 예를 들어, RT 중에 단일 샘플로부터 얻은 모든 cDNAs에 첨가 될 수 있다. 어떤 측면에서, 3’ 유전자 특이적 프라이머(GSPs)는 단일 샘플에서 발현된 모든 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, T 세포 수용체들 및 B세포 수용체들과 같은 5’ 가변 부위를 가지는 유전자들은 관심 유전자(들)을 증폭하는 다중 디제너레이트(degenerate) 5’ 프라이머의 필요 없이 증폭된다. GSPs는 IgG, IgM, IgD, IgA, IgE, TCR 체인, 및 다른 관심 유전자들에 특이적인 프라이머들을 포함할 수 있다.
어떤 측면에서, PCR의 다중 라운드들(multiple rounds)은 또한 예를 들어, 네스티드 GSPs(nested GSPs)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 네스티드 GSPs를 위해, PCR의 제2 라운드를 위한 GSP는 위치 5’에서 PCR의 제1 라운드에서 사용된 GSP에 의해 혼성화된 위치에 관한 그 서열과 따라서 그것의 표적 유전자 서열을 혼성화 된다.
어떤 측면에서, cDNA 부위 또는 앰프리콘 부위는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, cDNA 부위 또는 앰프리콘 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, cDNA 부위 또는 앰프리콘 부위는 DNA 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, cDNA 부위 또는 앰프리콘 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
어떤 측면에서, 범용 프라이머 부위는 모든 인간 엑손에 대해 완전히 상보적인 것이 아니다. 어떤 측면에서, 범용 프라이머 부위 모든 발현된 인간 유전자에 대해 완전히 상보적인 것이 아니다. 어떤 측면에서, 범용 프라이머 부위는 최소 이차 구조(minimal secondary structure)를 가진다.
어떤 측면에서, 앰프리콘 부위는 면역글로불린 헤비 체인 앰프리콘 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 앰프리콘 부위는 면역글로불린 라이트 앰프리콘 서열으 포함한다. 어떤 측면에서, 앰프리콘 부위는 T세포 수용체 알파 앰프리콘 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 앰프리콘 부위는 T세포 수용체 베타 앰프리콘 서열을 포함한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 내에 존재하고 폴리뉴클레오티드의 부위를 근거로 하여 라이브러리 내에 존재하는 다른 폴리뉴클레오티드로부터 분화될 수 있다.
어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개인 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위와 1 뉴클레오티드 이상의 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위와 1이상, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드들이 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 미만으로 동일한 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과 100% 미만으로 동일한 것이다. 어떤 측면에서, 샘플-식별 부위는 단일 샘플로부터 역전사된 모든 1st 가닥 cDNA 상에 있는 디지털 바코드로서 작용할 수 있다. 어떤 측면에서, 샘플 식별 부위는 길이가 1 뉴클레오티드 이상이다. 어떤 측면에서, 샘플-식별 부위은 3 뉴클레오티드들 이상을 포함할 수 있고, 샘플-식별 부위들은 서로 1 뉴클레오티드 이상으로 차이가 날 수 있다. 일 구현예에서, 샘플-식별 부위들은 길이가 3-15 뉴클레오티드들이고 서로 1 뉴클레오티드 이상으로 차이가 난다. 어떤 측면에서, 샘플 식별 부위들은 64개 이상의 변이체(variants)들(각 샘플-ID가 서로 1 뉴클레오티드 이상으로 차이가 나며 길이가 3 뉴클레오티드인 샘플-식별 부위들을 사용하는)을 포함할 수 있고, 또는 어떤 측면에서, 더 많은 개수의 변이체를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 샘플 식별 부위에 대해 3’부착된 서열은 1개 이상의 G를 포함하는 어댑터 부위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 샘플 식별 부위에 3’으로 부착되는 서열은 2개 이상의 G를 포함하는 어댑터 부위일 수 있다. 일 구현예에서, 샘플 식별 부위의 5’말단에 부착된 서열은 범용 프라이머 부위일 수 있고, 이는 PCR 증폭중에 사용되어 5’ 범용 프라이머 서열의 연속적 첨가(라이게이션 또는 다른 방법에 의해) 또는 가변 5’부위들을 가지는 유전자를 증폭하는 다중 디제너레이트 5’프라이머들의 사용을 피하게 한다. 샘플 식별 부위들의 예들은 표 2 및 8에 나타내었다.
어떤 측면에서, 단일 샘플들의 제1세트로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개인 것이다. 어떤 측면에서, 단일 샘플들의 제1세트로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 1 뉴클레오티드 이상의 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 단일 샘플들의 제1세트로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 2이상, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드들로 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 미만으로 동일한 것일 수 있다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열에 대해 100% 미만으로 동일한 것이다. 제1 플레이트 식별 부위들의 예들은 표 3 및 7에 나타내었다.
어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과 별개인 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과 1 뉴클레오티드 이상의 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과 2이상, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드들로 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 폴리뉴클레오티드 상의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 동일하다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 미만으로 동일할 수 있다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플들로부터 유래된 라이브러리 내의 각 폴리뉴클레오티드의 제2 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제2 플레이트 식별 부위의 서열과 100% 미만으로 동일하다. 제2 플레이트 식별 부위들의 예들은 표 3 및 7에 나타내었다.
어떤 측면에서, 플레이트-식별 부위(예를 들어, 제1 플레이트 식별 부위 또는 제2 플레이트 식별 부위)는 2 이상의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있고, 플레이트-식별 부위들은 서로 1 뉴클레오티드 이상으로 차이가 나는 것이다. 일 구현예에서, 플레이트-식별 부위들은 길이가 2-10 뉴클레오티드들이고 서로 1 뉴클레오티드이상으로 차이가 나는 것이다. 어떤 측면에서, 더 많은 수의 서로 다른 샘플 식별 부위들(단일 샘플당 한 개로 분석되는)은 플레이트-식별 부위들에 대한 필요를 없앨 수 있으므로, 플레이트-식별 부위들의 사용은 오직 동일한 구현예들에서만 나타난다. 어떤 측면에서, 플레이트-식별 부위들은 합성되어야 하는 샘플 식별 부위를 함유하는 특유한 올리고뉴클레오티드들의 숫자를 감소시키는데 사용된다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 어댑터 부위들을 포함한다. 어떤 측면에서, 어댑터 부위는 하나 이상의 G들을 포함한다. 어떤 측면에서, 어댑터 부위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 G들을 포함한다. 어떤 측면에서, 어댑터 부위는 MMLV H- 역전사 효소의 주형 전환 성질을 사용하여 cDNAs의 3’ 말단들로 부착된다. 어댑터 부위들을 부착시키는 다른 방법들이 존재하고, 이는 5’ 측면 어댑터 부위 서열들을 갖는 프라이머들로 PCR을 하는 것, 스티키 및 블런트 말단 라이게이션(sticky and blunt end ligations), 뉴클레오티드들의 주형-전환-매개 첨가(template-switching-mediated addition of nucleotides), 또는 폴리뉴클레오티드들의 5’ 말단, 3’ 말단, 또는 5’ 및 3’말단에 뉴클레오티드들을 공유결합 적으로 부착시키는 다른 방법들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법들은 흔히 분자 생물학에서 사용되는 효소들의 성질들을 사용할 수 있다. PCR은 예를 들어, 호열성(thermophilic) DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 상보적이거나 실질적으로 상보적인 스티키 말단은 오버행잉 말단들(overhanging end)을 남기는 것인 dsDNA를 제한 효소로 절단하는 것(cutting)을 통해 또는 TdT(말단 트랜스퍼라아제)와 같은 효소들의 3’ 테일링 활성들을 통하여 생성된다. 스티키 및 블런트 말단들은 그런 뒤 T4 리가아제와 같은 리가아제를 사용하여 상보적인 어댑터 부위와 라이게이션 될 수 있다. 주형-전환은 MMLV H- 역전사 효소의 3’ 테일링 활성을 사용하여 하나 이상의 시토신들(C’s)을 cDNAs의 3’ 말단에 첨가하고 그 능력으로 mRNA에서 상보적 G들을 갖는 어댑터 부위로 주형을 전환한다. 어떤 측면에서, cDNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 C들을 그 것의 3’ 말단 상에 포함한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제한 자리 부위들을 포함한다. 제한 자리 부위들은 하나 이상의 제한 자리들을 포함한다. 제한 자리들은: NheI, XhoI, BstBI, EcoRI, SacII, BbvCI, PspXI, AgeI, ApaI, KpnI, Acc65I, XmaI, BstEII, DraIII, PacI, FseI, AsiSI, 및 AscI를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 모든 레어 8-커터 효소(rare 8-cutter enzyme) 제한 자리가 사용될 수 있다.
어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부위들은 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 다른 부위들과 작동적으로 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 단일 폴리뉴클레오티드의 둘 이상인 별개의 부위들은 작동적으로 커플링 될 수 있다. 예를 들어, 범용 프라이머 부위는 어댑터 부위와 작동적으로 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 둘 이상의 부위들은 서로 작동적으로 커플링 될 수 있고 서열 내에서 서로 실질적으로 동일하거나 디스크립션(description)에 있어서 동일하다. 예를 들어, 제1 샘플 식별 부위는 제2 샘플 식별 부위와 작동적으로 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위의 서열들은 동일하거나 실질적으로 동일하다. 어떤 측면에서, 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위의 서열들은 서로 다르거나 별개이다.
어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부위들은 폴리뉴클레오티드의 다른 하나 이상의 부위들에 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 단일 폴리뉴클레오티드의 둘 이상의 별개인 부위들은 커플링 될 수 있다. 예를 들어, 범용 프라이머 부위는 어댑터 부위와 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 둘 이상의 부위들은 서로 커플링 될 수 있고 서열 내에서 서로 실질적으로 동일하거나 기재에서 동일하다. 예를 들어, 제1 샘플 식별 부위는 제2 샘플 식별 부위와 커플링 될 수 있다. 어떤 측면에서, 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위의 서열들은 동일하거나 실질적으로 동일하다. 어떤 측면에서, 제1 샘플 식별 부위 및 제2 샘플 식별 부위의 서열들은 서로 다르거나 별개이다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-3’을 포함하고, 상기 A는 샘플 식별 부위이고, 상기 B는 어댑터 부위이다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-3’을 포함하고, 상기 A는 범용 프라이머 부위이고, 상기 B는 샘플 식별 부위이고, 상기 C는 어댑터 부위이다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-3’를 포함하고, 상기 A는 샘플 식별 부위이고, 상기 B는 어댑터 부위이고, 상기 C는 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위이다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-3’를 포함하며, 상기 A는 범용 프라이머 부위이고, 상기 B는 샘플 식별 부위이고, 상기 C는 어댑터 부위이고, 상기 D는 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위이다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-E-3’를 포함하며, 상기 A는 플레이트 식별 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위이다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 5’-A-B-C-D-E-F-3’을 포함하고, 상기 A는 제1 제한 자리 부위이고, 상기 B는 범용 프라이머 부위이고, 상기 C는 샘플 식별 부위이고, 상기 D는 어댑터 부위이고, 상기 E는 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위이고, 상기 F는 제2 제한 자리 부위이다.
어떤 측면에서, 상기 각 서열들의 부위들은 예를 들어, 5’-C-A-D-B-3’ 또는 5’-E-A-C-B-D-F-3’ 또는5’-B-A-3’와 같이 서로 다른 순서로 재배열 될 수 있다. 어떤 측면에서, 상기 서열들의 하나 이상의 부위들은 예를 들어, 5’-A-D-3’ 또한 5’-B-C-3’와 같이 삭제될 수 있다. 어떤 측면에서, 하나 이상의 추가적인 부위들은 상기 서열들에 예를 들어, 5’-A-A2-B-3’ 또는 5’-A-B-C-D-E-F-G-3’와 같이 첨가될 수 있다. 이러한 예시들에서 하나 이상의 추가적인 부위들은 본 명세서에 기재된 모든 부위 또는 그들의 등가물(equivalents)일 수 있다. 어떤 측면에서, 상기 서열들의 하나 이상의 부위들은 메틸화 되는 것과 같이 변형 될 수 있다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 어댑터 분자를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 어댑터 분자는 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 및 어댑터 부위를 포함할 수 있으며, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 되고, 상기 샘플 식별 부위의 3’말단은 어댑터 부위의 5’ 말단과 커플링된다. 어떤 측면에서, 어댑터 분자는 1st 가닥 cDNA의 3’말단에서 역전사 효소에 의해 첨가된 C들에 결합하는 2 이상의 뉴클레오티드들을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, 어댑터 분자는 3-6개의 G들(DNA G들)을 포함하는 데옥시리보오스 폴리뉴클레오티드(deoxyribose polynucleotide)를 포함한다. 다른 구현예에서, 어댑터 분자는 3-6 개의 G들(RNA G들)로 구성된 리보오스 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 어댑터 분자는 LNA G들과 같은 잠금 핵산들(locked nucleic acids, LNAs)인 뉴클레오티드 유사체들을 활용할 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레오티드 염기는 또한 5-니트로인돌(5-nitroindole) 및 3-니트로피롤(3-nitropyrrole)과 같은 유니버셜(universal) 또는 디제너레이트 염기일 수 있고 모든 조합에서 다른 뉴클레오티드들 뿐 아니라 C들에도 염기-짝짓기를 할 수 있다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 프라이머는 범용 프라이머 부위 및 플레이트 식별 부위를 포함할 수 있으며, 상기 플레이트 식별 부위의 3’말단은 범용 프라이머 부위의 5’ 말단과 커플링된다.
어떤 측면에서, 조성물은 폴리뉴클레오티드 조성물 라이브러리를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 조성물 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들을 포함한다. 어떤 측면에서, 각 조성물은 독립된 용기에 존재한다. 어떤 측면에서, 용기는 테스트 튜브(test tube)일 수 있다. 어떤 측면에서, 용기는 플레이트 내의 웰일 수 있따. 어떤 측면에서, 용기는 96-웰 플레이트 내의 웰일 수 있다. 어떤 측면에서, 용기는 384-웰 플레이트 내의 웰일 수 있다. 어떤 측면에서, 각 조성물은 단일 샘플로부터 유래된 cDNA 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 각 조성물은 어댑터 부위와 커플링 된 샘플 식별 부위를 포함하는 샘플 식별-어댑터 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 라이브러리내의 각 샘플 식별-어댑터 부위의 샘플 식별 부위의 서열은 라이브러리내의 각 독립된 용기에 존재하는 다른 샘플 식별-어댑터 부위의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과 별개의 것이다. 어떤 측면에서, 샘플 식별-어댑터 부위는 cDNA 부위에 부착된다. 어떤 측면에서, 샘플 식별-어댑터 부위는 그들의 3’ 부위들 사이에 결합되는 것에 의해 cDNA에 부착된다. 어떤 측면에서, 샘플 식별-어댑터 부위는 G:C 결합에 의해 cDNA 부위에 부착된다. 어떤 측면에서, cDNA 부위는 DNA 폴리뉴클레오티드로 혼성화된 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 측면에서, cDNA 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드로 혼상화된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10,000이상, 30,000이상, 100,000이상, 300,000이상, 1,000,000이상, 3,000,000이상, 10,000,000이상, 30,000,000이상, 또는 그 이상의 멤버들을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10,000이상, 30,000이상, 또는 그 이상의 세포 샘플의 전체 전사체의 유전자를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 개체의 혈액 내에 존재하는 1 이상, 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 10,000이상, 100,000이상, 1,000,000이상, 10,000,000이상, 1,000,000,000이상, 또는 그 이상의 서로 다른 항체 종을 포함한다. 이러한 항체 종은 형질아세포, 형질세포, 기억B세포, 긴시간-생존하는 형질세포(long-lived plasma cells), 순수한 B세포(naive B cells), 다른 B 계통 세포(B lineage cell) 또는 그들의 조합에 의해 발현될 수 있다.
벡터
어떤 측면에서, 조성물은 벡터를 포함할 수 있다. 벡터들은 핵산 서열을 갖는 숙주 세포의 형질전환(transformation)에서 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 표적 폴리뉴클레오티드들을 인코딩(encoding)하는 핵산 서열들의 라이브러리는 세포 개체군(population of cells) 내로 도입될 수 있으며, 그에 따라 라이브러리의 스크리닝을 가능하게 한다. 용어 “벡터(vector)”는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 안으로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 캐리어 핵산 분자(carrier nucleic acid molecule)를 나타내기 위해 사용된다. 핵산 서열은 “외인성(exogenous)” 또는 “이종성(heterologous)”일 수 있으며 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 외부의 것(foreign)이라는 것 또는 서열이 세포 내의 서열과 상동성(homologous)이나 그 서열이 보통은 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있지 않다는 것을 의미한다. 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 및 바이러스들(예를 들어, 박테리오파지)를 포함한다. 통상의 기술자는 마니아티스 등(Maniatis et al., 1988) 및 우수벨 등(Ausubel et al., 1994)에 기재된 일반적 재조합 기술들을 통하여 벡터를 구성할 수 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조 인용된다. 어떤 측면에서, 벡터는 미리-조작된(pre-engineered in) 항체의 불변 부위들을 가지는 벡터일 수 있다. 여기서는, 통상의 기술자가 관심 항체의 VDJ 부위들만을 클로닝 할 수 있고 조립식 벡터 내의 이러한 부위들을 클로닝 할 수 있다.
용어 “발현 벡터(expression vector)”는 전사될 수 있는 유전자 생산물의 부분 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 나타낸다. 어떤 경우에는, 그런 뒤 RNA 분자들이 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 발현 벡터들은 다양한 “컨트롤 서열들(control sequences)”을 함유할 수 있는데, 이는 특정한 숙주 유기체 내의 작동가능하게(operably) 링크된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역을 위한 핵산 서열들을 나타내는 것이다. 전사 및 번역을 좌우하는 조절 서열들에 덧붙여, 벡터들 및 발현 벡터들은 또한 다른 기능들로 역할하는 핵산 서열들으 함유할 수 있다.
어떤 측면에서, 벡터는 프로모터(promoter)를 포함 할 수 있다. 어떤 측면에서, 벡터는 인핸서(enhancer)를 포함할 수 있다. “프로모터”는 개시 및 전사속도가 조절되는 핵산 서열의 부위인 조절 서열이다. 이는 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자들이 결합할 수 있는 곳으로서 유전 요소를 함유 할 수 있다. 구절 “작동적으로 위치된(operatively positioned)”, “작동적으로 링크된(operatively linked)”, “조절 되는(under control)” 및 “전사 조절 되는(under transcriptional control)”들은 의미한다 프로모터가 정확한 기능적 위치(functional location) 및/또는 전사 개시를 조절하는 핵산 서열에 관한 방향(orientation) 및/또는 그 서열의 발현에 있는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화(transcriptional activation)에 관련된 시스-작용(cis-acting) 조절 서열을 나타내는 “인핸서”와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있는데, 예컨대 코딩 절편(coding segment) 및/또는 엑손의 상류에 위치하는 5’ 비-코딩 서열들을 분리하는 것에 의해 수득될 수 있다. 이러한 프로모터는 “내인성(endogenous)”으로서 나타낼 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있고, 그 서열의 하류 또는 상류에 위치할 수 있다. 대안적으로, 그것의 자연적인 환경 내에서는 핵산 서열과 보통 연관되지 않는 프로모터를 나타내는, 재조합 또는 이종 프로모터로 조절되는 코딩 핵산 절편을 위치결정(positioning)하는 것 의해 어떠한 이득들이 얻어질 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 그것의 자연적인 환경 내에서는 핵산 서열과 보통 연관되지 않는 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터들 또는 인핸서들은 다른 유전자들의 프로모터들 또는 인핸서들, 및 임의의 다른 원핵 세포로부터 분리된 프로모터들 또는 인핸서들, 및 “자연적으로 발생하지” 않는, 즉, 서로 다른 전사 조절 부위들의 서로 다른 요소를 포함하는 프로모터들 또는 인핸서들, 및/또는 발현을 바꾸는 돌연변이들을 포함한다. 프로모터들 및 인핸서들의 핵산 서열들을 인공적으로 생산하는 것에 덧붙여, 본 명세서에 개시된 조성물들과 관련된 재조합 클로닝 및/또는 PCR을 포함하는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(본 명세서에 참조인용된 각각, U.S. Pat. No. 4,683,202, U.S. Pat. No. 5,928,906을 인용한다).
어떤 측면에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 발현을 위해 선택된 세포 타입 내의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 유도한다. 이러한 프로모터의 한 예로 사용될 수 있는 것은 E. coli 아라비노오스(arabinose) 또는 T7 프로모터이다. 분자 생물학의 통상의 기술자는 일반적으로 프로모터들, 인핸서들, 및 단백질 발현을 위한 세포 타입 조합들에 친숙하며, 예를 들어, 본 명세서에 참조인용된 Sambrook et al. (1989)를 인용한다. 사용된 프로모터들은 구성적(constitutive), 조직-특이적(tissue-specific), 유도성(inducible), 및/또는 적절한 조건 하에서 유용한 것일 수 있고, 도입된 DNA 절편의 높은 수준의 발현을 인도하고, 이는 재조합 단백질들 및/또는 펩티드들의 대규모 생산에서 유리하다.
어떤 측면에서, 벡터들은 개시 신호들 및/또는 내부 리보솜 결합 자리들(internal ribosome binding sites)을 포함할 수 있다. 특정한 개시 신호가 또한 코딩 서열들의 효과적인 번역을 위해 포함 될 수 있다. 이렇나 신호들은 ATG 개시 코돈 또는 인접한(adjacent) 서열들을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 전사 조절 신호들은 제공될 필요가 있을 수 있다. 통상의 기술자는 쉽게 이를 결정할 수 있으며 필요한 신호들을 제공할 수 있다. 개시코돈은 전체 삽입의 번역을 보장하는 목적 코딩 서열의 해독틀(reading frame)을 가지는 “인-프레임(in-frame)”이어야 한다는 것이 잘 알려져 있다. 외인성 전사 조절 신호들 및 개시 코돈들은 자연적 이거나 인공적인 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함하여 강화 될 수 있다.
어떤 측면에서, 벡터는 관심 유전자를 인코딩하는 DNA 절편의 발현 수준을 증가시키거나 최적화 하는 서열들을 포함할 수 있다. 이러한 서열들의 예는 발현된 mRNA에서 인트론의 첨가(Brinster, R.L. et al. (1988) Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 836-40; Choi, T. et al. (1991) A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 11, 3070-4) 를 포함한다. DNA 절편의 발현을 최저화 하는 방법의 다른 예는 “코돈 최적화(codon optimization)”이다. 코돈 최적화는 DNA 절편 내의 침묵 돌연변이의 삽입을 포함하고 단백질 번역을 최적화 하는데 드문 코돈들의 사용을 감소시킨다(Codon engineering for improved antibody expression in mammalian cells. Carton JM, Sauerwald T, Hawley-Nelson P, Morse B, Peffer N, Beck H, Lu J, Cotty A, Amegadzie B, Sweet R. Protein Expr Purif. 2007 Oct;55(2):279-86. Epub 2007 Jun 16.).
어떤 측면에서, 벡터는 다중 클로닝 자리들(multiple cloning sites )을 포함할 수 있다. 벡터들은 다중 클로닝 자리들(MCS)을 포함할 수 있고, 이 자리는 다중 제한 효소 자리들을 함유하는 핵산 부위이고, 이들 중 임의의 것은 일반적 재조합 기술과 함께 사용되어 벡터를 분해할 수 있다(본 명세서에 참조인용된 Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, 및 Cocea, 1997를 인용). “제한 효소 분해(Restriction enzyme digestion)”는 오직 핵산 분자 내의 특이적 위치들에서만 기능하는 효소를 가지는 핵산 분자의 촉매적 절단을 나타낸다. 이러한 제한 효소들의 많은 것들은 상업적으로 사용가능하다. 이러한 효소들의 사용은 통상의 기술자에게 이해된다. 자주, 벡터는 MCS 이내를 잘라 외인성 서열이 벡터에 라이게이션 되는 것을 가능하게 하는 제한효소를 사용하여 선형화 또는 단편화된다. “라이게이션(ligation)”은 서로 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있는 두 개의 핵산 단편들 사이의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합들을 형성하는 과정을 나타낸다. 제한 효소들 및 라이게이션 반응들을 포함하는 기술들은 재조합 기술의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
어떤 측면에서, 벡터는 종결 신호(termination signal)를 포함할 수 있다. 벡터들 또는 구조체들은 일반적으로 하나 이상의 종결 신호를 포함할 것이다. “종결 신호” 또는 “종결자(terminator)”는 RNA 폴리머라아제에 의한 RNA 전사의 특정한 종결에 관련된 DNA 서열들에 포함된다. 따라서, 특정 구현예에서, RNA 전사의 생산을 끝내는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 목적 메시지 수준들을 달성하기 위해 생체 내에서 필요할 수 있다.
사용을 위해 고려된 종결자들은 본 명세서에 기재된 모든 알려진 전사 종결자 또는 통상의 기술자에게 달려진 것을 포함하며, 예를 들어, 로 종속 또는 로 비종속 종결자들(rho dependent or rho independent terminators)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 종결 신호는 서열 절단(sequence truncation)으로 인한 것과 같은 전사 가능 또는 번역 가능한 서열의 결핍일 수 있다.
어떤 측면에서, 벡터는 복제 오리진을 포함할 수 있다.
벡터를 숙주세포 내에서 번식시키기 위해, 벡터는 복제가 시작되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 오리진(주로 “ori”로 정의되는)을 함유 할 수 있다.
어떤 측면에서, 벡터는 하나 이상의 선택가능(selectable) 및/또는 스크리닝가능(screenable) 마커들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 구조체를 포함하는 세포들은 발현 벡터 내에 마커를 포함하는 것에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 식별될 수 있다. 이러한 마커들은 발현 벡터를 포함하여 세포를 쉽게 식별하게 하는 식별 가능한 변화를 세포에 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 가능 마커는 선택(selection)을 가능하게 하는 성질을 부여하는 것이다. 양성 선택가능 마커는 마커의 존재가 그 것의 선택을 가능하게 하는 것이고, 반면 음성 선택가능 마커는 그 존재가 그것의 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택가능 마커의 예에는 약물 내성 마커가 있다.
흔히 약물 선택 마커의 포함(inclusion)은 형질전환체(transformants)의 클로닝 및 식별을 돕고, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 내성을 부여하는 유전자들은 유용한 선택가능 마커들이다. 조건들의 적용에 근거하여 형질전환체의 분별(discrimination)을 가능하게 하는 표현형(phenotype)을 부여하는 마커들에 덧붙여, 그 기초가 비색 분석(colorimetric analysis)인 GFP와 같은 스크린가능 마커들을 포함하는 마커들의 다른 타입들도 고려된다. 대안적으로, 클로람페니콜 아세틸트랜스포라아제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)와 같은 스르린가능 효소들이 활용될 수 있다. 통상의 기술자는 아마 FACS 분석과 함께, 면역학적 마커들을 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는 유전자 생산물을 인코딩하는 핵산과 동시에 발현되는 것이 가능한 한 중요한 것으로 여겨지진 않는다. 선택가능 및 스크리닝가능 마커들의 다른 예들은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
일 측면에서, 벡터는 관심 다중 폴리펩티드들을 인코딩하는 DNA 절편들을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 헤비 체인 및 라이트 체인 모두를 인코딩하는 DNA 절편들은 단일 벡터에 의해서 인코딩되고 발현될 수 있다. 일 측면에서, DNA 절편들 모두는 독립된 폴리펩티드들로서 DNA 절편들의 발현을 가능하게 하곤 하는 내부 리보솜 결합 자리(IRES) 서열들 및 동일한 발현 RNA 상에 포함될 수 있다(Pinkstaff JK, Chappell SA, Mauro VP, Edelman GM, Krushel LA., Internal initiation of translation of five dendritically localized neuronal mRNAs., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Feb 27;98(5):2770-5. Epub 2001 Feb 20.). 다른 측면에서, 각 DNA 절편은 독립된 mRNAs의 발현을 야기하는 자체 프로모터 부위를 가진다(Andersen CR, Nielsen LS, Baer A, Tolstrup AB, Weilguny D. Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters. Mol Biotechnol. 2010 Nov 27. [Epub ahead of print]).
숙주 세포 및 발현 시스템
어떤 측면에서, 조성물은 숙주세포를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 숙주세포는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 숙주 세포는 진핵 세포(예를 들어, 곤충, 효모, 또는 포유류) 또는 원핵세포(예를 들어, 박테리아)를 포함할 수 있다. 이종 핵산 서열을 발현시키는 문맥에서, “숙주 세포”는 원핵 세포를 나타낼 수 있고, 이는 벡터의 복제 및/또는 벡터에 의해 인코딩 된 이종 유전자의 발현을 가능하게 하는 형질전환 가능한 모든 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터들의 수용자(recipient)로서 사용되어 왔고, 사용될 수 있다. 숙주 세포는 “트랜스펙션 된(transfected)” 또는 “형질전환된” 것일 수 있고, 이는 외인성 핵산이 숙주세포 내로 이동 또는 도입되는 과정을 나타낸다. 형질전환된 세포는 1차 대상 세포 및 그 자손(progeny)을 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 그람 음성 박테리아(Gram negative bacterial) 세포 이다. 이러한 박테리아는 내막 및 외막 사이에 원형질막주위공간(periplasmic space) 및, 특히, 세포질막(cytoplasmic membrane)으로도 알려져 있는 원형질막공간(periplasm) 및 세포질(cytoplasm) 사이의 앞서 언급된 내막을 가지고 있으므로 사용하기에 적당하다. 이런 점에서, 이러한 원형질막주위공간을 가지는 다른 모든 세포들이 사용될 수 있다. 그람 음성 박테리아의 예들은 E. coli, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 보르토텔라 페르투시(Bordotella pertussi), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 리조븀 속(Rhizobium sp)을 포함하나 이제 제한되지는 않는다. 그람 음성 박테리아 세포는 여전히 선택된 리간드(ligand)에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 결합하는 후보를 포함하는 융합 폴리펩티드의 코딩 서열로 형질전환된 박테리아 세포로 더 정의될 수 있다. 폴리펩티드는 세포질 막의 외부에 고정되고, 원형질막주위공간을 향하고, 항체 코딩 서열 또는 다른 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 발현을 위한 한가지 방법은 이러한 인도(directing)를 유발할 수 있는 폴리펩티드에 리더 서열(leader sequence)의 첨가에 의한 것이다.
많은 원핵 세포주 및 배양물(cultures)은 숙주 세포로 사용될 수 있고, 그들은 살아있는 배양물 및 유전적 물질들에 대한 보관소(archive) 로서 역할하는 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)를 통해 수득할 수 있다. 적절한 숙주는 벡터 백본(vector backbone) 및 목적하는 결과에 근거하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 또는 코스미드는 많은 벡터들의 복제를 위해 원핵 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위해 숙주세포로 사용된 박테리아 세포들은 DH5-alpha, JM109, 및 KC8, 에 더하여 SURETM Competent Cells 및 SOLOPACKTM Gold Cells (STRATAGENETM, La Jolla)과 같은 상업적으로 이용 가능한 다수의 박테리아 숙주들을 포함한다. 어떤 측면에서, E. coli LE392과 같은 다른 박테리아 세포들도 숙주 세포들로 사용되는 것이 고려된다.
다양한 세포 타입들 및 유기체들로부터 얻은 많은 숙주 세포들은 사용 가능하고 통상의 기술자에게 알려진 것이다. 유사하게, 바이러스 벡터(viral vector)는 원핵 숙주 세포, 특히 벡터의 복제 및 발현을 허용하는 것과 함께 사용될 수 있다. 어떤 벡터들은 그것이 원핵 및 진핵 세포를 모두에서 복제 및/또는 발현되게 하는 조절 서열들을 사용할 수 있다. 통상의 기술자는 상기 기재된 모든 숙주 세포들을 배양하고 유지하고 벡터의 복제가 가능하게 하는 조건들에 대해 알고 있을 것이다. 또한 이해되고 알려진 것은 벡터들의 대규모 생산에 더하여 벡터 들에 의해 인코딩된 핵산, 그들의 동족(cognate) 폴리펩티드들, 단백질들, 또는 펩티드들의 생산을 가능하게 하는 기술들 및 조건들이다.
어떤 측면에서, 숙주 세포는 포유류이다. 예들은 CHO 세포, CHO-K1 세포, 또는 CHO-S 세포를 포함한다. 다른 포유류 숙주 세포들은 NS0 세포 및 dhfr-인 CHO 세포, 예를 들어 CHO-dhfr-, DUKX-B11 CHO 세포, 및 DG44 CHO 세포를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물들 일부 이상 또는 전부를 포함하는 많은 발현 시스템들이 존재할 수 있다. 발현 시스템들은 진핵 바현 시스템(eukaryotic expression systems) 및 원핵 발현 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템들은, 예를 들어, 특정 리간드에 결합할 수 있는 것으로서 식별되는 폴리펩티드 생산물의 생산을 위해 사용될 수 있다. 원핵-기반 시스템들은 핵산 서열들 또는 그들의 동족 폴리펩티드들, 단백질들 및 펩티드들을 생산하는데 사용될 수 있다. 많은 이러한 시스템들은 상업적으로 그리고 광범위하게 사용가능하다. 발현 시스템들의 다른 예들은 T7, Tac, Trc, BAD, 람다 pL, 테트라사이클린 또는 Lac 프로모터와 같은 강력한 원핵 프로모터, pET 발현 시스템 및 E. coli 발현 시스템을 함유하는 벡터들으 포함한다.
폴리펩티드
어떤 측면에서, 조성물은 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는, 예를 들어, 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 용어 “폴리펩티드” 또는 “단백질”은 자연적 단백질의 아미노산 서열을 가지는 거대분자, 즉 자연적으로-발생하고 비-재조합 세포에 의해 생성되는 단백질을 포함하거나; 또는 유전적으로-조작된(genetically-engineered) 또는 재조합된 세포에 의해 생성되어, 자연적 단백질의 아미노산 서열을 가지는 분자들, 또는 자연적 서열의 하나 이상의 아미노산들의 결실, 첨가, 및/또는 치환을 가지는 분자들을 포함한다. 또한 상기 용어는 상응하는 자연적으로 발생한 아미노산 및 폴리머들의 화학적 유사체들인 하나 이상의 아미노산들이 있는 아미노산 폴리머들을 포함한다. 용어들 “폴리펩티드” 및 “단백질’은 항원 결합 단백질들, 항체들, 또는 항원 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산들의 결실, 첨가, 및/또는 치환을 가지는 서열들을 망라한다. 용어 “폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)”은 완전한 길이의 자연적 단백질(full-length native protein )과 비교하여 아미노산 말단 결실, 카르복실-말단 결신, 및/또는 내부 결실을 가지는 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 단편들은 또한 자연적 단백질과 비교하여 변형된 아미노산들을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 단편들은 약 5 내지 500 아미노산 길이(amino acids long)이다. 예를 들어, 단편들은 5이상, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450 아미노산 길이 일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편들은 항체들의 면역학적으로 기능적인 단편들을 포함하고, 결합 도메인들을 포함한다. 결합 항체의 경우에서, 유용한 단편들은 CDR 부위, 헤비 및/또는 라이트 체인의 가변 도메인, 항체의 부분 또는 두 개의 CDRs를 포함하는 그것의 가변 부위, 및 그와 유사한 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 “분리된 단백질(isolated protein)”은 (1) 보통 잘 발견되지 않는 다른 단백질들이 없고, (2) 예를 들어, 같은 종들과 같은 같은 소스로부터 얻어진 다른 단백질들이 근본적으로 없고, (3) 서로 다른 종들로부터 얻은 세포에 의해 발현되고, (4) 약 50 퍼센트 이상의 뉴클레오티드들, 지질들(lipids), 탄수화물들, 또는 자연계와 연관된 다른 물질들로부터 분리되었고, (5) 자연계와 연관되지 않는 폴리펩티드와 작동가능하게 연관되고(공유결합 또는 비공유결합적 상호작용에 의해), (6) 자연계에서 발생하지 않는 것을 의미한다. 전형적으로, “분리된 단백질”은 주어진 샘플의 약 5%이상, 약 10%이상, 약 25%이상, 또는 약 50%이상을 구성한다. 유전체 DNA(Genomic DNA), cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 합성 오리진(synthetic origin)의 핵산, 또는 그들의 모든 조합은 이러한 분리된 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는 분리된 단백질은 그것의 자연적 환경에서 발견되고 그것의 치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 다른 용도를 방해하는 단백질들, 또는 폴리펩티드들, 또는 다른 오염물질들이 실질적으로 없다.
어떤 측면에서, 폴리펩티드는 항원 결합 단백질(ABP)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 “항원 결합 단백질”(“ABP”)은 특정된 표적 항원에 결합하는 모든 단백질을 의마한다. “항원 결합 단백질”은 항체들, 면역학적으로 기능적인 단편들과 같은 그들의 결합 부분들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 펩티바디(Peptibodies)들은 항원 결합 단백질들의 또 다른 예시이다. 본 명세서에서 사용된 항체 또는 면역글로불린 체인(헤비 또는 라이트 체인) 항원 결합 단백질의 “면역학적으로 기능적인 단편”(또는 간단히 “단편”)이라는 용어는 완전한-길이의 체인에 존재하는 어느 정도 이상의 아미노산들이 결핍되나 여전히 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분(그 부분이 어떻게 수득되거나 합성되었는지는 무관하게)을 포함하는 항원 결합 단백질의 종이다(species). 이러한 단편들은 생물학적으로 활성이므로 표적 항원에 결합하고 주어진 에피톱(given epitope)에 결합하기 위해 무손상 항체들(intact antibodies)을 포함하는 다른 항원 결합 단백질들과 경쟁할 수 있다. 어떤 구현예에서, 단편들은 중화 단편(neutralizing fragments)들이다. 이러한 생물학적으로 활성인 단편들은 재조합 DNA 기술들에 의해 생산될 수 있고, 또는 무손실 항체들을 포함하는 항원 결합 단백질들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편들은 Fab, 디아바디(라이트 체인 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 헤비 체인 가변 도메인, 동일한 체인 상의 두 도메인들 사이를 페어링 하기에는 너무 짧은 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된), Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체들 및 단일-체인 항체들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 인간, 마우스, 래트, 카멜리드(camelid) 또는 래빗을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 포유류 소스들로부터 유래될 수 있다.본 명세서에 개시된 항원 결합 단백질들의 기능적 부분-예를 들어, 하나 이상의 CDRs-이 제2 단백질 또는 소분자(small molecule)에 공유결합 적으로 결합하여 신체 내의 특정한 표적으로 향하고 양기능적 치료적 성질들(bifunctional therapeutic properties)을 보유하고 연장된 혈청 반감기(serum half-life)를 가지는 치료제(therapeutic agent)를 생성하는 것이 추가적으로 고려된다. 통상의 기술자에 의해 평가될 수 있는 대로, 항원 결합 단백질은 비단백질 요소들을 포함할 수 있다. 변형체, 변이체, 생성 방법, 및 스크리닝 방법들과 같은 항원 결합 단백질들 및 항체들에 대한 세부 사항들은 U.S. Pat. Pub. 20110027287에 나타나 있고, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조인용 된다.
어떤 측면에서, 폴리펩티드는 항체를 포함한다. 용어 “항체”는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 모든 이소타입(isotype)의 무손상 면역글로불린 또는 그들의 단편을 나타내고 예를 들어, 키메라(chimeric), 인간화(humanized), 인간(fully human), 및 양특이성(bispecific) 항체들을 포함한다. “항체”는 항원 결합 단백질의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 두 개의 완전한 길이의 헤비 체인들 및 두 개의 완전한 길이의 라이트 체인들을 포함하나, 어떤 예에서는 오직 헤비 체인들 만을 포함할 수 있는 카멜리드(camelids)들 내에서 자연적으로 발생하는 항체들과 같이 더 적은 체인들을 포함할 수 있다. 항체들은 단일 소스로부터 단독으로 유해할 수 있고, 또는 항체의 서로 다른 부분들이 두 개의 서로 다른 항체들로부터 유래된 것인 “키메라”일 수 있다. 항원 결합 단백질들, 항체들, 또는 결합 단편들은 하이브리도마(hybridomas) 내에서, 재조합 DNA 기술들, 또는 무손실 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해서 생성될 수 있다. 다르게 다르게 지시되지 않는 한, 용어 “항체는” 두 개의 완전한 길이의 헤비 체인들 및 두 개의 완전한 길이의 라이트 체인들을 포함하는 항체들뿐 아니라, 유도에(derivatives), 변이체(variants), 단편들, 및 그들의 돌연변이체(muteins)를 포함한다. 게다가, 명시적으로 배제되지 않는 한, 항체들은 단일클론 항체들, 양특이성 항체들, 미니바디들(minibodies), 도메인 항체들, 합성 항체들(synthetic antibodies)(가끔 본 명세서에서 “항체 모방체(antibody mimetics)”를 나타낸다), 키메라 항체들, 인간화 항체들, 인간 항체들, 항체 융합체들(가끔 본 명세서에서 “항체 접합체(antibody conjugates)”를 나타낸다), 및 그들의 단편들을 각각 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 용어는 또한 펩티바디들(peptibodies)을 망라한다.
ABP의 치료적으로 효과적인 양은 그들의 필요에 따라 대상에 투여될 수 있다. ABPs는 약제학적 조성물들의 형태로 제형화 될 수 있다. 이러한 조성물들은, 하나 이상의 ABPs뿐 아니라, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 버퍼(buffer), 안정제 또는 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비-독성이어야 하고 유효 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 예를 들어, 경구, 정맥, 피부 또는 피하, 코(nasal), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal)의 경로들과 같은 투여 경로에 의존할 수 있다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물들은 정제(tablet), 캡슐제, 파우더 또는 액상 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액상 약제학적 조성물들은 일반적으로 물, 석유(petroleum), 동물성 또는 식물성 오일들, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 생리 식염수(Physiological saline solution), 덱스트로오스(dextrose) 또는 다른 당류 용액(saccharide solution) 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜들이 포함 될 수 있다.
정맥, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에 주사를 위해, 유효 성분은 무 발열원(pyrogen-free)인 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있고, 적절한 pH, 등장도(isotonicity), 및 안정도(stability)를 가진다. 기술분야에서 이러한 관련 기술은, 예를 들어, 등장성 염화나트륨 주사액(Sodium Chloride Injection), 링거 주사액(Ringer's Injection), 락테이티드 링거 주사액(Lactated Ringer's Injection)과 같은 등장성 비히클들(isotonic vehicles)을 사용하여 적절한 용액을 잘 준비할 수 있다. 보존제(Preservatives), 안정제, 버퍼, 항산화제(antioxidants) 및/또는 다른 첨가제들이 필요하다면 포함될 수 있다.
ABP 투여는 “치료적으로 효과적인 양” 또는 “예방적으로(prophylactically) 효과적인 양”(비록 예방이 치료로 간주될 수 있다 하더라도, 상기가 그렇듯이)인 것이 바람직하고, 이는 개체에게 이득(benefit)을 나타내기에 충분한 것이다. 투여되는 실제 양 및 속도(rate) 및 투여 시간-코스(time-course)는 치료되고 있는 질병의 성질 및 중증도(severity)에 의존할 것이다. 예를 들어, 투여량에 대한 결정 등과 같은 치료의 처방전(Prescription of treatment)은 일반 진료의(general practitioners) 및 다른 의사들의 책임 내에 있으며, 전형적으로 치료되어야 할 장애(disorder), 개별적인 환자들의 질환, 전달 자리(site of delivery), 투여 방법 및 진료의들에게 알려진 다른 인자들을 고려한다. 상기 언급된 기술들 및 프로토콜들(protocols)의 예들은 레밍턴 약제학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980)에서 발견될 수 있다.
조성물은 단독 또는 다른 치료제들과 조합으로 동시에 또는 치료되어야할 질환에 의존하여 연속적으로 투여될 수 있다.
면역 세포
샘플은 면역 세포들을 포함할 수 있다. 면역 세포들은 T세포들 및 B세포들을 포함할 수 있다. T-세포들(T 림프구)은, 예를 들어, T 세포 수용체들을 발현시키는 세포를 포함한다. B-세포들은, 예를 들어, 활성화 B 세포들, 블라스팅(blasting) B 세포들, 형질 세포들, 형질아세포들, 기억 B 세포들, B1 세포들, B2 세포들, 변연대 B세포들(marginal-zone B cells), 및 소포성 B 세포(follicular B cells)를 포함한다. T세포들은 활성화 T세포들, 블라스팅 T세포들, 헬퍼 T세포들(이펙터 T세포 또는 Th 세포들), 세포 독성 T세포들(CTLs), 기억 T세포들, 중심 기억 T세포들, 이펙터(effector) 기억 T 세포들 및 조절 T세포들을 포함한다. 샘플은 어떤 적용(예를 들어, 관련된 T 또는 B세포들을 정의하는 검정 시험)에서 단일 세포를 포함하거나 또는 더 일반적으로는 1,000이상, 10,000이상, 100,000이상, 250,000이상, 500,000이상, 750,000이상, 1,000,000이상의 세포들을 포함할 수 있다.
B 세포
본 명세서에서 사용된 “B 세포”는 하나 이상의 재배열된 면역글로불린 유전자 부위(gene locus)를 가지는 모든 세포를 나타낸다. B세포는 하나 이상의 재배열된 면역글로불린 헤비 체인 부위 또는 하나 이상의 재배열된 면역글로불린 라이트 체인 부위를 포함할 수 있다. B세포는 하나 이상의 재배열된 면역글로불린 헤비 체인 부위 및 하나 이상의 재배열된 면역글로불린 라이트 체인 부위를 포함할 수 있다. B세포들은 후천성 면역 시스템(adaptive immune system)의 부분인 림프구이다. B세포들은 세포 표면 상의 B-세포 수용체(BCR)과 같은 막-결합 형태로 또는 분비된 항체들과 같은 항체들을 발현하는 모든 세포를 포함할 수 있다. B세포들은 면역글로불린들을 발현할 수 있다(항체들, B세포 수용체). 항체들은 헤비 및 라이트 면역글로불린 체인들로부터 형성된 헤테로다이머(heterodimers)를 포함할 수 있다. 헤비 체인은 불변 부위와 결합하는 가변 부위를 형성하는 가변성, 다양성(diversity), 및 접합성(junctional)(VDJ)유전자들의 유전자 재배열체로부터 형성된다. 라이트 체인은 불변 부위와 결합하는 가변 부위를 형성하는 가변성 및 접합성(VJ) 유전자들의 유전자 재조합체로부터 형성된다. 접합성 조합들의 많은 가능한 수 덕분에 항체 유전자의 가변 부위들(또한 BCR인)은 많은 다양성을 가지고, B세포가 외래성 항원(foreign antigen)을 인식하고 그에 대항하여 반응을 시작할 수 있게 한다.
B-세포 활성화 및 분화
B 세포는 그들이 염증성 면역 반응의 환경(context)에서 항원을 인식할 때 활성화되고 분화된다. 그들은 보통 활성화 되도록 하는 2개의 신호들, BCR(재배열 면역글로불린의 막-결합 형태)을 통해 전달되는 하나의 신호, 및 CD40 또는 다른 공동-자극성 분자(co-stimulatory molecule)를 통해 전달되는 다른 것들을 포함한다. 이 제2 신호는 그들의 표면 상에서 CD40에 대한 리간드(CD40L)를 발현하는 헬퍼 T세포들과의 상호작용을 통해서 제공될 수 있다. B세포들은 그런 뒤 증식하고 항체 유전자들의 뉴클레오티드 서열들 내에서 무작위적인 변화들이 만들어지는 체세포초돌연변이(somatic hypermutation)를 겪을 수 있고, B세포들의 항체들이 그 B세포들에 대해 더 높은 친화성을 가지는 B세포들이 선택된다. 그들은 또한 IgM 이소타입을 인코딩하는 헤비 체인의 불변 부위가 IgG, IgA, 또는 IgE 이소타입을 인코딩하는 불변 부위로 전환되는 것인 “클래스-전환(class-switching)”을 겪을 수 있다. 비록 어떤 기억 B세포들은 여전히 IgM 이소타입이긴 하지만, 분화하는 B세포들은 보통 높은 친화성이고 클래스 전환된 기억 B세포들이 될 수 있다. 기억 B세포들은 또한 형질아세포 내에서 그리고 결국, 형질 세포 내에서 활성화 및 분화할 수 있다. 분화하는 B세포들은 또한 먼저 형질아세포들이 될 수 있고, 그런 뒤 형질세포들로 분화할 수 있다.
친화성 성숙(Affinity maturation) 및 클론 패밀리들(clonal families)
클론 패밀리는 일반적으로 2 이상의 샘플들에 의한 관련된 면역글로불린(related immunoglobulin) 헤비 체인 및/또는 라이트 체인 V(D)J 서열들의 사용(use)에 의해 정의된다. 관련된 면역글로불린 헤비 체인 V(D)J 서열들은 유전체(genome) 내에서 인코딩되는 V(D)J 유전자 절편들의 그들의 공유된 사용에 의해 식별될 수 있다. 클론 패밀리 내에는 일반적으로 그들의 V(D)J 절편들 내에서 공유된 돌연변이체를 근거로 변화하는 서브패밀리들이 있고, 이는 B 세포 유전자 재조합 및 체세포초돌연변이 중에 발생할 수 있다.
활성화 B 세포들은 이동하여 그들이 친화성 성숙을 겪는 림프성 또는 다른 조직의 내에 있는 종자 중심을 형성한다. B세포들은 또한 종자 중심 밖에서 친화성 성숙을 겪을 수 있다. 친화성 성숙 중에, B세포들은 그들의 항체 유전자들 내에서 무작위적 돌연변이들을 겪고, B세포가 활성화되는 표적 항원에 대해 직접적으로 결합하여 인식하는 항체의 부분들을 인코딩하는 유전자들의 상보성 결정 부위(complementary determining regions, CDRs) 내에서 집중된다. 이는 오리지날 클론 및 서로 간에 조금 차이가 있는 면역글로불린들을 발현하는 오리지날(original) 증식성 B세포로부터 서브-클론들을 생성한다. 클론들은 항원과 경쟁하고 높은-친화성 클론들이 선택되나, 반면 낮은-친화성 클론들은 아포토시스(apoptosis)에 의해 사별한다. 이러한 과정은 B세포들의 “친화성 성숙”을 야기하고 그 결과 높은 친화성으로 항원에 결합하는 면역글로불린들을 발현하는 B세포들의 생성을 야기한다. 모든 B세포들은 클론 패밀리들을 형성하는 동일한 ‘부모’ B세포로부터 비롯된 것이며, 이러한 클론 패밀리들은 동일하거나 유사한 항원성 에피톱들을 인식하는 B세포들을 포함한다. 어떤 측면에서, 가장 높은-친화성 클론들이 친화성 성숙 중에 선택되므로, 우리는 높은 빈도수로 존재하는 클론들이 높은 친화성으로 항원에 결합하는 클론들을 나타낸다고 예상한다. 어떤 측면에서, 서로 다른 V(D)J 절편 유용성(usage)을 가지는 클론들은 서로 다른 결합 특성들을 나타낸다. 어떤 측면에서, 동일한 V(D)J 절편 유용성을 가지나 서로 다른 돌연변이를 갖는 클론들은 서로 다른 결합 특성들을 나타낸다.
기억 B세포
기억 B세포는 보통 친화성-성숙된(affinity-matured) B세포들이고, 클래스-전환된 것일 수 있다. 이러한 것들은 추후의 항원성 대항에 보다 신속하게 반응하여, 순수한 유기체에서 항체에 대한 친화성-성숙된 항체 분비에 포함되는 시간을 ~14일부터 ~7일까지 현저하게 감소시키는 세포들이다.
형질아세포 및 형질세포
형질 세포들은 긴시간-생존하거나 짧은시간-생존하는 것일 수 있다. 긴시간-생존하는 형질 세포들은 유기체의 생애 동안 생존할 수 있으나, 반면 짧은시간-생존하는 형질세포는 3-4일동안 지속될 수 있다. 긴시간-생존하는 형질세포들은 염증 영역, 점막 영역(IgA-분비성 형질세포의 경우), 2차 림프성 조직들(지라 또는 림프절과 같은), 또는 골수 내에서 존재할 수 있다. 이러한 분기하는(divergent) 영역들에 도달하려면, 긴시간-생존하는 형질세포가 되도록 운명지어진 형질아세포들은 적절한 영역들에 대한 트래픽(traffic)에 다양한 케모카인 구배가 활용되기 전에 먼저 혈관을 통해서 이동할 수 있다. 형질아세포들은 일반적으로 형질 세포들에 의해 생산되는 항체들의 양보다는 적은 양이긴 하지만, 친화성 성숙되고, 전형적으로 클래스-전환되고, 보통 항체들을 분비하는 세포들이다. 형질 세포들은 헌신적인 항체 분비자이다.
TCR 및 BCR 유전자들의 특성
재조합체들을 식별하는 것이 각 개체의 후천성 면역 세포의 DNA내에 존재하는 것뿐 아니라 그들의 연관된 RNA 전사체(transcripts)에도 존재하므로, RNA 또는 DNA는 시퀀싱될 수 있다. T-세포 또는 B-세포로부터 얻은 재조합된 서열은 또한 클로노타입(clonotype)으로서 나타내어진다. DNA 또는 RNA는 T-세포 수용체(TCR) 유전자들 또는 항체들을 인코딩하는 면역글로불린(Ig) 유전자들로부터 얻은 서열들과 일치할 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 TCR의 알파, 베타, 감마, 또는 델타 체인들을 인코딩하는 서열들과 일치 할 수 있다. 다수의 T-세포들에서, TCR은 알파-체인 및 베타-체인으로 구성된 헤테로다이머이다. TCR-알파 체인은 VJ 재조합에 의해 생성되고, 베타 체인 수용체는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다. TCR-베타 체인을 위해, 인간 내에는 48 V 절편들, 2 D 절편들, 및 13 J 절편들이 존재한다. 각각의 두 접합에서 수개의 염기들은 결실될 수 있고 다른 것들은 첨가될 수 있다(N 및 P 뉴클레오티드들로 불리는). 소수의 T-세포들에서, TCR은 감마 및 델타 체인들로 구성된다. TCR 감마 체인은 VJ 재조합에 의해 생성되고, TCR 델타는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다(Kenneth Murphy, Paul Travers, and Mark Walport, Janeway's Immunology 7th edition, Garland Science, 2007, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조인용 되어있다).
상기 방법들에 의해 분석된 DNA 및 RNA는 불변 부위들(알파, 델타, 감마, 엡실론, 또는 뮤)을 갖는 헤비 체인 면역글로불린들(IgH) 또는 불변 부위들 람다 또는 카파를 갖는 라이트 체인 면역글로불린들(IgK 또는 IgL)을 인코딩하는 서열들과 일치할 수 있다. 각 항체는 두 개의 동일한 라이트 체인들 및 두개의 동일한 헤비 체인들을 가질 수 있다. 각 체인은 불변(C) 및 가변 부위로 구성된다. 헤비 체인에 대해서, 가변 부위는 가변성(V), 다양성(D), 및 연결성(J) 절편들로 구성된다. 이러한 절편들의 각 타입을 코딩하기 위한 수개의 별개인 서열들은 유전체 내에 존재한다. 특정한 VDJ 재조합 이벤트는 B-세포의 발달 중에 발생하고, 특정한 헤비 체인을 생성하는 세포를 마킹한다. 라이트 체인 내에서 다양성은 D부위가 없고 오직 VJ 재조합만이 존재한다는 점을 제외하고는 유사한 형태(fashion)에서 생성된다. 체세포 돌연변이는 자주 재조합 자리와 가까운 곳에서 발생하고, 수개의 뉴클레오티드들의 첨가 또는 결실을 유발하고, 더욱이 B-세포들에 의해 생성된 헤비 및 라이트 체인들의 다양성을 증가시킨다. B-세포에 의해 생성된 항체들의 가능한 다양성은 그런 뒤 서로 다른 헤비 및 라이트 체인들의 생산물이다. 헤비 및 라이트 체인들의 가변 부위들은 항원 인식(또는 결합) 부위 또는 자리를 형성하는데 기여한다. 이에 덧붙여 다양성은 몇몇 에피톱에 대해 시작되는 특정한 반응 후에 발생할 수 있는 체세포 초돌연변이의 과정이다. 이러한 과정에서 돌연변이들은 특정한 에피톱과 더 강하게 결합할 수 있는 항체들 내에서 더 큰 다양성으로 이어지는 특정한 에피톱을 인식할 수 있는 이러한 B-세포들 내에서 발생한다. 이러한 모든 인자들은 B-세포들에 의해 생성된 항체들의 큰 다양성에 기여한다. 많은 수십억 및 어쩌면 1조 보다 많은 별개의 항체들이 생성될 수 있다. T-세포 다양성을 생성하는 것의 기본 전제는 B-세포들에 의해 항체들을 생성하는 것과 유사하다. T-세포 및 B-세포 활성화의 요소는 그들의 에피톱들에 대한 결합이다. 특정한 세포의 활성화는 세포들의 동일한 타입 이상의 생산으로 이어지고 클론 확장(clonal expansion)으로 이어진다.
상보성 결정 부위들(CDR), 또는 초가변 부위들(hypervariable regions)은 항원에 결합할 수 있는 항원 수용체들(예를 들어, T 세포 수용체 및 면역글로불린)의 가변 도메인들 내의 서열들이다. 각 항원 수용체의 체인은 세 개의 CDRs(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 함유한다. T 세포들(알파 및 베타) 및 면역글로불린(IgH 및 gK or IgL)을 만드는 두 개의 폴리펩티드들은 세 개의 CDRs의 형성에 기여한다.
TCR-베타에 의해 코딩되는 CDR1 및 CDR2의 부분은 47개의 기능적 V 절편들 중 하나의 내에 있다. CDRs의 다양성의 대부분은 T 림프구들의 발달 중에 체세포 재조합 이벤트들에 의해서 생성되는 다양성을 갖는 CDR3에서 발견된다.
BCR의 큰 다양성은 개인 간 및 개인 내(inter and intra-individuals)에서 존재한다. BCR은 항체 헤비 및 라이트 체인들을 코딩하는 두 개의 유전자들 IgH 및 IgK(또는 IgL)로 구성된다. 항원들 및 MHC 분자들에 결합하는 세 개의 상보성 결정 부위(CDR) 서열들은 IgH 및 IgK (또는 IgL)에서 최대 다양성을 갖는다. IgH에 의해 코딩되는 CDR1 및 CDR2의 부분은 44개의 기능적 V 절편들 중 하나의 내에 있다. 순수한 B 세포들내에서 다양성의 대부분은 B 림프구들의 발달 중에 체세포 재조합 이벤트들을 통한 CDR3의 생성 내에서 드러난다. 재조합은 V, D, 및 J 절편들의 각 하나를 가지는 분자들을 생성할 수 있다. 인간 내에서는, 44개의 V, 27개의 D, 및 6개의 J 절편들이 있으며; 따라서 7,000개가 넘는 조합들이 이론적으로 가능하다. BCRs의 소분획에서(약 5%) 두 개의 D 절편들이 발견된다. 게다가, 수개의 염기들은 결실될 수 있고 다른 것들(N 및 P 뉴클레오티드들로 불리는)은 큰 다양성 정도를 생성하는 두 개의 접합에 첨가될 수 있다. B세포 활성화 후에 체세포 초돌연변이를 통한 친화성 성숙화의 과정이 발생한다. 이 과정 내에서 활성화 B세포들의 자손 세포들은 CDR 부위내에서 더 높은 돌연변이 농도를 갖는 유전자 전체에 걸쳐 별개의 체세포 돌연변이를 축적하고 이는 항원들에 대해 더 높은 친화성을 가지는 항체를 생성하는 것으로 이어진다. 체세포 초돌연변이에 덧붙여 활성화 B세포들은 이소타입 전환의 과정을 겪는다. 동일한 가변 절편들을 가지는 항체들은 불변 절편들에 따라서 서로 다른 형태(이소타입들)을 가질 수 있다. 모든 순수한 B세포들이 IgM(또는 IgD)를 발현하는 반면, 활성화 B세포들은 대부분 IgG 뿐만 아니라 IgM, IgA 및 IgE를 발현한다. IgM (및/또는 IgD)로부터 IgG, IgA, 또는 IgE로의 이러한 발현 전환은 특정한 이소타입을 생성하는 것을 전문으로 하는 하나의 세포를 유발하는 재조합 이벤트를 통해서 발생한다. 각 IgM, IgD, and IgE에 대한 하나의 절편, IgA에 대한 두개의 절편들, 및 IgG에 대한 4개의 절편들이 존재한다.
방법
건강 관리 및 생명공학 사용에 대한 적용
항체들 및 TCRs을 식별하고 클론 패밀리들 내로 항체 및 TCR 서열들을 그룹핑하는 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들의 사용은 건강 관리 및 생명공학 연구에 대한 많은 유용하고 신규한 적용들을 갖는다. 항체 클론 패밀리들은 친화성-성숙된 비-동일성 클론들을 포함할 수 있고 TCR 클론 패밀리들은 동일한 클론들을 포함할 수 있다. 이러한 적용들은: 1) 항체 또는 항체-유래된 치료법(therapeutics)의 발견 및 개발; 2) 진단법(diagnostics)의 발견 및 개발; 3) 건강 및 생명 공학 연구에 유용한 연구 도구들의 발견 및 개발; 및 4) 백신 성분(components)으로 유용한 항원들의 식별 및 후보 백신들의 개발 및 평가를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명이 모든 타입의 B 또는 T 세포와 함께 사용될 수 있기 때문에, 세포 소스 및 특정한 B 또는 T 세포 서브타입(들)은 목적하는 궁극적인 생산물의 프로파일(profile)에 근거하여 선택된다. B 또는 T 세포들의 특정한 서브클래스들의 예들 및 그들의 용도는 일반적 재료 및 방법 섹션(General Materials and Methods section) 내의 서브섹션 “세포들 및 세포 서브개체군(subpopulations)의 분리 및 강화”에 기재되어 있다. 일반적으로, 세포들은 특정한 임상적 상태 또는 질병의 과정(course of disease)을 가지거나 또는 특정한 치료 방법(treatment regimen)을 받거나, 또는 특정한 대항, 면역화, 또는 면역 반응을 유도하는 질환들의 세트에 노출된 특정한 인간 또는 동물 대상으로부터 얻어질 수 있다.
치료적, 진단적, 및 연구 도구들의 발견 및 개발에 대한 적용
치료적, 진단적, 또는 연구 도구들로서 사용을 위한 항체 또는 항체로부터 유래된 분자를 개발하기 위해, 항체 및/또는 항체들의 항원-결합 부위들의 유도체들은 목적 항원(들) 또는 에피톱(들)에 결합하는 것 및/또는 생체 내 또는 시험관 내 시스템에서 목적하는 기능적 결과를 가지는 것으로서 먼저 식별되거나 발견될 수 있다. 그런 뒤 이러한 후보 항체들은 의도된 생산물에 특이적인 다른 목적하는 성질에 대해 더 스크리닝된다. 이러한 표적 생산물 성질들은 서로 다른 타입의 치료적, 진단적, 및 연구 도구 항체들에 따라 다를 것이며, 본 발명은 이러한 생산물 경로(paths) 중 임의의 것을 향해 더 개발하기 위한 후보들을 식별하는 유용한 수단들을 제공한다.
최종 생산물의 목적한 성질의 프로파일에 근거하여, 관련된 B세포들의 소스는 감염병(infectious disease), 암, 또는 자가면역 질환과 같은 질병을 가지는 환자; 암 치료법 또는 백신과 같은 치료를 받고 있는 환자; 또는 면역화 또는 질병모델의 유도/확립(establishment)과 같은 면역 반응을 유도하는 방법으로 처리되거나 질병을 갖는 동물일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 치료법, 진단법 또는 연구 도구들로서 개발을 위해 의도된 후보 항체들, 또는 항원-결합 부위들로부터 유래된 후보 거대분자(macromolecules)들은 두 개의 일반적인 접근법 중 하나로 나뉘는 다중 기술들을 통해 발견된다: 1) 인간 또는 동물의 면역 반응의 B 세포들로부터 얻은 관심 항체들의 분리; 및 2) 이종적으로 발현되고 하나 이상의 디스플레이 기술들을 사용하여 스크리닝된 면역글로불린 분자들, 또는 그들의 유도체의 발현 라이브러리들로부터 유래된 항체들의 분리(Hoogenboom HR, Trends Biotechnol., 1997,15:62-70; Hammond PW, MAbs, 2010, 2:157-64; Nissim A, Chernajovsky Y, Handb Exp Pharmacol., 2008, (181):3-18; Steinitz M, Hum Antibodies, 2009;18:1-10; Bradbury AR, Sidhu S, Dubel S, and McCafferty, Nat Biotechnol., 2011, 29:245-54; Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)에서 검토된).
전자의 접근(#1)을 위해, 후보 항체들은 예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션에 기재된 것으로서 관련 기증자(donors) 로부터 식별된 특정한 클론 패밀리들로부터 선택된다. 본 발명은 후보 항체들을 발견하거나 식별하기 위한 적절한 인간 기증자 또는 동물로부터 얻은 적절한 B-세포들(예를 들어, 블라스팅 B-세포들)로 기재된 것으로서 적용될 수 있다. 예를 들어, 암 치료법 항체 후보를 위해, 적절한 인간 기증자는 면역 반응을 통해서 암의 진행이 성공적으로 억제된 환자일 수 있고; 또는 특정한 진단법 항체 후보를 위해, 적절한 기증자는 진단 마커에 대한 자가항체(autoantibodies)를 가지는 환자 또는 마커에 대해 면역화된 마우스일 수 있고; 또는 항체 시약 도구 후보를 위해, 적절한 기증자는 마우스, 래빗, 고트(goat), 래트, 말, 닭, 개, 또는 표적 분자 및/또는 에피톱으로 면역화된 다른 동물들일 수 있고 항원 시약이 인식될 것이다. 발현 및 시험을 위한 항체들의 서열들 및 선택(selection)은 일반적 재료 및 방법 섹션에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다. 기술의 이러한 적용들은 더 힘들고 시간-소비적인 방법들(time-consuming methods)(예를 들어, 하이브리도마 기술, B세포의 바이러스-유도 불멸화 등)을 통해 흔히 수득되는 후보 항체들을 제공할 수 있다.
후자의 접근(#2)을 위해, #1에서 처럼 수득된 하나 이상의 인간 또는 동물 항체 레파토리들(repertoires)로부터 얻은 페어링된(paired) 헤비 및 라이트 체인 서열들의 서브세트 또는 전체 세트는 라이브러리 및/또는 라이브러리의 선택된/강화된 서브세트가 차세대 시퀀싱 플랫폼(next generation sequencing platform)을 사용하여 시퀀싱될 때 샘플 기원(sample origin) 및 그 샘플로부터 얻은 오리지널 동족 페어들(cognate pairs)을 추적하는 식별 부위들을 함유하는 발현 라이브러리들을 시딩(seed)하는데 사용된다. 가변 부위들 및 골격 부위 정보(framework region information)는 후보 항체들을 발견하는 하나 이상의 항체 디스플레이 라이브러리 포맷(formats)들 내로 통합될 수 있다. Ig 유전자들의 가변 부위들은 일반적인 재료 및 방법 섹션 내의 서브섹션 “클로닝된 라이트 및 헤비 체인 면역 글로불린 페어들의 클로닝 및 발현”에 기재된 방법들을 사용하여 클로닝되고 발현 벡터들 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, #1과 같이 수득된 동족 페어 헤비 및 라이트 체인들로부터 얻은 단편들 및/또는 도메인들은 비-내인성(비-동족) 페어링들 내의 서로 다른 헤비 및 라이트 체인들의 복합적 매칭과는 무관하게 오리진의 적절한, 오리지날 B세포로의 각 체인의 식별 부위추적으로 Fab 효모(Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR, et al., FEBS Lett, 2004, 564:24-34) 또는 파지미드(phagemid)(Kashyap AK, Steel J, Oner AF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105:5986-91) 라이브러리들을 시딩하는데 사용될 수 있다. #1과 같이 수득된 동족 페어 헤비 및 라이트 체인들은 또한 파지미드 또는 효모보다 나은 디스플레이 플랫폼들과 함께 사용될 수 있고, Fab 단편 발현 구조체들[Antibody Engineering (Kontermann, RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)]보다 나은 다른 항체 유도적 발현 구조체들과 함께 사용될 수 있다. 식별 부위들의 교대적 적용(alternate application)에서, 식별 부위들은 이미 존재하는 디스플레이 라이브러리들에 첨가되고 차세대 시퀀싱 데이터의 오류 수정(error correction 및 식별 부위 추적의 이점들을 제공할 수 있다. 라이브러리 타입, 포맷, 및 발현/디스플레이 시스템에 따라서, 식별 부위들은 PCR 반응들 또는 역전사 효소에 이은 PCR 반응들을 사용하여 통합될 수 있다(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션의 서브섹션, “단일 B-세포들로부터 얻은 페어링된 라이트 및 헤비 체인 면역글로불린 유전자들의 시퀀싱”을 인용한다).
B 세포 레파토리들(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션을 인용)로부터 얻어진 것이든지 또는 디스플레이 발현 라이브러리 “레파토리들”(Kashyap AK, Steel J, Oner AF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105:5986-91; Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR, et al., FEBS Lett, 2004, 564:24-34; Ravn U, Gueneau F, Baerlocher L, et al., Nucleic Acids Res, 2010, 38:e193; Antibody Engineering (Kontermann, RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)이든지, 후보 항체들은 목적하는 항원/표적(들) 및/또는 에피톱(들)에 대한 결합 검정 또는 생체 내 또는 시험관 내(생체 외 샘플들/준비들을 포함하는) 세팅(setting) 내에서 기능적 결과의 실험 검정 내에서 항체 또는 항체-유도 분자들, 또는 분자들의 라이브러리들을 발현하고 실험하는 것에 의해 식별된다. 출판된 보고서들은 발현 라이브러리 내에서 사용되기 위한 B-세포 레파토리로부터 수득된 항체 서열들의 지증자 소스를 추적하는 식별 부위들의 용도를 기재했다(예를 들어, Kashyap AK, Steel J, Oner AF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105:5986-91). 본 명세서에 기재된 식별 부위 기술은 이러한 식별 부위 처리 상의 유용한 개선을 특유하게 제공한다. 본 발명은: 1) 각 기증자 뿐만 아니라 동족 짝짓기 헤비 및 라이트체인들에 대한 기증자의 B 세포들까지 추적하는 수단을 제공하며; 2) 클로닝 및/또는 실험하기 위한 더 많은 샘플의 회수(retrieval)를 위한 오리지날 B 세포 샘플로 돌아가는 인덱스(index)하는 수단을 제공하며; 3) 발현 라이브러리 내의 비-동족 복합적 짝짓기에도 불구하고 헤비 및 라이트 체인 기원을 추적하는 수단을 제공하고; 4) 선택-강화(selection-enrichment)의 라운드들(rounds)에 걸쳐 헤비 및 라이트 체인을 추적하는 수단을 제공한다(예를 들어 시험관 내에서 풀(pool) 선택 중에 서열 진화를 모니터링할 때, Ravn U, Gueneau F, Baerlocher L, et al., Nucleic Acids Res, 2010, 38:e193 내에서와 같이).
B세포 면역 반응 레파토리 내에서 가장 빈번하게 나타나는 헤비 또는 라이트 체인 서열들의 식별, 및 개별 체인들의 빈도 순에 근거하는 헤비 및 라이트 체인 페어들의 조합(combining)은 이러한 방법으로 수행되었을 때 동족 페어 정보가 차세대 서열 분석 내에서 유지되지 않음에도 불구하고 어떤 후보 항체들을 식별하는 실행가능한 방법들인 것으로 보인다(Reddy ST, Ge X, Miklos AE, et al., Nat Biotechnol, 2010, 28:965-9). 본 발명은 또한 이러한 빈도 분석 방법론의 타입을 고려하나, 단순히 분리된 것이 아니라, 헤비 및 라이트 체인들과 독립된 레파토리 내에서 실제 항체들의 빈도를 평가하는 차세대 시퀀싱을 사용하는 방법을 더 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 빈도수 분석보다 나은 중요한 유틸리티의 3가지 이상의 개선을 제공한다: 1) 헤비 및 라이트 체인들의 동족 짝짓기를 추적할 수 있기 때문에, 면역 반응 내에서 B세포들에 의해 생산된 실제 항체 클론 패밀리들 및 면역 반응으로부터 얻은 실제 항체들의 발견이 식별될 수 있다(클론은 동일한 전구세포(cell progenitors)로부터 공동-진화된 헤비 및 라이트 체인들의 특이적, 동족 페어을 포함하고 친화성 성숙화 과정 내에서의 자연적 짝짓기에 대한 정보는 차세대 시퀀싱을 사용하여 면역 반응들을 분석하는 문헌 내에 기재되어 있는 접근법들을 향상시킨다[예를 들어, Wu X, Yang ZY, Li Y, Hogerkorp CM, et al., Science, 2010, 329:856-61]); 2) 식별 부위는 차세대 시퀀싱 플랫폼들에게 공통된 시퀀싱 오류들의 서열 분석들에 대한 영향을 최소화하거나 또는 제거하는 방법들을 제공한다(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션 내의 서브섹션, “다른 시퀀싱 데이터 분석 옵션”을 인용); 그리고 3) 식별 부위들은 단일 세포 수준에서 공동-발현된 ≥2의 서열들을 링크하고 추적하는 능력을 제공한다.
항원, 표적, 또는 에피톱, 또는 목적하는 기능적 효과를 가지는 것에 대해 목적하는 결합 성질들을 가지는 것으로서 식별된 이러한 후보 항체들을 위해, 각각의 클론 패킬리로부터 얻어진 더 많은 항체들은 유사하나, 잠재적으로는 더욱 최적인 항체들의 존재 또는 결합 또는 기능적 성질들이 같으나 최종 생산물 프로파일과 서로 다른 의미를 함유하는 항체의 존재를 실험하기 위해 클로닝되고 발현될 수 있다(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션을 인용).
후보들이 디스플레이 발현 라이브러리들로부터 식별되는 경우를 위해, 식별 부위들은 스크리닝 강화에서는 선택되지 않았으나 식별된 후보들의 식별 부위들을 함유하고 있고, 따라서 라이브러리에 시딩된 오리지널 헤비 및/또는 라이트 체인들과 동일한 것으로부터 유래된 서열들을 식별하는 것에 의해 후보들과 잠재적으로 유사한 서열의 항체들을 식별하는 방법을 제공할 수 있다. 항체들은 시험관 내 선택의 라운드들에서 손실되었으나, 선택된 것들과 유사하며, 후보 항체들은 추후의 분석에서 잠재적 후보들로서 회수 또는 “구제(rescued)” 될 수 있다. 이러한 구제는 유용하고 기능적 항체들을 놓칠 수 있는 발현 또는 검정 시스템 내에서 바이어스(bias)의 효과를 제거할 수 있다(Ravn U, Gueneau F, Baerlocher L, et al., Nucleic Acids Res, 2010, 38:e193).
일단 목적하는 결합 및/또는 기능적 성질들을 갖는 후보들이 식별되면, 그들은 목적하는, 하류, 생산물 프로파일에 근거하여 관련된 검정들 및 다른 평가들로 진행될 수 있다. 수동 면역화(passive immunization)에 사용되기 위해 의도된 치료적 항체들을 위해, 후보들은 인간의 임상 실험 또는 동물 건강의 사용을 위해 가장 뛰어난 후보들을 결정하는 검정들 및 임상전(preclinical) 실험 모델들로 진행되며, 이는 안정성 및 응집(aggregation), 제형 및 투여 용이성(dosing ease), 단백질 발현 및 준비, 종 선택성(species selectivity), 약리학, 약물동력학(pharmacokinetics), 안전성 및 독성학, 흡수(absorption), 대사(metabolism) 및 표적-항체 턴오버(target-antibody turnover), 뿐아니라 면역원성(immunogenicity)과 같은 성질들의 평가들을 포함하나 이제 제한되지는 않는다[예를 들어, 하기를 인용한다, Lynch CM, Hart BW, and Grewal IS, MAbs, 2009, 1: 2-11; Chapman K, Pullen N, Coney L, et al., mAbs, 2009, 1, 505-516; S. Dubel, Handbook of Therapeutic Antibodies: Technologies, Emerging Developments and Approved Therapeutics (John Wiley ＆ Sons, 2010); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, (Z. An ed., John Wiley ＆ Sons, 2009) Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)]. 따라서 인간에 대한 실험(즉, 생리적 마모(attrition)) 이전에 평가될 필요가 있는 많은 성질들 중 하나 이상의 것에 대한 인간의 치료적 실험에 그 다수가 충분하지 않을 것이기 때문에 많은 후보들이 선택된다. 클론 패밀리들은, 예를 들어, 상기에 기재된 대로, 이미 특성화된(characterized) 것들과 유사한 후보군들을 위해 발굴될 수 있으나, 아마도 임상전 작업(preclinical work)에서 평가되는 하나 이상의 성질들에 관해 차이를 내포한다(harboring). 특이적 항체 공학 전략들은 특정 성질들을 최적화 하는데 사용될 필요가 있을 수 있다[Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)].
진단법을 위해, 본 발명은 모든 비-감염성 질병, 병리 조건(pathological condition), 또는 의학적 치료(medical treatment) 또는 치료법(therapy)을 위한 것뿐만 아니라 감염원들(infectious agents)의 탐지에 사용하기 위해(Selvarajah S, Chatterji U, Kuhn R, et al., 2012, 6:29-37; Berry JD, Vet J, 2005, 170:193-211) 감염 또는 백신화(vaccination)에 의해 생산되는 항체들, TCRs, 및 클론 패밀리들을 식별하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체들, TCRs, 및/또는 클론 패밀리들은 유용한 진단적 프로브들을 바이오마커들로서 제공할 수 있으며 또는 인간 또는 동물에 대한 질병 상태 또는 그에 대한 치료의 효과에 관한 면역 시스템 정보를 제공할 수 있다. 이런 점에서, 특이적 항체들 또는 TCRs, 또는 면역 수용체 클래스들 중에서 어느 하나의 특이적 클론 패밀리들은 진단적 도구들 및 개인 맞춤형 의료(personalized medicine)에 대한 유틸리티들을 제공할 수 있다. 진단법에 대한 다른 적용에서, ELISAs 또는 다른 면역검정법들과 같은 진단적 실험에서 차후에 사용될 수 있었던(Selvarajah S, Chatterji U, Kuhn R, et al., 2012, 6:29-37)바이오마커에 대한 항체들을 식별하기 위해 B세포들이 채취되는(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션을 인용)마우스들 또는 다른 동물들을 면역화하는 면역원들로서 알려진 질병 또는 치료 반응 바이오마커들이 사용될 수 있다. 일단 잠재적인 진단 유틸리티를 가지는 것으로서 식별되면, 후보 항체들, TCRs, 및/또는 클론 패밀리들은 검정들, 모델들, 및 아마도 진단 생산물의 목적하는 프로파일과 관련된 시험들(trials)에 진행될 수 있다[Berry JD, Vet J, 2005, 170:193-211; Diagnostic and Therapeutic Antibodies in Methods in Molecular Medicine, Vol. 40 (George AJT and Urch CE eds., Humana Press); Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition) ; Colwill K, Renewable Protein Binder Working Group, and Graslund S, Nat Methods, 2011, 8:551-8; Pershad K, Pavlovic JD, Graslund S, et al., Protein Eng Des Sel, 2010, 23:279-88.]. 특이적 항체 공학 전략들은 특정 성질들을 최적화 하는데 사용될 필요가 있을 수 있다[Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)].
연구 도구 항체들을 위해, 예를 들어 상기에 기재된 것처럼 식별된 후보들은 연구 도구 항체가 의도되는 연구 적용에서 그들이 어떻게 수행하는지 실험하는데 진행될 수 있다(예를 들어, 면역침전법(immunoprecipitation); 면역블로팅법(immunoblotting); 면역염색법 및 조직학; 면역친화성 정제; 캡쳐-(capture-), 및 샌드위치-(sandwich-), 및 탐지(detection) 면역검정법들(immunoassays); 예를 들어 Antibodies: A Laboratory Manual, E Harlow and D Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에 기재된 것). 확인 기준(Validation criteria)은 최종 의도된 연구 용도를 근거로 할 것이다(Colwill K, Renewable Protein Binder Working Group, and Graslund S, Nat Methods, 2011, 8:551-8; Pershad K, Pavlovic JD, Graslund S, et al., Protein Eng Des Sel, 2010, 23:279-88). 특이적 항체 공학 전략들은 특정 성질들을 최적화 하는데 사용될 필요가 있을 수 있다[Antibody Engineering (Kontermann RE and Dubel S eds., Springer, 2nd edition)].
백신 발견 및 개발에 대한 적용
본 발명은 인간 또는 동물 내에서 백신 대항에 대한 항체들, TCRs, 및 이러한 각 면역 수용체 클래스들의 클론 패밀리들을 식별하는데 사용될 수 있다. 특이적 항체들은 항체 및 프로브로서 사용되는 항체들이 속하는 클론패밀리에 의해 인식되는 백신 성분(들)을 식별하는 프로브들로서 사용될 수 있다. 항체 및 클론 패밀리들에 대한 이러한 정보는 특정한 항원들 및/또는 백신의 에피톱들을 표적화하는 면역 반응의 비율(proportions) 또는 강도(strength)에 대해 평가하는데 사용될 수 있다. 서로 다른 백신 성분들에 대한 항체 면역 반응들의 평가는 백신에 대한 수반 TCR(concomitant TCR) 레파토리 반응에 관해 수집된 정보들로 보완될 수 있다(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션 내의, 서브섹션, “다른 세포 타입들을 위한” 및 “다른 면역글로불린 헤비 체인들 및 T-세포 수용체(TCR) 체인들의 PCR”을 인용). 이러한 정보는 추후에 백신의 어떤 성분들, 또는 백신의 어떤 변이체들, 또는 어떤 보조제들이 인간 또는 동물의 면역 시스템의 효과적인 또는 더 최적인 반응들을 생산하는지를 이해하는데 사용될 수 있다(Haynes BF, Gilbert PB, McElrath MJ, et al., N Engl J Med, 2012, 366:1275-86). 상기 접근법은 또한 백신에 대한 개체들 또는 개체군들의 반응에서 개체들 또는 개체군들을 비교하는데 사용될 수 있다.
유사한 분석법들은 실제 병원체(pathogen)에 대한 반응에서 생성되는 항체들, TCRs, 및 클론 패밀리들을 식별 및 평가하기 위해 수행될 수 있으며, 감염에 대한 보호적 반응들(예를 들어, 심각한 인플루엔자 세계적 유행병의 생존자들로부터얻은 항체들의 식별(identification of antibodies from survivors of a severe influenza pandemic, Yu X, Tsibane T, McGraw PA, et al., Nature, 2008, 455:532-6); 또는 광범위하게 HIV-중화 혈청들로 HIV-감염 개체들로부터 얻은 특이적 항체들의 식별(identification of specific antibodies from HIV-infected individuals with broadly HIV-neutralizing sera, Wu X, Yang ZY, Li Y, Hogerkorp CM, et al., Science, 2010, 329:856-61) 및 Walker LM, Phogat SK, Chan-Hui PY, et al., Science, 2009, 326:285-9)과 같은 관심 임상적 결과들과 연관성이 있을 수 있다. 보호의 이러한 연관체들의 식별은 상기에 기재된 백신 및/또는 특이적 백신 성분들에 의해 생성되는 반응과 비교될 수 있고 두 개의 데이터세트들은 실제 감염의 경우에서 보여지는 목적하는 결과들과 연관성이 있는 면역 반응들을 생성하는 백신의 능력을 평가하는데 비교될 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 또는 동물이 실제 감염으로 대항되기 전에, 항체 및/또는 TCR 레파토리 서열 분석을 통한 질병 보호 및 백신 반응의 서로게이트 판독(readout)을 수득하는 유용한 방법을 제공한다. 일단 클론 패밀리가 특정한 항원 또는 에피톱에 결합하는 것으로 식별되면, 다른 면역 반응 레파토리들에 의해 표적화된 항원들 또는 에피톱들의 식별은 동일하거나 유사한 클론 패밀리들이 레파토리 전체에 걸쳐 발견되는 경우에서 검정을 하지 않고 가능하다. 따라서, 클론 패밀리 및 그 항원/에피톱 결합에 대한 충분한 정보가 알려져 있는 경우에는(예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션의 서브섹션, “발현된 인간 항체들의 스크리닝”을 인용), 새롭게 분석된 레파토리들의 서열 분석법은 그것이 함유되어 있는 알려진 클론 패밀리들을 위해 그 레파토리의 항원의 판독을 단독으로 제공할 수 있다. 이 적용은 백신 임상적 시험들에서 하나, 어느 정도, 또는 많은 대상들 전체에 걸친 반응들을 모니터하는 유용한 방법과 개체군 수준 상에서 하나, 어느 정도, 또는 많은 사람에 대한 면역력 및 감염성 질병 관계를 모니터하는 유용한 방법을 제공할 수 있다.
또한, 항체, TCR, 및 병원체로부터 얻어진 보호와 연관성이 있는 클론 패밀리들은 병원체에 대한 보호적 및/또는 효과적 면역 반응들을 매개하는 특이적 항원들 및 항원들의 세트들(알려지고 신규한 항원들 모두를 포함하는)을 식별하는데 사용될 수 있다. 효과적인 면역 반응들 내에서 표적화된 항원들의 식별은 면역화된 인간들 및 동물들 내에서 보호적 항체- 및 TCR-매개 반응들을 생산할 것으로 예상되는 백신들에 포함되는 항원들의 선택을 가이드(guide) 하는데 사용될 수 있다.
검정법들에서 알려진 항원들과 결합하지 않는 항체들, TCR, 및 클론 패밀리들은 항체들 및/또는 TCRs이 보호를 제공하는 병원체의 신규 항원들 및/또는, 에피톱들을 잠재적으로 식별하기 위한 후보들이 된다. 이미 알려진 항원들에 결합하지 않는 것으로 알려진 항체들은 이전에 식별되지 않은 항원 또는 에피톱들을 식별하는 면역분리법(immunoseparation) 및 질량분석법(mass spectroscopy)과의 조합에서 프로브들로서 사용될 수 있다(Zhu YZ, Cai CS, Zhang W, et al., PLoS One, 2010, 5:e13915; 및 예를 들어, 일반적 재료 및 방법 섹션 내의 서브섹션들, “포도상구균(staph)-감염된 환자들로부터 유래된 항체들오 포도상구균 항원들의 면역침전법” 및 “펩티드들의 질량 분석법 식별”을 인용). 이러한 신규 항원들 또는 에피톱들은 면역화된 인간들 또는 동물들 내에서 보호적 항체- 및 TCR-매개 반응들의 생성을 생산하거나 또는 그에 기여하는 것으로 예상되는 백신 성분들로서 사용될 수 있다.
미생물 병원체들(microbial pathogens)에 대한 백신들의 개발을 촉진하는 것에 더하여, 항체, TCR 및 클론 패밀리들은 또한 종양(tumor) 백신들을 개발하는데 사용될 수 있다. 암 또는 전암성(pre-cancerous) 세포들에 대한 면역 반응을 시작하는 인간들 또는 동물들은 암에 대한 예방적 또는 치료적 백신들에 통합될 수 있는 개별적 항원들 및 그들의 조합을 식별하는데 사용될 수 있는 항원들, TCR, 및 클론패밀리들 산출할 수 있다.
하나 이상의 관심 뉴클레오티드들을 생산하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 하나 이상의 대상들로부터 수득된 복수의 샘플들과 연관된 복수의 cDNAs를 포함하는 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 cDNA는 복수의 샘플들 내의 단일 샘플과 연관되어 있고, 상기 각 샘플과 연관된 각 cDNA는 독립된 용기에 존재하는 단계; 각 샘플과 연관된 cDNA에 어댑터 분자를 첨가하는 단계로서, 상기 어댑터 분자는 샘플 식별 부위 및 어댑터 부위를 포함하고, 상기 샘플 식별 부위는 어댑터 부위와 커플링 된 것이고, 상기 각 어댑터 분자의 샘플 식별 부위의 서열은 라이브러리 내의 각 cDNA에 첨가된 다른 어댑터 분자들의 샘플 식별 부위의 서열과 별개의 것인 단계; 어댑터 부위를 라이브러리 내의 각 cDNA에 부착하고 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생성하게 하는 단계; 를 포함한다.
어떤 측면에서, cDNA 라이브러리를 수득하는 단계는 복수의 샘플들을 수득하는 단계 및 cDNA 라이브러리를 준비하는 샘플들을 가공하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, cDNA 라이브러리를 수득하는 단계는 cDNA 라이브러리를 준비하기 위해 복수의 샘플들을 가공한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 cDNA 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
어떤 측면에서, 어댑터 분자들은 범용 프라이머 부위를 더 포함하며, 상기 범용 프라이머 부위의 3’말단은 샘플 식별 부위의 5’말단과 커플링 된다. 어떤 측면에서, 각 cDNA 부위는 cDNA 폴리뉴클레오티드로 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 측면에서, 각 샘플은 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 세포는 B세포 이다. 어떤 측면에서, B세포는 형질아세포, 기억 B세포, 또는 형질 세포이다. 어떤 측면에서, 각 샘플은 복수의 세포들을 포함한다.
어떤 측면에서, 각 어댑터 부위는 예를 들어, G:C 결합과 같은 결합을 통해 각 cDNA에 부착된다.
어떤 측면에서, 어댑터 분자는 단일-가닥이고, 효소가 어댑터 분자를 이중-가닥으로 만들게 하는 것에 의해 각 cDNA 내에 어댑터 분자를 통합하는 것을 더 포함한다. 어떤 측면에서, 어댑터 분자는 각 cDNA 내에 통합되며 MMLV H- 역전사 효소에 의해 관심 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
어떤 측면에서, 방법들은 PCR 및 일반적으로 기술 분야에서 알려진 다른 증폭 반응들과 같은 증폭 단계들을 포함할 수 있다.
관심 폴리뉴클레오티드를 링크 및 바코딩하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 예를 들어, 단일 샘플로부터 얻은 항체 라이트 체인(LC) 및 헤비 체인(HC)과 같은 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열들을 링크하는 단계, 및 하나 이상의 바코드 또는 서열 식별 서열들을 제공하는 단계를 포함한다. 이 측면에서, 본 명세서에는 관심 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 물리적 링크뿐 아니라 예를 들어, 단일 세포, 샘플 웰, 단일 샘플 등과 같은 특정 소스 또는 샘플로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열들을 결정될 수 있게 하는 식별자(identifier)를 제공하는 하나 이상의 바코드들이 제공된다. 단일 샘플들은 하나 이상의 B-계통 세포들(B-lineage cells) 또는 다른 세포 타입들을 포함할 수 있다. 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열들을 링크하는 방법들의 예들은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, WO 99/16904, WO 93/03151, US 7,749,697이 있으며 이들은 본 명세서에 참조 인용되어있다. 링크된 폴리뉴클레오티드 서열들 상에서 바코드들의 사용과 연관된 다른 장점들 중에는 오리지널 샘플로 돌아가는 서열의 고-처리 시퀀싱 및 맵핑(mapping)의 촉진을 포함하고 그리하여 이는 재-시퀀싱(re-sequenced)될 수 있고 PCR 클로닝될 수 있으며 예를 들어 HC 및 LC 면역글로불린 폴리뉴클레오티드들과 같은 폴리뉴클레오티드 서열들을 발현할 수 있다. 고처리 시퀀싱 기술들의 어떤 것은 1-10+%의 시퀀싱 오류율을 나타내고, 바코드들의 사용은 주형의 시퀀싱을 반복 가능하게 하여 생물정보학적 오류 수정을 촉진한다. 이는 면역그로불린 폴리뉴클레오티드들 내에 있는 것들과 같은, 유전자 변이들로부터 온 특징적인 시퀀싱 오류들에 특히나 중요하다. 구체적으로, 가깝게 관련된 서열들이 사실은 별개의 서열들이거나 또는 그들이 대신 시퀀싱 오류들로부터 생성된 아티팩트들(artifacts)을 나타낸다면 이를 알아내기 어려울 수 있다. 바코드들은 개별적인 주형들의 반복 시퀀싱의 분석을 가능하게 하는 것에 의하여 시퀀싱 오류 수정을 가능하게 하고, 따라서 어떤 서열들이 시퀀싱 오류(들)로부터 온 아티팩트들에 비해 별개의 것인지 여부의 결정을 제공한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열들은 체세포 초도열변이 때분에 분기된 면역글로불린 HC 및 LC 서열들이며, 오직 1 뉴클레오티드의 차이가 난다.
이 측면에서, 도 15에 나타낸 바와 같이 물리적으로 링크되고 바코드된 구조들이 일반적으로 수득된다. 도 15는 두 핵산 절편들, A 및 B(예를 들어, 두 개의 cDNAs)의 물리적 링크(physical linkage)을 설명한다. A 바코드(BC)는 모든 말단들 중 하나 또는 A 및 B를 연결하는 링커 내에 부가(appended)된다. 바코드의 첨가뿐 아니라 이 A 및 B의 물리적 링크는 하기에 더 상세히 기재되는 것으로서 라이게이션, 재조합, 증폭, 또는 중복-확장, 또는 이러한 방법들의 조합에 의하는 것을 포함하는 모든 몇 개의 방법들을 통해서 성취된다. 선택적으로, 추가적인 바코드들은 도 15에 나타낸 구조에 첨가될 수 있으며, 더 적은 수의 바코드들을 사용하여 많은 수의 링크된 폴리뉴클레오티드들의 시퀀싱을 가능하게 하는 합성 바코딩(compound barcoding)을 제공한다. 또한, 두 개의 핵산 절편들을 링크하는데 사용된 특정한 전략에 따라서, 절편들의 모든 상대적인 방향(relative orientation)이, 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 방향에 대해서, 수득될 수 있다는 것, 즉, cDNAs과 같은 절편들이 헤드(head)에서 테일(tail), 헤드에서 헤드, 또는 테일에서 테일로 연결될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
바코드들은 본 기술 분야에 알려진 방법들을 사용하여 물리적 링크 이전, 도중 또는 이후에 폴리뉴클레오티드에 첨가될 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어, 바코드 어댑터들의 블런트 말단 라이게이션과 같은 라이게이션 방법들, 및 호모폴리머(homopolymeric) 테일링, 링커의 제한 효소 분해, 또는 역전사효소에 의한 cDNA의 3’테일링에 의해 생성되는 것들과 같은 호환가능한 말단들(compatible ends)의 어닐링 및 라이게이션에 의하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바코드들은 또한 바코드 서열들을 지니는 적절한 프라이머들을 사용하여 증폭 반응들 내에서 첨가될 수 있다. 바코드들은 또한 바코드 서열을 함유하는 적절한 프라이머들을 사용하여 역전사 반응 내에 첨가될 수 있다. 바코드들은 또한 중복-확장 테일들 또는 다른 방법들을 통해서 관심 유전자들을 서로 링크하곤 하는 올리고뉴클레오티드들 내에서의 통합에 의해 첨가될 수 있으며, 그리하여 그들은 두 개의 관심 유전자들 사이에 위치한다. 따라서, 이러한 방법들을 사용하여, 바코드들은 물리적으로 링크된 폴리뉴클레오티드 서열들의 말단들 상에 또는 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열들을 연결하는 링커 서열들 내에 통합될 수 있다.
일 구현예에서, 링크는 중복-확장의 사용을 통해 성취된다(도 16을 인용). 일반적으로, 중복 확장 테일들은 연결되어야 할 관심 폴리뉴클레오티드 서열들에 첨가되는 상보적인 서열들이다. 관심 폴리뉴클레오티드 분자들에 부가되는 중복-확장 테일들의 어닐링은 그들이 링크될 수 있게 한다(도 17, 18, 19 및 20을 인용). 하기에 기재된바와 같이, 중복-확장 테일들은 핵산 증폭 및 역전사와 같은 폴리뉴클레오티드 합성 반응들, 라이게이션, 및 재조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 잘 알려진 몇 개의 방법들을 통해서 첨가될 수 있다. 링크를 이루는 것을 가능하게 하는 다양한 방법을 때문에, 폴리뉴클레오티드 절편들의 서로 다른 상대적인 방향들이 수득될 수 있고, 센스 및 안티센스 방향에 대해서, 즉, 절편들, 예를 들어 항체 헤비 및 라이트 체인들은 머리에서 테일, 머리에서 머리, 또는 테일에서 테일로 연결될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
일 구현예에서, 중복-확장 테일들은 폴리뉴클레오티드 합성 반응 중에 생성되는 폴리뉴클레오티드 서열들의 링크를 가능하게 한다. 예를 들어, 중복 확장 테일들은 중복-확장 테일을 지니는 프라이머들을 사용하는 것에 의해, 증폭 또는 역젼사 반응들과 같은 폴리뉴클레오티드 합성 반응들의 과정중에 도입될 수 있다. 대안적으로, 라이게이션 반응이 사용될 수 있다. 도 17, 18, 19, 및 20에 나타나 있듯이, 상보적인 중복 확장 테일들의 어닐링 후에, DNA는 PCR과 같은 폴리뉴클레오티드 합성 반응의 확장 단계(phase) 중에 5’부터 3’방향으로 채워지고, 물리적으로 연결된 두 개의 관심 뉴클레오티드들을 가지는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
어떤 구현예에서, 중복-확장 RT-PCR 방법은 단일 튜브 내에서 반응이 진행되는 동안 서열들이 동시에 링크되도록 하며, 따라서 중간 정제(intermediate purification)의 필요를 제거한다. 어떤 구현예에서, 중복 확장 테일은 바코드 서열을 포함한다.
도 17은 항체 라이트 및 헤비 체인들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 연결하고 하나 이상의 바코드를 제공하는 중복-확장 테일들의 사용의 하나의 예를 일반적으로 설명한다. 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열들을 링크하는데 유용한 다른 방법들은 하기에서 논의된다. 이 예시에서, 예를 들어, 역전사와 같은 폴리뉴클레오티드 합성이 발생한 후에, 바코드, 선택적인 시퀀싱 프라이머 자리, 및 선택적인 제한 자리(RE1)를 함유하는 LC 유전자 특이적 PCR 프라이머의 사용은 이러한 요소들이 생성된 PCR 생산물의 말단에 첨가되게 한다. 확장 중복들(extension overlaps)을 가지고 선택적인 제한 자리(RE3)을 인코딩하는 LC(일 구현예에서 VL부위) 및 HC(일 구현예에서 VH 부위)에 특이적인 프라이머들이 나타내어진다. 일 구현예에서, LC는 불변 부위의 짧은 절편을 갖거나 갖지 않는 재배열된 VJ를 포함하고, HC는 헤비 체인의 불변 부위의 짧은 절편들을 갖거나 갖지 않는 재배열된 V(D)J를 포함한다. 일 구현예에서, 중복-확장 프라이머들은 또한 바코드 서열을 함유한다. 선택적인 RE2를 함유하는 HC에 특이적인 리버스 프라이머(reverse primer)가 또한 사용된다. 이러한 프라이머들로 증폭을 진행하는 동안, 나타낸 링크된 구조(linked structure shown)를 갖는 핵산은 한 말단에서 바코드와 함께 생성된다. 단일 샘플들 내에서 수행된 반응들로부터 얻은 생산물들은 본 명세서에 개시된 다른 작업 흐름들 내로 쉽게 합쳐(integrated)질 수 있다. 예를 들어, 선택적인 제2 바코드는 제1 바코드와 함께 추가되고 사용될 수 있으며 또한 상대적인 최소 숫자의 바코드들을 사용하여 많은 숫자의 서열들을 식별하는 멀티플렉싱(multiplexing)을 가능하게 한다. 시퀀싱을 위해, 단일 바코드가 충분할 수 있다.
도 17에 나타낸 일반적인 도식의 변이들, 본 명세서에 설명되어 있는 예시들, 은 명백할 것이다. 예를 들어, 바코드는 최종 생산물의 다른 말단, 또는 양 말단들 모두, 또는 폴리뉴클레오티드들 사이에 위치할 수 있다. 또한, 바코드는 확장 복합 부위의 부분으로서 포함될 수 있다(예를 들어, RE3의 양 측면 중 하나 또는 바코드는 RE3 서열에 의해 쪼개질 수 있다).
LC(VL 서열들을 포함) 및 HC(VH 서열들을 포함) 서열들은 다양한 방법들을 통해서 유래될 수 있다. 예를 들어, 그들은 올리고 dT 또는 유전자 특이적 프라이머들을 가지는 mRNA의 역전사를 통하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 역전사 및 그 후의 증폭 반응들은 동시에 수행되며, 즉 RT-PCR 반응, 최종 생산물을에 도달한다. 역전사가 사용되었을 때, 제한 자리들, 시퀀싱 프라이머 자리들, 또는 범용 서열들과 같은 다른 요소들뿐 아니라, 확장 중복 자리가 예를 들어, 도 18, 19, 및 20에 나타낸바와 같이 역전사 반응 내에서 생성된 cDNA의 3’테일링에 의해 생성된 하나 이상의 G 잔기들 내지 하나, 둘, 셋, 또는 그 이상의 C잔기들을 포함하는 어댑터의 어닐링을 통해서 첨가될 수 있다. 역전사 효소에 의한 주형 전환은 확장 중복 부위(및 다른 서열 요소들)을 cDNA에 첨가되도록 한다. 예를 들어, 도 18에 나타낸바와 같이, 3’ 테일링 및 역전사 효소의 주형 전환 활성을 이용할 때, 제1 기증자는 확장 중복 서열 및 바코드를 관심 제1 뉴클레오티드에 첨가하는데 사용될 수 있으며, 반면 제1 기증자의 중복-확장에 대해 상보적인 서열을 가지는 제2 기증자는 관심 제2 cDNA에 첨가될 수 있다. 상보적인 확장 중복 서열들은 그 이후의 PCR과 같은 핵산 합성 반응 중에 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드들을 연결하도록 어닐링한다. 중복의 포인트(point)로부터 확장은 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드들이 그들 사이에 바코드로 링크된 이중 나선 DNA 분자를 야기한다. 두 개의 링크된 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 두 개의 내부적으로 위치한 바코드들의 세대를 가능하게 하는 변이들은 도 19 및 20에 나타나있다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열들을 연결(joining) 또는 링크(linking)하는 다른 방법들은 라이게이션에 의한 것을 포함한다. 이 구현예에서, 증폭을 위해 사용되는 프라이머 믹스(mix)가 디자인되어 증폭된 표적 서열들이 적절한 제한 효소들로 절단될 수 있고, DNA 라이게이션에 의한 공유결합적 링크가 수행될 수 있다. 이러한 프라이머 믹스로 증폭에 뒤이어, 표적 서열들의 호환가능한 말단들을 형성하는데 필요한 제한 효소들이 혼합물(mixture)에 첨가된다. 표적 서열들은 그런 뒤 리가아제로 라이게이션된다. 정제가 수행될 수 있을지라도, 제한 효소 분해 또는 라이게이션 단계들 이전에 PCR 생산물들의 정제를 필요로 하지 않는다.
다른 구현예에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열들은 재조합에 의해 링크될 수 있다. 이 접근에서는, 증폭된 관심 폴리뉴클레오티드 서열들은 동일한 재조합 자리들을 사용하여 연결될 수 있다. 링크는 재조합을 촉진하는 적절한 재조합효소(recombinase)를 첨가하는 것에 의해 수행된다. 적절한 재조합효소 시스템들은 다양한 FRT 자리들을 갖는 Flp 재조합효소, 다양한 록스(lox) 자리들을 가지는 Cre 재조합효소, attP 자리 및 attB 자리 사이에서 재조합을 수행하는 인테그라아제(integrase) ФC31, 베타-재조합효소-식스 시스템(β-recombinase-six system)뿐만 아니라 진-긱스 시스템(Gin-gix system)을 포함한다. 재조합에 의한 링크는 두 개의 뉴클레오티드 서열들(VL 와 링크된 VH)의 전형적인 예시가 되고(Chapal, N. et al. 1997 BioTechniques 23, 518-524), 본 명세서에 참조인용 된다.
따라서, 일 측면에서, 상기 방법은 PCR 또는 RT-PCR 증폭에 의해, 분리된 단일 세포 또는 동종(isogenic) 세포들의 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 관심 뉴클레오티드 서열들을 증폭하는 단계 및 (1) 증폭된 관심 뉴클레오티드 서열들의 링크를 이루는 단계 및 (2) 하나 이상의 바코드를 링크된 폴리뉴클레오티드 서열들에 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 링크된 생산물들의 추가적인 증폭을 수행하여, 예를 들어, 추가적인 바코드들, 제한 자리들, 시퀀싱 프라이머 자리들, 및 기타 유사한 것들을 첨가하는 선택적인 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 기증자의 단일 세포들로부터 얻은 항체 헤비 및 라이트 체인들을 포함하는 바코드되고 링크된 페어들의 라이브러리를 생산하는 방법이 제공된다. 이 측면은 기증자로부터 얻은 림프구-함유 세포 분획(lymphocyte-containing cell fraction)을 제공하는 단계로서, 기증자는 상기 세포 분획으로부터 얻은 특정한 림프구 개체군에 대해 선택적으로 강화된 것인 단계를 포함한다. 또한 분리된 단일 세포들의 개체군은 림프구-함유 셀 분획, 또는 개별적으로 복수의 베슬들(vessels), 용기들, 또는 웰들 중에 있는 강화된 세포 분획으로부터 얻어진 세포들을 분배하는 것에 의해 수득된다. 분리된 단일 세포들의 개체군에 함유된 가변 부위 인코딩 서열들의 멀티플렉스 분자성 증폭(Multiplex molecular amplification)(예를 들어, 멀티플렉스 RT-PCR 증폭)이 수행되고, 헤비 및 라이트 체인들의 페어들의 링크 및 바코드 첨가가 발생되는데(affected), 여기서 상기 개별적인 페어는 단일 세포로부터 유래된 것이다. 또한, 다른 구현예에서, 상기 방법은 두 개의 선택적인 단계들을 포함할 수 있다: 첫번 째 단계에서, 단일 세포들의 개체군 내의 개별적인 분리된 단일 세포는 멀티플렉스 RT-PCR 증폭을 수행하기 이전에 동족 세포들의 개체군으로 확대(expanded)될 수 있으며, 그리하여 동족 세포들의 개체군을 가지는 복수의 베슬들, 용기들, 또는 웰들을 제공한다(하나의 베슬, 용기, 또는 웰 내에 하나의 동족 세포들의 개체군이 있다). 또 다른 선택적인 단계는 서열들을 인코딩하는 링크된 라이트 및 헤비 체인의 추가적인 증폭을 수행하는 단계를 망라한다. 이 추가적인 증폭 단계는 링크된 핵산의 양을 간단히 증가시키거나, 또는 제1 또는 제2 바코드 서열 또는 링크된 핵산에 대한 다른 서열 요소들을 추가하는데 사용될 수 있다.
어떤 측면에서, 멀티플렉스 RT-PCR 증폭은 역전사(RT)가 멀티플렉스 PCR 증폭과 독립되어 수행되는(또는 대체적 멀티플렉스 분자성 증폭) 두-단계 공정으로 또는 RT 및 멀티플렉스 PCR 증폭 단계들이 하나의 튜브 내에서 동일한 프라이머들로 수행되는 단일-단계 공정으로 수행될 수 있다.
역전사(RT)는 역전사 효소 활성을 함유하는 효소로 수행되고 분리된 단일 세포로부터 얻은 표적 특이적 RNA 또는 총 RNA, mRNA로부터 얻어진 cDNA의 생성을 야기한다. 역전사를 위해 활용될 수 있는 프라이머들은 올리고-dT 프라이머들, 무작위적 헥사머들(hexamers), 무작위적 데카머들(decamers), 다른 무작위적 프라이머들, 또는 관심 뉴클레오티드 서열들에 대해 특이적인 프라이머들을 포함한다. 어떤 구현예에서, 이러한 프라이머들은 바코드들, 범용 프라이밍 자리들(universal priming sites), 제한 자리들, 시퀀싱 프라이머 자리들, 및 이와 유사한 것들과 같은 요소들을 함유할 수 있다.
두-단계 멀티플렉스 RT-PCR 증폭 절차(procedure)는 필요에 따라 RT 단계에서 생성된 cDNA가 증폭으로 진행하기 이전에 주형 분획의 저장을 가능하게 하는 하나 이상의 베슬에 분배되는 것을 가능하게 한다. 추가적으로, 하나 이상의 튜브에 cDNA의 분배는, 동일한 주형으로부터 유래된 핵산의 하나 이상의 멀티플렉스 PCR 증폭의 수행을 가능하게 한다. 이 두-단계 접근은 예를 들어 하나의 튜브 내에서 서열들을 인코딩하는 카파 라이트 체인 가변 부위 및 헤비 체인 가변 부위 및 동일한 주형을 활용하여 서로 다른 튜브 내에서 서열들을 인코딩하는 람다 라이트 체인 가변 부위 및 헤비 체인 가변 부위를 증폭하고 링크하는데 사용될 수 있다. 단일 세포는 보통 라이트 체인들 중에서 오직 하나만을 발현한다. 그러나, 흔히 다른 것을 수행하기 이전에 반응들 중 하나의 결과를 기다리는 것 대신에 반응을 동시에 수행하기 더 쉬워질 것이다. 또한 오직 카파 또는 람다만이 단일 세포로부터 증폭될 것으로 예상될 것이므로 카파 및 람다 모두의 증폭은 내부의 음성 대조군으로서 역할을 수행한다.
단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 절차에서, 역전사 및 멀티플렉스 PCR 증폭은 동일한 베슬, 용기, 또는 웰에서 수행된다. 단일 단계 내에서 역전사 및 멀티플렉스 PCR 모두를 수행하는데 필요한 모든 요소들은 처음부터 베슬들, 용기들, 또는 웰들에 첨가되고 반응이 수행된다. 일반적으로, 한번 반응이 시작되면 추가적인 요소들을 첨가할 필요가 없다. 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 증폭의 장점(advantage)은 본 발명의 바코드 링크된 뉴클레오티드 서열들을 생성하는데 필요한 단계들의 수를 그것이 더욱 감소시키는 것이다. 이는 복수의 베슬들 내에서 동일한 반응이 수행되는, 단일 세포들의 어레이(array) 상에서 멀티플렉스 RT-PCR을 수행할 때 특히 유용하다. 일반적으로, 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR을 위해 필요한 조성물은 핵산 주형, 역전사 활성을 가지는 효소, DNA 폴리머라아제 활성을 가지는 효소, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 믹스(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 를 포함하는 dNTP 믹스) 및 멀티플렉스 프라이머 믹스를 포함한다. 핵산 주형은 바람직하게는 세포의 용해물로서, 정제된 형태의 또는 무손실 세포 내에 함유된 것으로서 분리된 단일 세포로부터 유래된 총 RNA 또는 mRNA이다.
일 측면에서, 방법들은 링크되고 바코드된 관심 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리들을 생성한다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리 내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10,000이상, 30,000이상, 100,000이상, 300,000이상, 1,000,000이상, 3,000,000이상, 10,000,000이상, 30,000,000이상, 또는 그 이상의 멤버들을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 3000이상, 10,000이상, 30,000이상, 또는 그 이상의 세포 샘플의 전체 전사체의 유전자들을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리내의 복수의 폴리뉴클레오티드 조성물들은 개체의 혈액에 존재하는 1이상, 2이상, 3이상, 10이상, 30이상, 100이상, 300이상, 1000이상, 10,000이상, 100,000이상, 1,000,000이상, 10,000,000이상, 1,000,000,000이상 또는 그 이상의 서로 다른 항체 종들을 포함한다. 이러한 항체 종은 형질아세포들, 형질 세포들, 기억 B세포들, 긴시간-생존하는 형질 세포들, 순수한 B세포들, 다른 B 계통 세포들, 또는 그들의 조합에 의해 발현될 수 있다.
상기에 개시된 방법들에 의해 생성된 링크되고 바코드된 폴리뉴클레오티드 조성물들은 고처리, 멀티플렉스된 시퀀싱, 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 차세대(NextGen) 시퀀싱 플랫폼들을 사용하는 것에 유리하게 적용될 수 있다.
상기에 개시된 방법들에 의해 생성된 링크되고 바코드된 폴리뉴클레오티드 조성물들은 또한 본 명세서에 개시된 클로닝, 관심 폴리펩티드들의 생산, 및 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.
시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 복수의 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 및 단일 샘플에서 유래된 앰프리콘 부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 유래된 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과 별개인 것인 단계; 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 프라이머들의 세트로 증폭하여 시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하는 단계로서, 상기 시퀀싱을 위한 하나 이상의 관심 뉴클레오티드들은 제1 시퀀싱 부위, 제1 플레이트 식별 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위, 및 제2 시퀀싱 부위를 포함하는 단계;를 포함한다.
어떤 측면에서, 방법은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 어떤 측면에서, 시퀀싱은 454 시퀀싱이다.
어떤 측면에서, 시퀀싱은 더 긴 시퀀싱 리드(reads)들을 포함하며 그리하여 포워드 및 리버스 시퀀싱 리드들은, 예를 들어, 항체 라이트 체인들(LCs)(정확한 서열 길이는 5’ 비번역 부위(UTR)의 길이에 따르는 것인)의 대략 600 염기 페어(bp) 서열, 및 헤비 체인들(HCs)의 대략 700bp 서열인, 전체의 재구성(reconstruction)을 가능하게 하는데 충분하게 중복된다. 그러므로, 어떤 측면에서, 350-400 bp이상의 시퀀싱 리드들을 산출할 수 있고 그리하여 서열 어셈블리에 포함된 중복을 달성하는 모든 시퀀싱 기술들이 사용될 수 있고, 600-700+bp 리드들을 가능하게하는 시퀀싱 기술들은 단지 포워드 프라이머만을 사용하여 하나를 시퀀싱할 수 있게 한다(5’말단으로부터 시퀀싱).
통상의 기술자에게 알려진 핵산을 시퀀싱하는 모든 기술이 사용될 수 있다. DNA 시퀀싱 기술들은 표지된 종결자들 또는 프라이머들 및 슬라브(slab) 내에서 젤 분리(gel separation) 또는 모세관 전기이동(capillary electrophoresis)을 사용하는 고전적인 디데옥시 시퀀싱 반응들(생어 방법)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 차세대(NextGen) 시퀀싱 플랫폼들은 본 발명의 실행(practice)에서 유리하게 사용된다. 차세대 시퀀싱은 고처리가 가능하고 동시에 많은 수의 샘플들의 멀티플렉스 시퀀싱이 가능한 후-고전적(post-classic) 생어 타입 시퀀싱 방법들의 몇가지를 나타낸다. 하기에 더자세히 기재되는 것들과 같은, 현재의 차세대 시퀀싱 플랫폼들은 동일한 시퀀싱 런(run)에서 다중 별개 핵산들(multiple distinct nucleic acids)로부터 리드들을 생성할 수 있다. 처리량이 런 당 100백만 염기들에서 600기가 염기들로 달라지고, 처리량이 기술의 향상으로 인해 급격하게 증가한다. 서로 다른 차세대 시퀀싱 플랫폼의 작동 원리는 또한 다르며: 역으로 종결되고 표지된 뉴클레오티드들을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 454 시퀀싱, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브들의 라이브러리에 대한 대립인자 특이적 혼성화(allele specific hybridization), 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브들의 라이브러리에 대한 대립인자 특이적 혼성화를 사용한 합성, 그 후의 라이게이션, 중합화 단계 중에 표지된 뉴클레오티트들의 통합의 실시간 모니터링(real time monitoring)에 의한 시퀀싱, 폴로니 시퀀싱(polony sequencing), 단일 분자 실시간 시퀀싱, 및 SOLiD 시퀀싱을 포함할 수 있다. 시퀀싱은 폴리머라아제 또는 리가아제를 사용하는 순차적인(sequential) 또는 단일 확장 반응들뿐만 아니라 프로브들의 라이브러리들로 단일 또는 순차적인 차등 혼성화(differential hybridizations)에 의하여 입증되었다. 이러한 반응들은 동시에 100백만 서열들이 넘는 현재의 상업적인 적용들 내에서 입증들(demonstrations) 포함하는 많은 클론 서열들 상에서 동시에 수행되었다. 이러한 시퀀싱 접근법들은 따라서 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 B-세포 수용체(BCR) 및 다른 관심 서열들의 레파토리를 연구하는데 사용될 수 있다.
상기 시퀀싱 기술들은 런 당 1000리드들 이상, 런 당 10,000리드들 이상, 런 당 100,000리드들 이상, 런 당 500,000리드들 이상, 런 당 1,000,000리드들 이상을 생성할 수 있다.
상기 시퀀싱 기술들은 약 30bp, 약 40bp, 약 50bp, 약 60bp, 약 70bp, 약 80bp, 약 90bp, 약 100bp, 약 110bp, 리드 당(per read) 약 120bp, 약 150bp, 약 200bp, 약 250bp, 약 300bp, 약 350bp, 약 400bp, 약 450bp, 약 500bp, 약 550bp, 약 3600bp, 약 650bp, 약 700bp, 또는 리드 당 그 이상의 bp를 생성할 수 있다.
시퀀싱 기술들은 리드당 30이상, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 그 이상의 뉴클레오티드들을 생성할 수 있다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술은, 예를 들어, 헬리코스 트루 단일 분자 시퀀싱(Helicos True Single Molecule Sequencing, tSMS)(Harris T. D. et al. (2008) Science 320:106-109)이다. tSMS 기술에서, DNA 샘플은 대략 100 내지 200 개의 뉴클레오티드들의 가닥들로 절단되고, 폴리A 서열은 각 DNA 가닥의 3’ 말단으로 첨가된다. 각 가닥은 형광성으로 표지된 아데노신 뉴클레오티드의 첨가에 의해 표지된다. DNA 가닥들은 그런 뒤 플로우 셀 표면에서 고정되어있는 수백만개의 올리고-T 캡쳐 자리들을 함유하는 플로우 세포(flow cell)로 혼성화된다. 주형들은 약 100백만 주형들/cm2 의 밀도에 있을 수 있다. 플로우 셀은 그런 뒤 예를 들어, HeliScopeTM 시퀀서(sequencer)와 같은 기기(instrument)들 내로 로딩되고, 레이저가 플로우 세포의 표면을 비추고, 각 주형의 위치를 밝힌다. CCD 카메라는 플로우 세포 표면 상의 주형들의 위치를 맵핑할 수 있다. 주형 형광 라벨은 그런 뒤 절단되고 세척되어 없어진다. 시퀀싱 반응은 DNA 폴리머라아제 및 형광성으로 표지된 뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 시작된다. 올리고-T 핵산은 프라이머로서의 역할한다. 폴리머라아제는 표지된 뉴클레오티드를 주형 인도 방법(template directed manner)으로 프라이머에 통합한다. 폴리머라아제 및 비통합된 뉴클레오티드들은 제거된다. 형광성으로 표지된 뉴클레오티드의 통합으로 인도된 주형들은 플로우 세포 표면을 이미징(imaging)하는 것에 의해 탐지된다. 이미징후에, 절단 단계는 형광성 표지를 제거하고, 공정은 목적하는 리드 길이를 성취할 때까지 다른 형광성으로 표지된 뉴클레오티드들로 반복된다. 서열 정보는 각 뉴클레오티드 첨가 단계에서 수집된다.
사용될 수 있는 DNA 시퀀싱 기술의 다른 예는 454 시퀀싱(Roche) (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380)이다. 454 시퀀싱은 두 단계들을 포함한다. 첫 번째 단계에서, DNA는 대략 300-800 염기 페어들의 단편들로 전단되고(sheared), 단편들은 블런트 말단화 된다. 올리고뉴클레오티드 어댑터들은 그런 뒤 단편의 말단들로 라이게이션된다. 어댑터들은 단편들의 증폭 및 시퀀싱을 위해 프라이머들로 역할한다. 단편들은 예를 들어, 5’-비오틴 태그(5'-biotin tag )를 함유하는 어댑터 B를 사용하는 예를 들어, 스트렙타비딘-코딩된 비드들(streptavidin-coated beads)과 같은 DNA 캡쳐 비드들에 부착될 수 있다. 비드들에 부착된 단편들은 오일-워터 에멀전(oil-water emulsion)의 비말(droplets)들 내에서 PCR 증폭된다. 그 결과는 각 비드 상에서 클론에 의하여 증폭된 DNA 단편들의 다중 카피들(multiple copies)이다. 두 번째 단계에서, 비드들은 웰들 내로 캡쳐된다(피코-리터 크기). 파이로시퀀싱이 각 DNA 단편에서 동시에 수행된다. 하나 이상의 뉴클레오티드들의 첨가는 시퀀싱 기기 내의 CCD 카메라에 의해 기록되는 빛 신호(light signal)를 생성한다. 신호 세기는 통합된 뉴클레오티드들의 개수에 비례한다.
파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 첨가에서 방출된 파이로포스페이트(PPi)를 이용한다. PPi는 ATP 설퍼릴라아제에 의해 아데노신 5’ 포스포설페이트의 존재 하에서 ATP로 변환된다. 루시퍼라아제는 ATP를 사용하여 루시페린을 옥시루시페린으로 변환하고, 이 반응은 탐지되고 분석될 수 있는 빛을 생성한다.
사용될 수 있는 DNA 시퀀싱 기술의 다른 예는 SOLiD 기술(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))이다. SOLiD 시퀀싱에서, 유전체 DNA는 단편들로 전단되고, 어댑터들은 단편들의 5’ 및 3’ 말단들에 부착된 단편 라이브러리를 생성한다. 대안적으로, 내부 어댑터들은 어댑터들을 단편들의 5’ 및 3’말단들로 라이게이션하고, 단편들을 환형화(circularizing)하고, 환형화된 단편들을 분해하여 내부 어댑터를 생성하고, 어댑터들을 생성된 단편들의 5’ 및 3’말단들에 부착하여 메이트-페어링된(mate-paired) 라이브러리를 생성하는 것에 의해 도입될 수 있다. 그 다음, 클론 비드 개체군들은 비드들, 프라이머들, 주형, 및 PCR 성분들을 함유하는 마이크로반응기(microreactors)들 내에서 준비된다. PCR 후에, 주형들은 변성되고 비드들은 강화되어 확장된 주형들을 갖는 비드들을 분리한다. 선택된 비드들 상의 주형들은 유리 슬라이드에 접합되는 것을 허용하는 3’ 변형(modification)에 적용된다.
상기 서열은 특이적 형광단(fluorophore)에 의해 식별되는 중심 결정 염기(central determined base)(또는 염기들의 페어)와의 부분적으로 무작위적인 올리고뉴클레오티드들의 순차적인 혼성화 및 라이게이션에 의해서 결정될 수 있다. 색깔이 기록된 후, 라이게이션된 올리고뉴클레오티드는 절단되고 제거되며 그런 뒤 공정이 반복된다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 SOLEXA 시퀀싱(일루미나(Illumina))이다. SOLEXA 시퀀싱은 폴드-백 PCR(fold-back PCR) 및 고정된 프라이머들(anchored primers)을 사용하는 고체 표면(solid surface)상의 DNA 증폭을 근거로 한다. 유전체 DNA는 단편화되고, 어댑터들은 단편들의 5’ 및 3’말단들에 첨가된다. 플로우 세포 채널의 표면에 부착된 DNA 단편들은 확장디고 브릿지 증폭(bridge amplified)된다. 단편들은 이중 가닥으로 되고, 이중 가닥 분자들은 변성된다. 고체-상 증폭의 다중 사이클들 후에 변성은 플로우 세포의 각 채널 내에 있는 동일한 주형의 단일-가닥 DNA 분자들의 대략 1,000 카피들의 수백만 클러스터들(clusters)을 생성할 수 있다. 프라이머들, DNA 폴리머라아제 및 네 개의 형광단-표지된 것, 역으로 종결된 뉴클레오티드들은 순차적인 시퀀싱을 수행하는데 사용된다. 뉴클레오티드 통합 후에, 레이저는 형광단을 자극하는데 사용되고, 이미지가 캡쳐되며 제1 염기의 상동성(identity)이 기록된다. 각 통합된 염기로부터 3’ 종결자들 및 형광단들은 제거되고 통합, 탐지(detection) 및 식별 단계가 반복된다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 퍼시픽 바이오사이언스즈(Pacific Biosciences)의 단일 분자, 실시간(SMRTTM) 기술을 포함한다. SMRT에서, 각 4 개의 DNA 염기들은 4 개의 서로 다른 형광 색소들(fluorescent dyes) 중 하나로 부착된다. 이러한 색소들은 포스포링크(phospholinked)된다. 단일 DNA 폴리머라아제는 제로-모드 웨이브가이드(zero-mode waveguide, ZMW)의 바닥에 있는 주형 단일 가닥 DNA의 단일 분자들과 고정되어있다. ZMW는 ZMW의 밖으로 급격하게 확산되는 형광성 뉴클레오티드들의 백그라운드(background)에 대항하여 DNA 폴리머라아제에 의한 단일 뉴클레오티드의 통합을 관찰할 수 있게하는 구속 구조(confinement structure)이다. 증가하는 가닥(growing strand) 내에서 뉴클레오티드를 통합하는데는 수천분의 1초가 걸린다. 이 시간 중에, 형광성 라벨이 자극되고 형광성 신호를 생산하며, 형광성 태그가 절단되어 떨어진다. 색소에 상응하는 형광(fluorescence)의 탐지는 염기가 통합되었다는 것을 나타낸다. 상기 공정은 반복된다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 나노포어(nanopore) 시퀀싱(Soni G V and Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001)이다. 나노포어는 작은 구멍이며, 직경이 1 나노미터 단위이다. 전도성 유체(conducting fluid)내의 나노포어의 이머젼(immersion) 및 그것을 통한 전위의 적용은 나노포어를 통한 이온의 전도로 인한 약간의 전류(slight electrical current)를 야기한다. 흐르는 전류의 양은 나노포어의 크기에 민감하다. DNA 분자가 나노포어를 통해 지나가는 동안, DNA 분자 상의 각 뉴클레오티드는 나노포어를 서로 다른 정도로 막는다(obstructs). 따라서, DNA분자가 나노포어를 통해 지나감으로 인해 나노포어를 통해 지나가는 전류의 변화는 DNA 서열의 리딩(reading)을 나타낸다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 DNA 서열에 대한 화학-민감성 전계 효과 트랜지스터(chemical-sensitive field effect transistor, cehmFET) 어레이를 사용하는 것을 포함한다(예를 들어, 미국출원공개 No. 20090026082 에 기재되었다). 기술의 한 예에서, DNA 분자들은 반응 챔저들 내에 위치할 수 있고, 주형 분자들은 폴리머라아제에 결합된 시퀀싱 프라이머들로 혼성화 될 수 있다. 시퀀싱 프라이머의 3’말단에 있는 새로운 핵산 가닥 내의 하나 이상의 트리포스페이트들의 통합은 chemFET에 의한 전류 변화에 의해 탐지될 수 있다. 어레이는 다중 chemFET 센서들을 가질 수 있다. 다른 예에서, 단일 핵산들은 비드들에 부착될 수 있고, 핵산들은 비드 상에서 증폭될 수 있고, 개별적인 비드들은 chemFET 어레이 상의 개별적인 반응 챔버들로 이동될 수 있고, 각 챔버는 chemFET 센서를 가지며, 핵산들은 시퀀싱 될 수 있다.
사용될 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 전자 현미경(electron microscope)을 사용하는 것을 포함한다(Moudrianakis E. N. and Beer M. Proc Natl Acad Sci USA. 1965 March; 53:564-71). 기술의 한 예에서, 개별적인 DNA 분자들은 전자 현미경을 사용하여 구별될 수 있는 금속성 표지들(metallic labels)을 사용하여 표지된다. 이러한 분자들은 그런 뒤 평면 표면(flat surface) 상에서 신장되고(stretched) 전자 현미경을 사용하여 이미지화되고 서열들을 측정한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 실험실에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
시퀀싱 데이터를 분석하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 복수의 폴리뉴클레오티드들과 연관된 데이터세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터세트는 복수의 폴리뉴클레오티드들에 대한 시퀀싱 데이터를 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위를 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드 상의 각 샘플 식별 부위는 단일 샘플에 특유한 것이고, 상기 제1 단일 샘플로루터 유래된 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개인 것인 단계; 및 동일한 샘플 식별 부위들로 폴리뉴클레오티드들을 함께 매칭(match)하여 데이터세트를 분석하는 단계로서, 상기 매치는 동일 샘플로부터 비롯된(originated from) 폴리뉴클레오티드들임을 나타낸다.
어떤 측면에서, 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 제1 플레이트 식별 부위를 더 포함하며, 상기 각 제1 플레이트 식별 부위의 각 조합 및 각 폴리뉴클레오티드 상의 샘플 식별 부위는 단일 샘플에 특유한 것이고, 상기 단일 샘플들의 제1 세트로부터 유래된 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플 세트들로부터 유래된 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개인 것이고, 동일한 제1 플레이트 식별 부위들 및 동일한 샘플 식별 부위들과 폴리뉴클레오티드들을 함께 매칭하여 데이터세트를 분석하는 단계를 더 포함하고, 상기 두 부위들 간의 매치는 폴리뉴클레오티드들이 동일 샘플로부터 비롯된 것임을 나타낸다.
어떤 측면에서, 두 폴리뉴클레오티드들 모두는 가변 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 가변 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 어느 폴리뉴클레오티드도 가변 부위를 포함하지 않는다.
어떤 측면에서, 데이터세트를 수득하는 단계는 복수의 폴리뉴클레오티드들을 수득하는 단계 및 복수의 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱하여 데이터세트를 실험적으로 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 데이터세트를 수득하는 단계는 데이터세트를 실험적으로 결정하기 위해 복수의 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 데이터세트를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 데이터세트는 전기적 저장 매체 상에 저장된다. 어떤 측면에서, 데이터세트는 인터넷을 통해 이동된다.
어떤 측면에서, 방법은 컴퓨터 상에서 시행되며, 예를 들어, 이는 컴퓨터-시행된(computer-implemented) 방법이다.
어떤 측면에서, 단일 샘플은 단일 세포이다. 어떤 측면에서, 단일 샘플은 단일 세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 단일 샘플은 단일 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 단일 샘플은 복수의 B세포들을 포함한다. 어떤 측면에서, 단일 샘플은 단일 B세포 및 하나 이상의 다른 세포들을 포함한다.
어떤 측면에서, 시퀀싱(예를 들어, 454 시퀀싱)으로부터 생성된 데이터는 454 GS FLX 데이터 분석 소프트웨어에 의해서 분석될 수 있고, 안좋은-퀄리티 점수(poor-quality scores)를 가지는 서열들은 걸러내어질 수 있다. 좋은-퀄리티 서열들은 그런 뒤 예를 들어, 뉴블러(Newbler)를 사용하는 것에 의하는 것과 같은 생물정보학 접근법들을 사용하여 서열들이 조립되기 이전에 파이썬(Python) 내의 스크립트(script)를 사용하는 것에 의해 그들의 샘플 식별 부위(그리고 어떤 구현예에서는 그들의 샘플 식별 부위 및 플레이트 식별 부위의 조합)에 따라 세분된다. 어떤 측면에서 리버스 리드들(reverse reads)이 오직 제2 플레이트 식별 부위만을 가질 수 있기 때문에, 시퀀스 어셈블리가 서로 다른 세포들로부터 얻은 서열들의 포워드 및 리버스 리드들 사이에서 발생할 수 있는 것이 가능하다. 이 잠재적 문제를 피하기(circumventing) 위해, 포워드 및 리버스 리드들 둘 다의 헤비- 및 라이트-체인 V(D)J 유용성은 먼저 HighV-QUEST를 사용하여 식별될 수 있다. 서열들은 그런 뒤 조립되기 이전에 그들의 V(D)J 유용성에 따라서 더 그룹핑 된다. 어떤 측면에서, 서열 어셈블리는 뉴클레오티드 불일치(nucleotide mismatches)를 용납하지 않는 것일 수 있고(intolerant), 그리하여 동일한 V(D)J 유용성을 공유하는 서로 다른 세포들로부터 얻은 포워드 및 리버스 리드들의 어셈블리를 예방한다. 어떤 측면에서, 서열들은 그런 뒤 컴퓨터 프로그램을 사용하여 그들의 V(D)J 유용성을 근거로 함께 클러스터링 된다.
어떤 측면에서, 생물정보학 방법들은 클론 패밀리들 및 서브패밀리들을 형성하는 서열들의 그룹들을 식별하는데 사용될 수 있으며, 그리하여 관심 면역글로불린 서열들을 식별한다. 이러한 생물정보학 방법들은 서열 유사성(sequence similarity)의 측정법(measurements)을 포함한다. 이러한 생물정보학 방법들은 개별적인 인간으로부터 유래된, 하나 이상의 인간들로부터 유래된, 질환을 갖는 하나 이상의 인간들로부터 유래된, 서로다른 질환들을 갖는 하나 이상의 인간들로부터 유래된 관심 서열들을 식별하는데 사용될 수 있다.
어떤 측면에서, 관련된 면역글로불린 헤비 및/또는 라이트 체인 서열들은 면역글로불린 헤비 체인 및/또는 라이트 체인 V(D)J 서열들 간의 상동성(homology)의 컴퓨터를 이용한 계통발생학적 분석(computational phylogenetic analysis)을 통해서 식별될 수 있다. 어떤 측면에서, 면역글로불린 헤비 체인 및/또는 라이트 체인으로부터 유래된 V, D, 및/또는 J 유전자 절편들 및/또는 다른 서열들의 개별적인, 또는 조합들을 나타내는 서열들의 표준 분류 방법들(standard classification methods)(즉, 클러스터링)은 클론 패밀리들 또는 서브패밀리들을 식별하는데 사용될 수 있다(예를 들어, ClustalX를 사용하는 것에 의한).
본 명세서에서 사용된 “클론 패밀리”는 V, D, 및/또는 J 부위들을 각각 가지는 복수의 면역글로불린 서열들을 나타내며, 상기 각 서열은 V, D, 및/또는 J 부위를 가지는 동일한 생식 면역글로불린 서열 또는 V, D, 및/또는 J 부위를 가지는 생식 변역글로불린 서열의 돌연변이된 버전(version)이다. 어떤 측면에서, 복수(plurality)는 복수의 헤비 체인 서열들이다. 어떤 측면에서, 복수는 복수의 라이트 체인 서열들이다. 어떤 측면에서, 복수는 복수의 페어링된 헤비 및 라이트 체인 서열들이다. 어떤 측면에서, 각 서열은 V, D, 및/또는 J 부위들을 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 V 및 D 부위들을 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 D 및 J 부위들을 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 V 및 J 부위들을 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 V부위를 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 D부위를 갖는다. 어떤 측면에서, 각 서열은 J부위를 갖는다. 어떤 측면에서, 하나 이상의 돌연변이체는 V, D, 및/또는 J 부위들 내에 위치한다. 어떤 측면에서, 하나 이상의 돌연변이체는 V, D, 및/또는 J 부위들 사이에 위치한다.
어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하는 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고 그 P/N 뉴클레오티드들 및 D뉴클레오티드들의 길이의 합이 동일한 길이인 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V, D 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하는 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V, D 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고, V 및 D 유전자 절편들 사이의 그 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이이고, D 및 J 유전자 절편들 사이의 그 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이인 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고 그 라이트 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하는 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고 그 P/N 뉴클레오티드들 및 D 뉴클레오티드들의 길이의 합이 동일한 길이이고, 그 라이트 체인들이 동일한 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고 그 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이인 항체들의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V, D 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고 그 라이트 체인들이 V 및 D 유전자 절편들을 모두 사용하는 항체의 세트는 클론 패밀리이다. 어떤 측면에서, 그 헤비 체인들이 동일한 V, D 및 J 유전자 절편들을 사용하고, V 및 D 유전자 절편들 사이의 그 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이이고, D 및 J 유전자 절편들 사이의 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이이고, 그 라이트 체인들이 V 및 J 유전자 절편들을 모두 사용하고, V 및 J 유전자 절편들 사이의 P/N 뉴클레오티드들이 동일한 길이인 항체들의 세트는 클론 패밀리이다.
클론 패밀리들을 구성하는(constructing) 방법
T 세포 수용체(TCR) 또는 면역글로불린 가변 유전자 쿼리 서열(query sequence)을 위한 V, D 및 J 유용성은 가장 서열을 생기게 할 것 같은 생식 V, D(적용가능하다면) 및 J 유전자 절편들을 식별하는 것에 의해 결정될 수 있다. D 절편들은 동일한 TCR 및 면역글로불린 서열들(예를 들어, TCRβ, TCRδ 및 항체 헤비 체인 서열들)내에 존재하나 다른 것들(예를 들어, TCRα, TCRγ 및 항체 라이트 체인 서열들)에는 없다. 하기 설명은 D 절편들을 포함하나 동일한 접근법들은 D 절편들이 결핍된 가변 부위 서열들에 적용될 수 있다. 모든 경우에서 V(D)J 유용성의 결정은 IMGT/GENE-DB와 같은 생식 V, D 및 J 유전자 절편 서열들의 참조 데이터베이스(reference database)를 사용한다(Giudicelli V, Chaume D, Lefranc MP. IMGT/GENE-DB: a comprehensive database for human and mouse immunoglobulin and T cell receptor genes. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61.).
V(D)J 유용성의 결정에 대한 한 접근법에서, 쿼리 서열은 연속적으로(serially) 각 V, D 및 J 생식 유전자 절편들과 별도로 비교되며 각 타입(V, D 또는 J)의 가장 유사한 유전자 절편이 쿼리 서열을 생기게 한 가능성이 가장 높은 것으로서 선택된다. V-QUEST 및 High V-QUEST는 이러한 접근법의 예이다(Giudicelli V, Chaume D, Lefranc MP. IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40.; Brochet X, Lefranc MP, Giudicelli V. IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res. 2008 Jul 1;36(Web Server issue):W503-8.). V-QUEST는 먼저 쿼리 서열 및 각 V 유전자 절편 서열을 위한 페어와이즈 정렬(pairwise alignments)을 생성한다. 그런 뒤 이는 V 절편 및 각 J 유전자 조걱 서열의 추정된(deduced) 3’말단의 쿼리 서열 부위 하류를 위해 페어와이즈 정렬을 생성한다. D 절편이 존재하면, V-QUEST는 그런 뒤 V 및 J 절편들 및 각 D 유전자 절편 서열들을 매칭하는 부위들 사이에서 발견되는 쿼리 서열 부위를 위해 페어와이즈 정렬을 생성한다. V-QUEST는 또한 V-D, V-J 및/또는 D-J 접합 부위들의 경계를 추론할 수 있다.
V(D)J 유용성의 결정에 대한 다른 접근법에서, 쿼리 서열을 생기게 한 가능성이 가장 높은 생식 V, D 및 J 절편들의 조합은 V, D 및 J 각각에 대한 3개의 독립된 단계들 보다 단일 단계에서 식별된다. 이 접근법은 한 타입의 절편(V, D 또는 J)의 식별이 다른 두 타입들의 절편들에 대한 잠재적인 매치에 관한 정보를 고려할 수 있다는 장점을 가진다. 예를 들어, D 절편을 최상으로 매칭하는 것은 어떤 V 절편 매치가 고려되느냐에 따를 것이다. SoDA는 이러한 접근법의 예이다(Volpe JM, Cowell LG, Kepler TB. SoDA: implementation of a 3D alignment algorithm for inference of antigen receptor recombinations. Bioinformatics. 2006 Feb 15;22(4):438-44.). SoDA는 먼저 후보 V, D 및 J 절편들을 선택한다. 이는 쿼리 서열 및 각 V 유전자 절편 서열에 대한 페어와이즈 로컬 정렬(pairwise local alignments)을 생성하고 그런 뒤 오직 점수 임계점(score threshold)을 충족하는 V 절편들만을 정렬들로 유지한다. 이는 이러한 단계를 J 절편들 및 D 절편들에 대해서 반복한다. 그런 뒤 최적의 정렬이 후보 V, D 및 J 절편들의 각 가능한 조합들에 대해서 생성된다. 정렬들은 서열 정렬에서 광범위하게 사용되는 동일한 일반적인 동적 프로그래밍 접근법(general dynamic programming approach)을 사용하여 생성되나(Needleman,S.B. and Wunsch,C.D. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 48,443-453.), V-D, V-J 및/또는 D-J 접합들에서 추가적인 뉴클레오티드들의 삽입을 감안한다. 이러한 삽입은 흔히 V(D)J 재조합의 생물학적 공정 중에 발생한다. 동적 프로그래밍에 의한 서열 정렬에서 삽입, 결실 및 불일치와 연관된 페널티 점수(penalty scores)가 전형적으로 존재한다. 그러나, V(D)J 유용성을 결정하는 것에 대한 이 접근법에서, 절편들 사이의 접합들에서 뉴클레오티드들의 삽입은 패널티가 적용되지 않는다. 가장 높은-점수를 올린 정렬(highest-scoring alignment )을 산출하는 V(D)J 조합은 쿼리 서열에 대한 V(D)J 유용성을 나타내어 선택된다. 이 접근법은 또한 접합 서열 부위들의 경계들을 식별할 수 있다.
클론 패밀리들 및 서브패밀리들로부터, 다양한 접근법들은 그들의 인코딩된 페어링된 헤비 및 라이트 체인 면역글로불린 유전자들의 발현 및 그들의 결합 성질들의 특성화(characterization)에 대해 특이적인 클론들을 선택하는데 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, 클론 패밀리들 및/또는 클론 서브패밀리들로부터 얻은 최고 빈도 클론뿐 아니라 클론 패밀리들 및 서브패밀리들로부터 얻은 다른 대표적인 클론들은 발현되고, 그들의 결합 성질들을 위해 스크리닝된다. 클론들은 또한, 모든 클론들로부터, 모든 또는 선택 클론 패밀리들로부터, 및/또는 그들의 결합 특성들의 발현 및 특성화를 위한 모든 또는 선택 클론 서브패밀리들로부터 무작위적으로 선택될 수 있다. 클론들은 또한 항체의 가변 부위 내에서 많은 수의 변이들을 갖는 것에 근거하여 선택될 수 있다. 진화계통수는 구성될 수 있고, 클론들이 진화계통수의 특징(features)에 근거하여 선택될 수 있으며, 예를 들어 하강하는 것에 의해(descending) 나무는 언제나 그 아래에 가장 큰 숫자의 리프 노드들(leaf nodes underneath)을 가지는 가지를 선택한다.
어떤 측면에서, 방법은 클로닝을 위한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들을 선택하는 단계를 더 포함한다.
관심 제1 폴리뉴클레오티드의 선택에 근거하여 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 복수의 폴리뉴클레오티드들과 연관된 데이터세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터세트는 복수의 폴리뉴클레오티드들에 대한 시퀀싱 데이터를 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위을 포함하고, 상기 각 폴리뉴클레오티드 상의 각 샘플 식별 부위는 단일 샘플에 대해 특유하고 그리하여 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 별개의 단일 샘플과 연관되고, 상기 제1 단일 샘플로부터 유래된 각 폴리뉴클레오티드 내의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개의 것인 단계; 및 데이터세트로부터 제1 단일 샘플과 연관된 관심 제1 폴리뉴클레오티드를 선택하는 단계 및 관심 제1 뉴클레오티드의 샘플 식별 부위를 근거로 제1 단일 샘플 내의 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 단계; 를 포함한다.
어떤 측면에서, 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 제1 플레이트 식별 부위를 더 포함하며, 상기 각 제1 플레이트 식별 부위의 각 조합 및 각 폴리뉴클레오티드 상의 샘플 식별 부위는 단일 샘플에 대해 특유하고, 상기 단일 샘플들의 제1 세트로부터 유래된 각 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위의 서열은 단일 샘플들의 제1 세트와는 별개인 하나 이상의 단일 샘플의 세트들로부터 유래된 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 제1 플레이트 식별 부위의 서열과 별개인 것이고, 관심 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 플레이트 식별 부위 및 샘플 식별 부위에 근거하여 제1 단일 샘플 내의 관심 제2 폴리뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함한다.
어떤 측면에서, 두 폴리뉴클레오티드들 모두는 가변 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 가변 부위를 포함한다. 어떤 측면에서, 어느 폴리뉴클레오티드도 가변 부위를 포함하지 않는다.
어떤 측면에서, 방법은 컴퓨터 상에서 시행되며, 예를 들어, 이는 컴퓨터-시행된(computer-implemented) 방법이다.
어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 B세포를 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 단일 B세포 및 하나 이상의 다른 세포들을 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 복수의 B세포들을 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 B 세포를 포함하며, 상기 관심 제1 폴리뉴클레오티드는 항체 헤비 체인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 관심 제2 폴리뉴클레오티드는 항체 라이트 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 측면에서, 제1 단일 샘플은 B세포를 포함하고, 상기 관심 제1 폴리뉴클레오티드는 항체 라이트 체인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 관심 제2 폴리뉴클레오티드는 항체 헤비 체인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 측면에서, 데이터세트를 수득하는 단계는 복수의 폴리뉴클레오티드들을 수득하는 단계 및 복수의 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱하여 데이터세트를 실험적으로 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 데이터세트를 수득하는 단계는 데이터세트를 실험적으로 결정하기 위해 복수의 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 데이터세트를 받는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 데이터세트는 전기적 저장 매체 상에 저장된다.
클로닝을 위해 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 복수의 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 각 폴리뉴클레오티드는 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 및 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위를 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위의 서열은 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일하고, 상기 제1 단일 샘플로부터 유래된 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위의 서열은 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 유래된 라이브러리내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과는 별개인 것인 단계; 및 클로닝을 위해 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하는 프라이머들의 세트를 가지는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 증폭하는 단계로서, 상기 클로닝을 위한 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들은 제1 제한 자리 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위, 어댑터 부위, 단일 샘플로부터 유래된 앰프리콘 부위, 및 제2 제한 자리 부위를 포함하는 것인 단계; 를 포함한다.
어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 실험실에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 수득하는 단계는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 받는 단계를 포함한다.
어떤 측면에서, 방법들은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 벡터 내에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들을 클로닝하는 단계를 더 포함한다.
관심 분자를 생산하는 방법
어떤 측면에서, 방법은 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 관심 분자를 생산하기에 충분한 환경에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
어떤 측면에서, 숙주 세포를 수득하는 단계는 실험실에서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계를 포함한다. 어떤 측면에서, 숙주 세포를 수득하는 단계는 숙주 세포를 준비한 제3자로부터 직접적 또는 간접적으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 받는 단계를 포함한다.
어떤 측면에서, 관심 분자는 폴리펩티드이다. 어떤 측면에서, 관심 분자는 항체이다. 어떤 측면에서, 관심 분자는 인간 단일클론 항체(human monoclonal antibody)이다.
어떤 측면에서, 방법은 관심 분자를 수집하는 단계를 더 포함한다.
어떤 측면에서, 특정한 폴리펩티드들을 “리폴드(refold)” 것이 바람직하며, 예를 들어, 폴리펩티드들은 하나 이상의 ABP 성분들 또는 ABP 그 자신을 포함하는 것이다. 특정한 구현예에서, 이러한 폴리펩티드들은 본 명세서에 논의된 발현 시스템들을 사용하여 생산될 수 있다. 특정한 구현예에서, 폴리펩티드들은 “리폴드되어” 및/또는 산화되어 목적하는 삼차 구조(tertiary structure)를 형성하거나 및/또는 디설파이드 링크(disulfide linkages)들을 생성할 수 있다. 특정한 구현예에서, 이러한 구조 및/또는 링크들은 폴리펩티드의 특정한 생물학적 활성과 관련된다. 특정한 구현예에서, 리폴딩(refolding)은 본 기술분야에 알려진 모든 몇 개의 방법을 사용하여 성취된다. 예시적인 방법들은 용해성 폴리펩티드제(solubilized polypeptide agent)를 전형적으로 7을 넘는 pH에 무질서유발제(chaotropic agent)의 존재 하에서 노출시키는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 무질서유발제는 구아니딘(guanidine)이다. 특정한 구현예에서, 리폴딩/산화(oxidation) 용액(solution)은 또한 환원제(reducing agent) 및 그 환원제의 산화된 형태를 함유한다. 특정한 구현예에서, 환원제 및 그것의 산화된 형태는 디설파이드 셔플링(disulfide shuffling)이 생성하게 하는 특정한 산화환원 전위(redox potential)를 생성할 것인 비율로 존재한다. 특정한 구현예에서, 이러한 셔플링은 시스틴 브릿지들의 형성을 가능하게 한다. 예시적인 산화환원 커플(redox couple)은 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화제이구리(cupric chloride), 디티오트레이톨 DDT/디티안(dithiane)DDT, 및 2-메르캅토에탄올(bME)/디티오-bME를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정한 구현예에서, 조용매(co-solvent)는 리폴딩의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 조용매들은 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정한 구현예에서, 예를 들어, 하나 이상의 ABP 성분들 또는 ABP그 자체를 포함하는 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 실질적으로 정제한다. 특정한 단백질 정제 기술은 통상의 기술자에게 알려져있다. 특정한 구현예에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획들로부터 폴리펩티드 분별들의 조분별(crude fractionation)을 포함한다. 특정한 구현예에서, 폴리펩티드들은 크로마토그래피 및/또는 전기러닝 기술들을 사용하여 정제된다. 예시적인 정제 방법들은 암모늄 설페이트로 침전; PEG로 침전; 면역침전; 가열변성(heat denaturation) 후의 원심분리; 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질-A-세파로오스), 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 크로마토그래피; 겔 여과; 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography); 등전점전기러닝(isoelectric focusing); 폴리아크릴아미드 겔 전기러닝; 이러한 기술들 및 다른 기술들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정한 구현예에서, 폴리펩티드는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography) 또는 고압액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC)에 의해 정제된다. 특정한 구현예에서, 정제 단계들은 변화될 수 있고 또는 특정한 단계들은 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 준비를 위한 적절한 방법을 여전히 야기한다.
특정한 구현예에서, 폴리펩티드 제제의 정제 정도를 수량화하여 나타낸다. 정제 정도를 수량화하는 특정한 방법들은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 특정한 예시적인 방법들은 제제(preparation)의 특이적 결합 활성을 결정하는 것 및 SDS/PAGE 분석에 의해 제제 내에서 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드 제제의 정제 양을 평가하는 특정한 예시적인 방법들은 제제의 결합 활성을 계산하는 것(calculating) 및 초기 추출물의 결합 활성과 그것을 비교하는 것을 포함한다. 특정한 구현예에서, 이러한 계산의 결과들은 “정제도(fold purification)”로서 표현된다. 결합 활성의 양을 나타내는데 사용되는 유닛들은 수행된 특정한 검정법에 따른다.
특정한 구현예에서, 하나 이상의 ABP 성분들 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 부분적으로 정제된다. 특정한 구현예에서, 부분적 정제(partial purification)는 더 적은 정제 단계들을 사용하거나 또는 동일한 일반적인 정제 도식(scheme)의 서로다른 형태들을 활용하는 것에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, HPLC 기구(HPLC apparatus)를 활용하여 수행된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 저-압력 크로마토그래피 시스템을 활용하는 동일한 기술보다 더 큰 “정제도”를 일반적으로 야기할 것이다. 특정한 구현예에서, 더 낮은 정제 정도를 야기하는 방법들은 폴리펩티드의 총 회수에서 또는 폴리펩티드의 결합 활성을 유지하는 것에서 장점들을 가질 수 있다.
특정한 경우에서, 폴리펩티드의 전기러닝적 이동(electrophoretic migration)은 SDS/PAGE의 서로 다른 조건들에 따라 달라질 수 있고, 때로는 현저하게 달라질 수 있다. 예를 들어, Capaldi et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)를 인용한다. 서로 다른 전기러닝 조건들 하에서는, 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드의 명백한 분자량이 서로 다를 수 있다는 것이 인정될 것이다.
스크리닝 방법
어떤 측면에서, 관심 분자는 활성에 대해 스크리닝된다. 어떤 측면에서, 관심 분자는 ABP이다. 어떤 측면에서, 관심 분자는 항체이다.
어떤 측면에서, 본 명세서에 개시된 라이브러리들을 스크리닝하는 방법은 목적하는 표적에 결합할 수 있는 ABPs를 식별하는데 사용될 수 있다. 라이브러리로부터 얻은 ABP의 선택을 가능하게 하고, 표적 분자에 결합하는 ABP를 근거로 하는, 모든 생체 내 또는 시험관 내 스크리닝 방법이 고려된다.
일 구체예에서, 라이브러리는 업계에 알려진 시험관 내 무세포 표현형-유전형 링크된 디스플레이(in vitro cell-free phenotype-genotype linked display)를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법들은 본 기술분야에 잘 알려져있고 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; 및 6,348,315에 기재되어있다. 이러한 방법들은 단백질이 그것이 기원된 핵산에 물리적으로 연관 또는 결합되는 것과 같은 방법으로 핵산으로부터의 시험관 내 단백질의 전사를 포함한다. 표적 분자로 발현된 단백질을 선택하는 것에 의해, 단백질을 코딩하는 핵산이 또한 선택될 수 있다.
scFv 단백질들의 발현을 향상시키기 위해, 상기 참조된 시험관 내 스크리닝 검정법들은 특정한 시약(reagents)의 첨가 및 제거를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 단백질 디설피드 아이소머라아제 효소들은 시험관 내 발현 시스템에 첨가될 수 있으며 기능적 scFv 분자들의 생산을 향상시킨다. 다른 구현예에서, 약한 산화제(mild oxidizing agent)(예를 들어, GSSG (산화된 글루타치온)/GSH (환원된 글루타치온), 예를들어 100 mM GSSG/10 mM GSH)는 scFv 단백질들의 시험관 내 번역 반응 혼합물(translation reaction mixture)에 첨가될 수 있으며 scFv 분자의 VH 및 VL 부위들 내에서 체인 내(intra-chain) 디설피드 본드(disulphide bond) 형성을 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨(DDT))는 scFv의 시험관 내 번역 반응 혼합물에서 제거될 수 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 표지된 아미노산들, 또는 그들의 유도체들은 시험관 내 번역 시스템으로 첨가될 수 있고 그런 뒤 표지된 아미노산(들)은 생성 항체 내로 통합된다. 업계에 알려진 모든 표지된 아미노산들이 고려되고, 예를 들어, 방사능표지된(radiolabelled) 아미노산, 예를 들어, 35S-표지된 메티오닌 또는 시스테인이 있다.
일 구현예에서, 시험관 내 스크리닝 검정법들은 항체 또는 복수의 항체들의 시험관 내 선택 후에 항체 또는 복수의 항체들과 물리적으로 연관된 mRNA는 역전사 될 수 있고 상기 항체 또는 복수의 항체들을 인코딩하는 cDNA를 생성한다는 것을 포함할 수 있다. 역전사를 위한 모든 적절한 방법들이 고려되며, 예를 들어, 효소 매개된(enzyme mediated), 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사 효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)가 있다.
스크리닝 방법들은 목적하는 표적에 특이적으로 결합하는 항체들을 인코딩하는 핵산의 증폭을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 복수의 항체들과 물리적으로 연관된 mRNA는 증폭될 수 있고 더 많은 mRNA를 생산한다. 업계에 알려진 모든 RNA 복제의 방법들이 고려되고, 예를 들어, RNA 레플리카제 효소를 사용하는 것이 있다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 복수의 항체들과 물리적으로 연관된 mRNA는 먼저 PCR에 의해 증폭되기 이전에 cDNA 내에서 역전사된다. 일 구현예에서, PCR 증폭은 고충실도(high fidelity), 프루프-리딩 폴리머라아제(proof--reading polymerase)를 사용하여 성취되고, 예를 들어, 써모코커스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) 또는 플래티눔 Taq DNA 폴리머라아제 하이 페델리티 (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)로부터 얻은 KOD1 내열성 DNA 폴리머라아제가 있다. 다른 구현예에서, PCR 증폭은 증폭된 DNA 내에서 돌연변이체의 도입을 야기하는 조건하에서 수행될 수 있으며, 이는 즉 오류-유발 PCR(error-prone PCR)이다.
스크리닝 방법은 또한 표적에 대한 향상된 친화성을 갖는 항체들을 선택하여 표적-결합 스크리닝 검정법의 엄격함이(stringency) 증가할 수 있다는 것이 포함된다. 업계에 알려진 항체-표적 상호작용 검정법의 엄격함을 증가시키는 방법들이 고려된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 검정 조건들은 목적하는 표적에 대한 항체 분자의 친화성이 감소하는 것으로 달라질 수 있다(예를 들어, 검정 버퍼의 염 농도). 또다른 구현예에서, 목적하는 표적에 결합하는 항체들에게 허용된 시간 길이는 감소될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 경쟁적 결합 단계는 항체-표적 상호작용 검정법에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 항체들은 먼저 목적하는 고정된 표적에 결합하는 것이 허용된다. 비-고정된 표적의 특이적 농도는 그런 뒤 첨가될 수 있고, 고정된 표적과 결합하기 위해 경쟁하는 역할을 하고 항원에 대해 가장 낮은 친화성을 갖는 항체들은 고정된 표적들로부터 용리되고, 그 결과 향상된 항원 결합 친화성을 갖는 항체들에 대한 강화를 야기한다. 구현예에서, 검정법 조건들의 엄격함은 검정법에 첨가되는 비-고정된 표적들의 농도를 증가시키는 것에 의해 더 증가될 수 있다.
스크리닝 방법들은 또한 향상된 표적 결합을 갖는 하나 이상의 항체들을 강화하는 선택의 다중 라운드들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 선택의 각 라운드에서 또한 아미노산 돌연변이체는업계에 알려진 방법들을 사용하여 항체들 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선택의 각 라운드에서 목적하는 표적에 대한 결합의 엄격함은 목적하는 표적에 대해 증가된 친화성을 갖는 항체들을 선택하여 증가될 수 있다.
스크리닝 방법들은 시험관 내 번역 시스템의 성분들로부터 얻은 RNA-항체 융합 단백질들의 정제를 포함할 수 있다. 이는 업계에 알려진 모든 분리 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 일 구현예에서, RNA-항체 융합 단백질들은 폴리데옥시티미딘(polydeoxythimidine, polydT) 수지(resin)을 사용하는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 구현예에서, RNA-항체 융합 단백질들은 RNA-항체 융합 단백질의 항체 성분에 존재하는 에피톱에 대해 특이적인 항체를 사용하는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 구현에에서, 에피톱은 예를 들어, FLAG 또는 HA 태그들과 같은 아미노산 서열 태그일 수 있으며, 예를 들어, N-말단, C-말단 또는 가변 부위 간 링커(inter variable region linker)에서 RNA-항체 융합 단백질의 항체 성분의 아미노산 서열 내로 통합될 수 있다.
라이브러리로부터 항체들의 선택은 고정된 표적 분자들의 사용을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 표적 분자는 예를 들어, 아가로오스 비드들과 같은 고체 기질(solid substrate)에 직접적으로 링크될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표적 분자는 먼저 예를 들어, 비오티닐화(biotinylated)와 같이 변형될 수 있고 변형된 표적 분자는 변형을 통해 예를 들어, 스트렙타비딘-M280, 뉴트라비딘-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-아가로오스, 및 NA-아가로오스와 같은 고체 지지(solid support)에 대해 결합될 수 있다.
어떤 측면에서, 형광성으로-표지된 항원들은 특이적, 표지된 항원들에 대해 반응성을 갖는 형질아세포 또는 다른 B 계통 세포들만을 단일 세포 분류하는데 사용된다. 다른 측면에서, 형광성으로-표지된 항원들은 단일 세포 분류가 발생하기 전에, 특이적, 표지된 항원들에 대해 반응성을 갖는 형질아세포 또는 다른 B 계통 세포를 강화하는데 사용된다. 어떤 측면에서, 형광원성(fluorogenic) 또는 색소원성(chromogenic) 분자들은 B 계통 세포들을 식별하고 분류하는데 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, 목적하는 형질아세포들 또는 다른 B 계통 세포들은 마그네틱-활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting, MACS) 또는 심지어 패닝(panning)에 의해서 분리될 수 있다. 생성된 생산물은 일반적으로 다양한 표적들에 대한 단일클론 항체들이고, 표적들은: 암 항원들, 사이토카인들, 케모카인들, 성장 인자들, 분비된 단백질들, 세포 표면 및 특이적 관심, 미생물들(microbes), 박테리아, 마이코박테리아(mycobacteria), 기생충(parasites), 및 바이러스들의 세포 타입들을 격감하는(deplete)다른 항원들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 스크리닝 방법들은 하기 실시예 섹션에 기재되어있다.
컴퓨터 시행(Computer implementation)
어떤 측면에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법들은 컴퓨터 상에서 시행될 수 있다. 일 구현예에서, 컴퓨터는 칩셋(chipset)과 연결된(coupled) 하나 이상의 프로세서(processor)를 포함한다. 또한 칩셋에 연결된 것은 메모리, 저장 장치(storage device), 키보드, 그래픽 어댑터, 포인팅 장치(pointing device), 및 네트워크 어댑터이다. 디스플레이는 그래픽 어댑터에 연결된다. 일 구현예에서, 칩셋의 기능성(functionality)은 메모리 컨트롤러 허브(memory controller hub) 및 I/O 컨트롤러 허브에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, 메모리는 칩셋 대신 프로세서에 직접 연결된다.
저장 장치는 하드 드라이브, 컴팩트 디스크 리드-온리 메모리(CD-ROM), DVD, 또는 고체-상태 메모리 장치와 같이 데이터를 보유할 수 있는 모든 장치들이다. 메모리는 프로세서에 의해 사용되는 지시(instructions) 및 데이터를 보유한다. 포인팅 장치는 마우스, 트랙볼, 또는 다른 타입의 포인팅 장치 일 수 있고, 컴퓨터 시스템으로 데이터를 입력하는데 키보드와 함께 사용된다. 그래픽 어댑터는 디스플레이 상에 이미지들 및 다른 정보를 나타낸다. 네트워크 어댑터는 컴퓨터 시스템을 로컬(local) 또는 광역 네트워크(wide area network)로 연결한다.
본 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 컴퓨터는 이전에 기재되어있는 것들 보다 서로 다른 및/또는 다른 구성 성분들(components)을 가질 수 있다. 또한, 컴퓨터는 특정한 구성요소가 결핍될 수 있다. 또한, 저장 장치는 컴퓨터로부터 로컬 및/또는 원격일 수 있다(광저장장치영역(storage area network, SAN) 내에 구현된 것과 같은).
본 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 컴퓨터는 본 명세서에 기재된 기능성을 제공하기 위한 컴퓨터 프로그램 모듈들을 실행하는데 조정된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 “모듈”은 명시된 기능성(specified functionality)을 제공하기 위해 활용된 컴퓨터 프로그램 로직(logic)을 나타낸다. 따라서, 모듈은 하드웨어, 펌웨어, 및/또는 소프트웨어에서 시행될 수 있다. 일 구현예에서, 프로그램 모듈들은 저장 장치에 저장되고, 메모리로 로딩되고, 프로세서에 의해 실행된다.
본 명세서에 기재된 구현예 전체들은 본 명세어세 기재된 것들과는 다른 및/또는 서로 다른 모듈들을 포함할 수 있다. 또한, 모듈들에 기인하는 기능성은 다른 구현예들 내의 다른 또는 서로 다른 모듈들에 의해 수행될 수 있다. 또한, 이 설명은 목적의 명확성 및 편의성을 위해 가끔 용어 “모듈”을 생략한다.
키트
키트는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 라이브러리, 벡터, 및/또는 숙주 세포 및 사용설명서(instructions for use)를 포함할 수 있다. 키트는 적절한 용기 내에, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 라이브러리, 벡터, 및/또는 숙주 세포, 하나 이상의 대조군, 및 다양한 버퍼, 시약, 효소 및 본 기술분야에 잘 알려진 다른 표준 성분들(standard ingredients)을 포함할 수 있다.
용기는 하나 이상의 웰들을 포함하는 플레이트 상에 하나 이상의 웰을 포함할 수 있다. 용기는 하나 이상의 바이알(vial), 테스트 튜브(test tube), 플라스크, 보틀(bottle), 주사기(syringe), 또는 다른 용기 수단(means)들을 포함할 수 있고, 그 안에는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 라이브러리, 벡터, 및/또는 숙주 세포가 위치할 수 있고, 어떤 경우에서는, 적합하게 부분표본화(aliquoted)된다. 추가적인 성분이 제공되는, 키트는 그 안에 이 성분들이 위치할 수 있는 추가적인 용기들을 함유할 수 있다. 키트는 또한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 라이브러리, 벡터, 및/또는 숙주 세포 및 시판용에 가까운 구속(confinement)의 다른 시약 용기들을 포함하기 위한 수단들을 포함한다. 이러한 용기들은 주사 또는 목적하는 바이알들이 보유된 블로우-몰드 플라스틱 용기들(blow-molded plastic containers)을 포함할 수 있다. 용기들은 사용 및/또는 경고를 위한 지시를 표지하는 것을 포함할 수 있다.
실시예
실시예들은 오직 예시적인 목적으로 제안된 것이며, 어떤 방법으로도 본 발명의 모든 구현예의 범주를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자들(예를 들어, 양, 온도, 등.)에 대하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였으나, 약간의 실험적 오류 및 편차(deviation)는 당연히 허용되어야 한다.
다르게 나타내지 않는 한, 다양한 방법들은 당해 기술분야의 지식 내에 있는 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술들 및 약리학의 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 이러한 기술들은 문헌 내에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992); Current Protocols in Molecular Biology (2002- ; Wiley; Online ISBN: 9780471142720; DOI: 10.1002/04711142727); Current Protocols in Immunology (2001- ; Wiley; Online ISBN: 9780471142737; DOI: 10.1002/0471142735)를 인용한다.
일반적 재료 및 방법
혈액 수집 및 PBMCs의 분리
사전 동의(informed consent)후에 임상시험심사위원회(Investigational Review Board, IRB)-승인된 인간 대상 프로토콜들 하에서 모든 인간 샘플들을 수집하였다. 혈액을 헤파린 튜브들(Beckton Dickinson and Company, catalog #BD366664) 또는 CPT 튜브들(Beckton Dickinson and Company, catalog BD362761)내에 수집하였다. 헤파린 튜브들의 가공을 위해, 1 밀리리터의 혈액을 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)내로 이동시키고 12,000rpm에서 3분동안 스핀 다운(spun down) 하였으며, 혈장을 수집하고 -80oC에서 냉동시키고(항체 반응성을 위한 추후 실험을 위해), 혈액의 잔여물(remainder)을 피콜(Ficoll)로 층을 이루게 하였으며 SX4750 스윙잉 버켓 로터(SX4750 Swinging Bucket Rotor)를 갖는 베크만 쿨터 알레그라 X-15R 벤치탑 원심분리기(Beckman Coulter Allegra X-15R benchtop centrifuge)내에서 800g에서 헤파린 튜브를 20분동안 상온에서 최소 가속으로 브레이크의 사용 없이 원심분리하였고, 그리고 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 층을 수집하였다. 수집된 PBMCs를 그런 뒤 사용하기 전에 PBS로 두번 세척하였다.
PBMCs는 또한 후일의 사용 및 B-세포들, 기억 B-세포들, 형질아세포들, 형질 세포들, 또는 다른 B-세포 개체군의 분리를 위해 동결될 수 있다. PBMCs를 동결하는 한가지 방법은 PBMCs를 사이로바이알(cryovials)내의 90% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 10% 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에서 리서스펜딩(resuspending)하고, 그런 뒤 바이알 내에 담긴 세포들을 하룻밤 동안 -80oC에서 Mr. Frosty(Sigma C1562-1EA)내에서 천천히 동결하는 것을 포함한다. 동결된 세포들의 바이알들을 그런 뒤 장기 저장(long-term storage)을 위해 액체질소로 이동시키고, 개별적인 B-세포들의 분리 및 페어링된 면역글로불린 유전자들의 고처리 시퀀싱을 위해 차후에 녹일 수 있다. 녹은 세포들(Thawed cells)을 보통 25ug/ml(Sigma D4513)인 초과 DNase I를 함유하는 배지(media)에서 세포 클럼핑(clumping)을 예방하는 1st 분류의 종결까지 배양한다.
세포들 및 세포 서브개체군의 분리 및 강화
형질아세포. 어떤 샘플들을 위해, 변형된 형질세포 분리 키트 II(modified Plasma Cells Isolation Kit II)(Miltenyi 130-093-628)를 사용하는 것에 의해 PBMCs를 먼저 형질아세포를 위해 강화한다. 이는 선택적인 단계이다. 이는 그 이후의 분류를 위해 더 적은 총 세포들을 산출하였고, 더 짧은 분류 시간을 야기한다. 이는 동일한 날에 다중 샘플들이 단일-세포 분류되어야 할 필요성이 있는 때에 주로 사용된다. 서로 다른 B-세포 개체군(하기를 인용)을 강화하기 위해 서로 다른 키트들을 사용하는 것이 가능하다. 모든 5x107 PBMCs를 위해, 세포들을 200 μL의 아이스-콜드(ice-cold) MACS 버퍼(0.5% FBS가 포함된 PBS)내에서 서스펜딩 하였다. 50 Ul의 비-형질 세포 비오틴-항체 칵테일(cocktail)을 첨가하였고, 세포들을 냉장고(4oC) 내에서 10분동안 배양하였다. 100 μL의 MACS 버퍼, 100 μL의 비-형질세포 마이크로비드 칵테일, 및 50 μL의 CD56 마이브로비드들을 첨가하고 냉장고 내에서 추가적으로 10분동안 배양하였다. 세포들을 그런 뒤 7 mL의 MACS 버퍼로 세척하고, 300g, 4oC에서 5분동안 원심분리하고, 500 μL의 MACS 버퍼에서 리서스펜딩하고, 마그네틱 필드(magnetic field)내의 평형화된 LS 컬럼 상에서 러닝하였다. 컬럼을 4 x 3 mL의 MACS 버퍼로 세척하고 강화된 세포들이 음성 분획(negative fraction)내에 존재하였다.
기억 B-세포. CD19+ 마이크로비드들(Miltenyi 130-050-301) 및 CD27+ 마이크로비드들(130-051-601)은 세포 분류 이전에 기억 B-세포들을 강화하고, 분류 시간을 단축하기 위해 사용될 수 있다. 기억 B-세포 분리 키트(Memory B-cell isolation kit)(Miltenyi 130-093-546)와 같은 다른 강화 방법들은 또한 사용되고, 그들이 CD19+CD27+ 세포들을 강화한다는 것을 제공할 수 있다. 모든 5x107 PBMCs를 위해, 300 μL의 아이스-콜드 MACS 버퍼를 리서스펜션에 사용하였다. 100 μL의 CD19 마이크로비드들 및 100 μL 의 CD27 마이크로비드들은 그런 뒤 첨가되고, 샘플들을 4oC에서 15분 동안 배양하였다. 세포들을 그런 뒤 7 mL의 MACS 버퍼로 세척하고, 300g, 4oC에서 5분동안 원심분리하고, 500 μL의 MACS 버퍼 내에서 리서스펜션 하였다. 세포들을 그런 뒤 마그네틱 필드 내의 평형화된 LC 컬럼을 통하여 러닝하고, 2x 3 mL의 MACS 버퍼로 세척하였다. LS 컬럼을 그런 뒤 마그네틱 필드로부터 제거하고, 세포들을 5 mL의 MACS 버퍼로 세척해 없애고 강화된 세포들을 용리한다.
총 B세포. CD19+ 마이크로비드들(Miltenyi 130-050-301)은 세포 분류 이전에 총 B-세포들을 강화하는데 사용될 수 있고 예를 들어, 분류 시간을 줄이는데 사용될 수 있다. 다른 강화 방법들은 또한 사용될 수 있고, 그들이 CD19+ 세포들을 강화한다는 것이 제공될 수 있다. 모든 5x107 PBMCs를 위해, 세포들을 400 μL의 아이스-콜드 MACS 버퍼내에서 리서스펜드한다. 100 μL의 CD19+ 마이크로비드들을 첨가하고 냉장고(4oC)내에서 15분 동안 배양한다. 세포들을 그런 뒤 7 mL의 MACS 버퍼로 세척하고, 300g, 4oC에서 5분동안 원심분리하고, 500 μL의 MACS 버퍼 내에서 리서스펜션 하였다. 세포들을 그런 뒤 마그네틱 필드 내의 평형화된 LC 컬럼을 통하여 러닝하고, 2x 3 mL의 MACS 버퍼로 세척하였다. LS 컬럼을 그런 뒤 마그네틱 필드로부터 제거하고, 세포들을 5 mL의 MACS 버퍼로 용리하고, 강화된 세포들을 산출한다.
다른 세포 타입. 필요하지 않을 지라도, 목적하는 세포 개체군의 MACS 강화는 분류 시간을 줄일 수 있다. 형질세포들, 다른 B-세포 개체군들 및 비-B-세포 개체군들을 포함하는 다른 세포 개체군들은 또한 MACS 또는 적절한 시약들을 사용하는 다른 시스템들을 사용하여 강화될 수 있다. 예를 들어, 총 T-세포들은 CD3+ 마이크로비드들, 이펙터 T-세포들 및 CD8+ and CD4+ 마이크로비드들을 사용하여 분리된 헬퍼 T-세포들을 각각 사용하여 강화될 수 있다. CD45RO 마이크로비드들은 기억 T-세포들을 분리하는데 사용될 수 있고, CD8+ 또는 CD4+비드들과 함께, 각각 이펙터 또는 기억 헬퍼 T-세포들을 분리하는데 사용될 수 있다.
단일-세포 분류
MACS 강화는 분류를 위해서는 요구되지 않으나, 형질아세포를 위한 MACS 강화는 분류 시간을 줄이기 위해 수행될 수 있다. PBMCs가 MACS 강화를 겪는다면, 비강화된 PBMCs의 부분표본(~ 1백만 세포)은 또한 동시에 분석되고, 샘플 내에서 베이스라인 형질아세포 백분율(baseline plasmablast percentage)이 결정되도록 한다. 형질아세포를 분류하는 것을 위해, 세포들을 제조자-권장 부피(manufacturer-recommended volumes)의 CD3-V450 (BD 560365), IgA-FITC (AbD Serotec STAR142F), IgM-FITC (AbD Serotec STAR146F) 또는 IgM-PE (AbD Serotec STAR146PE), CD20-PerCP-Cy5.5 (BD 340955), CD38-PE-Cy7 (BD 335808), CD19-APC (BD 340437) 및 CD27-APC-H7 (BD 560222)로 얼음 상에서 50 μL의 FACS 버퍼(2% FBS를 가지는 PBS 또는 HBSS)내에서 20분동안 암실에서 염색하였다. 어떤 세포들을 또한 IgM-FITC와 함께 대신에 IgG-PE (BD 555787), CD138-PE (eBioscience 12-1389-42), 또는 HLA-DR-PE (BD 555812)로 염색 할 수 있다. 형질아세포, 기억 및 순수 B-세포의 동시 분류를 위해, 하기 염색 구도가 사용된다: IgD-FITC (Biolegend 348205), IgG-PE (BD 555787), CD20-PerCP-Cy5.5, CD38-PECy7, IgM-APC (BD 551062), CD27-APC-H7, IgA-비오틴 (AbD Serotec 205008) 후에 Strepavidin-eFluor710 (eBioscience 49-4317-82) 및 CD19-BV421 (Biolegend 302233). 기억 B-세포들은 또한 CD19+CD27+IgG+ 또는 CD19+CD20+IgG로서 분류되고, 순수한 B-세포들은 CD19+IgD+IgM+로서 분류된다. IgA+ 형질아세포들은 또한 분류되고, CD19+CD20-CD27+CD38++IgA+IgM-로 정의된다. B-세포 또는 다른 세포 개체군이 세포 표면 마커들을 사용하여 표현형적으로 식별가능하기만 하다면 다른 세포 표면 마커들이 또한 사용될 수 있고, 개체군은 또한 단일-세포 분류될 수 있다. 하기를 인용한다. 세포들을 그런 뒤 2 mL 의 FACS 버퍼로 세척하고 적절한 부피에서 FACS로 리서스펜션 한다. 세포들을 5 mL 원형 바닥 튜브 내의 BD Aria II 에서 제1 분류한다. 전형적으로, 제1 분류로부터는 >80%의 순도(purities)를 달성한다. 단일 세포를 6.65 μL의 저장성(hypotonic) 버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.6)를 함유하고 2 mM의 dNTPs (NEB N0447L), 5 μM의 올리고(dT)20VN, 및 1 유닛의 리볼록(Ribolock) (Fermentas EO0384), RNase 억제제를 함유하는 96-웰 PCR 플레이트의 제1 11 컬럼들 내에서 분류한다. 음성대조군으로서, 세포가 전혀 없는 마지막 컬럼을 남긴다. IgG+ 형질아세포를 위한, 게이팅(gating)(세포들의 선택) 전략은 CD19+CD20-CD27+CD38++IgA-IgM-이다. 분류된 플레이트들을 알루미늄 플레이트 실러(sealers)(Axygen PCR-AS-600)로 밀봉하고 즉시 드라이아이스 상에서 동결시키고 -80oC에서 저장한다.
단일-세포 분류 게이팅 전략
B-세포. B-세포들을 위해, 게이팅 접근법은 하나 이상의 하기의 마커들을 분류하는 것을 포함한다: IgM, IgG, IgA, IgD, CD19, 또는 CD20. 총 IgG+ B-세포를 위해, 게이팅 접근법은 IgG+를 분류하는 것을 포함한다. 총 IgG+ B-세포를 위해, 게이팅 접근법은 IgA+를 분류하는 것을 포함한다. 총 IgM+ B-세포를 위해, 게이팅 접근법은 IgM+를 분류하는 것을 포함한다.
활성화 B 세포. 활성화 B세포들은 그 동족 항원에 대한 그들의 세포막 항원 수용체의 결합을 통해 자극된 및/또는 동일한 거대분자 항원으로부터 유래된 에피톱들을 인식하는 T세포들로부터 T 세포 헬프를 받은 B세포들을 포함한다. 활성화 B세포들은 증가된 세포 크기(예를 들어, “블라스팅 B세포들”, 하기를 인용), 세포 표면 마커 또는 마커들의 발현, 세포내 마커 또는 마커들의 발현, 전사 인자 또는 인자들의 발현, 세포 주기의 갭0(G0)기의 탈출(exiting), 세포 주기를 통한 진행(progressing), 사이토카인들 또는 다른 인자들의 생산, 및/또는 특정한 세포 표면 마커 또는 마커들, 세포내 마커 또는 마커들, 전사 인자 또는 다른 인자의 하향 조정(down regulation)을 포함하는 다양한 성질들에 의해 식별될 수 있다. 활성화 B세포를 식별하는 한가지 방법은 CD19 또는 면역글로불린과 같은 B세포 마커의 탐지를 증가된 세포 크기 또는 부피와 같은 활성화의 마커, 세포 표면 활성화 마커 CD69, 또는 세포-투과성(cell-permeable) 아크리딘 오렌지 DNA 스트레인(stain)에 기초한 세포주기 또는 다른 세포 주기 분석을 통한 진행(progression)과 조합하는 것이다.
블라스팅 B세포(Blasting B cells). “블라스팅 B세포”는 휴지 B세포에 관하여 활성화되고 크기가 증가된 B세포들이다. 블라스팅 B세포들은 형질아세포 개체군 뿐아니라 활성화 B세포의 다른 개체군들을 포함하며, 블라스팅 B세포들은 휴지 세포보다 물리적으로 더 큰 크기인 것이다. 블라스팅 B세포들은 세포 직경, 세포 부피, 전기적 임피던스, FSC, FSC 펄스(FSC-A)의 적분(면적), FSC 높이(FSC-H), 전방 산란 펄스 폭(forward scatter pulse width, FCS-W), 측방산란(side scatter, SSC), 측방 산란 펄스 면적(side scatter pulse area, SSC-A), 측방 산란 높이(side scatter height, SSC-H), 측방 산란 폭(side scatter width, SSC-W), 자가형광(autofluorescence) 및/또는 다른 세포 크기 측정법에 근거한 그들의 물리적으로 더 큰 상태인 것에 근거한 B세포들의 게이팅(선택)을 포함하는 여러가지 서로 다른 접근법들을 사용하여 단일-세포 분류될 수 있다.
흐름세포측정(flow cytometry)에서, 전방 산란(FSC)은 세포의 스트림(stream)을 따라서 라이트 빔(light beam)을 사용하여 측정되고 각 세포의 비례하는 크기 및 직경에 관한 정보를 제공한다. FSC를 사용할 때, 휴지 B세포의 정중(median) FSC보다 큰 FSC를 가지는 B세포를 선택할 수 있고, 예를 들어, 휴지 B세포들 보다 5% 큰, 휴지 B세포들 보다 10% 큰, 휴지 B세포들 보다 15% 큰, 휴지 B세포들 보다 20% 큰, 휴지 B세포들 보다 30% 큰, 휴지 B세포들 보다 40% 큰, 휴지 B세포들 보다 50% 큰, 휴지 B세포들 보다 60% 큰 FSC-A 또는 FSC-H이다. 특이적 크기들의 칼리브레이션(calibration) 비드들을 분석하는 것에 의해, 칼리브레이션 비드들에 관한 B세포들의 상대적인 크기를 결정하는데 FSC를 사용할 수 있다. 이렇게 하여, 구체적으로 게이트 온(gate on) 할 수 있고 그리하여 약 8um, >8 um, >9 um, >10 um, >11 um, >12 um, >13 um, > 14 um, >15 um, > 16 um, >17 um, >18 um, >19 um, 또는 >20 um의 직경을 갖는 B세포들을 선택할 수 있다.
또 다른 세포 크기 측정법(measurement)은 세포 부피이다. 세포 부피에 대한 “최적 표준(gold standard)”은 전기적 측정법(electronic measurement)을 근거로한 콜터 원리(Coulter principle)를 사용한다(Tzur et al, PLoS ONE, 6(1): e16053. doi:10.1371/journal.pone.0016053, 2011). 비말 충전(droplet charging) 및 굴절(deflection)에 의한 분류 방법이 임피던스에 의해 세포 부피를 측정하는 장치내에서 먼저 사용되었다 하더라도, 현재 이용 가능한 흐름 세포측정기는 오직 광학적인 측정을 한다. 비록 FSC 측정들이 입자들과 유체 간의 굴절률(refractive index) 차이에 의해 영향 받을 수 있다 하더라도 FSC 측정들, 구체적으로 FSC-A (FSC 적분 면적)은 흔히 세포 크기를 평가하는데 사용된다(Tzur et al, PLoS ONE, 6(1): e16053. doi:10.1371/journal.pone.0016053, 2011). 어떤 점에서 부피 추정(volume estimation)은 FSC-W, SSC 및 450/50-A 자가형광을 포함하는 광학적 파라미터들을 조합하는 것에 의해서 향상될 수 있다는 것이 나타난다(Tzur et al, PLoS ONE, 6(1): e16053. doi:10.1371/journal.pone.0016053, 2011).
예를 들어, 증가된 크기에 근거한 활성화 B세포들의 선택은 CD19와 같은 마커들을 사용하여 B세포들을 식별하는 것 및 FSC 또는 FSC-A를 통해 크기를 평가하는 것을 통하여 성취될 수 있다. 다른 B세포 마커들 및/또는 크기 평가를 위한 파라미터들은 본 명세서에 기재되어 있다.
형질아세포. 형질 아세포의 분리를 위해, 게이팅 접근법은 CD19+CD38++ B-세포들에 대해 분류하는 것을 포함한다. IgG+ 형질아세포들의 분리를 위해, 게이팅 접근법은 CD19+ CD38++IgA-IgM- B-세포들에 대해 분류하는 것을 포함한다. IgA+ 형질아세포들의 분리를 위해, 게이팅 접근법은 CD19+CD38++IgA+ B-세포들을 분류하는 것을 포함한다. IgM+ 형질아세포들의 분리를 위해, 게이팅 접근법은 CD19+CD38++IgM+ B-세포들을 분류하는 것을 포함한다. 또한 다른 게이팅 전략들은 본 명세서에 기재된 방법들을 수행하는데 충분한 숫자의 형질아세포들을 분리하는데 사용될 수 있다. 형질아세포들을 또한 하기의 마커 발현 패턴들 CD19low/+, CD20low/-, CD27+ 및 CD38++을 사용하여 분리한다. 모든 이러한 마커들의 사용이 일반적으로 단일 세포 분류로부터 가장 순수한 형질아세포 개체군을 야기한다고 하더라도, 상기의 모든 마커들이 사용될 필요는 없다. 예를 들어, 형질아세포는 또한 하기의 게이팅 전략들을 이용하여 분리될 수 있다: 더 큰 세포들, FSChiCD19lo 세포들, FSChi 및 CD27+, CD38++, 또는 CD20- 세포들에 대한 전방 산란 하이(forward scatter high, FSChi). 이러한 모든 마커들 또는 다른 B세포들로부터 얻은 형질아세포들을 구별할 수 있는 것으로 발견되는 다른 마커들의 조합은 일반적으로 복수의 분류된 형질아세포들의 순도를 증가시킬 것이나, 상기 마커들 중 어느 하나는 비록 낮은 순도일지라도, 단독으로(FSChi를 포함하는) 형질아세포들을 다른 B-세포들과 구별할 수 있다.
기억 B-세포를 위한. IgG+ 기억 B-세포들을 위해, 게이팅 접근법은 CD19+ CD27+IgG+ 또는CD19+ CD20+IgG+를 분류하는 것을 포함한다. IgA+ 기억 B-세포들을 위해, 게이팅 전략은 CD19+CD27+IgA+ 또는 CD19+CD20+IgA+를 포함한다. IgM+ 기억 B-세포들을 위해, 게이팅 전략은 CD19+CD27+IgM+ 또는 CD19+CD20+IgM+를 포함한다.
다른 세포 타입을 위한. B-세포, T-세포, 또는 다른 세포 개체군이 세포 마커들을 사용하여 표현형적으로 식별가능하기만 하다면, 이는 단일-세포 분류될 수 있다. 예를 들어, T-세포들은 CD3+로 식별될 수 있고 또는 TCR+, 순수한 T-세포들은 CD3+CD45RA+로 식별될 수 있고 또는 기억 T-세포들 은 CD3+CD45RO+로 식별될 수 있다. 이펙터 및 헬퍼 T-세포들은 각각, CD3+CD8+ 및 CD3+CD4+로 식별될 수 있다. 세포 개체군들은 기억 헬퍼 T-세포들을 위한 CD3+CD4+CD45RO+와 같은 마커들의 조합을 사용하는 것에 의해 더 세분화 될 수 있다.
단일 B-세포들로부터 얻은 페어링된 라이트 및 헤비 체인 면역글로불린 유전자들의 시퀀싱
어댑터 분자들로의 역전사
단일-세포 분류된 플레이트들을 얼음 위에서 녹였고 사용하기 전에 간단히 원심분리했다. 플레이트들을 유전자증폭장치(thermal cycler)내에서 55oC 에서 3분동안, 42oC 에서 2분동안, 그리고 4oC에서 무기한으로 배양했다. 플레이트들을 간단히 다시 원심분리했고 에어로졸(aerosols)의 제형을 피하기 위해 조심히 열었다. 1 μL의 적절한 어댑터 분자의 10 μM 용액(각 어댑터 분자는 일반적으로 샘플 식별 부위(샘플-ID) 를 가진다)을 각 웰에 첨가했고, 이는 동일한 어댑터 분자들을 받는 모든 음성 대조군 웰들(RNA 보존제 버퍼 단독, 또는 비-B-세포들)을 갖는다. 0.75 μL의 H2O, 1 μL의 10x M-MuLV RT 버퍼(NEB B0253S), 0.6 μL 의 50mM MgCl2, 0.25 μL 의 리볼록 (40 U/μL), 및 0.125 μL 의 수퍼스크립트III(Superscript III (200 U/μL))(Invitrogen 18080-085)을 함유하는 2.35 μL의 믹스를 첨가했고 피펫팅(pipetting)에 의해 혼합했다. 플레이트들을 간단히 원심분리했고 42oC에서 120분 내지 8시간동안 써멀 플레이트 쉐이커(thermal plate shaker)에서 배양했고 그런 뒤 -20oC에서 보관했다. 반응 후에, 모든 웰들로부터 얻은 RT 생산물들을 마이크로퓨지 튜브내에서 모았다. 모아진 RT 생산물들을 그런 뒤 ~0.1%의 8-하이드록시클로로퀴논(hydroxychloroquine)(Sigma 77617)을 갖는 페놀-클로로포름-이소프로필 알코올로 추출하였고, 그런 뒤 겔-락 상 튜브들(gel-lock phase tubes)(5 PRIME 2302820) 내에서 클로로포름 추출로 추출하였다. RT 생산물들을 그런 뒤 농축하고 Amicon Ultra-0.5 30kDa (Millipore UFC503096) 또는 Ultra-0.5 100kDa (Millipore UFC510096)으로 14 000g에서 5-분 회전에 의해 탈염하였고, 그 후에 TE (1mM EDTA를 갖는 10mM Tris-HCl pH 7.6)와 함께 14 000g에서 5 분 회전하고 EB (Qiagen 19086)로 14 000g에서 마지막 5-분 회전시켰다. 새로운 센트리퓨지 튜브 내에서 아미콘 울트라 컬럼(Amicon Ultra column)을 뒤집고 1000g에서 2분동안 원심분리하는 것에 의해 RT생산물들을 용리하였다. 이러한 점에서, RT 생산물을 -20oC 또는 -80oC에 보관하였다.
터치다운 PCR
454 시퀀싱 런 1 및 2를 위해, 터치다운 PCR 방법을 하기에 따라 사용하였다. PCR 런들 3 및 4 내의 어떤 샘플들을 위해, PCR 방법을 변화하였고, 이는 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 증가된 숫자로 이어진다. 이러한 변화는 하기 서브-섹션 “비 터치다운 PCR”에서 상세히 기재된다.
1st PCR 및 네스티드 2nd PCR 둘 다를 위해, 퓨션 핫 스타트 II DAN 폴리머라아제(Phusion Hot Start II DNA polymerase)(NEB F-549L)를 제공된 GC 버퍼 내에서 사용하였다. IgG를 위해, 프라이머들 및 어댑터 분자들을 표 1에 나타낸다. 샘플-ID 서열들은 표 2에 나타낸다. 플레이트-ID 서열들은 표 3내에 나타낸다. 또한 도 3 및 9를 인용한다. 농도반응 조건들은 1.8 mM의 최종 MgCl2 농도, 200 μM의 dNTPs, 모든 프라이머에 대해 0.2 μM, 0.2 U의 퓨션 폴리머라아제, 첨가제로서 변화하는 양의 DMSO 및 최종 부피 25 μL내의 2 μL의 주형을 포함한다. 1st PCR을 위해, 람다 및 카파 라이트 체인들 및 감마 헤비 체인들을 서로 다른 웰들 내에서 증폭하였고, DMSO는 최종 농도 8%, 5% 및 10%에서 각각 사용된다. 1st PCR에서 사용된 포워드 프라이머들은 FW 롱 프라이머1 및 FW 쇼트 프라이머1 이었다. FW 프라이머 1이 플레이트 식별 부위(플레이트-ID)를 앰프리콘 부위(앰프리콘들)의 5’ 말단에 첨가하므로, 서로 다른 플레이트-IDs를 함유하는 FW 롱 프라이머1를 서로 다른 샘플들에 첨가하였다. 카파, 람다, 및 감마 체인들에 사용된 유전자-특이적 리버스 프라이머들은 각각, 카파 GSP1, 람다 GSP1, 및 감마 GSP1이다. 1st PCR에 대한 사이클링(Cycling) 조건들은 98oC에서 30’’동안 초기 변성 단계, 그 후에 98oC에서 10’’ 동안 2사이클; 98oC에서 10’’ 동안, 71.5oC 내지 68.5oC에서 15’’ 동안 및 72oC에서 20’’ 동안 각 추후의 어닐링 단계를 위해 0.5oC의 낮춤(drop)을 갖는 7번의 터치다운 사이클들; 98oC에서 10’’동안, 68oC에서 15’’동안 그리고 72oC에서 20’’동안의 30사이클들, 그 후에 72oC 에서 5’동안 최종 확장 그리고 4oC에서 무기한으로 보유하는 것을 포함한다. 1st PCR로부터 얻어진 생산물을 TE내에서 100x 희석하였고 2 μL을 네스티드 2nd PCR을 위해 사용하였다. 2nd PCR을 위해, 5% DMSO를 첨가제로서 모든 샘플들에 사용하였다. 포워드 프라이머는 FW 프라이머2이고 리버스 프라이머들은 RV 프라이머2 및 GSP 롱 프라이머2였다. 카파 GPS 롱 프라이머2, 람다 GSP 롱 프라이머2 및 감마 롱 프라이머2를 그들 각각의 앰프리콘들을 증폭하는데 사용하였다. GSP 롱 프라이머2가 또한 플레이트-ID를 앰프리콘의 3’말단에 첨가하기 때문에, 플레이트-특이적 플레이트-IDs를 갖는 서로 다른 GSP 롱 프라이머2를 각각의 모아진-플레이트 샘플에 첨가하였다. 네스티드 2nd PCR 을 위한 사이클링 조건들은 98oC 에서 30’’동안의 초기 변성 단계, 98oC에서 10’’동안 30-40 사이클들, 67oC에서 15’’동안, 및 72oC 에서 20’’동안, 그 후에 72oC 에서 5’동안 최종 확장 그리고 4oC에서 무기한으로 보유하는 것을 포함한다.
비-터치다운 PCR
비-터치다운 PCR을 위해, 다르게 기재되지 않는 한 조건들을 터치다운 PCR과 동일하게 하였다. 1st PCR 사이클링 파라미터들은 초기 변성의 95oC에서 5'동안, 98oC 30''의 15-25사이클들, 62oC 30'', 72oC 30'', 최종 확장의 72oC 5' 그리고 4oC에서 무기한으로 보유하는 것이었다. 1st PCR은 멀티플렉스 PCR이었으며, 이는 모든 3개의 유전자-특이적 리버스 프라이머들, 카파, 람다, 및 감마 불변 부위들 리버스 프라이머들을 0.2, 0.2 및 0.24 μM로 각각 접합(conjunction)에서 사용하였다. 사용된 모든 다른 프라이머들은 터치다운 PCR에서와 동일한 것이었다. 유전자-특이적 프라이머들은 터치다운 PCR에서 사용된 것들일 수 있고 또한 1st PCR에 적절한 것으로서 지정된 것들(표 6) 중 임의의 하나일 수 있다. DMSO를 5%의 최종농도로 사용하였고; 0.1mg/ml 의 BSA (NEB B9001S), 및 ET-SSB (NEB M2401S)는 또한 PCR 반응을 위해 1:100으로 첨가될 수 있다. 1st PCR 중에, 4-6ul의 Cdna 주형을 총 80 또는 90ul 반응 부피에서 사용하였다. 각 PCR1 반응은 여덟 또는 아홉개의 10ul 반응들로 쪼개졌고, 각각 서로 다른 웰에서 발생하였다. 1st PCR을 PCR후에 다시 모았으며 TE내에서 100x 희석하고 0.1, 및 2ul를 2nd PCR를 위해 사용했다. 2nd PCR은 각 유전자-특이적 프라이머(멀티플렉스가 아닌)를 위한 독립적인 반응이고, 반응 믹스는 하기를 제외하고는 터치다운 2nd PCR와 동일하였다: 2nd PCR을 위해 작동(working)하는 것으로서 지정된 모든 유전자-특이적 불변 부위 프라이머들이 사용될 수 있고(표 6), 프라이머들을 전체에걸쳐 0.2μM 또는 0.4μM에 사용했으며, 또는 유전자-특이적 프라이머들을 0.2μM에 사용했고 나머지를 0.4μM에 사용했다. 0.1mg/ml BSA을 반응에 첨가했고 ET-SSB는 또한 1:100으로 사용할 수 있다. 2nd 세미-네스티드 PCR 사이클링 파라미터들은 초기 변성의 95oC에서 5'동안, 20-35 사이클의 98oC 30'', 67oC 30'', 72oC 30'', 최종 확장의 72oC 5' 그리고 4oC에서 무기한으로 보유하는 것이었다. 1st 및 2nd PCR이 결합된 PCR 사이클들의 총 숫자는 비-터치다운 PCR에 대해선 전형적으로 50-60 사이클들이었다. PCR을 겪는 서로 다른 모아진-웰들은 서로 다른 수의 사이클들을 사용하는 경향이 있고 DNA 생산물의 합리적인 양(전형적으로 1-12ng/ul)을 수득하므로, 예를 들어, 23, 26, 30 및 33사이클들과 같은 4개의 서로 다른 PCR 사이클들을 각 2nd PCR을 위해 수행하였고 5ul를 2% 아가로오스 겔 상에서 러닝하고 비교하였다. PCR 생산물 양의 퀄리티 판단(qualitative judgment)에 근거하여, 2nd PCR 사이클 숫자들 중 하나로부터 얻은 PCR 생산물만을 각 모아진(pooled)-웰 2nd PCR을 위해서 454 시퀀싱 런을 준비하는데에 사용하였다.
인간들의 다른 면역글로불린 헤비 체인들의 PCR을 위해, 마우스들의 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인들 및 인간들 및 마우스들의 TCR 체인들, PCR 조건들은 1st PCR이 비-멀티플렉스이고 개별적으로 증폭되는 각 cDNA를 갖는다는 것을 제외하고는 상기 비-터치다운 PCR 섹션과 동일하다. 하기 표 10 및 11의 3’프라이머들은 PCR1 및 2에서 사용된다.
454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비
1st 및 2nd 454 런들을 위해, 454 티타늄 시퀀싱 런을 위한 시퀀싱 프라이머(각각, 티타늄 프라이머들 A 및 B)를 1st 및 네스티드 2nd PCRs중에 앰프리콘들로 첨가하였다. 5 μL의 각 앰프리콘들을 질량 DNA 래더(mass DNA ladder)(Fermentas SM0383)와 함께 아가로스 겔에서 러닝하였고, 이미지를 얻었으며, 밴드 강도들을 분석하였고 AlphaFC 이미저 소프트웨어(AlphaFC Imager software)(Cell Biosciences)로 수량화 하였다. 5 ng의 각 카파, 람다, 감마 앰프리콘들을 독립적으로 모았으며, 0.8% 아가로오스 겔 상에서 러닝하였고, GelGreen(Biotium 41005)으로 시각화하였다. 적절한 크기들의 밴드들을(카파 및 람다는 ~600bp 그리고 감마는 ~750bp) 절단하였고 작은 변형을 가해서 제조자의 지시에 따라 민일루트 겔 추출 키트(MinElute Gel Extraction kit)(Qiagen 28606)로 정제하였다. 간단하게, 아가로오스겔을 가열 없이 QG 버퍼에서 녹였으며, 추가적인 QG 세척 단계를 수행한다. PE 세척 버퍼를 스피닝(spinning) 이전에 5분 동안 시팅(sit)하게 한다. 추가적인 PE 세척 단계를 또한 수행하였다. 샘플들을 25 uL의 EB 버퍼로 용리하였다. 샘플들을 또한 1:0.65 비율의 454 2nd 런을 위한 DNA 부피: 비드 부피를 사용하여 SPRI 비드들로 한번 청소하였다. DNA 농도를 피코그린 DNA 검정 키트(Picogreen DNA assay kit)(Invitrogen P11496)로 결정하였고, 샘플들을 모았고, 그리하여 감마:카파:람다의 농도가 2:1:1이다. 모아진 샘플들은 >0.5ng/μL의 농도에 있었고, 454 시퀀싱을 위한 454 DNA 시퀀싱 설비로 이동시켰다.
3rd 및 추후의 454 시퀀싱 런들을 위해, 프로토콜을 변경하였다. 앰프리콘들을 여전히 독립적으로 모아서 각 PCR 반응으로부터 얻은 DNA 수량들을 표준화하였으나, SPRI 비드 클린업(cleanup)을 먼저 겪게하여 제조자의 지시에 따라 작은 DNA 단편들을 제거하였다. 앰프리콘들을 3% 아가로오스 겔 상에서 러닝하였고, 적절한 밴드들을 절단하고 이전과 같이 민일루트 겔 추출 키트(MinElute Gel Extraction kit)로 정제하였다. 그 후에, 앰프리톤들을 다른 2라운드들의 SPRI 비드 클린업을 겪게하고 더 작은 DNA 단편들을 제거하고, 피코그린(Picogreen)으로 수량화 하고, 나노드롭(Nanodrop)으로 퀄리티를 확인하여 OD260/280 비율이 >1.8이었는지 보장하였고 1μl를 겔 상에서 러닝하여 작은 DNA 단편들이 없다는 것을 보장하였다. 람다 및 카파 앰프리콘들을 1:1의 비율로 모았으며 감마는 있는 그대로(as-is) 사용하였다. 그런 뒤 DNA를 454의 지시 당 1 x 109 카피들로 희석하였고(diluted to 1 x 109 copies per 454’s instructions), 1cpb에서 emPCR을 위해 시퀀싱 설비(Roche)로 보내 시퀀싱하였다; 피코타이터 플레이트(picotiter plate)의 하나의 부위 내의 감마 헤비 체인 및 다른 부위 내의 모아진 라이트 체인들.
454 XL+ 시퀀싱 런을 위한 준비
현재 454 XL+ 시퀀싱 런은 XLR70 런을 위해 사용되었던 것인 Lib-A 시퀀싱 키트를 지지하지 않는다. XL+는 현재 오직 단방향성 시퀀싱인 Lib-L 키트 만을 지지한다. XL+ 시퀀싱을 수행하는데에 우리의 프로토콜을 어댑트하기 위해, XLR70 런에 대한 프로토콜이 뒤를 따르나, 겔 클린업 단계 이후에는, 각 앰프리콘(카파, 람다, 및 감마)을 2개의 독립된 PCRs을 겪게하였고, 각 5개의 사이클들은 Lib-L A 및 B 어댑터들에 첨가할만큼 길다. PCR 조건들은 하기와 같다: 5x GC 버퍼 및 최종농도 5%의 DMSO와 함께 퓨션 폴리머라아제를 사용한다. 프라이머들은 0.2uM에서 사용한다. 0.1mg/ml BSA를 반응에 첨가한다. PCR 사이클링 파라미터들을 초기 변성의 95oC에서 5'동안, 20-35 사이클들의 98oC 30'', 67oC 30'', 72oC 30'', 최종 신장의 72oC 5' 그리고 4oC에서 무기한으로 보유하는 것으로 한다. 두 개의 PCRs을 각 앰프리콘에 대해 수행한다: 하나의 PCR에서 5LIB-LA 및 3LIB-LB, 및 다른 PCR에서 5LIB-LB 및 3LIB-LA. 어댑터들을 첨가하고 그리하여 각 앰프리콘들을 5’-LibA-앰프리콘-LibB-3’ 또는 5’-LibB-앰프리콘-LibA-3’이 되게한다. 이러한 앰프리콘들은 양방향성 시퀀싱을 가능하게 하는 5’말단 상에 LibA “A” 또는 “B” 어댑터들(및 3’말단 상에 상응하는 “B” 또는 “A”)을 갖는다. 그런 뒤 새로운 Lib A 어댑터들을 갖는 앰프리콘들은 3 라운드들의 SPRI 비드 클린업을 겪으며 그 후에 XLR 70 런들을 위한 프로토콜에 따라서 DNA를 수량화하고 퀄리티 확인을 하고 그 후에 그것을 1 x 109 카피들로 희석하고 1cpb에서 emPCR을 위해 454 시퀀싱 설비(Roche)로 보내고 시퀀싱한다.
PacBio 시퀀싱 런을 위한 준비
PacBio 시퀀싱 런을 위해, 터치다운 PCR을 상기와 같이 사용하였다. DNA 모음(pooling) 및 클린업을 상기의 “454 XLR70 런을 위한 준비” 섹션과 같이 수행하였다. 시퀀싱 요건(requirements)들을 위한 충분한 DNA(500ng)을 수득하기 위해, 최소 1ug의 DNA를 겔 및 SPRI 클린업으로 모았다. 피코그린(Picogreen) 수량화 및 1x109 희석들을 PacBio 시퀀싱에서는 요구되지 않으므로 수행하지 않았다. 충분하지 않은 DNA를 2nd로부터 수득하였다면, 2nd PCR 및 모음(pooling) 단계들을 충분한 DNA가 수득될 때까지 반복하였다. 최소 500ng의 클린-업 DNA를 시퀀싱을 위해 PacBio 시퀀싱 설비로 보냈다.
다른 시퀀싱 접근법
본 명세서에 개시된 방법들은 454 또는 PacBio 시퀀싱에 의존하지 않는다. 람다 및 카파 라이트 체인들은 ~600bp이고 감마 헤비 체인은 ~700bp이다. 따라서, 일반적으로 목적하는 것은 더 긴 시퀀싱 리드들을 가지는 능력이며 그리하여 포워드 및 리버스 시퀀싱 리드들이 전체의 재구성을 가능하게 하는데 충분히 중복될 수 있고, 대략 라이트 체인들의 600 bp 서열(LCs)(5’ 비번역 부위(UTR)의 길이를 따른 정확한 서열 길이), 및 대략 헤비 체인들의 700 bp 서열(HCs)이다. 그러므로, 약 350-400bp 이상의 시퀀싱 리드들을 산출 할 수 있고 그리하여 시퀀스 어셈블리에 사용되는 중복을 달성할 수 있는 모든 시퀀싱 기술이 활용될 수 있고, 대략 600-700+bp 리드들을 가능하게 하는 시퀀싱 기술들은 단지 포워즈(Fw)프라이머(5’말단 으로부터 시퀀싱)를 사용하여 시퀀싱을 가능하게 할 것이다.
서열
상기 런들을 위한 서열 데이터는 관련 시설로부터 받았고 하기에 기재된 대로 가공하였다.
서열 명명법
시퀀싱 리드, 서열 어셈블리 또는 서열로부터 얻은 아미노산 번역과 상응하는 서열 목록 내의 각 서열은 식별자를 가진다. 이러한 각 식별자는 마침표, “.”에 의해 9개의 필드들을 분리한다. 필드들은 1부터 9까지 숫자가 붙여지고 하기 정보를 제공한다:
1. 리드 ID. 리드 ID는 리드를 결정하는데 사용되는 시퀀싱 기술과 연관된 소프트웨어에 의해 할당되는 것이며, 또는 서열들이 로우 리드(raw read)가 아닌 것이라면 “NA”.
2. 플레이트 넘버. 플레이트 넘버는 서열과 연관된 것이다. 상응하는 생물학적 샘플 정보에 대한 표12를 인용한다(플레이트 내지 샘플 맴핑 테이블).
3. 샘플 ID. 샘플 ID는 서열이 연관쇤 웰을 나타낸다.
4. 웰 이름. 웰을 함유하는 웰 이름은 서열이 연관된 것이다. 웰 이름은 보통의 96 웰 플레이트 이름, 예를 들어 D07과 같다.
5. 콘티그(Contig) ID. 콘티그 ID는 주어진 어셈블리 및 체인 타입으로부터 얻어진 웰과 연관된 서로 다른 서열들을 구별한다.
6. 플랫폼. 플랫폼 필드는 서열이 유래된 시퀀싱 기술을 나타낸다. 플랫폼의 가능한 값들은 454, 생어 및 PacBio이다.
7. 체인 타입. 체인 타입 필드는 서열이 헤비 체인 항체 서열들의 세트, 라이트 체인 항체 서열들의 세트, 또는 헤비 및 라이트 체인 항체 서열들 모두를 함유하는 세트와 연관된 서열인지 여부를 나타내는 것이다.
8. 런ID. 특정 플랫폼 상의 리드들의 셋트에 대한 식별자.
9. 시퀀스 타입. 시퀀스의 타입이다. 가능한 값들은 로(raw) 시퀀싱 기술 리드들에 대해 “로(raw)”, 조립된 리드들에 대해 “nb”, “urt”, “multim50”, “zerom50” 또는 “pb”(서열의 어셈플리 섹션을 인용), 또는 다양한 nt 어셈블리 공통 서열(consensus sequences)로부터 유래된 아미노산 서열들에 대해 “nb-aa”, “urt-aa”, “multim50-aa”, “zerom50-aa” 또는 “sanger-aa” 이다.
분석을 위한 서열을 위한 준비
454 시퀀싱으로부터 생성된 데이터를 454 GS FLX 데이터 분석 소프트웨어에 의해 분석하였고, 필터-통과 고품질 서열들을 돌려보냈다. 454 GS FLX 데이터 분석 소프트웨어에 의해 사용되는 디폴트 앰프리콘 필터(default amplicon filter)의 엄격함 때문에, 필터 엄격함은 충분한 긴 리드들을 수득하기 위해 완화될 필요가 있을 수 있다. 한 가지 방법은 454 기술적 회보(technical bulletin) APP No. 001-2010내의 제안을 따르는 것이다. 앰프리콘 필터의 <vfScanAllFlows>를 "티아이온리(TiOnly)"로부터 "폴스(False)"로 변경하는 것은 좋은 품질의 필터-통과 서열들 내의 큰 증가를 이끌 수 있다. 또 다른 옵션은 <vfTrimBackScaleFactor>를 더 낮은 숫자로 변경하는 것이다. 454 런 1을 위해, 표준 샷건 프로세싱(standard shotgun processing)을 사용하였고 런2를 위해, <vfScanAllFlows>를 "폴스(False)"로 변경하였고, 런들 3 및 4를 위해 표준 앰프리콘 파이프라인 프로세싱을 사용하였다.
퍼시픽 바이오사이언스즈 시퀀싱(Pacific Biosciences sequencing)으로부터 생성된 데이터를 연관된 퀄리티 점수들을 가지는 환형 공통 서열(Circular Consensus Sequence)로서 퍼시픽 바이오사이언스즈사로부터 받았다.
웰에 대한 서열의 할당(Assignment of Sequences to Wells)
샘플로부터 얻어진 cDNA를 454 또는 퍼시픽 바이오사이언스즈 시퀀싱 기술로 시퀀싱하였다. 리드들은 서열 목록 내에 있는 것들이고 그 서열 타입은 “로우(raw)”이다. 시퀀싱 리드들을 분석하고 소스 플레이트 및 웰에 할당하거나 또는 폐기하였다.
리들를 위한 플레이트 및 웰 할당(assignments)을 관찰된 리드 서열과 가능한 플레이트 식별 부위, 범용 프라이머 부위, 샘플 식별 부위 서열들을 규칙적 발현(regular expressions)을 사용하여 비교하는 것에 의해 결정하였다. 비교를 표 13, 14 및 15에 나열된 규칙적 발현을 사용하여 세 단계로 수행하였다.
단계 1, 가능한 플레이트 식별 부위들의 분석에서, 리드들을 표 13의 컬럼 “플레이트 식별 부위 규칙적 발현”에 나열된 모든 규칙적 발현들에 대하여 확인하였는데, 이는 제1 서열의 뉴클레오티드로부터 시작하는 매치를 요구하였다. 매치가 발견되지 않는다면 리드를 폐기하고 플레이트/웰 할당을 다음 처리가능한 리드가 있다면 계속하였다. 매치가 발견되면, 서열에 그 플레이트 ID로서 “플레이트 ID” 컬럼으로부터 상응하는 ID를 할당한다. 플레이트 규칙적 발현에 매칭하는 리드의 뉴클레오티드들을 매칭의 추후단계 및 어셈플리 중에 사용하기 위해 기록하였다.
단계 2, 범용 프라이머 부위의 분석, 리드들을 “범용 프라이머 규칙적 발현” ” CACGACCGGTGCTCGATT+AG”에 대해 확인하였고, 플레이트 규칙적 발현에 매칭하는 마지막 리드 뉴클레오티드의 뒤를 이어 제1 뉴클레오티드로 시작하는 매치를 리드에 요구하였다. 리드가 범용 프라이머 규칙적 발현과 매치되지 않았다면, 리드를 폐기하였고 플레이트/웰 할당을 다음 처리가능한 리드가 있다면 계속하였다. 그 반대로 범용 프라이머 규칙적 발현에 매칭하는 리드의 뉴클레오티드들을 매칭의 마지막 단계 및 어셈블리 중에 사용하기 위해 기록하였다.
단계 3, 가능한 샘플 식별 부위들의 분석, 리드들을 표 14의 컬럼 “샘플 식별 부위 규칙적 발현”에 나열된 모든 규칙적 발현들에 대해 확인하였고, 범용 프라이머 규칙적 발현에 매칭하는 마지막 리드 뉴클레오티드의 뒤를 이어 제1 뉴클레오티드로 시작하는 매치를 요구하였다. 매치가 발견되지 않았다면 리드를 폐기하고 플레이트/웰 할당을 다음 처리가능한 리드가 있다면 계속 하였다. 매치가 발견되고 샘플 ID 컬럼이 오직 단일 식별자만을 함유한다면, 리드의 샘플 ID를 샘플 ID 컬럼 내에서 발견되는 ID가 되도록 할당하였다. 샘플 ID 컬럼이 단일 식별자 보다 많은 것을 함유했다면, 이러한 식별자들을 “후보 샘플 IDs”로 고려하였다. 그런 뒤 리드들을 표 15의 “샘플 ID” 컬럼내의 상응하는 하나 이상의 샘플 IDs이 후보 샘플 ID와 매치되는 표 15의 컬럼 “샘플 식별 부위 규칙적 발현”에 나열된 모든 규칙적 발현들에 대하여 순차적으로 확인하였다. 리드가 규칙적 발현과 매치되고, 그 매치가 범용 프라이머 규칙적 발현에 매칭하는 마지막 리드 뉴클레오티드 이후의 제1 뉴클레오티드로부터 시작되었다면, 후보 샘플 IDs로부터 가장 오른쪽(right-most) 식별자를 리드의 샘플 ID로 할당하였다. 그 반대로 가장 오른쪽 식별자를 후보 샘플 IDs로부터 제거하였고 공정을 후보 샘플 IDs의 더 작은 리스트로 매치가 발견될 때까지 또는 표 15의 규칙적 발현들의 리스트내에서 규칙적 발현에 매칭이 발견되지 않는 다면 그 때까지 반복하고 그런 뒤 마지막 후보 샘플 ID(이는 후보 샘플 IDs의 오리지널 리스트 내의 가장 왼쪽이다)를 리드에 대한 샘플 ID로 할당하였다.
플레이트 ID 및 샘플 ID 할당 공정중에 폐기되었던 리드들은 서열 목록 내에 포함되지 않았다.
서열의 어셈블리
웰과 연관된 샘플 ID로 할당된 모든 서열 리드들을 조립하여 공통 서열들을 생산하였다. 이러한 공통서열들은 분류된 세포 내에서 발현된 헤비 및 라이트 체인 mRNA 서열들과 상응한다.
서열들을 뉴블러 2.5(Newbler 2.5)(런 1 및 2)로 조립하였고 다른 서열들에 대해서는 뉴블러 버전 2.6(Newbler version 2.6) 및/또는 미라 버전 3.4.0(Mira version 3.4.0)으로 하였다.
“454” 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들, “믹스(mixed)”의 체인 타입 필드, “1” 또는 “2”의 런 ID 및 “nb”의 서열 타입은 뉴블러를 사용하는 어셈블리가 원인인 콘티그들이다. 이러한 서열들을 조립하기 위해, 454 시퀀싱으로부터 얻은 것으로서 서열들 및 각 뉴클레오티드에 대한 퀄리티 점수들을 둘 다 함유하는 sff 출력(output) 파일들을 파이썬(Python) 내에서 바이오파이썬(Biopython) 패키지를 사용하여 읽었으며 상기에 기재되어 있는 그들의 합성 바코드들(샘플-ID+ 플레이트-ID)에 따라서 서열들을 세분화하였고 독립한 sff 파일들 내에서 출력하였다. 그런 뒤 이러한 파일들을 뉴블러에 의해 이해되는 파일 헤더들을 갖는 sff 파일들 내의 sfffile에 의해(GS FLX 데이터 분석 소프트웨어에 의해 제공된) 재파싱 하였고 서열 어셈블러(sequence assembler)는 GS FLX 데이터 분석 소프트웨어 수트(software suite)를 제공하고 "-포스(-force)", "-cdna" 및 "-urt" 옵션들을 사용한다. 그런 뒤 뉴블러는 공유된 합성 바코드들로 포워드 리드들을 조립했다. 리버스 리드들이 오직 3’ 플레이트-ID만을 가지므로, 서열 어셈블리가 서로 다른 세포들로부터 얻은 서열들의 포워드 및 리버스 리드들 사이에서 발생할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 잠재적인 문제를 피하기 위해, 조립된 포워드 및 비조립된 리버스 리드들 모두의 헤비- 및 라이트-체인 V(D)J 유용성은 먼저 HighV-QUEST를 사용하여 식별될 수 있다(http://imgt.cines.fr/HighV-QUEST/index.action). 그런 뒤 서열들은 뉴블러로 다시 조립되는 것 이전에 하나의 조립된 포워드 리드 및 동일한 V(D)J 유용성을 공유하는 리버스 리드들을 사용하여 그들의 V(D)J 유용성에 따라서 더 그룹핑 될 수 있다. 이는 모든 조립된 포워드 리드들에 대해 반복될 수 있다. 서열 어셈블리는 또한 뉴클레오 불일치를 용납하지 않는 것으로 수행될 수 있고, 그리하여 동일한 V(D)J 유용성을 공유하는 서로 다른 ptvhemf로부터 얻은 포워드 및 리버스 리드들의 어셈블리를 예방한다. 이처럼, 서로 다른 세포로부터 얻은 매우 유사한 서열들 사이에 리버스 리드들의 부적절한 서열 어셈블리는 크게 피해질 수 있다.
“454” 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들, “헤비” 또는 “라이트”의 체인 타입 필드, “3” 또는 “4”의 런 ID 및 “nb”의 서열 타입은 454 리드들의 어셈블리들이 원인인 콘티그들이며, 이 명령 라인(command line)으로 뉴블러를 수행하였다: 런어셈블리-cdna-o-아웃풋 seqs. fastaq 상기 eqs.fastq은 FastQ 포맷 내에서 단일 웰들의 다듬어진(trimmed)리드들을 함유한다(runAssembly -cdna -o output seqs.fastaq where seqs.fastq contained a single well’s trimmed reads in FastQ format).
뉴블러가 정확히 하나의 헤비 체인 콘티그 또는 정확히 하나의 라이트 체인 콘티그를 생성못하는 런 ID 3 또는 런 ID 4리드들을 위한 모든 웰들을 미라(mira)로 조립하는 것에 의해 재분석하였다. “454” 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들, “헤비” 또는 “라이트”의 체인 타입 필드, “3” 또는 “4”의 런 ID 및 “멀팀50(multim50)” 또는 “제롬50(zerom50)”의 서열 타입은 이러한 어셈블리들이 원인인 콘티그들이고, 이 명령 라인으로 미라를 수행하였다: mira --project=seqs --job=denovo,est,accurate,454 454_SETTINGS -ED:ace=yes -AL:egp=no -CL:pvlc=yes --fastq -notraceinfo
이름이 seqs_in.454.fastq인 파일은 FastQ 포맷 내의 단일 세포의 다듬어진 리드들을 함유한다.
상기 어셈블리 명령을 사용하여 뉴블러와 미라 어디에서도 콘티그들을 생성하지 않는 런 ID 3 또는 런 ID 4 리드들로부터 얻어진 웰들을 위해, 서로 다른 뉴블러 명령을 수행하였다. “454” 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들, “헤비” 또는 “라이트”의 체인 타입 필드, “3” 또는 “4”의 런 ID 및 “urt”의 서열 타입은 이러한 어셈블리들이 원인인 콘티그들이고, 이 명령 라인으로 미라를 수행하였다: 런어셈블리(runAssembly) -cdna -ud -urt -o output seqs.fastaq 상기 seqs.fastq 는 FastQ 포맷 내에 단일 웰들의 다듬어진(trimmed)리드들을 함유한다(contained a single well’s trimmed reads in FastQ format).
“팩바이오(PacBio)”의 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들, “헤비”의 체인 타입 및 “pb”의 서열 타입은 팩바이오 플랫폼으로부터 얻은 리드들의 어셈블리들이 원인인 콘티그들이고, 이 명령 라인으로 미라를 수행하였다: mira --project=seqs --job=denovo,est,accurate,454 454_SETTINGS -ED:ace=yes -AL:egp=no -CL:pvlc=yes --fastq -notraceinfo
이름이 seqs_in.454.fastq인 파일은 FastQ 포맷 내의 단일 세포의 다듬어진 리드들을 함유한다.
아미노산 서열
“454”의 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들 및 “nb-aa”, “urt-aa”, “multim50-aa” 또는“zerom50-aa”의 서열 타입은 “서열의 어셈블리”에 기재된 454의 어셈블리들의 뉴클레오티드 서열들을 번역하는 것에 의해 결정된 아미노산 서열들이다.
“팩바이오”의 플랫폼 필드를 가지는 목록 내의 서열들 및 “pb-aa”의 서열 타입은 “서열의 어셈블리”에 기재된 퍼시픽 바이오사이언스즈의 어셈블리의 뉴클레오티드 서열들을 번역하는 것에 의해 결정된 아미노산 서열들이다.
“생어-aa(sanger-aa)”의 서열 타입을 가지는 목록 내의 서열들은 생어 시퀀싱에 의해 결정되는 리드들을 직접적으로 번역하는 것에 의해 결정되는 아미노산 서열들이다.
다른 시퀀싱 데이터 분석 옵션
상기에 기재된 데이터 분석의 작업흐름(workflow)은 각 세포의 헤비- 및 라이트-체인을 더 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이 정보는 우리의 “선택 스크리닝” 접근법(“발현된 인간 항체들의 스크리닝”을 인용)을 위해서는 절대적으로 필요한 것은 아니다. 작동하는 선택 스크린을 위해, 우리는 먼저 클론패밀리들 내의 항체 서열들을 그들의 헤비 체인 V(D)J 유용성 및 라이트 체인 VJ 유용성을 기반으로 하여 클러스터 페어링하였다. 그러므로, 우리는 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인들의 전체 서열을 요구하지 않으며, V(D)J 유용성을 결정하는데 충분한 서열 정보를 사용할 수 있다. 그러므로, 우리는 시퀀싱 오류들을 견딜 수 있고 454 또는 다른 시퀀싱 기술에 의해 생성되는 낮은-퀄리티 리드들을 사용할 수 있다. 모든 서열들이 조립되기 이전에 그들의 합성 바코드에 따라 먼저 그룹핑될 수 있기 때문에 포워드 리드의 서열 어셈블리는 일반적으로 이슈가 아니다. 각 합성 바코드가 하나의 샘플/세포로부터 오기 때문에, 동일한 합성 바코드를 가지는 각 면역글로불린 체인에 대한 오직 하나의 ‘정확한(correct)’서열만이 존재한다. 모든 시퀀싱 오류들이 동일한 염기들 상에서 발생할 것 같지 않기 때문에 서로 다른 가닥들 내의 시퀀싱 오류들은 그런 뒤 평균으로 내어 질 수 있으며, 이는 공통 염기 서열을 취하는 것이 가장 정확한 서열을 제공 할 것이라는 의미이다. 애매한 경우에, 높은 프레드(Phred) 퀄리티 점수들을 가지는 염기들은 일반적으로 대신에 선택될 것이다. 454가 3’말단으로부터 얻은 서열 리드들을 오직 더 높은 퀄리티 리드들만이 남을 때까지 다듬(trims)으므로, 이는 매우 짧은 리드들을 야기할 수 있다. 우리의 방법으로, 우리는 낮은-퀄리티 리드들을 견딜 수 있고 그리하여 454(400-500bp)에 의해 생성된 훨씬 긴 리드들을 사용한다. 이러한 더 긴 리드들로, 우리는 포워드 리드와 리버스 리드의 어셈블리를 요구하지 않으면서 V(D)J 유용성을 식별할 수 있고, 그리하여 어떤 측면에서, 3’플레이트-ID 비-본질적인(non-essential) 것을 만든다. 또한, 454 시퀀싱의 최신의 세대는 평균 746bp까지 시퀀싱할 수 있고 800bp의 모드로 시퀀싱 할 수있다. 따라서, 단지 포워드 리드들로부터 시퀀싱을 하는 것은 전체 헤비- 및 라이트-체인 면역글로불린 앰프리콘들을 덮기에 충분할 수 있고, 또한 어떤 측면에서, 포워드를 리버스 리드들로 조립하는 것은 더 이상 요구되지 않기 때문에 3’플레이트-ID 비-본질적인 것을 만든다.
항체들의 선택 및 클로닝
어셈블리 이후에, 헤비 및 라이트 체인 서열들을 분석하였고 특징화를 위한 항체들을 선택한다. 항체들을 예측되는 V(D)J 생식 유용성 및 항체 서열들로부터 유래된 진화계통수의 검토(inspection)에 근거하여 선택하였다. 선택된 항체들을 클로닝, 발현, 및 서로 다른 검정법들로 특성화 하였다.
V(D)J 할당
런들 1 및 2로부터 얻은 헤비 및 라이트 체인 서열들을 항체 체인 서열을 생식 서열들의 알려진 대립 인자의 데이터베이스와 비교하여 항체에 사용된 생식 대립 인자, 어떻게 생식 서열들이 재조합되었는지, 생식에 관한 항체들 내의 돌연변이체를 예측하는 V-QUEST(Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)) 소프트웨어로 분석하였다. 표 18은 추가적인 특성화를 위해 선택되었던 항체들에 대한 V-QUEST V(D)J 할당의 결과를 나타내며; 동일한 데이터를 런 1 및 런 2로부터도 얻어진 모든 다른 서열 어셈블리들을 위해 수득하였다. 런 3 및 런 4 어셈블리들로부터 얻은 어떤 서열들을 V-QUEST와 유사한 SoDA(Volpe, Cowell and Kepler, Bioinformatics (2006) 22 (4): 438-444) 소프트웨어로 분석하였다.
환자의 유전체가 시퀀싱되었다면, 유전체 서열 데이터는 VDJ 할당 분석을 위한 생식 서열들로서 사용될 수 있으며, 또한 환자의 항체 서열들 내에서 확실하게 체세포 초돌연변이를 식별하는 능력이 향상된다.
진화계통수 및 클론 패밀리들
런들 1 및 2로부터 얻어진 헤비 체인들의 성숙한 폴리펩티드들과 상응하는 뉴클레오티드 서열들을 그들이 유래되었던 곳으로부터 얻은 환자와 상응하는 세트들 안으로 분리하였다. 이러한 개별적인 세트들로부터 소프트웨어 clustalx2(Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007) Bioinformatics, 23, 2947-2948)를 모든 파라미터들에 대해 디폴트 세팅들을 사용하여 정렬 및 나무를 생성하는데 사용하였다.
환자들로부터 얻은 서열들의 진화계통수는 또한 개별적인 클론 패밀리들로부터 얻은 서열들의 세트로부터 구성될 수 있다. 패밀리에 대한 추정 선조(putative progenitor) 항체 헤비 및 라이트 체인 서열들은 추론될 수 있고, 그들이 이미 세트 내에 없다면 서열들의 세트로 첨가될 수 있다. 세트에 대한 진화계통수는 예를 들어, 맥시멈 파르시모니(Maximum Parsimony), 맥시멈 라이클리후드(Maximum Likelihood), 또는 모든 적절한 알고리즘을을 사용하여 구성될 수 있고, 나무는 선조 항체의 서열들에 뿌리를 둘 수 있다. 나무는 헤비 체인들 단독으로, 또는 라이트 체인들 단독으로, 또는 바람직하게는 개별적인 헤비 및 라이트 체인들을 동시에 근거로 하여 구성하는 것에 의하는 것을 근거로하여 구성될 수 있으며, 그리 하여 나무는 헤비 및 라이트 체인들의 공동-진화를 나타낸다.
항체 선택
각 환자를 위해, V-QUEST 결과들의 표를 런 1 또는 런 2 서열들로부터 만든 나무들과 함께 검토 하였다(TreeViewX에서 검토된: http://darwin.zoology.gla.a.c.uk/~rpage/treeviewx). 대표적인 서열들을 V-QUEST 데이터를 근거로 하여 VDJ 존재의 서로다른 패밀리들을 덮는데 선택될 수 있고, 나무상의 상응하는 서열들을 검토하여 클레이드의 대표적인것으로 나타나는 서열들을 나무 상에서 선택한다. 선택된 서열들 중에 어떤 것들은 많은 멤버를 가지는 패밀리들로부터 왔으나, 어떤 것들은 또한 적은 멤버 또는 하나의 멤버를 가지는 패밀리들로부터 선택되었다. 선택된 서열들은 표 18에 기재되어있다. 표 18의 각 항체를 위해, 컬럼 “항체”는 서열 목록의 서열과 연관된 이름의 콘티그 ID 필드 내의 “-“ 다음에 오는 문자와 동일하다.
클로닝된 라이트 및 헤비 체인 면역글로불린 페어들의 클로닝 및 발현
벡터
한 시스템은 인비트로젠 벡터들(Invitrogen vectors) pcDNA3.3 및 pOptivec 으로부터 변형된 네오마이신 및 디하이드로폴레이트 레덕타아제(dihydrofolate reductase, DHFR) 선택가능한 벡터 시스템이다. 대안적인 시스템은 증폭가능하고, 선택가능한 마커가 글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)인 론자 GS 시스템(Lonza GS system)이다(아래를 인용). 면역글로불린 카파 라이트 체인, 람다 라이트 체인, 및 감마 헤비 체인을 인코딩하는 서열들은 벡터들 내로 삽입된다. 코작(Kozak) 공통 및 리더(leader)서열들은 이미 클론들 내에 존재하고, 따라서 벡터 내로 조작될 필요가 없다. 불변 부위들은 5’-플랭킹(5’-flanking) 제한 자리들 및 하나 이상의 다른 내부적 제한 자리들을 함유하도록 합성된다. 다양한 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인들의 클로닝을 촉진하기 위해, 삽입체(inserts)는 클론 그 자신이 제한 자리를 함유하지 않을 것이고 그러므로 내부적으로 절단되지 않는다는 가능성을 증가시키는 다중 제한 자리들로 조작된다. 삽입체는 삽입 부위의 5’말단 및 불변 부위들 내에서 조작된 두 개의 서로 다른 제한 자리들에두 개의 서로 다른 8-커터 제한 자리를 갖는다. 5’제한 자리들은 라이트 체인들 둘 다에 대하여 FseI 및 PacI이고 감마 헤비 체인에 대하여 AscI 및 AsiSI이다. 불변 부위 내에서 그들스스로 조작된 제한 자리들은 라이트 체인들 둘 다에 대해 NheI 및 XhoI이고, 감마 헤비 체인에 대해 EcoRI 및 SacII 이다. 제한 자리들을 함유하는 불변 부위 삽입체들의 서열에 대해 표 16을 인용한다. 1st PCR 반응으로부터 얻은 헤비 또는 라이트 체인 클론들은 그런 뒤 PCR의 2nd 라운드에 클론들 내에 통합된 5’플랭킹 제한 자리들을 가지는 클로닝 프라이머와 함께 적용된다. 적절한 제한 효소들은 발현 벡터들 및 클론들을 절단하기 위해 사용되고, 이들은 이제 상보적인 말단들을 가지고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 함께 라이게이션된다. 인비트로젠 및 론자 GS 벡터 시스템들 모두 증폭가능한 선택 막커를 함유한다. 이 마커는 인비트로젠 시스템에서는 DHFR이고 론자 GS 시스템에서는 GS이다. 적절한 선택자(selector)(DHFR에 대해 메토트렉사트 및 글루코스 합성효소(GS)에 대해 L-메티오닌 설폭시민)로부터 온 선택 압력(selection pressure) 하에서, 선택 마커에 링크된 유전자들은 그것과 함께 증폭된다. 면역글로불린 유전자들의 더 많은 카피들로, 보다 큰 항체의 분비가 존재한다. 이는 중화 항체들에 대한 차후의 생체 내 스크리닝을 위해 많은 양의 항체가 정제될 필요가 있을 때 유용하다.
클로닝 및 발현
가령 가장 높은-친화성 형질아세포가 종자 중심 성숙중에 선택된다면, 우리는 가장 높은-친화성 클론 패밀리가 또한 가장 높은 숫자의 클론들을 가질 것으로 예상한다. 또한, 각 클론 패밀리 내의 가장 높은-친화성 클론은 또한 패밀리 내에서 가장 빈번한(frequent) 클론일 것이다. 이러한 가정에 근거하여, 우리는 어떤 측면에서, 각 환자 샘플로부터 얻은 5개의 가장 큰 클론 패밀리들로부터 가장 높은-빈도인 클론을 발현하는 것을 선택한다. 클론들을 1st PCR cDNA로부터 증폭하고, 모든 샘플들은 동일한 플레이트로부터 얻은 것이고, 각각은 단일 세포를 포함하고, 함께 모아졌다. 포워드 프라이머는 샘플-ID를 함유하며 그리하여 그 특정한 샘플-ID로 오직 DNA 바코드된 만을 증폭한다. 샘플-IDs가 서로간의 뉴클레오티드 차이들을 함유하기 때문에 이는 매우 특이적이다. 어떤 샘플-IDs는 동일한 클로닝 포워드 프라이머들을 가질 수 있고 이러한 프라이머들에 의해 증폭된 클론들은 차후에 박테리아 콜로니 선택에 의하는 것과 똑같이 서로로부터 구별되어야 한다. 포워드 및 리버스 프라이머들 모두는 클론을 통합하게 할 수 있는(코딩 프레임 정렬로) 플랭킹 제한 자리들을 (제1 및 제2 제한 자리 부위들) 벡터 내에 함유하고 그 벡터는 이미 카파, 람다, 또는 감마 불변 부위를 포함한다. 클로닝 프라이머 서열들에 대해 표 4 및 5를 인용한다. 라이트 체인들은 변형된 pcDNA3.3내에서 클로닝되고, 헤비 체인들은 변형된 pOptivec내에서 클로닝되고, 또는 두 체인들 모두는 론자 GS 듀얼-발현 벡터(Lonza GS dual-expression vector)내에서 클로닝 된다. 포유류 세포들은 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 인코딩하는 독립된 발현 벡터들에 의해 이중으로 트렌스펙션(transfected) 되거나 또는 헤비 및 라이트 체인 유전자들 모두를 함유하는 듀얼-발현 벡터에 의해 단일로 트렌스펙션된다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 수집하고 목적하는 성질을 위해 스크리닝한다.
어떤 경우에서, Ig 유전자들의 가변 부위들은 DNA 합성에 의해 클로닝 될 수 있고, 제한 효소들 및 표준 분자 생물학(standard molecular biology)을 사용하여 합성된 DNA를 적절한 불변 부위를 함유하는 벡터 내로 통합한다. 합성 중에, 돌연변이 유발을 목적으로 하지 않는 한 아미노산 서열이 변하지만 않는다면 정확한 뉴클레오티드 서열이 뒤를 따를 필요는 없다. 이는 더 높은 발현 수준들을 야기할 수 있는 코돈 최적화를 가능하게 한다. 이는 또한 클로닝의 목적을 위해서 제한 자리들에 첨가하는 것을 가능하게 한다. 5’UTR과 같은 비-번역된 서열들 및 바코드 서열들은 합성 될 필요없으며 리더 서열들은 또한 더 높은 발현 수준들로 알려진 신호 펩티드 서열들로 교환될 수 있다. 이러한 것은 고처리 리드들과는 매우 다를 수 있으나 발현되었을 때 동일한 아미노산 서열화된 것을 제공하는 Ig 뉴클레오티드 서열을 야기한다.
어떤 경우에서, 역전사 중에 첨가된 샘플-ID 바코드 어댑터는 이미 제한 효소 자리를 통합할 수 있다. 이는 PCR 앰프리콘 풀(pool)내에서 샘플-ID 바코드의 제한 자리 3’을 가지는 어댑터를 야기한다. 클로닝 프라이머들로 클로닝 중에, 목적하는 앰프리콘들은 플레이트-특이적 앰프리콘 풀로부터 샘플-ID 바코드 서열들 및 체인 특이적 3’프라이머들(카파, 람다, 및 감마 체인에 대해)에 상보적인 5’프라이머들을 사용하여 증폭된다. 3’프라이머들은 3’제한자리들에 첨가 될 것이다. 5’프라이머가 이미 웰-ID 바코드의 제한 자리 3’을 함유하고 있으므로 5’프라이머들은 제한 자리들에 첨가 될 필요가 없다. 이 증폭에 뒤이어, 제한 효소들은 불변 부위 삽입을 함유하는 벡터 내의 라이게이션을 위해 앰프리콘을 절단하는데 사용된다. 제한 효소의 분해 중에, 바코드들 및 범용 서열들과 같은 Ig 유전자 서열들의 5’말단에 첨가된 서열들은 그들이 5’제한 자리의 5’에 있을 때 절단된다.
클로닝 및 발현을 위한 대안적 방법
다른 측면에서, Ig 유전자들의 가변 부위들은 DNA 합성에 의해서 클로닝 될 수 있고, 합성된 DNA를 적절한 불변 부위를 함유하는 벡터 내로 제한 효소들 및 표준 분자 생물학을 사용하여 통합한다. 합성 중에, 돌연변이 유발을 목적으로 하지 않는 한 아미노산 서열이 변하지만 않는다면 정확한 뉴클레오티드 서열이 뒤를 따를 필요는 없다. 이는 더 높은 발현 수준들을 야기할 수 있는 코돈 최적화를 가능하게 한다. 이는 또한 클로닝의 목적을 위해서 제한 자리들에 첨가하는 것을 가능하게 한다. 5’UTR과 같은 비-번역된 서열들 및 바코드 서열들은 합성 될 필요없으며 리더 서열들은 또한 더 높은 발현 수준들로 알려진 신호 펩티드 서열들로 교환될 수 있다. 이러한 것은 고처리 리드들과는 매우 다를 수 있으나 발현되었을 때 동일한 아미노산 서열화된 것을 제공하는 Ig 뉴클레오티드 서열을 야기한다.
다른 측면에서, 역전사 중에 첨가된 웰-ID 바코드 어댑터는 이미 제한 효소 자리를 통합할 수 있다. 이는 PCR 앰프리콘 풀 내에서 웰-ID 바코드의 제한 자리 3’을 가지는 어댑터를 야기한다. 클로닝 프라이머들로 클로닝 중에, 목적하는 앰프리콘들은 플레이트-특이적 앰프리콘 풀로부터 웰-ID 바코드 서열들 및 체인 특이적 3’프라이머들(카파, 람다, 및 감마 체인에 대해)에 상보적인 5’프라이머들을 사용하여 증폭된다. 3’프라이머들은 3’제한자리들에 첨가 될 것이다. 5’프라이머가 이미 웰-ID 바코드의 제한 자리 3’을 함유하고 있으므로 5’프라이머들은 제한 자리들에 첨가 될 필요가 없다. 이 증폭에 뒤이어, 제한 효소들은 불변 부위 삽입을 함유하는 벡터 내의 라이게이션을 위해 앰프리콘을 절단하는데 사용된다. 제한 효소의 분해 중에, 바코드들 및 범용 서열들과 같은 Ig 유전자 서열들의 5’말단에 첨가된 서열들은 그들이 5’제한 자리의 5’에 있을 때 절단된다.
론자 벡터(Lonza vectors) 내에서 헤비 및 라이트 체인들의 클로닝
면역글로불린 불변 부위를 클로닝
론자 벡터들을 론자와 스탠포드 대학의 아카데믹 라이센싱 계약(Stanford University’s academic licensing agreement)을 통해 수득하였다. 카파 및 람다 라이트 체인들을 벡터 pEE12.4 내에 삽입하였고 감마 헤비 체인을 벡터 pEE6.4내에 삽입하였다. 헤비 및 라이트 체인 서열들을 두 단계들에서 클로닝하였다: 첫째, 불변 부위들을 클로닝 그 다음의 면역 글로불린 체인들(리더 및 V(D)J서열들)의 5’말단 내에 클로닝하였다. 불변 부위들 삽입체를 인테그레이티드 디엔에이 테크놀러지스(Intergrated DNA Technologies, IDT)에 의해 유전자-합성(gene-synthesized)하였고, 유전자 최적화 및 제한 자리들의 통합을 위해 적절한 침묵 돌연변이에 함유하였다. 삽입체들을 IDT로부터 그들의 등록상표가 붙은(proprietary) pIDTSmart vector에서 수득하였다. 삽입체 서열들은 표 17에 있다. IgG1을 감마 헤비 체인 불변 부위로서 사용하였다. 사용된 대립인자들은 카파, 람다 및 감마 체인들에 대해서 각각 Km3, Mcg-Ke-Oz- 및 G1m3이었다. 불변 부위들을 론자 벡터들 내에 통합하기 위해, 론자 벡터들 및 pIDTSmart-불변 부위 삽입체를 모두 개별적으로 컴피턴트(competent) dam-dcm- E. coli로 형질전환 하였고 플라스미드들을 제조자의 지시에 따라서 Qiagen 미니프렙 키트(miniprep kit)를 사용하여 정제하였다. 그런 뒤 플라스미드들을 HindIII 및 BclI를 사용하여 37oC에서 1시간 동안 분해하였고 1.2% 아가로오스 겔 상에서 150V에서 1시간 동안 러닝하였다. 분해된 론자 벡터들 및 불변 부위 삽입체들을 겔 정제하고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 10분동안 RT에서 3:1 insert:vector 의 비율로 라이게이션하였다(Km3 또는 Mcg-Ke-Oz- 라이트 체인들을 갖는 pEE12.4 및 G1m3 감마1 헤비 체인을 갖는 pEE6.4). T4 DNA 리가아제를 그런 뒤 70OC에서 8분동안 불활성화 하였고 5ul의 라이게이션 믹스를 히트 쇼크 컴피턴트 TOP10 세포들로 표준 분자 생물학 기술들을 사용하여 형질전환 하였다. 콜로니들을 골라냈고 삽입을 생어 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
면역글로불린 가변 부위를클로닝
그 다음, 람다 또는 카파 라이트 체인을 함유하는 pEE12.4를 AscI 및 XmaI를 사용하여 5시간동안 37oC에서 분해하였고 겔 정제하였다. 감마 1 헤비 체인을 함유하는 pEE6.4를 AscI 및 AgeI를 사용하여 5시간 동안 37OC에서 분해하였고 겔 정제하였다. 선택된 앰프리콘들을 1st PCR의 특이적 플레이트-ID 100x 희석으로부터 얻은 웰-ID 특이적 포워드 프라이머들 및 불변 부위-특이적 리버스 프라이머들(표 4 및 5)을 사용하여 선택적으로 증폭하였다. 포워드 프라이머들은 프라이머의 5’말단에 제한 자리 AscI를 가졌고 리버스 프라이머들은 각각 라이트 및 헤비 체인 프라이머들 불변 부위 프라이머들에 대한 XmaI 또는 AgeI 제한 자리를 함유했다. PCR 사이클링을 초기 변성을 98oC에서 30초 동안, 및 35 내지 45 사이클들 98oC에서 10초동안, 68oC에서 15초동안 및 72oC에서 20초동안 사용하여 수행하였다. 최종 확장은 72oC에서 5 분동안 되었고 4oC 무기한으로 보유되었다. PCR 생산물들을 제조자의 지시에 따라 밀리포어(Millipore)로부터 얻은 PCRu96 한외여과 플레이트들을 사용하여 정제하였다. 이에 뒤이어, PCR 생산물을 라이트 체인들에 대해 AscI 및 XmaI 그리고 감마 1 헤비 체인에 대해 AscI 및 AgeI를 사용하여 3시간동안 37oC에서 이중(double) 분해하였다. 분해된 생산물들을 그런 뒤 겔긴(gelgeen)(Biotium)과 함께 2.5% 로우 멜트 아가로오스(low melt agarose)에서 러닝하였고 청색광 아래에서 시각화하였다. 밴드들을 포함하는 겔 슬라이스들을 적절한 크기에서 잘라내었다. 겔에서 라이게이션을 겔 슬라이스를 65oC에서 녹이는 것에 의해 수행하였고 적절한 소화된 것(appropriate digested) 및 불변 부위 삽입체를 함유하는 앤트아티카 포스파타아제 (NEB)-처리 론자 벡터들(Antarctic phosphatase (NEB)-treated Lonza vectors)을 첨가하고, T4 DNA 리가아제와 함께 1-3시간동안 RT에서 배양한다. 히트-쇼크 컴피턴트 박테리아(Heat-shock competent bacteria)를 그런 뒤 형질전환 하였고 암피실린 아가 상에 플레이팅 하였다. 구조체당 6개 클론들을 골랐으며 2xLB(2x 농축된 루리아-버타니 브로스(Luria-Bertani broth))에서 생장시켰다. 밀리포어의 멀티스크린 96-웰 필터 플레이트(Millipore’s Multiscreen 96-well filter plates)를 사용하여 제조자의 지시에 따라(www.millipore.com/techpublications/tecg1/tn004) 미니프렙을 수행하였고 플라스미드 DNA를 수득했다. 콜로니 PCR을 95oC에서 5분동안 초기 변성, 및 95oC에서 1분 동안 40 사이클, 50OC에서 2분 동안, 72oC에서 1분동안, 및 최종 확장을 72oC에서 5분동안 그리고 4OC에서 무기한으로 보유하는 것을 사용하여 수행하였다. 적절한 삽입체와 함께 클론들을 생어 시퀀싱을 위해 세큐테크(Sequetech, Mountain View, CA, USA)로 보냈다. 클론 VDJ 식별을 IMGT HIGHV-Quest를 사용하여 행했고 정확한 클론들을 박테리아성 스톡(bacterial stock)(-80oC에서 15% 글리세롤과 함께 저장) 및 플라스미드들 모두로서 보관하였다.
293T내의 단일클론 항체들의 발현
페어링된 pEE12.4-라이트체인 및 pEE6.4-헤비체인 구조체들의 일시적인 이중 트렌스펙션을 제조자의 지시에 따라서 리포렉타민 2000을 사용하여 행했다. 트렌스펙션들은 48-웰, 24-웰, 6-웰, 60mm 및 100mm 디쉬들(dishes)에서 수행되어 왔다. 간략하게, 293T세포들을 DEME+10% 극저(ultralow) IgG FBS(Invitrogen) 내에서 배양하였고 분비된 인간 IgG와 하류 프로틴 A 정제 단계에서 경쟁하는 것으로부터 보바인(bovine) IgG를 예방한다. 새로운 부분 표본 N2를 녹이고 사용하기 이전에 293T 세포들을 20 패시지(passages)동안 배양하였다. 48-웰 플레이트 트렌스펙션을 위해, 각 웰을 8x104 세포들로 그 전날 시딩하였고, 그 다음날까지 컨플루언시가 ~90%될 때까지 생장하게 한다. 50ng의 각 헤비 및 라이트 체인 구조체들을 옵티멤(Optimem) 배지내에서 50ul의 최종 부피로 배양하였고, 리포펙타민 2000을 또한 50ul의 옵티멤 배지와 함께 독립적으로 배양하였다. 두 배양들 모두를 5-25분으로 하였다. 리포펙타민 2000 및 구조체들을 그런 뒤 조심스러운 피펫팅에 의해 혼합하였고 293T 세포들에 첨가하기 이전에 20분 동안 배양하였고 조심스럽게 혼합하였다. 배지들을 그 다음날 교체하였고 배양 상층액들을 2주 동안 하루 걸러 수집하였다(예를 들어, 월요일, 수요일, 및 금요일). 다른 크기들의 트렌스펙션을 위해, 하기 양의 구조체 및 리포펙타민 2000을 사용하였다: 24-웰 플레이트 트렌스펙션에 대해, 100ng의 각 구조체를 1.25ul의 리포펙타민 2000과 함께 사용하였다. 60mm 디쉬들에 대해, 625ng의 각 구조체를 12.5ul 의 리포펙타민 2000과 함께 사용하였다. 100mm 디쉬 트렌스펙션에 대해, 3ug의 각 구조체를 37.5ul의 리포펙타민 2000과 함께 사용하였다.
항-인간 IgG ELISA
어떤 경우에서, 인간 IgG ELISA를 샘플 상에서 수행하고 배양상층액 내의 발현된 IgG의 양을 수량화하고, 배양상층액을 항체의 양을 표준화한 후에 하류 적용들에서 직접적으로 사용하였다. 항-인간 IgG ELISA 수량화(quantitation) 키트를 베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories)에서 구입하였고 제작자의 지시에 따라 수행하였다. 간단하게, 100ul의 캡쳐 항체를 Nunc Maxisorp 플레이트들 상에 코팅하였고 하룻밤동안 4oC에 두었고 PBST(0.05% Tween20을 갖는 PBS)로 5번(5x) 세척하였다. 웰들을 PBS내의 1% BSA로 한시간 동안 RT에서 블록하였고, 그런 뒤 PBST로 5번(5x) 세척하였다. 그런 뒤 웰들을 키트 또는 희석된 배양상층액 으로부터 얻은 적절한 표준 희석액으로 1시간 동안 RT에서 배양하였고, 그런 뒤 PBST로 5번(5x) 세척하였다. 100ul의 희석된 HRP 탐지 항체를 각 웰에 첨가하였고 RT에서 1시간 동안 배양하였고 그런 뒤 PBST로 5번(5x) 세척하였다. 50ul의 TMB 기질 용액을 첨가하고 반응을 50ul의 종결 용액으로 종결시켰다. 흡광도를 SpectraMax M5 분광광도계(spectrophotometer) 상에서 450nm에서 읽었고 표준 곡선을 4-파라미터 곡선으로 생성하였다. 항체들을 4oC에서 0.1% 소디움 아지드(sodium azide)를 보존제로서 갖는 PBS내에서 보관하였다.
발현된 단일클론 항체들의 단백질 A-IgG 정제
다른 경우에서, 항체들을 먼저 배양상층액으로부터 정제하였고 사용하기 전에 BCA를 사용하여 수량화하였다. 간단하게, 배양상층액들을 2주동안 1주에 3번(3x) 50ml 튜브들로 수집하였고 4OC에서 첨가제로서 0.1% 소디움 아지드와 함께 단백질 A-IgG 정제까지 보관하였다. 배양상층액들을 스핀다운 하였고 모든 세포성 응집체(cellular aggregates)들을 제거하기 위해 디켄팅(decanted)하였다. 1M pH 9.0 트리스(Tris)를 배양상층액에 첨가하였고 pH가 7.5-8.0인지 pH 인디케이터 스트립(indicator strips)들에 의해 결정되는 것으로서 보장하였다. 단백질 A 플러스 아가로오스 비드들(Pierce)을 400ul의 50% 슬러리를 배양상층액에 첨가하기이전에 PBS로 2번(2x) 세척하였고 4oC에서 하룻밤동안 로테이터(rotator) 상에서 배양하였고 비드들의 고른게 믹싱되는 것을 보장하였다. 비드들을 배양상층액을 1000g에서 5분동안 스피닝(spinning)하고 5ml 중력 흐름 컬럼들 내의 튜브들의 바닥으로부터 비드들을 피펫팅하여 꺼내는 것에 의해 회수하였다. 낮은 pH 용리 버퍼이고 Amicon-4 100kDa 컨센트레이터 컬럼(concentrator column)내에 있는 2x1.5ml의 IgG 용리 버퍼(Pierce)와 함께 용리 전에 비드들을 2ml의 PBS로 4번(4x) 세척하였다. 용리된 항체들을 즉각 400ul의 1M 트리스 pH8.0로 중화하였다(neutralized). 그런 뒤 항체들을 1000g에서 10분 동안 Amicon-4 100kDa 컨센트레이터 내에서 스피닝하는 것에 의해 농축하였꼬, 그 후에 PBS의 2mL 세척 및 0.1% 소디움 아지드와 함께 PBS의 2mL세척이 따른다. 항체 농도들을 BCA 검정에 의해 결정하였거 0.5mg/ml로 조정하였다. 단백질 A 플러스 아가로오스를 2ml의 PBS로 1번(1x), 2ml의 IgG 용리 버퍼로 3번(3x) 세척하는 것에 의해 재생하였고(regenerated) 0.1% 소디움 아지드를 갖는 3ml의 PBS로 세척하고 4oC에서 보관하였다. 컬럼들을 5번까지 재생할 수 있다.
발현된 인간 항체들의 스크리닝
항체-항원 결합의 스크린
선택된 항체들(상기 클로닝 및 발현 섹션을 인용)은 먼저 관심 항체에 결합하는 그들의 능력이 스크리닝되고, 그런 뒤 전체 클론 패밀리의 항체들은 발현되고 항원을 블록(block)하거나 중화하는 (하기 “기능적 스크린”을 인용)그들의 능력이 스크리닝된다. 관심 항체들을 함유하는 상층액에서 IgG 농도는 먼저 IgG ELISA에 의해 결정되고, 그리 하여 동일한 양의 IgG가 항체-항원 결합 스크린에서 각 샘플을 위해 사용될 수 있다. 다른 경우에서, IgG를 단백질 A 아가로오스 비드들을 사용하여 상층액으로부터 정제하였고, 보바인 면역글로불린들을 표준으로서 사용하는 BCA 검정법으로 수량화 하였다. 그런 뒤 항체들을 스크리닝하는데 사용하기 전에 정제된 IgGs를 동일한 농도로 중화하였다. 항원에 결합하는 항체들을 스크린하기 위해, 우리는 간접적 ELISA를 수행하였다. 96-웰 플레이트를 하룻밤동안 관심 항원으로 코팅하고, 그런 뒤 초과 항원은 씻어낸다. 그런 뒤 관심 항체들을 함유하는 상층액들을 웰들이 세척된 후에 그 웰들에 첨가하고 4시간 동안 배양한다. 양성 대조군으로서, 항원에 특이적이고 알려진 양의 상업적으로 이용가능한 항체들(비-인간 종으로부터 얻은)을 항원을 함유하는 독립된 웰들에 첨가한다. 음성 대조군으로서, 관련없는 항원들에 특이적인 상업적으로 이용가능한 항체들을 관심 항원이 함유된 독립된 웰들에 첨가한다. 그런 뒤 HRP-접합 2차 항체를 웰들에 첨가하고, 30분 동안 배양하고, 초과분을 씻어낸다. 그런 뒤 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB)을 플레이트에 첨가하고, 양성 대조군 웰들에서 색깔이 관찰될 때까지 반응을 진행하게 한다. 그런 뒤 반응을 산으로 종결하고 흡광도를 측정한다. 흡광도 판독이 산출한 것이 음성 대조군의 그것보다 현저하게 더 높다면 특이적 웰 상층액들은 관심 항원에 결합할 수 있는 항체들을 함유한 것으로 여겨진다.
플루존 ELISA(Fluzone ELISA)
자원 봉사자들에게 플루존(Fluzone)으로부터 얻은 2010/2011 시즌 독감 백신을 투여하였고, 이는 비활성화 바이러스의 3개의 스트레인, A/California/7/2009, A/Perth/16/2009, B/Brisbane/60/2008 스트레인들로 구성된다. 결합 활성을 가지는 발현된 항체들에 대한 초기 스크린으로서 백신화된 자원봉사자들로부터 유래된 단일클론 항체들이 독감 백신 그 자체에 결합하는지 결정하기 위해 플루존 ELISAs를 수행했다. 플루존 백신을 pH9 카보네이트 버퍼에서 100x 희석하였고 Nunc Maxisorp 플레이트들 상에 RT에서 1시간동안 또는 하룻밤동안 4oC에서 코팅하였다. 그런 뒤 플레이트들을 PBST(0.05% Tween20가진 PBS)로 5번(5x) 세척하였고 1% BSA를 가진 PBS로 1시간 동안 RT에서 블록하였다. 그런 뒤 PBST로 5번(5x) 세척하기 이전에 100ul의 100ng/ml의 발현된 독감 항체들을 RT에서 1시간 동안 웰들에 첨가하였고 희석된 HRP 탐지 항체(Bethyl Labs 인간 IgG ELISA 수량화 키트로부터 얻음)를 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 플레이트들을 PBST로 5번 세척하고 50ul의 TMB 기질을 첨가한다. 50ul의 종결 용액으로 반응을 종결시키기 전에 색깔을 30분까지 발색할 수 있도록 하였다. 플레이트들을 SpectroMax M5 분광광도계 상에서 450nm 흡광도에서 읽었다. 이 검정법에서 사용된 항체들은 표 19에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
독감 항체 친화성의 표면 플라스몬 공명 결정(Surface plasmon resonance determination)
단일클론 항체들(mAbs)의 HA 분자들에 대한 결합을 25°C에서 프로테온 표면 플라스몬 공명 바이오센서(ProteOn surface plasmon resonance biosensor)(BioRad Labs)를 사용하여 분석하였다. 독감-백신화된 기증자의 형질아세포들로부터 유래된 발현된 독감 단일클론 항체들(pH 4.5 아세테이트 버퍼내의 25 nM)을 EDAC-NHS 화학법을 사용하여 테스트 흐름 세포들 내에서 800 공명 유닛(RU)의 표적 밀도에서 아민 커플링으로 GLC 센서 칩에 커플링하였다. 무반응 활성(Unreacted active) 에스테르 그룹들을 에탄올아미으로 냉각하였다. 정제된 재조합 헤마글루티닌 H3(HA(ΔTM)(H3N2/Perth/16/2009) and H1 (HA(ΔTM)(A/California/07/2009)(H1N1))을 이뮨 테크놀러지 코퍼레이션(Immune Technology Corp)(New York, NY)으로부터 구입하였고 100, 50, 25, 12.5, 6.25, nM로 희석하였으며, 블랭크 버퍼 대조군과 함께 30 μL/min의 유량에서 120 초의 접촉시간(contact time) 및 2000 초의 해리시간(dissociation time)을 갖는 것으로 주입하였다. 결합 동역학(Binding kinetics) 및 데이터 분석을 BioRad ProteON 매니저 소프르웨어로 수행하였다. 친화성 측정을 HA가 여러 반복 단위들로 구성된 것으로서 2가 분석물 알고리즘(bivalent analyte algorithm)을 사용하여 계산하였다. 맞춰진 곡선의 정확도를 각 피트(fit)의 적합도(goodness)의 χ2 값들이 피크 결합 값(peak binding value)(Rmax)의 10% 이하인지 체크하는 것에 의해 확인하였다. 이 검정에 사용된 항체들은 표 20에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
RA 항원 마이크로어레이 상에서 RA 항체 반응성
항원 마이크로어레이를 프린트(print)하기 위해, 항원들을 인삼완충식염수(phosphate buffered saline)에서 0.2mg/mL로 희석하였고 ArrayIt 나노프린트 단백질(NanoPrint Protein) LM210 시스템을 사용하여 ArrayIt 슈퍼에폭시 슬라이드(SuperEpoxy slides)에 부착하였다. 슬라이드들을 소수성 마커 팝(pap) 펜(pen)으로 마킹하였고 3% 소태아혈청 및 0.05% Tween 20 가지는 PBS내에서 하룻밤동안 4°C에서 블록하였고 조심스럽게 30rpm에서 흔들었다. 어레이들을 400uL 의 40ug/mL 단일클론 항체로 한시간 동안 4oC에서 조사하였고, 조심스럽게 30rpm에서 흔들었다. 그런 뒤 어레이들을 세척하였고 Cy3 접합된 항-인간 IgG/IgM 2차 항체가 1:2500으로 희석된 것 내에서 4분 동안 4oC에서 배양하였고, 조심스럽게 30rpm에서 흔들었다. 또다른 세척을 하고 나서, 슬라이드들을 GenePix 4300A 마이크로어레이 스캔너를 이용하여 스캔하였다. GenePix 7 소프트웨어를 사용하여 각 특성 및 배경의 형광 세기 중간값을 찾는다.
데이터를 분석하기 위해, 배경 형광 강도들을 각 형질로부터 뺐으며 각 어레이 상의 4개의 항원 특성의 중간값으로서 나타내었다. 중간 강도들을 컷-오프 값 10으로 log 변환 하였다. 이러한 값들을 클러스터 소프트웨어를 사용하여 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)에 적용하였고 서로에 대한 유사성에 근거하여 항원들을 배열한다. 관계들을 Java TreeView 소프트웨어를 사용하여 히트맵(heatmap)으로 디스플레이하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 21에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
항-히스톤 2A ELISA
직접 ELISA를 히스톤 2A에 대한 항체들의 탐지를 위해 사용하였다. 마이크로티터(Microtiter) 플레이트들(Nunc Maxisorp)을 100 μl의 재조합 H2A으로 카보네이트버퍼 내에서, 20 μg/ml의 농도로 코닝하였으며, 4°C에서 하룻밤동안 배양하였다. 1% 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 블로킹 한 후에, RA 환자-유래 항체들을 적정에서 15ug/ml 내지 250 ug/ml로 희석 버퍼(0.1% BSA 및 0.1% Tween-20를 함유하는 PBS)에서 사용하였고 플레이트에 100 μl/well에서 중복되게 첨가하였고, 2시간동안 상온에서 배양하였다. 그런 뒤 샘플들을 1시간 동안 상온에서 1:5,000 희석의 단일클론, 호세라디시 퍼옥시다아제-표지된 고트 항-인간 항체(horseradish peroxidase-labeled goat anti-human antibody)와 함께 배양하였다. 반응을 3,3′, 5, 5′-테트라메틸렌벤지딘 기질(TMB)(Sigma-Aldrich)의 15분 동안 적용에 의해 발달시켰고 50μl의 2N H2SO4의 첨가로 종료하였다. 항체의 상대적 수량화를 450nm에서 알려진 혈청반응양성 RA 혈청(seropositive RA serum)을 양성대조군으로 사용하여 광학적 밀도계측기(optical densitometry)에 의해 수행하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 22에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
항- CCP2 ELISA
항-CCP2 ELISA를 제조자의 지시에 따라 수행하였다(Eurodiagnostica, Malmo, Sweden). 간단하게, RA 환자들로부터 유래된 항체들을 대략 125ug/ml로 희석 버퍼(0.1% BSA 및 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS)에서 희석하였고, 예비-블록된 상업적 CCP2 ELISA 플레이트에 100 μl/well으로 첨가하였고, 2시간동안 상온에서 배양하였다. 그런 뒤 샘플들을 1시간 동안 상온에서 1:5,000 희석의 단일클론, 호세라디시 퍼옥시다아제-표지된 고트 항-인간 항체와 함께 배양하였다. 반응을 3,3′, 5, 5′-테트라메틸렌벤지딘 기질(TMB)(Sigma-Aldrich)의 15분 동안 적용에 의해 발달시켰고 50μl의 2N H2SO4의 첨가로 종료하였다. 대한 항체의 상대적 수량화를 벤더(vendor)로부터 제공된 것을 표준으로 사용하고 알려진 양성 RA 혈청을 사용하여 광학적 밀도계측기(optical densitometry)에 의해 수행하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 22에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
항-류머티즘성 인자 ELISA(Anti-Rheumatoid Factor ELISA)
류머티즘 인자(rheumatoid factor, RF)에 대한 항체들의 탐지를 위해, 마이크로타이터 플레이트들(Nunc Maxisorp)을 10ug/ml의 래빗 IgG로 카보네이트 버퍼 내에서 코팅하였고, 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 1% 소혈청알부민(BSA)를 함유하는 PBS에서 블로킹한 후에, RA 환자 유래 항체들을 5ug/ml 희석 버퍼(0.1% BSA 및 0.1% Tween-20를 함유하는 PBS)로 하고, 플레이트에 100 μl/well에서 중복되게 첨가하였고, 2시간 동안 상온에서 배양하였다. 그런 뒤 샘플들을 1시간 동안 상온에서 1:5,000 희석의 단일클론, 호세라디시 퍼옥시다아제-표지된 고트 항-인간 항체와 함께 배양하였다. 반응을 3,3′, 5, 5′-테트라메틸렌벤지딘 기질(TMB)(Sigma-Aldrich)의 15분 동안 적용에 의해 발달시켰고 50μl의 2N H2SO4의 첨가로 종료하였다. 대한 항체의 상대적 수량화를 450nm에서 알려진 두 개의 RF+ 대조군 혈청을 양성대조군으로 사용하여 광학적 밀도계측기(optical densitometry)에 의해 수행하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 23에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
폐암 조직 어레이 상에서 폐 샘암종 환자로부터 얻은 항체들의 면역조직화학
두 개의 서로 다른 타입의 조직 마이크로어레이 슬라이드들을 US바이오맥스(US Biomax)로부터 구입하였다. 그들은 VLC 12 및 BS0481이었다. 다양한 폐 암종(carcinomas) 조직 코어들은 슬라이드 상에 포함되고, 폐 샘암종을 포함하며, 또한 정상 폐 조직 대조군을 포함한다. RT로 식는 것을 허용하기 전에 슬라이드들을 사이트레이트 pH6.0 항원 레트리블 버퍼 내에서 95-99°C에서 40분동안 가열하였다. 슬라이드들을 0.02% Triton-X 및 0.6% H2O2로 20분동안 미리 처리하였다. 그런 뒤 100ug/ml의 F(ab) 고트-항-인간 IgG (Jackson Immunoresearch)에서 하룻밤 동안 4°C에서 더 블로킹하기 이전에 슬라이드들을 TBST(0.05% Tween20을 가지는 TBS) 내의 10% 정상 고트 혈청(normal goat serum)으로 2시간동안 블록하였다. 그런 뒤 슬라이드들을 제조자의 지시에 따라서 아비딘/비오틴 블록(Vector Laboratories)을 겪게 하였다. 그런 뒤 슬라이드들을 5 또는 10ug/ml의 발현된 폐 항체 내에서 1시간 동안 RT에서 배양하였고, 3x5분 TBST로 세척하였고, 그런 뒤 비오틴화된(biotinylated) 고트-항-인간 2차 항체와 함께 20분 동안 RT에서 배양하였다. 그런 뒤 슬라이드들을 3x5분 TBST로 세척하였고 준비된 벡타스타인(Vectastain) ABC 시약고 함께 30분 동안 RT에서 배양하였다. 그런 뒤 슬라이드들을 TBST로 3x5분 세척하였고 Vector Red (Vector Laboratories)로 염색하였고 발색 현상을 광학 현미경으로 추적하였다. 적절한 염색 시간 후에, 반응을 증류수로 세척하는 것에 의해 종료하였고 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 슬라이드들을 액상-마운트하였고 BX-51 현미경으로 사진찍었다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 24에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
폐암세포주에 대한 폐 샘암종 환자로부터 발현된 항체들의 결합의 흐름 세포측정 결정
사용된 폐암 세포주는 A549, H226, H441, H23, H1975, H1437, H2126, H1650 및 H2009이었다. HEK 293T 세포들을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 2mM EDTA를 가지며 Ca2+ 및 Mg2+는 없는 PBS에서 1시간 동안 37oC에서 세포를 배양하는 것에 의해 세포들을 분리하였다. 이는 트립신화(trypsinizing) 또는 세포를 분리하는 다른 단백질가수분해적 분해로 세포 표면 항원들을 손상시키는 것을 예방한다. 50ul 의 FACS 버퍼 내에서 서스펜딩하는 것 이전에 세포들을 한번 FACS 버퍼(2% FCS를 가지는 HBSS)로 세척하였고 10ug/ml, 3ug/ml, 1ug/ml, 0.2ug/ml의 발현된 폐 항체들과 함께 배양하였고 복용량을 적정한다. 최적의 농도는 0.2-1ug/ml의 범위인 것으로 나타난다. 그러므로, 1ug/ml, 0.5ug/ml, 0.25ug/ml의 폐 항체들을 순차적으로 사용하였다. 2x 200ul의 FACS 버퍼로 96-웰 플레이트 내에서 세척하기 이전에 폐 항체들을 30분동안 4oC에서 배양하였다. 그런 뒤 항-인간 IgG-Pe를 첨가하였고 15분동안 4oC의 암실에서 배양한다. 그런 뒤 샘플들을 2x200ul의 FACS 버퍼로 세척하고 200ul의 FACS 버퍼로 리서스펜딩하며 BD LSR II 또는 LSR Fortessa 상에서 분석하였다. 시톡스 블루(Sytox blue)를 생존/사망 염색법(live/dead staining)으로 사용하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 24에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
포도상구균 흐름 세포측정( Staph Flow Cytometry )
고정된 S. aureus 입자들(Wood strain)을 인비트로젠으로부터 수득하였다. 우드 스트레인(Wood strain)은 어떤 박테리아에 의해 최소한의 단백질 A를 발현하는 스트레인이다. 입자들을 50ul 의 FACS 버퍼내에 10x106 cells/50ul에서 서스펜션하였고, 포도상구균 개체들로부터 유래된 발현된 항체들의 10ug/ml, 5ug/ml 또는 1ug/ml의 적정과 함께 1시간 동안 4oC에서 배양하였다. 그런 뒤 항-인간 IgG-FITC 항체들과 함께 15분 동안 암실내에서 4OC에서 배양하기 이전에 고정된 포도상구균 입자들을 FACS 버퍼로 두 번 세척하였다. 그런 뒤 입자들을 1ml의 FACS 버퍼로 세척하였고 BD LSR II 또는 LSR Fortessa 상에서 분석을 위해 200ul의 FACS버퍼에서 리서스펜션하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 25에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
기능적 스크린
수용체- 리간드 상호작용에 대한 항체의 블로킹
리간드-수용체 상호작용들을 블록하는 항체의 능력에 대해 항체를 스크리닝하기 위해(예를 들어, 사이토카인-수용체 상호작용), 우리는 293T 세포들을 적절한 수용체를 인코딩하는 벡터로 트렌스펙션하였다. 이러한 293T 세포들은 또한 안정적으로 NF-κB-의존 루시퍼라아제 수용체(NF-κB-dependent luciferase reporter)에 트렌스펙션되며 그리 하여 이러한 안정적으로 트렌스펙션된 293T 세포들은 NF-κB가 활성화되었을 때 루시퍼라아제를 발현한다. 그런 뒤 우리는 트렌스펙션된 293T 세포들을 적절한 리간드와 함께 후보 항체들의 존재 또는 부존재 하에서 배양한다. 293T 세포들은 마침내 루시퍼라아제-의존 빛 방출을 측정하는 것에 의해 루시퍼라아제 발현에 대해 검정된다. 리간드와 그 수용체 간의 상호작용, 예를들어 IL-17A 및 IL-17R간의 상호작용은 NF-κB를 활성화시킨다. 항체들을 블로킹하는 것은 리간드-수용체 결합에 의한 NF-κB 신호화를 막고 그리하여 루시퍼라아제의 발현을 없앤다. 리간드-수용체 상호작용이 NF-κB를 활성화시키지 않는 경우에서, 다른 전사적 반응 요소들은 루시퍼라아제 유전자의 프로모터를 작동시키는데 사용되며 예를 들어, AP-1 반응 요소들 등과 같은 것이 있다.
사이토카인 기능을 억제하거나 기능적 검정법을 억제하는 항체의 능력에 대한 항체의 스크리닝
기능적 검정법들은 또한 환자 혈청 내에서 또는 클로닝된 및 발현된 항체들 내에서 항-사이토카인 항체들에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이 접근법에서, 발현된 인간 항체들은 사이토카인을 억제하거나 또는 세포성 반응의 다른 면역 매개체(mediator) 유도를 억제하는 그들의 능력에 대해 테스트된다.
박테리아, 바이러스로-감염된 세포들, 기생충들, 또는 암세포들을 표적하는 항체들
박테리아, 바이러스로-감염된 세포들, 기생충들, 또는 암세포들을 죽이거나 중화하는 항체들을 스크리닝하기 위해, 우리는 항체의 존재 또는 부존재하에서, 비-열-비활성 혈청(non-heat-inactivated serum)(보체 인자들을 함유하는)과 함께 적절한 세포 타입을 배양하였다. 만약 항체가 중화 항체라면, 이는 박테리아, 다른 미생물들, 또는 암세포들을 및 세포 사멸을 유도하는 막 공격 복합체(MAC)를 형성하는 활성 보체 성분들을 옵소닌화(opsonize) 할 것이다. 중화를 테스트하기 위해, 우리는 생존 또는 사망 세포들이 서로 다른 형광단으로 염색되는 형광성 생존/사망 검정법(Invitrogen)을 러닝한다. 세포들은 흐름 세포측정을 사용하는 것에 의해 생존 및 사망 세포들의 백분율로 검정될 수 있다. 가장 높은 사망 세포의 백분율을 야기하는 항체는 생체 내 스크린에서도 더 분석될 좋은 후보 중화 항체일 것이다.
바이러스들을 중화하는 항체
바이러스들을 중호하는 항체들을 스크린하기 위해, 우리는 표준 플라크-감소 검정법 또는 다른 시험관 내 세포성 감염 검정법들을 수행한다. 중화 항체들은 세포들의 바이러스성 감염을 감소시키는 것으로 예상된다. 그런 뒤 후보 항체들을 생체 내 모델에서 테스트한다.
인플루엔자 미세중화(microneutralization) 검정법
플루존 ELISA에 대해 결합 활성을 나타냈던 어떤 발현된 독감 항체들을 미세중화 검정법들을 위해 외부의 CRO, 바이라퍼(Virapur), LLC로 보냈다. 간단하게, 100ug/ml부터 시작하는, 각 항체들의 두-배수 희석액을 역가된 스톡 바이러스(titered stock virus) 의 대략 100 TCID50 감염성 유닛들의 동일한 부피와 함께 네번 거듭하여 96-웰 플레이트의 웰들 내에서 혼합하였다. 바이러스/항체 용액들을 2시간 동안 배양하였고 그런 뒤 혼합물을 80% 융합성(confluent) MDCK 세포들을 함유하는 96-웰 플레이트에 트렌스펙션하였다. 세포들, 항체 및 바이러스를 추가적으로 2시간동안 37oC에서 배양하였고, 바이러스를 제거한 뒤에, 단일층(monolayers)들을 씻어내고 바이러스성 성장 배지를 각 세포에 첨가하였다. 72시간 후에 웰들을 인플루엔자 바이러스 감염의 존재에 대해 미시적으로(microscopically) 관찰하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 26에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
포도상구균 억제 검정법(Staph Inhibition Assay)
S. aureus를 대수기 성장(log-phase growth)에 있을 때 사용하였다. 그들을 96-웰 폴리프로필렌 플레이드들에 첨가하고, 포도상구균 환자들로부터 얻은 항-포도상구균 항체를 10ug/ml로 첨가하였다. 아기 래빗 보체(Baby rabbit complement)(Cedarlane)를 제조자의 권장양으로 첨가하였고 완전히 혼합하였다. 1:10, 1:100 및 1:3000으로 희석하고 5% TSA 혈액 아가 플레이트들 상에 플레이팅하고 하룻밤동안 생장시키기 전에 플레이트들을 37oC에서 45분동안 배양하였다. 그 다음날 박테리아성 CFUs를 계산하였고 표로 작성하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 27에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
포도상구균-감염된 환자들로부터 유래된 항체들로 포도상구균 항원들의 면역침전법
100ng/ml의 리소스타핀을 가지는 B-Per 박테리아성 단백질 추출 시약(Bacterial Protein Extraction Reagent)(Pierce)을 사용하여 30분동안 RT에서 1x Halt 프로테아제 억제제(protease inhibitor)와 함께 S. aureus를 용해시키는 것에 의해 포도상구균 단백질 용해물을 만들었고, 이를 미세원심분리기(microcentrifuge)내에서 15000rmp으로 원심분리하는 것에 의해 불용성 분획으로부터 분리하였다. 용해물을 단백질 G 다이나비드들(Dynabeads)과 함께 1시간 동안 RT에서 배양하는 것에 의해 전처리(precleaned)하였다. 포도상구균 환자로부터 유래된 5ug의 항체를 1시간 동안 RT에서 배양하는 것에 의해 단백질 G 다이나비드들상에 결합시켰다. 단백질 G-결합 항체들을 그런 뒤 전처리된 포도상구균 용해물과 함께 하룻밤동안 4oC에서 배양하였다. 비드들을 그런 뒤 PBST(0.1% Tween20를 갖는 PBS)로 3번(3x) 세척하였고 4-12% 그리테리온 비스-트리스 겔(Criterion Bis-Tris gel)상에서 SDS-PAGE를 러닝(running)하기 전에 95oC에서 5분동안 5x 환원성 레인 샘플 버퍼(reducing lane sample buffer)(Thermo Scientific)와 함께 가열하였다. 단백질들을 RAPID염색 시약(Stain Reagent) (Calbiochem)으로 시각화하였다. 본 검정법에 사용된 항체들은 표 28에 기재되어 있다. 항체들의 서열들은 마스터 표, 표 18에 나타낼 수 있다.
펩티드들의 질량 분석법 식별
염색된 관심 단백질 밴드들을 겔에서 잘라내었고, 10 mM DTT 및 100 mM 요오도아세트아미드(iodoacetamide)를 함유하는 10 mM 암모니움 바이카보네이트에 담궜고, 100% 아세토니트릴로 처리하고, 그런 뒤 10% 아세토니트릴을 함유하는 10 mM 암모니움 아세테이트 내에서 0.1 mg 트립신(Sigma-Aldrich)로 37°C에서 하룻밤동안 분해하였다. 트립신화된 단백질들을 LCMS로 이전에 기재한바와 같이(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) as previously described (Lopez-Avila V, Sharpe O, Robinson WH: Determination of ceruloplasmin in human serum by SEC-ICPMS. Anal Bioanal Chem 2006, 386:180-7.) Agilent 1100 LC 시스템 및 Agilent XCT 울트라 이온 트랩(Ultra Ion Trap)(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하는 것에 의해 식별하였다. 단백질들을 식별하는데 사용된 펩티드들의 탐지를 위해 SpectrumMill 소프트웨어(Agilent)를 사용하여 LCMS 데이터를 SwissProt 또는 NCBInr 데이터베이스들에 대하여 스캔하였다. 이 검정법에 사용된 항체들은 표 29에 기재되어 있다.
실시예 1: 개별적인B세포들로부터 얻은 페어링된 헤비- 및 라이트-체인 서열들의 고처리 시퀀싱
우리는 어느 서열들이 플레이트 내의 동일한 웰들로부터 비롯된 것인지 명료하게 식별하기 위해 서열들에 합성 바코드들(샘플-ID + 플레이트-ID)을 첨가하는 방법을 개발했다. 우리는 이 접근법을 개별적인 B세포들로부터 얻은 페어링된 헤비 체인 및 라이트 체인 면역 글로불린 유전자들을 시퀀싱하는데 사용했다. 개별적인 B세포들은 혈액, 벌크 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs), 벌크 B세포들, 형질아세포들, 형질세포들, 기억 B세포들, 또는 다른 B세포 개체군들로부터 흐름 세포측정법에 의해 분류될 수 있다(도 1).
먼저, B세포들을 96-웰 PCR 플레이트들 안으로 단일-세포-분류하였고, 웰들의 한 컬럼은 음성대조군으로서 빈 것으로 남겨두었다. 서로 다른 샘플-ID 바코드들을 함유하는 올리고뉴클레오티드들을 역전사(RT) 중에 서로 다른 웰들 내로 첨가하였다. mRNA를 역전사 하는 것 후에, MMLV H- 역전사 효소는 주형들을 전환하고 올리고뉴클레오티드를 전사하고, 그것과 샘플-ID 바코드를 1st 가닥 cDNA의 3’말단 안으로 통합하였다(도 2a). 하나의 플레이트로부터 얻은 모든 cDNAs(샘플-ID로 바코드된)을 그런 뒤 모았고 PCR의 두 라운드들에 적용하였다. PCR 중에, 454 시퀀싱 프라이머들(제1 및 제2 시퀀싱 부위들) 및 플레이트-ID- 바코드들을 앰프리콘의 5’ 및 3’말단들에 5’-플랭킹 바코드 서열들을 갖는 PCR 프라이머들을 사용하여 첨가하였다. 서로 다른 플레이트들로부터 얻은 앰프리콘들(앰프리콘 부위들)은 이제 n 서로 다른 플레이트-IDs를 가지며, 플레이트-ID 및 샘플-ID를 포함하는 합성 바코드는 분명하게 특정한 세포들로부터 온 것으로서의 서열들을 식별하고, 시퀀싱된 헤비- 및 라이트-체인 유전자들의 페어를 이루는 것을 가능하게 한다(도 2b-c).
도 3은 사용된 일반적 방법론(general methodology) 및 연관된 서열들을 설명한다. 프라이머들 및 어댑터 분자들은 표 1에 나타내었다. 샘플-ID 서열들은 표 2에 나타냈다. 플레이트-ID 서열들은 표 3에 나타내었다. 클로닝 프라이머들은 표 4에 나타내었고, 표 5에 나타낸 클로닝 포워드 프라이머들의 3’ 서열을 갖는다.
우리는 PCR 생산물을 예상한 크기로 수득했다: 카파 및 람다 라이트 체인들에 대해 ~600bp, 그리고 감마 헤비 체인에 대해 ~700bp(도 4a). 그 다음, 우리는 생어 시퀀싱을 위해 재료를 보냈다. 우리는 NCBI BLAST에 의해 카파, 람다, 및 감마 체인들로서 식별된(데이터는 보이지 않는다)서열들을 수득했다. DNA 크로마토그램의 추가적 조사(investigation)는 샘플-ID 바코드들에서 시작하는 여러 개의 피크들의 믹스를 나타냈고, 이는 우리가 RT 도중에 서로 다른 웰들 내의 세포들로부터 얻은 cDNA에 샘플-ID 바코드들을 성공적으로 첨가 했고, PCR의 두 번의 추후 라운드들 내에서 그들을 성공적으로 증폭했다는 것을 보여주는 것이다(도 4b). 3’말단으로부터 얻은 생어 시퀀싱 체인은 또한 서로 다른 세포들로부터 얻은 유전자들의 증폭 때문에, VJ 접합에서 시작하는 여러 개의 피크들의 믹스를 나타내며, 이는 서로다른 V 및 J 유전자들의 삽입, 결실, 및 무작위적 재조합의 결과로서 VJ 접합 이후에 달라진다. 또한, 우리가 웰 A1 샘플-ID에 특이적인 클로닝 프라이머들로 PCR을 수행하였을 때, 우리는 여러 개의 피크들의 믹스 보다 단일 피크를 수득했고, 이는 우리가 풀 내에 있는 특이적 세포로부터 얻은 서열들을 확실히 증폭할 수 있음을 나타낸 것이다(도 4c-d).
실시예 2: 형질아세포들의 단일 세포 분류에 대한 게이팅 전략
형질아세포들을 이 실험에 대해서는 CD19+CD20-CD27+CD38++로 정의하였다. 도 22는 96-웰 플레이트들 안에서 단일 형질하세포 세포들의 흐름 세포측정법 소팅에 대한 게이팅 전략을 나타낸다.
단일 PBMCs를 준비했고, 상기 기재한 바와 같이 염색하였다. 세포들을 먼저 그들의 FSC 및 SSC 프로파일(데이터는 보이지 않음)을 근거로 하여 게이팅하였다. 생존 CD19+ B세포들을 그런 뒤 게이트 온(gated on)하였고(왼쪽 패널), CD20- B 세포들까지 더 좁혔고(왼쪽에서 2nd 패널), CD27+CD38++세포들로 정제하였다. 이로부터, IgG+ 형질아세포들은 세포 표면 IgG를 발현시키지 않으므로, IgG+ 형질아세포들을 IgA- 및 IgM- 로 정의하였다. 이 개체군을 96-웰 플레이트들 안에서 단일 세포 분류하였다.
실시예 3: 형질아세포들은 면역학적 대항을 겪은 대상들 내에 존재한다.
형질아세포들은 일반적으로 건강한 기증자에서 약 0.15%의 B세포들로 존재하나, 감염(예를들어, S. aureus 및 C. diff 감염들), 비-진행과 연관된 암(예를 들어, 인터벤션(intervention) (폐 샘암종 환자의 경우에는 화학요법 그리고 전이성 흑색종 환자의 경우에는 이필리무맵(ipilimumab) 치료) 이후의 활성화 B 세포 반응과 연관된 장기간 비-진행자가 된 환자들 폐의 전이성 샘암종(metastatic adenocarcinoma) 및 전이성 흑색종(metastatic melanoma), 백신화(예를 들어, 인플루엔자)를 포함하는 다양한 면역학적 대항들을 겪은 대상들에서는 약 3.3%-16.4%의 범위일 수 있다.
도 23은 형질아세포가 존재하고 페어링된 항체 레파토리의 고처리 시퀀싱 및 활성 체액성 반응 항체 레파토리의 특성화에 대한 대상들의 범위로부터 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 본 발명에 개시된 방법론들이 헤비 및 라이트(H＆L) 체인들의 진화계통수를 수득하는데 사용될 수 있고 이 정보를 예를 들어: a) 신규 항원 발견; b) 백신 디자인을 알아낸다 - 예를 들어, 면역 시스템을 사용하여 어떤 알려진 및 신규한 항원들이 옵소닌화 및 식균작용(phagocytosis)에 유용할 것 같은지에 관해 우리에게 알리는것 및/또는 병원체 또는 관심 표적들의 사멸/억제 및, 선택적으로, 이를 백신 디자인 안으로 넣는 것; c) 예를 들어 백신으로부터 얻어진 중화 단일클론 항체들을 만드는 것; d) 결합 단일클론 항체들을 만드는 것; e) 미생물 병원체들에 대한 항체들을 만드는 것; 및 f) 암들에 대한 항체를 만드는 것을 위한 항체들을 클로닝 및/또는 발현하는데 사용할 수 있다는 것을 증명한다. 이러한 것의 실시예들은 하기에 더 상세히 기재되어 있다.
실시예 4: CCP+ RA에서 질병 활성은 순환하는 형질아세포(circulating plasmablasts)와 관련된다.
우리의 방법이 인식 가능한 페어들 내의 면역글로불린 유전자들의 시퀀싱에 사용될 수 있다는 것을 입증하여, 우리는 CCP+ RA 환자들에서 형질아세포들의 항체 레파토리를 조사하는데 우리의 방법을 사용했다. 우리는 동의한 RA 환자들로부터 혈액 샘플을 수득했고 흐름 세포측정법에 의한 형질아세포를 위해 염색했다(도 5a). 순환하는 형질아세포들을 총 PBMCs의 백분율로서 나타내었다. 우리는 CCP+ RA 환자들이 CCP- RA 환자들에 비하여 현저하게 높은 말초 혈액 형질아세포 백분율들을 갖는다는 것을 발견했다(도 5b). 또한, CCP- 환자들 에서는 아니나, CCP+ 환자들 에서는 형질아세포 백분율들은 질병 활성과 관련되었다(r = 0.35 및 p = 0.028)(도 5c).
실시예 5: 항-CCP 항체들이 생성된 형질아세포
CCP+ 환자들이 질병 활성과 관련된 형질아세포 백분율들을 가진다 하여도, 이러한 환자들은 진행중인 감염 또는 그들의 순환성 형질아세포 백분율들을 상승시키는 다른 인자들을 가질 수 있다. CCP+ 환자들에서 순환하는 형질아세포들의 특이성을 결정하기 위해, 환자들로부터 얻은 RosetteSep-강화된 B세포들을 10% FBS로 보충된 RPMI에서 배양하였다. 항-IgM, IL-6, BAFF 등과 같은 다른 배지 보충물들은 사용하지 않았고 그리하여 형질아세포는 항체들을 분비하는 유일한 세포가 되었다(다른 B세포들은계속 불활성이다). 오직 형질아세포들만이 항체들을 생산하는지 확인하기 위해, 우리는 형질아세포들의 어떤 샘플들을 제거하였다(도 5d). 그런 뒤 상층액을 수득하고 Luminex 펩티드 어레이상에서 러닝하기 전에 B 세포들을 7일동안 배양하였다. 어레이는 시트룰린화 펩티드들에 대한 항체 반응성을 검정한다. 항체 반응성은 모의-제거 B세포들의 상층액과 비교하여 형질아세포-제거 샘플들의 상층액에서 없었으며, 이는 형질아세포가 현저한 양의 항-시트룰린 펩티드 자가항체들을 분비한다는 것을 제안한다(도 5e). 또한, 각 샘플에서 60이 넘는 평균 형광 강도(MFI)를 가지는 펩티드들이 계산되었을 때, 순환하는 형질아세포 백분율들 및 항체들이 반응하는 펩티드들의 숫자 사이에 강한 관련성을 발견했다(r = 0.90 및 p = 0.0139). 형질아세포-제거 샘플들의 상층액에서 펩티드 반응성의 >99%가 떨어지는 임계점 이하로서 60 MFI를 선택하였다.
실시예 6: 454 시퀀싱 및 서열들의 분석.
환자들로부터 얻은 형질아세포들을 상기 기재된 대로 96-웰 플레이트들 내로 단일-세포 분류하였고, 그들의 RNA를 역전사하고, 재료 및 방법 섹션내의 “터치다운 PCR”에 따라 PCR 증폭하였꼬 그리하여 그들은 상기 기재되어 있는 대로, 샘플-ID(샘플 식별 부위) 및 플레이트-ID(플레이트 식별 부위) 바코드들을 함유했다. 도 3을 인용한다. cDNA의 서열들을 그런 뒤 454-시퀀싱 시설로부터 수득하였다(DNA 시퀀싱 센터, Brigham Young University and 454 sequencing center, Roche).
서열들을 제1 454 시퀀싱 런(run)으로부터 샷건 파이프라인(shotgun pipeline)을 사용하여 수득하였다. 허용가능 퀄리티(acceptable quality)의 서열들을 2nd 454 시퀀싱 런으로부터 454 GS FLX 데이터 분석 수트의 변형된 앰프리콘 필터를 통해서 수득하였다. 앰프리콘 필터가 “폴스(false)”로 시작하는 <vfScanAllFlows> 및, “6”으로 변경된 <vfBadFlowThreshold>을 가지도록 변형하였다. 3번째 및 4번째 런으로부터 서열들을 표준 454 앰프리콘 필터를 사용하여 수득하였다. 필터-통과 서열들(Filter-passed sequences)을 그런 뒤 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당”에 기재된 대로 가공하였고, 각 웰에 있는 서열들을 재료 및 방법의 “서열의 어셈블리”에 기재된 대로 개별적으로 조립하였다. 조립된 서열들을 그런 뒤 IMGT 하이브이-퀘스트(IMGT HighV-Quest)로 파싱하였고 사용된 VDJ 부위들의 식별을 수득한다.
서열 어셈블리 및 V(D)J 유용성 식별 이후에, 클러스탈엑스(ClustalX)를 서열들을 클론 패밀리들 안으로 클러스터링하는데 사용하였다(도 6). 대안적으로, 서열들은 포워드 및 리버스 리드들을 모두 사용하여 조립될 수 있다. 이 경우에, 세분화된 포워드 서열들은 먼저 상기와 같이 조립된다. 포워드 및 리버스 서열들 V(D)J 유용성은 그런 뒤 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST) 및 플레이트-ID 및 V(D)J 유용성에 따른 포워드 및 리버스 서열들 서브세트, 및 뉴블러(Newbler)를 사용하여 조립된 포워드 및 리버스 서열들을 사용하여 식별된다. 면역글로불린 서열들이 대체로 유사하므로, 서열들의 더 작은 서브세트로부터 얻은 어셈블리는 부정확 하게 페어링 되고 있는 서로 다른 세포들로부터 얻은 서열들의 잠재적 문제들을 피한다.
실시예 7: 진화계통수 내의 서열들의 클러스터링
말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs)을 나타난 진단(indicated diagnoses)을 갖거나 또는 백신화 후의 인간 대상들로부터 분리하였다. 형질아세포들을 96-웰 플레이트의 개별적인 웰들 안으로 단일-세포 분류하였고, 각 웰 내에서 단일-세포 샘플들을 생성하였고, 각 웰의 mRNA를 그런 뒤 역전사 하였고, 그런 뒤 웰 내용물들을 모았고 PCR의 두 번의 라운드들에 적용하여 면역 글로불린 헤비 및 라이트 체인 cDNAs를 증폭하였다. 역전사는 각 단일 샘플로부터 생성된 모든 cDNAs에 대해 식별하는 샘플-ID를 첨가했고, PCR의 제1 라운드 및 제2 라운드는 플레이트-IDs 및 그런 뒤 454-티타늄 프라이머들 A 및 B를 모든 앰프리콘에, 각각, 재료 및 방법 섹션의 “터치다운 PCR 및 비-터치다운 PCR”에 기재된 바와 같이 첨가했다. 일반적 방법론은 도 3에 개설된다. 모아진 앰프리콘들을 454 시퀀싱 기술과 상기 기재된바와 같이 수득된 허용가능 퀄리티의 리드들을 가지고 시퀀싱하였다. 리드들을 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”섹션에 기재되어 있는 바와같이 웰들로 할당하였고 조립하였다. 조립된 서열들 내의 V(D)J 절편들을 그런 뒤 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 사용하여 식별하였다. 공유된 합성 바코드들을 갖는 식별된 헤비 및 라이트 체인 서열들은 조립된 서열들과 매칭(matching) 합성 바코드들을 함께 넣는 것에 의해서 간단히 페어링 될 수 있다.
개별적인 인간 대상들로부터 얻은 앰프리콘들을 이러한 V(D)J절편들을 근거로 하여 클러스터링 하였고, 동일한 V(D)J 절편들을 발현하는 서열들을 동일한 클론 패밀리로부터 온 것으로서 분류하였다(도 7). 각 파이(pie) 차트는 동일한 V(D)J 유전자 절편들을 발현하는 개별적인 인간 대상으로부터 얻은 개별적인 형질아세보들로부터 유래된 클론들의 백분율을 나타낸다(즉, 각 클론 패밀리 내의 클론들의 백분율). 인간 대상들은 패혈증(sepsis)(2개 대상들), 류머티즘성 관절염(rheumatoid arthritis)(3개 대상들), 폐암(1개 대상), 및 인플루엔자에 대한 백신화 후(1개 대상)를 갖는 것들을 포함했다. 이러한 대상들을 급성(패혈증 및 독감 백신) 및 만성 질환들(류머티즘성 관절염 및 폐암) 모두를 겪은 대상들의 형질아세포들로부터 분리할 수 있는 클론 패밀리들을 나타내는데 선택하였다.
도 7의 개별적인 인간 대상들로부터 얻은 면역글로불린 헤비 체인 V(D)J 서열들을 클러스탈엑스(ClustalX)를 사용하여 클러스터링 하였고, 방사상 나무(radial trees)가 근절된 것으로서 트리뷰(Treeview)를 사용하여 디스플레이하였다. 각 방사상 나무들은 개별적인 인간 대상으로부터 유래된 헤비 체인 서열들을 나타낸다. 각 방사상 나무에 대해, 종말 말단(terminal ends)들은 특유한 서열을 나타낸다. 주요 가지들(major branches)은 클론 패밀리를 나타내고, 더 작은 가지들은 접합 다양성(junctional diversity)(P-뉴클레오티드들 또는 N-뉴클레오티드들의 첨가, 또는 뉴클레오티드 결실), 체세포 초돌연변이 및 친화성 돌연변이를 통해 발생했던 돌연변이들에 의해 서로서로 다른 클론 서브 패밀리를 나타낸다.
실시예 8: 항체의 클로닝, 발현, 및 정제
모든 선택된 항체들을 재료 및 방법 섹션에 기재된 대로 클로닝, 발현, 및 분리하였다(섹션들: 론자 벡터들 내에서 헤비 및 라이트 체인들의 클로닝; 293T에서 단일클론 항체들의 발현; 항-인간 IgG ELISA; 및 발현된 단일클론 항체들의 단백질 A-IgG 정제를 인용). 정제된 항체들을 그런 뒤 하기에서 논의되는 것으로서, 추가 연구를 위해 사용하였다.
실시예 9: 인플루엔자 백신화 후의 대상들로부터 얻은 항체들의 특성화
인플루엔자 백신이 접종된 인간들로부터 얻은 항체들을 상기에 기재된 바와 같이 선택하였고 분리하였다. 하기의 추가 특성화를 위해 선택된 항체들은 적절한 섹션들 내에서 나타내었다.
플루존 ELISA
자원봉사자들에게 플루존으로부터 얻은 2010/2011 시즌 독감 백신을 투여하였고, 이는 비활성화 바이러스의 3개 스트레인, A/California/7/2009, A/Perth/16/2009, B/Brisbane/60/2008 스트레인 들로 구성된다. 플루존 ELISAs를 상기 기재된 대로 수행했고 결합 활성을 가지는 발현된 항체들에 대한 초기 스크린으로서 백신화된 자원봉사자들로부터 유래된 단일클론 항체들이 독감 백신 그 자체에 결합하는지 결정하였다. 31개의 항체들 중 14개가 플루존 ELISA에 결합했고(도 26) 이들의 서브세트를 차후에 선택하였고 헤마글루티닌에 대한 결합 활성에 대해 표면 플라스몬 공명을 사용하여 테스트랬다. 플루존 ELISA로 특성화된 항체들은: Flu14 - Flu23, Flu25 - Flu27, Flu29, Flu30, Flu34, Flu35, Flu37, Flu39 - Flu41, Flu43 - Flu46 이었다. S1 및 S2를 음성 대조군들로 사용했다.
독감 항체 친화성의 표면 플라스몬 공명 결정
HA 분자들에 대한 단일클론 항체들(mAbs)의 결합을 25°C에서 프로테온(ProteOn) 표면 플라스몬 공명 바이오센서(biosensor)(BioRad Labs)를 사용하여 상기에 기재된 대로 분석하였다. 플루존 ELISA에 결합하는 14개의 항체들 중, 10개는 H3에 결합했고, 1개는 H1에 결합했으며, 반면 3개는 결합하지 않았다(도 27). 비-결합자들(non-binders) 중에서 하나, H1 결합자(binder), 및 무작위로 선택된 4개의 다른 H3 결합자들을 선택하였고 미세중화 검정법 내에서 중화 활성을 테스트하기 위해 임상대행기관(contract research organization)(CRO)로 보냈다. SPR에 의해 특성화된 항체들은: Flu14 - Flu22, Flu26, Flu29, Flu34, Flu35, Flu46 이었다.
인플루엔자 미세중화 검정법
플루존 ELISA에서 결합 활성을 나타냈던 발현된 독감 항체들중 어떤 것을 상기 기재된 바와같이 미세중화 검정법들을 위해 외부 CRO, Virapur LLC에 보냈다. 검정법들의 결과들은 이전의 검정법들에서 H1에 결합했던 항체는 H1을 중화했던 반면, 이전의 검정법들에서 H3에 결합했던 항체들은 H3를 중화했다는 것을 나타냈다. 비-결합자는 인플루엔자 바이러스를 중화하지 않았다(도 28). 미세중화 검정법에 의해 특성화된 항체들은 Flu15, Flu16, Flu18, Flu19, Flu20, Flu21이었다.
CDR 변이(CDR Variation)
독감 항체들을 상기 기재된 대로 수득하였다. 도 25는 명확성을 위해 부분 계통수(dendrogram) 확대도(blown-up)를 나타낸다(a). 클론 패밀리들은 명확히 보이며 음영된(shaded) 클론 패밀리는 회색 박스에 나타난 대로 할당된 V(D)J를 가진다. 헤비 및 라이트 체인들에 대한 CDRs(박스된 부분)을 가로지른 아미노산 서열을 도 25(b) 및 (c)에 각각 나타내고, 이는 체인들 간의 몇몇 잔기 차이들을 나타낸다.
이러한 상기 결과들은 진화계통수가 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 수득될 수 있음을 증명한다. 완전 인간 단일클론 항체들은 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 급성 질환들을 겪은 대상들의 형질아세포들과 같은 활성화 B세포들로부터 분리할 수 있다. 이러한 완전 인간 단일클론 항체들은 또한 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 중화 항체들이 될 수 있다. 결과들은 또한 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법들이 외래성 항원들에 대해 표적화된 mAbs를 분리하는데 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 10: RA를 갖는 대상들로부터 얻은 항체들의 특성화
류머티즘 관절염(RA)으로부터 고통받는 인간들로부터 얻은 항체들을 상기에 기재된 대로 선택하였고 분리하였다. 하기의 추가 특성화를 위해 선택된 항체들은 적절한 섹션들에서 나타내었다.
RA 항원 마이크로어레이들 상에서 RA 항체 반응성
RA 환자들로부터 유래된 항체들을 RA 항원 어레이 상에서 조사했고 재료 및 방법의 “RA 항원 어레이들 상에서 RA 항체 반응성”에 기재된 대로 진픽스 머신(GenePix machine)으로 형광 스캔하였다. 식별된 관계를 자바 트리뷰 소프트웨어(Java TreeView software)를 사용하여 히트맵(heatmap)으로 디스플레이 했다(도 37). 이 분석법에 의해 특성화된 항체들은: RA1, RA2, RA3, RA4, RA8 - RA13, RA16, RA19, RA22 및 RA23이었다. Flu14 및 Flu26를 음성 대조군들로 사용했다.
항-히스톤 2A ELISA
H2A에 대한 항체들의 탐지를 위해, 직접 ELISA를 재료 및 방법 섹션의 “항-히스톤 2A ELISA”에 기재된 대로 수행하였다. 도 35a는 각 테스트된 항체에 대해 탐지된 흡광도 값들을 나타낸다. 도 35a 및 하기의 항-CCP2 ELISA에서 특성화된 항체들은: RA1, RA2, RA4-RA16, RA19, RA23-RA24이었다. 도 36은 30ug/ml의 항체들을 사용하는 다른 독립된 ELISA 상의 선택된 항체들(RA1, RA2, RA8, RA9)을 나타낸다.
항-CCP2 ELISA
항-CCP2 ELISA를 재료 및 방법 섹션의 “항-CCP2 ELISA”에 기재된 대로 수행하였다. 도 35b는 각 테스트된 항체들에 대해 탐지된 흡광도 값을 나타낸다.
항-류머티즘 인자 ELISA
RA 환자들로부터 유래된 항체들을 직접 ELISA에서 1차 항원으로서 사용하였고 항-인간 IgG-HRP를 2차 항원으로 사용하였으며, TMB 기질로 시각화하였다. 류머티즘 인자(RF)에 대한 항체들의 탐지를 위해, 항-RF ELISA를 재료 및 방법 섹션의 “항-류머티즘 인자” ELISA에 기재된 대로 수행하였다. 도 34는 반응성이 나타난 항체들 RA2 및 RA3을 나타낸다. 여기서 특성화된 항체들은: RA1-RA6, RA8-RA12, RA14 이었다.
이러한 상기 결과는 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 만성 질환들을 겪는 대상들의 형질아세포와 같은 활성화 B세포들로부터 항체들을 분리할 수 있다는 것을 증명한다. 상기 결과들은 또한 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법들이 자가 항원(self antigens)에 대해 표적화된 mAbs를 분리하는데 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 11: 폐암을 가진 대상들로부터 얻은 항체들의 특성화.
전이성 폐샘암종으로부터 고통받는 장기적인 비-진행자(long-term non-progressor) 인간으로부터 얻어진 항체들을 상기 기재된 대로 선택하고 분리하였다. 이 인간은 전이성 폐샘암종이 발달했고 암에 굴복할 것으로 예상되었으나, 화학요법 이후에 이 환자는 4년동안 장기적 비진행 상태로 들어갔고 이는 모든 말초 혈액 B세포들의 3.1%를 구성하는 형질아세포들과 연관된 것이다. 이 환자 내에서 상승된 말초 혈액 형질아세포 수준은 진행중인 면역 반응은 그의 장기적 비진행에 기여할 수 있다는 것을 나타냈다. 하기 항체들을 추가 특성화를 위해 선택하였다: LC1, LC5-LC7, LC9-LC18. Flu16을 음성 대조군으로 사용하였다.
폐암 조직 어레이들 상에서 폐 샘암종 환자로부터 얻은 항체들의 면역조직화학(Immunohistochemistry)
서로 다른 두 타입의 조직 마이크로어레이 슬라이드들을 사용한 면역조직화학을 재료 및 방법 섹션에 “폐암 조직 어레이들 상에서 폐 샘암종 환자로부터 얻은 항체들의 면역조직화학”에 기재된 대로 수행하였다. 우리의 결과들은 발현된 항체 중 하나가 폐 샘암종에 결합합한다는 것을 증명했다(도 32).
폐 샘암종 세포주에 대한 폐 샘암종 환자로부터 발현된 항체들의 결합의 흐름 세포측정결정
다양한 폐암 세포주에 대한 항체들의 결합을 재료 및 방법 섹션의 “폐암 세포주에 대한 폐 샘암종 환자로부터 발현된 항체들의 결합의 흐름 세포측정 결정”에 기재된 대로 수행하였다. 우리의 결과는 하나의 항체가 폐 샘암종 세포주에 결합했고 폐 샘암종들에 특이적일 수 있다는 것을 나타냈다(도 33).
이러한 상기 결과는 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 만성 질환들을 겪는 대상들의 형질아세포와 같은 활성화 B세포들로부터 항체들을 분리할 수 있다는 것을 증명한다. 상기 결과들은 또한 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법들이 자가 항원(self antigens)에 대해 표적화된 mAbs를 분리하는데 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 12: 스태필로코쿠스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) 감염을 갖는 대상들로부터 얻은 항체들의 특성화.
항생제가 없어서 감염의 면역-매개 대조군을 갖는 만성 S. aureus 골수염을 갖는 인간을 포함하는 S. aureus 감염들을 갖는 인간들을 말초 혈액의 소스들로 사용하였고, 그로부터 얻은 말초 혈액 형질아세포들을 염색 및 분류하였다. 바코딩, 454 시퀀싱 및 생물정보학 분석으로 가공하는 cDNA는 Staph. Aureus에 대해 효과적인 면역 반응들을 시작하는(mounting) 인간들 내의 항체 레파토리들의 진화계통수를 생성했다. S. aureus 감염에 대해 효과적인 면역 반응들을 시작하는 인간들로부터 얻은 항체들을 상기 기재된 대로 선택하였고 분리하였다. 하기 추가 특성화를 위해 선택된 항체들은 적절한 섹션들 내에서 나타내었다.
포도상구균 흐름 세포측정
항-포도상구균 항체들을 재료 및 방법의 “포도상구균 흐름 세포측정”에 기재된 대로 고정된 S. aureus를 염색하는데 사용하였다. 우리의 결과는 항체들 S6 및 S11이 S. aureus의 표면에 결합하며 옵소닌화를 위한 후보들일 수 있고, S. aureus의 식균 작용 및 사멸/억제를 야기한다는 것을 나타낸다(도 29). 이 검정법에서 특성화된 항체들은: S1 - S4, S6 - S13이었고, F26을 음성대조군으로 하였다.
포도상구균 억제 검정법
재료 및 방법의 “포도상구균 억제 검정법”에 기재된 대로 대수기 성장에 있는 S. aureus를 항-포도상구균 항체와 조합하였고 항체들의 억제 활성을 결정하였다. 우리의 결과들은 클로닝되어 발현된여러 항체들이 S. aureus에 대한 강력한 사멸/억제 활성을 드러냈다는 것을 증명한다(도 30). 이 검정법에서 특성화된 항체들은 S6 및 S9이었고, LC1을 음성대조군으로 하였다.
포도상구균-감염된 환자들로부터 유래된 항체들로 포도상구균 항원들의 면역침전법
재료 및 방법의 “포도상구균-감염된 환자들로부터 유래된 항체들로 포도상구균 항원들의 면역침전법”에 기재된대로 항체들을 다양한 후보 포도상구균 항원들을 면역침전하는데 사용하였다. 면역침전된 단백질들을 그런 뒤 하기에 기재된 대로 질량 분석법으로 식별하였다. 이 검정법에서 특성화된 항체들은 S1 - S13이었다.
펩티드들의 질량 분석법 식별
재료 및 방법의 “펩티드들의 질량 분석법 식별”에 기재된 대로 염색된 관심 단백질 밴드를 선택하고 질량분석기에 적용하였다. 상기 결과들은 항체 S4에 대한 결합 표적일 것 같은 것으로서 페놀-가용성 모두린 알파 1 펩티드(phenol-soluble modulin alpha 1 peptide) 또는 델타-헤몰리신(delta-hemolysin)을 식별했다. 이는 본 명세서에 개시된 방법들이 새로운 항원 별견을 수행하는데 사용될 수 있음을 증명한다(도 31). 이 검정법에서 특성화된 항체는 S4이다.
이러한 상기 결과들은 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 사용하여 박테리아성 감염과 같은 급성 질환들을 겪은 대상들의 형질아세포들과 같은 활성화 B세포들로부터 항체들을 분리할 수 있다는 것을 증명한다. 상기 결과들은 또한 본 명세서에 개시된 조성물들 및 방법들이 외래성 항원들에 대해 표적화된 mAbs를 분리하는데 사용될 수 있고 선택된 항체들에 의해 결합되는 항원들의 상동성을 결정할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 13: 블라스팅 셀들 및 형질아세포 특성화
계속중인 면역 반응에 의해 활성화된 B세포들로부터 얻은 면역글로불린 서열들은 상기에 기재된 대로 계속중인 면역 반응의 진화계통수를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 진화계통수는 전형적으로 다중 라인들의 하강(multiple lines of descent)으로부터 얻은 활성화 B세포들을 나타내는 다중 클론 패밀리들로부터 특성화된다. 순수한 B세포들로부터 얻은 서열들은, 그들이 활성화되지 않았고 그리하여 활성, 계속중인 면역 반응에 대한 정보를 제공하지 않으므로 일반적으로 이러한 진화계통수를 생성하는데 사용될 수가 없을 것이다. 활성화 B세포들은 먼저 활성화 된 것이고 더 큰 크기인 블라스팅 세포들로 된다. 이러한 블라스팅 세포들은 그런 뒤 기억 B세포들 또는 형질 세포들이 되는 것으로 나아간다. 인간에서, 비록 기억 B세포들 및 형질 세포들이 면역 반응을 원인으로 한 것이라도, 그들은 이전의 면역적 손상(immunological insults)에 대한 반응들을 원인으로한 형질세포 및 기억 B세포들의 큰 풀들(pools)에 포함된다. 그러므로, 인간에서는, 블라스팅 세포들은 게속중인 면역 반응의 진화계통수를 얻기 위한 시퀀싱에 대한 바람직한 후보이다. 그러나 조절된 조건들내에서 자란 동물들(예를 들어, 마우스들)에 대한 연구에서, 블라스팅 B세포들, 기억 B세포들 및 형질 세포들은 그들이 깨끗한 환경에서 자라서, 그 전에는 어떤 주요 면역학적 대항을 받아보지 못한 큰 기억 또는 형질 세포 개체군들을 그들이 가지고 있지 않을 것이므로, 가혹한 면역반응(rigorous immune response) 후의, 특히 부스터 샷(booster shots) 후의, 다수의 기억 B세포들 및 형질 세포들이 공격에 대항하는 것이 가능해 지므로 모두 진화계통수들을 얻기 위한 시퀀싱에 대한 후보들이다.
T세포들에도 유사하게, 인간에서, 계속 중인 면역 반응의 진화계통수를 수득하기 위한 시퀀싱에 대해 바람직한 세포들은 블라스팅 T 세포들이 될 것이다. 마우스들에서, 활성화, 블라스팅, 및 기억 T 세포들은 모두 진화계통수를 수득하기 위한 시퀀싱에 대한 바람직한 후보들이다.
블라스팅 B 세포들은 전형적인 B세포들보다 큰 것으로 알려져있다. 휴지 B세포가 그 하나인 작은 림프구의 크기는 전형적으로 크기에서 6-8 μm 이다. 블라스팅 림프구들(T 및 B세포들)은 전형적으로 크기에서 8-14 μm 이다. (도 41, 또한 Tzur et al, PLoS ONE, 6(1): e16053. doi:10.1371/journal.pone.0016053, 2011;Teague et al, Cytometry, 14:7 2005을 인용). 형질아세포들은 하기의 발현 패턴을 가질 수 있다: CD19low/+, CD20low/-, CD27+ and CD38high. 이러한 모든 마커들의 사용이 단일 세포 분류에 대해 가장 순수한 개체군을 야기한다 하더라도, 모든 마커들이 형질아세포들을 분리하는데 사용될 필요는 없다.
도 39에서 예가 되었듯이, 형질아세포들은 더 큰 세포들에 대해 FSChi를 사용하여 게이트 온 될 수 있고, 37%순수한 형질아세포 개체군을 야기한다. FSChiCD19hi 세포들을 게이트 온 하는 것은 72%의 형질아세포 순도를 부여한다. FSChi 및 CD27+, CD38hi, 또는 CD20- 를 게이트 온 하는 것은 각각, 44, 80, 및 71 퍼센트의 형질아세포 순수성을 부여한다. 형질아세포들을 다른 B세포들과 구별할 수 있는 것이 발견된 이러한 모든 마커들 또는 다른 마커들의 조합은 분류된 형질아세포들의 순도를 증가시키는데 사용될 수 있으나, 이러한 마커들의 어느 하나는, 비록 더 낮은 순도를 가질지라도, 단독으로 형질아세포들을 다른 B세포들과 구별할 수 있다.
실시예 14: 시퀀싱 및 분석을 위한 대안적 플랫폼
단일 플레이트, 플레이트 44로부터 얻은 헤비 체인 리드들을 재료 및 방법의 “터치다운 PCR”에 기재된 방법들을 사용하는 팩바이오(PacBio) 시퀀싱 런을 위해 준비하였고 감마 헤비 체인 cDNA를 증폭하였다. 48 2nd PCRs를 팩바이오 런에 충분한 DNA를 수득하는데 수행하였다. cDNA의 모음(pooling) 및 클린업을 “팩바이오 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된대로 수행했다. DNA를 준비(prep) 및 시퀀싱을 위해 팩바이오로 보냈다. CCS 리드들을 팩바이오로부터 수득하였고 웰들로 할당하였고 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 따라서 조립하였다. 할당의 결과들은 도 38에 있다. 이는 우리의 방법들 및 조성물들이 고처리 시퀀싱에 특이적인 플랫폼이 아니라는 것을 나타낸다.
실시예 15: 454 XL+ 런 상에서 시퀀싱 및 분석
“454 XL+ 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된 방법에 따라 시퀀싱은 454 XL+ 런들로 어댑트 될 수 있다. 454 XL+ 런들이 현재 오직 Lib-L 화학법(Lib-L chemistry)만을 지지하나, 반면 우리의 454 XLR70 런들은 Lib-A 화학법을 활용하므로 이는 수행될 필요가 있다. 이는 또한 일반적으로 XLR70 런들에 대한 앰프리콘 시퀀싱에 대해 전형적인 Lib-L 화학법보다 Lib-L 화학법이 선호되는 환경들로 어댑트 될 수 있다. 454 XL+런들로부터 얻은 리드들은 여전히 웰들로 할당 될 수 있고 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기재된 방법에 따라 조립될 수 있다. 454 필터링 이후에 XLR70 및 XL+ 런들로부터 얻은 리드들은 동일한 방식으로 사용될 수 있다, 즉 클로닝 및 발현을 위한 항체들의 하류 선택 및 항체 기능적 성질들의 검정은 각 도 6 및 9대로 여전히 진행할 수 있다.
실시예 16: 페어링된 면역글로불린 유전자들의 클로닝
각 클론 패밀리들이 동일한 에피톱을 인식하고, 그 각 패밀리 내의 서열 변화가 체세포 초돌연변이 때문이라면, 우리는 먼저 관심 항원에 결합하는 항체들의 스크리닝을 위해 각 클론 패밀리의 가장 빈번한 클론을 클로닝하고 발현할 수 있다(도 6). 가장 높은 친화성으로 항원에 결합하는 중심세포들(centrocytes)은 생존 인자들에 대해 다른 중심세포들과 경쟁하므로 우리는 친화성 성숙 및 종자 중심 내에서의 선택 중에, 가장 빈번한 클론들을 사용한다. 그러므로, 우리는 가장 높은 빈도 클론이 또한 가장 높은 결합 친화성을 가지는 것으로 예상한다. 일단 클론이 항원에 결합할 수 있는 항체로서 식별되면, 전체 클론 패밀리로부터 얻은 대표적인 페어링된 면역글로불린 서열들을 그런 뒤 클로닝, 발현, 및 중화 항체들인지 스크리닝한다(도 6). 이 공정은 클론 패밀리 내의 다중 서브클론들을 대표하는 서열들의 클로닝 및 발현, 또는 클론 패밀리내의 서로 다른 이소타입들의 항체들의 인코딩을 포함하고 클론패밀리 내에 함유된 항체들의 스펙트럼을 나타내는 대표하는 특이적 클론들의 결합 및기능적 성질들의 비교 및 직접 테스팅을 가능하게 한다. 목적하는 결합 및 기능적 성질들을 나타내는 특이적 클론은 그런 뒤 추가 특성화 및 치료적 인간 항체로서의 개발을 위한 고려를 위해 선택된다.
패밀리로부터(또는 관심 항체들의 모든 다른 세트) 클로닝을 위한 후보들을 선택하는 대안적 접근법은 항체들에 대한 진화계통수를 제작하는 것이다(클론 패밀리의 경우 내의 생식 서열에 뿌리를 둔). 이러한 나무 내의 리프 노드들은 항체 패밀리 멤버들과 상응한다. 그런 뒤 클로닝을 위한 후보들은 나무의 꼭대기로부터 하강하는 것에 의해 선택되고, 언제나 그 아래에 가장 큰 숫자의 리프 노드들을 가지는 가지를 선택하고(동수(tie)의 경우에는 무작위적으로 선택한다), 그런 뒤 리프들 상의 마지막 노드에서 가장 큰 숫자의 돌연변이를 가지는 리프를 선택하거나, 또는 동수인 경우에는 무작위 적으로 선택한다. 추가적인 후보들은 그런 뒤, 원한다면, 다음과 같이 목적하는 숫자가 달생 될 때까지 반복하여 후보들을 선택하는 것에 의해 선택될 수 있다. 나무의 모든 노드를 위해, 노드의 자손(descendants)인 리프들중 어느것도 선택되지 않았다면, 자손인 리프들의 숫자를 계산한다. 이러한 가장 큰 수를 가지는 노드를 위해(동수인 경우 무작위적으로 선택한다), 하강하고, 언제나 가장 큰 숫자의 자손 리프 노드들을 가지는 가지를 선택한다(가지들 사이에 동수인 경우에는 무작위적으로 선택한다). 그런 뒤, 상기 리프들 상의 마지막 노드에서, 가장 큰 수의 돌연변이들을 갖는 리프를 선택하거나 또는 동수인 경우에는 무작위적으로 선택한다.
게다가 항체들의 패밀리로부터(또는 관심 항체의 모든 다른 세트) 후보들을 선택하는 다른 접근법은 생식에 대한 비-침묵 돌연변이들의 하강하는 숫자에 의해 항체들을 나열하고, 순서대로 리스트로부터 선택하고, 그리하여 가장 진화된 항체들을 선택하는 것이다.
실시예 17: 후보 인간 항체들의 영구적 트렌스펙션 및 발현
목적하는 클론들은 서열들의 모아진 플레이트로부터 주어진 샘플-ID에 특이적인 클로닝 프라이머들을 사용하는 것에 의해 선택적으로 증폭되고; 이러한 프라이머들은 또한 클론 안으로 서로 다른 5’ 및 3’ 제한 자리들을 통합한다. 그런 뒤 제한 자리들을 클론을 벡터 안으로 삽입하는 것을 위해 사용한다. 증폭된 클론들이 오직 부분적인 불변 부위 서열들만을 함유 할 수 있으므로, 벡터들은 이미 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에 증폭된 클론들을 삽입하는데 필요한 적절한 제한 자리들과 함께 카파, 람다 또는 감마 불변 부위들을 포함한다. 클론들은 가변 서열들을 가지므로, 다중 제한 자리들은 벡터들 내에서 조작되며, 또한 클론 그 자체 내에 존재하는 제한 자리의 잠재적 문제를 회피하고, 그런 뒤 또한 제한 효소에 의해서 절단될 것이다. 이는 많은 클론들이 가능한 만큼 삽입되는 것을 가능케 한다. 사용된 벡터들은 서로 다른 포유류 선택가능 마커들을 갖는 두 개의 독립적인 벡터들(조작된 제한 자리들을 갖는 불변-부위 유전자를 함유하는 변형된 인비트로젠 pcDNA3.3 또는 pOptivec 벡터들) 또는 두 유전자들 모두를 함유하는 듀얼-발현 벡터(론자 GS 시스템; pEE6.4 및 pEE12.4). 불변 부위 삽입체들의 서열들에 대해 각각 표 16 및 17을 인용한다. pOptivec내의 디하이드로폴레이트 레덕타아제(DHFR) 또는 론자 GS 시스템 내의 글루타민 합성효소(GS)와 같은, 선택 마커들은 증폭가능하고, 유전자 증폭 및 많은 양의 항체를 필요로 하는 추가적 스크리닝 목적들을 위한 항체의 효율적인 생산(예를 들어 생체 내 스크린)을 가능하게 한다. 포유류 세포들은 하나에는 라이트 체인 그리고 다른 벡터에는 헤비 체인을 갖는(변형된 pOptivec 및 pcDNA3.3) 이중 트렌스펙션, 또는 두 유전자 모두를 함유하는 듀얼-발현 벡터(론자 GS 시스템)을 사용하여 트렌스펙션된다.
변형된 인비트로젠 벡터들. 벡터들은 서로 다른 포유류 선택가능 마커들 및 조작된 제한 자리들을 갖는 두 개의 독립적인 벡터들이다. pcDNA3.3은 선택가능한 마커로 네오마이신 내성 유전자(resistance gene)를 가지고, pOptivec은 DHFR-선택가능 마커를 가진다. CHO DHFR-세포들은 게네티신(Geneticin)의 선택 하에서 변형된 pcDNA3.3 및 pOptivec로 공동-트렌스펙션된다. 오직 DHFR-세포들만이 pOptivec로 트렌스펙션되고, 이는 DHFR의 카피를 함유하고, 생존할 것이고, pcDNA3.3 내의 네오마이신 내성 유전자가 게네티신에 대한 내성을 부여한다. 이는 두 벡터들(하나에는 라이트 체인 그리고 다른 벡터에는 헤비체인을 함유하는) 모두로 성공적으로 트렌스펙션된 세포들의 선택을 가능케 하고, 그러므로 기능적 면역글로불린들을 생산할 것이다.
론자 GS 시스템. 론자 GS 시스템은 벡터들 pEE12.4 및 pEE6.4를 활용한다. 벡터 pEE12.4는 증폭 가능한 선택 마커로서 GS 유전자를 함유하고, pEE6.4는 보충적 벡터이다. 라이트 체인은 벡터들 중 하나에서 클로닝 될 것이고 헤비 체인은 다른 벡터에서 될 것이다. 그 후에, 두 벡터들 모두는 제한 효소들로 절단되고 서로 라이게이션되어 서로 다른 프로모터들 상에서 헤비 및 라이트 체인 유전자들 모두를 발현할 수 있는 단일 벡터를 형성한다. 그러므로, 듀얼-발현 벡터 시스템이고, 단일 벡터로부터 두 유전자의 발현을 가능케 한다. CHO 세포들은 메티오닌 설폭시민(methionine sulfoximine)의 선택하에서 듀얼-발현 벡터로 트렌스펙션 된다. 트렌스펙션된 세포들은 따라서 선택된다.
유전자 증폭
디하이드로폴레이트 레덕타아제(DHFR) 및 GS 모두는 증폭가능한 선택 마커들이다. 증가하는양의 메토트렉사트 및 메티오닌 설폭시민 각각으로부터 온 선택 압력하에서, DHFR 및 GS 유전자들을 함유하는 유전체 부위들을 복제한 트렌스펙션된 세포주들은 그들이 선택 시약들에 대해 더욱 내성이 있기 때문에 생존 할 것이다. 삽입된 헤비- 및 라이트-체인 면역글로불린 유전자들과 같은 유전자들 근처에 있는 선택 마커들은 또한 증폭되고, 더 높은 유전자 카피들 및 면역글로불린들의 더 큰 생산율을 야기한다. 시험관 내 스크린(하기를 인용)에서 중화 성질들을 갖는 것으로 발견된 항체들을 생산하는 클론들은 증폭되고 그리하여 차후의 생체 내 연구들을 위해 더 많은 항체들은 수득 될 수 있다.
실시예 18: 발현된 인간 항체들의 특이성의 식별
항체 스크리닝은 두 단계들로 발생한다. 우리는 새로운 ‘선택적 스크리닝’ 공정을 활용하였고, 이는 우리가 먼저 중화 항체들을 위한 스크린에서 사용되는 적절한 클론 패밀리를 선택하는 것이다. 우리는 항원에 결합하는 그들의 능력을 위해 각 클론 패밀리의 가장 빈번한 1-3 클론들을 스크린한다. 비록 흐름 세포측정법이 세포-결합 항체들을 식별하는데 사용될 수 있다고 하더라도, 우리의 스크린은 전형적으로 간접적 ELISA의 형태를 택한다. 이는 먼저 ELISA 플레이트에 대해 적절한 항원을 결합시키는 단계, 그런 뒤 이를 발현된 항체들을 함유하는 상층액들과 배양하는 단계를 포함한다. 항원에 결합하는 항체들은 특이적 2차 항체에 의해 탐지된다.
일단 결합 항체들이 식별되면, 그 클론의 전체 클론 패밀리는 클로닝되고 ‘선택 스크린’의 스크리닝 단계에서 발현된다. 클론 패밀리 내의 모든 항체들이 동일한 에피톱에 결합하는 것으로 예상된다 하여도, 그들은 항원 결합에 대한 결합력(avidity) 및 그들의 항원 위로의 위치결정(positioning)에서 조금 다를 수 있고, 그 차이들은 결합 성질들 및/또는 항체의 중화 능력에 영향을 줄 수 있고; 따라서, 대부분의 경우에서, 여러 개의 서로 다른 항체들(그들의 CDR3부위들에서 작은 차이를 포함하는)은 결합 및 중화 성질들을 위해서 발현되고 스크리닝 된다.
특이적 리간드/수용체 페어를 표적하는 중화 항체들을 위해, 293T세포들을 먼저 안정하게 NF-kB 전사 반응 요소들에 링크된 루시퍼라아제 유전자를 함유하는 플라스미드와 같은 신호전달경로 리포터 구조체(signaling pathway reporter construct)로 트렌스펙션한다. 트렌스펙션된 세포 내에서 NF-kB의 활성화는 루시퍼라아제의 발현을 유도하고, 그 수준들은 루시퍼라아제 검정법에서 결정될 수 있다. 이는 리간드-리포터 결합에 의해 NF-kB 신호 활성화된 것을 측정한다. 대부분의 신호 이벤트들은 NF-kB를 활성화시키므로 NF-kB는 선택의 신호 요소이다. 다른 신호전달 경로를 검정하는 것을 위해, 루시퍼라아제 유전자 프로모터 부위는 예를 들어, AP-1을 위한 것과 같은 적절한 전사성 결합 자리를 함유한다. 다음으로, 293T 세포들을 표적 수용체로 트렌스펙션한다. 293T 세포들을 그런 뒤 리간드 및 관심 결합 항체들과 함께 96-웰 플레이트들 내에서 배양한다. 24 또는 48시간 후에, 루시퍼라아제 검정법을 루시퍼라아제 유전자의 발현을 결정하기 위해 수행한다. 중화 항체들을 가지는 웰들은 루시퍼라아제 발현이 없는 것에서 최소가 된다. 결과들은 NF-kB 신호전달 경로 내에서 인산화된(phosphorylated) 신호 단백질들에 대한 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 확인된다. 중화 항체는 리간드-수용체 신호를 예방하고; 및 그 결과로 신호 단백질들의 인산화를 제거한다.
암 항원들 및 박테리아성 항원들과 같은 생존 세포들 상에 존재하는 항원들을 위해, 실험관 내 중화 검정법은 생존/사망 세포들을 탐지하는 검정법의 형태로 택하였고, 고처리 방식에서 수행될 수 있다. 암세포들 또는 박테리아를 96-웰 플레이트들에서 후보 항체와 함께 배양하였다. 염색은 생존과 사망 세포들을 구별하고 그런 뒤 각 웰에 적용될 수 있는 흐름 세포측정법과 호환가능하다. 생존 및 사망 세포들은 서로 다른 형광단으로 염색되며 흐름을 사용하여 스크리닝되고 생존 및 사망 세포들의 백분율을 부여한다. 시험관 내 스크린을 통과한 항체들은 그런 뒤 중화 활성를 위해 생체 내 스크리닝 될 것이다.
바이러스 시험관 내 중화 검정법은 표준 플라크 중화 검정법을 사용하여 수행될 수 있다. 96-웰 플레이트들 내에서 플라크 중화 검정법들을 수행하는 것에 의해서, 각 웰은 현미경을 사용하여 이미지화 될 수 있으며 플라크 카운팅(counting)은 이미지-분석 소프트웨어로 자동화 될 수 있다. 중화 항체들은 플라크 형성을 감소시킨다. 이러한 항체들은 그런 뒤 중화 활성을 위해 더욱 생체 내 스크리닝된다.
ELISA(실시예 7) 및 흐름 세포측정법(실시예들 9 및 10)을 사용하는 결합 활성의 성공적인 검정법을 위해 실시예 9 섹션의 “플루존 ELISA”, 실시예 11 섹션의 “흐름 세포측정법…” 및 실시예 12 섹션의 “스태필로코커스 흐름 세포측정법”을 인용한다.
실시예 19: 웰당 하나 초과의 세포와 B세포들의 시퀀싱
다중 B세포들을 가지는 개별적인 샘플들을 독립적으로 용기들 내에서 역전사 한다. 역전사는 모든 1st 가닥 cDNA에 샘플-ID 및 5’범용 프라이머 부위를 첨가한다. 용기들의 세트의 모든 용기들로부터 얻은 cDNA를 모드고, 2라운드의 PCR을 겪게한다. 단계들은 재료 및 방법내의 “터치다운 PCR 및 비-터치다운 PCR”, “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재되어 있는 것과 같다. 프라이머들을 위한 서열들은 또한 도 9에 나타낸다. 어떤 유전자가 증폭되는지와 무관하게, 포워드 프라이머들은 불변으로 남는다는 것을 유의한다(b). RT 및 2PCRs 후에, 모든 용기 세트들로부터 얻은 앰프리콘들은 모아지고 454-시퀀싱된다. 웰들에 대한 할당 및 서열들의 조립은 재료 및 방법 내의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 조립”에 기재된 프로토콜을 따른다. 플레이트-IDs 및 샘플-IDs의 조합은 동일한 샘플로부터 비롯된 서열들의 식별을 가능케 한다.
비록 웰 내에 다중 세포들이 있다고 하더라도, 우리는 개별적인 헤비 체인들을 라이트 체인들로 페어링할 수 있다. 공통 선조들로부터 유래된 B 세포들로부터 얻은 헤비 체인들은 클론에 의하여 관련되어 있을 것이고, 라이트 체인들도 마찬가지일 것이다. 그러므로, 우리는 웰들에 걸친 연관성을 관찰하는 것에 의해 헤비 체인 클론 패밀리와 라이트 체인 클론 패밀리를 연관시킬 수 있다. 한번 클론 패밀리의 헤비 체인들 및 클론 패밀리의 라이트 체인들 간에 연관이 확립되면, 헤미 체인 클론 패밀리의 멤버인 헤비 체인 및 라이트 체인 클론 패밀리의 멤버인 라이트 체인을 선택하는 것에 의해 각 웰에 페어들이 할당된다. 오직 헤비 체인 패밀리의 단일 예 및 라이트 체인 패밀리의 단일 예 만이 웰에 존재할 때 페어의 선택은 명백하다. 어떤 헤비 및 라이트 체인들이 서로 연관되어 있는지 결정한 후에, 진화계통수들을 그릴 수 있고 항체들을 그들의 기능적 성질들의 하류 특성화를 위해서 선택할 수 있다.
실시예 20: 웰 당 하나이상의세포들과 B세포들의시퀀싱
샘플들은 어떤 플레이트들 내에서 웰 당 하나의 B세포, 및 다른 플레이트들에서는 웰 당 다중 B세포들로 분류 될 수 있고, 그러나 헤비 및 라이트 체인들은 하나 초과의 B세포를 가지는 그러한 웰들에 대해 여전히 페어링 될 수 있다. 우리는 상기 실시예 9의 독감 백신화 환자들로부터 생성된 서열들을 실험하였고, 어떤 웰들이 하나 초과의 별개인 헤비 체인 서열 어셈블리 또는 하나 초과의 별개인 라이트 체인 서열 어셈블리를 가졌던 것이 관찰되었다. RT, PCR, 시퀀싱 및 웰들에 대한 할당 및 서열들의 어셈블리는 상기 실시예 9의 프로토콜을 따랐다. 어떤 헤비 및 라이트 체인들이 서로와 연관되어 있는지 결정하기 위해, 헤비 체인들을 V 유전자 절편의 말단과 J 유전자 절편의 시작(beginning) 사이의 뉴클레오티드들의 동일한 숫자, 및 동일한 V 및 J 유전자 유용성을 가지는 모든 헤비 체인들을 그룹핑하는 것에 의해 클론 패밀리들로 할당하였다. 라이트 체인들을 V 유전자 절편의 말단과 J 유전자 절편의 시작(beginning) 사이의 뉴클레오티드들의 동일한 숫자, 및 동일한 V 및 J 유전자 유용성을 가지는 모든 라이트 체인들을 그룹핑하는 것에 의해 클론 패밀리들로 할당하였다. 헤비 및 라이트 체인들 간의 페어링 관계들을 먼저 웰을 공유하는 그들을 근거로 하여, 정확히 하나의 헤비 체인 및 하나의 라이트 체인을 가지는 웰들에 할당하였다(즉, 동일한 합성 바코드들을 가지는). 그런 뒤, 라이트 체인 클론 패밀리와 헤비 체인 클론 패밀리의 각 가능한 페어링에 대해 점수를 계산하였다. 상기 점수를 웰을 공유하는 라이트 체인 패밀리 및 헤비 체인 패밀리의 멤버의 회수를 계산하는 것에 의해 결정하였다. 그런 뒤, 각 헤비 체인 패밀리를 어느 것이 가장 높은 점수를 달성했는지로 라이트 체인 패밀리와 연관시키거나, 또는 하나 초과의 라이트 체인 패밀리로 가장 높은 점수가 달성되지 않았다면 헤비 체인 패밀리를 라이트 체인과 연관시키지 않았다. 그런 뒤 개별적인 헤비 및 라이트 체인들을 종합적인 가장 높은-점수(scoring)기록하는 헤비 체인 패밀리를 시작으로, 페어 할당 패밀리들을 통해 웰마다 진행하고, 그런 뒤 다음 헤비 체인 패밀리로 계속하는 것에 의해 페어링하였다. 각 웰에 대해 주어진 헤비 체인 패밀리에 대해, 헤비 체인 패밀리의 멤버인 웰 내의 단일 헤비 체인이 있었다면, 그 헤비 체인 패밀리의 관련된 라이트 체인 패밀리들에 속했던 그 웰로부터 얻은 라이트 체인들을 그 헤비 체인의 페어가 되도록 할당하였다. 이러한 하나 초과의 라이트 체인이 존재했다면, 어떤 페어링도 할당되지 않는다. 헤비 체인들과 라이트 체인들을 연관시키는 이 공정을 그러한 패밀리들 내의 모든 패밀리들 및 모든 체인들이 고려되었을 때까지 계속하였다. 주어진 헤비 및 라이트 체인에 대해, 만약 공정들이 페어링에 대해서 하나 초과의 후보들을 야기했다면, 헤비 및 라이트 체인 모두를 폐기하였다. 진화계통수들을 페어링된 체인들, 및 그들의 기능적 성질들의 하류 특성화를 위해 선택된 항체들로부터 생성하였다. 진화계통수의 부분은 도 25a에 나타낸다.
실시예 21: 인간 단일클론 항체들을 생성하는 분류된 형질아세포들의 사용
최근 또는 현재 급성, 아급성, 또는 순환하는 형질아세포의 계속중인 생성을 갖는 대상들로부터, 흐름 세포측정법을 말초 혈액(전혈 또는 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs)) 상에서 형질아세포 개체군을 식별하는데 수행하였다. 이 B세포들의 개체군은 그런 뒤 흐름 세포측정법에 의해서 RNAse 억제제를 가지는 저장성(hypotonic) 버퍼를 함유하는 웰들 내의 단일 웰들로서 분류하였다. 분류된 세포들을 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT 중에, 웰-특이적 샘플-ID 어댑터 올리고뉴클레오티드들을 반응에 첨가하였다. 이러한 어댑터들은 서로 다른 웰들로부터 비롯되는 것으로서 서열들을 식별 할 수 있게 하는 웰-특이적 바코드 서열들(샘플-IDs)을 갖는다. 3’ 테일링 및 MMLV H- 역전사효소의 주형-전환 활성에 사용하기 위해, 샘플-IDs를 1st 가닥 cDNA의 3’말단에 첨가하였다. 각 플레이트로부터 얻은 cDNA를 서로 모았다. PCR의 첫 번째 라운드 중에, 플레이트-특이적 FW 롱 프라이머 1은 플레이트-ID를 앰프리콘들의 5’말단에 첨가한다. 따라서, 서로 다른 플레이트-IDs를 갖는 FW 롱 프라이머1은 서로 다른 플레이트들에 첨가되어 각 PCR 생산물에 식별하는 바코드 서열들 부여한다. 유전자 특이적 리버스 프라이머들을 카파, 람다 및 감마 체인들을 증폭하는데 사용하고, 그들은 각각 카파 GSP1, 람다 GSP1 및 감마 GSP1이다. 이러한 프라이머들은 면역글로불린 유전자들의 불변 부위에 결합한다. PCR의 첫 번째 라운드로부터 얻은 생산물들을 희석하고 두 번째 네스티드 PCR을 위해 사용한다. FW 프라이머2를 포워드 프라이머로서 사용하고 리버스 프라이머들 카파, 람다 및 감마 GSP 롱 프라이머들을 그들의 각각의 앰프리콘들을 증폭하는데 사용한다. 특히, 각 플레이트에 대한 GSP 롱 프라이머2는 공통 플레이트 ID를 각 플레이트에 대한 각 앰프리콘의 3’말단에 첨가하고, 따라서 각각은 두 개의 플레이트-IDs 및 샘플-ID 바코드를 갖는 것으로서 끝나게 될 것이다. RT에 대해 더 자세한 것은, 재료 및 방법 내의 “비-터치다운 PCR” 내의 1st 및 2nd PCR 에서 발견된다. 다중 플레이트들은 그런 뒤 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된 방법에 따라서 모아지고 고처리 454 DNA 시퀀싱에 적용되고 개별적인 서열들은 식별자로 역할하는 그들의 바코드들로 식별되며 이는 헤비 및/또는 라이트 체인이 각 웰로부터 수득되고 따라서 재료 및 방법 내의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기술된 방법들에 따라, 동일한 초기 세포로부터 유래된 개별적인 가변 헤비 및 라이트 체인들을 매칭하기 위한 가이드를 제공한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다(도 6-8을 인용).
오리진(origin )의 특정한 세포들로부터 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 실시예 8에 있는 대로 목적하는 성질들의 스크리닝을 위해 클로닝 및 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 어떻게 이것이 수행되었는지를 인플루엔자-백신화된 인간으로부터 얻은 단일 세포 분류된 형질아세포들로부터 얻은 헤모글루티닌에 대한 인간 단일클론 항체를 수득하는 본 명세서의 조성물들 및 방법들을 사용하여 증명한다.
실시예 22: 인간 단일클론 항체들을 생성하는 분류된 편향되지 않은(unbiased) 또는 항원-특이적인 기억 B세포들의 사용
관심 항원에 노출된 것으로 기록되거나 의심되는 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 상에 기억 B세포 개체군(CD19+CD20+CD27+로 정의된)을 식별하는데 수행하였다. 추가적으로, 관심 항원들에 대해 특이적인 기억 B세포들은 또한 말초 혈액 또는 PBMCs를 기억 B세포 표면 마커들 및 형광단-접합 항원(들)(CD19+CD20+CD27+antigen+)로 염색하는 것에 의해 분류될 수 있다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립한다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 실시예 8에 있는대로 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 클로닝 및 발현은 실시예 8에 상세히 기재된 대로 수행한다. 일단 트렌스펙션되면, 전체 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 초기에 분류된 세포의 특이성을 반복하는 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 23: 인간 단일클론 항체들을 생성하는 분류된 편향되지 않은 또는 항원-특이적 총 B세포들의 사용
관심 항원에 사전 노출된 것으로 기록되거나 또는 의심되는 대상들 또는 그렇지 않은 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 상에 CD19+ B세포 개체군을 식별하는데 수행하였다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정을 반복한다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립한다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 실시예 8에 있는대로 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 일단 트렌스펙션되면, 전체 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 초기에 분류된 세포의 특이성을 반복하는 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 24: 인간 단일클론 항체들을 생성하는 형질 세포들의 사용
관심 항원에 사전 노출된 것으로 기록되거나 또는 의심되는 대상들 또는 그렇지 않은 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 또는 골수 세포들 상에 CD138+ 형질 세포 개체군을 식별하는데 수행하였다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립한다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 일단 트렌스펙션되면, 전체 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 초기에 분류된 세포의 특이성을 반복하는 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 25: 인간 단일클론 항체들을 생성하는 블라스팅 B세포들의 사용
관심 항원에 사전 노출된 것으로 기록되거나 또는 의심되는 대상들 또는 그렇지 않은 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 상에 FSChi 블라스팅 B세포 개체군을 식별하는데 수행하였다. 블라스팅 세포들은 활성화 B세포들이며, 그러므로 항원에 대해 반응한 세포들이며 활발히 증식한다. 이러한 B세포들은 클론 패밀리들로 구성되고 그들의 페어링된 헤비 및 라이트 체인들은 진화계통수들을 수득하는데 사용될 수 있다. CD69hi 및 CD44hi 와 같은 B세포 활성화의 다른 마커들은 또한 접합(conjunction)에서 사용될 수 있다. 추가적으로 SYTO 블루 (Invitrogen)와 같은 세포 투과성 DNA 염색제(stains)를 사용하여 염색될 수 있고 세포 주기 내에서 활성화되고 증식하는 세포들을 결정하는 DNA 내용물(content)은 또한 블라스팅 B세포들을 기술하는(delineate) 데에 함께 사용될 수 있다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립한다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 일단 트렌스펙션되면, 전체 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 초기에 분류된 세포의 특이성을 반복하는 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 26: 단일클론 항체들을 생성하는 뮤린 B세포들의 사용
뮤린 B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 뮤린 B세포들은 혈액 또는 지라세포(splenocytes)들 또는 골수로부터 수득될 수 있다. 흐름 세포측정법을 CD19+ 및 B220+ B세포들을 수득하는데 수행하였다. 이 B세포들의 개체군을 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류한다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR을 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR”에 기재된대로 수행한다. 마우스 유전자-특이적 프라이머들은 표 11에 나타내고 RT 및 PCR을 위해 사용된 다른 프라이머들은 표 1에 나타낸다. 그런 뒤 다중 플레이트들을 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된 방법에 따라 모으고 고처리 454 DNA 시퀀싱에 적용하고 개별적인 서열들을 각 웰로부터 수득된 헤미 및/또는 라이트 체인인 식별자들로서 역할하는 그들의 바코드들로 식별하고 따라서 재료 및 방법 내의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기술된 방법들에 따라, 동일한 초기 세포로부터 유래된 개별적인 가변 헤비 및 라이트 체인들을 매칭하기 위한 가이드를 제공한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
클로닝을 위한 서열들은 합성 유전자(synthetic gene) 합성으로부터 수득되거나 또는 클로닝 프라이머들을 사용하는 1st PCR 생산물들로부터 증폭될 수 있다. 포워드 클로닝 프라이머는 샘플-ID 특이적이고 앰프리콘의 풀로부터 얻은 특이적 서열들을 증폭할 수 있다. 각 헤비 및 라이트 체인을 위한 서열을 그런 뒤 클로닝 프라이머들에 의해 도입된 이러한 것들을 위한 상보적인 제한 자리들을 함유하는 발현 벡터 내에서 클로닝한다. 벡터들은 또한 헤비 또는 라이트 체인 불변 부위를 포함하고, 헤비 또는 라이트 체인 서열들은 전체 항체를 생산하는 (할당된 리딩 프레임) 내에서 클로닝 된다. 벡터들은 헤비 및 라이트 체인 클론들을 포함하고 그런 뒤 포유류 발현 시스템 또는 대안적인 것 안으로 듀얼 트렌스펙션 되고, 앰프리콘들 모두는 듀얼 발현 벡터 내에서 클로닝 될 수 있으며 포유류 세포들 내에서 단일 트렌스펙션을 가능케 한다.
오리진의 특정한 세포들로부터(particular cells of origin) 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 상기의 목적하는 성질들을 스크리닝을 위해 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 27: 단일클론 항체들을 생성하는 뮤린 형질세포들의 사용
뮤린 B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 뮤린 형질세포들은, 비록 지라세포들 및 골수가 전형적으로 사용되지만 혈액 또는 지라세포(splenocytes)들 또는 골수로부터 수득될 수 있다. 흐름 세포측정법을 CD19low/-B220low/-CD138+ 형질세포들을 수득하는데 수행하였다. 이 형질세포들의 개체군을 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류한다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR을 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR”에 기재된대로 수행한다. 마우스 유전자-특이적 프라이머들은 표 11에 나타내고 RT 및 PCR을 위해 사용된 다른 프라이머들은 표 1에 나타낸다. 그런 뒤 다중 플레이트들을 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된 방법에 따라 모으고 고처리 454 DNA 시퀀싱에 적용하고 개별적인 서열들을 각 웰로부터 수득된 헤미 및/또는 라이트 체인인 식별자들로서 역할하는 그들의 바코드들로 식별하고 따라서 재료 및 방법 내의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기술된 방법들에 따라, 동일한 초기 세포로부터 유래된 개별적인 가변 헤비 및 라이트 체인들을 매칭하기 위한 가이드를 제공한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
클로닝을 위한 서열들은 합성 유전자(synthetic gene) 합성으로부터 수득되거나 또는 실시예 26에 기재된 대로 클로닝 프라이머들을 사용하는 1st PCR 생산물들로부터 증폭될 수 있다. 오리진의 특정한 세포들로부터(particular cells of origin) 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 상기의 목적하는 성질들을 스크리닝을 위해 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 28: 단일클론 항체들을 생성하는 편향되지 않은 또는 항원-특이적 뮤린 기억 B세포들의 사용
뮤린 B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 뮤린 기억 B세포들은 전형적으로 지라세포들 또는 림프 절들에서 수득될 수 있다. 흐름 세포측정법을 CD19+ 또는 B220+ 및 CD38+IgG+ 기억 B세포들을 수득하는데 수행하였다. CD45RO와 같은 다른 마커들 또한 사용될 수 있다. 항원-특이적 기억 B세포들은 또한 형광단-접합 항원으로 염색하는 것에 의해 시각화 될 수 있고 분류된다. 이 기억 B세포들의 개체군을 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류한다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR, 그 후에 시퀀싱, 웰들에 대한 서열의 할당, 및 서열 어셈블리를 실시예 26에 기재된 대로 수행한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
클로닝을 위한 서열들은 합성 유전자(synthetic gene) 합성으로부터 수득되거나 또는 실시예 26에 기재된 대로 클로닝 프라이머들을 사용하는 1st PCR 생산물들로부터 증폭될 수 있다. 오리진의 특정한 세포들로부터(particular cells of origin) 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 상기의 목적하는 성질들을 스크리닝을 위해 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 3 및 9 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 29: 단일클론 항체들을 생성하는 짧은시간-생존하는 형질아세포들의 사용
뮤린 B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 뮤린 짧은시간-생존하는 형질아세포들은 전형적으로 지라세포들에서 수득될 수 있다. 이러한 형질하세포들은 CD19low/-B220low/- 및 CD22low 또는 CD11c+, 및 또한 CD138+로서 다양하게 설명된다. 흐름 세포측정법을 형질아세포들을 수득하는데 수행하였다. 이 형질아세포들의 개체군을 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류한다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR, 그 후에 시퀀싱, 웰들에 대한 서열의 할당, 및 서열 어셈블리를 실시예 26에 기재된 대로 수행한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
클로닝을 위한 서열들은 합성 유전자(synthetic gene) 합성으로부터 수득되거나 또는 실시예 26에 기재된 대로 클로닝 프라이머들을 사용하는 1st PCR 생산물들로부터 증폭될 수 있다. 오리진의 특정한 세포들로부터(particular cells of origin) 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 상기의 목적하는 성질들을 스크리닝을 위해 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 30: 단일클론 항체들을 생성하는 뮤린 블라스팅 B세포들의 사용
뮤린 B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 뮤린 블라스티이 B세포들은 전형적으로 지라세포들로부터 수득될 수 있다. 플라스팅 세포들은 활성화 B세포들이며, 그러므로 항원에 대해 반응한 세포들이고 활발히 증식한다. 이러한 B세포들은 클론 패밀리들로 구성되고 그들의 페어링된 헤비 및 라이트 체인들은 진화계통수들을 수득하는데 사용될 수 있다. 블라스팅 B세포들은 FSChi로서 게이트될 수 있고, 그리고 또한 CD44hi CD69hi와 같은 세포 표면 마커들을 통해 더 식별 될 수 있으며 블라스팅 B세포들은 증식하므로, 그들은 또한 SYRO 블루와 같은 세포 투과성 DNA 염색제에 의하여 염색되는 것으로서 DNA 내용물들이 증가되는 것에 의해 세포 주기로 들어가는 것으로서 식별 될 수 있다. 흐름 세포측정법을 블라스팅 B세포들을 수득하는데 수행한다. 이 형질아세포들의 개체군을 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류한다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR, 그 후에 시퀀싱, 웰들에 대한 서열의 할당, 및 서열 어셈블리를 실시예 26에 기재된 대로 수행한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
클로닝을 위한 서열들은 합성 유전자(synthetic gene) 합성으로부터 수득되거나 또는 실시예 26에 기재된 대로 클로닝 프라이머들을 사용하는 1st PCR 생산물들로부터 증폭될 수 있다. 오리진의 특정한 세포들로부터(particular cells of origin) 얻은 후보 헤비 및 라이트 체인 유전자들을 그런 뒤 상기의 목적하는 성질들을 스크리닝을 위해 발현시킨다. 일단 안정하게 또는 일시적으로(transiently) 트렌스펙션되면, 페어링된 헤비 및 라이트 체인들의 발현은 처음에 분류된 세포의 특이성을 반복하는(recapitulating) 단일클론 항체들의 생성을 야기할 것이다. 분비된 항체들을 함유하는 상층액들을 그런 뒤 관심 표적 항원에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성(functionality)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 목적하는 성질들을 위해 스크리닝 한다. 도 3 및 9 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 31: 편향되지 않은 또는 항원-특이적 인간 IgA+ B세포들로부터 단일클론 항체들의 수득
관심 항원에 노출된 것으로 기록되거나 의심되는 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 또는 골수 상에 IgA+ B세포들을 분리하는데 수행하였다. 이러한 B세포들은 기억 B세포들, 형질 세포들, 또는 형질아세포들일 수 있다. 이러한 IgA+ B세포들은 또한 항원-특이적일 수 있고, IgA+ B세포들에 대해 염색하는 형광단-접합 항원들을 사용하여 항원-양성 B세포들을 분류하는 것에 의해 그러 할 수 있다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립하고, PCR을 위해 사용된 IgA 불변 부위 특이적 프라이머들은 표 10에 있다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 실시예 8에 있는대로 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 32: 편향되지 않은 또는 항원-특이적 인간 IgM+ B세포들로부터 단일클론 항체들의 수득
관심 항원에 노출된 것으로 기록되거나 의심되는 대상들로부터, FACS를 말초 혈액(전혈 또는 분리 말초 혈액 단핵구 세포들, PBMCs) 또는 골수 상에 IgM+ B세포들을 분리하는데 수행하였다. 이러한 B세포들은 기억 B세포들, 형질 세포들, 또는 블라스팅 B세포들 일 수 있다. 이러한 IgM+ B세포들은 또한 항원-특이적일 수 있고, IgM+ B세포들에 대해 염색하는 형광단-접합 항원들을 사용하여 항원-양성 B세포들을 분류하는 것에 의해 그러 할 수 있다. 이 세포들의 개체군은 그런 뒤 FACS에 의하여 단일 세포들 또는 다중 세포들로 웰들 내에 분류된다. 실시예 21에 자세히 기재된 공정은 반복되어 454 시퀀싱으로부터 서열들을 바코드하고 수득하고 웰들에 서열들을 할당하고 서열들을 조립하고, PCR을 위해 사용된 IgM 불변 부위 특이적 프라이머들은 표 10에 있다. 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 VDJ 유전자 유용성 및 실시예 8에 있는대로 클로닝 및 발현을 위해 선택된 진화계통수 상의 각 클론 패밀리의 어느 정도의 멤버들을 식별하는데 사용한다. 항체들을 함유하는 상층액들은 관심 표적 항원(들)에 대한 항원 특이성뿐만 아니라 적절한 기능적 검정법들에 의한 기능성을 위해 스크리닝 될 것이다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 일반적 방법론의 한 예를 제공한다. 도 26-27은 진화계통수들로부터 선택된 클로닝된 및 발현된 항체들의 기능적 특성화로부터 인간 단일클론 항체들을 수득하는 다른 예시를 제공한다.
실시예 33: 편향되지 않은 또는 항원-특이적 뮤린 IgA+ B세포들로부터 단일클론 항체들의 수득
뮤린 IgA+ B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 이러한 B세포들은 기억 B세포들, 형질 세포들, 형질 아세포들 또는 블라스팅 B세포들 일 수 있고, 전형적으로 지라세포들로부터 수득 될 수 있다. 이러한 IgA+ B세포들은 또한 항원-특이적일 수 있고, IgA+ B세포들에 대해 염색하는 형광단-접합 항원들을 사용하여 항원-양성 B세포들을 분류하는 것에 의해 그러 할 수 있다. 이 IgA+ B세포들의 개체군은 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류된다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR, 그 후에 시퀀싱, 웰들에 대한 서열의 할당, 및 서열 어셈블리를 실시예 26에 기재된 대로 수행하고, PCR을 위해 사용된 IgA 불변 부위 특이적 프라이머들은 표 11에 있다. 그런 뒤 진화계통수들을 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다.
실시예 34: 편향되지 않은 또는 항원-특이적 뮤린 IgM+ B세포들로부터 단일클론 항체들의 수득
뮤린 IgM+ B세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. 이러한 B세포들은 기억 B세포들, 형질 세포들, 형질 아세포들 또는 블라스팅 B세포들 일 수 있고, 전형적으로 지라세포들로부터 수득 될 수 있다. 이러한 IgM+ B세포들은 또한 항원-특이적일 수 있고, IgM+ B세포들에 대해 염색하는 형광단-접합 항원들을 사용하여 항원-양성 B세포들을 분류하는 것에 의해 그러 할 수 있다. 이 IgA+ B세포들의 개체군은 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포로서 분류된다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR, 그 후에 시퀀싱, 웰들에 대한 서열의 할당, 및 서열 어셈블리를 실시예 26에 기재된 대로 수행하고, PCR을 위해 사용된 IgA 불변 부위 특이적 프라이머들은 표 11에 있다. 그런 뒤 진화계통수들을 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다. 도 9 및 6 각각은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다.
실시예 35: 인간 T 세포들로부터 하나 초과의 서열의 시퀀싱
최근 또는 현재 급성, 아급성, 또는 순환하는 T 세포들의 계속중인 생성을 갖는 대상들로부터, 흐름 세포측정법을 말초 혈액(전혈 또는 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs)) 상에서 관심 T 세포 개체군을 식별하는데 수행하였다. 이 T 세포들의 개체군은 활성화 T 세포들 또는 블라스팅 T 세포들일 수 있다. 활성화 T 세포들은 CD44hi, CD69hi, CD154+, CD137+ 또는 블라스팅 T 세포들을 사용하여 식별될 수 있고, 이들은 또한 그들의 크기 또는 FSChi에 의해서 기술될 수 있고, 그리고 또한 SYTO 블루와 같은 세포 투과성 DNA 염료를 사용하여 세포 주기 내 있는 것으로서 식별 될 수 있는 활성화 T 세포들이다. 활성화 T 세포들은 클론 패밀리들로 구성되어야 하고 그런 후 이는 진화계통수 내에서 클러스터링 될 수 있고, 클론 패밀리들 내의 동일한 패밀리 멤버들을 가지며, 이는 하류 기능적 분석을 위해 클론들을 선택할 수 있다. T 세포들은 그런 뒤 흐름 세포측정법에 의해서 RNAse 억제제를 가지는 저장성(hypotonic) 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포들로서 분류된다. 분류된 세포들을 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT 및 TCR 유전자들을 바코드하는 PCR은 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR”에 기재되어 있고, 시퀀싱 준비(prep)는 재료 및 방법의 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재되어 잇고, 웰들에 대한 서열들의 할당 및 리드들의 어셈블리는 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기재되어 있고, TCR 유전자-특이적 프라이머들은 표 10에 나타낸다. 그런 뒤 진화계통수들을 구성하고 그런 뒤 오리진의 특정 세포들로부터 얻은 후보 유전자들을 목적하는 성질들의 스크리닝을 위해 클로닝 및 발현 하는데 선택한다. 클로닝을 위한 서열들은 유전자-합성될 수도 있고 또는 클로닝 프라이머들을 갖는 1st PCR 생산물로부터 증폭될 수 있다. 특이적 클론들은 클론들의 풀(pool)로부터 샘플-ID 바코드 서열에 특이적인 포워드 클로닝 프라이머를 갖는 것에 의해 분리될 수 있다. 리버스 클로닝 프라이머들은 적절한 유전자에 대해 상보적이다. 포워드 및 리버스 프라이머들 모두는 플랭킹 제한 자리들을 함유하고 벡터 내로 클론(배열된 프레임을 코딩하는(coding frame aligned))을 통합시킨다. 세포들은 각각이 관심 유전자를 함유하는 두 개의 발현 벡터들로 이중으로 트렌스펙션되거나 또는 예를 들어, T 세포 알파 및 베타 체인들과 같은 관심 유전자들 모두를 발현하는 듀얼 발현 벡터에 의해 단일로 트렌스펙션된다.
일단 안정하게 또는 일시적으로 트렌스펙션되면, 관심 유전자들은 발현될 수 있고 목적하는 스크린들을 사용하여 기능 성질들을 위해 스크리닝 될 수 있다.
실시예 36: 뮤린 T 세포들로부터 얻은 하나 초과의 서열의 시퀀싱
뮤린 T 세포들을 수득하기 위해 마우스를 희생시키기 전에, 마우스를 관심 항원으로 대항시키고, 부스터 샷을 여러 번 부여할 수 있다. T 세포들은 CD3+이고, 헬퍼 T 세포들은 CD4+ 이고 세포독성 T 세포들은 CD8+이다. 이러한 T 세포들의 개체군은 기억 또는 활성화 T 세포들 또는 블라스팅 T 세포들일 수 있다. 기억 T 세포들은 CD45RO+로서 식별 될 수 있다. 활성화 T 세포들은 CD44hi, CD69hi, 또는 블라스팅 T 세포들을 사용하여 식별 될 수 있고, 이들은 또한 그들의 크기 또는 FSChi에 의해서 기술될 수 있고, 그리고 또한 SYTO 블루와 같은 세포 투과성 DNA 염료를 사용하여 세포 주기 내 있는 것으로서 식별 될 수 있는 활성화 T 세포들이다. 반복된 항원 노출 이후에 깨끗한 환경에서 보관된 마우스들 내의 이러한 모든 T 세포들은 클론 패밀리들의 큰 분획을 가져야 하고 그런 뒤 이는 진화계통수로 디스플레이 될 수 있고, 그런 뒤 클로닝 및 발현 및 하류 기능적 분석을 위해 TCRs를 선택하는데 사용될 수 있다.
T 세포들은 흐름 세포측정법에 의해서 제안된 마커들을 사용하여 RNAse 억제제를 가지는 저장성(hypotonic) 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포들로서 분류된다. 분류된 세포들을 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT 및 TCR 유전자들을 바코드하는 PCR은 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR”에 기재되어 있고, 시퀀싱 준비(prep)는 재료 및 방법의 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재되어 잇고, 웰들에 대한 서열들의 할당 및 리드들의 어셈블리는 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기재되어 있고, TCR 유전자-특이적 프라이머들은 표 11에 나타낸다. 그런 뒤 진화계통수들을 구성하고 그런 뒤 오리진의 특정 세포들로부터 얻은 후보 유전자들을 목적하는 성질들의 스크리닝을 위해 클로닝 및 발현 하는데 선택한다. 클로닝을 위한 서열들은 유전자-합성될 수도 있고 또는 클로닝 프라이머들을 갖는 1st PCR 생산물로부터 증폭될 수 있다. 특이적 클론들은 클론들의 풀(pool)로부터 샘플-ID 바코드 서열에 특이적인 포워드 클로닝 프라이머를 갖는 것에 의해 분리될 수 있다. 리버스 클로닝 프라이머들은 적절한 유전자에 대해 상보적이다. 포워드 및 리버스 프라이머들 모두는 플랭킹 제한 자리들을 함유하고 벡터 내로 클론(배열된 프레임을 코딩하는(coding frame aligned))을 통합시킨다. 세포들은 각각이 관심 유전자를 함유하는 두 개의 발현 벡터들로 이중으로 트렌스펙션되거나 또는 예를 들어, T 세포 알파 및 베타 체인들과 같은 관심 유전자들 모두를 발현하는 듀얼 발현 벡터에 의해 단일로 트렌스펙션된다.
일단 안정하게 또는 일시적으로 트렌스펙션되면, 관심 유전자들은 발현될 수 있고 목적하는 스크린들을 사용하여 기능 성질들을 위해 스크리닝 될 수 있다.
실시예 37: 샘플로부터 하나 초과의 서열의 시퀀싱
관심 핵산들을 포함하는 단일 샘플이 식별된다. 단일 샘플은 단일 세포 또는 세포들의 개체군을 가질 수 있다. 샘플은 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포들로서 분류될 수 있다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. B세포들의 이 개체군은 그런 뒤 흐름 세포측정법을 사용하여 RNAse 억제제를 갖는 저장성 버퍼를 함유하는 웰들 안으로 단일 세포들로서 분류된다. 분류된 세포들은 이때 동결시키거나 또는 cDNA를 생성하는 RT-PCR을 위해 사용하기 직전에 동결시킬 수 있다. RT, 1st 및 2nd PCR을 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR”에 기재된 대로 수행한다. 그런 뒤 다중 플레이트들을 “454 XLR70 시퀀싱 런을 위한 준비”에 기재된 방법에 따라 모으고 고처리 454 DNA 시퀀싱에 적용하고 개별적인 서열들을 각 웰로부터 수득된 헤미 및/또는 라이트 체인인 식별자들로서 역할하는 그들의 바코드들로 식별하고 따라서 재료 및 방법 내의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리”에 기술된 방법들에 따라, 동일한 초기 세포로부터 유래된 개별적인 가변 헤비 및 라이트 체인들을 매칭하기 위한 가이드를 제공한다. 진화계통수들을 그런 뒤 그리고 클로닝, 발현 및 기능적 활성의 결정을 위해 항체들을 선택한다.
그런 뒤 오리진의 특정한 세포들로부터 얻은 후보 유전자들을 클로닝시키고 목적하는 성질들 또는 다른 필요들 의 스크리닝을 위해 발현시킨다. 클로닝을 위한 서열들은 유전자-합성될 수도 있고 또는 클로닝 프라이머들을 갖는 1st PCR 생산물로부터 증폭될 수 있다. 특이적 클론들은 클론들의 풀(pool)로부터 샘플-ID 바코드 서열에 특이적인 포워드 클로닝 프라이머를 갖는 것에 의해 분리될 수 있다. 리버스 클로닝 프라이머들은 적절한 유전자에 대해 상보적이다. 포워드 및 리버스 프라이머들 모두는 플랭킹 제한 자리들을 함유하고 벡터 내로 클론(배열된 프레임을 코딩하는(coding frame aligned))을 통합시킨다. 세포들은 각각이 관심 유전자를 함유하는 두 개의 발현 벡터들로 이중으로 트렌스펙션되거나 또는 예를 들어, T 세포 알파 및 베타 체인들과 같은 관심 유전자들 모두를 발현하는 듀얼 발현 벡터에 의해 단일로 트렌스펙션된다.
일단 안정하게 또는 일시적으로 트렌스펙션되면, 관심 유전자들은 발현될 수 있고 목적하는 스크린들을 사용하여 기능 성질들을 위해 스크리닝 될 수 있다. 도 9 및 6은 이 방법을 수행하는 것을 위한 일반적인 방법론의 한 예를 제공한다.
실시예 38: DNA 합성에 의한 면역글로불린 V(D)J 부위들의 클로닝
목적하는 면역글로불린 라이트 체인 및 헤비 체인 V(D)J 부위들은 발현 벡터들 안에서의 클로닝을 위해 DNA 합성에 의해 인공적으로 생성될 수 있다. 합성을 위해 사용된 서열은 고처리 454 서열들로부터 직접적으로 유래될 수 있으며, 또는 대안적으로 관심 샘플(들) 로부터 얻은 헤비 및 라이트 체인 면역글로불린들을 인코딩하는 cDNA는 추가적인 서열의 확인을 위해 개별적인 샘플 또는 모아진 샘플들로부터 재-시퀀싱 될 수 있으며, 이 서열은 선택된 라이트 체인 및 헤비 체인 V(D)J 부위들을 합성하는데 사용된다. Ig 유전자들의 가변 부위들은 DNA 합성에 의해 클로닝될 수 있고, 합성된 DNA를 제한 효소들 및 표준 분자 생물학을 사용하여 적절한 불변 부위를 함유하는 벡터 안으로 통합시킬 수 있다. 합성 중에, 돌연변이 유발을 목적으로 하지 않는 한 아미노산 서열이 변하지만 않는다면 정확한 뉴클레오티드 서열이 뒤를 따를 필요는 없다. 이는 더 높은 발현 수준들을 야기할 수 있는 코돈 최적화를 가능하게 한다. 이는 또한 클로닝의 목적을 위해서 제한 자리들에 첨가하는 것을 가능하게 한다. 5’UTR과 같은 비-번역된 서열들 및 바코드 서열들은 합성 될 필요없으며 리더 서열들은 또한 더 높은 발현 수준들로 알려진 신호 펩티드 서열들로 교환될 수 있다. 이러한 것은 고처리 리드들과는 매우 다를 수 있으나 발현되었을 때 동일한 아미노산 서열화된 것을 제공하는 Ig 뉴클레오티드 서열을 야기한다.
일 구현예에서, 증폭된 V(D)J 부위들은 벡터들 안으로 삽입되고, 이 벡터는 이미 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에 증폭된 클론들을 삽입하는데 필요한 적절한 제한 자리들과 함께 카파, 람다 또는 감마 불변 부위들을 포함한다. 다른 구현예에서, 전체 가변 부위는 불변 부위와 함께 유전자 합성될 수 있고 발현 및 항체 성질들의 하류 기능적 테스팅(testing)을 위해 발현 벡터들 안으로 클로닝될 수 있다.
실시예 39: 이미 샘플 식별 어댑터 내에 존재하는 제한 자리를 사용하는 것에 의한 면역글로불린 V(D)J 부위들의 클로닝
다른 측면에서, 목적하는 면역글로불린 라이트 체인 및 헤비 체인 V(D)J 부위들은 역전사 중에 첨가된 샘플-ID 어댑터 내에 이미 통합된 제한 자리를 사용하여 클로닝될 수 있다. 이는 PCR 앰프리콘 풀 내에서 웰-ID 바코드의 제한 자리 3’을 갖는 어댑터를 야기한다. 클로닝 프라이머들로 클로닝 중에, 목적하는 앰프리콘들은 플레이트-특이적 앰프리콘 풀로부터 웰-ID 바코드 서열들 및 체인 특이적 3’ 프라이머들(카파, 람다 및 감마 체인들에 대한)에 대해 상보적인 5’ 프라이머들을 사용하여 증폭된다. 3’ 프라이머들은 3’ 제한 자리을 상에 첨가할 것이다. 5’ 프라이머가 이미 웰-ID 바코드의 제한 자리 3’을 함유하고 있기 때문에 5’ 프라이머들은 제한 자리들을 첨가할 필요가 없다. 이러한 증폭 이후에, 제한 효소들은 불변 부위 삽입체를 함유하는 벡터 안으로의 라이게이션을 위해 앰프리콘을 절단하는데 사용된다. 제한 효소 분해 중에, 바코드들 및 범용 서열들과 같은 Ig 유전자 서열들의 5’ 말단 상에 첨가된 서열들은 그들이 5’ 제한 자리의 5’이므로 절단된다.
실시예 40: 오직 하나의 면역글로불린 체인(헤비 체인 또는 라이트 체인)의 시퀀싱에 의한 클론 패밀리들의 식별, 그 후의 페어링된 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인 V(D)J 부위들의 클로닝
항체 헤비 및 라이트 체인들은 mRNA로부터 역전사되고, 각 샘플로부터 생성된 cDNAs 상에 별개의 샘플-IDs를 통합하고, 샘플 cDNAs는 PCR을 증폭하기 위해 모아진다. 면역글로불린 cDNAs는 증폭되고 면역글로불린 헤비 체인 또는 라이트 체인은 454 고처리 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱되며, 서열들은 동일한 유전체-인코딩된 V(D)J 절편들의 사용을 나타내는 면역글로불린 헤비 체인 V(D)J 또는 라이트 체인 V(D)J 서열들의 그들의 사용에 따라 그룹핑된다. 생물정보학을 관심 클론 패밀리들을 식별하기위해 사용하고, 동일한 샘플로부터 얻은 목적하는 면역글로불린 라이트 및 헤비 체인 V(D)J 부위들을 그런 뒤 시퀀싱 및/또는 클로닝을 위해 선택적으로 증폭시킨다. PCR 증폭을 위해, 포워드 프라이머는 샘플-ID를 포함하고 리버스 프라이머는 라이트 체인 또는 헤비 체인 불변 부위에 대해 특이적인 것이다. 프라이머들은 앰프리콘들 내의 제한 자리들을 통합할 수 있다. 앰프리콘들은 그런 뒤 이미 헤비 및 라이트 체인 불변 부위를 함유하는 적절한 발현 벡터들 안으로 삽입될 수 있다. 항체들은 그런 뒤 목적하는 성질들을 위해 발현되고 스크리닝된다.
실시예 41: 오직 샘플-IDs(그리고 플레이트-IDs는 아닌)만을 사용하여 항체들의 클로닝 및 발현을 위한 면역글로불린 헤비 및 라이트 체인 V(D)J 시퀀싱으로부터 얻은 클론 패밀리들의 식별
항체 헤비 및 라이트 체인들은 각 샘플 내의 mRNA로부터 역전사되고, 각 샘플로부터 생성된 cDNAs 안으로 별개의 샘플-IDs를 통합한다. 각 샘플-ID는 6개 이상의 뉴클레오티드들 길이이고 1개의 염기-페어가 다르며, 4096 별개의 잠재적 샘플-IDs를 야기한다. 별개의 샘플-ID는 각 샘플을 위해 사용되고, 특유한 샘플-IDs는 서로 다른 샘플들로부터 유래된 cDNA를 식별하고 개별적인 샘플 내에서 발현된 2 이상의 cDNAs의 페어링된 시퀀싱 및 클로닝을 가능하게 한다. 헤비 및 라이트 체인 앰프리콘들을 PCR을 사용하여 증폭시키고, 454 고처리 시퀀싱을 위해 필요한 티타늄 어댑터들 A 및 B 상에 첨가하고 그런 뒤 모든 샘플들을 시퀀싱을 위해 보냈다. 서열들을 웰들에 대해 할당하고 재료 및 방법의 “웰에 대한 서열의 할당” 및 “서열의 어셈블리” 섹션들에 따라 조립하였다. V(D)J 할당들은 하이브이-퀘스트(HighV-QUEST)를 사용하여 만들어지고 그들의 V(D)J 유용성에 근거하여 클론 패밀리들 안으로 그룹핑 된다. 선택된 클론들은 그런 뒤 클로닝 프라이머들로 구체적으로 증폭되고, 이는 또한 앰프리콘 내의 제한 자리들내에 첨가한다. 그런 뒤 앰프리콘들은 목적하는 성질들을 위한 스크리닝을 위한 항체들의 발현을 위한 적절한 헤비 및 라이트 불변 부위들을 이미 함유하는 발현 벡터들 안의 인-프레임(in-frame)으로 삽입된다.
실시예 42: 범용 프라이머 서열 상에 라이게이션하는 것에 의한 페어링된 서열들의 클로닝
항체 헤비 및 라이트 체인 유전자들은 mRNA로부터 역전사되고, 이는 어댑터 부위 및 샘플-ID 바코드로 구성된 새롭게 합성된 cDNA에 3’ 서열을 첨가한다. 그런 뒤 샘플들을 함께 모으고 범용 프라이머 서열을 1st 가닥 cDNA의 3’ 말단에 T4 DNA 리가아제 및 5’ 인산화 안티-센스 범용 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 첨가한다. 대안적으로, 2nd 가닥 cDNA 합성은 범용 프라이머 서열에 대한 라이게이션을 하는 것 이전에 mRNA/cDNA 혼성 하이브리드(hybrid) 대신에 이중 가닥 cDNA를 수득하는데 수행될 수 있다. 그런 뒤 두 라운드의 PCR을 cDNA를 증폭하는데 수행하고 454시퀀싱을 위해 플레이트-IDs 및 티타늄 프라이머들 A 및 B 상에 첨가하는데 수행한다. 대안적으로, 플레이트-IDs 및 티타늄 프라이머들은 또한 T4 DNA 리가아제를 사용하는 것에 의한 PCR 도중에 통합되는 것 대신에 DNA 라이게이션에 의해서 첨가될 수 있다. 454 시퀀싱 이후, 서열들을 조립하고 클론 패밀리들을 식별한다. 클론 패밀리들로부터 선택된 클론들은 앰프리콘들에 제한 자리들을 첨가하는 클로닝 프라이머들을 사용하여 구체적으로 클로닝될 수 있다. 그런 뒤 서열들을 이미 적절한 헤비 및 라이트 체인 불변 부위들을 가지는 발현 벡터들 안으로 인-프레임 삽입한다. 그런 뒤 항체들을 목적하는 성질들을 위해 발현 및 스크리닝 한다.
실시예 43: 면역글로불린헤비및라이트체인들의역전사(RT-GSPs)를위한유전자-특이적프라이머들의테스팅.
RT-GSPs를 올리고(dT)s 대신에 프라이머들로서 헤비 및 라이트 체인 유전자들의 역전사 내에서 사용하였다. 그런 뒤 cDNA들을 PCR에 의해 증폭하였고 아가로오스 겔 상에 시각화하였다. RT-GSP 프라이머들은 각각 레인들 1-4에서 IgKC_v3(a), IgLC_v5, IgLC_v6, IgLC_v7 및 IgLC_v8이었고(b), 각각 레인들 1-4에서 IgHGC_v10, IgHGC_v11, IgHGC_v13 및 IgGC_v15이었고(c) IgHGC_v16이었다(d). 프라이머 이름들 내의 KC, LC 및 GC는 프라이머가 카파 체인, 람다 체인 및 감마 헤비 체인에 각각 특이적이라는 것을 나타낸다. 겔 사진들 내의 백색 밴드들은 비-관련 레인들이 노출된 곳을 나타낸다. 도 10 및 표 6을 인용한다.
실시예 44: 어댑터 부위 서열들의 테스팅
RNA를 범용 프라이머 부위 및 어댑터 부위를 3’ 종단 말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드들로 역전사하였다. cDNA를 그런 뒤 포워드 프라이머로서 범용 프라이머 부위 서열 및 리버스 프라이머들로서 유전자-특이적 서열들을 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 생산물들을 아가로오스 겔 상에 시각화하였다. 어댑터 부위는 G (a), 각각 레인들 1 및 2에 GGGGG 및 rGrGrG로 구성된다. rG는 DNA 뉴클레오티드들 대신 RNA 뉴클레오티드들을 나타낸다. 도 11 및 표 6을 인용한다.
실시에 45: 범용 프라이머 서열들의 테스팅
RNA를 범용 프라이머 부위 및 어댑터 부위를 3’ 종단 말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드들로 역전사하였다. cDNA를 그런 뒤 범용 프라이머 부위에 상보적인 포워드 프라이머 및 유전자-특이적 서열에 상보적인 리버스 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. Univ_seq_4 (a), univ_seq_5 (b) and univ_seq_f (c). 겔 사진들 내의 수직의 백색 밴드들은 비-관련 레인들이 노출된 곳을 나타낸다. 반면 레인들은 동일한 겔 사진에 속한다. 도 12 및 표 6을 인용한다.
실시예 46: 1st PCR 반응을 위한 유전자-특이적 프라이머 서열들의 테스팅
유전자-특이적 리버스 프라이머들을 첫 번째 PCR 반응 내의 서열들의 증폭에 사용하였다. 1st PCR 반응 또는 추후의 2nd 네스티드 PCR 생산물들을 아가로오스 겔 상에 러닝시키고 시각화하였다. 사용된 리버스 프라이머들은 레인들 1-3 상에서 각각 IgKC_v4, IgLC_v5, IgHGC_v13 (a), 레인들 1-3 상에서 각각 K_GSP1, L_GSP1, G_GSP1 (b), 레인들 1-2 상에서 각각 K_GSP1c, L_GSP1c (c), G_GSP1 (d), 레인들 1-2 상에서 각각 L_GSP1d, G_GSP1g (e), 레인들 1-4 상에서 각각 G_GSP1h, G_GSP1k, L_GSP1f, L_GSP1g (f), G_GSP1d (g) 레인들 1-8에서 각각 L_GSP1h-o (h), 레인들 1-6 상에서 각각 G_GSP1m-q 및 G_GSP1t (프라이머 이름들 K, L 및 G은 카파, 람다 및 감마 면역 글로불린 불변 영역들에대해 각각 특이적인 프라이머들을 나타낸다). 각 겔은 레인 마커와 함께 왼쪽 상에서 츌발하고 샘플 레인들이 뒤따른다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다. 도 13을 인용한다. 또한, 더 많은 프라이머들을 도 43에서 테스트하였다. 이러한 프라이머들을 1st PCR을 위해 사용하였고, 그런 뒤 2nd PCR을 표 1에서 얻은 프라이머들을 사용하여 수행하였고 PCR 생산물들을 2% 아가로오스 겔 상에 러닝시켰고 이미지를 취하였다. 1st PCR을 위해 사용된 프라이머들은 각각 카파 GSP1, 카파 GSP1e, 카파 GSP1f, 람다 GSP1, 람다 GSP1x 및 람다 GSP1y이다. 또한 사용된 서열들에 대해 표 6을 인용한다.
실시예 47: 2nd PCR 반응에대한유전자-특이적서열들의테스팅
유전자-특이적 리버스 프라이머들을 2nd PCR 반응 내의 서열들의 증폭에 사용하였다. PCR 생산물들을 아가로오스 겔에 러닝시키고 시각화하였다. 사용된 리버스 프라이머들은 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2, L_GSP2, G_GSP2 (a), 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2v2a, K_GSP2v2b, L_GSP2v2 (b), 레인들 1-4에서 각각 K_GSP2v2c, K_GSP2v2c, G_GSP2v2c1, G_GSP2v2c2 (c), 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2v2d-f (d), 레인들 1-3에서 각각 K_GSP2v2g, L_GSP2v2d 및 G_GSP2b (e) 이었다. 프라이머 이름들 내의 K, L, G는 그들이 각각 카파, 람다 및 감마 면역글로불린 불변 부위들에 대해 특이적인 것임을 나타낸다. 각 겔은 레인 마커와 함께 왼쪽 상에서 출발하고 샘플 레인들이 뒤따른다. 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바(bar)들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다. 도 14 및 표 6을 인용한다.
실시예 48: 다른 인간 가변 부위 유전자들에 대한 유전자-특이적 프라이머들의 테스팅
1st 및 2nd PCR을 유전자-특이적 리버스 프라이머들을 사용하여 수행하였고 생산물을 2% 아가로오스 겔 상에서 러닝시켰고 이미지화했다. 레인들은 왼쪽부터: 마커, 뮤(mu), 알파 불변부위들, TCR 알파 (a) 및 마커, TCR 베타 (b)이다. 사용된 3’ 프라이머들의 서열들은 표 10에 있다. 동일한 겔 상에서 레인들 사이의 백색 바들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다. 도 44를 인용한다.
실시예 49: 마우스 가변 부위 유전자들의 유전자-특이적 프라이머들의 테스팅
1st 및 2nd PCR을 수행하였고 생산물들을 2% 아가로오스 겔 상에서 러닝시키고 이미지화하였다. 레인들은 왼쪽부터: 마커, 카파, 람다, 람다, 람다, 람다 라이트 체인들 및 뮤 헤비 체인 (a) 이다. 4개의 람다 레인들은 이러한 프라이머들의 조합을 가졌다: 마우스_람다_GSP1a와 마우스_람다 GSP2a, 마우스_람다_GSP1a와 마우스_람다 GSP2b, 마우스_람다_GSP1b와 마우스_람다 GSP2a 및 마우스_람다 _GSP1b 와 마우스_람다 GSP2a. 마커 및 알파 헤비 체인 (b). 감마1, 2a, 2c 헤비 체인들과 각각 mo_g12_GSP2d 및 mo_g12_GSP2e를 사용하는 2nd PCR, 마커(c). 감마 3 헤비 체인과 각각 mo_g3_GSP2d, mo_g3_GSP2e 를 사용하는 2nd PCR 그 뒤에 이어 감마 2b 헤비 체인과 각각 mo_g2b_GSP2d, mo_g2b_GSP2e를 사용하는 2nd PCR, 그 뒤에 이어 마커 (d). 마커, TCR 알파 (e). 마커, TCR 베타(f). 동일한 겔 사진 상에서 레인들 사이의 백색 바들은 비-관련 레인들이 중간에 노출된 곳을 나타낸다. 도 45 및 표 11을 인용한다.
실시예 50: 하나의 말단에서 바코드를 가지는 항체 헤비 및 라이트 체인들의 링크된 페어들의 생성
도 1에 나타난 것과 같이, 개별적인 B세포들은 흐름 세포측정법에 의하여 혈액, 벌크 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs), 벌크 B세포들, 형질아세포들, 형질 세포들, 기억 B세포들, 또는 다른 B세포 개체군들로부터 분류될 수 있다. B세포들은 96-웰 PCR 플레이트들 안에서 단일-세포-분류 되고, 음성 대조군으로서 웰들의 한 컬럼은 비워둔다. 도 17은 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 링크하고 하나의 말단에서 바코드를 첨가할 수 있는 방법의 일반적인 방법론을 설명한다.
단일 단계 멀티플렉스 중복-확장 RT-PCR은 제조자의 권장(recommendations)에 따라서 상업적으로 이용가능한 일-단계 RT-PCR 키트(예를 들어, 퀴아겐(Qiagen) 일-단계 RT PCR 키트)를 사용하여 수행될 수 있다. 이 특정한 실시예에서, 역전사 반응과 같은, 폴리뉴클레오티드 합성 반응은 mRNA 샘플로부터 cDNA 주형들을 생성하는데 사용된다. 도 17과 관련하여, RT-PCR 반응에 대한 포워드 유전자 특이적 프라이머는 제한 효소 자리(RE1), 시퀀싱 프라이머 자리, 및 바코드를 함유하며 이러한 요소들을 관심 제1 cDNA에 첨가한다. 두 개의 추가적인 프라이머들(RE를 함유하는것으로 나타낸)은 상보적 중복-확장 테일들을 갖는다. PCR 반응에서 이러한 프라이머들의 사용은 증폭 중에 두 개의 관심 cDNAs가 어닐링 및 링크하는 것을 가능케하는, 중복 확장 테일들을 지니는 두 개의 관심 cDNAs를 야기한다. 나타낸 실시예에서, 표시된 구조의 생산물은 LC 및 HC 체인들이 하나의 말단에서 바코드와 물리적으로 링크된 곳에서 생성되었을 것이다.
RE1 및 RE2 제한 자리들은 시퀀싱을 위한 적절한 벡터들 안에서 PCR 생산물을 클로닝하는데 사용될 수 있다.
실시예 51: 내부적 바코드를 가지는 항체 헤비 및 라이트 체인들의 링크된 페어들의 생성
도 1에 나타난 것과 같이, 개별적인 B세포들은 흐름 세포측정법에 의하여 혈액, 벌크 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs), 벌크 B세포들, 형질아세포들, 형질 세포들, 기억 B세포들, 또는 다른 B세포 개체군들로부터 분류될 수 있다. B세포들은 96-웰 PCR 플레이트들 안에서 단일-세포-분류 되고, 음성 대조군으로서 웰들의 한 컬럼은 비워둔다. 도 18은 그들 사이에 위치한 바코드를 갖는 두 개의 관심 폴리뉴클레오티드들을 링크하는데 사용될 수 있는 방법에 대한 일반적 방법론을 설명한다. 항체 헤비 및 라이트 체인들을 위해 사용될 수 있는 프라이머들 및 올리고뉴클레오티드들은 표 30에 나타낸다. 제한 자리들 AsiSI 및 PacI은 RT 올리고튜클레오티드들에 포함된다. 샘플-ID 서열들은 표 2에 나타낸다.
도 18에 나타낸 방법은 cDNA 합성 반응 중에 3’ 테일링 및 역전사효소의 주형 전환 활성들에 의존한다. 합성된 cDNA에 첨가된 3’ C 테일은 중복 확장 서열 및 바코드를 지니는 어댑터 분자의 어닐링을 위해 사용될 수 있다. 어댑터 분자들의 두 타입들은 두 개의 cDNAs를 링크시키는데 사용될 수 있다. 중복 확장 및 바코드 서열을 지니는 제1 어댑터는 제1 cDNA에 첨가된다. 중복 확장의 리버스 보체를 지니고 바코드 서열이 없는 제2 어댑터는 제2 cDNA에 첨가된다. 역전사 효소의 주형 전환 성질은 이러한 서열들을 그들 각각의 cDNAs의 3’ 말단들에 첨가한다.
PCR 반응에서, 도 18에 나타낸 것과 같이, DNA의 가닥들에 어닐 및 상응하는 상보적인 중복 확장 서열들(the complementary overlap extension sequences anneal and corresponding strands of DNA)은 어닐링 자리로부터 합성된다. 외부적 프라이머들을 사용하는 PCR의 추후 라운드들은 링크된 cDNA 분자들의 증폭을 야기한다.
적절한 제한 자리들의 첨가 및 증폭 반응 또는 그 후의 라이게이션을 위한 프라이머들 안으로 통합된 시퀀싱 프라이머 자리들의 첨가를 통해서, PCR 생산물들은 시퀀싱을 위한 적절한 벡터들 안으로 클로닝될 수 있다.
실시예 52: 범용 서열 중복-확장 프라이머들을 사용하여 두 개의 내부적 바코드들을 갖는 항체 헤비 및 라이트 체인들의 링크된 페어들의 생성.
도 1에 나타난 것과 같이, 개별적인 B세포들은 흐름 세포측정법에 의하여 혈액, 벌크 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs), 벌크 B세포들, 형질아세포들, 형질 세포들, 기억 B세포들, 또는 다른 B세포 개체군들로부터 분류될 수 있다. B세포들은 96-웰 PCR 플레이트들 안에서 단일-세포-분류 되고, 음성 대조군으로서 웰들의 한 컬럼은 비워둔다. 도 19는 두 개의 링크된 관심 폴리뉴클레오티드들 사이에 두 개의 내부적 바코드들을 도입하는데 사용될 수 있는 방법에 대한 일반적 방법론을 설명한다. 항체 헤비 및 라이트 체인들을 위해 사용될 수 있는 프라이머들 및 올리고뉴클레오티드들은 표 31에 나타낸다. 제한 자리들 AsiSI 및 PacI는 RT 올리고뉴클레오티드에 포함된다. 샘플-ID 서열들은 표 2에 나타낸다.
도 19에 나타낸 방법들은 cDNA 합성 반응 중에 3’ 테일링 및 역전사 효소의 주형 전환 활성들에 의존한다. 이 실시에에서, 올리고(dT) 프라이밍된(primed) cDNA에 첨가된 3’ C 테일은 연결되어야 하는 각 cDNAs에 대해 범용 서열 및 바코드를 지니는 어댑터 분자의 어닐링을 위해 사용될 수 있다. 역전사 효소의 주형 전환 성질은 이러한 서열을 그들 각각의 cDNAs의 3’ 말단들에 첨가한다. 외부적 LC 및 HC 특이적 프라이머들과 함께 상보적 중복-확장 서열들을 지니는 범용 서열에 프라이머들을 사용하는 추후의 중복-확장 PCR은 도 19에 나타낸 것과 같이 LC가 HC에 링크되고 그들 사이에 두 개의 내부적 바코드들을 갖는 구조를 야기한다.
적절한 제한 자리들의 첨가 및 증폭 반응 또는 그 후의 라이게이션을 위한 프라이머들 안으로 통합된 시퀀싱 프라이머 자리들의 첨가를 통해서, PCR 생산물들은 시퀀싱을 위한 적절한 벡터들 안으로 클로닝될 수 있다.
실시예 53: 중복-확장 어댑터들을 사용하여 두 개의 내부적 바코드들을 갖는 항체 헤비 및 라이트 체인들의 링크된 페어들의 생성.
도 1에 나타난 것과 같이, 개별적인 B세포들은 흐름 세포측정법에 의하여 혈액, 벌크 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs), 벌크 B세포들, 형질아세포들, 형질 세포들, 기억 B세포들, 또는 다른 B세포 개체군들로부터 분류될 수 있다. B세포들은 96-웰 PCR 플레이트들 안에서 단일-세포-분류 되고, 음성 대조군으로서 웰들의 한 컬럼은 비워둔다. 도 20은 두 개의 링크된 관심 폴리뉴클레오티드들 사이에 두 개의 내부적 바코드들을 도입하는데 사용될 수 있는 다른 방법에 대한 일반적 방법론을 설명한다. 항체 헤비 및 라이트 체인들을 위해 사용될 수 있는 프라이머들 및 올리고뉴클레오티드들은 표 32에 나타낸다. 제한 자리들 AsiSI 및 PacI은 RT 올리고튜클레오티드들에 포함된다. 샘플-ID 서열들은 표 2에 나타낸다.
도 20에 나타난 방법은 cDNA 합성 반응 중에 3’ 테일링 및 역전사 효소의 주형 전환 활성들에 의존한다. 이 실시예에서, 유전자 특이적 프라이머들을 사용하여 합성된 cDNA에 첨가된 3’ C 테일은 자가 상보적 또는 팔린드롬 중복-확장 서열들을 운반하는 어댑터 분자 및 연결 되어야 하는 각 cDNAs에 대한 바코드들의 어닐링을 위해 사용될 수 있다. 역전사 효소의 중형 전환 성질은 이러한 서열을 그들 각각의 cDNAs의 3’ 말단들에 첨가한다. LC 및 HC cDNAs에 첨가된 중복-확장 서열들의 추후의 어닐링은 중복 자리에서 그들을 함께 링크한다. LC 및 HC에 대해 외부적 프라이머들을 사용하는 중복-확장 PCR은 도 20에 나타낸 것과 같이 LC가 HC에 링크되고 그들 사이에 두 개의 내부적 바코드들을 갖는 구조를 야기한다.
적절한 제한 자리들의 첨가 및 증폭 반응 또는 그 후의 라이게이션을 위한 프라이머들 안으로 통합된 시퀀싱 프라이머 자리들의 첨가를 통해서, PCR 생산물들은 시퀀싱을 위한 적절한 벡터들 안으로 클로닝될 수 있다.
실시예 54: 바코드들을 컴가하는 서로 다른 방법에 대한 연구들
우리는 어떤 바코드들이 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 역전사 또는 증폭 반응의 과정 중에 첨가될 수 있는지를 통해서 다양한 방법을 연구했다. 우리는 바코드들의 첨가를 그들을 유전자-특이적 프라이머들(GSPs) 및 주형 전환에 의해서 cDNAs의 3’ 말단에 첨가될 수 있는 하나 이상의 Gs를 함유하는 올리고뉴클레오티드들 안으로 통합한느 것에 의해 테스트했다. 문헌 및 우리의 과학적 지식에 근거하여, 우리의 예상은 우리가 5’ 바코드된 올리고뉴클레오티드 또는 3’ 바코드된 GPSs를 사용하여 cDNA를 효과적으로 바코드 할 수 있을 것이라는 것이었다.
도 21에서 입증되듯이, RT를 1μg 의 총 PBMC RNA 및 0.5μM의 univ_seq_2 주형-전환 올리고 및 0.1 μM의 IgKC_v3 GSP (레인들 1-2) 및 그것의 제 1 부위가 고정된_PCR3(Fixed_PCR3) 서열이고, 마지막 8bp AACAATAC가 바코드인 추가적인 5’ 플랭킹 서열을 갖는 IgLC_v5 GSP (레인들 3-4)와 함께 수행하였다. RT 반응을 뉴클레오트라PCR(NucleoTraPCR)(Macherey-Nagel)를 사용하여 클린업 하였고 최종 부피가 50μl가 되도록 용해시켰다. 이 반응의 2 μl를 5’primer로서 Univ_seq_2 (레인 2 및 4) 또는 VL (레인 3) 프라이머 또는 내부적 5’ VK (레인 1), 및 3’프라이머로서 고정된_PCR3(Fixed_PCR3)과 함께 추후의 각 PCR 반응에서 사용하였다. VK 프라이머는 카파 V 유전자들 1 및 2에 특이적이고, VL 프라이머는 람다 V 유전자 2에 특이적이라는 것을 유의한다. 서열들은 표 33에 있다. 보여지는 바와 같이, 라인들 2 및 4내의 PCR 생산물을 도말표본(smear)으로서 러닝시켰다. 그에 반하여, 내부적인 5’ 프라이머들은 별개의 밴드들(레인 1 및 3)을 생성했고, 이는 프라이머 페어들이 작동하는 것을 나타내며, 레인 1 및 3에 나타낸 도말표본(smearing)은 좋지 않게 디자인된 프라이머들에 기인하지 않을 수 있다. 도말표본이 PCR 증폭 중에 univ_seq_2 및 3’ 바코드된 GSPs를 사용하여 수득될 때, 올리고뉴클레오티드가 완전한-길이의 역전사된 모든 cDNA 서열들에 첨가되므로, 이는 바코드된 GSPs를 쓴 역전사는 RT 반응 내에서 비-특이적 프라이밍된 핵산 서열들을 야기한다는 것을 시사한다. 우리의 결과들은 5’ 범용 서열 어댑터들 및 3’ 바코드된 프라이머들의 사용이 B세포 또는 다른 세포들로부터 발현된 면역글로불린 또는 다른 유전자들의 바코딩 및 특이적 증폭에 좋지 않은 전략이라는 것을 시사한다.
돌이켜 보니, 사용된 DNA의 여러가지 생물학적 성질들 및 분자 반응들은 우리의 관찰에 기여할 것이었다. 역전사는 보통 42oC 또는 56oC와 같은 낮은 온도에서 수행된다. PCR과 달리, 어닐링 단계는 보통 프라이머들의 Tm 바로 약간 아래의 온도에서 수행되어 프라이밍 특이성을 촉진하고, 이는 역전사효소가 높은 온도에서는 불활성화되기 때문에 역전사에서는 수행될 수 없다. 그러므로, 반응이 프라이머의 Tm 보다 훨씬 낮은 온도에서 진행되기 때문에, RT 중에 사용된 유전자 특이적 프라이머들은 전형적으로 관심 유전자에 대해 매우 특이적이지는 않다. 이러한 상황에서, 프라이머는 또한 표적을 벗어난(off-target) mRNA 서열들에 몇몇 불일치를 가지면서 결합할 수 있고, 미스프라이밍(mispriming)이 발생한다. 바코드가 GSP 상에 첨가된다면, 프라이머는 또한 추후의 PCR에서 사용하기 위해 바코드의 고정된 서열 5’을 가져야 한다. 이는 프라이머를 매우 길게 만들고(~60 nt), 심지어 훨씬 높은 수준의 미스프라이밍을 갖는 프라이머를 야기한다. 그러나, PCR 중에 특이적 증폭은 보통 매우 유전자-특이적인 포워드 프라이머를 사용하는 것에 의해 여전히 달성될 수 있으며; 프라이머 페어의 한 멤버가 특이적이기만 하면, 레인 1 및 3에 나타낸 대로 보통 특이적 증폭이 있을 수 있다.
주형 전환 기술이 어댑터를 첨가하는데 사용되면, 이 어댑터는 제1-가닥 cDNA를 형성하기 위해 합성된 모든 mRNAs에 첨가된다. 상기에 기재된바와 같이, 바코드된 GSPs는 현저한 양의 미스프라이밍을 가질 것이고, 특히 RT 효소 수퍼스크립트 III은 56oC에서 그의 주형-전환 활성을 잃으므로, 역전사는 42oC에서 진행된다. 특이적 네스티드 5’ 또는 3’ 프라이머들은 모든 면역글로불린 유전자들을 PCR 증폭하는 능력을 잃게되거나(따라서 가변 V 유전자들 때문에 다중 디제너레이트 5’ 프라이머들에 의존 해야하는) 또는 그 밖에 3’ 바코드를 잃게 되는 것으로 사용될 수는 없다. 그러므로, TdT 테일링 또는 블런트 말단 클로닝과 같은 5’ 어댑터들에 첨가하는 방법들은 또한 어댑터들을 비-식별적으로(non-discriminately) 첨가하므로, 바코드된 GSPs는 주형-전환 첨가된 어댑터들 또는 모든 다른 5’ 어댑터들과의 사용에는 적절하지 않다. 그러므로, 내부적 3’ 프라이머들 또는 네스티드 또는 세미-네스티드 PCR 증폭 전략이 또한 필요하고, 바코드된 3’ GSPs는 B세포 또는 다른 세포로부터 얻은 유전자들의 특이적 증폭을 위한 이러한 전략의 사용을 가능하게 하지 않는다. 우리의 결과들에 근거하여, 바코드된 올리고(dT)s가 또한 우리는 바코드된 GSPs가 좋지 않게 수행된다고 생각하는 많은 동일한 이유들로 인해 좋지 않게 수행될 것이라는 점이 또한 예상된다. 이러한 원인들은 B세포 또는 다른 세포들로부터 얻은 유전자들의 특이적인 증폭을 위한 네스티드 또는 세미-네스티드 PCR 전략 또는 내부적 3’ 프라이머들을 사용 불가능성을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이에 반하여, 우리의 결과들은(다른 실시예들을 인용) 역전사 반응 중에 생성된 cDNA의 3’ 테일에 어닐링하는 어댑터 및 바코드 서열을 포함하는 프라이머를 사용하는 역전사 과정 중에 바코드 서열 첨가의 우월성(superiority)을 증명한다. 이러한 구현예에서, 어댑터 서열은 바코드 서열을 포함할 수 있고 항체 헤비 및 라이트 체인들을 인코딩하는 표지 유전자들에 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 주형 전환, 또는 cDNA를 테일링하는 모든 다른 방법들은 5’ 서열들 그 자체의 사전 지식 없이 PCR 증폭을 위해 사용될 수 있는 서열들을 첨가하고, 항체 레파토리의 효율적이고 치우치지 않은 묘사(representation)를 가능하게 한다. 또한, 이 접근법은 항체들에 덧붙여 단백질을 인코딩하는 다른 공동-발현된 유전자들의 레파토리를 수득하는 것을 가능하게 한다. 또한, 주형-전환 어댑터들을 사용하는 접근법은 다중 V 유전자들을 증폭하는 디제너레이트 포워드 프라이머들의 세트들을 사용하는 본 기술분야에 개시된 다른 방법들을 넘는 분명한 장점들을 가진다. 알려진 5’ 프라이머 세트들: a) 대부분을 덮으나 전체 항체 레파토리를 덮지는 못하고; b) 인간 개체군에서 아직 알려지지 않은 V 유전자들 변이체들(다형성(polymorphism))을 덮을 수는 없고; 및 c) 대규모 체세포 초돌연변이(SHM)을 겪은 항체 서열들을 효과적으로 증폭 할 수는 없을 수 있는 세트들 때문에 이러한 방법들은 또한 전체 항체 레파토리를 캡쳐 할 수 없다.
따라서, 예를 들어, 항체 헤비 및 라이트 체인들과 같은 발현된 유전자들의 라이브러리을 위한 준비를 위한 주형-전환 어댑터들의 사용은 특정한 유전자 패밀리들 및 다른 공동-발현된 유전자들의 편향되지 않은 묘사를 가능하게 함으로써 본 기술분야에 알려진 다른 방법들을 넘는 분명한 장점들을 제공한다. TdT 테일링 및 블런트 말단 라이게이션과 같으나 이에 제한되지는 않는 모든 다른 방법을 사용하여 첨가된 주형-전환 어댑터들 또는 5’ 어댑터들의 사용은 또한 상기에 논의된 원인들을 위해서 바코드된 3’ GSPs 또는 바코드된 올리고(dT)s 보다 바코드된 5’ 어댑터들의 사용과 더욱 호환 가능하다.
실시예 55: 흐름 세포측정법에서 전방-산란 및/또는 측방-산란 및/또는 다른 표면 마커들과 함께에 의한 형질아세포들의 분류
형질아세포들은 활성화되고, 증식된/증식중인 및 친화성 성숙을 겪은 블라스팅 B세포들 이다. 형질아세포들은 활발한 면역 반응을 나타내고 관심 표적 항원들에 결합하는 항체의 클론 패밀리들을 갖는 진화계통수의 생물정보학적 구조를 가능하게 하는 본 명세서의 방법들 및 조성물들을 실행하는 것에 의해, 그것이 감염, 백신, 자가면역 또는 암 항원인지를 나타낸다.
형질아세포들은 블라스팅 B세포들이고 휴지 B세포들 보다 큰 것이다(도 40a-b). 그러므로 그들은 흐름세포 측정법 상에서 그들의 전방- 및 측방-산란 성질들을 사용하여 분류될 수 있다. 도 40c에 나타내었듯이, 형질아세포들은 다른 CD20+ B 세포들의 정중 FSC-A 보다 큰 ~1.29-1.66x인 정중 FSC-A를 가지며, 휴지 CD20+ B 세포들보다 큰 1.04-1.16x인 정중 FSC-W를 가진다. 형질아세포들은 또한 95% 신뢰 구간에 의해서 결정된 것으로서 단핵구의 것인 0.92-1.02x인 정중 FSC-W, 및 단핵구의 것인 0.85-0.98x인 정중 FSC-A을 갖는다. 여기서 FSC-A 및 FSC-H는 상호교환적일 수 있고 FSC-A와 동등하며(equivalent) FSC-H는 동일한 값들을 부여하는 조정된 흐름 세포측정법 상에서 규모가 조정된다. SSC-A(및 SSC-H, 규모조정 때문에(due to scaling)) 및 SSC-W와 유사하게, 형질아세포들은 CD20+ B세포들의 것인 0.74-2.56x 및 단핵구들의 것인 0.21-0.84x인 정중 SSC-A를 가지고 CD20+ B세포들의 것인 1.01-1.20x 및 단핵구들의 것인 0.82-1.03x인 정중 SSC-W를 가진다. 형질아세포들의 B세포들에 대한 비율은 휴지 림프구들이 크기에서 비슷하므로 림프구에 대한 것을 나타낸다.
형질아세포들을 식별하는 대안적인 방법들은 CD20+ B 세포들 또는 단핵구들의 정중 FSC 또는 SSC에 대한 형질아세포들의 20th 백분위수 FSC 또는 SCC를 사용하는 것이고(도 40d), 이는 CD20+ B세포들에 대해 정중 FSC-A(FSC-W)인 1.04-1.50x (1.02-1.11x) 이고 단핵구들에 대해 0.70-0.88x (0.88-1.00x)이다. 형질아세포들은 20th 백분위수 SSC-A(SSC-W)를 가지며, 이는 CD20+ B 세포들에 대해 정중 SSC-A (SSC-W)인 0.67-1.89x (0.99-1.11x) 그리고 단핵구들에 대해 0.20-0.62x (0.77-0.99x)이다. 이러한 숫자들은 80%의 형질아세포들을 포함하고 다른 림프구들은 제외하는 게이팅 컷오프(gating cutoff)를 가능하게 한다. 이는 FSC (및/또는 SSC)와 함께 단일 또는 듀얼 색깔 염색제를 사용하여 형질아세포들을 단일 세포 분류하는 것 내에서 형질아세포들을 위해 게이팅 하는 것을 가능하게 한다. 이러한 조합들은 FSChiCD19lo (도 39b), CD19+FSChi (도 39c) CD19+FSChiCD20- (도 39d), CD19+FSChiCD38hi (도 39e) 및 CD19+FSChiCD27+(도 39f)를 포함할 수 있다. 분류된 세포들은 그런 뒤 재료 및 방법의 “비-터치다운” PCR에서와 같이 수행되는 것으로서 바코딩을 위한 RT, PCR을 겪을 수 있다. 시퀀싱을 위한 하류 준비, 클로닝 및 발현은 실시예 6 및 8을 따른다. 주어진 비율들은 95% 신뢰구간이고, 또는 비율들의 95%가 이 구간에 포함되어야 한다는 것을 유의한다.
실시예 56: 미세유동장치와 같은 거름 장치(sieving device) 상에서 크기에 의한 형질아세포들의 분류
형질아세포들은 활성화되고, 증식된/증식중인 및 친화성 성숙을 겪은 블라스팅 B세포들 이다. 형질아세포들은 활발한 면역 반응을 나타내고 관심 표적 항원들에 결합하는 항체의 클론 패밀리들을 갖는 진화계통수의 생물정보학적 구조를 가능하게 하는 본 명세서의 방법들 및 조성물들을 실행하는 것에 의해, 그것이 감염, 백신, 자가면역 또는 암 항원인지를 나타낸다.
형질아세포들은 블라스팅 B세포들이고 휴지 B세포들 보다 큰 것이다. 형질아세포들 및 CD20+ B세포들을 FACS 분류하였으며 사망 세포들을 제외하는 트리판(trypan) 블루로 염색하였고 200x 배율(magnification)에서 이미지화하였다. 52개의 형질아세포들 및 51개의 CD20+ B 세포들을 이미지화 하고 세포 면적을 이미지제이(ImageJ로 측정하였다. 이미지화된 형질아세포들은 7.8-13uM의 직경이었으며, 48-121uM2의 면적이었고, 251-996uM3 의 부피였다. CD20+ B세포들은 블라스팅이 아니고 더 작지 않으며, 다수가 6-8uM의 직경이며, 또는 50uM2 보다 작거나, 또는 268uM3 보다 작으며, 오직 51개중 4개의 세포들만이 그것보다 컸다(도 41). 직경 8 uM 또는 넓이 50uM2 또는 부피 268uM3 보다 크거나 또는 작은 세포들을 분리할 수 있는 모든 거름 장치는 CD20+ 휴지 B세포들로부터 형질아세포를 분리할 수 있으며, 형질아세포들의 96%가 캡쳐되고, 휴지 B세포들의 92%가 걸러져 나왔다. 이러한 장치는 8uM의 직경인 구멍들을 가지는 고운체(fine sieve) 일 수 있고, 또는 빠져나가면서 직경이 8uM 또는 면적이 50uM2 또는 부피가 268uM3 보다 큰 세포들만을 통과 가능케하거나 또는 통과하지 못하게 막는 채널들을 가지는 미세유동장치 일 수 있다. 이러한 세포들은 그런 뒤 웰들 안에서 미세유동 장치 내의 작동기들/펌프들에 의해 분류될 수 있고 그리하여 오직 1 또는 적은 세포(들)/웰 만이 남고 바코딩을 위한 RT, PCR이 그런뒤 동일한 농도의 시약들을 사용하여 재료 및 방법의 “비-터치다운” PCR에 있는 것과 같이 수행될 수 있다. 시퀀싱, 클로닝 및 발현을 위한 하류 준비는 실시예들 6 및 8을 따르는 것과 같다.
실시예 57: 항- 스태필로코커스 아우레우스 항체들은 뉴트로필(neutrophil) 세포주에 의해서 S. 아우레우스 의 식균작용을 강화한다
예를 들어 항생제 치료에 대한 필요 없이 S. 아우레우스를 없앤 사람들과 같이, 그들의 S. 아우레우스 감염에 대한 효과적인 면역 반응들을 시작하는 S. 아우레우스 감염들을 가지는 인간들을 말초 혈액을 위한 소스로서 사용하고 그 말초 혈액 형질아세포들을 염색하고 분류한다. 형질아세포들을 재료 및 방법의 “비 터치다운 PCR”에 기재되어 있는 바와 같이 단일-세포 분류하고 바코딩하였고, 재료 및 방법의 “454 XLR70 시퀀싱을 위한 준비”에 기재되어 있는 바와 같이 시퀀싱을 위해 준비하였다. 진화계통수들을 생물정보학적으로 구성하였고 각 클론 패밀리의 어느 정도의 선택 대표자(select representatives)들을 선택하였고 실시예 8에 있는 대로 재조합 항체들로서 발현하기 위해 클로닝하였다. ~5% 단백질 A 양성인 S. 아우레우스 우드 스트레인(Wood strain)을 5% 트립티카아제 소이 아가(trypticase soy agar, TCA) 혈액 아가에서 플레이팅하고 콜로니를 성장시키고 4oC에서 스톡(stock)으로서 보관하였다. 이 스톡을 다른 콜로니를 채집하는 것에 의해서 매주 리프레시하였다(refreshed). 1mL의 이 스톡을 S. 아우레우스 성장에 OD550 = 0.5가 될때까지 접종하는데 사용하였고, 이는 대략 중간-대수기(mid-log growth phase)이다. S. 아우레우스를 4% 파라포름알데하이드(PFA)에서 15분 동안 상온에서 가볍게 고정하였고 1uM CFSE로 15분 동안 상온에서 염색하기 전에 행크 평형 염액(balanced salt solution, HBSS)로 한번 세척하였다. 그런 뒤 고정된 박테리아를 세척하고 10ug/ml의 발현된 재조합 항-S. 아우레우스 항체들 또는 10ug/ml의 발현된 항-인플루엔자 바이러스 항체들을 음성대조군으로 하여 이와 함께 접종하였다. 그런 뒤 박테리아들을 두번 세척하였다. HL-60, 뉴트로필 세포주, 을 96시간(96hr)동안 25uM 레티노산(retinoic acid)과 함께 활성화시키고, 표지된 것으로 배양하고, 박테리아와 1:1 내지 1:100에서 45분 동안 37oC에서 조심스럽게 300rpm에서 96-웰 플레이트 내에서 혼합하여 고정시켰다. 그런 뒤 HL-60를 두번 세척하고 흐름세포측정기 상에서 분석하였다. HL-60s에서 라벨링하는 CFSE의 양은 식균 작용된 S. 아우레우스 의 양을 나타낸다. 몇몇 발현된 항-S. 아우레우스 항체들은 스태필로코커스 세포 표면 단백질들에 결합 할 것이고 박테리아를 옵소닌화 하고, 증가된 식균작용을 이끈다.
실시예 58: 항- 스태필로코커스 아우레우스 항체들은 S. 아우레우스 의 뉴트로필-매개 사멸을강화한다
그들의 S. 아우레우스 감염들을 효과적으로 조절 및/또는 없앨 수 있던 인간들을 상기 관련 실시예에 있는 것과 같이 선택하였고, 형질아세포들을 분리하였고 상기 관련 실시예에 있는 것과 같이 시퀀싱 및 클로닝 및 발현을 위해 단일 세포 분류하였다. S. 아우레우스 임상적 분리주 (clinical isolate), 를 5% TCA 혈액 아가상에서 플레이팅하였고 콜로니를 성장시켰고 스톡으로서 4oC에서 보관하였다. 이 스톡을 다른 콜로니를 채집하는 것에 의해서 매주 리프레시하였다. 1mL의 이 스톡을 S. 아우레우스 성장에 OD550 = 0.5가 될때까지 접종하는데 사용하였고, 이는 대략 중간-대수기(mid-log growth phase)이다. S. 아우레우스를 그런 뒤 두번 세척하기 전에 2ug/ml의 발현된 항-S. 아우레우스 항체들과 함께 30분 동안 4oC에서 배양하였다. HL-60 뉴트로필 세포를 96시간 동안 25uM의 레티노산과 함께 활성화 시켰고, 1:1 내지 1:100 비율인 아기 래빗 보체 및 S. 아우레우스와 함께 45분 동안 37oC에서 조심스럽게 300rpm에서 96-웰 플레이트 내에서 혼합하여 배양하였다. HL-60 세포들을 그런 뒤 급속히 얼음에 넣고 3번(3x) 세척하였고 느슨하게 결합된 S. 아우레우스를 제거한다. 세포 밖 S. 아우레우스를 그런 뒤 연속적으로 희석하였고 5% TSA 혈액 아가에서 플레이팅하였고 37oC에서 하룻밤동안 배양하였다. 콜로니들을 그 다음날 카운팅하였고 콜로니 형성 유닛들(CFU)의 숫자를 결정하였다. 특이적 항-S. 아우레우스 재조합 항체들에 의한 CFUs 에서 감소(S. 아우레우스와 배양한 후에)는 이러한 항체들이 HL-60세포들에 의한 S. 아우레우스의 향상된 식균작용을 매개하고 이를 사멸시키고, 또는 성장을 감소시키는데 효과적이었다는 것을 증명한다(도 46).
실시예 59: 마우스 모델에서 발현된 항- S. 아우레우스 항체들을 사용한 스태필로코커스 아우레우스 -감염된 마우스들의 치료
시험관 내에서 사멸, 감소된 성장 또는 실시예 58에 있는 것과 같은 결합 활성을 증명하는 항-S. 아우레우스 항체들은 또한 생체 내 활성을 가질 수 있다. 사멸 활성을 가지는 항-S. 아우레우스 항체들을 실시예 55-58에 있는 것과 같이 그들의 스태필로코커스 감염을 조절할 수 있는 S. 아우레우스-감염된 인간들로부터 분리한다. 마우스들에게 치사량의 S. 아우레우스를 부여하고 그런 뒤 증명된 시험관 내 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 가지는 재조합 항-S. 아우레우스 항체(들) 또는 대조군 항체들로 처리하였다. 마우스들은 그들이 카프란-메이어 생존 테스트(Kaplan-Meier survival test)에 의해 결정한 것으로서 더 장기적인 생존 또는 감염의 감소된 중증도를 가지는 경우에 보호되는 것으로 여겨진다. 그들의 S. 아우레우스 감염들의 중증도를 조절하거나 또는 감소시킨 인간들로부터 유래된 항-S. 아우레우스 항체들을 그렇게 함으로써 S. 아우레우스에 대한 수동적 보호(passive protection)를 부여하는 그들의 능력을 위해 평가한다.
실시예 60: 백신들을 개발하기 위한 효과적인 항- 스태필로코커스 아우레우스 면역 반응들의 항원 표적들의 사용.
사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 나타내는 항-S. 아우레우스 항체들에 의해 표적화된 S. 아우레우스 항원들은 S. 아우레우스 백신을 위한 좋은 후보들이다. 그들의 특이적 항원들에 대한 강한 반응을 개발하는(develop) 백신들은 S. 아우레우스를 갖는 감염의 감소된 중증도를 나타내거나 똔는 그것에 대해 보호될 수 있다. 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 갖는 항-S. 아우레우스 항체들을 그들의 S. 아우레우스 감염을 조절할 수 있는 S. 아우레우스-감염된 인간들로부터 분리하고, 그들이 표적 항원들을 실시예 55-58에 있느 것과 같이 질량 분석법을 사용하여 식별한다. 마우스들을 모의 벡터로 백신화하거나 또는 후보 S. 아우레우스 항원들로 백신화 하고 그런 뒤 2 개월의 기간에 걸쳐 2번 부스팅하였다(boosted). 마우스들은 S. 아우레우스 항원들 개별적으로 또는 조합으로 면역될 수 있다. 항-S. 아우레우스 항원 항체 역가(titer)를 ELISA에 의해 확인한다. 그런 뒤 마우스들을 치사량의 S. 아우레우스로 대항시킨다. 마우스들은 그들이 카프란-메이어 생존 테스트에 의해 결정된 것으로서 더 장기적인 생존을 갖는다면 S. 아우레우스에 대해 보호되는 것으로 여겨진다. 그러므로 이러한 선택된 S. 아우레우스 항원들에 대한 면역화는 보호를 부여하거나 또는 감염의 중증도를 감소시키고, 이는 본 명세서의 조성물들 및 방법들이 백신 디자인을 위해 도울 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 61: 인간에서 생체 내 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 가지는 재조합 항- S. 아우레우스 항체들을 사용하는 스태필로코커스 아우레우스 -감염된 인간들의 치료
그들의 S. 아우레우스 감염을 조절하거나 실시예 55-59에 있는 것과 같이 시험과 내 및 생체 내 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 나타내는 인간들롭루터 유래된 항체들은 S. 아우레우스-감염된 환자들을 치료하는데 사용될 수 있다. 항체들을 수득하고 실시예 55-59에 있는 것과 같이 시험관 내 및 생체 내 사멸 활성을 테스트하였다. 우수의약품제조관리기준(Good Manufacturing Practice, GMP)로 준비된 항-S. 아우레우스단일클론 항체들을 S. 아우레우스-감염된 인간들, 특히 메타실린 내성 S. 아우레우스(methicillin resistant resistant S. aureus, MRSA) 또는 약물-내성-S. 아우레우스의 다른 스트레인들로 감염된 환자들에게 정맥(intravenously) 또는 피하로(subcutaneously) 주어질 수 있으며, 효능에 따라서 항생제들을 비교했다. 항-S. 아우레우스 항체들은 환자들이 침습성(invasive) S. 아우레우스 감염들에 대해 보호되거나, 덜 심각한 S. 아우레우스 감염들을 가지거나, 및/또는 항생제들 단독으로 주어지거나 또는 항생제들이 주어지지 않은 환자들보다 더욱 급속히 회복된다면 치료적 유틸리티를 가지는 것으로 여겨진다. 재조합 항-S. 아우레우스 항체들은 활동적인 S. 아우레우스 감염들을 가지는 환자들에게 치료적으로 주어질 수 있으며 감염의 중증도를 감소시키거나 및/또는 감염의 청소(clearance)를 강화할 뿐만 아니라 신부전(renal failure)을 위한 혈액투석(hemodialysis)상의 환자들, 병원에 입원된 환자들, 또는 S. 아우레우스 또는 MRSA에 대해 양성-스크린을 가지는 환자들과 같은 고-위험성 환자 개체군들에 대해 예방적으로 강화한다.
실시예 62: 인간에서 방어 면역(protective immunity)을 부여하는 식별된 S. 아우레우스 항원들을 사용하는 스태필로코컬 아우레우스 백신화
생체 내 에서 사멸 또는 결합 활성을 나타내고, 마우스 모델에 대해서 백신화 되었을 때 S. 아우레우스 대항에 대한 보호를 부여하고는 항-S. 아우레우스 항체들에 의해 표적화된 S. 아우레우스 항원들은 인간에서 예방 백신(prophylactic vaccine)을 위한 좋은 후보들 일 수 있다. 항-S. 아우레우스 항체들을 그들의 S. 아우레우스 감염들을 조절하는 인간들로부터 유래되고 생체 내에서 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 위해서 클로닝, 발현 그리고 테스트하고 그리고 실시예 55-58 및 59에 있는 것과 같이 마우스들에서 백신 후보들로서 클로닝, 발현 그리고 테스트한다. 그런 뒤 인간들을 대조군으로서 되는 플라시보(placebo)를 갖고 사멸, 감소된 성장 또는 결합 활성을 갖는 항-S. 아우레우스 항체들의 표적들인 S. 아우레우스 항원들을 함유하는 S. 아우레우스 백신으로 부여한다. 집단들(cohorts)을 그들의 발생정도(incidence) 또는 S. 아우레우스 감염들의 중증도를 위해 추적하였다. 백신은 그것이 플라시보 집단들과 비교하여 S. 아우레우스 감염들의 중증도 또는 백신화된 집단들의 발생정도를 낮춘다면 성공적인 것으로 여겨진다.
실시예 63: 보호의상관관계(correlate) 로서후보 스태필로코커스아우레우스 백신들에의해유도된면역반응들의모니터링
실시예 62에 있는 것과 같이 후보 S. 아우레우스 백신으로 인간의 면역화 이후에, 백신 반응은 표적인 관심 S. 아우레우스 항원들에 대한 로버스트(robust) 클론 패밀리들이 유발되었는지를 결정하는 것에 의해서 모니터링 될 수 있다. 혈액을 백신화-후 7-14일 사이에 뽑고 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR” 및 “454 XLR70 시퀀싱을 위한 준비”에 기재된바와 같이 형질아세포들을 단일 세포 분류하고, 바코딩하고 454시퀀싱한다. 진화계통수들을 그리고 그런 뒤 각 클론 패밀리의 2-3 멤버들을 실시예 8에 있는 대로 클로닝 및 발현시키고 ELISA에서 관심 스태필로코커스 항원들에 대한 그들의 결합에 대해 테스트한다. 우리는 강한 백신-유도된 항-S. 아우레우스 면역 반응을 가지는 인간들은 효과적인 인간 면역 반응들에서 표적화된 S. 아우레우스 항원들에 대한 많은 클론 패밀리들을 나타낼 것이라고 예상한다. 이러한 접근법은 S. 아우레우스 백신에 대한 보호의 상관관계를 제공할 가능성을 가지고 그렇게 하여 최신화 되는 임상 시험들 및 개발을 가능하게 한다. 이 항체 및/또는 TCR 면역 레파토리 모니터링은 후보 백신들이 효능을 제공할 것인 가능성(likelihood)의 신속한 평가를 가능하게 한다.
실시예 64: 재조합항-폐샘암종항체들을사용하는폐-샘암종을가지는마우스들의치료
세포 표면 단백질 또는 다른 폐 샘암종 단백질들에 결합하는 항-폐 샘암종 항체는 폐 샘암종 세포들에 대한 독소(toxins)들을 표적으로 하거나 또는 폐 샘암종 세포들에 의해 발현되는 다른 분자들을 표적으로 하는 담체(carrier)로서 유용할 수 있다. 세포 표면 결합 활성을 가지는 항-폐 샘암종 항체들 또는 다른 폐 샘암종 항원들은 장기간 비-진행자 폐 샘암종 암환자(들)로부터 실시예 11에 있는대로 분리된다. 누드 마우스들(Nude mice)에게 H1650 폐 샘암종 세포주의 피하 주사(subcutaneous injection)를 주고 종양을 일주일 동안 성장 가능하게 하였다. 항-폐 샘암종 항체들을 그런 뒤 세포-결합 도메인이고 디프테리아 톡신을 세포 안으로 들어가게 하는 R-도메인이 결핍된 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 독소와 접합시킨다. 그러므로 R-도메인이 결핍된 디프테리아 독소는 오직 폐 샘암종 세포들에 대해서만 치명적이며 이러한 세포들은 항체가 결합하고 디프테리아 독소 페이로드(payload)를 전달하는 것이다. R 도메인이 없는 디프테리아 독소에 접합된 대조군 항체를 대조군으로서 사용한다. 폐-샘암종 항체는 종양 로드(tumor load)가 대조군보다 더 감소하면 샘암종 세포들을 사멸시키는 그것의 페이로드를 성공적으로 전달한 것으로 여겨진다. 대안적으로, 특정한 경우에서 재조합 항체들 그 자체는 종양 세포 사멸을 매개거나 또는 종양 세포 성장을 방지할 수 있다(접합된 독소가 없는 경우에서).
실시예 65: 발현된 항-폐 샘암종 항체들을 사용한 폐 샘암종 환자들의 치료
세포 표면 항원에 결합하는 항-폐 샘암종 항체들은 폐 샘암종 세포들에 대한 독소를 표적으로 하는 담체로서 유용할 수 있다. 세포 표면 결합 활성을 갖는 항-폐 샘암종 항체들은 장기적인 비-진행자 폐 샘암종 암환자들로부터 실시예 11에 있는것과 같이 분리된다. GMP 단일클론 항체 또는 다른 항-폐 샘암종 단일클로 항체들은 정맥 또는 피하로 폐 샘암종 환자들, 특히 그들의 생체검사된(biopsied) 샘암종 세포들이 단일클론 항체에 의해 표적화된 높은 레벨의 세포 표면 항원을 발현하는 환자들 에게 주어질 수 있다. 재조합 단일클론 항체(들) 폐 샘암종 항원(들), 또는 그들이 유래된 것으로부터 얻은 클론 패밀리들의 다른 멤버들은 개별적인 환자들의 폐 샘암종의 생체검사 시료(biopsy specimen)를 면역조직화학적으로 염색하여 종양 항원 발현 수준들에 대한 정보를 얻는데 사용될 수 있고, 이 정보는 개별적인 환자가 이 단일클론 항체를 가지는 치료법에 대해 반응할 것 같은지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 항-폐 샘암종 항체들은 세포-결합 도메인이고 디프테리아 톡신을 세포 안으로 들어가게 하는 R-도메인이 결핍된 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 독소와 접합될 수 있다. 그러므로 R-도메인이 결핍된 디프테리아 독소는 오직 폐 샘암종 세포들에 대해서만 치명적이며 이러한 세포들은 항체가 결합하고 디프테리아 독소 페이로드(payload)를 전달하는 것이다. 표준 케어 화학요법(Standard of care chemotherapy)을 비교 그룹의 치료를 위해서 사용한다. 항-샘암종 항체들은 환자들이 더 오래 생존하거나 또는 재발 또는 진행에 앞서는 더 긴 시간들을 나타내면 치료적 유틸리티를 간고 그들의 페이로드를 전달한 것으로 여겨진다. 대안적으로, 특정한 경우에 폐 샘암종 항원들에 대한, 재조합 항체들 그 자체, 는 종양 세포 사멸을 매개거나 또는 종양 세포 성장을 방지할 수 있다(접합된 독소가 없는 경우에서).
실시예 66: 인간에서 식별된 항원들을 사용하는 폐 샘암종 치료적 백신화
항-폐 샘암종 항체들에 의해 결합된 세포 표면 항원들은 확립된(established) 폐 샘암종을 치료하거나 또는 폐 샘암종의 발달로부터 방어하는 치료적 백신으로 사용될 수 있다. 세포 표면 결합 활성을 갖는 항-폐 샘암종 항체들은 실시예 11에 있는 것과 같이 장기적인 비-진행자 폐 샘암종 ㅎ암환자(들)로부터 분리되고, 표적 항원은 면역침전법 또는 면역블로팅법 및 질량분석법을 사용하여 식별된다. 백신들은 관심 폐 샘암종 항원(들) 또는 대조군 백신을 함유하는 백신으로 주어진다. 그런 뒤 집단들이 뒤따르고 그들의 발생정도 또는 폐 샘암종의 진행이 추적된다. 백신들은 표적 항원으로 백신화된 인간이 치료 기준 비교 그룹(standard-of-care comparator group)과 비교하여 생존이 연장된(prolonged) 또는 재발에 대한 시간이 연장되면 성공적인 것으로 여겨진다.
실시예 67: 반응의 효능에 대한 폐 샘암종 백신화의 면역 모니터링
실시예 66에 있는 대로 폐 샘암종 백신으로 인간들의 면역화 이후에, 백신 반응은 백신에서 관심 샘암종 항원(들)에 대한 로버스트 클론 패밀리들이 유발되었는지를 결정하는 것에 의해서 모니터링 될 수 있다. 혈액을 백신화 후 7-14일 사이에 뽑고 재료 및 방법의 “비-터치다운 PCR” 및 “454 XLR70 시퀀싱을 위한 준비”에 기재된바와 같이 형질아세포들을 단일 세포 분류하고, 바코딩하고, 454 시퀀싱을 수행한다. 진화계통수들을 그리고 그런 뒤 각 클론 패밀리의 2-3 멤버들을 실시예 8에 있는 대로 클로닝 및 발현시키고 ELISA에서 관심 스태필로코커스 항원들에 대한 그들의 결합에 대해 테스트한다. 우리는 강한 면역 반응을 가지는 인간들은 관심 폐 샘암종 항원(들)에 대한 많은 클론 패밀리들 및/또는 관심 샘암종 항원(들)에 대한 많은 클론 패밀리들을 가질 것이라고 예상한다. 이 면역 모니터링은 우리가 후보 백신의 효능을 신속히 예측하는 것을 가능케 한다.
실시예 68: 역전사중 주형 전환을 위한 수퍼스크립트 III의 사용
우리의 방법들에서, 샘플 식별 부위 및 어댑터 부위들은 역전사 동안 첨가된다. 이는 RNase H- 역전사효소의 3’ 테일링 활성 및 주형 전환 활성을 활용한다. 더 빈번하게, 수퍼스크립트 II(Invitrogen)과 같은 역전사 효소는 그것의 작동 온도인 42oC에서 사용된다. 또한 내열성(thermal stability)이 조작되고 권장된 50oC의 작동 온도를 갖는 수퍼스크립트 III과 같은 MMLV H- 역전사 효소는 이 3’ 테일링 활성을 가진다고 보고되지 않았으며 그러므로 주형 전환 활성이 없다(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/ProductNotes/F_Superscript%20III%20Enzyme%20RD-MKT-TL-HL0506021.pdf?ProductNoteId=36). 그러나 도 42에서, 우리는 수퍼스크립트 III가 3’ 테일링 및 주형 전환 활성을 갖는 다고 나타내었다. 이 성질은 수퍼스크립트 III에 대한 권장된 역전사 온도인, 50oC에서는 약하고, 왜 수퍼스크립트 III의 3’ 테일링 활성이 이전에 보고되지 않았는지를 설명할 수 있다. 그러나, RT 온도가 50oC에서 45.5oC로 42oC로 낮아졌기 때문에 3’ 테일링 활성 및 주형 전환은 상당히 증가한다. 우리는 내열성을 위해 조작되어 또한 낮은 작동 온도들, 즉 42oC 내지 50oC에서 3’ 테일링 활성을 가지는 모든 MMLV RNase H- 역전사 효소들을 예상할 것이다.
실시예 69: 기억 B세포 및 형질세포 반응들과 연관된 것뿐만 아니라 특이적 조직으로 귀소하는 항체들을 식별하는 공동-발현된 유전자들의 분석.
본 명세서의 방법들 및 조성물들에 의해 설명되는 것과 같이 B세포들, T 세포들, 또는 개별적인 웰들로 분류된 다른 세포들에 의해 생성된 모든 cDNA의 바코딩은 단일 세포 수준에서 형질아세포들, 다른 B세포들, T 세포들 및 다른 세포들 내의 유전자 공동-발현의 특성화를 가능하게 한다. 이는 특이적 항체들 및 기억 B세포들, 형질 세포들, 기억 T세포들, 이펙터 T세포들의 특이적 타입(예를 들어, Th1, Th2, Th17 또는 T-조절자 T 세포들) 안에서 분화하도록 유도되거나, 또는 특이적 조직 또는 자리로 귀소하도록 유도된(예를 들어, 위장관, 피부, 또는 뇌) B 및 T 세포들에 의해 발현된 TCRs을 식별하는 공동-발현된 유전자들의 사용을 가능하게 한다. 특이적 샘플 내에서 세포들의 무리 또는 개별적인 세포에 의해 생성된 모든 cDNA의 바코딩은 특이적 이러한 유전자들의 공동 발현을 특성화하는 1st 및 2nd PCR 둘 모두에 대해 추가적인 3’ PCR 프라이머들의 사용을 가능하게 한다. 5’ 프라이머들은 가변 부위들의 유전자들을 증폭하는데 사용된 것들과 동일한 것을 남긴다. 또한, 공동-발현된 유전자들의 분석은 기억 B세포들, 짧은시간-생존하는 형질아세포들, 및 긴시간-생존하는 형질세포들(표 34)로의 B세포들의 분화, Tregs 또는 Th1, Th2, Th17 세포들(표 35)로의 순수한 또는 기억 T세포들의 분화, 또는 특이적 자리들로의 B 또는 T 세포들의 귀소 와 연관된 유전자들의 공동-발현과 클론 패밀리들의 친화성 성숙 간의 관계들의 생물정보학적 분석을 가능하게 한다. 이러한 분석은 효과적인 면역 반응을 매개하는 중대한(critical) 항체들 또는 TCRs을 더욱 정확히 찾아낼 수 있다.
예를 들어 면역 반응을 시작하는 개체(individuals)들로부터 유래된 PMBCs는 단일 세포 분류 형질아세포들에 사용된다. 본 명세서의 방법들 및 조성물들은 서로 다른 조직들 안에서 형질아세포들의 귀소와 연관된 유전자(표 36을 인용)들의 공동-발현을 분석하는데 사용된다. 데이터세트들의 생물정보학적 분석은 서로 다른 신체의 위치들에서 분비와 연관된 항체들을 식별한다. 이러한 항체 유전자들은 그런 뒤 실시예 8에 있는 것과 같이 시험관 내 스크리닝 검정법 내의 특성화를 위해 재조합적으로 발현된다.
형태에서 다양하게 변화하는 관련 기술 내에서 통상의 지식을 가진자에 의해 이해될 것이고 세부 사항들은 본 발명의 다양한 측면들의 범주 및 취지를 벗어나지 않는 범위 내에서 만들어 질 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위들에서 사용된 것으로서, 단수형들(singular forms) “a,” “an” and “the” 은 문맥에서 명확히 다르게 기재되지 않는 한 복수형 지시대상(plural referents)들을 포함한다는 것을 유의해야 한다.
본 명세서의 본문 내에 인용된 모든 참조 인용들, 등록된 특허들 및 특허 출원들은 모든 목적들에서, 그 전문이 본 명세서에 참조인용 된다.
표
표 1 - 프라이머들 및 어댑터 분자들
seq id no 설명 서열
샘플-ID 어댑터 CACGACCGGTGCTCGATTTAG(샘플-ID)GGG
FW 롱(long)프라이머1 GAGAGACTGACAGCGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG (플레이트-ID)CACGACCGGTGCTCGATTTAG
FW 쇼트(short)프라이머1 GAGAGACTGACAGCGTATCGCCTC
카파GSP1 CGATTGGAGGGCGTTATCCAC
람다GSP1 TYTGTGGGACTTCCACTGCTC
감마GSP1 TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTG
FW 프라이머2 CGTATCGCCTCCCTCGCG
카파GSP 롱 프라이머2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG(플레이트-ID)TCAGATGGC GGGAAGATGAAGAC
람다GSP 롱 프라이머2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG(플레이트-ID)GAGGAGGGY GGGAACAGAGTGAC
감마GSP 롱 프라이머2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG(플레이트-ID)GGAAGTAGT CCTTGACCAGGCAG
카파GSP 2s CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGATGGCGGGAAGATGAAGAC
람다GSP 2s CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGAGGAGGGY GGGAACAGAGTGAC
감마GSP 2s CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG
RV 프라이머2 CTATGCGCCTTGCCAGCCC
* 샘플-ID서열에 대하여, 표 2를 인용. 플레이트-ID서열에 대하여, 표 3을 인용. 카파 GSP 2s, 람다 GSP 2s 및 감마 GSP 2s는 그들이 플레이트-ID 서열을 가지지 않은 것을 제외하고 카파, 람다 및 감마GSP 롱 프라이머 2와 동일하다. 플레이트-ID 서열은 XL+ 런을 할 때, 또는 티타늄 LibA 화학법(Titanium LibA chemistry)으로 XLR70런을 할 때 오직 포워드 리드(forwards reads)를 목적하는 때에는 필수적이지 않다. **프라이머 서열은 IMGT 데이터베이스 내에 있는 것으로서 모든 서로 다른 불변 유전자 변종들을 증폭할 수 있도록 디자인된 것이다(http://imgt.cines.fr/).
표 2 - 샘플-ID
웰 샘플ID 샘플-ID의 서열 SEQ ID NO
A1 1 ACGTCTCATCA
A2 2 ACTCATCTACA
A3 3 AGAGCGTCACA
A4 4 AGTAGTGATCA
A5 5 ATAGATAGACA
A6 6 ATCTACTGACA
A7 7 CACGTGTCGCA
A8 8 CATACTCTACA
A9 9 CGAGACGCGCA
A10 10 CGTCGATCTCA
A11 11 CTACGACTGCA
B1 12 TAGTGTAGATA
B2 13 TCTAGCGACTA
B3 14 TGTGAGTAGTA
B4 15 ACAGTATATAA
B5 16 AGCTCACGTAA
B6 17 TCGATAGTGAA
B7 18 TCGCTGCGTAA
B8 19 TGAGTCAGTAA
B9 20 TGTAGTGTGAA
B10 21 TGTCGTCGCAA
B11 22 ACGACAGCTCA
C1 23 TACACGTGATTAGGGATT
C2 24 TACAGATCGTTAGGGAAA
C3 25 TAGTGTAGATTTGGGTTT
C4 26 TCTAGCGACTTTGGGTTT
C5 27 ACGCGATCGAAGGGTTT
C6 28 AGCTCACGTATTGGGTTT
C7 29 AGTGCTACGAAGGGAAA
C8 30 TCTGACGTCAAAGGGAAA
C9 31 ACGTCTCATCAAGGAAGGAA
C10 32 TATAGACATCAACACACAAA
C11 33 AGTGAGCTCGTTGGGTTT
D1 34 ATCGTCTGTGTTGGGTTT
D2 35 CACACGATAGTTGGGTTT
D3 36 CTGCGTCACGATCTCTCTT
D4 37 TAGCATACTGTTGGGTTT
D5 38 TATCTGATAGTTGGGTTT
D6 39 TGACATCTCGCAGTTCTTT
D7 40 TGATAGAGCGTAACAACAGA
D8 41 TCACGCGAGAAAGGGAAA
D9 42 ACACATACGCAGGGAAA
D10 43 ACTAGCAGTAA
D11 44 CGCAGTACGAA
E1 45 TGAGTCAGTAAGGGAAA
E2 46 ACTCATCTACAGGGAAA
E3 47 ACTCGCGCACAGAGAGAA
E4 48 AGAGCGTCACAGAGAGAA
E5 49 AGCGACTAGCAACACACAAA
E6 50 ATCTACTGACAACACACAA
E7 51 CATACTCTACAACACACAAA
E8 52 TCGAGCTCTCAGAGAGAAA
E9 53 AGAGAGTGTGTTGGGTTT
E10 54 ATCGTAGCAGAACACACAAA
E11 55 CACTCGCACGTTGGGTTT
F1 56 CAGACGTCTGAACACACAAA
F2 57 CTCGATATAGTTGGGTTT
F3 58 TCTGATCGAGAAGGGAAA
F4 59 TACACACACTTAGGGATT
F5 60 TACGTCATCAGGGAAA
F6 61 CTACGCTCTAAGGGAAA
F7 62 TAGTCGCATAAAGGGAAA
F8 63 CGATCGTATAA
F9 64 CGCGTATACAA
F10 65 CTACGCTCTAA
F11 66 TCACGCGAGAA
G1 67 AGTATACATATTGGGTTT
G2 68 TCGATAGTGAAGGGAAA
G3 69 TCGCTGCGTAAAGGAGAAA
G4 70 TGTAGTGTGAAGGGAAA
G5 71 TGTCGTCGCAAGAGAGAG
G6 72 CTACGACTGCAAGGGAAA
G7 73 CTCTACGCTCA
G8 74 TAGCTCTATCA
G9 75 TATAGACATCA
G10 76 TCACTCATACA
G11 77 CTAGTCACTCAAGGGAAA
H1 78 TGTGAGTAGTTTGGGTTT
H2 79 TGTCACACGAAGGGAAA
H3 80 CTGTGCGTCGAAGGGAAA
H4 81 TAGTGTAGATTCGC
H5 82 TCGAGCTCTCTCGC
H6 83 ATCACGTGCGTCGC
H7 84 CAGACGTCTGTCGC
H8 85 TATCACTCAGTCGC
H9 86 TGCTATAGACTTGGGTTT
H10 87 CAGTACTGCGTTGGGTTT
H11 88 CGACAGCGAGAACACACAAA
A12-H12 89 TATGCTAGTAA (음성 대조군)
표 3 - 플레이트-ID
플레이트 플레이트ID의 서열 SEQ ID NO
1 ACGAGTGCGT
2 ACGCTCGACA
3 AGACGCACTC
4 AGCACTGTAG
5 ATCAGACACG
6 ATATCGCGAG
7 CGTGTCTCTA
8 CTCGCGTGTC
9 TGATACGTCT
10 CATAGTAGTG
11 CGAGAGATAC
12 ATACGACGTA
13 TCACGTACTA
14 CGTCTAGTAC
15 TCTACGTAGC
16 TGTACTACTC
17 CGTAGACTAG
18 TACGAGTATG
19 TACTCTCGTG
20 TAGAGACGAG
21 TCGTCGCTCG
22 ACATACGCGT
23 ACGCGAGTAT
24 ACTACTATGT
25 ACTGTACAGT
26 AGACTATACT
27 AGCGTCGTCT
28 AGTACGCTAT
29 ATAGAGTACT
30 CACGCTACGT
31 CAGTAGACGT
32 CGACGTGACT
33 TACACACACT
34 TACACGTGAT
35 TACAGATCGT
36 TACGCTGTCT
37 TAGTGTAGAT
38 TCGATCACGT
39 TCGCACTAGT
40 TCTAGCGACT
41 TCTATACTAT
42 TGACGTATGT
43 TGTGAGTAGT
44 ACAGTATATA
45 ACGCGATCGA
46 ACTAGCAGTA
47 AGCTCACGTA
48 AGTATACATA
49 AGTCGAGAGA
50 AGTGCTACGA
51 CGATCGTATA
52 CGCAGTACGA
53 CGCGTATACA
54 CGTACAGTCA
55 CGTACTCAGA
56 CTACGCTCTA
57 CTATAGCGTA
58 TACGTCATCA
59 TAGTCGCATA
60 TATATATACA
표 4 - 클로닝 프라이머들
seq id no 설명 서열
Clon_PacI ACTGTTAATTAA(샘플-ID)
Clon_AscI ATTAGGCGCGCC(샘플-ID)
Clon_FseI ATTAGGCCGGCC(샘플-ID)
Clon_AsiSI ATTAGCGATCGC(샘플-ID)
K_NheIa_DHFR ACGTGCTAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTCATCAGA
K_Xho1d_DHFR ACGTCTCGAGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACA
L_XhoI_PspXI_DHFR ACTTGCTCGAGTCTGCYTTCCARGCMACTGT
L_NheI_DHFR AGTCGCTAGCCGCRTACTTGTTGTTGCTYTGTTTG
G_EcoRI_DHFR AGTCGAATTCCACGACACCGTCACCGGTT
G_SacII_DHFR ATTACCGCGGGGAAGGTGTGCACGCCG
G_XhoI_PspXI_Lonza acgtCTCGAGGGTGccagggggaagaccgatg
G_AgeI_Lonza actgACCGGTTCGgggaagtagtccttgaccaggca
G_EcoRI_Lonza tgcaGAAttccacgacaccgtcaccg
G_ApaI_Lonza tgtaGGGCcctgagttccacgacaccgtc
L_XmaI_Lonza TGATcccgggaTAGAAGTCACTKATSAGRCACACYAGTGTGG
L_BstEII_Lonza tgcaGGTCACCgctcccgggtagaagtcactkatsagr
L_XhoI_PspXI_v2_Lonza tgatGCTCGAGtctgcyttccargcmactgtc
K_XmaI_Lonza tagtCCCGgggatagaagttattcagcaggcacac
*클로닝 포워드 프라이머(Cloning forward primers)는 5’ 측면(flanking) 제한 자리로 시작하여 3’말단 상에 있는 샘플-ID 서열로 끝난다. 이는 클로닝 프라이머를 서로 다른 웰 기원으로 서열들 사이에서 구별 하게 하고 선택적으로 특이적 샘플-ID 서열로 앰프리콘을 증폭하게 한다. 그러므로, 각각이 특정한 샘플-ID(들)에 대해 특이적인, 다중 클로닝 포워드 프라이머가 존재한다. 클로닝 포워드 프라이머의 3’ 서열은 웰-ID와 상보적이고 표 5에서 제공된다. “클론(Clon)”으로 시작하는 이름을 가진 프라이머는 포워드 프라이머이다. “K”, “L” 또는 “G”로 시작하는 이름을 가진 프라이머는 리버스 프라이머(reverse primers)이며 이는 각각 카파, 람다 및 감마 체인에 대해 특이적인 불변 부위이다. 리버스 프라이머의 이름은 또한 프라이머가 추가될 제한 자리를 표시한다. 마지막으로, “DHFR” 또는 “론자(Lonza)”는 불변 부위 프라이머가 그에 첨가된 불변 부위 삽입들을 가지는 벡터 세트 pcDNA3.3 및 pOptivec 또는 론자(Lonza) 벡터pEE12.4 및 pEE6.4 중 각각 어느 것에 대한 것인지를 표시한다.
표 5 - 클로닝 프라이머들 웰-특이적 서열(Cloning Primers Well-Specific Sequence)
웰 서열 SEQ ID NO
A1 GGTGCTCGATTTAGACGTCTCATCAG
A2 CGGTGCTCGATTTAGACTCATCTACAG
A3 GTGCTCGATTTAGAGAGCGTCACAG
A4 CGGTGCTCGATTTAGAGTAGTGATCA
A5 ACCGGTGCTCGATTTAGATAGATAGACA
A6 CGGTGCTCGATTTAGATCTACTGACAG
A7 CTCGATTTAGCACGTGTCGCA
A8 CGGTGCTCGATTTAGCATACTCTACA
A9 CGATTTAGCGAGACGCGCA
A10 TGCTCGATTTAGCGTCGATCTCA
A11 GTGCTCGATTTAGCTACGACTGCA
B1 GACCGGTGCTCGATTTAGTAGTGTAGATAG
B2 CGGTGCTCGATTTAGTCTAGCGACTAG
B3 ACCGGTGCTCGATTTAGTGTGAGTAGTAG
B4 CGACCGGTGCTCGATTTAGACAGTATATAA
B5 GGTGCTCGATTTAGAGCTCACGTAAG
B6 CGGTGCTCGATTTAGTCGATAGTGAA
B7 TGCTCGATTTAGTCGCTGCGTAAG
B8 CGGTGCTCGATTTAGTGAGTCAGTAA
B9 CGGTGCTCGATTTAGTGTAGTGTGAA
B10 GCTCGATTTAGTGTCGTCGCAA
B11 GTGCTCGATTTAGACGACAGCTCA
C1 CGGTGCTCGATTTAGTACACGTGATT
C2 CGGTGCTCGATTTAGTACAGATCGTT
C3 GACCGGTGCTCGATTTAGTAGTGTAGATTT
C4 CGGTGCTCGATTTAGTCTAGCGACTTT
C5 GCTCGATTTAGACGCGATCGAA
C6 GGTGCTCGATTTAGAGCTCACGTATT
C7 GGTGCTCGATTTAGAGTGCTACGAA
C8 GGTGCTCGATTTAGTCTGACGTCAA
C9 GGTGCTCGATTTAGACGTCTCATCAA
C10 ACCGGTGCTCGATTTAGTATAGACATCAA
C11 GGTGCTCGATTTAGAGTGAGCTCGT
D1 GGTGCTCGATTTAGATCGTCTGTGT
D2 GGTGCTCGATTTAGCACACGATAGT
D3 GCTCGATTTAGCTGCGTCACGA
D4 CCGGTGCTCGATTTAGTAGCATACTGT
D5 GACCGGTGCTCGATTTAGTATCTGATAGT
D6 GTGCTCGATTTAGTGACATCTCGC
D7 CGGTGCTCGATTTAGTGATAGAGCGT
D8 GCTCGATTTAGTCACGCGAGAAA
D9 GGTGCTCGATTTAGACACATACGCA
D10 CCGGTGCTCGATTTAGACTAGCAGTAA
D11 TGCTCGATTTAGCGCAGTACGAA
E1 CGGTGCTCGATTTAGTGAGTCAGTAA
E2 CGGTGCTCGATTTAGACTCATCTACAG
E3 GCTCGATTTAGACTCGCGCACA
E4 GTGCTCGATTTAGAGAGCGTCACAG
E5 GGTGCTCGATTTAGAGCGACTAGCA
E6 CGGTGCTCGATTTAGATCTACTGACAA
E7 CGGTGCTCGATTTAGCATACTCTACA
E8 GTGCTCGATTTAGTCGAGCTCTCAG
E9 CGGTGCTCGATTTAGAGAGAGTGTGT
E10 GGTGCTCGATTTAGATCGTAGCAGA
E11 GCTCGATTTAGCACTCGCACGT
F1 TGCTCGATTTAGCAGACGTCTGAA
F2 CGGTGCTCGATTTAGCTCGATATAGT
F3 GGTGCTCGATTTAGTCTGATCGAGA
F4 CGGTGCTCGATTTAGTACACACACTT
F5 CGGTGCTCGATTTAGTACGTCATCA
F6 CGGTGCTCGATTTAGCTACGCTCTAA
F7 CGGTGCTCGATTTAGTAGTCGCATAA
F8 GGTGCTCGATTTAGCGATCGTATAA
F9 GGTGCTCGATTTAGCGCGTATACAA
F10 CGGTGCTCGATTTAGCTACGCTCTAA
F11 GCTCGATTTAGTCACGCGAGAAG
G1 ACGACCGGTGCTCGATTTAGAGTATACATAT
G2 CGGTGCTCGATTTAGTCGATAGTGAA
G3 GCTCGATTTAGTCGCTGCGTAAA
G4 CGGTGCTCGATTTAGTGTAGTGTGAA
G5 GCTCGATTTAGTGTCGTCGCAA
G6 GTGCTCGATTTAGCTACGACTGCA
G7 GGTGCTCGATTTAGCTCTACGCTCA
G8 CCGGTGCTCGATTTAGTAGCTCTATCA
G9 ACCGGTGCTCGATTTAGTATAGACATCAG
G10 CGGTGCTCGATTTAGTCACTCATACA
G11 CGGTGCTCGATTTAGCTAGTCACTCA
H1 CGGTGCTCGATTTAGTGTGAGTAGTTT
H2 GGTGCTCGATTTAGTGTCACACGAA
H3 GCTCGATTTAGCTGTGCGTCGA
H4 GACCGGTGCTCGATTTAGTAGTGTAGATTC
H5 GGTGCTCGATTTAGTCGAGCTCTCTC
H6 TGCTCGATTTAGATCACGTGCGT
H7 GTGCTCGATTTAGCAGACGTCTGTC
H8 CCGGTGCTCGATTTAGTATCACTCAGT
H9 ACCGGTGCTCGATTTAGTGCTATAGACT
H10 GGTGCTCGATTTAGCAGTACTGCGT
H11 GCTCGATTTAGCGACAGCGAGA
표 6
seq id no 설명 서열
카파에 대한 (For kappa)
IgKC_v3 CAGATGGCGGGAAGATGAAGAC
람다에 대한 (For Lambda)
IgLC_v5 CTCCCGGGTAGAAGTCAC
IgLC_v6 TCCCGGGTAGAAGTCAC
IgLC_v7 GCTCCCGGGTAGAAGTC
IgLC_v8 AGTGTGGCCTTGTTGG
감마에 대한
IgHGC_v10 GCCAGGGGGAAGACCGATG
IgHGC_v11 CAGGGGGAAGACCGATG
IgHGC_v13 AAGTAGTCCTTGACCAGGC
IgHGC_v15 GAAGACCGATGGGCCCTTGG
IgHGC_v16 AAGACCGATGGGCCCTTG
어댑터_v1 G
어댑터_v2 GGGGG
어댑터_v3 rGrGrG
Univ_seq_2 AACGCGTGACGAGAGACTGACAG
Univ_seq_4 TTGTTGCGTTCCTAGCCGCTATAG
Univ_seq_5 CTCTACGACCGGTGCTCGATTTAG
Univ_seq_e CCGTCGGTCGGCAGTG
카파 라이트 체인 특이적
IgKC_v4 ATGGCGGGAAGATGAAGAC
K_GSP1 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
K_GSP1c AGCAGGCACACAACAGAG
K_GSP1e ttgtgtttctcgtagtctgctttgc
K_GSP1f tctcccctgttgaagctctttgtg
IgLC_v5 CTCCCGGGTAGAAGTCAC
L_GSP1 ATCTGCCTTCCAGGCCACTGTC
L_GSP1c CTCCCGGGTAGAAGTCAC
L_GSP1d ACRGCTCCCGGGTAGAAGTCAC
L_GSP1f TCCACGGTGCTCCCTTCAT
L_GSP1g GGCCGCRTACTTGTTGTTGC
L_GSP1h GCCTTCCAGGCCACTGTCAC
L_GSP1i CTGCCTTCCAGGCCACTGTC
L_GSP1j CTCCACGGTGCTCCCTTCA
L_GSP1k GCTCCCTTCATGCGTGACC
L_GSP1l TCTGTGGGACTTCCACTGCTC
L_GSP1m GGGGCCACTGTCTTCTCCA
L_GSP1n CTTCTGTGGGACTTCCACTGCT
L_GSP1o ATCTGCCTTCCAGGCCACTGT
L_GSP1x CTTYTGTGGGACTTCCACTGCTC
L_GSP1y GCTTYTGTGGGACTTCCACTGCTC
IgHGC_v13 AAGTAGTCCTTGACCAGGC
G_GSP1c TTCCACGACACCGTCAC
G_GSP1d CACGCCGCTGGTCAG
G_GSP1g GCTGCTGAGGGAGTAGAGTCCTGA
G_GSP1h TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCT
G_GSP1k GCTGGAGGGCACGGTCAC
G_GSP1 TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTG
G_GSP1m TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCT
G_GSP1n GACTGTAGGACAGCCGGGAAGG
G_GSP1o ACCACGCTGCTGAGGGAGTAG
G_GSP1p TTGTCCACCTTGGTGTTGCTG
G_GSP1q TGAGTTCCACGACACCGTCAC
G_GSP1t GAGTTCCACGACACCGTCACC
카파 특이적
K_GSP2 ATGGCGGGAAGATGAAGAC
K_GSP2v2a ATGGCGGGAAGATGAAGAC
K_GSP2v2b TGGCGGGAAGATGAAGAC
K_GSP2v2d CGGAAGATGAAGACAGATGGT
K_GSP2v2e GCAGTTCCAGATTTCAACTG
K_GSP2v2f ATGGTGCAGCCACAGTT
K_GSP2v2c CAGATTTCAACTGCTCATCAGAT
K_GSP2v2g TCAGATGGCGGGAAGATGAAGAC
람다 특이적
L_GSP2 CTCCCGGGTAGAAGTCAC
L_GSP2v2c AGGGYGGGAACAGAGTGAC
L_GSP2v2 CTCCCGGGTAGAAGTCAC
L_GSP2v2d GAGGAGGGYGGGAACAGAGTGAC
감마 특이적
G_GSP2v2c1 GCCAGGGGGAAGACCG
G_GSP2v2c2 GGAAGTAGTCCTTGACCAGG
G_GSP2b GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG
G_GSP2 AAGTAGTCCTTGACCAGGC
표 7
플레이트-ID SEQ ID NO
TATGCTAGTA
TCACGCGAGA
TCGATAGTGA
TCGCTGCGTA
TCTGACGTCA
TGAGTCAGTA
TGTAGTGTGA
TGTCACACGA
TGTCGTCGCA
ACACATACGC
ACAGTCGTGC
ACATGACGAC
ACGACAGCTC
ACGTCTCATC
ACTCATCTAC
ACTCGCGCAC
AGAGCGTCAC
AGCGACTAGC
AGTAGTGATC
AGTGACACAC
AGTGTATGTC
ATAGATAGAC
ATATAGTCGC
ATCTACTGAC
CACGTAGATC
CACGTGTCGC
CATACTCTAC
CGACACTATC
CGAGACGCGC
CGTATGCGAC
CGTCGATCTC
CTACGACTGC
CTAGTCACTC
CTCTACGCTC
CTGTACATAC
TAGACTGCAC
TAGCGCGCGC
TAGCTCTATC
TATAGACATC
TATGATACGC
TCACTCATAC
TCATCGAGTC
TCGAGCTCTC
TCGCAGACAC
TCTGTCTCGC
TGAGTGACGC
TGATGTGTAC
TGCTATAGAC
TGCTCGCTAC
ACGTGCAGCG
ACTCACAGAG
AGACTCAGCG
AGAGAGTGTG
AGCTATCGCG
AGTCTGACTG
AGTGAGCTCG
ATAGCTCTCG
ATCACGTGCG
ATCGTAGCAG
ATCGTCTGTG
ATGTACGATG
ATGTGTCTAG
CACACGATAG
CACTCGCACG
CAGACGTCTG
CAGTACTGCG
CGACAGCGAG
CGATCTGTCG
CGCGTGCTAG
CGCTCGAGTG
CGTGATGACG
CTATGTACAG
CTCGATATAG
CTCGCACGCG
CTGCGTCACG
CTGTGCGTCG
TAGCATACTG
TATACATGTG
TATCACTCAG
TATCTGATAG
TCGTGACATG
TCTGATCGAG
TGACATCTCG
TGAGCTAGAG
TGATAGAGCG
TGCGTGTGCG
TGCTAGTCAG
TGTATCACAG
TGTGCGCGTG
표 8
샘플-ID SEQ ID NO
ACGAGTGCGT
TAGACTGCAC
TAGCGCGCGC
TCATCGAGTC
TCGCAGACAC
TCTGTCTCGC
TGATACGTCT
TGAGTGACGC
TGCTCGCTAC
ACGTGCAGCG
ACTCACAGAG
AGACTCAGCG
AGCTATCGCG
AGTCTGACTG
ATAGCTCTCG
CATAGTAGTG
CGATCTGTCG
CGCGTGCTAG
CGCTCGAGTG
CGAGAGATAC
TGAGCTAGAG
ATACGACGTA
TGCGTGTGCG
TGCTAGTCAG
TGTATCACAG
TGTGCGCGTG
TCACGTACTA
CGTCTAGTAC
TCTACGTAGC
TGTACTACTC
ACGCTCGACA
ACGACTACAG
CGTAGACTAG
TACTCTCGTG
TAGAGACGAG
TCGTCGCTCG
ACATACGCGT
ACGCGAGTAT
ACTGTACAGT
AGACGCACTC
AGACTATACT
AGCGTCGTCT
AGTACGCTAT
ATAGAGTACT
CACGCTACGT
CAGTAGACGT
CGACGTGACT
AGCACTGTAG
TACGCTGTCT
TCGATCACGT
TCGCACTAGT
TCTATACTAT
ATCAGACACG
AGTCGAGAGA
CGTACAGTCA
CGTACTCAGA
ATATCGCGAG
CTATAGCGTA
TATATATACA
CGTGTCTCTA
ACAGTCGTGC
CTCGCGTGTC
AGTGACACAC
ATATAGTCGC
CACGTAGATC
CGACACTATC
CTGTACATAC
표 9-XL+ 시퀀싱을 위해 어댑터 상에 라이게이션하기 위한 프라이머들
seq id no 설명 서열
5LIB-LA CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGTATCGCCTCCCTCGCGCCAT
5LIB-LB CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCGTATCGCCTCCCTCGCGCCAT
3LIB-LA CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCA
3LIB-LB CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCA
표 10-다른 인간 유전자들을 위한 3' 프라이머들
seq id no 설명 서열
mu 불변 부위 특이적
mu GSP1 CTCTCAGGACTGATGGGAAGCC
mu GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGAATTCTCACAGGAGACGAGG
알파 불변 부위 특이적
알파 GSP1 ATTCGTGTAGTGCTTCACGTGGC
알파 GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTCAGCGGGAAGACCTTGGG
TCR 알파 불변 부위 특이적
TR 알파 GSP1a cgtttgcacatgcaaagtcagatt
TR 알파 GSP2b CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGtcggtgaataggcagacagacttg
TRC 베타 불변 부위 특이적
TR 베타 GSP1 CCTATCCTGGGTCCACTCGTCA
TR 베타 GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGCTTCTGATGGCTCAAACACA
표 11-마우스 유전자들을 위한3' 프라이머들
seq id no 설명 서열
mu 불변 부위 특이적
mouse_mu_GSP1 CTGAACCTTCAAGGATGCTCTTGG
mouse_mu_GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGAAGACATTTGGGAAGGACTGACTC
알파 불변 부위 특이적
mouse_alpha_GSP1 TCTCCTTCTGGGCACTCGACAG
mouse_alpha_GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGAGTGTCAGTGGGTAGATGGTG
감마 불변 부위 특이적
mo_g12b_GSP1d AGGGGACAGTCACTGAGCTGCT
mo_g2ac_GSP1d TCGAGGTTACAGTCACTGAGCTGCT
mo_g3_GSP1d TGGAGGGTACAGTCACCAAGCTGCT
mo_g12_GSP2d CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGCCAGTGGATAGACHGATGG
mo_g3_GSP2d CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGACCAAGGGATAGACAGATGG
mo_g12_GSP2e CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC
mo_g3_GSP2e CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGGACAGGGCTCCATAGTTCC
카파 불변 부위 특이적
mouse_kappa_GSP1 GAAGTTGATGTCTTGTGAGTGGCCT
mouse_kappa_GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGCTCACTGGATGGTGGGAA
lambda constant region specific
mouse_lambda_GSP1a ACTCTTCTCCACAGTGTCCCCTTCATG
mouse_lambda_GSP1b ACTCTTCTCCACAGTGTGACCTTCATG
mouse_lambda_GSP2a CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGAGGAAGGTGGAAACASGGTGA
mouse_lambda_GSP2b CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGGGGAAGGTGGAAACATGGTGA
TCR 알파 불변 부위 특이적
mo_TRA_GSP1b TTGAAGATATCTTGGCAGGTGAAGCTT
mouse_TRA_GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCACAGCAGGTTCTGGGTTCTGG
TRC beta constant region specific
mouse_TRB_GSP1 GAAAGCCCATGGAACTGCACTTG
mouse_TRB_GSP2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGTGGAGTCACATTTCTCAGATCC
*람다 GSP1a 및 GSP1b는 50:50이 되도록 혼합되고, 람다 GSP2a 및 람다 GSP2b는 또한 IMGT 내에 있는 모든 람다 불변 부위 대립 인자(alleles)를 증폭하기 위해 50:50이 되도록 혼합된다. 모든 감마 GSP1ds는 또한 모든 감마 1, 2a, 2b, 2c 및 3 불변 부위 대립인자를 증폭하기 위해 동일하게 혼합된다. 감마 GSP2ds는 또한 50:50으로 혼합되고, 감마 GSP2es는 또한 IMGT 데이터베이스 내에 있는 모든 감마 1, 2a, 2b, 2c, 및 3 불변 부위 대립인자를 증폭시키기 위해 50:50으로 혼합된다.
표 12-환자 표시를 위한 플레이트(Plate to patient referencing)
플레이트ID 환자
2 B Staph
3 B Staph
4 B Staph
5 B Staph
7 Lung Adeno
8 Lung Adeno
9 Lung Adeno
10 Lung Adeno
11 360 CCP+RA
12 360 CCP+RA
13 360 CCP+RA
14 361 Staph
15 361 Staph
16 361 Staph
17 361 Staph
18 368 CCP+RF+RA
19 368 CCP+RF+RA
21 368 CCP+RF+RA
22 368 CCP+RF+RA
26 372 CCP+RF+RA
27 372 CCP+RF+RA
40 375 CCP+RF+
41 375 CCP+RF+
43 375 CCP+RF+
44 369 CCP+RF+RA
46 372 CCP+RF+RA
47 372 CCP+RF+RA
48 375 CCP+RF+
49 Flu
51 Flu
52 Flu
53 Flu
표 13
플레이트 ID 플레이트 식별 부위 규칙적 발현(Identification Region Regular Expression)
1 ACGAGTGCGT
2 ACGCTCGACA
3 AGACGCACTC
4 AGCACTGTAG
5 ATCAGACACG
6 ATATCGCGAG
7 CGTGTCTCTA
8 CTCGCGTGTC
9 TGATACGTCT
10 CATAGTAGTG
11 CGAGAGATAC
12 ATACGACGTA
13 TCACGTACTA
14 CGTCTAGTAC
15 TCTACGTAGC
16 TGTACTACTC
17 CGTAGACTAG
18 TACGAGTATG
19 TACTCTCGTG
20 TAGAGACGAG
21 TCGTCGCTCG
22 ACATACGCGT
23 ACGCGAGTAT
24 ACTACTATGT
25 ACTGTACAGT
26 AGACTATACT
27 AGCGTCGTCT
28 AGTACGCTAT
29 ATAGAGTACT
30 CACGCTACGT
31 CAGTAGACGT
32 CGACGTGACT
33 TACACACACT
34 TACACGTGAT
35 TACAGATCGT
36 TACGCTGTCT
37 TAGTGTAGAT
38 TCGATCACGT
39 TCGCACTAGT
40 TCTAGCGACT
41 TCTATACTAT
42 TGACGTATGT
43 TGTGAGTAGT
44 ACAGTATATA
45 ACGCGATCGA
46 ACTAGCAGTA
47 AGCTCACGTA
48 AGTATACATA
49 AGTCGAGAGA
50 AGTGCTACGA
51 CGATCGTATA
52 CGCAGTACGA
53 CGCGTATACA
54 CGTACAGTCA
55 CGTACTCAGA
56 CTACGCTCTA
57 CTATAGCGTA
58 TACGTCATCA
59 TAGTCGCATA
60 TATATATACA
표 14
샘플ID 샘플 식별 부위 규칙적 발현(Sample Identification Region Regular Expression)
1,31 ACGTCTCATC
2,46 ACTCATCTAC
3,48 AGAGCGTCAC
4 AGTAGTGATC
5 ATAGATAGAC
6,50 ATCTACTGAC
7 CACGTGTCGC
8,51 CATACTCTAC
9 CGAGACGCGC
10 CGTCGATCTC
11,72 CTACGACTGC
12,81,25 TAGTGTAGAT
13,26 TCTAGCGACT
14,78 TGTGAGTAGT
15 ACAGTATATA
16,28 AGCTCACGTA
17,68 TCGATAGTGA
18,69 TCGCTGCGTA
19,45 TGAGTCAGTA
20,70 TGTAGTGTGA
21,71 TGTCGTCGCA
22 ACGACAGCTC
23 TACACGTGAT
24 TACAGATCGT
27 ACGCGATCGA
29 AGTGCTACGA
30 TCTGACGTCA
75,32 TATAGACATC
33 AGTGAGCTCG
34 ATCGTCTGTG
35 CACACGATAG
36 CTGCGTCACG
37 TAGCATACTG
38 TATCTGATAG
39 TGACATCTCG
40 TGATAGAGCG
66,41 TCACGCGAGA
42 ACACATACGC
43 ACTAGCAGTA
44 CGCAGTACGA
47 ACTCGCGCAC
49 AGCGACTAGC
52,82 TCGAGCTCTC
53 AGAGAGTGTG
54 ATCGTAGCAG
55 CACTCGCACG
56,84 CAGACGTCTG
57 CTCGATATAG
58 TCTGATCGAG
59 TACACACACT
60 TACGTCATCA
65,61 CTACGCTCTA
62 TAGTCGCATA
63 CGATCGTATA
64 CGCGTATACA
67 AGTATACATA
73 CTCTACGCTC
74 TAGCTCTATC
76 TCACTCATAC
77 CTAGTCACTC
79 TGTCACACGA
80 CTGTGCGTCG
83 ATCACGTGCG
85 TATCACTCAG
86 TGCTATAGAC
87 CAGTACTGCG
88 CGACAGCGAG
89 TATGCTAGTA
표 15
샘플ID 샘플 식별 부위 규칙적 발현(Sample Identification Region Regular Expression)
1,31 ACGTCTCATCAAGGAAGGAAGG+
2,46 ACTCATCTACAGG+AA+GG+
3,48 AGAGCGTCACAGAGAGAAGG+
6,50 ATCTACTGACAACACACAAGG+
8,51 CATACTCTACAACACACAA+GG+
11,72 CTACGACTGCAAGG+AA+GG+
12,81,25 TAGTGTAGATT+GG+TT+GG+
12,81 TAGTGTAGATTCGCGG+
13,26 TCTAGCGACTT+GG+TT+GG+
14,78 TGTGAGTAGTT+GG+TT+GG+
16,28 AGCTCACGTATTGG+TT+GG+
17,68 TCGATAGTGAAGG+AA+GG+
18,69 TCGCTGCGTAA+GGAGAA+GG+
19,45 TGAGTCAGTAAGG+AA+GG+
20,70 TGTAGTGTGAAGG+AA+GG+
21,71 TGTCGTCGCAAGAGAGAGG+
75,32 TATAGACATCAACACACAA+GG+
66,41 TCACGCGAGAAAGG+AA+GG+
52,82 TCGAGCTCTCTCGCGG+
56,84 CAGACGTCTGTCGCGG+
65,61 CTACGCTCTAAGG+AA+GG+
표 16. DHFR 벡터 pcDNA3.3 및 pOptivec를 위한 불변 지역 삽입 서열들(Constant region insert sequences for DHFR vectors pcDNA3.3 and pOptivec)
Seq ID no 설명 서열
IGHG1-G1m3 불변 지역 삽입 서열 (침묵 돌연변이를 통해 도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 BstBI, EcoRI, SacII, BbvCI) AATGTACAACTGACTGAGGATCCT
IGKC-Km3 불변 부위삽입 서열 (침묵 돌연변이를 통해도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 NheI, XhoI) TAAGCTTACTGACTAGGCCGGCCTTAATTAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCTCGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAATCGATACTGACTGAGGATCCT
IGLC-Mcg-Ke-Oz- 불변 부위 삽입 서열 (침묵 돌연변이를 통해도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 Bsu36I, XhoI, PspXI, NheI) TAAGCTTACTGACTAGGCCGGCCTTAATTAAGGTCAGCCTAAGGCTGCCCCCAGCGTCACTCTGTTCCCTCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATCAGTGACTTCTACCCCGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGACTCGAGCCCCGTCAAGGCTGGAGTGGAGACCACCACACCTTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCAGCTAGCAGCTACCGCAGCCTGACCCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACTCCTGCCAGGTCACACATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCCACAGAATGTTCATGATAAATCGATACTGACTGAGGATCCT
표 17. Lonza 벡터들에 대한 불변 부위 삽입 서열들
seq id no 설명 서열
IGHG1-G1m3 불변 부위 삽입서열 (침묵 돌연변이를 통해도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 EcoRI, ApaI, AgeI, KpnI, XhoI) AAGCTTGGCGCGCCTTAATTAAGCCAGCACAAAAGGCCCCAGTGTGTTTCCCTTGGCACCCTCGAGCAAGAGTACATCTGGAGGTACAGCTGCCTTGGGCTGTTTGGTGAAAGACTATTTCCCCGAACCGGTTACTGTCTCTTGGAATTCCGGGGCCCTCACCAGTGGTGTCCATACCTTTCCCGCGGTGCTTCAGAGTTCCGGTTTGTATTCCCTGTCAAGTGTCGTGACGGTACCAAGTTCAAGTCTAGGCACCCAGACATATATCTGTAACGTCAACCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTTGACAAGCGGGTTGAACCTAAGTCCTGTGACAAGACCCATACCTGCCCCCCATGCCCCGCACCCGAGCTCCTCGGAGGGCCTTCCGTCTTTCTTTTCCCTCCCAAACCCAAGGACACTTTGATGATCTCAAGAACACCAGAAGTCACTTGCGTCGTGGTTGACGTGTCTCACGAAGATCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGGGTAGAGGTTCATAACGCCAAGACCAAACCCCGAGAGGAACAGTATAACTCCACCTATAGGGTAGTGTCCGTGCTCACCGTGCTCCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGTAATAAGGCACTGCCTGCACCCATTGAGAAGACAATATCTAAAGCAAAGGGACAGCCCAGAGAGCCCCAGGTTTATACTCTGCCACCTAGCAGAGAGGAAATGACTAAAAACCAGGTCAGCCTTACTTGTCTCGTAAAAGGCTTTTATCCAAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAATCAAATGGCCAACCTGAGAATAATTATAAGACTACACCTCCCGTCCTTGACTCAGACGGTTCCTTCTTCCTGTATAGCAAGCTCACCGTCGATAAAAGTCGGTGGCAACAGGGAAACGTGTTCTCATGCAGCGTCATGCACGAGGCCTTGCACAATCATTACACCCAGAAGTCTCTGTCCCTGAGCCCTGGAAAGTGATCA
IGKC-Km3 불변 부위 삽입 서열(침묵 돌연변이를 통해도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 XmaI, EcoRI, BstEII,) AAGCTTAATTAAGGCGCGCCGAACAGTGGCTGCTCCTTCCGTGTTCATATTCCCCCCATCCGACGAGCAGCTTAAATCTGGGACTGCTAGCGTCGTGTGCCTGTTGAATAATTTTTATCCCCGGGAGGCTAAGGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCAGGGAATTCCCAGGAGTCGGTCACCGAACAGGACAGCAAGGACTCAACCTACTCTCTGTCATCCACTCTCACACTCAGCAAAGCCGACTATGAAAAACACAAAGTGTATGCTTGCGAGGTGACTCATCAAGGGCTCTCCAGTCCTGTGACTAAATCCTTCAACCGAGGCGAATGCTGATCA
IGLC-Mcg-Ke-Oz- 불변 부위 삽입 서열 (침묵 돌연변이를 통해도입된 가변 부위 내의 스플라이싱에 대한 제한 자리들 DraIII, XmaI, BstEII, PspXI) AAGCTTGGCGCGCCTTAATTAAGGCCAGCCTAAAGCCGCACCCAGTGTGACCCTGTTTCCTCCCTCCTCTGAAGAGCTCCAGGCAAACAAAGCTACTCTGGTGTGTCTTATTAGCGATTTCTATCCCGGGGCGGTGACCGTGGCTTGGAAGGCCGACTCGAGCCCAGTGAAGGCCGGAGTGGAAACTACAACCCCTTCCAAACAGTCAAACAATAAATACGCCGCTAGCAGCTATCTCTCTCTCACCCCAGAACAGTGGAAATCCCACAGGTCCTATTCTTGCCAGGTCACACACGAGGGGTCAACCGTTGAGAAGACTGTTGCCCCAACAGAGTGCAGCTGATCA
표 18. 발현된 모든 항체들(All expressed antibodies)
SEQ ID NO 항체 체인 타입 클론 V-유전자 및 대립유전자 J-유전자 및 대립유전자 D-유전자 및 대립 유전자
LC1 라이트 체인 K8B8 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
LC1 헤비 체인 G8B8 IGHV1-46*01 F, 또는 IGHV1-46*03 F IGHJ3*01 F, 또는IGHJ3*02 F IGHD5-24*01 ORF
LC2 라이트 체인 K8C11 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F, or IGKJ4*01 F
LC2 헤비 체인 G8C11 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD6-25*01 F
LC3 라이트 체인 K8D6 IGKV3-20*01 F IGKJ1*01 F
LC3 헤비 체인 G8D6 IGHV1-46*01 F, 또는 IGHV1-46*03 F IGHJ3*01 F, or IGHJ3*02 F IGHD5-24*01 ORF
LC5 라이트 체인 K10G5 IGKV3-11*01 F IGKJ4*01 F
LC5 헤비 체인 G10G5 IGHV3-33*05 F IGHJ4*02 F IGHD6-13*01 F
LC6 라이트 체인 K8D6 IGKV3-20*01 F IGKJ1*01 F
LC6 헤비 체인 G10H2 IGHV3-11*01 F IGHJ4*02 F IGHD3-9*01 F
LC7 라이트 체인 L8D9 IGLV2-8*01 F IGLJ2*01 F, 또는 IGLJ3*01 F 또는 IGLJ3*02 F
LC7 헤비 체인 G8D9 IGHV3-53*02 F IGHJ4*02 F IGHD4-17*01 F
LC9 라이트 체인 L10A1 IGLV10-54*01 F IGLJ3*02 F
LC9 헤비 체인 G10A1 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ3*02 F IGHD2-2*01 F
LC10 라이트 체인 K9C11 IGKV3-11*01 F IGKJ4*01 F
LC10 헤비 체인 G9C11 IGHV3-33*01 F, 또는 IGHV3-33*06 F IGHJ6*02 F IGHD5-18*01 F
LC11 라이트 체인 L10A6 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
LC11 헤비 체인 G10A6 IGHV3-21*01 F, 또는 IGHV3-21*04 F IGHJ4*02 F IGHD1-20*01 F
LC12 라이트 체인 L9C9 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
LC12 헤비 체인 G9C9 IGHV3-15*01 F IGHJ4*02 F IGHD1-26*01 F
LC13 라이트 체인 L9B1 IGLV2-8*01 F IGLJ1*01 F
LC13 헤비 체인 G9B1 IGHV3-66*01 F, 또는 IGHV3-66*04 F IGHJ3*02 F IGHD2-8*01 F
LC14 라이트 체인 L9A1 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
LC14 헤비 체인 G9A1 IGHV3-15*01 F IGHJ4*02 F IGHD1-26*01 F
LC15 라이트 체인 K10A9 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
LC15 헤비 체인 G10A9 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD6-25*01 F
LC16 라이트 체인 K10D2 IGKV3-20*01 F IGKJ2*02 F
LC16 헤비 체인 G10D2 IGHV3-15*01 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
LC17 라이트 체인 K8D5 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
LC17 헤비 체인 G8D5 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
LC18 라이트 체인 L10D5 IGLV2-8*01 F IGLJ3*02 F
LC18 헤비 체인 G10D5 IGHV3-53*02 F IGHJ4*02 F IGHD4-17*01 F
Flu14 라이트 체인 L51A6 IGLV3-25*03 F IGLJ1*01 F
Flu14 헤비 체인 G51A6 IGHV3-30-3*01 F IGHJ3*01 F IGHD1-14*01 ORF
Flu15 라이트 체인 L51C4 IGLV3-1*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F or IGLJ3*02 F
Flu15 헤비 체인 G51C4 IGHV3-30*04 F IGHJ6*02 F IGHD3-10*01 F
Flu16 라이트 체인 K51G11 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu16 헤비 체인 G51G11 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD4-17*01 F
Flu17 라이트 체인 K49F7 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu17 헤비 체인 G49F7 IGHV1-69*02 F, 또는 IGHV1-69*04 F IGHJ3*02 F IGHD3-22*01 F
Flu18 라이트 체인 K51D7 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu18 헤비 체인 G51D7 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD4-11*01 ORF
Flu19 라이트 체인 K51D8 IGKV1-39*01 F, 또는 IGKV1D-39*01 F IGKJ4*01 F
Flu19 헤비 체인 G51D8 IGHV3-49*04 F IGHJ6*02 F IGHD3-22*01 F
Flu20 라이트 체인 K51G10 IGKV3-15*01 F IGKJ2*01 F
Flu20 헤비 체인 G51G10 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*01 F IGHD3-16*02 F
Flu21 라이트 체인 L49A9 IGLV3-21*02 F IGLJ3*02 F
Flu21 헤비 체인 G49A9 IGHV3-74*01 F IGHJ2*01 F IGHD2-21*01 F
Flu22 라이트 체인 L52A6 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu22 헤비 체인 G52A6 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD4-23*01 ORF
Flu23 라이트 체인 K49F11 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
Flu23 헤비 체인 G49F11 IGHV3-30*04 F, 또는 IGHV3-30*08 F 또는 IGHV3-30-3*01 F IGHJ4*02 F IGHD3-16*01 F
Flu24 라이트 체인 K51C8 IGKV3-15*01 F IGKJ2*01 F
Flu24 헤비 체인 G51C8 IGHV3-30*14 F IGHJ5*02 F IGHD3-22*01 F
Flu25 라이트 체인 K51H1 IGKV1-39*01 F, 또는 IGKV1D-39*01 F IGKJ4*01 F
Flu25 헤비 체인 G51H1 IGHV3-9*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-13*01 F
Flu26 라이트 체인 K52A2 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu26 헤비 체인 G52A2 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD4-23*01 ORF
Flu27 라이트 체인 L49A11 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu27 헤비 체인 G49A11 IGHV3-7*03 F IGHJ5*02 F IGHD3-3*01 F
Flu28 라이트 체인 L49C4 IGLV3-10*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F
Flu28 헤비 체인 G49C4 IGHV3-43*01 F IGHJ4*02 F IGHD4-17*01 F
Flu29 라이트 체인 L51H5 IGLV3-27*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F
Flu29 헤비 체인 G51H5 IGHV1-2*04 F IGHJ6*02 F IGHD2-21*02 F
Flu30 라이트 체인 L52B8 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu30 헤비 체인 G52B8 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD4-17*01 F
Flu31 라이트 체인 K49A5 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu31 헤비 체인 G49A5 IGHV3-30-3*01 F IGHJ4*02 F IGHD5-12*01 F
Flu32 라이트 체인 K49C11 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
Flu32 헤비 체인 G49C11 IGHV3-66*01 F, 또는 IGHV3-66*04 F IGHJ4*02 F IGHD6-19*01 F
Flu33 라이트 체인 L51E9 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu33 헤비 체인 G51E9 IGHV3-23*01 F IGHJ4*02 F IGHD3-16*01 F
Flu34 라이트 체인 L52G10 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu34 헤비 체인 G52G10 IGHV3-30-3*01 F IGHJ3*01 F, or IGHJ3*02 F IGHD6-19*01 F
Flu35 라이트 체인 L53F10 IGLV3-21*02 F IGLJ3*02 F
Flu35 헤비 체인 G53F10 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ6*02 F IGHD3-3*01 F
Flu36 라이트 체인 L52G7 IGLV2-8*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F or IGLJ3*02 F
Flu36 헤비 체인 G52G7 IGHV3-66*02 F IGHJ4*02 F IGHD2-15*01 F
Flu37 라이트 체인 K51E8 IGKV3-15*01 F IGKJ1*01 F
Flu37 헤비 체인 G51E8 IGHV1-2*04 F IGHJ6*02 F IGHD2-21*02 F
Flu39 라이트 체인 K53G7 IGKV1-5*03 F IGKJ1*01 F
Flu39 헤비 체인 G53G7 IGHV1-46*01 F, 또는 IGHV1-46*03 F IGHJ4*02 F IGHD3-9*01 F
Flu40 라이트 체인 L51A5 IGLV3-10*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F or IGLJ3*02 F
Flu40 헤비 체인 G51A5 IGHV4-34*01 F IGHJ6*02 F IGHD5-24*01 ORF
Flu41 라이트 체인 L51B1 IGLV3-25*03 F IGLJ1*01 F
Flu41 헤비 체인 G51B1 IGHV1-2*02 F IGHJ4*02 F IGHD3-10*01 F
Flu43 라이트 체인 L51D3 IGLV3-22*01 F IGLJ3*02 F
Flu43 헤비 체인 G51D3 IGHV4-39*01 F IGHJ3*02 F IGHD1-26*01 F
Flu44 라이트 체인 L51D4 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu44 헤비 체인 G51D4 IGHV3-11*01 F IGHJ6*02 F IGHD4-17*01 F
Flu45 라이트 체인 L52D4 IGLV2-14*01 F IGLJ3*02 F
Flu45 헤비 체인 G52D4 IGHV3-30-3*01 F IGHJ3*01 F, or IGHJ3*02 F IGHD6-19*01 F
Flu46 라이트 체인 L52H4 IGLV1-51*01 F IGLJ3*02 F
Flu46 헤비 체인 G52H4 IGHV3-23*01 F, 또는 IGHV3-23*04 F IGHJ4*02 F IGHD6-13*01 F
S1 라이트 체인 K3G4 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
S1 헤비 체인 G3G4 IGHV3-53*02 F IGHJ4*02 F IGHD2-21*01 F
S2 라이트 체인 K4C4 IGKV2-28*01 F, 또는 IGKV2D-28*01 F IGKJ4*01 F
S2 헤비 체인 G4C4 IGHV3-23*04 F IGHJ5*02 F IGHD6-19*01 F
S3 라이트 체인 K15C6 IGKV1-5*01 F IGKJ4*01 F
S3 헤비 체인 G15C6 IGHV3-7*01 F IGHJ1*01 F IGHD2-2*01 F
S4 라이트 체인 K15G1 IGKV1-6*01 F IGKJ1*01 F
S4 헤비 체인 G15G1 IGHV3-7*03 F IGHJ3*02 F IGHD6-13*01 F
S5 라이트 체인 K17C3 IGKV1-39*01 F, 또는 IGKV1D-39*01 F IGKJ2*02 F
S5 헤비 체인 G17C3 IGHV1-8*02 F IGHJ4*02 F IGHD3-16*01 F
S6 라이트 체인 K3E11 IGKV3-15*01 F IGKJ1*01 F
S6 헤비 체인 G3E11 IGHV3-30*04 F, 또는 IGHV3-30-3*01 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
S7 라이트 체인 L4B8 IGLV2-8*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F
S7 헤비 체인 G4B8 IGHV3-30*04 F, 또는 IGHV3-30*10 F IGHJ4*01 F, or IGHJ4*02 F IGHD5-18*01 F
S8 라이트 체인 L4D2 IGLV2-23*01 F, 또는 IGLV2-23*03 F IGLJ3*02 F
S8 헤비 체인 G4D2 IGHV3-33*03 F IGHJ6*02 F IGHD3-10*01 F
S9 라이트 체인 L4D6 IGLV2-8*01 F IGLJ2*01 F, or IGLJ3*01 F
S9 헤비 체인 G4D6 IGHV3-20*01 F IGHJ4*02 F IGHD2-2*01 F
S10 라이트 체인 L4F4 IGLV3-1*01 F IGLJ3*02 F
S10 헤비 체인 G4F4 IGHV4-59*01 F, 또는 IGHV4-59*08 F IGHJ4*02 F IGHD3-3*01 F
S11 라이트 체인 L15D1 IGLV8-61*01 F IGLJ3*02 F
S11 헤비 체인 G15D1 IGHV3-7*01 F IGHJ4*02 F IGHD3-10*01 F
S12 라이트 체인 L17C6 IGLV1-47*01 F, 또는 IGLV1-47*02 F IGLJ3*02 F
S12 헤비 체인 G17C6 IGHV3-7*03 F IGHJ4*02 F IGHD5-18*01 F
S13 라이트 체인 L17C9 IGLV7-46*01 F IGLJ3*02 F
S13 헤비 체인 G17C9 IGHV5-a*03 F IGHJ6*02 F IGHD6-13*01 F
RA1 라이트 체인 K11G5 IGKV3-11*01 F IGKJ5*01 F
RA1 헤비 체인 G11G5 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
RA2 라이트 체인 K22C7 IGKV3-15*01 F IGKJ1*01 F
RA2 헤비 체인 G22C7 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD6-25*01 F
RA3 라이트 체인 K26B1 IGKV3-15*01 F IGKJ4*01 F
RA3 헤비 체인 G26B1 IGHV4-39*07 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
RA4 라이트 체인 K26F5 IGKV3-15*01 F IGKJ5*01 F
RA4 헤비 체인 G26F5 IGHV3-23*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-19*01 F
RA5 라이트 체인 K26H1 IGKV3-11*01 F IGKJ4*01 F
RA5 헤비 체인 G26H1 IGHV3-9*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-13*01 F
RA6 라이트 체인 K40C5 IGKV1-39*01 F, 또는 IGKV1D-39*01 F IGKJ3*01 F
RA6 헤비 체인 G40C5 IGHV3-30*04 F, 또는 IGHV3-30*08 F 또는 IGHV3-30-3*01 F IGHJ4*02 F IGHD3-16*01 F
RA7 라이트 체인 K40G1 IGKV3-11*01 F IGKJ1*01 F
RA7 헤비 체인 G40G1 IGHV4-39*01 F IGHJ6*02 F IGHD2-15*01 F
RA8 라이트 체인 K40H4 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
RA8 헤비 체인 G40H4 IGHV1-2*02 F IGHJ5*02 F IGHD2-21*02 F
RA9 라이트 체인 K41A2 IGKV1-33*01 F, 또는 IGKV1D-33*01 F IGKJ4*01 F
RA9 헤비 체인 G41A2 IGHV1-2*02 F IGHJ6*02 F IGHD1-1*01 F
RA10 라이트 체인 K47A2 IGKV3-15*01 F IGKJ5*01 F
RA10 헤비 체인 G47A2 IGHV3-23*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-19*01 F
RA11 라이트 체인 K47E2 IGKV3-15*01 F IGKJ5*01 F
RA11 헤비 체인 G47E2 IGHV3-23*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-19*01 F
RA12 라이트 체인 K47F9 IGKV3-11*01 F IGKJ4*01 F
RA12 헤비 체인 G47F9 IGHV4-39*02 F IGHJ3*02 F IGHD3-3*02 F
RA13 라이트 체인 L13B10 IGLV3-1*01 F IGLJ1*01 F
RA13 헤비 체인 G13B10 IGHV5-51*01 F IGHJ6*02 F IGHD6-25*01 F
RA14 라이트 체인 L13G5 IGLV3-1*01 F IGLJ1*01 F
RA14 헤비 체인 G13G5 IGHV5-51*01 F IGHJ6*02 F IGHD6-25*01 F
RA15 라이트 체인 K40D6 IGKV3-20*01 F IGKJ5*01 F
RA15 헤비 체인 G40D6 IGHV4-39*07 F IGHJ4*02 F IGHD4-23*01 ORF
RA16 라이트 체인 K25D6 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
RA16 헤비 체인 G26D6 IGHV3-72*01 F IGHJ6*03 F IGHD4-17*01 F
RA17 라이트 체인 K25E9 IGKV3-11*01 F IGKJ3*01 F
RA17 헤비 체인 G25E9 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F 또는 IGHV3-33*05 F IGHJ5*02 F IGHD3-22*01 F
RA18 라이트 체인 K25G4 IGKV1-27*01 F IGKJ2*03 F
RA18 헤비 체인 G25G4 IGHV3-30*09 F IGHJ4*02 F IGHD1-1*01 F
RA19 라이트 체인 K45D9 IGKV3-15*01 F IGKJ1*01 F
RA19 헤비 체인 G45D9 IGHV3-30*03 F, 또는 IGHV3-30*18 F IGHJ4*02 F IGHD3-22*01 F
RA21 라이트 체인 L13E11 IGLV2-23*02 F IGLJ1*01 F
RA21 헤비 체인 G13E11 IGHV3-15*01 F IGHJ4*02 F IGHD6-13*01 F
RA22 라이트 체인 L13G5 IGLV3-1*01 F IGLJ1*01 F
RA22 헤비 체인 G13G5 IGHV3-7*01 F IGHJ5*02 F IGHD5-12*01 F
RA23 라이트 체인 L44C5 IGLV2-23*01 F, 또는 IGLV2-23*02 F 또는 IGLV2-23*03 F IGLJ1*01 F
RA23 헤비 체인 G44C5 IGHV3-30*14 F IGHJ5*02 F IGHD7-27*01 F
RA24 라이트 체인 L44D6 IGLV2-23*01 F, 또는 IGLV2-23*02 F 또는 IGLV2-23*03 F IGLJ1*01 F
RA24 헤비 체인 G44D6 IGHV3-30*04 F IGHJ6*03 F IGHD3-10*01 F
*VDJ 상동성은 V-QUEST에 의해 제공되었다.
표 19 - 플루존(Fluzone) ELISA에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
Flu15 라이트 체인 L51C4
Flu15 헤비 체인 G51C4
Flu16 라이트 체인 K51G11
Flu16 헤비 체인 G51G11
Flu17 라이트 체인 K49F7
Flu17 헤비 체인 G49F7
Flu18 라이트 체인 K51D7
Flu18 헤비 체인 G51D7
Flu19 라이트 체인 K51D8
Flu19 헤비 체인 G51D8
Flu20 라이트 체인 K51G10
Flu20 헤비 체인 G51G10
Flu21 라이트 체인 L49A9
Flu21 헤비 체인 G49A9
Flu22 라이트 체인 L52A6
Flu22 헤비 체인 G52A6
Flu23 라이트 체인 K49F11
Flu23 헤비 체인 G49F11
Flu25 라이트 체인 K51H1
Flu25 헤비 체인 G51H1
Flu26 라이트 체인 K52A2
Flu26 헤비 체인 G52A2
Flu27 라이트 체인 L49A11
Flu27 헤비 체인 G49A11
Flu29 라이트 체인 L51H5
Flu29 헤비 체인 G51H5
Flu30 라이트 체인 L52B8
Flu30 헤비 체인 G52B8
Flu33 헤비 체인 G51E9
Flu34 라이트 체인 L52G10
Flu34 헤비 체인 G52G10
Flu35 라이트 체인 L53F10
Flu35 헤비 체인 G53F10
Flu37 라이트 체인 K51E8
Flu37 헤비 체인 G51E8
Flu39 라이트 체인 K53G7
Flu39 헤비 체인 G53G7
Flu40 라이트 체인 L51A5
Flu40 헤비 체인 G51A5
Flu41 라이트 체인 L51B1
Flu41 헤비 체인 G51B1
Flu43 라이트 체인 L51D3
Flu43 헤비 체인 G51D3
Flu44 라이트 체인 L51D4
Flu44 헤비 체인 G51D4
Flu45 라이트 체인 L52D4
Flu45 헤비 체인 G52D4
Flu46 라이트 체인 L52H4
Flu46 헤비 체인 G52H4
S1 라이트 체인 K3G4
S1 헤비 체인 G3G4
S2 라이트 체인 K4C4
S2 헤비 체인 G4C4
표 20- 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
Flu15 라이트 체인 L51C4
Flu15 헤비 체인 G51C4
Flu16 라이트 체인 K51G11
Flu16 헤비 체인 G51G11
Flu17 라이트 체인 K49F7
Flu17 헤비 체인 G49F7
Flu18 라이트 체인 K51D7
Flu18 헤비 체인 G51D7
Flu19 라이트 체인 K51D8
Flu19 헤비 체인 G51D8
Flu20 라이트 체인 K51G10
Flu20 헤비 체인 G51G10
Flu21 라이트 체인 L49A9
Flu21 헤비 체인 G49A9
Flu22 라이트 체인 L52A6
Flu22 헤비 체인 G52A6
Flu26 라이트 체인 K52A2
Flu26 헤비 체인 G52A2
Flu29 라이트 체인 L51H5
Flu29 헤비 체인 G51H5
Flu34 라이트 체인 L52G10
Flu34 헤비 체인 G52G10
Flu35 라이트 체인 L53F10
Flu35 헤비 체인 G53F10
Flu46 라이트 체인 L52H4
Flu46 헤비 체인 G52H4
표 21 - RA 항원 분석에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
RA1 라이트 체인 K11G5
RA1 헤비 체인 G11G5
RA2 라이트 체인 K22C7
RA2 헤비 체인 G22C7
RA4 라이트 체인 K26F5
RA4 헤비 체인 G26F5
RA5 라이트 체인 K26H1
RA5 헤비 체인 G26H1
RA8 라이트 체인 K40H4
RA8 헤비 체인 G40H4
RA9 라이트 체인 K41A2
RA9 헤비 체인 G41A2
RA10 라이트 체인 K47A2
RA10 헤비 체인 G47A2
RA11 라이트 체인 K47E2
RA11 헤비 체인 G47E2
RA12 라이트 체인 K47F9
RA12 헤비 체인 G47F9
RA13 라이트 체인 L13B10
RA13 헤비 체인 G13B10
RA16 라이트 체인 K25D6
RA16 헤비 체인 G26D6
RA19 라이트 체인 K45D9
RA19 헤비 체인 G45D9
RA22 라이트 체인 L13G5
RA22 헤비 체인 G13G5
RA23 라이트 체인 L44C5
RA23 헤비 체인 G44C5
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
Flu26 라이트 체인 K52A2
Flu26 헤비 체인 G52A2
표 22 - 히스톤 2A ELISA 및 CCP ELISA에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
RA1 라이트 체인 K11G5
RA1 헤비 체인 G11G5
RA2 라이트 체인 K22C7
RA2 헤비 체인 G22C7
RA4 라이트 체인 K26F5
RA4 헤비 체인 G26F5
RA5 라이트 체인 K26H1
RA5 헤비 체인 G26H1
RA6 라이트 체인 K40C5
RA6 헤비 체인 G40C5
RA7 라이트 체인 K40G1
RA7 헤비 체인 G40G1
RA8 라이트 체인 K40H4
RA8 헤비 체인 G40H4
RA9 라이트 체인 K41A2
RA9 헤비 체인 G41A2
RA10 라이트 체인 K47A2
RA10 헤비 체인 G47A2
RA11 라이트 체인 K47E2
RA11 헤비 체인 G47E2
RA12 라이트 체인 K47F9
RA12 헤비 체인 G47F9
RA13 라이트 체인 L13B10
RA13 헤비 체인 G13B10
RA16 라이트 체인 K25D6
RA16 헤비 체인 G26D6
RA17 라이트 체인 K25E9
RA17 헤비 체인 G25E9
RA18 라이트 체인 K25G4
RA18 헤비 체인 G25G4
RA19 라이트 체인 K45D9
RA19 헤비 체인 G45D9
RA22 라이트 체인 L13G5
RA22 헤비 체인 G13G5
RA23 라이트 체인 L44C5
RA23 헤비 체인 G44C5
RA24 라이트 체인 L44D6
RA24 헤비 체인 G44D6
표 23 - RF ELISA에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
RA1 라이트 체인 K11G5
RA1 헤비 체인 G11G5
RA2 라이트 체인 K22C7
RA2 헤비 체인 G22C7
RA4 라이트 체인 K26F5
RA4 헤비 체인 G26F5
RA5 라이트 체인 K26H1
RA5 헤비 체인 G26H1
RA6 라이트 체인 K40C5
RA6 헤비 체인 G40C5
RA8 라이트 체인 K40H4
RA8 헤비 체인 G40H4
RA9 라이트 체인 K41A2
RA9 헤비 체인 G41A2
RA10 라이트 체인 K47A2
RA10 헤비 체인 G47A2
RA11 라이트 체인 K47E2
RA11 헤비 체인 G47E2
RA12 라이트 체인 K47F9
RA12 헤비 체인 G47F9
RA14 라이트 체인 L13G5
RA14 헤비 체인 G13G5
표 24 - 폐암 조직 IHC 및 폐암 세포주들의 흐름세포측정에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
LC1 라이트 체인 K8B8
LC1 헤비 체인 G8B8
LC5 라이트 체인 K10G5
LC5 헤비 체인 G10G5
LC6 라이트 체인 K8D6
LC6 헤비 체인 G10H2
LC7 라이트 체인 L8D9
LC7 헤비 체인 G8D9
LC9 라이트 체인 L10A1
LC9 헤비 체인 G10A1
LC10 라이트 체인 K9C11
LC10 헤비 체인 G9C11
LC11 라이트 체인 L10A6
LC11 헤비 체인 G10A6
LC12 라이트 체인 L9C9
LC12 헤비 체인 G9C9
LC13 라이트 체인 L9B1
LC13 헤비 체인 G9B1
LC14 라이트 체인 L9A1
LC14 헤비 체인 G9A1
LC15 라이트 체인 K10A9
LC15 헤비 체인 G10A9
LC16 라이트 체인 K10D2
LC16 헤비 체인 G10D2
LC17 라이트 체인 K8D5
LC17 헤비 체인 G8D5
LC18 라이트 체인 L10D5
LC18 헤비 체인 G10D5
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
표 25 - S. aureus 표면 염색에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
S1 라이트 체인 K3G4
S1 헤비 체인 G3G4
S2 라이트 체인 K4C4
S2 헤비 체인 G4C4
S3 라이트 체인 K15C6
S3 헤비 체인 G15C6
S4 라이트 체인 K15G1
S4 헤비 체인 G15G1
S6 라이트 체인 K3E11
S6 헤비 체인 G3E11
S7 라이트 체인 L4B8
S7 헤비 체인 G4B8
S8 라이트 체인 L4D2
S8 헤비 체인 G4D2
S9 라이트 체인 L4D6
S9 헤비 체인 G4D6
S10 라이트 체인 L4F4
S10 헤비 체인 G4F4
S11 라이트 체인 L15D1
S11 헤비 체인 G15D1
S12 라이트 체인 L17C6
S12 헤비 체인 G17C6
S13 라이트 체인 L17C9
S13 헤비 체인 G17C9
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
Flu26 라이트 체인 K52A2
Flu26 헤비 체인 G52A2
표 26 - 미세중화 분석(microneutralization assay)에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
Flu15 라이트 체인 L51C4
Flu15 헤비 체인 G51C4
Flu16 라이트 체인 K51G11
Flu16 헤비 체인 G51G11
Flu18 라이트 체인 K51D7
Flu18 헤비 체인 G51D7
Flu19 라이트 체인 K51D8
Flu19 헤비 체인 G51D8
Flu20 라이트 체인 K51G10
Flu20 헤비 체인 G51G10
Flu21 라이트 체인 L49A9
Flu21 헤비 체인 G49A9
표 27 - 포도상구균 억제 분석(staph inhibition assay)에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
S6 라이트 체인 K3E11
S6 헤비 체인 G3E11
S9 라이트 체인 L4D6
S9 헤비 체인 G4D6
LC1 라이트 체인 K8B8
LC1 헤비 체인 G8B8
표 28 - 포도상구균 IP에서 사용된 항체들
항체 체인 타입 클론
S1 라이트 체인 K3G4
S1 헤비 체인 G3G4
S2 라이트 체인 K4C4
S2 헤비 체인 G4C4
S3 라이트 체인 K15C6
S3 헤비 체인 G15C6
S4 라이트 체인 K15G1
S4 헤비 체인 G15G1
S5 라이트 체인 K17C3
S5 헤비 체인 G17C3
S6 라이트 체인 K3E11
S6 헤비 체인 G3E11
S7 라이트 체인 L4B8
S7 헤비 체인 G4B8
S8 라이트 체인 L4D2
S8 헤비 체인 G4D2
S9 라이트 체인 L4D6
S9 헤비 체인 G4D6
S10 라이트 체인 L4F4
S10 헤비 체인 G4F4
S11 라이트 체인 L15D1
S11 헤비 체인 G15D1
S12 라이트 체인 L17C6
S12 헤비 체인 G17C6
S13 라이트 체인 L17C9
S13 헤비 체인 G17C9
Flu14 라이트 체인 L51A6
Flu14 헤비 체인 G51A6
표 29 - 포도상구균 질량 분석(staph mass spec)에서 사용된 항체
항체 체인 타입 클론
S4 라이트 체인 K15G1
S4 헤비 체인 G15G1
표 30.
이름 서열
RT 올리고(oligo) CACGACCGGTGCTCGATTTAGTTAATTAA[샘플ID]AGCGATCGCTGGG
RT 올리고’(oligo') CTAAATCGAGCACCGGTCGTGTGGG
포워드프라이머(Fwd rimer) (카파 체인에 대한) CGATTGGAGGGCGTTATCCAC
포워드 프라이머 (람다 체인에 대한) TYTGTGGGACTTCCACTGCTC
표 31.
이름 서열
RT 올리고(oligo) CACGACCGGTGCTCGATTTAGTTAATTAA[샘플-ID]AGCGATCGCTGGG
중복-확장 프라이머 CGTATCGCTCCTAGGAGCGATACGCACGACCGGTGCTCGATTTAG
LC 프라이머 (카파 체인에대한) CGATTGGAGGGCGTTATCCAC
LC 프라이머(람다 체인에 대한) TYTGTGGGACTTCCACTGCTC
HC 프라이머 TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTG
표 32.
이름 서열
RT 올리고 CGTATCGCTCCTAGGAGCGATACGTTAATTAA[샘플-ID]AGCGATCGCTGGG
LC 프라이머(카파 체인에 대한) CGATTGGAGGGCGTTATCCAC
LC 프라이머(람다 체인에 대한) TYTGTGGGACTTCCACTGCTC
HC 프라이머 TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTG
표 33.
이름 서열
Univ_seq_2 AACGCGTGACGAGAGACTGACAG
VK ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTG G
VL GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
IgKC_v3_바코드된(barcoded) AGGCCCTTACGACTGCGTCTTGAACAATAC CAGATGGCGGGAAGATGAAGAC
IgLC_v5_바코드된(barcoded) AGGCCCTTACGACTGCGTCTTGAACAATAC CTCCCGGGTAGAAGTCAC
고정된(Fixed)_PCR3 AGGCCCTTACGACTGCGTCTTG
표 34. 기억 B세포들, 짧은시간-생존하는 형질세포, 긴시간-생존하는 형질세포들 및 항체 분비 세포들 내에서 B세포 분화와 연관된 공동-발현 유전자(Co-expressed genes associated with B cell differentiation into memory B cells, short-lived plasma cell, long-lived plasma cells and antibody secreting cells).
기억 B세포들의 세대(Generation of memory B cells) 짧은시간-생존하는형질세포들의 세대 긴시간-생존하는 형질세포들의세대 항체-분비 세포들
PAX-5 Blimp-1 Blimp-1 SLC7A7 CD36
소안구증-연관전사인자(Microphthalmia-assoc. transcription factor, (MITF) X-박스 결합 단백질 1 (XBP-1) X-박스 결합 단백질 1 (XBP-1) IL6R BCL2L1
RPN2 IL21R
IRF-4 IRF-4 PDIA4 IKZF1
BCMA IGHD BACH2
표 35. Treg, Th1, Th2, Th17 세포들 내에서 T 세포 분화와 연관된 공동-발현 유전자
Th1의 세대 Th2의 세대 Th17의 세대 Tregs의 세대
T-bet Gata-3 RORγt FoxP3 GITR
표 36. 특이적 조직들로 귀소하는 형질아세포와 연관된 공동-발현 유전자들
소장에 대한 형질아세포들의 귀소(Homing of plasmablasts to the small intesting) 점막 조직들에 대한 형질아세포의귀소 피부에 대한 형질아세포들의 귀소
CCR9 CCR10 피부 림프구-연관 항원(cutaneous lymphocyte-associated antigen ,CLA)
α4β7
일반적 참조문헌
Burbelo, P. D., S. K. Browne, et al. (2010). "Anti-cytokine autoantibodies are associated with opportunistic infection in patients with thymic neoplasia." Blood 116(23): 4848-4858.
Hua, J., K. Kirou, et al. (2006). "Functional assay of type I interferon in systemic lupus erythematosus plasma and association with anti-RNA binding protein autoantibodies." Arthritis Rheum 54(6): 1906-1916.
May, L. T., R. Neta, et al. (1993). "Antibodies chaperone circulating IL-6. Paradoxical effects of anti-IL-6 "neutralizing" antibodies in vivo." J Immunol 151(6): 3225-3236.
Mostbock, S. (2009). "Cytokine/Antibody complexes: an emerging class of immunostimulants." Curr Pharm Des 15(7): 809-825.
Robinson, W. H., C. DiGennaro, et al. (2002). "Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses." Nat Med 8(3): 295-301.
Watanabe, M., K. Uchida, et al. (2007). "Anti-cytokine autoantibodies are ubiquitous in healthy individuals." FEBS Lett 581(10): 2017-2021.
Wildbaum, G., M. A. Nahir, et al. (2003). "Beneficial autoimmunity to proinflammatory mediators restrains the consequences of self-destructive immunity." Immunity 19(5): 679-688.
Wrammert, J., K. Smith, et al. (2008). "Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus." Nature 453(7195): 667-671.

Claims (385)

  1. 복수의 조성물들을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서,
    상기 라이브러리는, 면역글로불린 헤비 체인 및 라이트 체인의 가변 부위, 또는 T세포 수용체 알파 및 베타의 가변부위로서, 동일 클론 패밀리 유래의 가변부위를 인코딩하는 cDNA를 포함하며:
    상기 각 조성물은 독립된 용기에 존재하고,
    상기 각 조성물은,
    (i) 단일 샘플-유래 cDNA 분자로서, 상기 cDNA 분자는
    a. 하나 이상의 B세포로부터의 면역글로불린 헤비 체인 가변 부위를 인코딩하는 cDNA 분자 및 면역글로불린 라이트 체인 가변 부위를 인코딩하는 cDNA 분자, 또는
    b. 하나 이상의 T세포로부터의 T세포 수용체 알파 체인 서열을 인코딩하는 cDNA 분자 및 T세포 수용체 베타 체인 서열을 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 cDNA 분자; 및
    (ii) 상기 cDNA 분자에 부착된 샘플 식별 부위;를 포함하고,
    상기 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리 내의 다른 독립된 용기 내에 존재하는 다른 조성물들의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과는 별개의 것인 라이브러리.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 cDNA 분자는 어댑터 부위에 의해 샘플 식별 부위에 부착된 것인 라이브러리.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 어댑터 부위는 그 3' 말단에 뉴클레오티드 dG를 포함하고 상기 cDNA 분자는 3' 말단에 뉴클레오티드 C를 포함하는 것인 라이브러리.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 각 조성물은 샘플 식별 부위에 부착된 범용 프라이머 부위를 더 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위는 각 독립 용기 내에서 실질적으로 동일한 것인 라이브러리.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단일 샘플-유래 cDNA 분자는 하나 이상의 B세포로부터의 면역글로불린 헤비 체인 가변 부위 및 면역글로불린 라이트 체인 가변 부위를 인코딩하는 것인 라이브러리.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 하나 이상의 B세포는 형질아세포인 라이브러리.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 하나 이상의 B세포는 뮤린 B세포인 라이브러리.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 단일 샘플은 단일 B세포인 라이브러리.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 cDNA 분자는 하나 이상의 T세포로부터의 T세포 수용체 알파 체인 서열 및 T세포 수용체 베타 체인 서열을 인코딩하는 단일 샘플 유래인 것인 라이브러리.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 단일 샘플은 단일 T세포인 라이브러리.
  11. 복수의 조성물들을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리로서, 상기 라이브러리는
    면역글로불린 헤비 체인 및 라이트 체인의 가변 부위, 또는 T세포 수용체 알파 및 베타의 가변부위로서, 동일 클론 패밀리 유래의 가변부위를 인코딩하는 cDNA를 포함하고:
    상기 각 조성물은 독립된 용기 내에 존재하고,
    상기 조성물은:
    각 cDNA 분자가 3' 말단에 뉴클레오티드 C를 포함하는 단일 샘플-유래의 복수의 cDNA 분자, 및
    어댑터 부위와 커플링 된 샘플 식별 부위를 포함하는 샘플 식별-어댑터 부위를 포함하고;
    상기 각 샘플 식별-어댑터 부위의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열은 라이브러리내의 다른 조성물의 다른 샘플 식별-어댑터 부위들의 샘플 식별 부위의 뉴클레오티드 서열과는 별개의 것이고,
    상기 샘플 식별-어댑터 부위는 공유결합적으로 상기 조성물 내의 cDNA 분자에 부착되고,
    상기 단일 샘플-유래 cDNA 분자는:
    (i) 하나 이상의 B세포로부터의 면역글로불린 헤비 체인 가변 부위를 인코딩하는 cDNA 분자 및 면역글로불린 라이트 체인 가변 부위를 인코딩하는 cDNA 분자, 또는
    (ii) 하나 이상의 T세포로부터의 T세포 수용체 알파 체인 서열을 인코딩하는 cDNA 분자 및 T세포 수용체 베타 체인 서열을 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 cDNA 분자;를 포함하는 것인 라이브러리.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 각 cDNA 분자는 가변 부위를 포함하는 라이브러리.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 가변 부위는 B세포 면역글로불린 가변 부위인 라이브러리.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 가변 부위는 T세포 수용체 가변 부위인 라이브러리.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 각 조성물은 샘플 식별 부위에 부착된 범용 프라이머 부위를 더 포함하고, 상기 범용 프라이머 부위는 각 독립 용기 내에서 실질적으로 동일한 것인 라이브러리.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 단일 샘플은 단일 B세포 또는 단일 T세포인 라이브러리.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 단일 B세포는 단일 형질아세포인 라이브러리.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 라이브러리를 수득하는 단계; 및
    하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하기 위한 프라이머들의 세트로 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 증폭하는 단계; 를 포함하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 시퀀싱하는 단계; 및
    하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드들을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 프라이머들의 세트는 하나 이상의 3' 유전자 특이적 프라이머들, 또는 하나 이상의 3' 유전자 특이적 프라이머들 및 5' 범용 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  21. 시퀀싱 데이터를 분석하고 사용하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 라이브러리로부터 얻은 복수의 폴리뉴클레오티드들과 연관된 데이터세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터세트는 상기 복수의 폴리뉴클레오티드들에 대한 시퀀싱 데이터를 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 각 폴리뉴클레오티드는 샘플 식별 부위를 포함하고, 각 폴리뉴클레오티드의 샘플 식별 부위는 단일 샘플에 특유한 것이어서, 제1 단일 샘플로부터 얻은 각 폴리뉴클레오티드의 상기 샘플 식별 부위의 서열은 상기 복수의 폴리뉴클레오티드들 내의 다른 폴리뉴클레오티드들의 샘플 식별 부위의 서열과 별개이고, 상기 다른 폴리뉴클레오티드들은 상기 제1 단일 샘플과는 별개인 하나 이상의 샘플들로부터 얻은 것인 단계;
    상기 데이터세트를 컴퓨터로 분석하여 동일한 샘플 식별 부위들을 가지는 폴리뉴클레오티드들과 연관된 데이터를 서로 매칭하는 단계로서, 매치는 상기 폴리뉴클레오티드들이 동일한 샘플로부터 비롯된 것임을 보여주는 것인 단계; 및
    동일 샘플로부터 유래한 폴리뉴클레오티드들을 인코딩하는 cDNA를 선택 및 클로닝하여 인코딩된 페어링된 면역글로불린 헤비 체인 및 라이트 체인 가변 부위 또는 인코딩된 페어링된 T세포 수용체 알파 및 T세포 수용체 베타 서열의 결합 활성을 분석하는 단계; 를 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 cDNA 분자 및 샘플 인식 부위는 동일한 DNA 가닥(strand)에 통합되는 것인 라이브러리.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 (i) 상기 cDNA 분자의 하나 이상의 부분 및 (ii) 상기 샘플 인식 부위에 상보적인 DNA 분자를 더 포함하는 라이브러리.
  24. 제3항에 있어서,
    상기 cDNA 분자는 3' 말단에 서열 CCC 를 포함하는 라이브러리.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 내의 가변 부위를 인코딩하는 모든 cDNA 분자는 동일 세포 유래이고,
    상기 독립된 용기 내의 cDNA 분자는 (a) 동족쌍(cognate pair) 면역글로불린 헤비 체인 및 라이트체인의 가변 부위, 또는 (b) 동족쌍 T세포 수용체 알파 및 베타 체인 서열을 인코딩하는, 라이브러리.
  26. 제1항 내지 제8항, 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 이상의 면역글로불린 헤비 체인 가변부위 또는 2 이상의 면역글로불린 라이트 체인 가변부위는 80-99% 이상의 서열 상동성을 갖는 라이브러리.
  27. 제1항 내지 제8항, 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 면역글로불린 헤비 체인 가변 부위 또는 각 면역글로불린 라이트 체인 가변 부위는 80-99% 이상의 서열 상동성을 갖는 라이브러리.
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