KR101069146B1

KR101069146B1 - 인간 항체 ｓｃＦｖ 라이브러리 제작용 재조합 벡터, 발현벡터 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101069146B1
Application number: KR1020080096653A
Authority: KR
Inventors: 김성섭; 장영순
Original assignee: 주식회사에이앤알쎄라퓨틱스
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2008-10-01
Publication date: 2011-09-30
Also published as: KR20100037359A

Abstract

본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터, 발현 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하고, 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 사용하는 경우 2개의 제한효소와 2번의 제한효소 처리만으로도 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 안정적이고 간편하게 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 이용하여 간편하게 인간 항체 scFv 라이브러리를 제조할 수 있고, 상기의 인간 항체 scFv 라이브러리를 이용하여 특정 항원에 대한 항체의 탐색 및 항암제 등의 발굴이 가능하다.

파지미드, 파지 디스플레이, 항체 라이브러리, scFv, 제한효소, BstXI

Description

인간 항체 ｓｃＦｖ 라이브러리 제작용 재조합 벡터, 발현 벡터 및 이의 제조방법{Recombinant vector, expression vector for antibody scFv library and manufacturing method thereof}

본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터, 발현 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자와 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리가 형성된 인간 항체 scFv 라이브 제작용 재조합 벡터, 상기 인간 항체 scFv 라이브 제작용 재조합 벡터 내의 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자가 삽입된 발현 벡터, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

1975년 kohler와 Milstein에 의해 종양세포와 생쥐의 B 세포간의 세포 융합기술이 도입된 이후로 단일클론항체 생산이 가능하게 되었다(Stone MJ(2001):Monoclonal antibodies in the prehybridoma era: a brief historical perspective and personal reminiscence. Clin lymphoma, 2: 148-154). 이러한 하이브리도마(Hybridoma) 기술의 발달로 종양 표적화를 위해 종양 세포의 표면에 발현되는 특이 항원에 친화성을 가지는 단일클론항체의 제조가 가능하게 되었다. 생 쥐 단일클론항체는 다양한 표적항원의 적용과 대량 생산이 가능한 장점을 가지며, 선택적 약제의 개념은 마법의 탄환이라는 표현으로 Ehrlich에 의해 제시되어 진단시약이나 기초연구에 매우 유용하게 사용되고 있다(Reilly RM, Sandhu J, Alvarez-Diez TM, Gallinger S, Kirsh J and Stern H (1995): Problems of delivery of monoclonal antibodies. Pharmaceutical and pharmacokinetic solutions. Clin Pharmacokinet, 28:126-142). 그러나 생쥐에서 유래하는 항체는 인체에 반복 투여될 경우 치명적인 체내 면역반응(HAMA, human anti-mouse antibody response)을 유발할 수 있기 때문에 인간 질환의 예방과 치료를 위한 치료제로 부적합한 단점을 가진다.

한편, 파지 디스플레이(Phage display) 방법은 비용해성 섬유상 박테리오파지 M13(filamentous bacteriophage M13) 표면에 특이 결합 펩티드 또는 항체를 전시 발현시키는 것으로서, 바이오패닝(Biopanning) 이라고 불리는 선택적 반응 과정을 수 회 반복하여 특이 결합 물질이 다양하게 발현된 파지 중에서 특정 항원에 반응하는 파지만을 선별하는 과정으로 이루어지고, 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하거나, 이렇게 선택된 파지를 증식시켜 대량으로 생산할 수 있다. 이러한 파지 디스플레이의 원리는 M13 박테리오파지의 유전자III(GIII)가 인코드하는 마이너 코트 단백질(minor coat protein)인 pIII는 파지의 표면단백질로서 보통 3~5개가 발현되고, 박테리아 필루스(bacterial pilus)에 흡착하는 역할을 하는데, 파지 벡터를 사용하여 다양한 펩티드 또는 항체를 pIII와 연결되도록 발현시키면, 바이오패닝을 통해 특이 결합 물질과 반응하는 파지를 찾 아내는 것이다. 현실적으로 유용한 재조합 항체를 만드는 것은 위와 같은 파지 디스플레이 방법을 이용하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유전자 재조합 방법을 이용, 특이 결합부위인 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 일정 길이의 펩티드 링커로 연결하여 가변 부분으로 연결된 단일사슬항체(single chain variable fragment, 이하 항체 scFv)를 만드는 것이다. 이렇게 만들어진 단일사슬항체는 유래된 단일클론항체의 결합부위와 유사한 구조를 가지게 된다 (Thirion S, Motmans K, Heyligen H, Janssens J, Raus J and Vandevyver C (1996): Mono- and bispecific single-chain antibody fragments ofr cancer therapy. Eur J Cancer Prev, 5: 507-511).

종래의 합성항체 라이브러리는 중쇄 가변영역 유전자와 경쇄 가변영역 유전자를 일일이 펩티드 링커 유전자로 연결하여 항체 scFv를 코딩하는 인서트 DNA를 제작하고 이를 벡터에 삽입하는 방식을 사용하였다. 이러한 종래의 합성항체 라이브러리 제작 방법은 여러 단계를 거쳐야 하는 번거로움 때문에 항체 유전자를 충분히 구축하기 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 펩티드 링커 유전자를 미리 벡터 내에 삽입한 재조합 벡터를 이용하기도 하는 데, 상기 방법에서도 일반적으로 중쇄 가변영역 유전자를 삽입할 때 서로 다른 2개의 제한효소가 필요하고 경쇄 가변영역 유전자를 삽입할 때에도 서로 다른 2개의 제한효소가 필요하기 때문에 서로 다른 4개의 제한효소 및 4번의 제한효소 처리 단계를 거쳐야 하는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 링커 유전자 및 링커 유전자와 연결되고 새로운 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 중쇄 가변영역 유전자와 경쇄 가변영역 유전자가 삽입되어 실질적으로 인간 항체 scFv를 발현할 수 있는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 연구자들은 인간의 생식세포 라인 항체의 가변영역 유전자에 대하여 염기서열 및 제한효소 인식 자리를 분석한 결과 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에 BstXI 제한효소 인식 자리가 없다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제공한다. 여기서, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 제한효소 인식 자리를 가지는 데 바람직하게는 sfiI 제한효소 인식 자리인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 항체의 발현량을 정량하기 위한 태그 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Myc 태그 유전자인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법으로서, (a) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 링커 펩티드를 코딩하고 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위와 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 사이에 위치하는 링커 유전자를 포함하고, 양쪽 말단에 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리를 포함하는 인서트 DNA를 합성하는 단계; (b) 모벡터를 sfiI 및 BstXI 제한효소와 다른 제한효소로 처리하여 제한효소 인식 자리에 점착성 말단을 형성하는 단계; (c) (a) 단계의 인서트 DNA를 (b) 단계에서 모벡터에 처리한 제한효소와 동일한 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계;및 (d) (b) 단계에서 제조한 모벡터 내에 (c) 단계에서 제조한 인서트 DNA를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다. 여기서 상기 모벡터 내에 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리가 이미 존재하는 경우 (d) 단계 이전에 모벡터 내에 존재하는 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터에 있어서, 상기 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 제공한다. 여기서, 상기 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자는 양쪽 말단에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 제한효소 인식 자리를 가지는 데 바람직하게는 sfiI 제한효소 인식 자리인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터의 제조방법으로서, (가) 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지며, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 BstXI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계; (나) 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 BstXI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계; (다) (가) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 (나) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계; (라) (다)에서 제조한 경쇄 가변영역 유전자가 도입된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 sfiI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계; (마) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 sfiI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계; 및 (바) (라) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 (마) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터의 제조방법을 제공한다.

상기의 제조방법에서는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 먼저 도입하고 이후 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 도입한 이유는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 인 간항체 경쇄 가변영역 유전자의 도입에 이용되는 BstXI 제한효소 인식 자리가 존재하기 때문이다. 반대로, 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자의 도입에 이용되는 sfiI 제한효소 인식 자리가 존재하지 않는다.

본 발명의 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 벡터 내에 링커 유전자가 삽입되어 있고, 양쪽 말단에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 새로운 BstXI 제한효소 인식 자리를 가진 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위가 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결되어 있어서, 안정적이고 간편하게 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자가 도입된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 양쪽 말단에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 제한효소 인식 자리로서 바람직하게는 sfiI 제한효소 인식 자리를 가진 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위가 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결되어 있어서 2개의 제한효소와 2번의 제한효소 처리만으로도 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자와 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 도입하여 제조한 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 이용하여 간편하게 인간 항체 scFv 라이브러리를 제조할 수 있고, 상기의 인간 항체 scFv 라이브러리를 이용하여 특정 항원에 대한 항체의 탐색 및 항암제 등의 발굴이 가능하다.

본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터와 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터는 구별되어 사용되고 있는바, 재조합 벡터는 인간 항체 가변영역 유전자가 도입되기 전의 벡터를 의미하고, 발현 벡터는 인간 항체 가변영역 유전자가 도입된 벡터를 의미한다. 따라서, 재조합 벡터만으로는 인간 항체 scFv를 발현할 수 없고 재조합 벡터에 인간 항체 가변영역 유전자가 도입된 발현 벡터에 의해 인간 항체 scFv를 발현할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 제한효소 인식 자리를 가지는 데 바람직하게는 sfiI 제한효소 인식 자리인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 연구자들이 연구한 결과에 의할 때 인간 항체 가변영역 유전자는 BstXI 제한효소 인식 자리가 없으므로 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위를 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 형성시키고 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 도입시켜 안정적이고 간편하게 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제조할 수 있다.

도 1은 BstXI 제한효소 인식 자리와 sfiI 제한효소 인식 자리의 특정 염기서열을 나타낸 그림이다. 본 발명의 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터에서 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위의 양쪽 말단에 형성되는 BstXI 제한효소 인식 자리는 도 1에서 보이는 바와 같이 특정 염기서열을 가지며 BstXI 제한효소로 처리하는 경우 "NNNN"의 점착성 말단이 형성된다. 또한, 본 발명의 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터에서 중쇄 가변영역 유전자 삽입 부위의 양쪽 말단 에 형성되는 sfiI 제한효소 인식 자리는 도 1에서 보이는 바와 같이 특정 염기서열을 가지며 sfiI 제한효소로 처리하는 경우 "NNN"의 점착성 말단이 형성된다. 도 1에서 "N"으로 표시되는 염기는 a 또는 g 또는 c 또는 t/u, 불명 또는 기타 등 임의의 염기를 의미한다.

본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제조하는 방법은 다양하게 존재할 수 있으나, 바람직하게는

(a) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 링커 펩티드를 코딩하고 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위와 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 사이에 위치하는 링커 유전자를 포함하고, 양쪽 말단에 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리를 포함하는 인서트 DNA를 합성하는 단계; (b) 모벡터를 sfiI 및 BstXI 제한효소와 다른 제한효소로 처리하여 제한효소 인식 자리에 점착성 말단을 형성하는 단계; (c) (a) 단계의 인서트 DNA를 (b) 단계에서 모벡터에 처리한 제한효소와 동일한 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계;및 (d) (b) 단계에서 제조한 모벡터 내에 (c) 단계에서 제조한 인서트 DNA를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함한다.

여기서, 상기 모벡터는 자체적으로 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 경우가 발생할 수 있는데, 모벡터 내에 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리가 이미 존재하는 경우 본 발명의 인 간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제조하는 방법은 (d) 단계 이전에 모벡터 내에 존재하는 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, pAK100 모벡터로부터 본 발명의 바람직한 일 실시예인 pYG100 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제조하는 방법을 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

도 2는 모벡터 pAK100의 개략적인 개열지도이다. pAK100 벡터는 Andreas Pluckthun이 Journal of immunological methods(vol 201, page 35-55)에서 개시한 파지미드(Phagemid) 벡터로서 도 2에 도시된 바와 같이 벡터 내에 융합 펩티드인 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 두 개의 sfiI 제한효소 인식 자리가 형성되고, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 부위와 PIII 단백질을 코딩하는 GIII 유전자 사이에 항체의 발현량을 정량화하기 위한 Myc 태그 유전자가 위치하고, Myc 태그 유전자와 GIII 유전자 사이에 앰버 코돈(Amber codon)이 삽입되어 있어서 비억제성 숙주세포(Non-suppressor host cell)에서는 scFv만이 발현된다.

도 3은 모벡터 pAK100의 구체적인 개열지도이다. pAK100 벡터는 도 3에 도시된 바와 같이 다양한 구성요소를 포함하고(여기서 CAP, -35 Signal, -10 Signal, LacO, SD1, SD2는 도 2의 Lac P/O에 해당한다), 서열번호 9의 전체 염기서열(6,438개의 염기쌍)을 갖는다. 또한, 표 1과 같이 pAK100 벡터를 구성하는 각 구성요소의 염기서열은 특정 위치를 가진다. 도 3의 개열지도, 서열번호 9의 전체 염기서열, 표 1에 나타난 각 구성요소의 염기서열 위치를 참조하여 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진자가 pAK100 벡터를 용이하게 실시할 수 있음은 자명하다.

pAK100 벡터의 구성요소	염기서열의 위치
pAK100 벡터의 구성요소	시작 위치	종결 위치
colE1 ori	5917	67
lacI	209	1291
tHP terminator	1295	1349
CAP	1359	1381
-35 Signal	1395	1400
-10 Signal	1419	1424
LacO	1431	1451
SD1	1458	1461
SD2	1498	1501
pelB Leader	1509	1568
tetAR cassette	1569	3669
Myc tag	3689	3718
Amber codon	3719	3721
gIII(250-406)	3722	4192
f1 origin	4283	4738
camR	4925	5584

pAK100 벡터로부터 본 발명의 바람직한 일 실시예인 pYG100 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제조하기 위해서는 먼저 pAK100 벡터 내에 존재하는 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거해야 한다. 본 발명에서 BstXI 제한효소 인식 자리는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 pYG100 벡터에 도입할 때 사용되므로 적어도 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 링커 펩티드를 코딩하고 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위와 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 사이에 위치하는 링커 유전자를 포함하고, 양쪽 말단에 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리를 가지는 인서트 DNA를 pAK100 벡터 내에 도입하기 전에 제거하여야 한다.

도 4는 pAK100 벡터 내의 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하여 pAK100B 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 그림이다. pAK100 벡터 내에 존재하는 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하는 방법으로는 특정부위 돌연변이화(Site-directed mutagenesis) 방법을 사용할 수 있는데, 특정부위 돌연변이화 방법으로는 스트라타진(Stratagene)사의 QuickChange Kit를 이용하는 방법, 우라실(Uracil)을 함유한 단일 가닥 DNA를 이용하는 방법, PCR에 의해 돌연변이를 함유한 DNA 단편을 만들고 서브클론(Subclone)을 제조하는 방법 등이 있다. 이 중 스트라타진(Stratagene)사의 QuickChange Kit를 이용하는 경우 표 2에 나타난 서열을 가진 프라이머를 사용한다.

프라이머 이름	염기서열(5' ---> 3')
BstXI1-mutF	ggagctgaattacattcctaaccgcgtggcacaacaac
BstXI1-mutR	gttgttgtgccacgcggttaggaatgtaattcagctcc
BstXI2-mutF	cgccgatcaactgggtgctagcgtggtggtgtcgatg
BstXI2-mutR	catcgacaccaccacgctagcacccagttgatcggcg
BstXI3-mutF	gctggatgaccaggatgctattgctgtggaagctgcc
BstXI3-mutR	ggcagcttccacagcaatagcatcctggtcatccagc

pAK100 벡터 내의 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하여 pAK100B 벡터를 만든 후 pAK100B 벡터 내에 인서트 DNA를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하면 본 발명의 바람직한 일 실시예인 pYG100 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터가 완성된다. 도 5는 pAK100B 벡터와 인서트 DNA로부터 pYG100 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

도 5에서 보이는 바와 같이 pAK100 벡터 내에 도입되는 인서트 DNA는 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 링커 펩티드를 코딩하고 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위와 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 사이에 위치하는 링커 유전자를 포함하고, 양쪽 말단에 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리를 가지는 바람직한 일 예로 서열번호 2의 염기서열을 가진다. 서열번호 2의 인서트 DNA는 도 5에서 보이는 바와 같이 sfiI(81)부터 sfiI(100)까지의 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, BstXI(152)부터 BstXI(170) 까지의 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 링커 펩티드 서열인 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 링커 유전자를 포함하고, 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 5' 방향 앞에는 pelB 리더(leader) 펩티드를 코딩하는 pelB 리더 유전자가 위치한다. 또한, 인서트 DNA의 5' 말단과 3' 말단에는 각각 pAK100B 벡터 내에 존재하는 Xbal 제한효소 인식 자리와 EcoRI 제한효소 인식 자리가 형성된다.

서열번호 2의 인서트 DNA는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 이용하여 서열번호 3(도 5에서의 oligo 1), 서열번호 4(도 5에서의 oligo 2), 서열번호 5(도 5에서의 oligo 3), 서열번호 6(도 5에서의 oligo 4), 서열번호 7(도 5에서의 oligo 5), 및 서열번호 8(도 5에서의 oligo 6)의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로부터 형성될 수 있다.

pAK100B 벡터와 서열번호 2의 인서트 DNA가 준비되면 pAK100B 벡터와 서열번호 2의 인서트 DNA를 동일한 제한효소인 Xbal과 EcoRI 제한효소로 처리하여 점착상 말단을 형성시키고 인서트 DNA를 pAK100B 벡터에 도입한 후 리가아제(Ligase)로 연결하여 pYG100 재조합 벡터를 제조한다.

본 발명은 다른 측면은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터는 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 포함하고, 상기 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자는 바람직한 일 예로 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터의 제조방법으로서,

(가) 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지며, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 BstXI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계; (나) 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 BstXI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계; (다) (가) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 (나) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계; (라) (다)에서 제조한 경쇄 가변영역 유전자가 도입된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 sfiI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계; (마) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 sfiI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계; 및 (바) (라) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브 제작용 재조합 벡터 내에 (마) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터의 제조방법을 제공한다.

상기의 제조방법에서는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 먼저 도입하고 이후 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 도입한 이유는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자의 도입에 이용되는 BstXI 제한효소 인식 자리가 존재하기 때문이다. 반대로, 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자의 도입에 이용되는 sfiI 제한효소 인식 자리가 존재하지 않는다.

특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예인 pYG100 재조합 벡터는 벡터 내에 링커 유전자가 삽입되어 있고, 양쪽 말단에 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 새로운 BstXI 제한효소 인식 자리를 가진 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위가 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결되어 있으며, 양쪽 말단에 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에 존재하지 않는 sfiI 제한효소 인식 자리를 가진 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위가 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결되어 있어서, 2개의 제한효소와 2번의 제한효소 처리만으로도 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 안정적이고 간편하게 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 생식 계열( Germ Line ) 항체 가변영역 유전자의 제한효소 맵핑

인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 유전자의 제한효소 인식 자리를 알아보기 위하여 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 유전자의 서열을 분석하였다. 도 6은 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 유전자 서열 분석에서 확인된 가변영역의 그룹을 나타낸 것이다. 분석 결과, 중쇄 가변영역은 35개의 하위그룹(Subgroup)과 40개의 유전자가 확인되었고, sfiI 제한효소 인식 자리는 발견되지 않았다. 또한, 카파 경쇄 가변영역은 24개의 하위그룹과 33개의 유전자, 람다 경쇄 가변영역은 28개의 하위그룹과 36개 유전자가 확인되었고 BstXI 제한효소 인식 자리는 발견되지 않았다. 본 실험의 결과로부터 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 벡터 내에 도입할 때 BstXI 제한효소 처리는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에 영향을 주지 않으므로 안정적으로 BstXI 제한효소 인식 자리를 이용할 수 있다는 결론을 얻을 수 있다.

실시예 2. 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 pYG100 의 제조

위에서 상술한 바와 같이 도 4 및 도 5의 방법을 사용하여 pAK100 모벡터로부터 pYG100 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 제작하였다.

실시예 3. 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터 및 인간 항체 scFv 라이브러리의 제조

(1) BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자의 제조

양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 제조하기 위하여 표 3와 같이 BstXI 제한효소 인식 자리(표 3의 염기서열 중 굵은 글씨 부분)를 가지는 PCR 프라이머(Primer)를 제작하였다. 카파(Kappa) 경쇄 가변영역과 람다(Lambda) 경쇄 가변영역에 대한 센스 프라이머(sense primer)와 안티센스 프라이머(antisense primer)를 섞은 후, 말초 혈액 림프구(Peripheral Blood Lymphocyte, PBL)의 cDNA를 주형(template)으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 농도는 각각 1uM, 어닐링(annealing) 온도는 50℃, 반복회수는 30 사이클(cycles)이었다. PCR 결과물을 젤 용출(gel elution) 방법으로 정제하여 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 제조하였다.

카파 센스 프라이머(5' ---> 3')
K1aS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGACATCCAGATGACCCAGTC
K1bS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGCCATCCAGTTGACCCAGTC
K1cS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGYCATCYGGATGACCCAGTC
K2aS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGATATTGTGATGACCCAGAC
K2bS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGATRTTGTGATGACWCAGTC
K3aS	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGAAATTGTRWTGACRCAGTC
K4S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGAAACGACACTCACGCAGTC
K5S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGACATCGTGATGACCCAGTC
카파 안티센스 프라이머(5' ---> 3')
JK1L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG
JK2L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCC
JK3L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAG
JK4L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC
JK5L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCT
람다 센스 프라이머(5' ---> 3')
L1S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGYCTGTGCTGACTCAG
L2S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGTCTGTGCTGACGCA
L3S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGCCTGTGCTGACTCAAT
L4S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGTCTGCCCTGACTCAG
L5S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGRCTGTGGTGACYCAG
L6S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCTCCTATGAGCTGACWCAG
L7S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCCAGGCAGGGCTGACTCAG
L8S	GTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCAATTTTATGCTGACTCAG
람다 안티센스 프라이머(5' ---> 3')
JL1L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCCAGTT
JL2/3L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCG
JL7L	CTCGAATTCCACGAGGCTGGCTCCTCCACCGAGGGCGGTCAGCTGGGTGCCTCCT

(2) sfiI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자의 제조

PCR 프라이머(Primer)로 표 4와 같이 sfiI 제한효소 인식 자리(표 4의 염기서열 중 굵은 글씨 부분)를 가지는 프라이머를 사용한 점을 제외하고는 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자의 제조 방법과 동일한 방법을 사용하여 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 제조하였다.

중쇄 센스 프라이머(5' ---> 3')
Hf1	ATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTGCAGCTGGTRCAGTC
Hf2	ATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGARGGAGTC
Hf3	ATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
Hf4	ATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTRCAGSAGT
중쇄 안티센스 프라이머(5' ---> 3')
JH1L	GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCT
JH2L	GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACAGTGACCAGGGTGCCAC
JH4L	GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTT
JH3L	GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTT
JH6L	GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTT

(3) 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터 및 인간 항체 scFv 라이브러리의 제조

먼저, pYG100 재조합 벡터 및 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 BstXI 제한효소로 처리한 후 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 pYG100 재조합 벡터 내로 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하였다. 다음에 sfiI 제한효소를 이용하여 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 pYG100 재조합 벡터 내로 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하여 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 제조하였다. 위에서 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 먼저 도입하는 이유는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자에는 BstXI 제한효소 인식 자리가 존재하지만, 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자에는 sfiI 제한효소 인식 자리가 존재하지 않기 때문이다.

인간 항체 경쇄 가변영역 유전자와 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자의 다양한 조합에 의해 제조된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터를 TG1 대장균에 넣고 형질전환시켜 3E+10(3×10¹⁰) 크기의 인간 항체 scFv 라이브러리를 제조하였다. 상기 인간 항체 scFv 라이브러리의 크기는 발현 벡터 수를 기준으로 한 것이므로, 동일한 조합의 항체가 존재할 수 있다.

실시예 4. 인간 항체 scFv 라이브러리를 이용한 암 관련 프로테아제 TMPRSS4 항원의 항체 탐색

실시예 3에서 제조한 인간 항체 scFv 라이브러리 저장액 4L를 2×YT (+chloramphenicol, + 2% glucose + 2mM MgCl₂) 배지에 현탁한 후[O.D.(Optical Density)=0.1, 측정파장 : 595nm], 37℃에서 배양하였다[O.D.(Optical Density)=0.6, 측정파장 : 595nm]. 여기에 M13 헬퍼 파지(helper phage)를 20 M.O.I(Multiplicity Of Infection, 대장균 세포 대비 감염시키는 헬퍼 파지의 수)로 첨가한 후, 30분간 정치 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 대장균을 회수하고, 2×YT (+chloramphenicol, +2mM MgCl₂, +1mM IPTG, +Kanamycin) 배지에 현탁한 후 30℃에서 밤새 배양하여 인간 항체 라이브러리 파지를 생산하였다. 생산된 인간 항체 라이브러리 파지에 40g/L PEG, 30g/L NaCl을 첨가하고, 얼음 위에서 1시간 동안 침전시켜 50배 이상 농축하였다.

이렇게 생산된 인간 항체 라이브러리 파지 중에서 TMPRSS4 항원에 선택적으로 반응하는 파지만을 선별하기 위해 바이오패닝(Biopanning)을 수행하였다. 먼저, 10ug/ml 농도의 TMPRSS4 항원 2ml을 면역튜브(immunotube)에 첨가하고 4℃에서 밤새 코팅하였다. 상기 TMPRSS4 항원이 코팅된 면역튜브에 인간항체 라이브러리 파지 2ml(+1% skim milk)을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 결합시키고, PBST(Phosphate buffered saline: 0.01 M phosphate buffer with 0.138 M NaCl. 0.0027 M KCl, 0.05% Tween 20)로 세척한 후, 100mM 농도의 TEA 2ml로 파지를 용출시켰다. 용출된 파지에 1M 농도의 트리스 버퍼(Tris buffer, pH 7.5) 1ml를 첨가하여 중화시켰다. 이후, 용출된 파지를 대장균 XL1-blue에 감염시켜 TMPRSS4 항원의 항체를 발현하는 대장균체를 수집하였다. 수집된 대장균체를 다시 배양시키고, TMPRSS4 항원과의 선택적 결합, 용출과정으로 이루어진 바이오패닝 과정을 3번 내지 4번 반복하였다.

표 5는 3차까지의 바이오패닝 과정에서 투입 파지 수 및 TMPRSS4 항원에 결합하는 파지 수를 나타낸 것이다. 표 5에서 나타나는 바와 같이 바이오패닝 과정을 반복할수록 TMPRSS4 항원에 결합하는 항체 파지의 농축이 증가함을 알 수 있다.

항원	탐색 차수	투입 파지수	결합 파지수
TMPRSS4	1차	4×10¹³	4.6×10⁶
	2차	7.7×10¹²	5×10⁷
	3차	7.2×10¹²	1.9×10⁹

3차까지의 바이오패닝 과정에서 농축된 파지가 선택적으로 농축되었는지, 즉 TMPRSS4 항원에 결합하는 파지로 농축되었는지 여부를 효소면역진단(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 이하 ELISA라 함)을 이용하여 측정하였다. TMPRSS4 항원을 100ng/well로 코팅한 96 well 면역 플레이트(immuneplate)에 각 탐색 차수의 파지 집합을 1시간 동안 상온에서 결합시키고, PBST로 세척하였다. 다시 항-M13-HRP(horseradish peroxidase)를 1시간 동안 상온에서 결합시키고, PBST로 세척하였다. OPD(o-phenylenediamine) 기질로 5~10분간 발색시킨 후 2.5M 농도의 황산(H₂SO₄) 50ul를 첨가하여 발색을 정지시키고 490nm 파장에서 흡광도(Optical Density, O.D.) 값을 측정하였다.

표 6은 TMPRSS4 항원, 항-Myc 항체, His 태그에 대한 파지의 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 표 6에서 나타내는 바와 같이 바이오패닝 과정을 반복할수록 TMPRSS4 항원에 대하여 결합력이 있는 파지가 선택적으로 잘 농축되었다.

탐색차수	흡광도
탐색차수	TMPRSS4 항원	항-Myc 항체	His 태그
탐색전	0.0089	1.543	0.0254
1차	-0.0103	1.244	0.0209
2차	1.0798	1.0921	0.0148
3차	2.9477	1.5178	0.0356

3차 탐색 대장균체에서 단일 대장균들을 골라 파지를 발현시키고 TMPRSS4 항원에 대한 결합력을 ELISA를 이용하여 측정한 결과, 총 96개 중 38개의 단일 파지가 TMPRSS4 항원에 결합하는 것으로 나타났으며, Myc 태그의 발현량을 비교하여 TMPRSS4 항원에 강하게 결합하는 11개의 항체 발현 파지를 선택하였다.

도 7은 TMPRSS4 항원에 강하게 결합하는 파지들의 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 그룹과 CDR3(Complementarity determining region 3, 상보성결정영역 3) 부분의 아미노산 서열을 분석한 그림이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에서 선택된 11개의 항체 발현 파지는 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 그룹과 90% 이상의 상동성을 가지고 있으며, 상기 항체 가변영역 내지 CDR3 아미노산 서열을 이용하여 TMPRSS4 항원 관련 질환을 진단하거나, TMPRSS4 항원 관련 질환의 치료제를 효율적으로 발굴할 수 있다.

도 1은 BstXI 제한효소 인식 자리와 sfiI 제한효소 인식 자리의 특정 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 2는 모벡터 pAK100의 개략적인 개열지도이고, 도 3은 모벡터 pAK100의 구체적인 개열지도이다.

도 4는 pAK100 벡터 내의 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하여 pAK100B 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 그림이고, 도 5는 pAK100B 벡터와 인서트 DNA로부터 pYG100 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

도 6은 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 유전자 서열 분석에서 확인된 가변영역의 그룹을 나타낸 것이고, 도 7은 TMPRSS4 항원에 강하게 결합하는 파지들의 인간 생식 계열(Germ Line) 항체 가변영역 그룹과 CDR3(Complementarity determining region 3, 상보성결정영역 3) 부분의 아미노산 서열을 분석한 그림이다.

<110> A&R Therapeutics <120> Recombinant vector, expression vector for antibody scFv library and manufacturing method thereof <130> P08-05983 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insert DNA <400> 2 aatttctaga taacgagggc aaatcatgaa atacctattg cctacggcag ccgctggatt 60 gttattactc gcggccnnnn nggccatggc cggccnnnnn ggcctcggag gaggaggtag 120 tggcggagga ggctccggtg gatccannnn nntgggttcc gccannnnnn tggaattcga 180 ggag 184 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 1 <400> 3 aatttctaga taacgagggc aaatcatgaa atacct 36 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 2 <400> 4 gcgagtaata acaatccagc ggctgccgta ggcaataggt atttcatgat ttgc 54 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 3 <400> 5 tggattgtta ttactcgcgg cccagccggc catggccggc ctcgggggcc tcg 53 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 4 <400> 6 ctggatccac cggagcctcc tccgccacta cctcctcctc cgaggccccc gaggccgg 58 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 5 <400> 7 ggctccggtg gatccagcgg tgtgggttcc gccagcctcg tgg 43 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 6 <400> 8 ctcctcgaat tccacgaggc tggcggaa 28 <210> 9 <211> 6438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAK100 Phagemid vector <400> 9 gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 60 atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 120 tcacatgccc gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc 180 ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga 240 gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc 300 tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg 360 cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct 420 ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg 480 tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt 540 gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca 600 ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc 660 tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt 720 ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc 780 tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca 840 gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca 900 aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct 960 gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggaca tctcggtagt 1020 gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca 1080 ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca 1140 ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc 1200 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 1260 acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcggtaccc gataaaagcg gcttcctgac 1320 aggaggccgt tttgttttgc agcccacctc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 1380 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 1440 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgaatttct agataacgag 1500 ggcaaatcat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta ctcgcggccc 1560 agccggccaa aaagcccgta gcgggctgct acgggcgtct gacgcggtgg aaagggggag 1620 gggatgttgt ctacatggct ctgctgtagt gagtgggttg cgctccggca gcggtcctga 1680 tcaatcgtca ccctttctcg gtccttcaac gttcctgaca acgagcctcc ttttcgccaa 1740 tccatcgaca atcaccgcga gtccctgctc gaacgctgcg tccggaccgg cttcgtcgaa 1800 ggcgtctatc gcggcccgca acagcggcga gagcggagcc tgttcaacgg tgccgccgcg 1860 ctcgccggca tcgctgtcgc cggcctgctc ctcaagcacg gccccaacag tgaagtagct 1920 gattgtcatc agcgcattga cggcgtcccc ggccgaaaaa cccgcctcgc agaggaagcg 1980 aagctgcgcg tcggccgttt ccatctgcgg tgcgcccggt cgcgtgccgg catggatgcg 2040 cgcgccatcg cggtaggcga gcagcgcctg cctgaagctg cgggcattcc cgatcagaaa 2100 tgagcgccag tcgtcgtcgg ctctcggcac cgaatgcgta tgattctccg ccagcatggc 2160 ttcggccagt gcgtcgagca gcgcccgctt gttcctgaag tgccagtaaa gcgccggctg 2220 ctgaaccccc aaccgttccg ccagtttgcg tgtcgtcaga ccgtctacgc cgacctcgtt 2280 caacaggtcc agggcggcac ggatcactgt attcggctgc aactttgtca tgcttgacac 2340 tttatcactg ataaacataa tatgtccacc aacttatcag tgataaagaa tccgcgcgtt 2400 caatcggacc agcggaggct ggtccggagg ccagacgtga aacccaacat acccctgatc 2460 gtaattctga gcactgtcgc gctcgacgct gtcggcatcg gcctgattat gccggtgctg 2520 ccgggcctcc tgcgcgatct ggttcactcg aacgacgtca ccgcccacta tggcattctg 2580 ctggcgctgt atgcgttggt gcaatttgcc tgcgcacctg tgctgggcgc gctgtcggat 2640 cgtttcgggc ggcggccaat cttgctcgtc tcgctggccg gcgccactgt cgactacgcc 2700 atcatggcga cagcgccttt cctttgggtt ctctatatcg ggcggatcgt ggccggcatc 2760 accggggcga ctggggcggt agccggcgct tatattgccg atatcactga tggcgatgag 2820 cgcgcgcggc acttcggctt catgagcgcc tgtttcgggt tcgggatggt cgcgggacct 2880 gtgctcggtg ggctgatggg cggtttctcc ccccacgctc cgttcttcgc cgcggcagcc 2940 ttgaacggcc tcaatttcct gacgggctgt ttccttttgc cggagtcgca caaaggcgaa 3000 cgccggccgt tacgccggga ggctctcaac ccgctcgctt cgttccggtg ggcccggggc 3060 atgaccgtcg tcgccgccct gatggcggtc ttcttcatca tgcaacttgt cggacaggtg 3120 ccggccgcgc tttgggtcat tttcggcgag gatcgctttc actgggacgc gaccacgatc 3180 ggcatttcgc ttgccgcatt tggcattctg cattcactcg cccaggcaat gatcaccggc 3240 cctgtagccg cccggctcgg cgaaaggcgg gcactcatgc tcggaatgat tgccgacggc 3300 acaggctaca tcctgcttgc cttcgcgaca cggggatgga tggcgttccc gatcatggtc 3360 ctgcttgctt cgggtggcat cggaatgccg gcgctgcaag caatgttgtc caggcaggtg 3420 gatgaggaac gtcaggggca gctgcaaggc tcactggcgg cgctcaccag cctgacctcg 3480 atcgtcggac ccctcctctt cacggcgatc tatgcggctt ctataacaac gtggaacggg 3540 tgggcatgga ttgcaggcgc tgccctctac ttgctctgcc tgccggcgct gcgtcgcggg 3600 ctttggagcg gcgcagggca acgagccgat cgctgatcgt ggaaacgata ggcctatgcc 3660 atgcgggtcg gcctcggggg ccgaattcga gcagaagctg atctctgagg aagacctgta 3720 gggtggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag atggcaaacg ctaataaggg 3780 ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag gcaaacttga 3840 ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg tttccggcct 3900 tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa tggctcaagt 3960 cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac cttccctccc 4020 tcaatcggtt gaatgtcgcc cttttgtctt tggcgctggt aaaccatatg aattttctat 4080 tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat atgttgccac 4140 ctttatgtat gtattttcta cgtttgctaa catactgcgt aataaggagt cttgataagc 4200 ttgacctgtg aagtgaaaaa tggcgcacat tgtgcgacat tttttttgtc tgccgtttac 4260 cgctactgcg tcacggatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg 4320 gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct 4380 ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg 4440 ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 4500 ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg 4560 gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 4620 tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat 4680 gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttca 4740 ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 4800 tcaaatatgt atccgctcat gtcgagacgt tgggtgaggt tccaactttc accataatga 4860 aataagatca ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag ctaaggaagc 4920 taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa 4980 agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct 5040 ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt 5100 tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggag ttccgtatgg caatgaaaga 5160 cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac 5220 tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat 5280 atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat 5340 tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa 5400 cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca 5460 aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt 5520 ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc 5580 gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg cctgaataag 5640 tgataataag cggatgaatg gcagaaattc gaaagcaaat tcgacccggt cgtcggttca 5700 gggcagggtc gttaaatagc cgcttatgtc tattgctggt ttaccggttt attgactacc 5760 ggaagcagtg tgaccgtgtg cttctcaaat gcctgaggcc agtttgctca ggctctcccc 5820 gtggaggtaa taattgctcg acatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 5880 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 5940 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 6000 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 6060 tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 6120 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 6180 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 6240 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 6300 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 6360 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 6420 tctttatagt cctgtcgg 6438

Claims

링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지며, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 sfiⅠ 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 태그 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 태그 유전자는 Myc 태그 유전자인 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터는 PYG100인 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터.
(a) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지는 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 링커 펩티드를 코딩하고 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위와 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위의 사이에 위치하는 링커 유전자를 포함하고, 양쪽 말단에 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리를 포함하는 인서트 DNA를 합성하는 단계;

(b) 모벡터를 sfiI 및 BstXI 제한효소와 다른 제한효소로 처리하여 제한효소 인식 자리에 점착성 말단을 형성하는 단계;

(c) (a) 단계의 인서트 DNA를 (b) 단계에서 모벡터에 처리한 제한효소와 동일한 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계;및

(d) (b) 단계에서 제조한 모벡터 내에 (c) 단계에서 제조한 인서트 DNA를 도 입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법은 (d) 단계 이전에 모벡터 내에 존재하는 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 인서트 DNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
삭제
제 7항에 있어서, 상기 모벡터 내에 존재하는 sfiI 제한효소 인식 자리 또는 BstXI 제한효소 인식 자리는 특정부위 돌연변이화(Site-directed mutagenesis)에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 인서트 DNA의 양쪽 말단에 형성된 sfiI 및 BstXI 제한효소 인식 자리와 다르고 모벡터의 제한효소 인식 자리와 동일한 제한효소 인식 자리는 서로 다른 두 개의 제한효소 인식 자리인 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 인서트 DNA의 양쪽 말단에 형성된 서로 다른 두 개의 제한효소 인식 자리는 Xbal 제한효소 인식자리 및 EcoRI 제한효소 인식 자리인 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터의 제조방법.
링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터에 있어서, 상기 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지며, 상기 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자는 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터.
삭제
(가) 링커 펩티드를 코딩하는 링커 유전자, 상기 링커 유전자의 한쪽 말단과 연결된 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위, 및 상기 링커 유전자의 다른 쪽 말단과 연결된 경쇄 가변영역 유전자 삽입부위를 포함하고, 상기 경쇄 가변영역 유전자 삽입 부위는 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 가지며, 상기 중쇄 가변영역 유전자 삽입부위는 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 가지는 것을 특징으로 하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터를 BstXI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계;

(나) 양쪽 말단에 BstXI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 BstXI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단 계;

(다) (가) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 (나) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 경쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;

(라) (다)에서 제조한 경쇄 가변영역 유전자가 도입된 인간 항체 scFv 라이브 제작용 재조합 벡터를 sfiI 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계;

(마) 양쪽 말단에 sfiI 제한효소 인식 자리를 포함하는 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 sfiI 제한효소로 처리하여 양쪽에 점착성 말단을 형성하는 단계; 및

(바) (라) 단계에서 제조한 점착성 말단이 형성된 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 재조합 벡터 내에 (마) 단계에서 제조한 양쪽에 점착성 말단이 형성된 인간 항체 중쇄 가변영역 유전자를 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;를 포함하는 인간 항체 scFv 라이브러리 제작용 발현 벡터의 제조방법.