CN116444675A - 一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116444675A CN116444675A CN202310529865.6A CN202310529865A CN116444675A CN 116444675 A CN116444675 A CN 116444675A CN 202310529865 A CN202310529865 A CN 202310529865A CN 116444675 A CN116444675 A CN 116444675A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna polymerase
- pfu dna
- nanobody
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 title claims description 59
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 11
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 8
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 7
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种PfuDNA聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用,所述纳米抗体与PfuDNA聚合酶特异性结合以封闭所述PfuDNA聚合酶的活性。本发明公开的纳米抗体与PfuDNA聚合酶有较高的亲和力,并且能够在低温下有效抑制PfuDNA聚合酶的聚合活性,从而降低PCR技术中在低温条件下产生非特异性扩增或者引物二聚体等问题并同时能够保证其热稳定性,为Pfu DNA酶热启动技术提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物抗体开发领域,具体涉及一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
链式聚合反应(polymerase chainreaction,PCR)是分子生物学研究最基本的工具,在DNA酶的催化下,以母链DNA为模板,以引物为起点通过变性、退火和延伸等循环步骤,在体外对DNA分子进行扩增,从而实现DNA的复制。
Pfu DNA聚合酶是从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus,Pfu)分离出的DNA聚合酶,被广泛应用于PCR,由于其高保真性和稳定性广受科研人员的青睐。但是通常和大多数DNA聚合酶一样,面临着如下问题:在低温条件下,酶仍然具有一定聚合活性,从而产生非特异性扩增或者引物二聚体。
热启动PCR技术是解决该问题的方法之一,通过基因工程对酶进行突变或者改造,或者使用配体抑制DNA聚合酶在低温条件下的聚合活性,又或对引物进行修饰,从而达到热启动控制PCR反应的目的。通过基因工程改造聚合酶通常是比较困难的,而修饰引物的成本比较高。传统抗体尽管在低温条件下能抑制聚合酶的活性,降低反应的非特异性扩增,但由于其体积相对较大,在加入到反应体系中后,也可能会影响酶的长期稳定性,导致整体的扩增能力下降。纳米抗体是骆驼科动物血清中重链抗体的抗原结合域,由于其体积小,亲和力高,常被用作传统抗体的替代品。因此需要开发一种新型纳米抗体封闭系统,最大程度降低Pfu DNA聚合酶非特异性扩增的同时,还能保证聚合酶长期热稳定性。
发明内容
为克服上述缺陷,本发明目的在于提供一种Pfu DNA聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种Pfu DNA聚合酶的纳米抗体,所述纳米抗体与Pfu DNA聚合酶特异性结合以封闭所述Pfu DNA聚合酶的活性,所述纳米抗体命名为NB-PF1,所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。
进一步的,所述纳米抗体包括CDR1、CDR2和CDR3,所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
进一步的,所述纳米抗体还包括FR1、FR2、FR3和FR4,所述纳米抗体的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,FR3的氨基酸序列如SEQID NO.7所示,FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步的,所述纳米抗体与Pfu DNA聚合酶的平衡解离常数KD为(5.9±2.4)×10-8。
本发明提供一种如上述的Pfu DNA聚合酶的纳米抗体的制备方法,包括以下步骤:
(1)动物免疫:用Pfu DNA聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫,采集多次免疫后的羊驼的外周血;
(2)提取(1)中采集的外周血的mRNA,并进行反转录,得到cDNA文库,再利用巢式PCR技术扩增得到抗体基因序列;
(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收,然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上,将所述载体进行转化,之后涂平板,得到质粒文库;
(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中,经过诱导之后离心,得上清液,ELISA检测上清液,采用类似限制稀释法,逐步稀释富集,筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。
进一步的,其特征在于,在所述步骤(4)之后还包括步骤(5):使用ITC技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述Pfu DNA聚合酶的亲和力。
进一步的,在所述步骤(5)之后还包括步骤(6):采用毛细管电泳验证所述纳米抗体对Pfu DNA聚合酶活性的封闭作用。
进一步的,所述步骤(2)中利用巢式PCR技术扩增中所使用的引物对为CALL001和CALL002、VHH-EcoRI-For和VHH-HindIII-Rev,所述CALL001的序列组成为GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO.9),所述CALL002的序列组成为GGTACGTGCTGTTGAACT-GTTCC(SEQ ID NO.10),所述VHH-EcoRI-For的序列组成为CTTGAATTCCATCACCATCACCATCACSAGGTG-CAGCTGGTGGAGTCTGG RGGAG(SEQ ID NO.11),所述VHH-HindIII-Rev的序列组成为GGGAAGCTTTTAGCT-GGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO.12)。
本发明还提供一种如上述的Pfu DNA聚合酶的纳米抗体在降低PCR非特异性扩增中的用途。
进一步的,所述纳米抗体降低PCR非特异性扩增是通过与所述Pfu DNA聚合酶结合、在低温下抑制所述Pfu DNA聚合酶的聚合活性而实现的。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供一种Pfu DNA聚合酶的纳米抗体及其制备方法和应用,纳米抗体与PfuDNA聚合酶有较高的亲和力,并且能够在低温下有效抑制Pfu DNA聚合酶的聚合活性,从而降低PCR技术中在低温条件下产生非特异性扩增或者引物二聚体等问题并同时能够保证其热稳定性,为Pfu DNA酶热启动技术提供了新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中免疫羊驼的血清效价检测结果图;
图2为实施例3中纳米抗体NB-PF1和Pfu DNA聚合酶的亲和力数据;
图3为实施例4中在30℃和40℃下的实验组的毛细管电泳测定结果;
图4为实施例4中95℃热激后分别在30℃和40℃下的实验组的毛细管电泳测定结果;
图5为实施例4中在30℃和40℃下的对照组的毛细管电泳测定结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例及附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明实施例提供一种Pfu DNA聚合酶的纳米抗体,所述纳米抗体与Pfu DNA聚合酶特异性结合以封闭所述Pfu DNA聚合酶的活性,所述纳米抗体命名为NB-PF1,所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。
SEQ ID NO.1的序列组成为:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYVMSWYRAQPGKERELVAVITSAGGSTNYADSVKGRISFTRDNAKNTVYL QMNSLKPEDTAVYYCNAVYYSGSYYSPSRPYEYDYWGQGTQVTVSS。
具体的,所述置换为保守置换。
具体的,所述纳米抗体包括CDR1、CDR2和CDR3,所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(序列组成为:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS)所示,CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.3(序列组成为:MSWYRAQPGKERELVAV)所示,CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4(序列组成为:NYADSVKGRISFTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC)所示。
其中,CDR1、CDR2和CDR3为3个互补决定区(complementarity determiningregion,CDR),是抗体识别及结合抗原的部位,决定抗体的特异性。
具体的,所述纳米抗体还包括FR1、FR2、FR3和FR4,所述纳米抗体的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5(序列组成为:WGQGTQVTVSS)所示,FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6(序列组成为:GFTFSSYV)所示,FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7(序列组成为:ITSAGGST)所示,FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.8(序列组成为:NAVYYSGSYYSPSRPYEYDY)所示。
其中,在V区(可变区)中,CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守,称为骨架区(frameworkregion,FR)。VH或VL各有四个骨架区,分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。
具体的,所述纳米抗体与Pfu DNA聚合酶的平衡解离常数KD为(5.9±2.4)×10-8。
其中,亲和力(affinity ofantibodies)系指单个分子与其配体结合的强度。KD是抗体与其抗原之间的平衡解离常数,即抗原解离的速率koff与抗体与抗原缔合的速率kon之间的比值。KD与亲和力成反比。KD值与抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)有关,因此KD值越低(浓度越低),抗体的亲和力越高。
本发明实施例提供一种如上述的Pfu DNA聚合酶的纳米抗体的制备方法,包括以下步骤:
(1)动物免疫:用Pfu DNA聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫,采集多次免疫后的羊驼的外周血;
(2)提取(1)中采集的外周血的mRNA,并进行反转录,得到cDNA文库,再利用巢式PCR技术扩增得到抗体基因序列;
(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收,然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上,将所述载体进行转化,之后涂平板,得到质粒文库;
(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中,经过诱导之后离心,得上清液,ELISA检测上清液,采用类似限制稀释法,逐步稀释富集,筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。
具体的,在所述步骤(4)之后还包括步骤(5):使用ITC技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述Pfu DNA聚合酶的亲和力。
其中,等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)近年来迅速发展并广泛应用于分子生物学及其相关领域的研究分子相互作用的生物物理技术,它是在恒定温度下唯一能够直接测量复合物形成过程中的热量变化的方法。它可以简单地通过测量两个溶液相互作用时吸收或放出的热量来提供分子相互作用的重要信息,如结合常数、结合位点数、自由能、焓和熵。
具体的,在所述步骤(5)之后还包括步骤(6):采用毛细管电泳验证所述纳米抗体对Pfu DNA聚合酶活性的封闭作用。
具体的,所述步骤(2)中利用巢式PCR技术扩增中所使用的引物对为CALL001和CALL002、VHH-EcoRI-For和VHH-HindIII-Rev,所述CALL001的序列组成为GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO.9),所述CALL002的序列组成为GGTACGTGCTGTTGAACT-GTTCC(SEQ ID NO.10),所述VHH-EcoRI-For的序列组成为CTTGAATTCCATCACCATCACCATCACSAGGTG-CAGCTGGTGGAGTCTGG RGGAG(SEQ ID NO.11),所述VHH-HindIII-Rev的序列组成为GGGAAGCTTTTAGCT-GGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO.12)。
本发明实施例还提供一种如上述的Pfu DNA聚合酶的纳米抗体在降低PCR非特异性扩增中的用途。
具体的,所述纳米抗体降低PCR非特异性扩增是通过与所述Pfu DNA聚合酶结合、在低温下抑制所述Pfu DNA聚合酶的聚合活性而实现的。
以下结合具体实施例说明:
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得,它们仅作为举例,对本发明不是唯一的,可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。
实施例1 Pfu DNA聚合酶的羊驼免疫
用4mgPfu DNA聚合酶对一只3岁的雌性羊驼进行免疫,在羊驼的颈下靠近淋巴结附近位置,进行多点皮下注射,每次免疫之前,收集3ml血液用于效价检测,首次免疫将1mg抗原稀释到150ul PBS缓冲液中,并与等体积的GERBU佐剂进行乳化,之后每隔一周将0.5mg抗原进行乳化注射,总共免疫7次。测定的血清效价如图1所示,在经过约104稀释之后,仍能检测出部分信号,说明免疫良好。在最后一次免疫后的第3天,采集外周血50ml,用于构建纳米抗体免疫文库。
实施例2 Pfu DNA聚合酶的纳米抗体的制备和筛选
将实施例1新鲜采集的外周血,先经过LeukoLOCKTMTotal RNA Isolation Kit(Thermo Fisher)从10ml血液中的淋巴细胞提取总mRNA。经过TransScriptR-UniOne-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物)反转录得到cDNA文库之后,再利用巢式PCR技术先后经过CALL001(SEQ ID NO.9:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG)、CALL002(SEQ ID NO.10:GGTACGTGCTGTTGAACT-GTTCC)和VHH-EcoRI-For(SEQ ID NO.11:CTTGAATTCCATCACCATCACCATCACSAGGTG-CAGCTGGTGGAGTCTG GRGGAG)、VHH-HindIII-Rev(SEQID NO.12:GGGAAGCTTTTAGCT-GGAGACGGTGACCTGGGT)扩增得到多样化抗体基因序列(包括VHH基因片段),反应体系及条件如下表1和表2:
表1 PCR反应体系
组分 | 体积 |
模板 | 50ng |
正向引物(10uM) | 2μl |
反向引物(10uM) | 2μl |
2xFasHifiPCRSuperMix | 25μl |
去核酸酶超纯水 | 补齐至50μl |
总体积 | 50μl |
表2 PCR反应条件
先后经过两次凝胶回收得到700bp和400bp的片段。经过限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切,酶切反应体系如下表3:
表3酶切反应体系
之后用T4连接酶连接,将VHH融合到修饰改造的pET-22B(+)载体(噬菌体载体)上,位于PelB信号肽和His(6X)的C端。连接反应体系如下表4:
表4 T4 DNA连接酶连接反应体系
成分 | 体积 |
VHH片段 | 100ng |
pET22b质粒 | 25ng |
10xT4DNAligaseReaction缓冲液 | 2μl |
T4DNAligase | 1μl |
ddH2O | 补齐至20μl |
总体积 | 20μl |
取约10ng的质粒文库进行转化(转化至TG1感受态细胞(电转)),涂平板(含有氨苄抗性的LB培养板)。然后随机挑选10~20个克隆测序,将测序结果中纳米抗体片段翻译成氨基酸序列后进行序列比对,检测细菌文库中序列多样性。最终得到多样性>107/ug的质粒文库(噬菌体库)。
将质粒文库(噬菌体库)转化至T7菌株(表达菌株如BL21)中,接种方式为96孔板中每孔接种1000个克隆,经过IPTG诱导(诱导蛋白表达)之后离心,ELISA检测上清,采用类似限制稀释法,逐步稀释富集,具体操作为:将阳性克隆孔放大培养,挑取10000个克隆,平均分配到新的96孔板中,每孔接种约100个克隆,经过IPTG诱导(诱导蛋白表达)之后离心,ELISA检测上清,将阳性克隆孔放大培养,挑取1000个克隆,平均分配到新的96孔板中,每孔接种约10个克隆,经过IPTG诱导(诱导蛋白表达)之后离心,ELISA检测上清,将阳性克隆孔放大培养,挑取100个克隆,平均分配到新的96孔板中,每孔接种约1个克隆,从而筛选出阳性纳米抗体单克隆以及阳性纳米抗体单克隆表达的NB-PF1。
实施例3 Pfu DNA聚合酶与纳米抗体的亲和力的测定
将实施例2筛选出的与Pfu DNA聚合酶特异性结合的纳米抗体NB-PF1和Pfu DNA聚合酶置于HEPES缓冲液(包括25mM HEPES和150mM NaCl,PH为8.0)中透析过夜,调节各个蛋白的浓度到合适大小。使用MicroCal iTC200微量量热仪器(GE Healthcare)进行ITC实验,反应池中含有10~100μM的抗原或抗体,注射器中含有约10倍浓度的对应的抗原或抗体,搅拌速率为750rpM,温度为25℃,使用AFFINImeter ITC软件进行数据拟合,得到亲和力数据,结果见图2,从图2可看出,纳米抗体NB-PF1与Pfu DNA聚合酶的平衡解离常数KD为(5.9±2.4)×10-8。
实施例4纳米抗体封闭Pfu DNA聚合酶的聚合活性的测定
毛细管电泳验证纳米抗体NB-PF1对Pfu DNA聚合酶活性的封闭作用。用1UPfu DNA聚合酶进行单链DNA扩增实验。实验组加入1μM的Pfu DNA聚合酶单克隆纳米抗体,分别在30℃、40℃(图3)以及95℃热激后在30℃和40℃(图4)下重复进行实验,对照组(图5)加入1μM非特异性纳米抗体,分别在在30℃和40℃下重复进行实验,所得产物进行毛细管电泳。图3显示主要产物出峰在50bp,Pfu聚合酶没有引起DNA片段的延伸,而图5和图4显示在超过50bp的位置有多个位置出峰,表明Pfu聚合酶具有延伸DNA片段的活性,这说明纳米抗体NB-PF1在低温下对Pfu DNA聚合酶活性具有封闭作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种PfuDNA聚合酶的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体与PfuDNA聚合酶特异性结合以封闭所述PfuDNA聚合酶的活性,所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列。
2.如权利要求1所述的PfuDNA聚合酶的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体包括CDR1、CDR2和CDR3,所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1所述的PfuDNA聚合酶的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体还包括FR1、FR2、FR3和FR4,所述纳米抗体的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
4.如权利要求1所述的PfuDNA聚合酶的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体与PfuDNA聚合酶的平衡解离常数KD为(5.9±2.4)×10-8。
5.一种如权利要求1-4任一所述的PfuDNA聚合酶的纳米抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)动物免疫:用PfuDNA聚合酶对雌性羊驼进行多次免疫,采集多次免疫后的羊驼的外周血;
(2)提取(1)中采集的外周血的mRNA,并进行反转录,得到cDNA文库,再利用巢式PCR技术扩增得到抗体基因序列;
(3)将(2)中得到的抗体基因序列进行凝胶回收,然后通过酶切和连接反应将所述抗体基因序列融合到载体上,将所述载体进行转化,之后涂平板,得到质粒文库;
(4)将(3)中得到的质粒文库转化至菌株中,经过诱导之后离心,得上清液,ELISA检测上清液,逐步稀释富集,筛选出阳性纳米抗体单克隆及其产生的纳米抗体。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,还包括步骤(5):使用ITC技术检测步骤(4)筛选出的纳米抗体与所述PfuDNA聚合酶的亲和力。
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(5)之后还包括步骤(6):采用毛细管电泳PCR验证所述纳米抗体对PfuDNA聚合酶活性的封闭作用。
8.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中利用巢式PCR技术扩增中所使用的引物对为CALL001和CALL002、VHH-EcoRI-For和VHH-HindIII-Rev,所述CALL001的序列组成为GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG,所述CALL002的序列组成为GGTACGTGCTGTTGAACT-GTTCC,所述VHH-EcoRI-For的序列组成为CTTGAATTCCATCACCATCACCATCACSAGGTG-CAGCTGGTGGAGTCTG GRGGAG,所述VHH-HindIII-Rev的序列组成为GGGAAGCTTTTAGCT-GGAGACGGTGACCTGGGT。
9.如权利要求1-4任一所述的PfuDNA聚合酶的纳米抗体在降低PCR非特异性扩增中的用途。
10.如权利要求9的用途,其特征在于,所述纳米抗体降低PCR非特异性扩增是通过与所述PfuDNA聚合酶结合、在低温下抑制所述PfuDNA聚合酶的聚合活性而实现的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310529865.6A CN116444675B (zh) | 2023-05-11 | 2023-05-11 | 一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310529865.6A CN116444675B (zh) | 2023-05-11 | 2023-05-11 | 一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116444675A true CN116444675A (zh) | 2023-07-18 |
CN116444675B CN116444675B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=87130221
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310529865.6A Active CN116444675B (zh) | 2023-05-11 | 2023-05-11 | 一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116444675B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010077634A1 (en) * | 2008-12-09 | 2010-07-08 | Genentech, Inc. | Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function |
WO2012131076A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | BISPECIFIC BINDING MOLECULES BINDING TO Dll4 AND Ang2 |
CN105492025A (zh) * | 2013-07-16 | 2016-04-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用pd-1轴结合拮抗剂和tigit抑制剂治疗癌症的方法 |
WO2017121843A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Antibodies that bind thermophilic dna polymerases |
US20210002370A1 (en) * | 2019-07-05 | 2021-01-07 | Shihezi University | Pd-l1 nanobodies, preparation methods and uses thereof |
KR20220064331A (ko) * | 2020-11-10 | 2022-05-18 | (주)샤페론 | SARS-CoV-2에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도 |
-
2023
- 2023-05-11 CN CN202310529865.6A patent/CN116444675B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010077634A1 (en) * | 2008-12-09 | 2010-07-08 | Genentech, Inc. | Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function |
CN102245640A (zh) * | 2008-12-09 | 2011-11-16 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途 |
WO2012131076A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | BISPECIFIC BINDING MOLECULES BINDING TO Dll4 AND Ang2 |
CN105492025A (zh) * | 2013-07-16 | 2016-04-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用pd-1轴结合拮抗剂和tigit抑制剂治疗癌症的方法 |
WO2017121843A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Antibodies that bind thermophilic dna polymerases |
US20210002370A1 (en) * | 2019-07-05 | 2021-01-07 | Shihezi University | Pd-l1 nanobodies, preparation methods and uses thereof |
KR20220064331A (ko) * | 2020-11-10 | 2022-05-18 | (주)샤페론 | SARS-CoV-2에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
"WO2012131076A1", pages 286 * |
姬培;王楷;刘志平;林优优;吴纱;李文辉;潘传荣;张文生;许艇;: "杀虫剂甲萘威纳米抗体的制备及鉴定", 中国科技论文, no. 12, pages 95 - 98 * |
宋欢;孙明霞;尹坤;温永俊;刘永刚;蔡雪辉;: "猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定", 中国预防兽医学报, no. 04, pages 78 - 82 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116444675B (zh) | 2023-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4323317B2 (ja) | 可変領域配列のクローニング方法 | |
CN110655574B (zh) | 一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体、应用和gfp免疫亲和吸附材料 | |
Grimm et al. | Ribosome display selection of a murine IgG 1 Fab binding affibody molecule allowing species selective recovery of monoclonal antibodies | |
US20220155319A1 (en) | Use of nanoexpression to interrogate antibody repertoires | |
US10273530B2 (en) | Antibodies that bind thermophilic DNA polymerases | |
CN115838429A (zh) | 一种Taq DNA聚合酶抗体组合及其应用 | |
CN116444675B (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶纳米抗体及其制备方法和应用 | |
US20100036106A1 (en) | High-Affinity RNA Aptamer Molecule Against Glutathione-S-Transferase Protein | |
EP3394256B1 (en) | A method of generating an antibody naïve library, said library and application(s) thereof | |
Dillon et al. | Production of a recombinant anti-morphine-3-glucuronide single-chain variable fragment (scFv) antibody for the development of a “real-time” biosensor-based immunoassay | |
Ferrara et al. | Exploiting next-generation sequencing in antibody selections–a simple PCR method to recover binders | |
CN114075282B (zh) | Il-5的结合分子及其制备方法和应用 | |
JP7029138B2 (ja) | 連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及び連結核酸断片から構成されるライブラリ | |
CN102732507B (zh) | 一种改进的dna配基筛选方法 | |
CN112250765A (zh) | 一种针对her2的纳米抗体及其应用 | |
CN117777298A (zh) | 一种封闭Pfu DNA聚合酶突变体聚合活性的单克隆抗体组合及其应用 | |
CN117384293B (zh) | Taq DNA聚合酶抗体及其组合物、其修饰的Taq DNA聚合酶及其应用 | |
CN112574301B (zh) | 一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用 | |
CN111499734B (zh) | 一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用 | |
CN114773462B (zh) | 用于检测牛crp蛋白的重组单链抗体及其应用 | |
CN114106167B (zh) | 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用 | |
CN116496392B (zh) | 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用 | |
CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 | |
US9938522B2 (en) | High throughput sequencing of end regions of long linear DNAs | |
CN115594768A (zh) | 一种分泌抗dna聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |