KR101754222B1

KR101754222B1 - 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101754222B1
Application number: KR1020150033599A
Authority: KR
Inventors: 이찬호
Original assignee: (주)시크릿허브코리아
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2017-07-06
Also published as: KR20160109355A

Abstract

본 발명은 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, (1) 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 준비하는 단계; (2) 상기 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 건조하여 분말화하는 단계; 및 (3) 상기 분말화된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 온시 추출하는 단계를 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.
본 발명에서 제안하고 있는 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물이, 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 항산화 효과에 의해 피부세포를 보호하고, 피부를 미백시키며, 트러블 피부염증 치료 또는 개선 효능을 얻을 수 있다.

Description

천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법{SKIN AGING AND ACNE IMPROVING COMPOSITION INCLUDING NATURAL MEDICINAL HERBS COSMETIC COMPOSITION AND PREPARATION METHOD OF THE SAME}

본 발명은 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

경제가 발전하고 사람들의 소득 수준이 향상됨에 따라, 건강에 대한 관심도 증가하고 있다. 최근에는 젊음과 아름다움을 추구하는 안티 에이징(anti-aging) 트렌드가 빠르게 확산되고 있으며, 단순히 오래 사는 것에서 건강하게 사는 것을 넘어, 아름답게 사는 것을 추구하는 시대가 도래하고 있다.

이와 관련하여, 피부과, 화장품, 미용 서비스 등 안티 에이징 산업 고객층이 확대되면서 미디어, 학계, 산업계 전반에서도 관심이 증가하고 있다. 화장품, 미용의료 등 피부노화 분야는 안티 에이징 산업의 주요 축으로서, 피부는 신체 바깥쪽에 있어 다른 기관에 비해 관리를 통한 개선이 용이하고, 피부 상태로부터 신체건강, 나이 등을 가늠하기 시작하면서 피부가 안티 에이징의 핵심 부문으로 여겨지고 있다.

한편, 고령화, 소득증가 등으로 수요 측면에서나, 바이오 기술혁신 등 공급측면 모두에서 안티 에이징 산업은 충분히 성장할 잠재력을 가진 것으로 여겨지며, 자본투자 및 기술개발도 활성화될 것으로 예상된다. 그러나, 이러한 안티 에이징 열풍에 편승하여 효과가 제대로 검증되지 않은 제품이 유통되면서 소비자 피해도 급증하고 있으며, 이에 따라 체계적 R&D를 통한 우수제품 개발과 제대로 된 사용방법 및 효과검증이 모두 이루어진 우수제품 개발이 매우 중요하고 필수적인 상황이다.

한편, 피부에 나타나는 중요한 질환 중 하나인 아토피 피부염의 경우, 질병관리본부가 전국 45개 초등학교 2003명 40개 중학교 4112명을 대상으로 실시한 어린이청소년) 천식 및 알레르기질환 조사 결과에 따르면, 최근 15년간(1995년~2010년) 아토피피부염(atopic dermatitis)은 어린이(초등1)에서 2.2배(9.2%→20.6%), 청소년(중등1)에서 3.2배(4.0%→12.9%)로 증가하는 등, 전 세계적으로 아토피 피부염이 증가하는 추세이다. 특히, 12개월 유아의 아토피 피부염 증상 유병률은 대부분의 국가에서 증가하고 있다.

기능성 화장품 중 천연물 유래 화장품은 부작용이 적고, 작용이 일반적으로 온화하고 지속적이며, 생분해성이 높고 환경 친화적이기 때문에 일반 소비자 사이에서 이미지가 좋아 미국 일본 등 선진국에서도 천연물 유래 화장품 개발연구에 박차를 가하고 있다. 그러나, 우리나라에서 천연물 유래 화장품에 대한 연구는 선진국에 비하면 미미한 수준이다. 특히, 환경오염과 주거 환경의 변화로 영유아뿐만 아니라 아토피 피부로 고생하는 인구가 늘어나고 있는 실정인데 비해, 아토피 증상을 개선시키면서 전반적인 피부 노화를 개선할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1470064호(2014.12.12.)에서는 느릅나무 추출액을 함유하는 아토피 피부염 치료용 크림 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1224519호(2013.01.22.)에서는 피부 노화를 방지하기 위해 상황버섯 균사체 발효 콜라겐을 함유한 화장료 조성물을 개시하고 있으나, 아토피 피부염 및 피부 노화 중 어느 하나의 증상 및 개선을 위한 조성물을 개시하고 있을 뿐, 이러한 피부 노화를 개선함과 동시에, 아토피 피부염 증상을 개선할 수 있는 의약용 조성물, 화장품 조성물 등은 개시되지 않은 한계가 있다.

본 발명은 기존에 제안된 방법들의 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물이, 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 항산화 효과에 의해 피부세포를 보호하고, 피부를 미백시키며, 트러블 피부염증 치료 또는 개선 효능을 얻을 수 있는, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물은,

피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물로서,

하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.

바람직하게는,

상기 하수오의 배합비는 5 중량% 내지 8중량%이고, 상기 박하의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이며, 상기 마치현의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이고, 상기 감초의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이며, 상기 비즈왁스의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이고, 상기 카렌들라의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이며, 상기 백봉령의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이고, 상기 백강잠의 배합비는 24 중량% 내지 27 중량%이며, 상기 쇠뜨기의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%인 것으로 구성될 수 있다.

바람직하게는,

상기 하수오의 배합비는 6 중량% 내지 7중량%이고, 상기 박하의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이며, 상기 마치현의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이고, 상기 감초의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이며, 상기 비즈왁스의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이고, 상기 카렌들라의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이며, 상기 백봉령의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이고, 상기 백강잠의 배합비는 25 중량% 내지 26 중량%이며, 상기 쇠뜨기의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%인 것으로 구성될 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화 개선용 조성물은,

피부 노화 개선용 조성물로서,

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 여드름 개선용 조성물은,

여드름 개선용 조성물로서,

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물은,

피부 미백용 조성물로서,

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 제조방법은,

(1) 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 준비하는 단계;

(2) 상기 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 건조하여 분말화하는 단계; 및

(3) 상기 분말화된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 온시 추출하는 단계를 포함하는 것을 그 구성상의 특징으로 한다.

바람직하게는,

(4) 상기 추출된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 냉동 건조하는 단계를 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명에서 제안하고 있는 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물이, 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 항산화 효과에 의해 피부세포를 보호하고, 피부를 미백시키며, 트러블 피부염증 치료 또는 개선 효능을 얻을 수 있다.

도 1은 태양 노출 여부에 따른 피부 노화를 설명하기 위한 예시적인 도면.
도 2는 내인성 피부 노화 및 외인성 피부 노화의 세포외 기질(ECM)의 리모델링을 도시한 도면.
도 3은 자외선 노출에 의한 MMP1 발현량 증가에 미치는 TRPV1의 효과를 도시한 도면.
도 4는 아토피 피부염의 면역 병리 기전을 개념적으로 도시한 도면.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 구성을 도시한 도면.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 DPPH 라디칼 소거 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 지질과산화 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 과산화물음이온 소거 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 엘라스타아제 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 티로시나아제 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 세포 독성 시험 예의 결과를 도시한 도면.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 피부 이온 통로 제어 효능 평가를 위한 설비 구성을 도시한 도면.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 TRPV1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 Orai1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 용량별 Orai1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 NO 생성 억제 효과를 도시한 도면.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 PGE2 억제 효과를 도시한 도면.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 IL-1β 억제 효과를 도시한 도면.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 TNF-α 억제 효과를 도시한 도면.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 IL-6 억제 효과를 도시한 도면.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 iNOS, COX-2 유전자 발현 억제 효과를 도시한 도면.
도 22 내지 도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물을 피부 트러블에 임상 적용한 결과를 도시한 도면.

이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일 또는 유사한 부호를 사용한다.

덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 ‘연결’되어 있다고 할 때, 이는 ‘직접적으로 연결’되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 ‘간접적으로 연결’되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 ‘포함’한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 조성물의 효능효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

이하에서는, 피부 노화의 기전을 각각 설명하고, 피부 노화 및 여드름을 개선하기 위해 본 발명자들이 제안하는 발명의 구성 및 효과를 설명하도록 한다.

피부 노화의 기전

피부 노화의 생리적 특성을 보면, 피부 노화는 복잡한 생물학적 현상으로서 내인적(intrinsic) 및 외인적(extrinsic) 2가지 요인에 의해 그 정도가 결정될 수 있다. 이러한 피부 노화는 주로, 노화로 인해 생기는 주름(wrinkling), 늘어짐(sagging), 피부 이완(laxity) 등과 밀접한 연관이 있다. 예를 들어, 자연스러운 노화에 의해 생기는 주름의 경우, 잔주름이 많으며 피부가 부드럽고 창백한 것에 반해, 자외선 A와 B에 의한 광노화(photoaging)로 인한 피부는 거칠고 깊은 주름이 생성되고 동시에 색소 침착과 모세관 확장증이 관찰되는 특징이 있다.

도 1은 태양 노출 여부에 따른 피부 노화를 설명하기 위한 예시적인 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 태양에 노출된 피부(A, B)와 노출되지 않은 피부(C, D)의 변화를 관찰하면, 태양에 노출된 얼굴 피부의 경우 두꺼워진 표피로 인해(탄력섬유증, elastosis) 생성되는 전형적인 쳐지고 깊은 주름과 거친 피부를 관찰 할 수 있다(A). 또한, 진피 조직 내 탄력 섬유의 분해로 인해 피부가 얇아진 것이 관찰된다(B). 이에 비해, 45세 여성(C)과 70세 여성(D)의 태양에 노출되지 않은 피부의 경우 어느 정도 저하된 탄력성과 함께, 얇고 잔주름이 많으며 부드럽고 건조하지만, 반점 등과 같은 결점이 없으며 누르스름하며 창백한 피부를 가지는 것을 확인할 수 있다.

내인성 피부 노화(intrinsic skin aging)는 주로 유전적으로 결정되고, 임상적으로 피부의 취약성(fragility)과 탄력성(elasticity) 저하가 수반되며, 피부가 창백해지는 특징이 있다. 내인성 노화의 경우, 조직학적으로 표피의 점진적인 위축으로 대변되며, 대개 30~80세 사이에 표피 두께가 10~50% 정도 얇아지는 현상이 나타날 수 있다.

내인성 노화에 따른 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 변화는 다음과 같다. 먼저, 교원 섬유(collagenous fiber)의 경우, 진피의 콜라겐 섬유 위축(특히, 그물진피(reticular dermis))이 관찰되며, 가교 결합이 증가하여 탄력과 장력이 감소할 수 있다. 탄력 섬유(elastic fibre)의 경우, elastin, fibrillin-rich microfibrils, microfibril associated glycoproteins(MAGPs) 등 여러 구성요소로 이루어져 있는데, 노화가 진행되면서 표피 진피 접합부위(dermal-epidermal junction)에서 oxytalan fibre를 형성하는 fibrillin-rich microfibrils 위축(atrophy)이 두드러지게 나타날 수 있다. 한편, 진피의 세포외 기질은 섬유상 단백질로만 이루어져 있는 것이 아니라 다양한 탄수화물이 단백질과 결합되어 있거나 독립되어 있는 형태로 존재하는데, 이러한 ECM 구성요소는 주로 글리코사미노글리칸으로 불린다. 글리코사미노글리칸은 헥소사민과 우론산 또는 갈락토오스의 이당 단위를 기본 구조로 하는 다당류의 총칭으로, 이들 친수성인 당단백질과 프로테오글리칸(proteoglycan)들은 풍부하게 존재하는 히알루론산 중합체와 결합하여 피부 보습을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 그러나, 피부 노화가 일어나면 글리코사미노글리칸은 감소하게 되고 이로 인해 피부 건조가 일어날 수 있다.

이러한 피부노화의 과정은 1) 피부 유래 세포들(각질형성세포 (keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast), 멜라닌세포(melanocyte))의 증식 능력 약화, 2) 진피의 기질(matrix) 합성 능력 감소, 3) 콜라겐 성분이 포함된 기질 분해를 위한 콜라겐 분해 효소관련 단백들의 발현양 증가 등을 수반하며, 이들 현상이 서로 복합적으로 나타나 노화가 진행될 수 있다.

피부 노화는 피부의 주된 구성요소 중 하나인 콜라겐 양의 변화가 주된 원인 중 하나라고 알려져 있지만 아직까지 이러한 콜라겐 파괴나 세포 증식 및 재생 능력 감소에 대한 정확한 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않다. 또한, 이러한 콜라겐 파괴 속도 증가를 보완하기 위한 콜라겐 합성 촉진 및 콜라겐 물질 전달 물질 개발에 관한 연구가 학계 및 화장품 산업계에서 활발히 진행 중이지만 아직까지 뚜렷한 성과를 나타냈다는 보고는 없다.

따라서, 현 시점에서 피부 노화 속도를 줄일 수 있는 피부 세포 증식 조절 소재 발굴, 콜라겐 분해 효소 활성 억제 소재 발굴 및 콜라겐 생성 촉진 소재 발굴이 피부 미용을 위한 기능성 화장품 개발에 있어 매우 중요한바, 본 발명자들은 천연생약으로 구성된 추출물 소재가, ① 피부 세포들의 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고 각질형성 세포에서 발현되는 콜라겐 분해 효소의 활성 및 발현 억제 유무를 확인하며 ③ 콜라겐을 생성하는 섬유아세포의 콜라겐 합성 능력 향상에 기여하지 알아보는 시험을 진행하였다. 이러한 시험 예들의 결과는 이하에서 보다 상세히 설명하도록 한다.

한편, 외인성 피부 노화(extrinsic skin aging)는 주로 자외선 노출에 의해 영향을 받으며, 보통 80% 이상의 얼굴 피부 노화가 햇빛 노출에 의해 영향을 받는다고 알려져 있다. 임상적으로 자외선에 손상을 받은 피부는 탄력성이 저하되고, 피부가 거칠어지고 건조하며, 비정상적인 색소 침착과 깊은 주름이 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 내인성 노화에서는 표피가 얇아지는 것에 반해, 외인성 노화에서는 표피 두께의 증가와 감소(과형성, hyperplasia) 및 심각한 위축(atrophy)이 같이 일어나며, 표피가 극성 (polarity)을 잃어버리는 것이 관찰될 수 있다. 또한, 앞서 내인성 요인에서 기술하였던 세포외 기질의 분포나 기능이 상당부분 변화되는 것을 알 수 있다. 구체적으로, 교원 섬유(collagenous fiber)의 경우, 내인성 노화에서는 그물 진피의 콜라겐 감소가 관찰되는 것에 반해 외인성에서는 원섬유아교질(fibrillar collagen)과 표피 진피 접합부위의 collagen VII가 특이적으로 감소할 수 있다. 탄력 섬유(elastic fibre)의 경우, 광노화에 의해 비정상적인 탄력섬유의 축적이 진피전체에서 일어날 수 있고(일광 탄력섬유증, solar elastosis), 그로 인해 체계적이지 못한 탄력 섬유의 분포를 관찰 할 수 있다. 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG)의 경우, 비정상적으로 형성된 글리코스아미노글리칸이 피부에 축적될 수 있다.

외인성 노화의 작용 기전은 TRPV1에 의한 MMP의 발현 및 활성 조절 메커니즘을 통해 확인될 수 있다. 콜라겐은 전체 피부 건조 중량의 80%를 차지하는 세포외 기질을 구성하는 중요 물질로서, 진피에 강한 장력을 부여하는데, 노화로 인한 피부 콜라겐 함량 감소는 피부 주름을 유발하며 이는 외인성 및 내인성 노화 모두에서 나타나는 현상이다. 콜라겐 파괴는 각질 형성세포 및 섬유아세포에서 형성되는 matrix metalloproteinase(MMP)라는 콜라겐 분해효소와 부분적으로 연관이 있다. MMP는 matrix degrading enzyme 중 하나로서, 염증을 포함한 다양한 파괴 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 몇몇 종류의 MMP가 외인성 및 내인성 노화로 인한 진피의 콜라겐 파괴와 연관되어 있는데, 이들은 평상시에 세포에서 낮은 수준으로 발현되어 있다가 자외선이나 적외선, 성장 조절인자, 시토카인 등 다양한 외부자극에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.

도 2는 내인성 피부 노화 및 외인성 피부 노화의 세포외 기질(ECM)의 리모델링을 도시한 도면이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 진피의 콜라겐, 탄력섬유, 글리코사미노글리칸(붉은색으로 표시됨)의 리모델링이 내인성 및 외인성 노화가 진행된 피부에서 관찰될 수 있는데, 노화 진행 양상이 조직학적으로 서로 다른 것을 관찰할 수 있다. 도 2에서 Young은 23세 사람의 전완 안쪽 피부를, Old는 75세 사람의 둔부 피부(photoprotected), 전완부(photoexposed)에서 채취된 것을 나타낸다.

이와 같이, 자외선 노출은 DNA결합 단백인 AP1(activator protein-1)을 활성화시켜 MMP-1, 3, 9, 12 등의 발현율을 증가시키는 것으로 알려져 있다.- 특히, MMP-1에 의해 콜라겐 분해가 시작되면 분해되는 콜라겐은 MMP-3와 MMP-9에 의해 더 분해가 이루어질 수 있다.

이러한 MMP의 활성 및 발현 증가는 칼슘에 의해 조절되는데, 세포 밖 칼슘 농도의 증가는 인간 각질형성세포의 MMP-9의 유전자 발현을 증가시키고. 반면에 세포 내 칼슘 유입을 저해하면 MMP-1의 mRNA 발현 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구들에서 밝혀진 바에 따르면 이러한 세포 내 칼슘 유입은 TRPV1이라는 비선택성 양이온 통로에 의해 일어난다.

도 3은 자외선 노출에 의한 MMP1 발현량 증가에 미치는 TRPV1의 효과를 도시한 도면이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 자외선 조사가 PKC 의존성 경로를 통해 TRPV1을 활성화 시키면 세포 내 칼슘 유입이 일어나는데, 이러한 세포 내 칼슘 유입은 MMP1을 활성화시키고 콜라겐을 분해하게 만든다. 자외선 조사는 또한 TRPV1 발현양을 직접적으로 증가시킨다. 이처럼, 자외선 노출에 의한 MMP-1의 발현양 증가는 TRPV1의 PKC 의존적 활성화와 이로 인해 생성된 세포 내 칼슘 유입으로 인해 생성된다는 것이 최근에 밝혀졌는데, 즉, 자외선에 의해 활성된 MMP-1 발현은 TRPV1에 의한 세포 내 칼슘 유입에 의해 일어난다는 것이다.

이러한 자외선은 TRPV1의 활성화뿐만 아니라 발현양에도 영향을 끼치는데, 인간 피부 조직에 자외선을 조사한 후 TRPV1의 발현양 변화를 살펴보면, 시간이 지남에 따라 TRPV1의 발현양이 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 TRPV1 발현양 증가는 외인적 노화에서만 일어나는 것이 아니라 내인적 노화, 즉, 자연스러운 노화 현상에 있어서도 TRPV1의 발현양이 증가한다.

따라서, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물을 이용할 경우, 자외선 조사 시에 일어나는 반응 중 상위 신호전달 기전에 속해있는 TRPV1의 활성화가 차단되는지 시험을 통해 확인하였으며, 또한 그 하위 신호인 콜라겐의 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제시킬 수 있는지 확인하였다. 이러한 시험 예들은 뒤에서 보다 상세히 설명하도록 한다.

본 발명자들은 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물로서, 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물을 발명하였다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 구성을 도시한 도면이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물은 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하수오의 배합비는 5 중량% 내지 8중량%이고, 박하의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이며, 마치현의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이고, 감초의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이며, 비즈왁스의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이고, 카렌들라의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이며, 백봉령의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이고, 백강잠의 배합비는 24 중량% 내지 27 중량%이며, 쇠뜨기의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%일 수 있다. 또한, 바람직하게는, 하수오의 배합비는 6 중량% 내지 7중량%이고, 박하의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이며, 마치현의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이고, 감초의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이며, 비즈왁스의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이고, 카렌들라의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이며, 백봉령의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이고, 백강잠의 배합비는 25 중량% 내지 26 중량%이며, 쇠뜨기의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%일 수 있다.

하수오(Pleuropterus multiflorus TURCZ.)는, 마디풀과에 속하는 덩굴성 다년생 초본식물로서, 주로 덩이뿌리를 약재로 사용하는데, 약성은 따뜻하고 감고(甘苦)하며 조삽(燥澁: 파슬파슬)한 것으로 알려져 있다. 또한, 하수오는 강정·양혈·보간·거풍·소종의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서는 신체허약·요통·동맥경화·고혈압·만성간염·결핵성 임파선염·장염·변비 등의 증상에 치료제로 쓰이기도 한다.

박하(Mentha arvensis var. piperascens)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 다년생 숙근초로서, 줄기 단면이 사각형이고 표면에 털이 있는데, 잎 표면에는 기름샘이 있다. 박하의 기름인 박하유의 주성분은 멘톨로서, 도포제·진통제·흥분제·구충제 등에 약용하거나, 치약·잼·사탕·화장품·담배 등에 청량제나 향료로 사용되기도 한다.

마치현(Portulaca oleracea L.)은 쇠비름과의 쇠비름의 전초로서, 잎 모양이 말의 이빨과 비슷하게 생겼는데, 해열, 해독, 지혈 효과가 있어 세균성이질, 종기, 치질, 경부림프절염, 습진, 대하, 자궁출혈, 소변불리 등에 사용하며, 약리작용으로 항균작용, 자궁평활근 수축력 증강으로 인한 장관 연동작용, 이뇨작용 등이 알려져 있다.

감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 독특한 냄새가 있으며 단맛을 나타내는데, 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있으며, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염 작용이 있고 소화성궤양을 억제하는 것으로 알려져 있다.

비즈왁스(beeswax, 밀랍)는 벌집에서 가열압착, 용제추출 등에 의해 채취하는 동물성 고체랍으로서, 멜리실알코올의 팔미트산 에스터와 세로트산을 주성분으로 포함하고, 그 밖에 여러 지방산, 알코올, 탄화수소 등을 함유한다.

카렌들라(Calendula officinalis, 금잔화)는 쌍떡잎식물의 국화과 1년초 또는 다년초로서, 꽃을 이용한 습포제는 화상, 탕상(湯傷), 불똥이 튀어 번진 곳에 뛰어난 응급 처치가 되며, 냉침출액은 결막염의 세안수로 유효한 것으로 알려져 있다. 또한, 항진균성도 있어 칸디다증 치료의 보조약으로 사용하는데, 내복하면 위염, 위궤양, 십이장궤양에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

백봉령(Poria)은 베어낸 지 여러 해 지난 소나무 뿌리에 기생하여 자라나는 균핵의 일종으로, 맛은 달고 심심하며 성질이 평(平)하여 보(補)하는 작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 강장제로 사용되거나 병 후 회복에도 이용되기도 하며, 이뇨작용과 혈당량을 낮추는 작용, 진정작용 등의 약효가 있는 것으로 알려져 있다.

백강잠(Bombycis corpus)은 누에나방의 새끼가 흰가루병에 걸려 죽은 것을 말린 것으로, 풍을 가라앉히거나 경기를 없애는 작용을 하는데, 간질병이 발작하는 증상에는 전갈과 천마·담남성 등을 같이 쓰는 것으로 알려져 있다. 중풍으로 입이 돌아갔거나 안면근육이 수축되었을 때에는 전갈·백부자 등을 함께 쓰며, 풍열과 간의 열로 두통이 날 때, 눈이 붉어지고 목이 붓거나 아플 때도 사용되는 것으로 알려져 있다.

쇠뜨기(Equisetum arvense)는 관다발식물 속새과의 다년생초로서, 소가 잘 먹으며, 생식줄기는 식용되거나, 영양줄기는 이뇨제로 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물은, 1) 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 준비하여, 2) 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 건조하여 분말화하며, 3) 분말화된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 물로 온시 추출하여 제조될 수 있으며, 4) 추출된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 냉동 건조하여 수분 함량이 약 10 중량% 미만이 되도록 완전히 더 건조시켜 제조될 수 있다.

이하의 설명 및 도면들에서 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물을 SA로 나타내었다.

시험 예 항산화 활성 평가 1 (DDPH 라디칼 소거 효과)

DPPH 라디칼 소거 효과(DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging activity)를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Blosi의 방법에 따라 시험을 실시하였다. 즉, 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml 및 4.0 mg/ml 농도의 각 시료 0.1 ml 에 DPPH radical 1.5×10^-5 M ethanol 용액 4 ml을 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하고 그 효과를 하기의 [식 1]에 의해 %로 산출하였다.

[식 1]

Radical scavenging activity(%) = {(ODcontrol - ODsample) / ODcontrol}×100

DPPH는 비교적 안정한 라디칼로서, 불안정한 라디칼인 hydroxyl radical (·OH)이나 superoxide anion (·O₂ ^-)과는 달리 반응 시 취급이 용이하여 많이 이용되고 있다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 DPPH 라디칼 소거 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 도 6에 도시된 바와 같이, 시험 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)에서 78.5% 정도의 우수한 라디칼 소거 활성을 확인하였으며, 양성대조군인 ascorbic acid는 약 95%의 소거활성을 나타내었다.

시험 예 항산화 활성 평가 2 (지질과산화 억제 효과)

본 발명자들은 항산화활성의 또 다른 지표로서 지질과산화 억제효과를 측정하였다. 지질과산화 억제활성(Anti-lipid peroxidation activity)은 Ohkawa 방법에 따라 과산화지질의 함량을 측정하여 산출하였다. 즉, 먼저, 0.1 M potasium phosphate buffer (pH 7.4) 0.65 ml과 sample 0.05 ml, homogenate 0.1 ml을 넣고, 37 ℃에서 1시간 동안 incubation한 다음, 1시간 후 반응액에 8.1% SDS 0.2 ml, acetate buffer (pH 3.5) 1.5 ml, 0.8% TBA 1.5 ml을 첨가하고, 95 ℃에서 1시간 반응시킨 다음 실온으로 냉각하였다. 이 반응액에 n-butanol : pyridine 15 : 1 (v/v) 5 ml을 첨가하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상징액을 사용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 화합물은 DMSO에 녹여 사용하였고 양성대조물질(positive control)은 α-tocopherol을 사용하였으며, 시료 대신 DMSO를 가하여 반응시킨 용액을 대조군로 하여 하기의 [식 2]에 따라 저해율(%)을 계산하였다.

[식 2]

Inhibition (%) = {(O.Dcontrol- O.Dsample) / O.Dcontrol} × 100

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 지질과산화 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 세포막을 구성하는 성분인 인지질의 불포화지방산은 활성산소에 의해 지질과산화반응을 일으키며 이때 생성된 과산화지질은 뇌신경세포를 비롯한 세포막 손상의 주요 원인이 되어 각종 조직에 손상을 가져오는 것으로 보고, 시료의 과산화지질함량을 in vitro에서 측정한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)이 23.2%의 과산화지질 생성 억제 활성을 보이는 것을 확인하였다.

시험 예 항산화 활성 평가 3 (과산화물음이온 소거 활성)

본 발명자들은 항산화 활성의 또 다른 지표로서 과산화물음이온(superoxide anion) 소거 효과를 측정하기 위해 NBT 환원법을 이용하여 측정하였다. Superoxide anion은 수많은 효소계에 의해 singlet oxygen, hydroxyl radical과 같은 더 위험한 활성 산소종을 생성시켜 지질의 과산화를 초래하는데, Superoxide anion은 생물학적 거대분자와 반응할 수 있는 유리기를 활성화시킴으로써 조직손상을 야기할 수 있고, 지질과산화를 개시하기도 한다. 이와 같이, 과산화물음이온 라디칼은 처음에는 정상적으로 생성되지만, 그들의 효과는 다른 종류의 유리기와 산화제를 생성함으로써 확대된다.

Superoxide anion 소거 활성은 Gotoh와 Niki의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 먼저 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 4.0 mg/ml 농도의 시료 30 ㎕에 30 mM EDTA (pH 7.4) 100 ㎕, 30 mM hypoxanthine 10 ㎕, 1.42 mM NBT 200 ㎕를 가한 다음, 실온에서 3분 반응시킨 후에, 0.5 U/ml xanthine oxidase l00 ㎕를 첨가하고 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)로 총 용량을 3 ml로 맞추었다. 또한, 반응용액을 실온에서 20분간 반응시킨 후, 560 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조물질(positive control)은 ascorbic acid를 사용하였고, 시료 대신 DMSO를 가하여 반응시킨 용액을 대조군으로 하여 하기의 [식 3]에 따라 저해율 (%)을 계산하였다.

[식 3]

Inhibition ratio (%) = {1 - (O.Dsample / O.Dcontrol)} × 100

도 8는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 과산화물음이온 소거 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 시험 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)이 22.3%의 superoxide anion 소거 활성을 보이는 것으로 확인하였다.

시험 예 피부 노화 억제 활성 평가

본 발명자들은 피부 노화 억제 활성(Elastase inhibitory activity)을 평가하였다. 피부 노화 억제 활성 평가에 사용된 효소반응에서는, Tris-Cl (0.12M pH8.0)에 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (1 mM)을 첨가한 기질용액 1300 ul, 10 mg의 sample을 DMSO 1 ml에 녹인 용액 7.5 ul를 사용하였다. Kojic acid는 200 ug/ml 용액 7.5 ul를 사용하였다. 그리고 Tris-Cl (0.12 M, pH 8.0) 용액 92.5 ul를 첨가 후 10분간 preincubation시킨 뒤, enzyme(Elastase 0.0375U/ml) 용액 100 ul를 가한 후 10분 동안 incubation하고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 엘라스타아제 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 엘라스타아제(Elastase)는 엘라스틴(elastine)을 분해하는 효소로서 과하게 분비되었을 경우 피부의 엘라스틴(elastine)이 분해되어 피부의 탄력을 잃게 되는데, 활성 측정 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)이 4.78%의 엘라스타아제(elastase) 억제 활성을 보이는 것으로 확인하였다.

시험 예 피부 미백 효과 평가

본 발명자들은 피부 미백 효과(Tyrosinase inhibitory activity)를 평가하였다. 피부 미백 효과 평가에 사용된 효소반응에서는 sodium phosphate buffer (1/15 M pH 6.8) 1.8 ml, 기질 1.5 mM L-DOPA 1.0 ml, 10 mg의 sample을 DMSO 1 ml에 녹인 용액 0.1 ml을 사용하였다. Kojic acid(양성대조약물)는 200 ㎍/ml용액 0.1 ml을 사용하였다. 또한, Enzyme(Mushroom tyrosinase 1000U/ml) 용액 0.1 ml을 가한 후, 10분 동안 incubation 시킨 뒤 ice bath에서 효소활성을 중지시킨 다음, 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 티로시나아제 억제 활성의 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 티로시나아제(Tyrosinase)는 L-DOPA로부터 멜라닌(melanine)을 형성하는데 작용하는 효소(oxidase)로서, 기질인 L-DOPA로부터 melanin의 생성을 억제하는 효과를 측정하였는데, 활성 측정 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)이 26.83%의 티로시나아제(tyrosinase) 억제 활성을 보이는 것을 확인하였다.

시험 예 세포 독성 검정

본 발명자들은 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 피부염증 억제 효능(Antiinflammatory effect) 및 세포 독성을 평가하였다. 이를 위해, 먼저 세포 배양에 있어서는 쥐(mouse)의 대식세포인 RAW 264.7 cell (ATCC; Manassas, VA, USA)을 10% heat-inactivated FBS, 100 units/ml penicillin, 100 ng/ml streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여, 37℃, 5 % CO2 조건하에 배양하여, 세포 독성을 검정(MTT assay)하였다. 이 방법은 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTT가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 방법이다. 이를 위해, RAW 264.7 cell 5×105 cells/ml의 세포를 96-multi well culture plate에 100 ㎕씩 분주하여 24시간 배양한 다음, 다양한 농도의 시료를 처리하여 24 시간 배양하였다. 24시간 뒤 각 well에 5 mg/ml 농도의 MTT용액을 20 ㎕씩 넣고 4 시간 배양한 후, 배양액을 제거하고, 생성된 formazan을 DMSO 100 ㎕에 녹인 후 900 ㎕의 물과 섞어 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 450 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 세포만 배양한 무처리군(control)을 100% 생존률로 하여, 시료 처리군의 상대적인 세포 생존도(cell viability, %)를 계산하였다.

도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 세포 독성 시험 예의 결과를 도시한 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은, 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 cell에 대한 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)의 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 이때, 조성물(SA)의 시료들을 농도별(7.5, 15, 30, 60, 120, 240 ㎍/ml)로 24 시간 처리하였을 때, 30 ㎍/ml 이하에서는 독성이 나타나지 않았으며, 60 ㎍/ml 이상에서는 세포독성이 관찰되었다. 따라서 시료 농도 30 ㎍/ml 이하에서 세포 독성에 안전함을 확인하였다.

시험 예 피부 이온통로 제어 효능 평가

도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 피부 이온 통로 제어 효능 평가를 위한 설비 구성을 도시한 도면이다. 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은, 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 피부 이온 통로 제어 효능 평가를 위해, 패치 클램프(patch clamp)를 이용하여 피부 이온통로 제어 효능을 평가하였다. 패치 클램프는, 유리 미세 전극을 세포에 밀착시킨 뒤, 세포 내외에 흐르는 전류를 측정할 수 있게 해주는 장치이다. TRPV1과 Orai1 이온통로 단백질이 과발현되어 있는 HEK293 세포에 patch clamp를 이용하여 conventional whole cell patch clamp를 수행하였는데, 유리 전극은 whole cell patch clamp시 저항 2 ~ 4 MW, inside out과 cell attached patch clamp시 저항 > 1.2 MW의 것을 사용하였다. Patch clamp 증폭기(Axopatch 1-D, Axon instruments, USA)를 통해서 나온 전체적인 신호는 Axoscope 9.0을 통해(Axon instruments, USA) 디지털화시켜 저장시켰다. 고정 전압과 자극 전압을 가하고 이때의 전류 반응을 기록하고 저장하기 위해서, pClamp software (v9.2)와 동작 클럭이 3.2 GHz인 개인 컴퓨터에 장착된 아날로그-디지털 변환기(Digidata-1322A, Axon instruments, USA)를 이용하였다. 막 전압고정 실험에 얻어진 결과는 clampfit v9.2, origin (Microcal software, USA) 등을 이용하여 분석, 처리하였다.

도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 TRPV1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료는 피부노화를 유발하는 TRPV1 이온통로를 효과적으로 억제하지 못하는 것을 확인하였다.

도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 Orai1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 14에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료는 피부 미백과 관련된 Orai1 이온통로를 어느 정도 억제하는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료는 피부를 검게 하는 원인이 되는 tyrosinase 억제 활성이 약 28% 정도로 나타나, 효소 활성과 Orai1 이온통로를 함께 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 용량별 Orai1 이온 통로 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 15에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료의 효과를 용량별로 관찰한 결과, 용량 의존적으로 remaining current를 감소시켜 효과를 확인할 수 있었다. 특히, 30 ug/ml에서는 약 20 %, 100 ug/ml에서는 약 70 %를 억제하는 것을 확인하였다.

시험 예 일산화질소 측정

본 발명자들은 염증 매개 물질인 NO 생성량을 측정하기 위해, MTT assay와 같은 방법으로 배양한 세포에서 생성되는 활성질소종인 nitric oxide (NO)의 양을, 배양액 중 존재하는 NO2- 형태로 Griess시약 반응 방법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 24 시간 배양 후 다양한 농도의 시료를 처리하며, 시료 처리 30분 후 LPS를 최종 농도 200 ng/ml이 되도록 처리하였다. 이후 24 시간 배양하여 RAW 264.7 cell의 염증을 유발시켰다. 이때 생성된 NO의 양을 확인하기 위해 배양액을 수거한 다음, 배양액 100 ㎕와 Griess 시약 (0.1% N-NED, 1% sulfanilamide 의 1% H3PO4용액) 100 ㎕를 넣어 잘 섞은 후 15분간 암반응 시킨 후 800 ㎕의 물과 섞어 UV-VIS spectophotometer를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내의 농도는 LPS를 처리하지 않은 정상군의 NO의 생성량에 비해 LPS만을 처리한 군의 생성된 NO의 양을 100 %로 하여, 시료처리군의 상대적인 생성량(% of control)으로 비교하였다.

도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 NO 생성 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 16에 도시된 바와 같이, LPS처리로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에서 시료가 세포독성을 나타나지 않는 농도를 처리한 후 염증매개물질인 NO의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)은 5.21 μM 농도로 염증 매개 물질인 NO의 생성을 억제함을 확인하였다.

시험 예 PGE2 측정

본 발명자들은, 염증 매개 물질인 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성량을 측정하기 위해, RAW 264.7 cell을 각 시료(100 ㎍/mL)로 1시간 동안 전처리한 후, 세포를 LPS로 12시간 처리하였다. Culture media에서의 PGE2 level을 PGE2 detection kit를 사용하여 kit의 방법대로 분석하였다.

도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 PGE2 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 17에 도시된 바와 같이, LPS처리로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에서 시료가 세포 독성을 나타나지 않는 농도로 처리한 후, 염증 매개 물질인 PGE2의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)은 염증 매개 물질인 PGE2의 생성을 억제함을 확인하였다.

시험 예 Pro-inflammatory cytokine 측정

본 발명자들은, 염증 매개 물질인 IL-1β, TNF-α 및 IL-6 각각의 생성량을 측정하였다. 이를 위해, 각 시료가 LPS-stimulated RAW 264.7 cell에 의해 생성된 cytokine(IL-1β, IL-6, and TNF-α)을 억제하는 효과를 ELISA assay kit로 분석하였다. 각 시료(100 ㎍/mL)와 RAW 264.7 cell을 1 시간 동안 pre-incubation한 다음, 이 세포를 12 시간 더 LPS로 처리하였다. 상징액을 제거하고 IL-1β, TNF-α, IL-6 level을 ELISA kit로 분석하였으며, cytokine의 농도는 표준곡선을 이용하여 측정하였다.

도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 IL-1β 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 18에 도시된 바와 같이, LPS 처리로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에서 시료가 세포독성을 나타나지 않는 농도로 처리한 후 염증 매개 물질인 IL-1β의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)은 염증 매개 물질인 IL-1β의 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 TNF-α 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 19에 도시된 바와 같이, LPS처리로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에서 시료가 세포독성을 나타나지 않는 농도로 처리한 후 염증 매개 물질인 TNF-α의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)은 염증 매개 물질인 TNF-α의 생성을 약간 억제함을 확인하였다.

도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 IL-6 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 20에 도시된 바와 같이, LPS처리로 염증이 유도된 RAW 264.7 macrophage에서 시료가 세포독성을 나타나지 않는 농도로 처리한 후, 염증 매개 물질인 IL-6의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)은, 염증 매개 물질인 IL-6의 생성을 억제하지는 않음을 확인하였다.

시험 예 RNA 분리 및 RT-PCR(유전자 발현 억제효과 확인)

본 발명자들은, 활성화된 대식세포로부터 분비되는 염증 매개물질인 NO 합성효소인 iNOS의 유전자와 염증 매개 물질인 PGE2의 합성효소인, COX-2의 유전자의 발현 억제에 대한 시료의 효과를 조사하였다. 구체적으로, RAW 264.7 세포에서 발현되는 NO 합성효소인 iNOS와 PGE2 합성효소인 COX-2에 대한 약물의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 먼저 RAW 264.7 세포 (1×106 cells/ml)를 6-well plate에 하룻밤 배양하고 다양한 농도의 약물을 처리한 다음 1시간 배양하고 여기에 LPS(200 ng/ml)를 처리한 후 24 시간 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후, 1 ml의 TRIzol를 넣어 10분 동안 세포 구조의 용해를 유도하고 여기에 0.2 ml chloroform을 첨가하여 강하게 혼합하여 실온에서 10분간 정치한 후, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하였다. 상징액에 0.5 ml의 isopropanol을 넣어 10분간 실온에서 반응시킨 다음 12,000 rpm에서 8분 동안 원심분리하고 얻은 pellet을 DEPC가 처리된 75 %의 에탄올로 1회 세척한 후 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리하는 과정을 반복하여 total RNA를 회수하였다. 분리한 RNA는 UV spectrophotometer를 이용하여 260 nm와 280 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며 PCR로 특정 유전자를 증폭시키기 위해 One-Step RT-PCR PreMix kit을 사용하였으며 reverse transcription reaction을 위해 45 ℃에서 30분, cDNA 증폭을 위해 94 ℃에서 5분간 1회, denaturation을 위해 94 ℃에서 30초, annealing을 위해 56 ℃에서 30초 및 extension을 위해 70 ℃에서 60초 조건에서 30 cycle을 수행하고 final extension을 위해 72 ℃에서 5분간 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조군 (internal housekeeping gene)으로 GAPDHs를 사용하였으며 PCR 결과의 최종 산물은 1 % agarose gel에서 100 volt로 전기영동한 후, UV 상에서 시각화 하였다.

도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 iNOS, COX-2 유전자 발현 억제 효과를 도시한 도면이다. 도 21에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료를 농도별(100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 12.5 ㎍/ml)로 1시간 동안 전처리하고, LPS를 24시간 동안 처리하여 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성량과 iNOS와 COX-2 유전자의 발현억제를 확인하기 위해 Griess assay와 RT-PCR을 수행한 결과, LPS를 처리하지 않은 정상군에서는 극소량의 mRNA 만이 발현 되었으나, LPS를 처리하여 염증을 유발시킨 대조군에서는 mRNA의 발현량이 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA) 시료를 처리한 경우에는 농도 의존적으로 mRNA 발현량이 모두 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

임상 시험 예

도 22 내지 도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물을 피부 트러블에 임상 적용한 결과를 도시한 도면이다. 도 22 내지 도 25에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물(SA)을 여드름, 여드름 상처, 화장품 트러블 등의 피부 트러블에 적용한 결과, 항산화 효과에 의한 피부 세포 보호와 피부 미백, 피부 염증 치료 또는 개선에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물로서,
하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기의 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 하수오의 배합비는 5 중량% 내지 8중량%이고, 박하의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이며, 마치현의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%이고, 감초의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이며, 비즈왁스의 배합비는 7 중량% 내지 10 중량%이고, 카렌들라의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이며, 백봉령의 배합비는 5 중량% 내지 8 중량%이고, 백강잠의 배합비는 24 중량% 내지 27 중량%이며, 쇠뜨기의 배합비는 11 중량% 내지 14 중량%인 것을 특징으로 하는, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 하수오의 배합비는 6 중량% 내지 7중량%이고, 상기 박하의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이며, 상기 마치현의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%이고, 상기 감초의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이며, 상기 비즈왁스의 배합비는 8 중량% 내지 9 중량%이고, 상기 카렌들라의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이며, 상기 백봉령의 배합비는 6 중량% 내지 7 중량%이고, 상기 백강잠의 배합비는 25 중량% 내지 26 중량%이며, 상기 쇠뜨기의 배합비는 12 중량% 내지 13 중량%인 것을 특징으로 하는, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물.
삭제
삭제
삭제
피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 제조방법으로서,
(1) 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 준비하는 단계;
(2) 상기 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 건조하여 분말화하는 단계; 및
(3) 상기 분말화된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 온시 추출하는 단계를 포함하되,
(4) 상기 추출된 하수오, 박하, 마치현, 감초, 비즈왁스, 카렌들라, 백봉령, 백강잠 및 쇠뜨기를 수분 함량이 10 중량% 미만이 되도록 냉동 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 천연 생약초 추출물을 포함하는 피부 노화, 여드름 개선 및 피부 미백용 조성물의 제조방법.
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