KR101688090B1 - 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물을 함유하는 항당뇨 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 복합물은 천연 소재로만 조성되어 부작용이 없고, 세포 내 당 이용대사 증가를 통해 우수한 항당뇨 효과를 나타낸다.

Description

돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물을 함유하는 항당뇨 조성물 {Composition for anti-diabetes with the extract of Helianthus tuberosus, rice bran, Schizandra chinensis, Momordica charantin}
본 발명은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물을 함유하는 항당뇨 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물을 함유하여 세포 내 당 이용대사 증가를 통해 혈당 감소 효과를 발휘하는 항당뇨 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 혈중 포도당 농도의 상승, 췌장의 손상에서 유래되는 인슐린 분비능 저하 또는 내성에 의한 인슐린 작용의 감소, 포도당, 지방과 단백질 대사의 이상과 이로 인한 급성과 만성 합병증의 발생으로 특징 지워지는 다양한 원인과 병을 지닌 일련의 질환 군을 말한다.
한편, 당뇨병은 발병 원인이 다양하지만 어떤 형태의 당뇨이던지 증상의 개선이나 치유를 위한 기본원리는 식사 후 체내로 흡수된 당을 각 조직의 세포가 이용하는 속도를 증가시켜 혈중에 당이 과도하게 머무는 시간을 감소시키는 것이며, 이는 약물이나 천연소재를 막론하고 공통으로 적용된다. 이를 위해서는 세포 내 당을 분해하여 에너지 대사의 기질로 사용하는데 관여하는 효소인 글루코키나아제 (glucokinase) 및 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)의 활성 증가 정도와 에너지를 생성하고 남은 잉여의 당을 지방으로 전환하는데 관여하는 효소인 아세틸-코에이 카르복시라아제(Acetyl-CoA carboxylase)의 활성 증가 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성 억제가 필요하다.
한편, 현재까지 의과학적인 치료목표는 혈당 수준의 정상적 유지를 위해 보조요법인 식사요법, 운동요법과 함께 다양한 원리의 약물 요법들이 시도되고 있지만 오히려 환자는 급증하고 있는 상황이며 유병률 또한 장기화되고 있다. 결국 발생된 부작용에 대한 완화 차원의 치료가 병행되면서 국가적, 개인적인 경제손실이 막대하며, 아직 당뇨에 대한 의과학적 완치제가 없는 실정이다.
이에 따라, 천연 소재 중에서 항당뇨 관련 기전상의 과학적 근거를 가지고 부작용 없이 다양한 당뇨 증상의 일부 또는 전부를 개선하거나 치유할 수 있는 물질을 발굴 및 검증하고 건강 기능성 소재로 활용할 수 있는 기술을 개발하는 것이 절실히 필요하다.
대한민국 등록특허 제10-1226881호 (등록일자: 2013.01.21)에는, 기장 추출물을 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물에 대한 내용이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-0678568호 (등록일자: 2007.01.29)에는, 대나무 추출물을 함유하는 당뇨병 치료 또는 예방용 조성물에 대한 내용이 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2014-0032961호 (공개일자: 2014.03.17)에는, 새콩 분말 또는 이의 추출물을 함유하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물에 대한 내용이 기재되어 있다.
본 발명은 돼지감자, 미강, 오미자, 여주를 이용하여 부작용 없이 안전하게 당뇨를 개선할 수 있는 항당뇨 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 복합물은, 우수한 혈당 흡수(Glucose uptake) 증진 효과, 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity) 증진 효과, 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity) 증진 효과를 발휘할 뿐만아니라, HIT-T15 세포 증식 효과, HIT-T15 세포의 인슐린 분비량 증가 효과를 발휘한다.
한편, 당뇨병은 인슐린의 부족으로 혈액 중 포도당(혈당) 농도가 정상인에 비해 높아져 소변으로 포도당이 배출되는 만성질환으로, 본 발명에서는 이를 예방 및 치료하는 항당뇨 조성물을 개발하여 제공하고자, 소재별 (단일소재, 복합물)로 세포 내 당을 분해하여 에너지 대사의 기질로 사용하는데 관여하는 효소인 글루코키나아제(glucokinase) 및 피루브산 탈수소효소(pyruvate dehydrogenase)의 활성 증가 정도를 확인하였다.
하기 실험예에 의하면, 단일 소재 (돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물)보다 복합물이 더욱 우수한 항당뇨 효능을 나타내었고, 다양한 조성의 복합물 중 'MIX 3' (돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물)과 'MIX 5' (돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물)가 모든 실험에서 우수한 증가 활성을 나타내었다. 그 중, 'MIX 3'이 보다 우수한 HIT-T15 세포 증식 효과, HIT-T15 세포의 인슐린 분비량 증가 효과를 발휘함을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물이 항당뇨 효능을 발휘하는 기능성 소재로서 가장 적합함을 확인하였다.
상기 효소들에 대해 더욱 상세히 설명하면 글루코키나아제(glucokinase)는 세포 내 당 이용 대사에 관여하는 첫 단계 효소로, 당이 세포 내에 유입되면 당을 분해하여 세포 내 당 농도가 저하되는데, 세포 내 당 농도가 저하되면 혈액으로부터 당이 유입되어 결국 혈당을 저하된다.
피루브산 탈수소효소(pyruvate dehydrogenase)는 상기 글루코키나아제(glucokinase) 등에 의해 세포 내 당의 분해 과정 중 생성되는 피루베이트(pyruvate)를 아세틸 코에이(acetyl CoA)로 비가역적으로 전환시키는 효소이다. 피루브산 탈수소효소를 거친 당 대사물은 다시 당으로 가역적 생성이 불가능하기 때문에 세포 내 당 농도를 저하시킬 수 있는데, 세포 내 당 농도가 저하되면 혈당이 세포로 유입되어 결국 혈당이 저하된다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 복합물은, 바람직하게 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물이 0.5~1.2 : 0.8~1.5 : 0.5~1.2 : 0.5~1.2의 무게 비율로 조성된 것이 좋다. 상기 조성을 만족할 경우 우수한 혈당 흡수(Glucose uptake) 증진 효과, 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity) 증진 효과, 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity) 증진 효과 뿐만 아니라, 우수한 HIT-T15 세포 증식 증가 효과, HIT-T15 세포의 인슐린 분비 증가 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물은, 본 기술이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 이용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 추출 용매로 물을 이용하여 추출된 것이 좋다. 유기 용매로 추출된 추출물은 독성이 있어 식품의 기능성 소재로서 활용하는데 제한이 있기 때문이다.
한편, 상기 돼지감자(Helianthus tuberosus)는, 일명 뚱딴지라고도 불리는 노란색의 꽃을 피우는 국화과 식물로, 높이 1.5~3 m로 자라며, 땅속줄기의 끝이 굵어져 덩이줄기가 발달하며 잎과 더불어 털이 있다. 이러한 돼지감자는 덩이줄기를 이용하게 되는데, 최근 그 추출물에 다량의 페놀성 화합물이 함유되어 있어 강력한 항산화 효과를 지니고 있는 것으로 규명된 바 있다. 또한, 돼지감자는 독성이 없는 것으로 알려져 있다.
상기 미강(rice bran)은, 벼의 도정과정 중 발생하는 부산물로서 12~16%의 단백질과 20~25%의 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 등의 식이섬유와 16~22%의 지방을 함유하고 있고 그 밖에 비타민, 미네랄 등의 미량 영양소가 풍부하게 함유되어 있으며, 이 외에도 인체에 유효한 폴리페놀(polyphenol) 등의 성분이 풍부하게 함유되어 영양적으로 가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다.
상기 오미자(Schizandra chinensis)는, 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 식물로서, 한방에서는 그 열매를 전신쇠약, 정신 육체적 피로, 기관지염, 기관지천식, 신경쇠약, 저혈압, 심장기능저하, 영양실조궤양과 상처의 치료 및 시력 증진을 위해 사용하여 왔으며, 주로 차, 화채 및 술로 가공되어 음용되어 오고 있다.
상기 여주(Momordica charantin)는, 비터메론(bitter melon)이라고 불리는 쌍떡잎식물에 속하는 박목 박과의 덩굴성 한해살이풀로, 줄기는 가늘고 길이는 1~3 m이며 덩굴손으로 다른 물건을 감아서 올라간다. 열매는 긴 타원형으로 혹 같은 것이 돋아 있는 것이 특징이고, 황적색으로 익으면 불규칙하게 갈라져서 홍색 육질로 싸인 종자가 나오는데, 어린 열매와 홍색 종피(種皮)는 식용으로, 종자는 약용으로 사용한다. 여주는 주로 남아메리카, 인도 및 동남아 등의 열대지방에서 자생 또는 재배되고, 중국 및 서구에서는 요리로 활용될 뿐만 아니라 민간용법으로 다이어트와 면역기능 강화 등에 활용되고 있다.
한편, 본 발명의 당뇨 개선용 식품 조성물은, 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 당뇨 개선용 식품 조성물은, 바람직하게 식품 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형체 및 희석제는 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케니트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 톨리돈, 물, 꿀, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 당뇨 개선용 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜렛 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 천연 과일 쥬스 및 과일 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물은 세포 내 당 이용대사 증가를 통해 우수한 항당뇨 효과를 나타내며, 천연 소재로만 조성되었기 때문에, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 부작용 없이 안전하게 혈당을 감소시킬 수 있다.
도 1은 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 혈당 흡수(glucose uptake)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 2는 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 3은 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 복합물이 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
도 5는 복합물이 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
도 6은 복합물이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
이하 본, 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
한편, 하기 실험예의 모든 분석 수치는 mean±SEM으로 나타내었다. 또한, 실험 자료의 통계처리는 SPSS(statistical package for social science, Version 10.0, Chicago, USA)를 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험 군들의 평균치 간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하였고, P 값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
[ 제조예 1: 소재 추출]
실험 소재인 돼지감자(DJ), 미강(MK), 오미자(OMJ), 여주(YJ), 율무(YM)를 세척 및 건조 후 파쇄하여 분말로 만든 다음 각 건조중량의 10.7배의 증류수를 가하고 60℃에서 24시간 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 소재별로 각각 추출하였다. 24시간 후 거즈 및 원심분리기를 통해 불순물을 제거하였으며, 감압필터 후 동결건조하여 각 소재 추출물을 제조하였다.
[ 제조준비예 1: 세포 배양]
(1) HepG2 세포배양
HepG2 세포(hepatocellular carcinoma)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. HepG2 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 최소 필수 배지(minimum essential medium)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
(2) HIT-T15 세포배양
햄스터에서 유래한 췌장 β-세포인 HIT-T15 세포(cells)는 ATCC(ATCC, Rockville, MD, USA) 에서 구입하여 사용하였다. HIT-T15 세포(cells)는 Ham’F12K medium (Gibco-Invitrogen, carlabad, CA, USA)에 10% 말혈청(horse serum), 2.5% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 세포 배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2, /95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 인산완충식염수(phosphate-buffered saline) (PBS, pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% Trypsin-2.65 mM EDTA로 처리하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
[ 실험예 1: 단일 소재가 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 제조한 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물 각 추출물이 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
혈당 흡수(Glucose uptake)는 HepG2 세포를 이용하여 'glucose uptake colorimetric assay kit'를 이용하여 측정하였다.
세포를 96-웰 플레이트(well plates)에 1×105 cells/㎖로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 24시간 더 배양하고, 배양된 세포는 2% BSA가 포함되어 있는 KRPH(Krebs ringer phosphate HEPES)로 교체하였다. 40분 후, 1 μM의 인슐린과 각 소재를 (1 mg/㎖) 처리하고 20분간 동안 더 배양한 다음 10 mM 2-디옥시글루코스(2-deoxyglucose)를 20분간 처리하였다. 그 후, 세포에 어세이 버퍼(assay buffer) 8 ㎕와 엔자임 믹스 A(enzyme mix A) 2 ㎕를 처리한 후 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 추출 버퍼(extraction buffer)를 이용해 세포 추출물을 회수하였다. 회수된 세포 추출물을 85℃에서 40분간 가열하고 얼음 위에서 냉각시킨 뒤 중성화 버퍼(neutralization buffer)를 첨가하였다. 그 후, 500 rpm에서 10초간 원심분리하고 상층액을 취하였으며, 각각의 웰(well)에 글루타티온환원효소(glutathione reductase) 20 ㎕, DTNB [5-5’(2-nitrobenzoic acid)] 16 ㎕, 리사이클링 믹스(recycling mix) 2 ㎕를 첨가한 후 40분 동안 반응을 시켰다. 그 후, ELISA 마이크로플레이트 리더(ELISA microplate reader) (EL808, BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물 모두 혈당 흡수(glucose uptake) 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 중, 돼지감자 추출물(DJ)이 145%로 가장 높은 증가 효과를 나타내었으며, 그 다음으로 오미자 추출물(OMJ)이 137%, 율무 추출물(YM)이 130%로 높은 증가 효과를 나타내었고, 그 다음으로는 미강, 율무가 높은 혈당 흡수 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 1).
도 1은 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 혈당 흡수(glucose uptake)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
[ 실험예 2: 단일 소재가 글루코키나아제 활성( Glucokinase activity)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 제조한 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물 각 추출물이 글루코키나아제 활성(Glucokinase(GK) activity)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
글루코키나아제 활성은 'hexokinase colorimetric assay kit'를 이용하여 측정하였다. 글루코키나아제 활성에 의해 생성된 G6P(glucose-6-phosphate)가 G6PDH(G6P dehydrogenase)와 반응할 때 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide)가 NADH로 환원되는 것을 이용하여 글루코키나아제 활성도를 측정하였다.
HepG2 세포에 각 소재를 (1 mg/㎖) 처리한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후 단백질을 정량하여 각 웰(well) 당 40 ㎍/50 ㎕씩 처리한 후, 각 웰(well) 당 어세이 버퍼(assay buffer) 34 ㎕, 엔자임 믹스(enzyme Mix) 2 ㎕, 디벨로퍼(developer) 2 ㎕, 코엔자임(coenzyme) 2 ㎕, 헥소키나아제(hexokinase) 10 ㎕를 처리한 후 450 nm에서 3분 간격으로 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMG), 여주 추출물(YJ)이 글루코키나아제 활성을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 그 중, 오미자 추출물(OMJ)이 161%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 다음은 여주 추출물(YJ)이 143%, 미강 추출물(MK)이 130%로 높은 활성을 나타내었고, 그 다음은 돼지감자 추출물(DJ)이 높은 활성을 나타내었다 (도 2).
도 2는 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
[ 실험예 3: 단일 소재가 피루브산 탈수소효소 활성( Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 제조한 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물 각 추출물이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase(PDH) activity)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
피루브산 탈수소효소(PDH) 활성은 'PDH activity assay kit'를 이용하여 측정하였다. 피루브산 탈수소효소 활성도는 PDH 활성에 의해 NAD+가 NADH로 환원되는 원리를 이용하여 측정하였다.
HepG2 세포에 각 소재를 (1 mg/㎖) 처리한 뒤 24시간 배양한 후 단백질을 정량하여 각 웰(well) 당 100 ㎍/0.2 ㎖씩 분주한 후 실온에서 3시간 인큐베이션(incubation) 한 다음 1X 스태빌라이저(stabilizer)로 2회 세척 후 20X 리간트 믹스(reagent Mix) 11 ㎕, 1X 버퍼(buffer) 0.2 ㎖, 100X 커플러(coupler) 2.25 ㎕, 100X 리간트 염료(reagent Dye) 2.25 ㎕를 처리한 후 450 nm에서 3분 간격으로 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMG), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM) 모두 피부르산 탈수소효소 활성 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 중, 여주 추출물(YJ)이 180%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 다음은 돼지감자 추출물(DJ)이 167%, 율무 추출물(YM)이 130%로 높은 활성을 나타내었고, 그 다음은 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMG)이 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 3).
도 3은 돼지감자 추출물(DJ), 미강 추출물(MK), 오미자 추출물(OMJ), 여주 추출물(YJ), 율무 추출물(YM)이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
[ 실시예 1: 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물을 이용하여 복합물 제조]
상기 제조예 1에서 제조한 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물, 율무 추출물을 하기 표 1과 같이 조성하여 각 복합물을 제조하고 MIX 1 내지 5라고 지칭하였다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
돼지감자
추출물(DJ)		 미강 추출물(MK) 오미자 추출물(OMJ) 여주 추출물(YJ) 율무 추출물(YM)
MIX 1 1.2 1 - - -
MIX 2 1.2 - 1.1 1 -
MIX 3 1 1.2 1 1 -
MIX 4 - - 1 1.5 -
MIX 5 1.2 1.1 1.1 1.1 1
[ 실험예 4: 복합물이 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 각 복합물 (MIX 1~5)이 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
혈당 흡수(Glucose uptake)는 HepG2 세포를 이용하여 'glucose uptake colorimetric assay kit'를 이용하여 측정하였다.
세포를 96-웰 플레이트(well plates)에 1×105 cells/㎖로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 24시간 더 배양하고, 배양된 세포는 2% BSA가 포함되어 있는 KRPH(Krebs ringer phosphate HEPES)로 교체하였다. 40분 후, 1 μM의 인슐린과 각 복합물 (MIX 1~5) (0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/㎖)을 처리하고 20분간 동안 더 배양한 다음 10 mM 2-디옥시글루코스(2-deoxyglucose)를 20분간 처리하였다. 그 후, 세포에 어세이 버퍼(assay buffer) 8 ㎕와 엔자임 믹스 A(enzyme mix A) 2 ㎕를 처리한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 추출 버퍼(extraction buffer)를 이용해 세포 추출물을 회수하였다. 회수된 세포 추출물을 85℃에서 40분간 가열하고 얼음 위에서 냉각시킨 뒤 중성화 버퍼(neutralization buffer)를 첨가하였다. 그 후, 500 rpm에서 10초간 원심분리하고 상층액을 취하였으며, 각 웰(well)에 글루타티온환원효소(glutathione reductase) 20 ㎕, DTNB [5-5’(2-nitrobenzoic acid)] 16 ㎕, 리사이클릭 믹스(recycling mix) 2 ㎕를 첨가한 후 40분 동안 반응시켰다. 그 후, ELISA 마이크로플레이트 리더(ELISA microplate reader) (EL808, BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, MIX 1~5 처리구 모두에서 유의적으로 혈당 흡수(glucose uptake) 증가 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다 (도 4).
도 4는 복합물이 혈당 흡수(Glucose uptake)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
[ 실험예 5: 복합물이 글루코키나아제 활성( Glucokinase activity)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 각 복합물 (MIX 1~5)이 글루코키나아제 활성(Glucokinase(GK) activity)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
글루코키나아제 활성은 'hexokinase colorimetric assay kit'를 이용하여 측정하였다. 글루코키나아제 활성에 의해 생성된 G6P(glucose-6-phosphate)가 G6PDH(G6P dehydrogenase)와 반응할 때 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide)가 NADH로 환원되는 것을 이용하여 글루코키나아제 활성도를 측정하였다.
HepG2 세포에 각 복합물 (MIX 1~5) (0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/㎖)을 처리한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후 단백질을 정량하여 각 웰(well) 당 40 ㎍/50 ㎕씩 처리한 후, 각 웰(well) 당 어세이 버퍼(assay buffer) 34 ㎕, 엔자임 믹스(enzyme Mix) 2 ㎕, 디벨로퍼(developer) 2 ㎕, 코엔자임(coenzyme) 2 ㎕, 헥소키나아제(hexokinase) 10 ㎕를 처리한 다음 450 nm에서 3분 간격으로 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 'MIX 3', 'MIX 5' 모든 농도 처리구에서 유의적으로 높은 글루코키나아제 활성 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 5).
도 5는 복합물이 글루코키나아제 활성(Glucokinase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
[ 실험예 6: 복합물이 피루브산 탈수소효소 활성( Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 각 복합물 (MIX 1~5)이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase(PDH) activity)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
피루브산 탈수소효소(PDH) 활성은 'PDH activity assay kit'를 이용하여 측정하였다. 피루브산 탈수소효소 활성도는 PDH 활성에 의해 NAD+가 NADH로 환원되는 원리를 이용하여 측정하였다
HepG2 세포에 각 복합물 (MIX 1~5) (0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/㎖)을 처리한 뒤 24시간 배양한 후 단백질을 정량하여 각 웰(well) 당 100 ㎍/0.2 ㎖씩 분주한 후 실온에서 3시간 인큐베이션(incubation) 한 다음 1X 스태빌라이저(stabilizer)로 2회 세척 후 20X 리간트 믹스(reagent Mix) 11 ㎕, 1X 버퍼(buffer) 0.2 ㎖, 100X 커플러(coupler) 2.25 ㎕, 100X 리간트 염료(reagent Dye) 2.25 ㎕를 처리한 다음 450 nm에서 3분 간격으로 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 'MIX 3', 'MIX 5' 모든 농도 처리구에서 유의적으로 높은 피루브산 탈수소효소 활성 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 6).
도 6은 복합물이 피루브산 탈수소효소 활성(Pyruvate dehydrogenase activity)에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'MIX 1'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 2'는 돼지감자 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 3'은 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 4'는 오미자 추출물 및 여주 추출물로 조성된 복합물, 'MIX 5'는 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물로 조성된 복합물을 의미한다.
[ 실험예 7: 복합물의 HIT-T15 세포 증식에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 각 복합물 (MIX 1~5)이 HIT-T15 세포(cell) 증식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
HIT-T15 세포(cell)의 증식능은 CellTiter '96® AQueous ONE Solution Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA)'을 사용하여 측정하였다. HIT-T15 세포(cells)는 3×104 cells/well의 밀도로 96-웰 플레이트(well plate)에 분주하였고 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지난 후 복합물 (MIX 1~5)을 각각 0.1 mg/㎖, 0.25 mg/㎖, 0.5 mg/㎖, 1 mg/㎖ 농도로 세포 배양액에 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 시험물질 첨가하여 배양 후 각 웰(well)에 ONE 용액(solution)을 20 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 추가 배양한 후 'SpectraMaxM2 Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)'를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
MIX 1 Proliferation
(Absrobance at 490 nm)
Control 1.000±0.007a
0.1 mg/㎖ 1.127±0.004c
0.25 mg/㎖ 1.143±0.004d
0.5 mg/㎖ 1.087±0.016b
1 mg/㎖ 1.084±0.014b
MIX 2 Proliferation
(Absrobance at 490 nm)
Control 1.000±0.007a
0.1 mg/㎖ 1.112±0.001c
0.25 mg/㎖ 1.082±0.004b
0.5 mg/㎖ 1.074±0.010b
1 mg/㎖ 1.060±0.007b
MIX 3 Proliferation
(Absrobance at 490 nm)
Control 1.000±0.007a
0.1 mg/㎖ 1.145±0.004b
0.25 mg/㎖ 1.150±0.002b
0.5 mg/㎖ 1.151±0.007b
1 mg/㎖ 1.174±0.009c
MIX 4 Proliferation
(Absrobance at 490 nm)
Control 1.000±0.007a
0.1 mg/㎖ 1.128±0.008c
0.25 mg/㎖ 1.120±0.008c
0.5 mg/㎖ 1.087±0.006b
1 mg/㎖ 1.081±0.004b
MIX 5 Proliferation
(Absrobance at 490 nm)
Control 1.000±0.007a
0.1 mg/㎖ 1.128±0.008c
0.25 mg/㎖ 1.106±0.023b
0.5 mg/㎖ 1.103±0.011b
1 mg/㎖ 1.115±0.010b
실험결과, 복합물 MIX 1~5 모든 농도 처리구가 대조군에 비해 HIT-T15 세포(cells)의 증식이 유의적으로 증가하였고, 그 중 MIX 3이 가장 높은 세포 증식 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 8: 복합물이 HIT-T15 세포(cells)의 인슐린 분비량에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 각 복합물 (MIX 1~5)이 HIT-T15 세포(cell)의 인슐린 분비량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
HIT-T15 세포(cells)의 인슐린 분비량은 'Mouse Insulin ELISA Kit (Shibayagi, Gunma, Japan)'를 사용하여 측정하였다. HIT-T15 세포(cells)는 1×105 cells/well의 밀도로 24-웰 플레이트(well plate)에 분주하였고 48시간 동안 세포를 배양하였다. 48시간 배양 후 세포 배양액을 제거하고 각 복합물 (MIX 1~5)이 다양한 농도 (0.1 mg/㎖, 0.25 mg/㎖, 0.5 mg/㎖, 1 mg/㎖)로 첨가된 1 ㎖ Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer (KRB buffer: 10 mM D-glucose, 0.49 mM MgCl2, 119.78 mM NaCl, 4.56 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 1.3 mM NaH2PO4, 14.99 mM NaHCO3)를 첨가하여 30분 동안 배양하였다. 그 후 세포가 컨디션(condition)한 KRB 버퍼(buffer)를 수거하여 12,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 다음 상층액을 취해 'Mouse Insulin ELISA Kit'를 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 인슐린을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
MIX 1 Insulin (ng/㎖)
Control 6.87±1.15a
0.1 mg/㎖ 7.59±0.61a
0.25 mg/㎖ 9.64±1.13b
0.5 mg/㎖ 12.09±1.63c
1 mg/㎖ 19.33±0.58d
MIX 2 Insulin (ng/㎖)
Control 6.87±1.15a
0.1 mg/㎖ 8.42±0.67b
0.25 mg/㎖ 9.53±1.46b
0.5 mg/㎖ 11.34±1.31c
1 mg/㎖ 14.80±1.62c
MIX 3 Insulin (ng/㎖)
Control 6.87±1.15a
0.1 mg/㎖ 7.99±0.62b
0.25 mg/㎖ 8.48±1.34b
0.5m g/㎖ 9.45±1.67b
1 mg/㎖ 14.94±1.76c
MIX 4 Insulin (ng/㎖)
Control 6.87±1.15a
0.1 mg/㎖ 8.14±0.39b
0.25 mg/㎖ 6.28±0.40a
0.5 mg/㎖ 7.24±0.61a
1 mg/㎖ 7.82±1.38b
MIX 5 Insulin (ng/㎖)
Control 6.87±1.15a
0.1 mg/㎖ 8.28±1.52b
0.25 mg/㎖ 10.35±0.92c
0.5 mg/㎖ 11.47±0.32c
1 mg/㎖ 11.42±0.77c
실험 결과, MIX 1, 2, 3, 5 처리구가 농도 의존적으로 HIT-T15 세포(cells)의 인슐린 분비를 증가시키는 경향을 보임을 확인할 수 있었다.

Claims (3)

  1. 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물이 1 : 1.2 : 1 : 1의 무게비율로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하고,
    상기 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물 및 여주 추출물은,
    추출 용매로 물을 이용하여 추출된 물 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨 개선용 식품 조성물.
  2. 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물이 1.2 : 1.1 : 1.1 : 1.1 : 1의 무게비율로 조성된 복합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨 개선용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물 및 율무 추출물은,
    추출 용매로 물을 이용하여 추출된 물 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨 개선용 식품 조성물.
KR1020160005123A 2016-01-15 2016-01-15 돼지감자 추출물, 미강 추출물, 오미자 추출물, 여주 추출물을 함유하는 항당뇨 조성물 KR101688090B1 (ko)

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