KR101636126B1 - 한방이화주 주박 추출물의 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

한방이화주 주박 추출물의 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한방이화주 주박 추출물의 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상업적 시설에서 생산되고 있는 한방이화주의 부산물인 주박으로부터 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 조제하고, 이들의 순차적 유기 용매 분획물 및 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 한방이화주 주박 추출물의 유기용매 분획물은, 본 명세서의 실시예를 통해 구체적으로 증명된 바와 같이, 혈액 응고 저해 활성 및 혈소판 응집 저해 활성과 같은 강력한 항혈전 효과를 가지므로 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명에서 사용되는 한방이화주 주박은 사료 및 구황식품으로 이용되는 것이므로 기존의 항혈전제를 대치할 수 있는 안전한 성분으로서 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

한방이화주 주박 추출물의 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS COMPRISING ORGANIC SOLVENT FRACTION PREPARED FROM LEES EXTRACT OF MEDICINAL EHWA TAKJU AS AN EFFECTIVE COMPONENT AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 한방이화주 주박 추출물의 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상업적 시설에서 생산되고 있는 한방이화주의 부산물인 주박으로부터 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 조제하고, 이들의 순차적 유기 용매 분획물 및 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것이다.
인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다. 그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증(thrombosis)을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있으며, 이러한 원인들은 개별적 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전 생성을 유발한다. 혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
한편, 한방이화주는 전분질 원료에 별도의 효모나 국을 첨가하지 않고 이화누룩(이화곡)만을 첨가하여 1단 담금하고, 이후 추가적으로 전분질 원료와 이화곡, 한방 추출물을 첨가하여 2단 담금하여 제조하는 고급 탁주의 일종이다. 한방이화주를 제조한 후 남은 찌꺼기인 주박은 술지게미, 재강 또는 아레기 등으로 불리며, 상당량의 영양성분과 유용 생리활성 성분을 가지고 있는 것으로 여겨지고 있으나, 현재까지 폐기되고 있는 한방이화주 주박에 대한 연구는 이루어진 바 없으며, 이의 생리기능으로는 한방이화주 주박의 항균 및 항산화 활성이 일부 보고(김미선 외, 한국미생물생명공학회 영남지부 학술대회, 2013. 2. 22. p28))된 바 있을 뿐이다.
또한, 이화누룩은 이화주를 제조할 때 사용되는 전통 쌀 누룩으로 증자하지 않은 쌀을 물에 불린 후 분쇄하고, 이를 8~10cm의 구형으로 성형하여 솔잎으로 띄워 발효시킨 누룩이다. 이화누룩은 통상의 증자한 밀을 사용하는 밀 누룩과는 달리, 증자하지 않은 쌀을 분쇄하여 사용하는 쌀 누룩으로서, 아스페르질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 곰팡이와 한세눌라속(Hansenula sp.) 효모가 누룩의 우점종으로 알려져 있으며, 이화누룩으로 제조된 이화주는 특유의 맛과 향이 있다. 현재까지 이화누룩의 성분 및 유용 생리활성에 관련된 연구 또한 본 발명자들의 이화누룩의 항균 및 항산화 활성 보고(김미선 외, 한국미생물생명공학회 영남지부 학술대회, 2013. 2. 22. p28)만이 알려져 있다.
이와 같이, 한방이화주를 포함한 이화주에 대한 연구는 매우 미미하여, 전통 이화주 양조 중의 주요성분 및 관능적 품질 특성에 관한 연구(김정옥 외, 한국조리과학회지, 1994, 10: 1-7), 전통 이화주 양조 중의 화학성분 변화((김정옥 외, 한국조리과학회지, 1993, 9: 272-277) 및 전통 이화주의 양조와 관련된 미생물 및 효소적 특성(김정옥 외, 한국조리과학회지, 1993, 9: 266-271) 및 한방이화주의 미백 및 피부주름개선 효과(이상진 외, 한국식품영양과학회지, 2013, 42: 550-555)가 보고되어 있을 뿐이다.
또한, 이화주과 관련된 특허로는 이화누룩을 포함하는 고두밥을 담은 컵 용기에 대한 즉석 막걸리 제조 용기(대한민국 등록특허 제10-1293117호, 쌀누룩 컵 막걸리, 등록일자 2014년 4월 30일) 및 이화누룩으로 빚은 이화주를 이용하는 미용조성물 특허(대한민국 공개특허 제10-2014-0044224호, 이화누룩 약주를 포함하는 미용조성물 및 그 제조방법, 공개일자 2014년 4월 14일), 한약재를 포함하는 한방이화주를 이용한 화장료 조성물 특허(대한민국 공개특허 제10-2013-0130415호, 한방이화주를 이용한 화장료 조성물, 공개일자 2013년 12월 2일)가 알려져 있을 뿐이다.
상술한 바와 같이, 한방이화주를 포함하는 이화주와 관련된 연구는 미미하며, 특히, 한방이화주의 제조시 발생하는 부산물인 주박에 대한 연구나 특허는 전무한 상태이다. 특히, 폐기되고 있는 한방이화주 주박의 추출물의 활성 분획물을 대상으로 인간 트롬빈 효소, 프로트롬빈 효소, 혈액응고 관련인자들의 직접저해 및 혈소판 응집저해를 통한 혈전생성저해 효과에 대해 알려진 바 없다.
KR 10-2014-0044224 A KR 10-2013-0130415 A
본 발명은 폐기되고 있는 한방이화주 주박의 생물자원으로서의 효용성을 증대시키며, 기존 항혈전제의 부작용에 따른 위험성을 극복할 수 있는 새로운 신약 후보 물질 및 건강 기능 식품을 제공하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 한방이화주 주박의 추출물의 유기 용매 순차 분획물을 유효성분으로 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 내인성 혈액응고인자 저해에 따른 혈액 응고 저해 활성과 혈소판 응집 저해 활성을 이용한 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 유효성분을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초 추출물을 첨가하여 제조되는 한방 이화주로부터 분리된 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 각각 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물 중에서, 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물의 부탄올 분획물, 에탄올 추출물의 물 잔류물 및 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 한방 이화주는 (S1) 수세된 쌀을 침지하는 단계; (S2) 물을 제거하고 분쇄하는 단계; (S3) 일정한 형상으로 성형하는 단계; (S4) 배양하는 단계; 및 (S5) 건조, 숙성 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 이화누룩을 이용하여 제조되는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 혈액응고 저해 활성 및 혈소판 응집 저해 활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 혈액응고 저해 활성은 트롬빈 저해 활성, 프로트롬빈 저해 활성 및 혈액응고인자 저해 활성 중 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초 추출물을 첨가하여 제조되는 한방 이화주로부터 분리된 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 각각 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물 중에서, 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물의 부탄올 분획물, 에탄올 추출물의 물 잔류물 및 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 한방이화주 주박 추출물의 유기용매 분획물은, 본 명세서의 실시예를 통해 구체적으로 증명된 바와 같이, 혈액 응고 저해 활성 및 혈소판 응집 저해 활성과 같은 강력한 항혈전 효과를 가지므로 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명에서 사용되는 한방이화주 주박은 사료 및 구황식품으로 이용되는 것이므로 기존의 항혈전제를 대치할 수 있는 안전한 성분으로서 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 한방이화주 주박 에탄올 추출물 및 이의 분획물 (4~8번)과 한방이화주 주박 열수 추출물 및 이의 분획물 (9~13번)의 인간 혈소판 응집저해 활성의 결과를 나타낸 그래프이다. 각각의 그래프는 1: 용매 대조구(DMSO), 2: 아스피린(0.50mg/ml), 3: 아스피린(0.25mg/ml), 4: 한방이화주 주박 에탄올 추출물(0.25mg/ml), 5: 한방이화주 주박 에탄올 추출물의 헥센 분획물(0.25mg/ml), 6: 한방이화주 주박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(0.25mg/ml), 7: 한방이화주 주박 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(0.25mg/ml) 및 8: 한방이화주 주박 에탄올 추출물의 유기용매 분획 후의 물 잔류물(0.25mg/ml), 9: 한방이화주 주박 열수 추출물(0.25mg/ml), 10: 한방이화주 주박 열수 추출물의 헥센 분획물(0.25mg/ml), 11: 한방이화주 주박 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물(0.25mg/ml), 12: 한방이화주 주박 열수 추출물의 부탄올 분획물(0.25mg/ml) 및 13: 한방이화주 주박 열수 추출물의 유기용매 분획 후의 물 잔류물(0.25mg/ml)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 항혈전 및 혈류개선 활성을 나타내는 기능성 소재 개발을 목표로, 한방이화주의 주박으로부터 추출물을 조제한 후, 이를 유기 용매를 사용한 순차 분획으로 다양한 분획물을 조제하고, 이를 대상으로 인간 혈장과 인간 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자들을 이용하여 혈전생성 저해활성을 평가하고, 인간 농축혈소판을 이용하여 혈소판 응집저해 활성을 측정하여, 최종적으로 매우 강력한 항혈전 활성을 나타내는 조정제물을 확보하였다.
이와 같은 한바이화주 주박 추출물의 유기용매 분획물의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 한방이화주를 제조하고, 이로부터 주박을 회수한 후, 이의 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 얻었으며, 각각의 추출물에 대하여 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 제조하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 추출물, 분획물 및 물 잔류물의 인간트롬빈 직접저해 효과, 프로트롬빈 저해효과, 혈액응고인자(VIII 인자, IX 인자, XI 인자 및 XII 인자) 저해에 의한 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장효과를 평가하고, 또한, 농축 인간혈소판을 이용하여 혈소판 응집저해효과를 평가하여, 본 발명의 상업적으로 이용되고 있는 항혈전제 아스피린(상품명: 프로텍트)보다 강력한 항혈전 활성을 가지는 성분(조정제물)을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초 추출물을 첨가하여 제조되는 한방 이화주로부터 분리된 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 각각 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물 중에서, 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물의 부탄올 분획물, 에탄올 추출물의 물 잔류물 및 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명자들에 의하여 기존에 공개된 이화누룩 제조법(대한민국 공개특허 제10-2014-0044224호, 이화누룩 약주를 포함하는 미용조성물 및 그 제조방법, 공개일자 2014년 4월 14일) 또는 이의 일부 변형된 방법에 따라 이화누룩을 제조하는 단계; 본 발명자들에 의하여 기존에 공개된 한방이화주 제조법(대한민국 공개특허 제10-2013-0130415호, 한방 이화주를 이용한 화장료 조성물, 공개일자 2013년 12월 2일) 또는 이의 일부 변형된 방법에 따라 이화누룩과 전분, 한방 추출물(구기자, 삼백초, 상백피 및 감초의 추출물)을 이용한 한방이화주를 제조하는 단계; 발효가 완료된 한방이화주를 체별기로 거른 후 남는 찌꺼기인 주박을 회수하는 단계; 주박으로부터 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 조제하는 단계; 에탄올 추출물과 열수 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 각각 조정제하는 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 효능 및 안정성 조사단계를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 한방이화주의 제조에 이용되는 이화누룩은 대한민국 공개특허 제10-2014-0044224 및 대한민국 공개특허 제10-2013-0130415호에서 상세하게 설명된 공정 또는 이의 변형된 공정에 따라 제조될 수 있다. 이를 구체적으로 설명하면, 한방이화주의 제조에 사용되는 이화누룩은 (S1) 수세된 쌀을 침지하는 단계; (S2) 물을 제거하고 분쇄하는 단계; (S3) 일정한 형상으로 성형하는 단계; (S4) 배양하는 단계; 및 (S5) 건조, 숙성 및 분쇄하는 단계에 의하여 제조될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 이화누룩은 다음과 같은 공정으로 제조될 수 있다. 먼저, 멥쌀 100중량부를 8~10회 세미한 후 7~8의 120~180중량부의 냉수에서 4시간 동안 침지하고, 30분 간격으로 쌀을 뒤적이면서 2~5시간 동안 물을 뺀 후, 15~30메쉬의 체를 통과할 수 있을 정도로 쌀을 분쇄하고 쌀 분말을 선별한다. 이 후, 상기 쌀 분말을 8~10cm의 크기로 둥글게 뭉쳐 빚어 성형한다. 상기 성형물의 개당 무게는 200~250g이며, 종이 상자에 송엽을 흩어 뿌린 후 상기 성형물들을 넣고 그 위에 다시 송엽을 흩어 뿌리고 25~35, 습도 40~60%로 유지하는 항온 항습기(배양기)에서 약 8~11일간 배양한다. 이때, 사용하는 송엽의 양은 멥쌀 100중량부에 대하여 0.5~5중량부이다. 그 후, 둥근 형상의 배양물 표면의 균사와 포자 등을 깨끗이 털어내고, 이를 8~16등분으로 쪼개어 내부의 오염 여부를 검사함으로써 법제 공정을 수행한다. 그리고, 바람이 약하게 불고 습하지 않고 햇볕이 잘 드는 곳에서 약 1주일 동안 건조와 숙성을 진행한다. 그 후, 잘 건조된 배양물을 건식분쇄기로 미세하게 분쇄하고, 분쇄물을 미생물 분석, 수분 함량 측정 등을 통하여 선별함으로써 이화누룩을 제조하게 된다.
다음으로, 상기 설명된 이화누룩을 이용하여 대한민국 공개특허 제10-2013-0130415호에 기재된 방법 또는 이의 변형된 방법에 따라 한방이화주를 제조할 수 있다. 여기에 사용되는 재료로는 상기 성명된 이화누룩, 전분질 원료, 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초로 이루어지는 한방 추출물 및 물을 들 수 있다.
바람직한 구체예로서 한방이화주를 제조하는 방법은 다음과 같다.
본 발명의 한방 이화주 생산을 위한 전분질 원료는 고두밥, 고두밥 분말, 생쌀, 침미 후 분쇄기를 이용한 후 분쇄된 쌀 또는 백설기 파쇄물 등으로, 상기 백설기 파쇄물은 쌀 또는 분쇄된 쌀을 증편하여 만든 백설기를 방냉후 파쇄한 것이다. 본 발명의 한방 이화주는 1단 담금 및 2단 담금을 거쳐 제조되며, 이 과정에서 별도의 입국 또는 효모를 첨가하지 않는다. 1단 담금은 전분질 원료 100중량부를 90~120중량부의 이화누룩 및 80~120중량부의 물과 혼합한 후 20~25에서 7~10일간 발효하여 수행한다. 1단 담금 시 이화누룩 이외의 효모나 타 누룩은 첨가되지 않는다. 2단 담금은 1단 발효와 동일하게 전분질 원료를 이화누룩, 물, 한방 추출물 및 상기 1단 담금물과 혼합한 후 20~25에서 20~30일간 발효를 진행한다. 이때, 2단 담금의 전분질 원료는 1단 담금 시 사용한 전분질 원료의 100~200중량부, 바람직하게는 80~150 중량부, 더욱 바람직하게는 100 중량부이며, 2단 담금 시 사용하는 전분질 원료, 이화누룩 및 물의 중량비는 1단 담금 시 사용한 전분질 원료, 이화누룩 및 물의 중량비와 동일하다. 상기 한방 추출물은 한약재의 추출물로, 구기자, 감초, 상백피 및 삼백초를 동량으로 혼합하고, 이를 열수 추출하여 제조한다. 바람직하게는, 본 발명의 한방 추출물은 2단 담금 시 사용하는 전분질 원료의 5~10중량%의 한약재를 사용하여 제조하며, 이때, 한약재 중량의 2~10배, 바람직하게는 2~5배의 물을 이용하여 1~6시간, 바람직하게는, 2~4시간 동안 열수 추출한다. 상기 2단 담금 후 체별 과정을 통해 술지게미를 분리하여 한방이화주를 완성한다. 체별 과정은 발효가 끝난 술덧을 체별기를 이용하여 술지게미(덩어리 상태의 전분질원료)를 분리시키는 과정이다.
위와 같이 한방이화주를 제조한 후 남은 주박을 회수하여 본 발명의 추출물 및 유기용매 분획물의 제조에 사용한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 한방이화주 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물로부터 각각 분획된 유기용매 분획물 및 물 잔류물은 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 헥센으로 분획 후 잔류물을 순차적으로 에틸아세테이트 및 부탄올로 분획하여 각각의 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 회수하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 80~95% 에탄올 또는 열수가 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 한방이화주 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물과 이들 각각의 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 대상으로 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 에탄올 추출물의 헥센 분획에서는 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 15배 이상 연장시켰으며, 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 각각 15배 이상 연장시켜 매우 강력한 항혈전 활성을 나타내었다. 또한, 한방이화주 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물과 이들 각각의 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 대상으로 혈소판 응집저해능을 평가한 결과에서는, 에탄올 추출물의 헥센 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물에서 혈소판 응집능이 35.3, 55.7 및 50.3%로 나타났고, 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 50.8%로 나타남을 확인함으로써, 동일농도의 아스피린과 유사한 응집저해를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 한방이화주 주박 추출물의 상기 조정제물이 다양한 방식으로 혈전 생성을 억제할 수 있으며, 현재 위장장해와 같은 부작용이 알려진 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 한방이화주 주박 추출물의 유기용매 분획물 및 물 잔류물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 한방이화주 주박 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 유효성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 설명된 유효 성분을 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품으로도 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초 추출물을 첨가하여 제조되는 한방 이화주로부터 분리된 주박의 에탄올 추출물 또는 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 각각 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물 중에서, 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 에탄올 추출물의 부탄올 분획물, 에탄올 추출물의 물 잔류물 및 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 한방이화주 주박의 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물 및 물 잔류물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 주박 추출물 100중량부 당 0.01 내지 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 한방이화주 주박의 제조 및 주박의 특성
2012년 국순당에서 한방이화주를 제조하고 걸러낸 주박을 사용하였다. 이화누룩 제조 및 한방이화주의 제조는 대한민국 공개특허 제10-2014-0044224호 (이화누룩 약주를 포함하는 미용조성물 및 그 제조방법, 공개일자 2014년 4월 14일) 및 대한민국 공개특허 제10-2013-0130415호(한방이화주를 이용한 화장료 조성물, 공개일자 2013년 12월 2일)에 제시한 바와 동일하게 제조하였다.
위와 같은 방법으로 제조된 이화누룩 10g에 100 ml의 물을 첨가하여 현탁 한 경우, 현탁액의 pH는 4.37, brix는 1.0을 나타내었다. 이화누룩은 수분함량 13.6%, 알코올 함량은 0%로 나타났으며, 한방이화주 주박은 pH 4.16, brix는 27.0을 나타내었으며, 수분함량 59.8%, 알코올 함량은 1.5%로 나타났다.
실시예 2: 한방이화주 주박 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 제조 및 성분 분석
한방이화주 주박의 에탄올 추출물을 조제하기 위해 누룩 무게에 대해 10배의 에탄올(95%, 덕산, 한국)을 가하고 상온에서 8시간씩 2회 추출하였으며, 추출액은 필터기를 사용하여 이물질을 제거한 후 회수하고, 이를 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 열수 추출물은 주박에 대해 5배 부피의 물을 가하고 100에서 1시간 가열 추출하였다. 이후, 각각의 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었으며, 이를 감압농축하여 분말화한 후 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다.
한방이화주 주박의 에탄올 및 열수 추출물과 이들이 분획물의 수득율 및 성분 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 에탄올 추출물의 수득율은 16.150.4%이었으며, 열수 추출물의 경우 수율은 1.890.1%로 에탄올 추출 수율이 열수 추출에 비해 약 8.5배 높았다. 이는 한방이화주 주박에 지용성 물질이 많이 포함되어 있음을 의미한다. 에탄올 추출물의 분획시 헥센 분획 수율은 4%, 에틸아세테이트 분획은 3.2%, 부탄올 분획은 9.1% 및 물 잔류물은 83.7%였으며, 열수 추출물의 경우 에틸아세테이트 분획은 6.6%를 차지하였다. 이러한 결과는 각 분획물은 상당히 정제된 상태에 있음을 암시하는 결과이다.
조제된 한방이화주 주박의 에탄올 추출물과 열수 추출물 및 이들의 유기용매 분획물과 물 잔류물의 총 폴리페놀(total polyphenol) 및 총 플라보노이드(total flavonoid) 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400l에 50l의 Folin-ciocalteau, 100l의 Na2CO3 포화용액을 넣고, 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올로 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400l에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40l를 넣고 37에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 측정 결과, 한방이화주 주박의 에탄올 추출물의 경우 에틸아세테이트 분획물에서, 열수 추출물에서는 부탄올 분획에서 가장 높은 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 나타내었다. 따라서, 주박 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 다양한 생리활성이 우수하리라 판단되었다.
[표 1] 한방이화주 주박의 에탄올 및 열수 추출물 및 이들의 순차적 유기용매 분획물의 수율 및 이들의 성분 분석
Figure 112014050040176-pat00001
실시예 3: 한방이화주 주박 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가
상기 실시예 2에서 제조된 한방이화주 주박의 에탄올 및 열수 추출물 및 이들의 순차적 유기용매 분획물과 물 잔류물의 항혈전 활성을 평가하기 위해 혈액응고 저해활성과 혈소판 응집저해 활성을 측정하였다. 혈액응고 저해활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정하였다. 구체적인 측정 방법은 다음과 같다.
트롬빈 타임(Thrombin Time)
37에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50l와 20mM CaCl2 50l, 시료 10l를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) 100l를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 트롬빈 타임을 용매 대조구의 트롬빈 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.
프로트롬빈 타임(prothrombin time)
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70l와 시료 10l를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37에서 3분간 가온 후, 130l의 PT reagent를 첨가하고 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA)이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 프로트롬빈 타임을 용매 대조구의 프로트롬빈 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.
aPTT (activated Partial Thromboplastin Time)
혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) 100l 와 시료 10l를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37에서 3분간 가온한 후, 50l의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM, USA) 를 첨가하고 다시 37에서 3분간 배양하였다. 이후 50l CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 에이피티 타임을 용매 대조구의 에이피티 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.
상기 설명된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법에 따른 혈액응고 저해활성 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 한방이화주 주박의 에탄올 및 열수 추출물 및 이들의 순차적 유기용매 분획물의 항혈전 활성
Figure 112014050040176-pat00002
대조구로 사용된 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 각각 2.6배, 1.7배 및 1.4배 연장시켜 우수한 항혈전 효과를 나타내었으며, 한방이화주의 에탄올 추출물 및 열수 추출물은 혈액응고에 효과를 나타내지 않았다. 또한 열수 추출물의 분획물들도 혈액응고에 거의 효과가 없었다. 그러나, 주박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서는 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 각각 15배 이상 연장시켜 매우 강력한 혈전 생성 억제활성을 나타내었으며, 주박 에탄올 추출물의 헥센 분획에서는 에이피티 타임만을 무첨가구에 비해 15배 이상 연장시켰다. 한편, 한방이화주의 에탄올 추출물의 헥센 및 에틸아세테이트 분획은 pH 2(0.01M HCl)에서 1시간, 100에서 30분, 혈장(fetal bovine serum, Sigma Co., USA)에서 1시간을 처리시에도 항혈전 활성의 변화는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 한방이화주의 에탄올 추출물의 헥센 및 에틸아세테이트 분획은 기존의 부작용이 많은 아스피린을 대치할 수 있는 항혈전제로 사용가능함을 제시하고 있다.
실시예 4: 한방이화주 주박의 에탄올, 열수 추출물 및 이들의 분획물의 혈소판 응집저해활성 평가
상기 실시예 2에서 조제된 에탄올 추출물, 열수 추출물 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 평가하였으며, 그 결과는 도 1 및 표 3에 나타내었다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.
혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )
혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl2, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5l collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37에서 혈소판 응집을 측정하였으며, 응집강도, 기울기, 연장시간 및 하강면적으로 나타내었다.
[표 3] 한방이화주 주박의 에탄올 및 열수 추출물 및 이의 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성
Figure 112014050040176-pat00003
* 하강면적이 작을수록 응집저해가 강력함
먼저, 아스피린은 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다. 반면, 한방이화주 주박의 에탄올 추출물 및 열수 추출물은 0.25mg/ml 농도에서 혈소판 응집에 영향을 미치지 않았으며, 에탄올 추출물의 헥센 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물에서 동일 농도의 아스피린과 유사한 혈소판 응집능이 나타나 강력한 응집저해 활성을 나타내었다. 반면, 혈액 응고저해 활성이 우수하였던 주박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획은 무첨가구에 비해 혈소판 응집능이 142.9%로 촉진시킴을 확인하였다. 열수 추출물의 경우에는 에틸아세테이트 분획에서 양호한 응집저해를 나타내었다. 따라서, 혈액응고 및 혈소판 응집능을 고려한 항혈전제로서는 한방이화주의 에탄올 추출물의 헥센 분획물이 가장 우수하며, 혈액응고 저해 활성제의 경우 한방이화주의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수함을 확인하였다. 즉 상기 헥센 분획은 내인성 혈액응고인자의 저해와 혈소판 응집저해를 통한 항혈전 활성을 나타내며, 상기 에틸아세테이트 분획은 트롬빈, 프로트롬빈 및 내인성 혈전 생성 관련 혈액응고인자 저해를 통한 항혈전 활성이 나타남을 확인하였다.

Claims (5)

  1. 구기자, 삼백초, 상백피 및 감초 추출물을 첨가하여 제조하되, (S1) 수세된 쌀을 침지하는 단계; (S2) 물을 제거하고 분쇄하는 단계; (S3) 일정한 형상으로 성형하는 단계; (S4) 배양하는 단계; 및 (S5) 건조, 숙성 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 한방 이화주로부터 분리된 주박의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 약학 조성물.
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