KR101710263B1 - 헛개나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 식용으로 사용되는 헛개나무의 열수 또는 에탄올 추출물, 또는 상기 에탄올 추출물로부터 순차적 유기 용매 분획 후 수득되는 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 헛개나무 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 헛개나무로부터 추출물을 제조하고, 또한 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어지는 분획물 형태로도 조제되며, 상기 추출물 또는 이의 활성 분획물은 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고 인자 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타내며, 혈소판 응집 저해에 따른 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전성 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 헛개나무 추출물은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈액 응고 인자 저해, 혈전 생성 관련 효소 저해 및 혈소판 응집 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

헛개나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF HOVENIA DULCIS AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 식용으로 사용되는 헛개나무의 열수 또는 에탄올 추출물, 또는 상기 에탄올 추출물로부터 순차적 유기 용매 분획 후 수득되는 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착 및 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

헛개나무(Hovenia dulcis)는 중국과 일본, 우리나라에 주로 분포하고 있는 갈매나무과의 낙엽교목으로, 호깨나무, 허리깨나무, 지구자 나무, 백석목, 목밀, 현포리 등으로 불리며(김종오 외, 2008, 약학회지 52: 56~61), 국내에서는 주로 강원도 및 울릉도에 자생 군락을 형성하고 있다. 헛개나무의 열매와 줄기는 약용으로 이용되며, 주로 물로 달여 음용한다. 약리기능으로 간장의 기능 개선 및 해독작용(김종오 외, 2008, 약학회지 52: 56~61), 발암억제 및 간암세포 생육억제(박선희 외, 2007. 한국식품영양과학회지 36: 1371~1376; 황현익 외, 2003, 한국생물공학회 279~283), 숙취 해소 기능(박선희 외, 2009. 한국식품영양과학회지 38: 569~573), 항당뇨 효과(한혜경 외, 2003, 한국영양학회 추계학술대회 115; 안병수 외, 2010, 한국임상수의학회지 27: 366~373) 및 위장염, 대장염 치료 효과가 알려져 있다. 또한, 최근에는 헛개나무 추출물이 안면 염증통증의 경감효과가 보고(이준선 외, 2014, 한국산학기술학회지 15: 5088~5094)되었으며, 항염증 효과(김현준 외, 2013, 한국자원식물학회지, 26: 169~177)와 화장품 원료로의 이용 가능성을 검토하기 위한 미백, 주름개선 효과도 알려져 있다(김세현 외, 2010. 한국임학회지, 99: 836~842). 한편, 헛개나무 열매 및 줄기의 간 독소 해독 물질로는 ampelopsin(Hase 등, 1997, Biol. Pharm. Bulletin. 41: 381~385), 항 감미제로 hoduloside, jujuboside(Yoshikawa 등, 1992, Bulletin. 40: 2287~2291) 등이 보고된 바 있으며, ferulic acid(4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid), vanillic acid(4-hydroxy-3 -methoxybenzoic acid) 등이 항산화 및 항균 활성과 관련되어 있다고 보고된 바 있다(조정용 외, 2000, 한국식품과학회지 32: 1403~1408). 또한, 헛개나무를 이용한 가공식품도 오래전부터 개발된 바, 헛개나무 열매를 이용한 가공식품으로는 식혜 제조(김향희 외, 2007, 한국식품조리학회지, 23: 848~857), 국수 제조(최수 외, 2005, 한국식품영양과학회지, 34: 1586~1592), 스펀지 케익 제조(오명석, 2012. 세종대학교 박사학위논문 143p) 및 숙취제거용 건강음료(박은미 외, 2006, 한국식생활문화학회지, 21: 71~75)가 개발되어 있다. 헛개나무 잎을 이용한 가공제품으로는 잎 추출액의 젖산발효 음료(김소망, 2013, 순천대학교 석사논문) 및 잎차 개발이 진행되어 있다(정창호 외, 2000, 농산물저장유통학회지, 7: 117~123). 그러나, 전 세계적으로 보고된 150여건의 학술논문 및 학위논문에서도 헛개나무의 항혈전 활성과 관련된 보고는 없는 실정이다.

한편, 헛개나무와 관련된 국내외 특허로는 약 330여건이 알려져 있으며, 주로 알콜성 독성 제거 및 간 기능 개선 활성 조성물과 관련된 내용이 대부분이다. 구체적으로는 대한민국 등록특허 제10-1463717호(2014-11-14)에는 "헛개나무 추출물로부터 유래된 화합물, 이를 포함하는 헛개나무 추출물, 및 헛개나무 추출물을 함유하는 알코올 음료의 맛 개선용 조성물", 대한민국 등록특허 제10-1408101호(2014-06-10)에는 "헛개나무 추출물을 첨가한 표고버섯 균사체 흑미 배양액을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 식품", 등록번호 제10-1337525호(2013-11-29)에는 "진주초, 헛개, 황금 및 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물", 등록번호 제10-1344054호(2013-12-16)에는 "헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물", 등록번호 제10-0536855호(2005-12-08)에는 "헛개나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신장 기능개선용 조성물", 등록번호 제10-0672902호(2007-01-16)에는 "헛개나무 추출물을 포함하는 콜레스테롤 저하제 조성물"이 개시되어 있다. 한편, 헛개나무를 이용한 식품, 주류 및 화장품 개발과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0802906호(2008-02-01)에 "엄나무 또는 헛개나무를 이용한 소취기능의 주류 제조방법", 등록번호 제10-1321470호(2013-10-17)에 "헛개나무 잎 및 매실로부터 추출한 당 추출액을 이용한 발효식초의 제조방법 및 그 제조된 발효식초", 등록번호 제10-1418948호(2014-07-07)에 "헛개나무 추출물의 농축액과 나무수액을 혼합한 살균처리 천연음료의 제조방법", 등록번호 제10-1314749호(2013-09-27)에 "헛개나무 및 지구자가 함유된 티백용 조성물의 제조방법", 등록번호 제10-1097427호(2011-12-15)에는 "헛개나무 추출물을 함유하는 커피 원두 및 이의 제조방법 그리고 이를 이용한 기능성 커피 및 기능성 커피의 제조방법" 및 등록번호 제10-0536744호(2005-12-08)에는 "헛개나무 열매 추출물을 함유하는 피부 노화 방지 효과를 갖는 화장료 조성물 및 그 제조 방법"이 개시되어 있다.

헛개나무와 관련된 공개특허로는 제10-2014-0100336호(2014-08-14)에 "헛개나무 목질부로부터 분리된 추출물을 포함하는 숙취해소 조성물", 제10-2014-0075081호(2014-06-19)에는 "헛개나무 열매를 포함하는 헛개나무 발효차의 제조방법", 제10-2014-0055207호(2014-05-09)에는 "기능성 한방 헛개 음료 및 그 제조 방법", 제10-2014-0046150호(2014-04-18)에는 "헛개나무 추출물을 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물"이 최근 공개되어 있으며, 제10-2011-0003923호(2011-01-13)에는 "알코올성 간질환 및 위궤양의 예방과 개선에 효능이 있는 헛개나무와 알로에 추출물을 이용한 기능성 물질", 제10-2005-0079913호(2005-08-11)에는 "헛개나무 추출물을 포함하는 비만 예방 및 치료를 위한 조성물", 제10-2006-0099225호(2006-09-19)에는 "헛개나무 열매 추출물을 함유하는 항염증제 및 이의 용도", 제10-2004-0099894호(2004-12-02)에는 "간기능 개선효과와 숙취개선효과가 우수한 헛개나무 열매추출물 분말과 혼합유산균을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품조성물" 등이 공개되어 있다. 그러나, 현재까지 헛개나무 추출물 및 이의 활성 분획물들에 의한 강력한 혈액 응고 저해 및 혈소판 응집저해에 따른 항혈전 활성 및 이에 기반한 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 대한 특허는 알려져 있지 않다.

KR 10-2014-0100336 A KR 10-2014-0046150 A KR 10-2005-0079913 A

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 식용 및 약용으로 이용되고 있는 헛개나무의 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 헛개나무는 헛개나무의 잎, 열매 및 줄기로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

상기 헛개나무 추출물은 헛개나무 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

상기 헛개나무 에탄올 추출물은 헛개나무 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득된, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

상기 혈전성 질환은 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 헛개나무 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 헛개나무로부터 추출물을 제조하고, 또한 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어지는 분획물 형태로도 조제되며, 상기 추출물 또는 이의 활성 분획물은 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고 인자 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타내며, 혈소판 응집 저해에 따른 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전성 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 헛개나무 추출물은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈액 응고 인자 저해, 혈전 생성 관련 효소 저해 및 혈소판 응집 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명의 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 유기용매 분획물들의 혈소판 응집 저해 효과를 나타낸 그래프이다. 도면 아래의 숫자는 1: 용매대조구(DMSO), 2: 아스피린 0.50mg/ml, 3: 아스피린 0.25mg/ml, 4: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물 0.25mg/ml, 5: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 헥센 분획물 0.25mg/ml, 6: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 헥센 분획물 0.20mg/ml, 7: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 0.25mg/ml, 8: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 0.20mg/ml, 9: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 부탄올 분획물 0.25mg/ml, 10: 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 물 잔류물 0.25mg/ml를 각각 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 헛개나무를 대상으로 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 수득한 헛개나무 추출물을 회수하였고, 이러한 성분은 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 추출물을 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 헛개나무를 이용하여 혈전성 질환의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 헛개나무의 잎, 줄기 및 열매를 대상으로 이들의 열수 또는 에탄올 등의 유기 용매 추출물과 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제하고, 이들의 항혈전 활성을 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접 저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 평가하였고, 그 결과, 헛개나무 잎의 에탄올 추출물, 열매의 열수 추출물 및 줄기의 에탄올 추출물에서 활성을 확인하였으며, 특히 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물로부터 순차적으로 분획된 유기 용매 분획물인 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서 강력한 트롬빈 및 프로트롬빈 저해활성과 혈액 응고 인자의 특이적 저해활성을 확인하였으며, 인간 혈소판을 이용하여 응집저해를 평가한 결과, 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 헥센 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 항혈소판제로 사용되고 있는 아스피린(상품명: 프로텍트)보다 강력한 응집 저해활성이 나타나며, 부탄올 분획에서 아스피린에 필적하는 양호한 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다. 또한, 상기 활성 분획물은 pH 2의 산처리, 100℃의 열처리 및 혈장 처리시에도 활성의 손실이 나타나지 않음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이와 같은 효과를 보다 구체적으로 확인하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 헛개나무 잎, 열매 및 줄기의 열수 또는 에탄올 추출물과 이의 순차적인 유기 용매 분획물을 제조하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 추출물 및 분획물의 인간 트롬빈 직접 저해 효과, 프로트롬빈 저해 효과, 혈액 응고 인자(VIII 인자, IX 인자, XI 인자 및 XII 인자) 저해에 의한 활성부분 트롬보플라스틴(에이피티) 타임 연장 효과를 평가하여, 본 발명의 헛개나무 잎의 에탄올 추출물에서 인간 트롬빈 직접 저해 효과를 확인하였고, 열매의 열수 추출물 및 줄기의 에탄올 추출물에서 혈액 응고 인자 저해에 의한 활성부분 트롬보 플라스틴 타임 연장 효과를 확인하였으며, 특히, 헛개나무 열매의 열수 추출물 및 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물의 5mg/ml 농도에서 혈액응고인자 저해를 통해 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 15배 이상 연장시키며, 특히 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 2.5mg/ml 농도에서도 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 15배 이상 연장시킴을 확인하였다. 또한, 혈소판 응집저해 평가결과 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물이 양호한 혈소판 응집저해 활성을 나타내며, 특히 이의 헥센 분획물과 에틸아세테이트 분획물의 50% 응집저해농도는 각각 0.229mg/ml 및 0.195mg/ml로, 순수 물질인 항혈전제 아세틸살리실산(아스피린)의 50% 응집저해농도인 0.280mg/ml 보다 낮은 값을 나타내어 매우 강력한 혈소판 응집 저해 활성을 나타냄을 확인하였고, 상기 항혈전 활성 물질이 혈장, 열 및 산 안정성을 조사하여 식품 가공적성 및 안정성이 우수함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 헛개나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 "헛개나무"는 헛개나무 전체, 또는 부분, 예를 들어, 잎, 열매 또는 줄기를 각각 또는 혼합하여 이용할 수 있으며, 잎, 열매 및 줄기로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 부분(들)을 대상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "헛개나무 추출물"은 헛개나무를 수확, 세척한 후, 음건하는 단계, 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수 또는 에탄올 추출이 가장 바람직하다.

본 발명의 활성 성분인 헛개나무 추출물은 추가적인 몇몇 유기 용매 분획물에서 보다 우수한 활성을 나타내는데, 상기 분획물로는 특히 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득된, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 헛개나무 추출물 및 특정 유기 용매 활성 분획은 혈액 응고 인자 및 효소의 활성을 억제하는 우수한 효과를 나타내므로, 이러한 활성 성분들은 특히 항응고제의 용도로서 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해용 조성물을 제공한다.

이러한 혈액 응고 저해용도의 유효 성분으로서의 상기 헛개나무 추출물은 상기 헛개나무 열수 또는 에탄올 추출물, 또는 상기 에탄올 추출물의 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득된, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 헛개나무 추출물의 특정 유기 용매 활성 분획은 강력한 혈소판 응집 저해 활성을 나타내므로, 이러한 활성 성분들은 특히 항혈소판제의 용도로서 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득된, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 조성물을 제공한다.

상기 설명된 약리 활성을 갖는 헛개나무 추출물, 특히 헛개나무 잎의 에탄올 추출물, 열매의 열수 추출물 또는 줄기의 에탄올 추출물, 또는 이의 활성 성분 유기 용매 분획물 또는 이들의 혼합물은 약학적 조성물의 용도 이외에도 상기 설명된 약리 활성을 이용하여 혈전성 질환의 예방과 개선을 목적으로 하는 기능성 식품 소재로서도 개발될 수 있다.

따라서, 본 발명은 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

이하에서는, 본 발명의 헛개나무 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 헛개나무로부터 활성 추출물을 조제하는 단계; 헛개나무 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가 단계 및 안정성 조사 단계를 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "헛개나무 추출물"은 헛개나무를 수확, 세척한 후, 음건하는 단계, 추출 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 추출 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 열수 또는 에탄올을 사용하여 추출하였다.

본 발명에서는, 헛개나무 추출물 및 이의 분획물들을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 헛개나무 잎의 에탄올 추출물에서 무첨가구보다 약 1.9배의 연장된 트롬빈 타임, 열매의 열수 추출물 및 줄기의 에탄올 추출물에서 무첨가구보다 15배 연장된 에이피티 타임을 확인하였고, 분획물 중에서는 줄기의 에탄올 추출물의 헥센 분획 및 물잔류물에서는 항혈전 활성이 나타나지 않는 반면, 에틸아세테이트 분획에서는 4.52배, 1.52배 및 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타냄을 확인하였다. 또한, 부탄올 분획에서도 1.65배, 1.27배 및 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타냄을 확인함으로써 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 강력한 혈액 응고인자 저해를 통한 항혈전 효과가 있음을 증명하였다. 특히, 상기 에틸아세테이트 분획은 농도 의존적인 혈액 응고 저해 효과를 나타내었으며, 6mg/ml 농도에서는 15배, 2.16배 및 15배 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임, 7mg/ml 농도에서 모두 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내어 상업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인하였다. 상업적으로 판매되고 있는 항혈전제인 아스피린(상품명 프로텍트)의 경우 1.5mg/ml농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임이 무첨가구보다 각각 1.39배, 1.86배 및 1.40배 연장됨을 고려할 때, 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은, 기존의 부작용 우려가 높은 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.

한편, 혈전 생성에 있어 가장 중요한 단계는 혈소판 응집에 의한 초기 응집괴(Primary hemostatic plug) 형성이며, 이는 혈관내피에서 노출된 콜라겐과 혈소판의 응집으로 개시되는데, 헛개나무의 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 분획물들을 0.25mg/ml의 농도로 하여 혈소판 응집저해 효과를 평가한 결과, 헥센 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 아스피린보다 수배 강력한 혈소판 응집 저해 활성을 나타내었다.

본 발명의 헛개나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 헛개나무 추출물은 혈전성 질환과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 헛개나무 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 헛개나무 추출물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 헛개나무 추출물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 헛개나무 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 헛개나무 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 헛개나무 추출물 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 헛개나무 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 조제 및 이들의 성분 분석

2014년 11월 강원도 춘천에서 수확한 헛개나무를 수세한 후 탈수하고, 음건한 후, 헛개나무 잎 또는 줄기 중량의 10배의 에탄올(95%, 덕산, 한국)을 가하고 상온에서 24시간 추출한 후, 다시 상기 과정을 2회 반복한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 헛개나무 잎 또는 줄기의 에탄올 추출물을 제조하였다. 이때 줄기의 경우 1회 추출효율은 1.5%, 2회 추출효율은 0.3%로, 3회 추출효율은 0.1% 미만으로 최종 추출효율은 1.9%이었으며, 효율적인 추출은 2회 추출임을 확인하였다. 한편, 헛개나무 열매의 경우 열매 중량의 10배의 열수를 가하여 1 내지 3회 추출하였으며, 추출물을 에탄올 추출물과 동일한 방법으로 분말화하였다. 이후, 회수된 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물은 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다. 이와 같이 제조된 각각의 추출물 및 분획물의 분획효율 및 이들의 성분 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 이때 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

[표 1] 헛개나무 추출물 및 분획물의 성분 분석 (단위: mg /g)

표 1에서 나타낸 바와 같이, 유용 활성 성분인 총폴리페놀의 경우 줄기, 잎, 열매의 순으로 추출되었고, 총플라보노이드의 경우 잎, 줄기, 열매의 순으로 추출되었으며, 총당 및 환원당은 열매, 줄기, 잎의 순서로 추출되었다.

헛개나무 줄기의 분획물은 일반적인 식물 줄기와는 달리, 부탄올 분획물, 물 잔류물, 에틸아세테이트 분획물, 헥센 분획물 순으로 분획율이 높게 나타났으며, 특히 헥센 분획물이 다른 천연물의 분획과는 달리 17.7%를 차지하여 헛개나무 줄기는 상당량의 지용성 오일 성분을 함유하고 있음을 확인하였다. 한편 에틸아세테이트 분획 역시 23.8%를 차지하여 다른 식물체의 줄기들이 일반적으로 2~10% 미만의 분획효율에 비해 2~10배 이상 높은 에틸아세테이트 분획율을 나타내었다.

한편, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과, 헛개나무 줄기 에탄올 추출물은 매우 높은 124mg/g 함량의 폴리페놀 성분을 함유하여, 기존의 보고된 헛개나무 추출물의 강력한 항산화 활성을 이해할 수 있었다. 또한 분획물 중 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물에서는 183.5~172.2mg/g의 매우 높은 함량의 폴리페놀 함량이 확인되었으며, 헥센 분획에서는 4.6mg/g의 상대적으로 낮은 함량의 폴리페놀이 확인되었다. 이러한 현상은 총 플라보노이드 함량 측정에서도 유사하게 나타났으며, 에틸아세테이트 분획에서 26.9mg/g의 높은 함량이 확인되었다. 한편, 총당 및 환원당은 주로 물 잔류물 및 부탄올 분획물에서 높게 나타났으며, 이어 에틸아세테이트 분획, 헥센 분획물 순으로 나타났다. 그러나 헥센 분획에서도 27.5mg/g의 총당이 확인되어, 헥센 분획물은 지용성 오일과 상당량의 당이 함유된 상태임을 알 수 있었다.

실시예 2. 헛개나무 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 혈액응고 저해 활성 평가

실시예 1에서 조제된 추출물과 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 혈액 응고 저해 활성을 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922~928), 그 결과는 표 2에 나타내었다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Hemostasis, MD Pacific, 중국)를 구입하여 사용하였으며, 기타 시약은 Sigma사(USA)의 제품을 사용하였다. 각각의 혈액응고 저해활성 평가법은 다음과 같다.

트롬빈 타임( Thrombin Time )

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time )

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT시간을 용매 대조구의 aPTT시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

[표 2] 헛개나무 추출물 및 분획물의 항혈전 활성

표 2에 나타낸 바와 같이, 대조구로 사용된 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 무첨가구보다 각각 1.39배, 1.86배 및 1.40배 연장시켜 우수한 혈액응고 저해활성을 확인하였다. 헛개나무 잎의 에탄올 추출물은 5mg/ml 농도에서 무첨가구보다 약 1.9배 연장된 트롬빈 타임을 나타내었고, 헛개나무 열매의 열수 추출물은 5mg/ml의 농도에서 무첨가구보다 15배 이상의 연장된 에이피티 타임을 나타내었다. 한편, 헛개나무 줄기의 에탄올 추출물은 5mg/ml 농도에서 무첨가구보다 각각 1.31배, 1.29배 및 15배 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내어 강력한 혈액응고인자 저해에 의한 항혈전 효과를 나타냄을 확인하였다. 분획물 중에서는 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 에탄올 추출물보다 더욱 강력한 항응고 활성이 나타난 바, 상기 분획물은 2.5mg/ml 농도에서도 15배 연장된 에이피티 타임을 나타내었다. 또한, 에틸아세테이트 분획물은 7mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임 측정결과 모두 무첨가구에 비해 15배 이상 연장된 혈액응고시간을 나타내어, 헛개나무 줄기 에틸아세테이트 분획물은 상업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인하였다. 따라서, 본 결과는 식약청에서 식품원료로 인정하여 안정성이 확보된 헛개나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 기존의 부작용 우려가 높은 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.

실시예 3. 헛개나무 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 혈소판 응집 저해활성 평가

실시예 1에서 조제된 추출물과 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 혈소판 응집저해 활성을 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였다(김 등 2014. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 42, 302~306). 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하여 응집괴를 형성한다. 따라서, 혈소판 응집현상은 혈전 생성에 있어 가장 중요한 단계로, 혈관내피에서 노출된 콜라겐과 혈소판의 응집으로 개시되는 혈소판 초기 응집괴(Primary hemostatic plug) 형성 이후 혈액응고인자, 프로트롬빈, 트롬빈의 순차적 반응에 의해 피브리노젠이 피브린으로 전환되면서 비가역적인 혈전이 생성된다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였으며, 반응튜브내의 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 impedance 법을 사용하여 평가하였다. 이때, 강도(amplitude: ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, 기울기(slope)는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, 하강면적(area under)은 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 기울기 곡선의 하강면적을 나타낸다.

혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )

혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1.100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml이 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

[표 3] 헛개나무 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 혈소판 응집 저해활성

표 3에 나타낸 바와 같이, 먼저 임상에서 항혈소판제로 사용되고 있는 아스피린은 농도의존적으로 우수한 혈소판 응집저해 효과를 나타내었으며, 0.25mg/ml 농도에서 53.5%의 응집능, 0.5mg/ml 농도에서 26.4%의 응집능을 나타내어 50% 응집저해에 필요한 농도는 0.280mg/ml로 계산되었다. 한편, 헛개나무 줄기 에탄올 추출물과 분획물의 경우 강력한 혈소판 응집저해는 헥센 분획물과 에틸아세테이트 분획에서 나타났으며, 에탄올 추출물과 부탄올 분획물에서 0.25mg/ml 농도에서 79.9~82.1%의 응집율을 나타내어, 약 18~29%의 응집저해를 나타내었다. 상기의 헥센 분획물의 경우, 0.25mg/ml 농도에서 38.3%의 응집능, 0.20mg/ml 농도에서 66.2%의 응집능을 나타내어 50% 응집에 필요한 농도는 0.229mg/ml로 계산되었다. 상기의 에틸아세테이트 분획물의 경우, 0.25mg/ml 농도에서 26.5%의 응집능, 0.20mg/ml 농도에서 48.0%의 응집능, 0.15mg/ml 농도에서 99%의 응집능을 나타내어 50% 응집에 필요한 농도는 0.195mg/ml로 계산되었다. 특히, 도 1에 나타낸 바와 같이, 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 초기 2분 이내에 응집이 빠르게 진행되지만, 이후 매우 서서히 응집이 나타나거나, 응집이 더 이상 진행되지 않음을 알 수 있다. 이는 헛개나무의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 정제된 상태가 아님에도 불구하고, 상업적으로 사용되는 혈소판 응집저해제인 아스피린보다 적은 양으로도 동일한 혈소판 응집저해를 나타냄을 의미하고 있으며, 상기 분획물 또는 이들의 혼합물이 위장 장해 등의 부작용을 나타내는 아스피린을 대치할 수 있는 항혈소판제로 사용 가능함을 보여주고 있다.

실시예 4. 헛개나무 추출물의 활성 분획의 안정성

상기 실시예 1에서 얻은 헛개나무 줄기 추출물의 헥센 분획물(0.25 mg/ml)을 대상으로 100℃에서 1시간 처리, pH 2(0.01 M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리 이후 혈소판 응집 저해 활성을 평가한 결과, 비처리구에 비해 89~105%의 활성을 나타내어, 혈소판 응집 저해 활성의 감소는 확인되지 않았다. 또한, 실시예 1에서 얻은 헛개나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(5mg/ml)을 대상으로 100℃에서 1시간 처리, pH 2(0.01 M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리 이후, 에이피티 타임을 평가한 결과, 비처리구와 동일한 15배 이상의 연장효과를 나타내어, 열처리, 산처리, 혈장처리에 의한 혈액 응고 저해 활성의 감소는 확인되지 않았다.

Claims (6)

1. 헛개나무(Hovenia dulcis) 줄기 에탄올 추출물의 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 헛개나무(Hovenia dulcis) 줄기 에탄올 추출물의 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 약학적 조성물.
3. 헛개나무(Hovenia dulcis) 줄기 에탄올 추출물의 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
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