KR101627258B1 - 질염의 진단 방법 및 진단 키트 - Google Patents

질염의 진단 방법 및 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 hBD-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 hBD-3 유전자에 대한 프라이머 또는 프로브, 또는 hBD-3 단백질에 대한 항체를 포함하는 질염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 질 상피조직에서 hBD-3 유전자의 발현 수준 증가가 질염의 발병과 상관관계가 있음을 발견한 것에 기초한다. 본 발명의 방법에 의하면 간단하고 저비용의 분자생물학적 검출방법을 통해 대량의 시료에 대해 질염 진단에 관한 신뢰성 있는 정보를 제공할 수 있다.

Description

질염의 진단 방법 및 진단 키트{Method for Diagnosis of Vaginalitis and Kit for the Same}
본 발명은 질염의 진단 방법 및 질염 진단용 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는 질 상피로부터 분리한 생물학적 시료에서 hBD(human β defensin)-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 질염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 hBD-3 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 hBD-3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 질염 진단용 키트에 관한 것이다.
질 상피는 여성 생식 기관을 감염으로부터 보호하는 강력한 선천성 면역시스템을 갖추고 있다. 질의 계층화된 편평상피는 병원성 미생물에 대한 물리적 장벽을 형성하고, 질 감염을 일으키는 다양한 박테리아에 대해 저항을 나타내는 상재성 마이크로플로라 및 산성 환경에 의해 더욱 지탱된다[1]. 질 상피세포의 물리적 장벽 기능이 감염에 대한 보호 기능에서 중요한 역할을 한다는 것은 예전부터 예측되어 왔고, 질 상피세포에 의해 매개되는 항-캔디다(anti-Candida) 활성이 관찰된 것은 질 상피가 선천성 면역에서도 중요한 역할을 한다는 것을 또한 시사한다[2, 3]. 그러나, 병원체에 의해 상피세포가 활성화되는 메카니즘과, 면역 반응에 관련된 수용체 및 매개인자에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
β-디펜신(defensin)은 36-42개 아미노산으로 이루어진 시스테인 풍부 펩타이드로서, 3개의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 안정화된다[4]. 가장 잘 특성이 분석된 3가지 종류의 인간 디펜신인 인간 β디펜신-1(hBD-1), hBD-2, 및 hBD-3는 인간 피부 및 배양된 각질세포에서 검출되었다. hBD-1의 발현은 구성적 발현 양상을 나타내는데 반해, hBD-2 및 hBD-3의 발현은 종양괴사인자-α 및 인터루킨-1β와 같은 사이토카인, 다양한 미생물, 리포폴리사카라이드(LPS), 및 다른 미생물 생성물에 의해 유도되는 양상을 나타낸다[5-7]. β-디펜신이 박테리아를 죽이거나 불활성화시키는 메카니즘은 정확하게 규명되어 있지 않지만, 미생물의 막(membrane)상에 구멍을 형성하여 상기와 같은 작용을 발휘할 것으로 생각되고 있다[8]. 상피 점막 및 대식세포에서 분비되는 내생의 양이온성 항미생물 및 면역조절 펩타이드 패밀리인 hBD가 숙주의 방어기전에서 매우 중요한 구성요소라는 증거가 증가하고 있다[9, 10].
hBD 패밀리는 다수의 구성원으로 구성되어 있다. hBD-1은 구성적 발현 양상을 보이는 반면[11], hBD-2 및 hBD-3의 발현은 박테리아 및/또는 사이토카인에 의한 자극에 의해 유도될 수 있다[12-14]. 다른 hBD들과는 다르게, hBD-3는 염(salt)-의존성 디펜신으로서 다약재내성의 병원내 감염균에 대해서도 항균 활성을 보이는 비교적 광범위한 항미생물 활성을 나타낸다[12-15]. hBD-3가 질 상피세포에 의해 발현되고 질염 발생시에 발현이 더욱 증가되는지에 대해서는 아직 밝혀진 바 없다. hBD-3 발현은 전사인자 NF-κB(nuclear factor-κB) 및 AP-1(activator proitein-1)을 포함하는 조절 네트워크에 의해 조절된다[16-18]. 이들 전사인자들은 JNK mitogen-activated protein kinase (MAPK)를 포함하는 복잡한 신호 전달 경로에 의해 활성화된다[19]. 그러나, 질 상피세포에서의 hBD-3 생성의 조절 메카니즘은 아직 규명되어 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Harder et al., Nature 1997, 387:861. Harder et al., J Biol Chem 2001, 276:5707-5713. Maisetta et al., Antimicrob Agents Chemother 2006, 50:806-809.
본 발명자들은 인간 질 상피 조직이 미생물 등의 질 감염에 대해 어떠한 면역 반응을 나타내는지에 대해 연구하였다. 그 결과, 인간 질 상피세포에서 미생물 감염 조건에서 항균 펩타이드 인간 β-디펜신(Human β defensin, hBD)-3의 발현 수준이 현저히 증가되고, 이의 발현 수준의 증가는 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase)의 활성화를 통해 이루어진다는 것을 실험적으로 규명하였으며, 이러한 실험 결과에 근거하여 질 상피조직에서의 hBD-3 유전자의 발현 수준이 미생물 감염에 의해 발생되는 질염 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 질염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 hBD-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 hBD-3 유전자 발현 측정 요소를 포함하는 질염 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대상자(subject)의 질 상피로부터 분리한 생물학적 시료에서 hBD (human β defensin)-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 질염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 미생물의 감염에 의한 질염의 발병시에 질 상피조직에서 hBD-3 유전자의 발현 수준이 크게 증가한다는 패턴을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 질 상피세포에서 hBD-3 유전자의 발현수준의 증가와 미생물 감염에 의해 발생되는 질염 발병과의 상관성에 기초한다.
본 명세서에서 용어 “대상자(subject)”는 질염을 겪을 것으로 추정되어 질염 여부를 진단하고자 하는 대상자를 의미하며, 바람직하게는 인간(human)을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “생물학적 시료(biological sample)”은 hBD-3 유전자의 발현을 측정할 수 있는 대상자의 세포 또는 조직을 의미하며, 예를 들어, 혈액, 조직, 체액, 오줌 등도 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 “질염" 은 질 기관에서 발생되는 염증성 질환을 의미하며, 상기 질염은 바람직하게는 미생물 감염에 의해 발생되는 질염이며, 보다 바람직하게는 그람-음성 박테리아, 그람-양성 박테리아 또는 진균(fungus) 감염에 의한 질염을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 질염 환자의 질 상피로부터 분리한 시료에서의 hBD-3 유전자 발현 수준이 정상인 질 상피로부터 분리한 시료에서의 hBD-3 유전자 발현수준에 비해 증가되어 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 hBD-3 유전자의 발현 수준의 측정은 hBD-3 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 hBD-3 단백질 발현 수준의 측정을 통해 이루어진다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 hBD-3 유전자의 발현 수준의 측정은 hBD-3 유전자의 mRNA를 RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction)에 의해 증폭하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 hBD-3 단백질의 발현 수준의 측정은 hBD-3 단백질을 면역분석(immunoassay)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서 hBD-3 유전자의 발현 수준을 측정하여 질염 발병 여부를 판단하는 것은 크게 두 가지의 방법, 즉 유전적 분석(genetic analysis) 방법과 면역 분석(immunoassay)방법으로 실시할 수 있다.
유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, hBD-3 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다.
프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 hBD-3 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 hBD-3 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포 또는 조직)에서 hBD-3 mRNA 발현양을 조사하여 hBD-3 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여, 먼저 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시 사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면 본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 hBD-3 유전자의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 hBD-3 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 발명의 프라이머는 hBD-3 유전자의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머는 hBD-3 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
이렇게 증폭된 핵산 분자를 적합한 방법으로 분석하여 hBD-3 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 hBD-3 유전자의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, hBD-3 유전자의 발현이 정상인 질 상피로부터 분리한 시료에서의 발현 수준에 비해 높은 것으로 확인되는 경우에는 질염으로 진단된다.
또한, 본 발명의 방법은 hBD-3 유전자 또는 hBD-3의 cDNA에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 통해 시행할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지(label)는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신, 피코에리트린, 로다민, 리사민, 그리고 Cy3와 Cy5), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, hBD-3 유전자의 cDNA에 혼성화되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀 룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t- NBT(nitroblue tetrazolium)등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
다음으로, 본 발명에서 hBD-3 단백질의 발현 수준은 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 hBD-3 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다. hBD-3 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. hBD-3 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow,E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999;Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차 항체로서 hBD-3 단백질에 대한 항체와 상기 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR, TMB, ABTS, o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT 및 m-PMS와 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 hBD-3 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고, hBD-3 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 표지로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 가지고 있다. 상기 표지는 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35 ), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 표지 및 표지화 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) hBD-3 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) hBD-3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 질염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 질염 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
본 발명에서 질염 진단용 키트가 면역분석방법에 적용되는 경우 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 질염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 hBD-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 hBD-3 유전자에 대한 프라이머 또는 프로브, 또는 hBD-3 단백질에 대한 항체를 포함하는 질염 진단용 키트에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명은 질 상피조직에서 hBD-3 유전자의 발현 수준 증가가 질염의 발병과 상관관계가 있음을 발견한 것에 기초한다.
(ⅲ) 본 발명의 방법에 의하면 간단하고 저비용의 분자생물학적 검출방법을 통해 대량의 시료에 대해 질염 진단에 관한 신뢰성 있는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 질염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 hBD-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 이 방법에 사용되는 질염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 키트에 의하면, 간단하면서도 저비용의 분자생물학적 분석을 통해 질염을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 정보를 제공한다.
도 1은 배양된 인간 질 상피세포에서 TLR (Toll-like receptor) 및 부속 분자들의 발현 결과를 보여준다. 정상의 인간 질 상피세포주 VK2/E6E7에서 공지된 모든 TLR 및 보조분자 MD-2 및 MyD88의 mRNA 발현에 대해 스크리닝하였다.
도 2는 그람-음성 박테리아, 그람-양성 박테리아 및 진균 병원체를 대표하는 미생물 화합물이 질 상피세포에서 인간 β-디펜신-3 (human beta-defensin-3; hBD-3)를 유도한다는 것을 보여준다. 불사멸화된 질 상피세포를 LPS (lipopolysaccharide), PGN (Staphylococcus aureus peptidoglycan) 또는 지모산(zymosan)으로 처리한 후에 hBD-3 mRNA 발현을 반정량적(semiquantitative) RT-PCR로 분석한 결과를 보여준다.
도 3은 LPS, PGN 및 지모산이 VK2/E6E7 세포에서 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 인산화를 유도하는 것을 보여준다.
도 4는 VK2/E6E7 세포내에서 p38 MAPK 억제자 (SB203580)가 LPS, PGN 및 지모산에 의해 유도되는 hBD-3 유전자의 발현을 약화시킨다는 것을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 세포 및 자극
불사멸화된 인간 질 상피세포주 (VK2/E6E7 세포)는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였다. 세포는 5 ng/㎖ 재조합 상피생장인자, 50μg/㎖ 소 뇌하수체 추출물, 항생제/항진균제 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 20 mM L-글루타민(Sigma)이 첨가된 Keratinocyte-SFM (Gibco BRL, Eggstein, Germany) 배지를 사용하여 5％ CO2의 습화된 분위기에서 배양하였다. 배지는 매 2일 마다 교환하였다. LPS (Escherichia coli 026:B6으로부터 정제), PGN (Staphylococcus aureus peptidoglycan) 및 지모산 (Zymosan; Saccharomyces cerevisiae으로부터 정제된 것)는 Sigma사로부터 구입하였다. VK2/E6E7 세포는 LPS (1 μg/ml), PGN (5 μg/ml), 또는 지모산 (10 μg/ml)으로 처리하거나, 또는 미생물 성분이 포함되지 않은 대조군 배지에서 0, 3, 6, 12 또는 24 시간 동안 배양하였다. 지정된 시간 동안 배양한 후에, 세포 및 상층액을 수득하여 추가 분석에 사용하였다.
2. RNA 분리 및 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)
총 세포 RNA는 RNeasy 키트(Qiagen, Seoul, Korea)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. 총 RNA (2μg)를 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. 역전사(RT) 후에, cDNA를 코딩 서열의 일부를 증폭할 수 있도록 디자인된 유전자-특이 프라이머를 사용하여 PCR 방법에 의해 증폭하였다(하기 표 1 참조). PCR은 94℃에서 10분간 변성 1사이클; 94℃에서 1분, 48-55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분을 18-35 사이클; 72℃에서 10분간 최종 연장으로 구성하여 행하였다. 각 샘플에 대해 동일한 양의 cDNA가 사용되었다는 점을 확인하기 위해 β-액틴을 증폭하였으며, 모든 실험은 2회 중복하여 행하였다. TLR 6를 제외하고 모든 TLR들을 발현하는 정상 인간 단핵세포인 THP-1으로부터 준비한 주형 cDNA을 VK2/E6E7 세포에서 TLR mRNA를 검출하는데 있어서 양성 대조군으로서 사용하였다. 증폭된 모든 유전자들의 정체를 확인하기 위해 모든 양성 PCR 산물에 대해 서열분석을 행하였다(Macrogen, Seoul, Korea).
Figure 112012049024781-pat00001
3. 면역 블로팅
1.5％ SDS, 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1％ 2-머르캅토에탄올, 1μg/mL의 안티페인 디하이드로클로라이드, 1μg/mL 키모스타틴, 및 1μg/mL 루펩틴(상기 모든 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입함)으로 제조한 용해 완충액을 사용하여 VK2/E6E7 세포의 총 단백질 추출물을 얻었다. 세포 용해물을 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하여 -80℃에서 보관하였다. 상피세포 용해물의 구성 단백질들을 10％ 분리젤상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)상에 옮겼다. 웰에 동일한 양의 단백질을 로딩한 것을 입증하기 위해 젤 및 니트로셀룰로오스 멤브레인을 각각 Coomassie Brilliant Blue (Sigma사) 및 Ponceau S (Sigma사)을 사용하여 염색하였다. 멤브레인을 0.05％ Tween 20 (Sigma) 및 3％ 탈지유(Sigma)을 포함하는 TBS(150 mM NaCl, 25 mM Tris [pH 7.4])내에 실온에서 2시간 동안 두어 블로킹하고, 1차 항체(토끼-항-phospho-p38 MAPK 및 토끼 항-β-액틴) (Cell Signaling Technology, Inc, Danvers, MA, USA)을 1:1000 희석하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 2차 항체로는 블로킹 완충액에 1:10000 비율로 희석한 HRP (horse radish peroxidase) 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG (Cell Signaling Technology)를 사용하여 멤브레인과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯에 대하여 Enhanced Chemiluminescence (GE Health-Care, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 시각화하였다.
4. 면역세포화학
VK2/E6E7 세포를 유리 커버슬립상에서 성장시키고, 0.1％ Triton X-100으로 실온에서 20분간 처리하여 세포의 투과성을 높였다. 세포를 3％ BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich)으로 2시간 동안 처리하여 항체의 비특이적 결합을 차단하고, hBD-3에 대한 항체 (6 μg/ml; AF4435; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후에 FITC-컨쥬게이트된 항-염소 IgG(1:400 희석; F7367; Sigma-Aldrich)을 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, DNA를 프로피디움 요오드(Sigma-Aldrich)를 사용하여 대비염색하였다. 커버슬립을 Fluorescence Mounting Medium (DAKO, Carpentaria, CA, USA)을 사용하여 마운팅하였다. 형광은 공초점 레이져 현미경(Zeiss LSM 510, Oberkochen, Germany)을 사용하여 검출하였다.
실험 결과
1. 정상 인간 질 상피 세포는 다수의 TLR들과 보조분자들을 발현하였다
불사멸화된 정상 인간 질 세포주인 VK2/E6E7 세포내에서, TLR mRNA 발현 및 보조분자 MD-2 및 MyD88의 발현을 RT-PCR을 통해 평가하였다. TLR6을 제외한 모든 알려진 TLR 분자를 발현하는 인간 단핵세포주 THP-1 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 실험결과, VK2/E6E7 세포에서 TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR9의 mRNA가 검출되었다(도 1 참조). 이미 보고된 바와 동일하게[20], TLR2 및 TLR4 mRNA가 VK2/E6E7 세포내에서 확인되었다(도 1 참조).
2. 미생물 성분들이 VK2/E6E7 세포에서 hBD-3 생성을 유도하였다
TLR들은 숙주의 선천적 방어 기작 및 감염 과정 동안에 적응성 면역반응 개시에 있어서 필요한 필수 요소이다[21-23]. 질 상피세포에서 다수의 TLR들이 발현되는 것이 어떠한 생물학적 타당성을 갖는 지에 대해 평가하기 위해, 그람-음성 박테리아, 그람-양성 박테리아 및 진균을 각각 대표하는 미생물 유래 화합물이 항미생물 펩타이드 hBD-2 및 hBD-3의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. RT-PCR 실험 결과, LPS (lipopolysaccharide) 및 PGN (Staphylococcus aureus peptidoglycan), Zymosan (Saccharomyces cerevisiae)으로 VK2/E6E7 세포를 자극한 후 3, 6, 12, 및 24 시간 시점에서 측정한 결과, hBD-3 mRNA 발현이 강력하게 촉진되는 효과를 보여주었다(도 2 참조). hBD-2 발현은 LPS 및 PGN 처리에 의해 현저하게 증가하는 것으로 나타났으나, 지모산(zymosan) 처리에 의해서는 증가하지 않았는데, 이러한 결과는 이전에 보고된 결과와 일치한다[20](도 2 참조).
3. 미생물 유래 화합물은 VK2/E6E7 세포내에서 p38 MAPK 활성화를 유도하였다.
다양한 세포에서 세포 표면 수용체 매개 신호전달에 의해 MAPK가 활성화된다. 본 발명자들은 MAPK 억제 실험을 통해 VK2/E6E7 세포내에서 hBD-3의 유도에 미치는 MAPK의 역할을 조사하였다. VK2/E6E7 세포내에서 LPS-유도, PGN-유도, 및 지모산(zymosan)-유도된 hBD-3 발현이 p38 MAPK를 통해 이루어지는 지를 평가하기 위해, VK2/E6E7 세포에서 p38 MAPK의 특이 억제자인 20μM의 SB203580를 LPS, PGN, 또는 지모산(zymosan)과 함께 도입시켰다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, p38 MAPK를 억제한 경우, hBD-3 mRNA 발현 및 단백질 생성이 감소하였다(도 3 참조). 인산화-p38 MAPK 단백질을 검출함으로써 p38 MAPK의 활성화를 확인하였다(도 4 참조).
고찰
여성 생식 기관의 조직은 매우 다양한 많은 수의 감염체에 노출되어 있기 때문에, 질 감염은 자주 발생된다[24]. 대부분의 경우에 있어서 질염은 캔디다(Candida sp.)와 같은 효모 또는 그람-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아에 의해 발생된다. 박테리아 질염(bacterial vaginosis)은 모든 질 감염증의 약 60％를 차지하고, 부인과 질환에 의한 사망, 불임, 자궁외 임신 및 조기진통의 중요한 원인이 되고 있다[25-27]. 박테리아 질염을 가진 여성은 생식기관에 손상을 주어 불임을 유발할 수 있는 수축성 골반내 염증질환에 걸릴 위험도 훨씬 높다[25]. 점막 표면의 상피 세포는 병원체와 최초로 접촉하는 부분이기 때문에, 본 발명자들은 VK2/E6E7 질 상피 세포주에서 그람-음성, 그람-양성 및 진균으로부터 유래한 미생물 화합물에 반응하여 항-미생물 펩타이드가 생성되는지에 대해 전반적으로 조사하였다. 실험결과, 인간 질 상피 세포에서 다수의 TLR 분자들이 발현된다는 것을 확인하였으며, 미생물 화합물들이 질 상피세포에서 p38 MAPK를 활성화시킨다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (8)

  1. 대상자(subject)의 질 상피로부터 분리한 생물학적 시료에서 hBD (human β defensin)-3 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 질염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 질염은 그람-양성(Gram-positive) 박테리아, 그람-음성(Gram-negative) 박테리아, 또는 진균(fungi)의 감염에 의한 질염인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 hBD-3 유전자의 발현 수준의 측정은 hBD-3 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 hBD-3 단백질 발현 수준의 측정인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 hBD-3 유전자의 발현 수준의 측정은 hBD-3 유전자의 mRNA를 RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction)에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 hBD-3 단백질의 발현 수준의 측정은 hBD-3 단백질을 면역분석(immunoassay)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 질염 환자의 질 상피로부터 분리한 시료에서의 hBD-3 유전자 발현 수준이 정상인 질 상피로부터 분리한 시료에서의 hBD-3 유전자 발현수준에 비해 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) hBD (human β defensin)-3 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) hBD-3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 질염 진단용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 질염은 그람-양성(Gram-positive) 박테리아, 그람-음성(Gram-negative) 박테리아, 또는 진균(fungi)의 감염에 의한 질염인 것을 특징으로 하는 키트.
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