KR101611508B1 - 병원체에 대해 내성인 굴을 얻는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 병원체에 대하여 내성인 굴을 얻는 방법 및 이렇게 얻은 굴에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 상기 병원체에 대하여 내성인 지중해 오스트리아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴 및 반대 성의 비내성 굴을 하이브리드화하는 것을 포함한다. 본 발명은 특히 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)와 같은 병원체에 대하여 내성인 양식 굴의 상업적 생산에 유용하다.
Description
본 발명은 병원체에 대해 내성인 굴을 얻는 방법 및 이렇게 얻어진 굴에 관한 것이다.
본 발명은 특히 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Marteilia Refringens)와 같은 병원체에 내성인 양식 굴의 시판 제품에 적용된다.
이하의 설명에서, 괄호([]) 안의 참고 문헌에 대해서는 실시예 뒤에 나타낸 참고 문헌 목록을 참조한다.
납작굴(flat oyster)인 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis)는 미국 및 캐나다에서도 재배되지만 유럽에서 가장 많이 재배되는 굴의 일종이다.
70년대 내지 80년대에, 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens) 및 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 기생충의 출현으로 굴 생산이 크게 감소되어, 굴 양식업자들은 이들 기생충을 박멸하기 위한 수단을 찾아야 했다.
굴의 감염을 제한하기 위한 몇가지 조치가 강구되었다. 이들 조치 중의 하나는 한 배양장(hatchery)에서 다른 배양장으로의 굴의 이동을 제한하고 한 지역에서 다른 지역으로의 스팻 굴(spat oyster)의 이동을 제한하는 것이었다.
또다른 조치는 기생충 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae)에 대해 내성인 굴을 선택하는 것이었다[Naciri-Graven 등 (1998) "기생충 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 감염시의 생존을 위해 납작굴 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis)(L.)를 선택하는 것(Selecting the flat oyster Ostrea edulis (L.) for survival when infected with the parasite Bonamia ostreae)" J.Exp. Mar Biol. Ecol., 224: 91-107 [1]]. 이들 선택은 상기 기생충에 대해 잘 견디지만 비내성인 굴을 미리 유입시켜 굴의 근친 교배의 유해성 증가 및 재배된 굴의 유전적 다양성의 약화를 야기하였다[N. Taris 등 "양식장에서 굴 유생(larva) 생산의 유전자적 영향: 유도 및 선택의 과정에 대한 연구", Les actes du BRG, 6 (2006) 521-541. [2]].
대서양에서 유래하는 민감한 스팻 굴을 이용하여 비감염 굴의 양식 지역을 밝히기 위하여 여러 연구들이 이루어졌다. 코르시카 다이아나 연못에서 80년대에 행해진 이들 연구 중 하나는, 수경 제품 및 동물의 시판을 규제하는 위생 경찰의 조건에 대한 유럽 의회 91/67/CEE에 따라 IFREMER 제의에 의거 이 연못을 감염 지역으로 분류하였다. 전체 코르시카 지방을 포함하는 지역 I은 보나미아 감염증 및 마르테일리아 감염증이 배제되지 않은 지역으로 분류된다.
여러 연구들에 의하여, 기생충에 의하여 감염된 지역의 지도화(mapping)가 확립될 수 있었고 기생충에 대한 내성은 증가되나 유전적 다양성은 약화된 굴 지역에 의한 선별화가 이루어질 수 있었다.
이들 연구 중 어떤 것도 기생충에 내성인 굴을 생산할 수 없었다
따라서, 병원체에 대해 내성인 굴을 얻어 상기 종래 기술의 결점, 단점 및 곤란들을 해결할 수 있고 감소된 비용으로 공업적 생산을 조절할 수 있는 방법이 절실히 필요하다. 이러한 방법은 또한 쉽게 실시될 수 있어야 한다.
본 발명은 정확하게는 병원체에 대하여 내성인 굴을 얻는 방법을 제공함으로써 상기 문제점 및 필요성을 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 방법은 병원체에 대하여 내성인 지중해의 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴을 비내성인 굴과 하이브리드화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의하여 수득될 수 있는, 병원체에 대하여 내성인 굴에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, "내성인 굴"이란 병원체에 대하여 내성인 임의의 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis)를 의미한다. 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴은 지중해 기원의 모든 야생 내성 굴일 수 있다. 예컨대, 모든 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴은 예컨대, 발생 기원적 선택 압력을 경험하지 않고 예컨대 양식 및/또는 대서양 유래의 재배 균주(strain)의 이식으로 인한 유전적 오염도 경험하지 않은 지중해의 모든 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴이다. 굴의 대서양 기원은 알로자임(allozyme) 마커, 부수체(microsatellite) 마커[Launey S 등, "부수체 다형 현상에 의하여 드러난 바와 같은 유럽 납작굴(Ostrea edulis L.)의 지리적 구조" J Hered. 9월-10월 2002; 93(5): 331-51. (2002)[3]], 또는 RNA 서열에 의한 균주의 분자 분석에 의하여 확인될 수 있다. 예컨대, 균주의 대서양 기원을 입증하기 위하여 이용될 수 있는 분자 마커는 과학 문헌[Diaz-Almela 등, "유럽 납작굴(Ostrea edulis)에서 암컷 유전자 흐름 감소" J Hered. 2004 11월-12월; 95(6): 510-6. (2004)[4]]에 제시된 바와 같이 균주의 미토콘드리아 유전자 12s-rRNA의 313 염기쌍의 서열에 상응한다.
내성 굴은, 하이브리드화 방법에 가장 잘 적응된, 성장 및 상태 지수, 즉 총 중량에 대한 식용 육질의 비가 동물 기술적(zootechnical) 품질을 제공하도록 선택되는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대 상기 비율은 0.10 내지 0.20, 바람직하게는 0.15 초과이다. 상기 측정은 한 세대 군에서 가장 크고, 적응된 껍질 형상을 가지는, 즉 하부 쌍각이 볼록한 굴에 대하여 실시될 수 있다. 내성 굴은 예컨대 코르시카 굴에 대하여 중량이 80 g 미만인 첫 성숙한 어린 굴 중에서 선택될 수 있는데, 가장 큰 굴은 껍질의 더 큰 부분을 생성하는 경향이 있다. 이들 중에서 평균 직경에 대한 두께의 비[(길이+너비)/2]로서 정의되는 볼록도가 0.33을 초과하는 것들이 바람직할 수 있다.
내성 굴은 길이, 중량 등과 같은 표현형 특징에 따라 선택될 수 있다. 예컨대, 60 mm 초과의 직경을 갖는 지중해의 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴이 바람직하게 선택될 수 있다.
내성 굴은 또한 그 지역 분포에 따라 자연적인 성장 환경에서 선택될 수 있다. 예컨대, 유리형 굴, 침적물 표면에 살포된 굴 및 자연적 환경에서 암석 입자에 부착된 굴 중에서, 유리형이 양식에 더 적응된 특징을 나타내므로 바람직하다.
자연적 장소에서 굴의 채취 지역은 바람직하게는 가장 큰 군집을 포함하는 지역, 즉 큰 생산성을 갖는 지역이다. 유리형은 이동성 침적물을 점유하므로, 굴은 예컨대 m2당 1개 이상의 개체, 바람직하게는 m2당 2개 이상의 개체의 밀도를 갖는 군집에서 선택될 수 있다.
내성 오스트레아 에둘리스 굴은 지중해의 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴, 예컨대 코르시카의 석호(lagoon), 모로코의 나도르, 튀니지의 가베스, 리비아, 그리스, 스페인의 메노해 무르시아, 터키 보스포로스의 에게 지방, 발레리아 군도의 미노르, 우크라이나 세바스토폴, 러시아해 및/또는 발틱해에서 유래하는 굴에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명 방법의 실시를 위해, 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴은 다이아나 연못, 우르비노 연못, 포르토 베치오 만, 산타 만자 만 및 사르네뉴 석호의 야생 코르시카 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴을 포함하는 군에서 선택된다. 바람직하게는 본 발명 방법의 실시를 위하여, 선택되는 내성 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴은 다이아나 연못에서 유래하는 야생 코르시카 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴이다.
본 발명에 따르면, 지중해의 내성 굴은 지중해의 고대 지층에서 유래하는 굴일 수 있다. 상기 굴은 바람직하게는 이식 또는 양식으로 인한 외부의 유전적 영향을 경험하지 않은 야생 납작굴 및/또는 지리적으로 제한된 지중해 석호에서 유래하는 굴이다. 지중해의 석호에 오랫동안 정착된 야생 군집은 이들의 생활 환경, 특히 온도 범위, 염도 변화, 배지의 산소화, 배지의 영양 품질 및 조수 그리고 천연 지층의 수면 위로의 상승에 대해 가능한 내성과 밀접한 특정 적응 자질 변화에 적절한 유전자형, 표현형 및 동물 기술적 특징을 보유한다. 예컨대, 모로코 나도르 석호의 천연 굴 층은 수 시간 동안 높은 조수를 피하며 죽지 않고 그 지역의 아열대성 일조를 견딜 수 있다. 비내성 굴은 본 발명 방법의 실시를 위하여, 예컨대 대서양 해안에서의 양식에 적응된 하이브리드를 얻기 위하여 나도드의 굴일 수 있다.
그러나, 영양 공급이 낮고 개방된 생활 환경에서 유래하는 지중해 내성 균주는 일반적으로 하이브리드화를 위한 품질에 매우 바람직하지 않은 공통의 적응 특성을 가진다. 이것은 그리스 섬 시클라드 제도, 크로아티아, 칼라브리아, 시실 및 까마르그(포트-쌩-루이-뒤-론)에서 유래하는 내성 균주의 경우이다.
굴의 대서양 기원은 예컨대 상기 개시한 바와 같은 알로자임(allozyme) 마커, 부수체 마커[3] 또는 RNA 서열[4]에 의한 균주의 분자 분석에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명에 따르면, 선택되는 내성 굴은 하이브리드화에 적당한 탄수화물 저장 수준을 보유한다. 글리코겐으로 구성된 이러한 저장 물질은 생식선을 발달시키고 생식 세포를 생성할 수 있는 "지방분"을 굴에게 점차 부여할 것이다. 이러한 저장 물질은 생식 세포의 생성을 위한 봄철에 그리고 배우자 형성 동안 이동될 수 있는데; 이렇게 부모의 영양이 수정 및 보충을 결정한다. 탄수화물 저장 물질은 굴의 완전한 수정의 발현 및 본 발명 방법의 실시를 촉진할 수 있다.
본 발명에 따르면, 내성 굴인 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis)는 바람직하게는 생식 세대, 바람직하게는 제1 생식 세대에서 선택하는 것이 바람직하다. 제1 생식 세대에서 굴을 선택하면 하이브리드화의 실현을 위한 최대 생식 세포 생존율을 보장하는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 따르면, "비내성인 굴"이란 기원, 속 또는 종과 무관하게 병원체에 대하여 취약한 임의의 민감한 굴을 의미한다. 병원체에 대한 굴의 비내성인 굴의 생물학적 기능의 임의의 변화에 의하여 나타나 예컨대 굴의 성장을 변화, 감소 또는 정지시킬 수 있다. 병원체에 대한 비내성은 또한 굴의 사멸을 유발할 수도 있다. 보나미아 감염증(bonamiosis)의 경우, 감염의 첫 징후는 종종 성장의 지연, 아가미의 병변, 패각의 벌어짐 후에 일어나고, 일반적으로 첫 성적 성숙으로부터 나타나 높은 사망율이 동반된다. 소위 "포구병"인 마르테일리아 감염증(marteiliosis)의 경우, 이하의 임상적 증상이 포구 및 물가에서의 양식에서 나타난 후 많이 죽는다: 글리코겐 저장의 약화 및 소모, 소화샘(digestive gland)의 완전한 탈색, 영양 섭취 중단 및 굴의 약화.
또 다른 용어로, 비내성 굴은 양식 굴의 병원체에 민감한 임의의 굴일 수 있다. 예컨대 굴과의 쌍각류 굴일 수 있다.
예컨대, 비내성 굴은 굴의 1형 헤르페스 바이러스["굴 헤르페스 바이러스-1 (OsHV-1)"]에 민감한 굴일 수 있다.
예컨대, 비내성 굴은 독, 오염물 또는 배지의 물리화학적 인자와 같은 환경 인자의 변화로 인하여 면역 방어력이 약화된 굴일 수 있다(Gagnaire B., 2005) [10]
예컨대, 비내성 굴은 배양장의 선택 압력 또는 실제 양식의 결과 유전자 변화에 의하여 감염성 물질에 민감하게 된 굴일 수도 있다(Taris N., 2007) [15].
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법으로 하이브리드화될 수 있는 비내성 굴은 자연적 포획 또는 배양으로 얻은 야생 굴, 양식 굴, 천연 굴의 균주, 지중해 자생 굴 및 지중해 외부 기원 굴에서 선택될 수 있다. 예컨대 비내성 굴은 대서양 굴, 태평양 굴 및/또는 인도양 굴일 수 있다.
본 발명에 따르면, 비내성 굴은 예컨대 대서양, 태평양 및/또는 인도양의 오염된 및/또는 민감한 굴의 운송에 의하여 오염되거나 또는 실제 굴 양식에 의하여 퇴화된 지중해 굴일 수 있다.
본 발명에 따르면, 비내성 굴은 내성 굴인 오스트레아 에둘리스와 동일하거나 또는 상이한 속 또는 종일 수 있다. 예컨대 이것은 납작굴 또는 포르투갈굴일 수 있다. 예컨대, 본 발명에 사용될 수 있는 비내성 굴 종은 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis), 오스트레아 안가시(Ostrea angasi), 오스트레아 콘카필라(Ostrea conchaphila), 오스트레아 루리다(Ostrea lurida), 오스트레아 덴셀아멜로사(Ostrea denselamellosa), 오스트레아 푸엘카나(Ostrea puelchana), 오스트레아 폴리움(Ostrea folium), 오스트레아 페르몰리스(Ostrea permollis), 오스트레아 스텐티나(Ostrea stentina), 티오스트레아 킬렌시스(Tiostrea chilensis), 크라스오스테라 비르기니카(Crassostera virginica), 크라스오스트레아 가사르(Crassostrea gasar) 및 크라스오스트레아 리조포라이(Crassostrea Rhizophorae) 등과 같은 속 및/또는 종에 속할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
비내성 굴은 예컨대 서아프리카의 홍수, 하구 및 맹그로브의 굴 크라스오스트레아 가사르(Crassostrea gasar), 홍수, 인도-퍼시픽(indo-Pacific)의 크라스오스트레아 리조포라이(Crassostrea Rhizophorae)를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
비내성 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴은 예컨대 타우 연목의 납작굴 "부지그", 베니스 석호의 굴: 베니스 납작굴, 아르카콘, 샤랑뜨 및/또는 방데 해안에서 유래하는 "그라베트", 남브르타뉴의 납작굴, 아베르 및 모르비한 만에서 유래하는 "블롱", 북 브르타늄 및 노르망디에서 유래하는 "깡깔", 스페인의 갈리시아에서 유래하는 굴, 포르투갈에서 유래하는 굴, 그랜드 브르타늄 드 꼬르누아이의 굴, 남아일랜드 및 북아일랜드의 굴, 네덜란드의 굴, 덴마크의 굴, 플로리다에서 퀘벡까지 서대서양의 미국 및 캐나다의 굴, 미국 및 캐나다의 해안에서 유래하는 동태평양의 굴, 캘리포니아에서 알라스카까지의 해안의 굴을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명 방법의 실시를 위한 비내성 굴은 감염되거나 또는 감염되지 않을 수 있고, 병원체에 대하여 잘 견디거나 잘 견디지 않을 수 있다. 상기 굴은 이들이 갖는 병원체가 발현되기 전 처음으로 번식될 수 있을 때 잘 견딘다고 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명 방법의 실시를 위해, 지중해의 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴 및 비내성 굴은 비번식기 후에 선택하는 것이 바람직하다. 상기 비번식기는 보통 겨울이다. 상기 내성 굴 및 비내성 굴은 예컨대 성장 광주기(phytoperiod)에서 예컨대 배양 탱크에서 하이브리드화를 위해 상태 조절(conditioning)하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 굴은 병원체에 대한 내성 또는 비내성 특징에 따라 개별적으로 표지될 수 있다. 상기 표지는 당업자에게 공지된 임의의 수단 중 하나에 의하여, 예컨대 난절법(scarification)에 의하여 또는 에폭시 접착제를 예로 들 수 있는 접착제로 라벨을 고정시킴으로서, 실시될 수 있다. 이러한 굴의 개별적 표지는 스팻 굴 하이브리드의 균질한 배치(batch) 구성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 하이브리드화에 사용되는 굴은 반대 성이다. 오스트레아(Ostrea) 속의 납작굴은 순화적(rhythmic)이고 연속적인 성을 갖는 비동기 쌍각류(asynchronous bivalve)이다. 일반적으로, 굴은 동일한 시기에 여러 번 성을 바꿀 수 있어, 남성 및 여성 계통이 동시에 공존하므로 성 구별이 곤란하다. 오스트레아(Ostrea) 속에 결부된 이러한 특이적 번식 방식은 대량 번식의 경우 유전적 동일성 조절을 방해한다. 따라서, 오스트레아(Ostrea) 속의 내성 굴 및 비내성 굴과 관련된 하이브리드화의 경우 굴을 둘씩 분리시키는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 굴을 둘씩 분리시키는 것이 바람직하다. 이론적으로, 분리된 각각의 굴 쌍은 둘이 수컷-암컷 쌍을 형성하는 기회를 한 번만 가져야 한다. 쌍의 70∼80%에서 수정이 이루어지는 것이 본 발명에 있어 유리하다. 실제로, 가장 이른 굴의 성숙은 두 번째 굴의 성의 반전을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하여 수득되는 하이브리드화의 수는 이론적으로 추정되는 수보다 크다.
굴은 대체로 에우리테르무스(eurythermus) 및 에우리할린스(euryhalins)이다. 이들의 잘 견딤은 생식 세포의 방출 및 성숙의 동조화(synchronization) 및 하나의 지리적 환경에서 유래하는 두 굴의 하이브리드화를 용이하게 한다.
본 발명에 따르면, 병원체는 박테리아, 기생충 및 바이러스를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, "병원체"란 단독 병원체 또는 복수의 병원체 또는 단독으로 또는 또 다른 물질과 조합하여 박테리아성, 바이러스성, 기생충 질병 또는 상기와 관련된 질병을 유발하는 병원체를 의미한다.
본 발명에 따르면, 병원체는 하플로스포르디아(Haplosporidia), 원생동물(protozoa), 마르테일리아(Marteilia), 기생충 및 굴의 체액 및/또는 세포 면역의 일반적인 메커니즘에 영향을 주는 외부 오염 물질을 포함하는 군에서 선택될 수 있고, 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)를 예로 들 수 있다.
본 발명에 따르면, 병원체는 예컨대 보나미아(Bonamia) 감염증, 마르테일리아(Marteilia) 감염증, 하플로스포리디움(Haplosporidium) 감염증, 미크로사이토스(microcytos) 감염증, 페르킨수스(Perkinsus) 감염증 및/또는 이리도 바이러스 감염증과 같은 질병의 원인일 수 있고, 바람직하게는 병원체는 보나미아 감염증 및/또는 마르테일리아 감염증의 원인이다.
본 발명에 따르면, 상기 병원체는 예컨대 배양 배지의 온도의 상승 및/또는 굴의 1형 헤르페스 바이러스(OsHV-1) 및 예컨대 노카르디아 크라스오스트레아이(Nocardia crassostreae)와 같은 기회 감염성(opportunistic) 물질과 관련된 여름철의 사망과 같은 대량적이거나 또는 반복적인 사망 증후군 또는 수역(epizooties)의 원인일 수 있다. 경제적으로 주목되는 연체동물에서 개시된 이들 병원체 및/또는 기회 감염성 물질은 "상업적으로 이용되는 조개류의 감염성 질병 및 기생충에 대한 개요(Synopsis off Infectious Diseases and Pests off Commercially Exploited Shellfish)"(Bower and Al, 1994)[13], (Bower & McGIaddery, 2003) [14]에 나와 있다.
본 발명 방법의 실시 수단이 이하에 개시된다.
본 발명에 따르면, 하이브리드화는 굴의 하이브리드화를 실시할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 탱크에서 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 탱크는 배양통, 수족관, 임의의 탱크, 트레이, 유리, 목재, 금속, 합성 물질 또는 석재로 제조된 통 또는 용기, 또는 임의의 적당한 용기일 수 있다. 본 발명 방법의 실시에 이용되는 탱크의 부피는 예컨대 1∼100 리터, 바람직하게는 5∼20 리터의 부피일 수 있다.
본 발명에 따르면, 탱크는 물의 산소화 수단을 포함할 수 있다. 예컨대, 물은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의하여, 예컨대 탱크의 물에 공기를 배출할 수 있는 펌프에 의하여 산소화될 수 있다. 산소화는 또한 물 순환 장치에서 실시될 수도 있다. 물의 산소화 유량은 바람직하게는 본 발명에 요구되는 온도 및 염도의 수준과 무관하게 용존 산소로 수중 배지를 포화시키도록 하이브리드화의 실시에 걸쳐 맞추어질 수 있다. 산소 농도는 5 mg/l 내지 11 mg/l, 바람직하게는 6.5 mg/l 초과일 수 있다. 본 발명에 따르면, 하이브리드화될 굴을 포함하는 탱크를 예컨대 미리 물로 채우고 물 순환 장치에 의하여 연속적 또는 비연속적으로 공급할 수 있다. 물의 순환 유량은 0 l/h 내지 100 l/h, 바람직하게는 5 l/h 내지 20 l/h일 수 있다. 상기 유량은 굴 및 유생의 호흡 및 사육의 필요에 따라 조절될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 물 순환 장치는 탱크별로 분리되어 있을 수 있다. 물 순환 장치를 분리하면 특히 하이브리드화할 굴에 대한 외부의 영향을 회피하고 유생 하이브리드의 순도를 보장할 수 있다. 이러한 분리는 예컨대 원치 않는 유전자 오염물의 하이브리드 생성을 방지할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 사용되는 물은 하이브리드화의 실시에 맞춘 임의의 물일 수 있다. 본 발명의 실시에 맞춰진 물은, 예컨대 내성 굴의 환경 및/또는 비내성 굴의 원래 환경과 동일하거나 중간적이거나 상이한, 예컨대 염도, pH, 온도 등과 같은 물리화학적 특성을 갖는 물일 수 있다.
본 발명에 따르면, 물은 본 발명 방법의 단계에 따라 상이한 조성을 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, 사용되는 물은 3 ‰ 내지 50 ‰, 바람직하게는 12 ‰ 내지 38 ‰ 범위의 염도를 가질 수 있다. 물의 pH는 6.5 내지 9, 바람직하게는 7 내지 8.5 범위일 수 있다. 물의 온도는 -8℃ 내지 +55℃, 바람직하게는 12℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 실시를 위한 영양 공급물은 굴의 배양 및/또는 굴의 하이브리드화를 위해 당업자에게 공지된 임의의 영양 공급원으로 구성될 수 있다. 상기 영양 공급물은 예컨대 단세포 조류(unicellular algae), 식물 플랑크톤, 저서성(benthic) 박테리아, 미립자 식품, 복합 식품, 당, 단백질, 비타민 등과 같은 용해된 유기물의 공급물 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있다.
식물 플랑크톤, 저서성 박테리아 및 단세포 조류는 자연적인 굴 성장 환경 및/또는 배양장에서 유래할 수 있다. 미소 입자는 예컨대 유기 찌꺼기 및/또는 수경 재배 폐기물에서 유래할 수 있는 천연 또는 인공 기원일 수 있다.
단세포 조류 및/또는 식물 플랑크톤은 예컨대 원심분리에 의하여 냉동 페이스트의 형태로 농축될 수 있으며, 미립자 식품은 예컨대 현탁액 및/또는 유액(emulsion)일 수 있고, 복합 식품은 예컨대 임의로 압출된, 규격화된 또는 미세캡슐로 된, 탄수화물 및/또는 지방 및/또는 단백질 물질을 포함시킨 건조 식품 또는 수화된 식품일 수 있다.
배양장에서 및/또는 천연 환경에서 재배되는 단세포 조류는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum), 파블로바 루테리(Pavlova lutheri), 카이토세로스 칼시트란스(Chaetoceros calcitrans), 테트라셀미스 에스피(Tetraselmis sp.) 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 예컨대, 식물 플랑크톤은 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 파블로바 루테리(Pavlova lutheri), 카이토세로스 포르마 푸밀룸(Chaetoceros forma pumilum) 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 사용되는 식물 플랑크톤 및 단세포 조류의 양 및 품질은 본 발명 방법의 실시에 맞추는 것이 바람직하다. 영양소는 부모의 생식력 및 유생 및 하이브리드 굴의 성공적인 수확에 중요한 요소이다.
본 발명에서, "하이브리드화(hybridization)"는 상기 설명한 바와 같이 적어도 내성 굴 및 비내성 굴 간의 하이브리드화의 실현을 가능하게 하는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 의미한다. 하이브리드화는 또한 문헌[Lannan J. E의 논문, 1971, "저온 보관 정자를 이용한 태평양 굴 크라스오스트레아 기가스의 실험적 자가 수정(Experimental self-fertilization of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, utilising cryopreserved sperm)", Genetics, 68: 599-601 [5], Bougrier and Rabedomanana, 1986. "일본 굴 크라스오스트레아 기가스의 정자의 저온 보관(Cryopreservation of spermatozoa of the Japanese oyster, Crassostreea gigas", Aquaculture, 58: 277-280 [6]]에 따른 정자의 저온 저장 기술에 의하여, 또는 문헌[Haffray 등, "SYSAAF 범위 내에서 어류 양식 생물의 유전자 개선 및 국산화", INRA Prod. Anim., 2004, 17 (3), 243-252 [7]]에 따른 생식 세포의 멀티-특정 보존 및 세정 희석액의 사용에 의하여 상기 개시한 내성 및/또는 비내성 굴의 생식 세포로 직접 구현될 수 있다. 동물 기술적 지식(zootechnical knowledge)은 성의 제어, 부모의 개별적인 성숙, 산란의 동기화(synchronism) 및 부모간 화학물질 교환에 의하여 확인된 개체의 인공 번식 조절을 가능하게 할 수 있다. 이러한 기술은 이하의 합성 과학 문헌의 주제였다: Gerard A., Naciri-Graven Y., Boudry P., Launey S., Heutebise S., Ledu C, Phelipot P., (1997). "납작굴(flat oyster) 및 중공굴(hollow oyster)의 배우자 형성 조절". In: Natural and controlled reproduction Bivalves cultured in France, Devauchelle NR., Barret J., Salaun G., (1997), DRV/RA/RST 97-11, Ifremer Brest, 217 pp. [8].
본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 하이브리드화는
a) 상기 병원체에 대하여 내성인 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴을 제공하는 단계,
b) 상기 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴 중 하나에 대하여 반대 성인, 상기 병원체에 대하여 비내성인 굴을 제공하는 단계,
c) 하이브리드화가 가능한 염도를 갖는 물을 포함하는 탱크에 상기 굴들을 함께 넣는 단계,
d) 성숙에 충분한 영양물을 공급하면서 상승 광주기에서 상기 탱크 내의 굴을 성숙시키는 단계
e) 상기 굴에 유도제를 적용하여 수컷 생식 세포의 방출을 유도하는 단계,
f) 단계 e)에서 방출되는 수컷 생식 세포에 의하여 암컷 생식 세포를 수정시키는 단계,
g) 단계 f)에서 얻은 유생을 8∼10일 동안 항온처리하는 단계,
h) 단계 g)에서 얻은 유생을 식물 플랑크톤에 의하여 영양 공급하여 눈이 난 유생을 수득하는 단계,
i) 상기 수득한 눈이 난 유생을 수확하는 단계, 및
j) 상기 유생을 성장 지지대 상에 고정하여 병원체에 대하여 내성인 하나 이상의 굴을 얻는 단계
를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 a)에서 제공된 병원체에 대하여 내성인 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴은 상기 개시된 바와 같은 내성 굴이다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 b)에서 제공된 병원체에 대하여 비내성인 굴은 상기 개시된 바와 같은 비내성 굴이다.
본 발명의 방법에 따르면 단계 c)는 단계 a)에서 수득한 1 이상의 굴 및 단계 b)에서 수득한 1 이상의 굴을 함께 탱크에 넣는 것으로 이루어진다. 예컨대, 단계 a)에서 수득한 복수의 굴을 단계 b)의 하나의 굴과 함께 탱크에 넣거나 반대로 할 수 있다. 또한, 단계 a)에서 수득한 복수의 굴을 단계 b)에서 수득한 복수의 굴과 함께 탱크에 넣을 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 단계 a) 및 b)에서 제공된 상기 굴은 본 발명의 방법 단계 c)에서 둘씩 분리된다. 즉, 각 탱크는 2개의 굴만을 함유하며, 하나는 단계 a)에서 수득한 굴에 해당하고 또 다른 하나는 단계 b)에서 수득한 굴에 해당한다.
본 발명의 방법에 사용되는 탱크는 상기 개시한 바와 같은 탱크일 수 있다.
단계 d) 내지 i)는 상기 개시한 실시 수단으로 실현될 수 있다. 이들 수단은 본 발명 방법의 각 단계에 적응될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명 방법의 단계 d)에서 실시하는 성숙은 굴을 성숙시킬 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의하여 실시될 수 있다. 바람직하게는 굴의 성숙은 광주기의 점진적 증가에 의하여 실현된다. 이러한 증가는 1주 내지 6개월, 바람직하게는 1개월 내지 3개월의 기간에 실시될 수 있다. 최소 조명 시간은 1 시간 내지 12 시간이고 최대 조명 시간은 12 시간 내지 23시간이다. 성숙 단계는 본 발명의 방법을 실시할 수 있는 임의의 온도에서 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 성숙은 바람직하게는 20∼30℃의 온도까지 온도를 점진적으로 증가시키면서 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 성숙은 20∼30℃의 온도에서 실시된다. 최종 성숙 온도의 선택은 특히 하이브리드화 과정 동안 사용되는 균주 및 이들의 성숙에 대한 반응에 의존한다. 온도는 하이브리드화될 굴에 따라 맞출 수 있다. 이 단계에서 굴의 반응 제어는 생식선의 성숙 및 생식 세포의 형성을 제어함으로써 실현될 수 있다. 굴은 비번식기에 해당하는 0으로부터 생식 세포의 방출에 해당하는 4에 이르기까지 상이한 성숙 단계에 있다. 성숙은 예컨대 염화마그네슘(MgCl2)을 사용하여 마취제 탕치법 하에 패각의 열림을 관찰하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법에 조절할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 굴이 생식선 성숙의 3단계에 도달하였을 때 성숙이라고 취급된다.
이러한 성숙 단계 동안, 당업자에게 공지된 임의의 적절한 수단에 의하여 영양물을 공급할 수 있다. 예컨대 상기 정의한 바와 같은 영양 공급물일 수 있다. 예컨대 단세포 조류, 식물 플랑크톤, 저서성 박테리아, 미립자 식품 등일 수 있다.
성숙 단계 동안 탱크가 물 순환 장치로 공급받는 특정 실시 형태에서, 상기 순환기는 탱크마다 분리될 수 있다. 물 순환 장치의 분리는 탱크간 물의 교환을 회피하며 따라서 예컨대 단백질 및/또는 병원체 및/또는 재배된 성숙한 굴이 다른 탱크로 방출할 수 있는 화학 물질과 같은 물질이 탱크간 교환되는 것을 회피할 수 있다. 이들 물질은 실제로 부모의 성을 지배할 수 있다. 다른 탱크에서 재배된 성숙한 굴이 방출하는 생식 세포가 교환되는 것은 형제 사이에서 부적절한 자동 수정을 유발할 수 있어 본 발명의 실시에 바람직하지 않다.
본 발명에 따르면, 본 발명 방법의 단계 e)에서 정의된 바와 같은 생식 세포의 방출 유도는 바람직하게는 생식선의 성숙 3단계에 있는 굴과 같은 성숙한 굴에 대하여 실시한다. 이들 성숙한 굴은 예컨대 본 발명 방법의 단계 d)에서 수득되는 굴일 수 있다. 본 발명 방법의 단계 e)에서 사용되는 유도 수단은 예컨대 1 이상의 열 쇼크 및/또는 호르몬, 화학 물질 또는 세로토닌을 예로 들 수 있는 신경 전달 물질을 예로 들 수 있는 1 이상의 단백질과 같은 당업자에게 공지된 임의의 유도 수단일 수 있다.
바람직하게는, 유도제는 1 이상의 열 쇼크일 수 있다. 이것은 온도의 계속적인 감소 및 증가에 해당하며, 온도 변화는 본 발명 방법의 실시에 맞춘다. 예컨대, 최대 온도는 25∼55℃일 수 있고 최소 온도는 5∼20℃일 수 있다.
예컨대 열 쇼크와 같은 유도는 먼저 수컷 생식 세포를 방출시킬 수 있고 이것은 암컷 생식 세포의 산란을 자극한다. 암컷 생식 세포의 방출 유도는 수컷 생식 세포에 의한 화학적 방식으로 실현된다. 예컨대, 호르몬 또는 예컨대 세로토닌과 같은 신경 전달 물질일 수 있다.
암컷 생식 세포의 방출 유도는 또한 암컷 생식 세포의 방출을 유도하는 당업자에게 공지된 임의의 물질에 의하여 실현될 수 있다. 예컨대, 화학 물질, 호르몬 또는 예컨대 세로토닌과 같은 신경 전달 물질, 바람직하게는 수컷 생식 세포를 함유하는 물, 생식 세포를 함유한 여과수 및/또는 저온 보관으로부터 얻은 활성 정자를 함유하는 희석 배지이다.
특정 실시예에서, 생식 세포의 방출 유도 단계 e)는 굴에 의한 생식 세포의 분산을 회피하기 위하여 물의 순환 없이 탱크 내에서 실시하는 것이 바람직하다. 이 경우, 앞의 단계들에서 물의 순환이 일어나고 있었다면, 단계 e)를 위해 물 순환을 중단한다.
단계 e)의 또 다른 특정 실시예에서, 호르몬 또는 수컷 생식 세포와 같은 물질이 또 다른 탱크로 분산되는 것을 회피하기 위하여 한 탱크에서 또 다른 탱크로의 물의 순환도 또한 단절될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 f)는 수컷 생식 세포에 의한 암컷 생식 세포의 수정에 해당하며, 수컷 생식 세포는 미리 암컷 생식 세포에 의하여 필터링된다. 수정은 굴의 외투강(mantle cavity)에서 일어난다. 이 단계의 실시 수단은 상기 개시한 바와 같은 수단 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 이들 수단은 물론 수정 실현에 맞추어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 g)에서 정의된 바와 같은 유생의 항온 처리는 바람직하게는 굴의 외투강에서 실시될 수 있다. 이러한 유생의 항온 처리 단계 동안, 이 단계의 실시 수단은 상기 개시한 바와 같은 수단 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 이들 수단은 물론 항온 처리 실시에 맞추어지는 것이 바람직하다. 이러한 항온 처리 단계는 8∼10일 동안 실시될 수 있다. 이러한 항온 처리 단계 동안, 굴 및 유생의 영양 공급은 예컨대 상기 개시한 바와 같은 식물 플랑크톤 또는 적절한 다른 영양물에 의하여 실시될 수 있다. 이러한 항온 처리 기간 후, 유생은 배지 내에 방출된다.
본 발명의 방법에 따르면, 산란 유도, 수정 및 유생의 항온 처리에 해당하는 단계 e) 및 g)는 외투강 밖에서 생체 외 실시 또는 암컷의 외투강 내에서 생체 내 실시될 수 있다. 단계 g)를 생체 내, 즉 암컷 굴의 외투강에서 실시하는 경우, 생식 세포는 암컷 굴의 외투강 내에서 필터링, 수정 및 항온 처리된다. 항온 처리는 단계 g)에서 유생이 배출될 수 있도록 실시된다.
생체 외에서, 생식 세포는 생식선의 난절("스트리핑" 기술)에 의하여 수득되어, 수정 및 발달 단계를 프로그래밍하고 제어할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 h)는 단계 g)에서 배지에 방출된 유생에 영양을 공급하여 눈이 난 유생을 얻는 단계에 해당한다. 상기 개시된 바와 같은 유생에 영양을 공급할 수 있는 식물 플랑크톤은 이 단계를 실시할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 식물 플랑크톤일 수 있다. 이 단계의 실시 수단은 상기 개시한 바와 같은 수단 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 이들 수단은 유생의 영양 공급의 실시에 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 i)는 단계 h)에서 수득되는 눈이 난 유생을 수확하는 단계에 해당한다. 눈이 난 유생의 수확은 예컨대 유생의 배출 후 8일 내지 10일에 실시될 수 있다. 눈이 난 유생의 수확 수단은 예컨대 필터, 유생을 수확할 수 있는 세공 직경을 갖는 체와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 예컨대, 체의 공극 크기는 10 ㎛ 내지 180 ㎛, 바람직하게는 50 ㎛ 내지 150㎛이다. 공극의 크기는 방출되는 유생의 크기에 따라 선택될 수 있으며, 이것은 방출되는 유생의 크기보다 작아야 한다.
본 발명의 방법에 따르면, 단계 j)는 성장 지지대(development support) 상에 유생을 고정시키는 것에 해당한다. 상기 고정은 상기 개시한 바와 같은 탱크 내에서 실시할 수 있다. 이 단계의 실시 수단은 상기 개시한 바와 같은 수단 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 이들 수단은 수정의 실시에 맞추는 것이 바람직하다. 상기 탱크는 벽에 동일하거나 또는 상이한 성장 지지대를 포함할 수 있다. 상기 유생의 성장 지지대는 본 발명의 방법을 실시할 수 있는 임의의 지지대일 수 있다. 예컨대, 상기 성장 지지대는, 예컨대 250 ㎛ 내지 500 ㎛에서 스크린된 미세-분쇄된 굴 껍질 또는 섭조개 또는 미세 분쇄된 유리 및/또는 임의의 물질일 수 있고, 이는 본 발명의 방법에 의하여 수득된 유생의 연쇄 및 유리 스팻 굴의 수득을 가능하게 한다.
고정 단계 후, 스팻 굴을 성장시켜 하나 이상의 하이브리드 굴을 수득한다. 이러한 발달 단계의 실시 수단은 상기 개시한 바와 같은 수단 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단일 수 있다. 이들 수단은 유생의 발달에 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 하이브리드화는 예컨대 한 번식기에 걸쳐, 예컨대 첫 성숙의 1년 동안 6개월에 걸쳐 실시될 수 있다. 온도 및 영양 조건은 각각의 굴이 첫 성숙 동안 수차례 성을 바꿀 수 있도록 선택될 수 있다. 굴은 10 내지 70일의 가변적 간격을 두고 새로운 생식 세포를 방출할 수 있다.
유리하게는, 첫 번째 성숙 해에 본 발명의 방법을 실시하여 어린 굴에서 유래하는 최적 품질의 생식 세포 및 유생을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득되는 하이브리드 굴은 부모가 같은 형제(full-brother) 유형으로서, 이들은 동일한 생태적 및 지리적 특징에서 유래하는 특정의 유전적 다형 및 이형 접합체에 의하여 추가된 보체를 갖는 부모에게서만 유래한다. 이러한 하이브리드화 및 이형 접합체의 형성으로 병원체에 대하여 내성인 특징을 갖는 하이브리드를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 하이브리드화는 유전적으로 구분되는 야생 군집의 지리학적 거리 및 오스트레아(Ostrea) 속의 생식의 생물학적인 이유에서 자연적으로는 결코 일어나지 않는다. 양식 시스템은 단일의 하이브리드 F1을 생성하는 것이 바람직하며, 이형화의 특질은 굴과가 특히 취약한 근친 교배 퇴화에 의하여 후속 세대에서 매우 빠르게 소실된다. 따라서, 본 발명의 방법은 첫 세대의 내성 굴을 얻을 수 있다.
내성 하이브리드 굴은 다양한 조건에서 발달될 수 있다. 이것은 실시되는 하이브리드화에 따라 부모의 원래 배지(original medium)에서 발달될 수 있다. 예컨대 코르시카의 오스트레아 에둘리스(Ostrea Edulis) 내성 굴을 대서양의 비내성 굴과 교배하면 대서양 해안 및 또한 지중해에서 발달될 수 있는 병원체에 대하여 내성인 하이브리드가 얻어진다. 본 발명의 이러한 측면은 코르시카의 내성 굴이 대서양 해안에서 자랄 수 없고 코르시카의 굴은 예컨대 염도, 온도와 같은 환경의 변화에 따라, 예컨대 조수 현상 및 이에 따른 침수 및 상승 현상에 적응하지 못한다고 알려진 종래 기술에 비하여 큰 이점을 가진다.
하이브리드화에 의하여 수득되는 내성 굴은, 환경에 대한 적응능 및 내성으로 인하여, 병원체에 의하여 감염된 굴 양식지에서 굴 생산을 상당히 개선시키고 가격을 낮출 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득되는 내성 굴은 이 밖에 예컨대 배양 환경의 온도 상승과 같은 기후 변화에 대한 적응 특성을 보유한다.
또한, 하이브리드는 이것의 유래인 부모의 성장에 비하여 30%까지 증가된 1일 성장을 보인다. 이러한 측면은 굴 양식 생산지에서 내성 하이브리드의 이용 이익을 증가시킨다.
하이브리드화에 의하여 수득되는 내성 굴은 또한 감염된 굴 양식을 통해 사람에 의하여 유입되거나 유입되지 않은 병원체에 의하여 감염된 지역을 재번성시킬 수 있고 해양 생태계의 복구를 가능하게 할 수 있다.
하이브리드화에 의하여 수득되는 이러한 내성 굴은 또한 근친 교배가 점점 중요해지는 굴 양식지에서 재배된 균주의 생물학적 다양성을 재생시킬 수 있다. 근친 교배는 균주의 퇴화 원인이며 굴 양식지의 생산성 저하의 원인이다.
굴의 근친 교배는 실제로 굴 양식 파크에서 수역 현상의 증대에 의하여 1920년 이래로 관찰된 바와 같은 병원체에 대한 굴의 내성을 저하시킬 수 있다[16].
본 발명의 방법에 따라 수득된 내성 하이브리드 굴은 당업자에게 공지된 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충 병원체에 대하여 증대된 내성 특성을 보유한다. 증대된 내성 특성은 예컨대 특히 혈액 세포의 방어에 있어서 체액 및 세포 면역 반응의 개선일 수 있다. 이러한 특성은 예컨대 이형접합체에서 유래하는 유전적 다양성의 복구로 인한 것일 수 있다[15].
본 발명의 방법에 따라 수득된 내성 하이브리드 굴은, 예컨대 굴의 1형 헤르페스 바이러스["굴 헤르페스 바이러스-1(OsHV-1)"]으로 인한 수역 또는 수온 증가로 인한 수역과 같은, 굴 양식 파크 내부에서 재발하는 수역 문제를 해결할 수 있다. 실제로, 본 발명의 방법에 위하여 수득되는 굴의 유전적 다양성은 근친 교배 굴에 비하여 높은 면역성 및 야생성을 굴에 제공하여 환경 변화, 특히 기후 변화에 대한 간헐적 감염에 내성이 되게 할 수 있다[10].
다른 이점들은 예시로서 주어진 이하의 실시예를 읽으면 당업자에게 명백해질 수 있을 것이다.
실시예
1: 코르시카
다이아나
연못의
오스트레아
에둘리스
(
Ostrea
Edulis
) 내성 굴
1980년대 이후로 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)에 의하여 오염된 연못으로 분류된 다이아나 연못에서 야생 굴을 수집하여 배양장에서 성공적으로 번식시켰다. 상기 연못에서 0.2 g으로 양식 중인 스팻 굴이 우수한 품질의 실험적 생산을 얻을 수 있게 한다. 이러한 성공으로 다음과 같은 결론을 도출할 수 있다:
- 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)에 의하여 오염된 지역에서 시판될 수 있는 크기에 도달할 때까지 질병이 없다는 것은 오스트레아 에둘리스(Ostrea Edulis) 납작굴의 코르시카 균주에 속한 특정 유전적 다형과 연관된 기생충 감염증에 대한 내성을 시사한다.
- 0.2 g의 스팻 굴로부터 18 개월에 n°1 및 n°0 크기의 첫 롯(lot)을 얻는 것은 코르시카 균주의 높은 성장 잠재적 가능성을 입증한다. 양식 사이클 시간은 대서양에서의 납작 블롱굴 양식 사이클 시간에 비하여 50% 이상 감소된다.
- 상태 지수(총 중량에 대한 식용 육질의 중량)는 16%로 남브르타뉴의 블롱굴의 상태 지수보다 더 크다. 만족스런 미각 테스트는 상용화 면에서 코르시카 균주의 괄목할만한 품질을 확인해 준다.
이어서 균주의 위생 상태 및 병원체에 대한 내성을 테스트하였다. 이들 검사는 O.I.E(보나미아 감염증 및 마르테일리아 감염증에 대한 세계 동물 건강 협회)에 의하여 제시된 프로토콜에 따라 실시한다:
- 아가미 또는 심실의 조직 압흔에 대한 현미경 세포 검사: 염색 후 혈액 세포 내부에 2∼5 ㎛의 구형 또는 타원형 소-유기체가 관찰되지 않음(보나미아).
- 고정 및 염색한 아가미, 소화샘, 생식선 조직 절편의 현미경 조직 병리학적 검사. 혈액 세포의 내부에 유리 상태의 2∼5 ㎛의 기생충 세포가 관찰되지 않음(보나미아). 마르테일리아의 존재를 나타내는 소화샘의 이상도, 20∼30 ㎛의 구형 유기체의 존재도 없음.
- 천연 배지에서 보나미아 및 마르테일리아 기생충의 존재에 대한, 코르시카 균주의 내성을 나타내는 단일 클론 항체의 면역 형광 기술에 의한 검출.
- 중합효소 연쇄 반응(PCR): 기생충의 ITS1 부위를 표적으로 하는 특정 DNA 프로브를 갖는 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)의 검출 없음.
- PCR-RFLP(Restriction fragment length polymorphism: 제한효소 단편 길이 다형성) 분석: 기생충 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae)의 특징인 SSU rDNA 단편을 표적으로 하는 굴 조직의 RNA 추출물의 음성 대조군, 코르시카 균주의 비오염을 입증함.
- 인시츄 하이브리드화 분자 기술(ISH): 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae)의 DNA, SSU rDNA 절편 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)의 DNA, ITS1의 절편의 특정 프로브를 굴 조직의 조직학적 절편(cut)과 접촉시킨다. 현미경 관찰에 의하여 실시된 음성 대조군은 코르시카 균주의 조직 내부에 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)가 없음을 나타낸다. 이들 검사는 다이아나 연못의 납작굴의 야생 군집이 천연 배지에서 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)와 접촉하여 이들 기생충에 감염되지 않음을 입증한다.
이어서, 이들 기생충의 인공 접종 시험을 실시하였다.
- 코르시카의 납작굴을 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae)로 강하게 오염시킨 굴과의 공생 통에 수 개월 동안 가두었다. 굴은 질병을 발병시키지 않았고 상기 개시한 검출 테스트에 대하여 음성 반응하였다.
- 코르시카 굴은 Mialhe 등(1988)의 방법에 따라 분리된 생존 가능한 5 x 106의 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 기생충을 함유하는 필터링된 50 ㎕의 해수를 외투강 속에 주입받았다. 이전에, 패각을 개방할 수 있도록 3.5% MgCl2-6H2O 용액으로 탕치(bathing)하여 굴을 마취시켰다.
외투강에 오염 용량의 접종물(inoculum)을 주입한 후, 기포 형성에 의하여 공기를 주입한 해수로 채워진 양식통에 넣기 전에 물 밖에서 한 시간 동안 두었다. 1 개월의 양식 후에도, 사망이 관찰되지 않았으며 굴은 상기 개시한 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 검출 테스트에 대하여 음성 반응하였다. 외투강으로의 주입에 의한 또는 탕치에 의한 이러한 실험적 감염 기술은 직접적인 수평적 전파 없이 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)에 대한 내성을 테스트하는 데는 이용될 수 없다.
이들 실험은 다이아나 연목, 우리비노, 포르토 베치오 만 및 산타 만자, 사르디니아 석호에서 특히 유래하는 코르시카-사르디니아 야생 납작굴이 하플로스포르디아(Haplosporidia)과의 원생 동물인 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 기생충에 대하여 100% 내성임을 입증한다. 실시된 이들 실험은 오스트레아 에둘리스(Ostrea Edulis)의 토착 균주는 원생 생물에 의하여 유발된 질병에 의하여 죽는다는 과학 지식 상태를 명백히 반박하며, 문헌[MINICONI R., 2000, "코르시카 해안의 바다의 열매", Editions Alain Piazzola, P. 90 [9])에 나타난 잘못된 언급은 사실상 대서양 기원의 수입된 비내성 및/또는 비감염 스팻 굴의 양식 시험에 관한 것이다.
코르시카 납작굴에 대해 행한 모든 관찰에 대한 검증은 하플로스포리디아, 원생 생물, 마르테일리아, 기생충, 기회 감염성 병원체, 및 면역계가 비적응 상태로 있는, 즉 면역 기억(immune memory)이 없는 쌍각류의 체액 및 세포(혈액 세포)의 일반적인 면역 메카니즘에 영향을 주는 외부 오염 물질에 대한 상기 야생 균주의 내성을 나타낸다.
지중해의 다른 납작굴 야생 군집이 앞의 프로토콜에 따라 테스트되었고 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)에 대하여 완전한 내성을 입증하였다. 이것은 코르시카, 모로코 나도르 석호, 튀니지 가베스만, 리비아의 튀니지 국경 근처의 석호 및 그리스의 야생 군집이다.
실시예 2: 코르시카 다이아나 연못의 내성 굴 오스트레아 에둘리스
(Ostrea Edulis).
병원체 보나미아 오스트레아이(Bonamia Ostreae) 및 마르테일리아 레프린겐스(Martelia Refringens)에 의하여 오염된 지역인 다이아나 연못에서 야생 굴을 수집하여 양식장에서 번식시켰다. 야생 굴은 자연적 장소에서 직접 채취되며 병원체에 대하여 내성이다.
채취된 야생 굴은 직경이 60 mm를 초과하고 첫 번째 번식 세대인 굴이다.
굴은, 일단 채취되면, 37 ‰의 염도, 13℃의 온도 및 8.1의 pH를 갖는 20 리터의 해수를 포함하는 20 리터 부피 용기 내에서 상태 조절(conditioning)되어 배양장으로 이송된다. 채취된 굴은 상태 조절에 앞서 에폭시 접착제로 접착된 라벨에 의하여 표지된다.
실시예 3: 비내성 굴
이 실시예에서는, 자연 포획으로 얻은 아직 성숙하지 않은 60 mm 사이즈의 블롱(Belon) 지방의 굴("Quiberon" 균주, 프랑스 남브르타뉴 지방)을 선택하였다. 본 발명의 방법의 실시에 사용되는 굴은 질병 상태를 나타내지 않는 굴이다.
실시예 4: 수정을 위한 굴의 성숙
실시예 2 및 3에서 하이브리드화 하고자 하는 굴을 채취한 후, 이것을 분리하여 둘씩 결합시킨다. 즉 민감한 굴을 내성 굴과 결합시킨다. 이렇게 20쌍을 구성한다. 이렇게 형성된 쌍을 각각 20 리터의 단위 부피를 갖도록 미리 채운 20개의 탱크에 넣는다. 각 탱크를 염도 37 ‰를 갖는 20 리터의 해수로 미리 채웠다. 상기 해수의 pH는 8.1이다. 상기 해수의 처음 온도는 13℃이고 15일 내에 20℃가 된다. 상기 해수를 각 탱크당 20 l/h의 공기 유량을 갖는 펌프 시스템으로 산소화한다.
성숙 동안 각 탱크당 분리되고 폐쇄된 물 순환 장치에 의하여 물을 공급한다. 물의 물리화학적 특성은 성숙시키는 동안 내내 일정하게 유지한다.
굴의 성숙은 9 시간 내지 15 시간의 광주기를 증가시키고 물의 온도를 20℃에서 30℃로 증가시킴으로써 15일 내지 90일의 기간에 걸쳐 실시한다.
이 성숙 기간 동안, SATMAR사의 냉동 농축 페이스트 또는 배양장에서 유래하는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum), 파블로바 루테리(Pavlova lutheri), 카이토세로스 칼시트란스(Chaetoceros calcitrans) 균주의 단세포 조류를 배지에 첨가함으로써 영양물을 공급한다. 상기 공급은 굴의 공급이 관찰되는 동안 매일 3회 자발적으로 실시된다. 영양물의 공급과 동시에 특히 어린 물고기 양식장의 찌꺼기에서 유래하는 유기 물질이 공급된다.
염화마그네슘(MgCl2)에 의한 마취제 탕치법으로 당업자에게 공지된 기술에 의하여 생식선의 성숙 단계를 관찰하여 성숙을 확인한다[Gagnaire B., 2005, "오염물이 중공굴 크라스오스트레아 기가스(Crassostrea gigas)의 혈액 세포 파라미터에 미치는 영향에 관한 연구- 환경, 방어 메카니즘 및 감염성 질병 간의 상호작용", 로셸 대학 박사 학위 논문, 412 pp. [10] ].
생식선의 성숙이 단계 3에 이르렀을 때 생식 세포의 산란을 유도할 정도로 굴이 성숙한 것이다.
실시예 5: 생식 세포의 방출 및 생식 세포의 수정 유도
생식 세포의 방출 유도는 실시예 4의 성숙을 거친 굴에 대하여 실시한다.
생식 세포의 방출 유도는 실시예 4에서와 동일한 수단 및 동일한 굴 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 실시한다.
유도에 앞서, 배양 배지에 생식 세포가 분산되는 것을 회피하기 위하여 물의 순환을 중단시킨다.
생식 세포의 방출 유도는 열 쇼크에 의하여 이루어진다. 온도는 23℃ 내지 30℃ 범위의 최소값 및 30℃ 내지 37℃ 범위의 최대값 내에서 4℃ 내지 7℃까지 교대로 감소 및 증가된다.
수컷 생식 세포가 먼저 방출되고 이것이 암컷 굴에 의한 암컷 생식 세포의 방출을 화학적 방식으로 유도한다.
배지 중에 유리된 정자는 암컷에 의하여 필터링된다. 수정은 암컷의 외투강에서 일어나며, 유생을 8일 내지 10일 동안 항온 처리한 다음 암컷당 약 백만의 비율로 외부로 배출한다.
외투강 내에서 유생의 항온 처리 단계 동안, 물은 재순환된다. 유생은 식물 플랑크톤에 의하여 영양을 공급받는다. 유생의 영양 공급에 사용되는 식물 플랑크톤은 양식장의 외부에 있는 탱크에서 실시되는 대량 배양에서 유래하는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 파블로바 루테리(Pavlova lutheri), 카이토세로스 포르마 퓔룸(Chaetoceros forma pumilum)로 구성되고 필요하다면 SATMAR사의 조류 농축 페이스트로 보충된다. 사용되는 식물 플랑크톤의 크기는 처음 단계의 유생에대하여 20 내지 40 ㎛이고 성숙 단계까지의 변형기에서 50 내지 200 ㎛이다. 배지에 첨가되는 식물 플랑크톤의 하루 양은 탱크내 영양 물질의 필터링을 관찰하여 임의로 조절하며 휴지기 동안 물의 순환은 중단된다.
실시예 6: 유생의 수집 및 고정
실시예 5의 배지 중에 방출된 유생의 수집은 스크린(screen)을 사용하여 실시한다. 유생의 수집 및 고정의 실시 조건은 실시예 3의 조건과 동일하다. 사용되는 스크린은 직경 120 ㎛의 세공을 가진다. 스크린을 사용하여 배양 배지 중에 존재하는 유생을 수집할 수 있다. 유생은 부모에 따라 동질한 배치로 그룹화된다. 상기 그룹화는 탱크 내에서 실시되며, 상기 탱크의 바닥에는 250 ㎛ 내지 500 ㎛의 스크린 상에 눈금이 매겨진 미세 분쇄된 굴 및 섭조개가 존재한다.
탱크의 부피는 2∼5 m3이다. 탱크는 염도가 37 ‰이고, pH가 8.2이며 온도가 20∼25℃인 물로 채운다. 폐쇄 순환되는 탱크는 2∼5 m3/h의 공기 유량을 갖는 펌프로 산소화된다. 8일 내지 10일 동안 항온 처리 후, 유생을 성장 지지대 상에 고정시킨다. 사용되는 유생의 고정 방법은, 구체적으로 이하의 기술 문헌에 개시된, 지지대 상에 유생을 고정하는 종래의 방법이다: IFREMER, Ifremer, 2007, Fiche aquaculture, March 17, 2007, "양식장: 중공굴의 경우"[11] 및 Helm, M.M., Bourne, NR., Lovatelli, A., (comp./ed.) 쌍각류 양식어장, 실제 메뉴얼. 낚시에 관한 FAO 기술 문헌 471호. Rome, FAO. 2006. 184 p. [12]
실시예 7: 내성 및 비내성 굴
아래의 표는 본 발명의 방법을 위한 내성 굴 및 비내성 굴의 다른 실시예들을 나타낸다;
표 1: 지중해의 내성 O. edulis
표 2: 지중해의 내성 O. edulis
표 3: 지중해의 비내성 O. edulis
표 4: 비내성 O. edulis
표 5: 다른 비내성 굴
8.
하이브리드화의
다른 예:
이하의 표들은 본 발명 범위 내의 또 다른 예를 나타낸다. 해당 양식 배지의 물리적, 생물학적 및 상업적 제약을 만족시키기 위하여 특성이 미리 선택된 국내산 굴의 지속적 이용의 관점에서, 본 발명의 하이브리드화의 실현으로 질병에 대한 내성을 얻을 수 있다.
앞에서 개시한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 수득된 하이브리드는 이러한 하이브리드화에 의하여 얻어지며 납작굴의 종래 생산에서의 요구에 부응하는 특별한 특징을 보유한다. 상기 하이브리드는 보나미아 감염증 및 마르테일리아 감염증에 대하여 내성이다. 또한, 이들은 기회 감염성 병원체에 대하여 내성이다. 상기 하이브리드는 예컨대 조수 간만에 의한 수면 위로의 상승 또는 침수, 온도, 염도와 같은 환경 변화 범위에 대해 잘 견디고 강인성을 보유한다. 이들은 강한 성장 능력을 가진다. 이들은 연안수의 기후 변화 제약을 받는 만조와 간조 사이의 지역, 영양물 및 유기물이 풍부한 물에서의 양식에 적응된다. 끝으로, 상기 하이브리드는 산소 결핍증, 건조 및 운송 제약에 대하여 잘 견딘다.
실시예 9: 코르시카 연못의 야생 굴 및 모로코 나도르 석호의 굴 간의 하이브리드화
코르시카 연못의 야생 굴 및 나도르 석호의 굴을 본 발명에 따라 교배하였다. 이것은 두 내성 굴을 교배한 경우이다. 나도르의 지브랄타 해협과의 근접성은 석호에서 2 미터에 달할 수 있는 조수의 원인이며 이로써 모로코의 천연 굴층이 일시적으로 수면 위로 부상할 수 있다. 다이아나의 굴과 나도르의 굴의 하이브리드화는 대서양에서 조우하게 되는 조수의 제약에 적응하고, 기후 변화와 관련된 성장 온도 증가를 견디며, 시판을 위하여 건조 상태로 운송시 건조에 견디고, 강한 성장력을 가지며, 치명적인 질병에 대해 내성인 하이브리드를 생성할 수 있다.
하이브리드 스팻 굴의 생산을 동시에 배양장에서 생산되는 나도르 굴의 스팻 굴 생산과 비교하였다. 상기 하이브리드는 변태기 이후 달에 1일 평균 성장이 모로코 스팻 굴의 대조군 배치보다 30% 높다. 또한, 국산 하이브리드 스팻 굴의 상대적 크기는 극히 불균일성을 나타내는 대조군 배치보다 더 균일하다. 조절된 하이브리드화에 의하여 유도되는 이형화(하이브리드 강도)의 효과는 동물 기술적 잠재성이 큰 국내산 납작굴의 생산 프레임 내에서 확인된다.
이렇게 생성된 국내산 하이브리드 F1은 대서양 연안의 패류 양식지에서 납작굴 "블롱굴"의 멸종 문제를 해결한다.
본 발명의 방법에 따른 이러한 하이브리드화에 의하여 수득된 매우 큰 적응(adaptation)은 결과적으로 포르투갈, 갈리시아, 브르타뉴, 노르망디, 아일랜드 및 네덜란드의 납작굴의 종래 생산에서의 요구에 부응한다. 상기 하이브리드는 보나미아 감염증 및 마르테일리아 감염증에 대하여 내성이다. 이들은 또한 기회 감염성 병원체에 대하여 내성이다. 상기 하이브리드는 예컨대 온도 및 염도와 같은 환경의 변화 및 조수의 변화에 대하여 잘 견디고 강인성을 보유한다. 이들은 강한 성장성을 가진다. 이들은 연안수의 기후적 가열의 제약을 받는 만조와 간조 사이의 지역(물가에서의 양식), 영양물 및 유기물이 풍부한 물(포구에서의 정제, 굴 양식장에서의 정제)에서의 배양에 적응된다. 끝으로 상기 하이브리드는 산소 결핍증, 건조 및 운송 제약에 견디고, 내성은 코르시카에서 브르통 시장까지의 화물 운송시 나타났다.
참고 문헌 목록
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[15] Taris N. et al., 2007, 크라스오스트레아 기가스(Crassostrea gigas) 유생의 더 빠른 발달 및 발육 억제에 대한 무의식적 선택에 대한 응답의 증거, Aquaculture, Vol. 272, supplement 1 , pages S69-S79, Supplement: Genetics in aquaculture IX.
[16] Anon., 2008, "수역에 의하여 표지되는 굴 배양", Le Marin n° 3183, vendredi 11 juillet 2008, 5.
Claims (24)
- 박테리아, 기생충 및 바이러스 중에서 선택된 병원체에 대하여 내성인 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴을 반대 성(sex)의 비내성 굴과 하이브리드화(hybridization)하는 것을 포함하며,
상기 비내성 굴은 오스트레아 안가시(Ostrea angasi), 오스트레아 콘카필라(Ostrea conchaphila), 오스트레아 루리다(Ostrea lurida), 오스트레아 덴셀아멜로사(Ostrea denselamellosa), 오스트레아 푸엘카나(Ostrea puelchana), 오스트레아 폴리움(Ostrea folium), 오스트레아 스텐티나(Ostrea stentina), 티오스트레아 킬렌시스(Tiostrea chilensis), 크라스오스테라 비르기니카(Crassostera virginica), 크라스오스트레아 가사르(Crassostrea gasar) 및 크라스오스트레아 리조포라이(Crassostrea Rhizophorae) 종을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상이며,
상기 병원체는 박테리아, 기생충 및 바이러스 중에서 선택된 하나 이상이며,
상기 병원체는 보나미아(Bonamia) 감염증, 마르테일리아(Marteilia) 감염증, 하플로스포리디움(Haplosporidium) 감염증, 미크로사이토스(microcytos) 감염증, 페르킨수스(Perkinsus) 감염증 및 이리도 바이러스 감염증을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상인 질환의 원인인 것을 특징으로 하는, 병원체에 대하여 내성인 굴을 얻는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 병원체는 보나미아 감염증 및 마르테일리아 감염증 중 하나 이상의 원인인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 하이브리드화는
a) 상기 병원체에 대하여 내성인 지중해 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴을 제공하는 단계,
b) 상기 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 내성 굴 중 하나에 대하여 반대 성인, 상기 병원체에 대하여 비내성인 굴을 제공하는 단계,
c) 하이브리드화가 가능한 염도를 갖는 물을 포함하는 탱크에 상기 굴들을 함께 넣는 단계,
d) 성숙에 충분한 영양물을 공급하면서 상승 광주기(photoperiod)에서 상기 탱크 내의 굴을 성숙시키는 단계,
e) 상기 굴에 유도제를 적용하여 수컷 생식 세포의 방출을 유도하는 단계로서, 상기 수컷 생식 세포는 지중해 오스트레아 에둘리스 굴 또는 비내성굴로부터 얻은 것인 단계,
f) 단계 e)에서 방출되는 수컷 생식 세포에 의하여 암컷 생식 세포를 수정시켜 유생을 얻는 단계로서, 상기 암컷 생식 세포는 단계 e)에서 수컷 생식 세포와 서로 다른 굴로부터 얻은 것인 단계,
g) 단계 f)의 수정에 의하여 얻은 상기 유생을 8∼10일 동안 항온처리하는 단계,
h) 단계 g)에서 얻은 유생을 식물 플랑크톤(phytoplankton)에 의하여 영양 공급하여 눈이 난 유생을 수득하는 단계,
i) 상기 수득한 눈이 난 유생을 수확하는 단계, 및
j) 상기 유생을 성장 지지대 상에 고정하여 병원체에 대하여 내성인 하나 이상의 굴을 얻는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제6항에 있어서, 단계 e) 내지 g)는 생체 외에서 실시되며, 이때 생식 세포는 생식선의 난절(scarification)에 의하여 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 e) 내지 g)는 생체 내에서 실시되며, 단계 e)에서 방출된 생식 세포의 수정 단계 f)는 암컷 굴의 외투강(mantle cavity)에서 상기 생식 세포의 필터링 후 실시되고, 항온 처리 단계 g)는 유생이 배출되도록 암컷 굴의 외투강에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 탱크는 상기 물 순환 장치에 의하여 연속적으로 공급받으며, 단계 e)의 실시를 위해서는 상기 물 순환 장치가 닫히는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 물 순환 장치는 단절되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 d)의 성숙은 20∼30℃의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 탱크는 배양 탱크인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 e)에서 정의된 바와 같은 유도 수단은 열 쇼크 및 하나 이상의 단백질 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 열 쇼크는 5∼55℃ 범위의 값으로 온도를 연속적으로 증가 및 감소시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 영양물 공급은 배양장(hatchery)에서 양식된 살아 있는 단세포 조류로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 단세포 조류는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum), 파블로바 루테리(Pavlova lutheri), 카이토세로스 칼시트란스(Chaetoceros calcitrans) 및 테트라셀미스 에스피(Tetraselmis sp.)를 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 i)는 유생의 배출 후 8∼10일에 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 j)의 성장 지지대(development support)는 250∼500 ㎛에서 스크린된(screened) 물질 및 미세 분쇄된 껍질을 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항, 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지중해의 내성 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴은 제 1 번식 세대이고 장축의 직경이 60 mm를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항, 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내성 오스트레아 에둘리스(Ostrea edulis) 굴 및 비내성 굴은 비번식기 후에 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항, 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리드화는 한 번식기에 걸쳐서만 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항, 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비내성 굴은 대서양, 태평양 또는 인도양에서 유래하는 굴의 균주(strain)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항, 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득되는 굴.
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