CN103814867B - 一种长杂回交牡蛎品系的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长杂回交牡蛎品系的培育方法。本发明通过精卵制备、受精孵化、子代培育等技术环节，克服了杂种F1雄性不育的特性，利用杂种F2中兼具杂种F1特性、完全可育的雄性个体作为精子来源，与长牡蛎卵子受精，成功培育出长杂回交牡蛎新品系。本发明不同于以往回交中利用杂种F1与亲本回交的特点，而是采用杂种F2中完全可育的兼具F1特性的杂种与香港牡蛎回交培育新品系。本发明获得的新品系，具有适温范围广，耐高盐能力强，从南至北均可以养殖，显著扩大了牡蛎养殖面积；同时，具有显著的生长、存活优势，产量较长牡蛎提高30-50％。本发明具有操作简单、实用性强、易于推广等优点。
Description
技术领域：
本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种长杂回交牡蛎新品系的培育方法。
背景技术：
种间级进回交，又称为级进回交、吸收杂交或改造杂交，是根据当地自然条件、经济条件和生产需要及原地方品种品质育种目标，引入一个相应的改良品种与当地被改良品种杂交，获得级进第一代杂种(级F1)；然后将此杂种再与被改良品种杂交，如此使各代级进杂种与原改良品种回交若干代而向改良品种特性方向级进，并结合定向选育，以获得在生产性能上显著改良品种方向发展，并适当保留本地品种原有的某些优点(楼允东，1999)。
种间级进回交在农作物(Bernacchi&Tanksley,1997；Kirstetal.,2004)及畜牧业(McAllister,2002)上已经得到了广泛应用，育种学家们采用该方法先后获得了一些具有优良性状的动植物新品系。对于水产动物而言，种间级进回交在鱼类育种上已有较多报道，如比较成功的鲤鲫杂种F1与鲤、鲫的回交制种，获得了生长快、产量高、抗逆性强的回交新品系(楼允东，1999)；至于贝类，仅限于对同一物种内的不同地理群体虾夷扇贝(曹学斌等，2005)、菲律宾蛤仔(闫喜武等，2008)的研究报道。
本发明使用的长牡蛎及杂种各具优缺点：长牡蛎生活在我国北方的辽宁、河北、山东等地，具有生长快、产量高、抗低温等优点，同时有耐高温能力差、夏季死亡率高的缺陷；而香港牡蛎与长牡蛎种间杂种(即F1)具有抗高低温、耐高低盐、夏季致死率低等优点，但缺点就是生长较慢(Zhangetal.,2011)。
发明内容：
为了克服长牡蛎和香港牡蛎与长牡蛎种间杂种二者的缺陷，本发明提供了一种能培育出生长快、抗逆性强、高产、优质的长杂回交牡蛎新品系的培育方法。
结合同质选配，本发明采用长牡蛎与香港牡蛎与长牡蛎杂种F2中兼具杂种F1可育个体作为亲本，进行种间级进回交，旨在探索回交中的生殖隔离模式，获得生长快、抗逆性强、高产、优质的杂交新品系。
本发明的长杂回交牡蛎新品系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、卵子制备：在长牡蛎繁殖季节，从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取成熟卵子；
b、精子制备：利用高度不育的香港牡蛎与长牡蛎杂种F1进行自繁，通过分子标记筛选出杂种F2中兼具杂种F1基因型的完全可育的雄性个体为材料，解剖获取新鲜有受精能力的精子；
c、受精孵化：以步骤a的成熟卵子和步骤b的精子作为材料，在新鲜海水中进行受精孵化，其受精率≥90％，孵化率≥90％，再按照牡蛎常规方法进行子代培育，即可培育出长杂回交牡蛎新品系。
所述的步骤a的从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取成熟卵子是从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取卵子，经过200目筛网过滤，400目筛绢网浓缩，新鲜海水浸泡30-60min，生发泡破裂即为成熟卵子。
所述的步骤b的解剖获取新鲜有受精能力的精子是：解剖获取新鲜精子，经过500目筛绢网过获得精液，经过海水激活5-10min，在显微镜下活跃跳动即为有受精能力的精子；或者解剖获取新鲜精子，经过500筛绢网过获得精液，再采用低温冷藏技术保存，之后通过解冻、稀释、激活之后的精子。
所述的c步骤中的受精孵化，其方式可以采用家系交配形式，也可以采用群体交配形式。
所述的c步骤中的子代培育，适用于我国南北方沿海的高盐度环境的自然海区或者生态土池中。
张跃环等(2012)公开了香港牡蛎与长牡蛎种间杂交研究的对比文件，介绍了香港牡蛎与长牡蛎杂种F1与香港牡蛎回交过程中会产生显著回交优势。本发明不同于以上对比文件，具有以下主要创新点：①本发明采用的是杂种F2中与F1比较一致的个体，而对比文件采用的是的杂种F1。②本发明使用的是完全可育的杂种F2，而对比文件采用的高度不育的杂种F1。③本发明可以大规模培育出的G/Hg长杂回交新品系，容易大面积推广应用；而对比文件仅仅可以培育出少量G/HG新品系，仅仅可以用于科研实验材料。
本发明通过精卵制备、受精孵化、子代培育等技术环节，克服了杂种F1雄性不育的特性，利用杂种F2中兼具杂种F1特性、完全可育的雄性个体作为精子来源，与长牡蛎卵子受精，成功培育出长杂回交牡蛎新品系。本发明不同于以往回交中利用杂种F1与亲本回交的特点，而是采用杂种F2中完全可育的兼具F1特性的杂种与香港牡蛎回交培育新品系。本发明获得的新品系，具有适温范围广，耐高盐特性，从南至北均可以养殖，显著扩大了牡蛎养殖面积；同时，具有显著的生长、存活优势，产量较长牡蛎提高30-50％。本发明具有操作简单、实用性强、易于推广等优点。
附图说明：
图1虚线部分为对比文件技术路线图，实线部分为本发明技术路线图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
a、卵子制备：2012年7月，在大连庄河海洋贝类苗种场内，以该场虾池中性成熟的长牡蛎Crassssotreagigas为材料，筛选出18个雌性个体通过解剖形式获取单体卵子；每一个个体的卵子经过200目筛网过滤，400目筛绢网浓缩；之后放置于2L新鲜海水红桶中浸泡30-60min，生发泡破裂即为成熟卵子。
b、精子制备：利用高度不育的香港牡蛎C.hongkongensis与长牡蛎杂种F1进行自繁(参照文献：张跃环等，香港巨牡蛎与长牡蛎种间杂交及早期杂种优势分析，水产学报，36(9)，2012，9；1358-1366)，通过分子标记筛选出杂种F2中兼具杂种F1基因型的完全可育的6个雄性个体为材料，解剖获取新鲜单体精子，经过500目筛绢网过滤分别获得100mL精液，经过海水激活5-10min，在显微镜下活跃跳动即为有受精能力的精子。
c、受精孵化：以步骤a的成熟卵子和步骤b的精子作为材料，采用平衡巢式设计，按照1个雄性杂种个体精子与3个雌性长牡蛎卵子对应的原则，建立6个父系半同胞、18个母系全同胞回交家系。每个家系在新鲜海水中进行受精孵化，其受精率均≥90％，孵化率均≥90％，即获得18个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代。同时，设置3个长牡蛎父系半同胞家系，9个长牡蛎全同胞家系作为对照。
d、子代培育：按照牡蛎常规方法进行子代培育，大约经过60d培育，稚贝生长至15mm左右，将其制备为单体，每个家系子代放在30个20目网孔的40×30cm的网袋中(100个/袋)，放置于该场生态虾池中养成。经过一周年养成，18个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代较9个长牡蛎全同胞家系子代生长速度提高10-20％，存活率提高30-50％，产量提高了40-80％。该长杂回交牡蛎新品系具有适温范围广，耐高盐特性，从南至北均可以养殖，显著扩大了牡蛎养殖面积的优点。
实施例2
a、卵子制备：2012年6月，在中国科学院南海海洋研究所湛江特种水产动物试验站贝类苗种场内，以大连空运至湛江的性成熟的长牡蛎为材料，筛选出30个雌性个体通过解剖形式获取单体卵子；每一个个体的卵子经过200目筛网过滤，400目筛绢网浓缩；之后放置于5L新鲜海水红桶中浸泡30-60min，生发泡破裂即为成熟卵子。
b、精子制备：利用高度不育的香港牡蛎与长牡蛎杂种F1进行自繁，通过分子标记筛选出杂种F2中兼具杂种F1基因型的完全可育的10个雄性个体为材料，解剖获取新鲜单体精子，经过500目筛绢网过滤分别获得100mL精液，经过海水激活5-10min，在显微镜下活跃跳动即为有受精能力的精子。
c、受精孵化：以步骤a的成熟卵子和步骤b的精子作为材料，采用平衡巢式设计，按照1个雄性杂种个体精子与3个雌性长牡蛎卵子对应的原则，建立10个父系半同胞、30个母系全同胞回交家系。每个家系在新鲜海水中进行受精孵化，其受精率均≥90％，孵化率均≥90％，即获得30个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代。同时，设置5个长牡蛎父系半同胞家系，15个长牡蛎全同胞家系作为对照。
d、子代培育：按照牡蛎常规方法进行子代培育，大约经过60d培育，稚贝生长至12mm左右，将其制备为单体，每个家系子代放在50个20目网孔的40×30cm的网袋中(100个/袋)，放置于湛江硇洲水道海域养成。经过一周年养成，30个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代较15个长牡蛎全同胞家系的子代生长速度提高20-30％，存活率提高30-40％，产量提高了60-90％。
实施例3
a、卵子制备：2013年7月，在中国科学院南海海洋研究所湛江特种水产动物试验站贝类苗种场内，以大连空运至湛江的性成熟的长牡蛎为材料，筛选出36个雌性个体通过解剖形式获取单体卵子；每一个个体的卵子经过200目筛网过滤，400目筛绢网浓缩；之后放置于5L新鲜海水红桶中浸泡30-60min，生发泡破裂即为成熟卵子。
b、精子制备：利用高度不育的香港牡蛎与长牡蛎杂种F1进行自繁，通过分子标记筛选出杂种F2中兼具杂种F1基因型的完全可育的12个雄性个体为材料，解剖获取新鲜单体精子，经过500目筛绢网过滤分别获得100mL精液，经过海水激活5-10min，在显微镜下活跃跳动即为有受精能力的精子。
c、受精孵化：以步骤a的成熟卵子和步骤b的精子作为材料，采用平衡巢式设计，按照1个雄性杂种个体精子与3个雌性长牡蛎卵子对应的原则，建立12个父系半同胞、36个母系全同胞回交家系。每个家系在新鲜海水中进行受精孵化，其受精率均≥90％，孵化率均≥90％，即获得36个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代。同时，设置6个香港牡蛎父系半同胞家系，18个香港牡蛎全同胞家系作为对照。
d、子代培育：每个回交家系筛选150万D形幼虫，36个家系子代共计4800万个，混合在一起放置于4个12m3水泥池中培育；每个自交家系筛选出150万D形幼虫共计2400万个，混合在一起放置于2个12m3水泥中培育。按照牡蛎常规方法进行子代培育，大约经过50-60d培育，稚贝壳高生长至6-12mm，将牡蛎壳水泥块附着基上的稚贝挂养于湛江硇洲水道海域养成。经过一周年养成，36个母系全同胞回交家系的长杂回交牡蛎新品系子代新品系较香港牡蛎生长速度提高20-30％，存活率提高30-60％，产量提高了60-100％。
Claims (5)
1.一种长杂回交牡蛎品系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、卵子制备：在长牡蛎繁殖季节，从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取成熟卵子；
b、精子制备：利用高度不育的香港牡蛎与长牡蛎杂种F1进行自繁，通过分子标记筛选出杂种F2中兼具杂种F1基因型的完全可育的雄性个体为材料，解剖获取新鲜有受精能力的精子；
c、受精孵化：以步骤a的成熟卵子和步骤b的精子作为材料，在新鲜海水中进行受精孵化，再按照牡蛎常规方法进行子代培育，即可培育出长杂回交牡蛎品系。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述的步骤a的从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取成熟卵子是从其群体中筛选出雌性个体通过解剖形式获取卵子，经过200目筛网过滤，400目筛绢网浓缩，新鲜海水浸泡30-60min，生发泡破裂即为成熟卵子。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述的步骤b的解剖获取新鲜有受精能力的精子是：解剖获取新鲜精子，经过500目筛绢网过获得精液，经过海水激活5-10min，在显微镜下活跃跳动即为有受精能力的精子；或者解剖获取新鲜精子，经过500筛绢网过获得精液，再采用低温冷藏技术保存，之后通过解冻、稀释、激活之后的精子。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述的c步骤中的受精孵化，其方式可以采用家系交配形式，也可以采用群体交配形式。
5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述的c步骤中的子代培育，适用于我国南北方沿海的高盐度环境的自然海区或者生态土池中。
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