CN103891646A - 获得抗病原体之牡蛎的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及获得抗病原体之牡蛎的方法以及所得的牡蛎。本发明的方法包括将抗所述病原体的地中海牡蛎食用牡蛎(Ostrea edulis)与异性非抗性牡蛎杂交。特别地，本发明涉及抗病原体(例如牡蛎包拉米虫(Bonamia ostreae)和马泰氏孢子虫(Martelia refringens))的养殖牡蛎在商业生产中的用途。
Description
本申请是中国专利申请200880111381.3的分案，后者是2008年8月12日提交的PCT申请PCT/FR2008/001187于2010年4月13日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及获得抗病原体之牡蛎的方法以及所得的牡蛎。
更特别地，本发明涉及抗病原体(例如牡蛎包拉米虫(Bonamiaostreae)和马泰氏孢子虫(Martelia refringens))的养殖牡蛎在商业生产中的用途。
在下述说明书中，方括号([])内的数字指实施例后给出的参考文献的序号。
背景技术
平牡蛎食用牡蛎(Ostrea edulis)是欧洲、美国以及加拿大养殖最多的牡蛎品种之一。
在1970-1980年间，寄生虫马泰氏孢子虫和牡蛎包拉米虫的出现导致牡蛎的产量显著下降，因此迫使牡蛎养殖者们寻找对抗这些寄生虫的手段。
已采取了数种方法来限制牡蛎的感染。所述方法之一是限制牡蛎从一处孵化场所向另一孵化场所迁移，并且限制牡蛎苗(naissain)从一个区域向另一区域迁移。
另一种方法是设法选择抗寄生虫牡蛎包拉米虫的牡蛎(Naciri-Graven等(1998)“Selecting the flat oyster Ostrea edulis(L.)for survival when infected with the parasite Bonamia ostreae”J.Exp.Mar Biol.Ecol.，224：91-107[1])。这样的选择使得促进牡蛎耐受成为可能，而非抵抗所述寄生虫，并且削弱了养殖牡蛎的遗传多样性以及有害的牡蛎近亲(consanguinity)增加(N.Taris等“Conséquences génétiquesde la production des larves
én écloserie：étude des processusde dérive et de sélection.”，Les actes du BRG，6(2006)521-541.[2])。
另一些研究利用来自大西洋的敏感型牡蛎苗鉴定用于养殖牡蛎的未感染区。这些研究之一是于80年代在科西嘉岛的Etang de Diana(黛安娜湖)中进行的，根据有关调节水产养殖品的动物健康条件的欧洲议会指令91/67/CEE，遵照IFREMER的提案，将该池塘归类为感染区。围绕整个科西嘉岛的区域1被归类为无包拉米虫病(bonamiose)并且无马泰氏孢子虫病(marteliose)的区域。
许多研究使得可绘制出受寄生虫感染的区域图，甚至在各区域选择出更好地耐受寄生虫的牡蛎，但是这削弱了它们的遗传多样性。
任何这些研究均不可能产生抗所述寄生虫的牡蛎。
因此，实际上需要可获得抗病原体之牡蛎的方法以克服现有技术中的不足、缺点和障碍，并且可降低工业生产的成本。该方法还必须易于实施。
发明内容
更明确地，本发明的目的在于通过提供用于获得抗病原体之牡蛎的方法来满足需求和克服上述缺点。
本发明方法的特征在于其包括将抗这些病原体的地中海牡蛎食用牡蛎与非抗性牡蛎进行杂交。
本发明还涉及可利用本发明方法获得的抗病原体的牡蛎。
根据本发明，“抗性牡蛎”意指抗病原体的任何地中海牡蛎食用牡蛎。所述抗性地中海牡蛎食用牡蛎可以是抗病原体且来自地中海的任何野生型牡蛎。例如，所有未经人为来源的选择压力、也未经遗传性污染(例如通过培养和/或对源自大西洋的培养品系的移植来实现)的地中海牡蛎食用牡蛎。可以利用等位酶标志物或微卫星标志物(Launey S.等“Geographic structure in the European flat oyster(Ostrea edulis L.)as revealed by Microsatellite polymorphism.”J Hered.2002 9-10月；93(5)：331-51.(2002)[3])或者RNA序列对品系进行分子分析来鉴定牡蛎的地中海来源。例如，可用于显示地中海来源之牡蛎的分子标志物对应于品系的线粒体12s-rRNA基因的313对碱基序列，例如科学文献Diaz-Almela等，“Reduced female gene flow in the European flat oysterOstrea edulis”，J Hered.2004年11-12月；95(6)：510-6.(2004)[4]中所述的。
可选择抗性牡蛎使其具有最适于杂交方法的优选的养殖生长品质和状态指数，即可食用肉占总重量的比例。例如，所述比例可以为0.10～0.20，优选大于0.15。例如，可对处于同年龄段且具有适宜的壳构造(指下半部的壳凸起)的最大牡蛎进行测量。例如，可在最初成熟的幼龄牡蛎(例如对于科西嘉岛牡蛎而言，重量小于80g)中选择抗性牡蛎，最大的牡蛎具有产生较大比例的壳的趋势。其中，优选地可选择凸起度(定义为厚度与平均直径[(长度+宽度)/2]的比值)大于0.33的牡蛎。
可根据其表型特征例如大小、重量等来选择抗性牡蛎。例如，优选地可选择直径大于60mm的抗性地中海牡蛎食用牡蛎。
还可根据有关其天然生长介质的场所来选择抗性牡蛎。例如，就散布在沉积物表面上的游离形式和固定在其天然介质中的岩石上的牡蛎而言，游离形式的牡蛎是优选的，这是因为它们表现出更适于养殖的特征。
在天然场所中的牡蛎采样区域优选那些包括最重要群体(意即具有最高生产力)的区域。对于生长在软沉积物上的游离形式而言，可例如在密度大于1只个体/m2、优选大于2只个体/m2的群体中选择牡蛎。
可在例如抗性地中海牡蛎食用牡蛎、来源于科西嘉岛潟湖的牡蛎、来自摩洛哥纳多尔的牡蛎、来自突尼斯加贝斯的牡蛎、来自利比亚的牡蛎、来自希腊的牡蛎、来自西班牙穆尔西亚的Mar Menor中的牡蛎、来自土耳其博斯普鲁斯的爱琴海区域的牡蛎、来自巴利阿里群岛的米诺卡岛的牡蛎、来自乌克兰塞瓦斯托波尔的牡蛎、来自红海和/或波罗的海的牡蛎中选择抗性牡蛎食用牡蛎。
优选地，为了实施本发明的方法，可在来自黛安娜湖、乌尔比诺湖(Etang d’Urbino)、波尔图维基奥(Porto Vecchio)海湾、Santa Manza海湾和撒丁岛潟湖的野生型科西嘉岛牡蛎食用牡蛎中选择抗性牡蛎食用牡蛎。优选地，为了实施本发明的方法，所选抗性牡蛎食用牡蛎是来自黛安娜湖的野生型科西嘉岛牡蛎食用牡蛎。
根据本发明，所述抗性地中海牡蛎可以是来自古老的地中海种群的牡蛎。优选地，所述牡蛎是未经由移植或养殖引起的外部遗传改变的野生型平牡蛎和/或来源于地理受限的地中海潟湖的牡蛎。长期生活在地中海潟湖的野生型种群具有适于改变的基因型、表型和养殖特征，所述改变特别是与其群落生境相关的适应特质，更特别地是温度水平和幅度、盐度水平和变化、介质的氧化作用、介质的营养特质、潮汐以及天然种群对着陆的可能抗性。例如，摩洛哥纳多尔潟湖中牡蛎的天然种群可在高潮汐期间暴露数小时，并且经受亚热带地区的日光而不死亡。就本发明方法的实施方案而言，所述抗性牡蛎可以是来自纳多尔的牡蛎，例如用以获得适于在大西洋的潮间带养殖的杂交体。
然而，来自具有低食物供应的开放群落生境的抗性地中海品系遗传了常见的适应特征，其通常对杂交的品质不是非常有利。对来自希腊基克拉泽斯群岛(Cyclades)、克罗地亚、卡拉布里亚(Calabre)、西西里岛和卡马尔格(Camargue)(罗讷河畔圣路易港
)的抗性牡蛎而言，情形如此。
可例如通过利用前述的等位酶标志物、微卫星标志物[3]或RNA序列[4]对所述品系进行分子分析来鉴定牡蛎的地中海来源。
根据本发明，所选的抗性牡蛎有利地具有适于杂交的碳水化合物储备物质水平。由糖原组成的这种储备物质将日益呈现出“富含脂肪的”牡蛎，这可使其生殖腺发育以及产生其配子。这种储备物质可在春季用于产生配子以及在整个配子发生过程中使用；因此，产卵牡蛎(géniteurs)的营养决定了繁殖能力和产生后代(recrutement)。碳水化合物储备物质有利于牡蛎表现出完全的繁殖能力，从而有利于实施本发明的方法。
根据本发明，优选选择繁殖期(
de reproduction)(尤其是第一繁殖期)的抗性地中海牡蛎食用牡蛎。选择第一繁殖期的牡蛎可保证用于进行杂交的配子具有最大存活率。
根据本发明，“非抗性牡蛎”意指易受病原体攻击的任何敏感型牡蛎，无论其来源、属或种如何。牡蛎对于病原体不具有抗性可表现为牡蛎生物学功能的任何改变，例如可引起牡蛎生长改变、减少或停止的生物学功能。对病原体不具有抗性还可导致牡蛎死亡。在包拉米虫病的情形中，出现感染的最初指征常常进一步造成生长减慢、腮损伤、贝壳打开以及高死亡率，通常从最初性成熟开始出现。就马泰氏孢子虫病(也称为“Aber病”)而言，在溺湾或其它潮间带的养殖场中可出现下述临床征兆：消瘦和糖原储备耗竭、消化腺完全褪色、停止进食以及牡蛎逐渐衰弱，这些是随后出现高死亡率的征兆。
换句话说，所述非抗性牡蛎可以是对养殖牡蛎的病理学敏感的任何牡蛎。例如，其可以是牡蛎科(Ostréidés)的双壳牡蛎。
例如，所述非抗性牡蛎可以是对1型牡蛎疱疹病毒(OstreidHerpesvirus-1，OsHV-1)敏感的牡蛎。
例如，所述非抗性牡蛎可以是由于以下环境因素改变而引起免疫防御下降的牡蛎：毒性元素、污染物或环境的物理化学因素(Gagnaire B.，2005)[10]。
例如，所述非抗性牡蛎还可以是通过遗传漂变而对感染原敏感的牡蛎，所述遗传漂变是由孵化场所中的培养措施或选择压力而引起的(Taris N.，2007)[15]。
根据本发明，可根据本发明方法进行杂交的非抗性牡蛎可选自从天然收集(collection)或孵化场所获得的野生型牡蛎、养殖牡蛎，天然牡蛎品系，地中海本地牡蛎以及来源于地中海以外地区的牡蛎。例如，所述非抗性牡蛎可以是来自大西洋、太平洋和/或印度洋的牡蛎。
根据本发明，所述非抗性牡蛎可例如是由于牡蛎养殖而退化或者被来自大西洋、太平洋和/或印度洋的敏感型牡蛎和/或受污染牡蛎的迁移而污染的地中海牡蛎。
根据本发明，非抗性牡蛎可以是与所述抗性牡蛎食用牡蛎相同或不同的属或种。其可以是例如平牡蛎或葡萄牙牡蛎。例如，可用于本发明中的非抗性牡蛎种类可属于但不限于下述属和/或种：食用牡蛎、扁牡蛎(Ostrea angasi)、奥林匹亚牡蛎(Ostrea conchaphila)、浅黄牡蛎(Ostrea lurida)、密鳞牡蛎(Ostrea denselamellosa)、Ostrea puelchana、叶片牡蛎(Ostrea folium)、Ostrea permollis、Ostrea stentina、智利平牡蛎(Tiostrea chilensis)、美洲牡蛎(Crassoster virginica)、巨牡蛎(Crassostrea gasar)以及红树牡蛎(Crassostrea Rhizoporae)等。
所述非抗性牡蛎可选自例如巨牡蛎(其是红树、河口和西非红树的牡蛎)、红树牡蛎(Crassostrea Rhizophorae，一种红树牡蛎)、印度洋-太平洋牡蛎等。
所述非抗性牡蛎食用牡蛎可例如选自如下牡蛎：来自托湖(Etang deThau)“Bouzigues”的平牡蛎、来自威尼斯潟湖的牡蛎、来自威尼斯的平牡蛎、来自阿尔卡雄湾(Bassin d’Arcachon)“Gravettes”的平牡蛎、来自沙伦特河(Charente)和/或旺代(Vendée)的平牡蛎、来自南布列塔尼(Brittany)“Belon”的起源于溺湾和莫尔比昂湾(golfe du Morbihan)的平牡蛎、来源于北布列塔尼和诺曼底的“Canceles”的牡蛎、来源于西班牙的加利西亚(Galice)的牡蛎、来源于葡萄牙的牡蛎、来源于大不列颠、康沃尔的牡蛎、来自南爱尔兰和北爱尔兰的牡蛎、来自荷兰的牡蛎、来自丹麦的牡蛎、来自美国和加拿大、西大西洋(从佛罗里达到魁北克)的牡蛎、来自东太平洋的源于美国和加拿大海岸的牡蛎、来自加利福尼亚和阿拉斯加之间海岸的牡蛎。
为了实施本发明的方法，非抗性牡蛎可以是感染或未感染病原体的、耐受或不耐受病原体的。当在表现其所具有的病变之前可进行初次繁殖时，所述牡蛎是所述耐受型牡蛎。
根据本发明，为了实施本发明的方法，优选在性潜伏期(repossexuel)之后选择所述抗性地中海牡蛎食用牡蛎和非抗性牡蛎。该时期通常出现在冬季。然后，优选使这些抗性和非抗性牡蛎适应于杂交，例如在孵化池中，例如逐渐增加光周期。
根据本发明，可根据针对病原体的抗性或非抗性特征分别对所述牡蛎进行标记。可通过本领域技术人员公知的任何方法进行标记，例如通过划痕或使用胶水(例如环氧树脂胶)固定标签来实现。对牡蛎进行这样的单独标记可形成杂交牡蛎苗的同源批次。
根据本发明，用于杂交的牡蛎是异性的。牡蛎属的平牡蛎是非同步双壳，具有节律性的连续性行为。通常是先雄后雌(protandrique)，其可在同一季节中数次改变性别，由于雄性和雌性品系同时存在，使得难于辨认性别。与牡蛎属相关的这种特殊繁殖方式在大量繁殖的情形中妨碍对遗传同一性的任何控制。因此，当杂交涉及牡蛎属的抗性和非抗性牡蛎时，优选两两分离牡蛎。换句话说，由此优选两两分离牡蛎。从理论上讲，所分离的每对牡蛎应当仅有一半机会是雄性-雌性配对的。有利地，在本发明中，70％～80％的配对发生受精。事实上，最早成熟的牡蛎的成熟可导致另一只牡蛎的性别朝相反方向发展。因此，本发明所获得的杂交数目高于所假设的理论数目。
应当指出，牡蛎更通常是广温性和广盐性的。这种耐受有利于同步成熟和配子排出以及来源于不同地理介质的两只牡蛎的杂交。
根据本发明，所述病原体可选自细菌、寄生虫和病毒。
根据本发明，“病原体”意指一种病原体或几种病原体，或者一种病原体与引起细菌性病变、病毒性病变、寄生虫病或与此相关之病变的其它病原体的组合。
根据本发明，所述病原体可选自单孢子虫(haplosporidies)、原生动物、马泰氏孢子虫(martelias)、寄生虫以及启动牡蛎中一般性细胞和/或体液免疫机制的外部污染病原体(例如牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫病原体)。
根据本发明，所述病原体可引起病变，例如包拉米虫病、马泰氏孢子虫病、单孢子虫病(haplosporidose)、小红细胞症(microcytose)、派琴虫病(perkinsose)和/或irivovirose。优选地，所述病原体引起包拉米虫病和/或马泰氏孢子虫病。
根据本发明，所述病原体可引起动物流行病、大规模的或反复的死亡综合征，例如与诸如培养介质温度升高和/或1型牡蛎疱疹病毒(OsHV-1))以及与机会致病性病原体(例如诺卡氏菌(Nocardia crassostreae))相关的夏季死亡。这些在对具有经济效益的软体动物中有所描述的病原体和/或机会致病性病原体总结于“Synopsis of Infectious Diseases andParasites of Commercially Exploited Shellfish”(Bower等，1994)[13]和(Bower&McGladerry，2003)[14]中。
具体实施方式
下文描述用于实施本发明方法的手段。
根据本发明，杂交可在本领域技术人员公知的能实施牡蛎杂交的任何池中进行。例如，所述池可以是育苗容器(bac d’éclosion)，养鱼缸，由玻璃、木材、金属、合成材料或砖石结构制得的任何池、容器或盆，或者任何合适的器皿。用于实施本发明方法的池的容积可例如是1～100升，优选5～20升。
根据本发明，所述池可包括水充氧装置(moyens d’oxygénation del’eau)。例如，可利用本领域技术人员公知的任何装置向水充氧，例如能将空气排放到池的水中的泵。也可以利用水循环来充氧。可在实施杂交的过程中调节水的充氧速率，优选地，无论本发明所需的温度和盐度水平如何，均以用溶解氧使水介质饱和为准。氧的水平可以是5mg/l至11mg/l，优选高于6.5mg/l。根据本发明，包含待杂交之牡蛎的池可例如预先装满水，其通过水循环连续或间断供应来实现。所述水循环速率可为0升/小时至100升/小时，优选为5升/小时至20升/小时。所述速率可根据牡蛎和幼体的呼吸和进食需求进行调整。
根据本发明，池与池之间的水循环可以是隔离的。更具体而言，水循环的隔离可避免对待杂交之牡蛎的外部影响，从而保证杂交幼体的纯度。这种隔离可例如防止产生具有不期望之基因污染的杂交体。
根据本发明，本发明所用的水可以是适于实施杂交的任意水。适于实施本发明的水可例如是与非抗性牡蛎的原始介质和/或抗性牡蛎的原始介质之物理化学特性(例如盐度、pH、温度等)相同、不同或介于之间的水。
根据本发明，随着本发明方法之步骤的变化，水可以具有不同的组成。
根据本发明，所用水的盐度可为3‰～50‰，优选为12‰～38‰。其pH可为6.5～9，优选7～8.5。其温度可为-8～+55℃，优选12～40℃。
根据本发明，用于实施本发明的食物供应可由本领域技术人员公知的用于养殖牡蛎和/或杂交牡蛎的任何食物来源组成。所述食物供应可由例如单细胞藻类、浮游植物、用于提供食物微粒的水底细菌、组合食品、溶解的有机物质供应(例如碳水化合物、蛋白质、维生素等)或其组合组成。
浮游植物、水底细菌以及单细胞藻类可来源于牡蛎的孵化场所和/或天然培养介质。微粒可以是天然或人工来源的，例如其可来源于有机废弃物和/或水产养殖废弃物。
单细胞藻类和/或浮游植物可例如通过离心浓缩成冷糊形式，所述食物微粒可例如采用混悬和/或乳剂形式，组合食物可例如是干燥的或水合的、可与甘油和/或脂质和/或蛋白质物质一起被挤出、标定或微囊化的。
生长在孵化场所和/或天然介质中的单细胞藻类可选自金藻(Isochrysisgalbana)、中肋骨条藻(Skeletonema costanum)、路氏杷夫藻(Pavlovalutheri)、钙质角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、扁藻(Tetraselmis sp.)等。例如，浮游植物可选自金藻、路氏杷夫藻、Chaetoceros forma pumilum等。所用的浮游植物和单细胞藻类的数量和质量优选地适于实施本发明的方法。营养是产卵牡蛎繁殖以及成功产生幼体和杂交牡蛎的重要因素。
在本申请中，“杂交”意指本领域技术人员公知的能实施上述至少一种抗性牡蛎与一种非抗性牡蛎杂交的任何方法。也可根据Lannan J.E，1971，Experimental self-fertilization of the Pacific oyster，Crassostreagigas，utilising cryopreserved sperm，Genetics，68：599-601[5]以及Bougrier和Rabedomanana，1986，Cryopreservation of spermatozoa ofthe Japanese oyster，Crassostreea gigas.Aquaculture，58：227-280[6]的研究中的精子冷冻保藏技术，或者通过使用Haffray等“Domesticationet amélioration génétique des cheptels piscicoles dans le cadre duSYSAAF”，INRA Prod.Anim.，2004，17(3)，243-252[7]的配子多种特异性保藏和清洗稀释剂，利用上述抗性和/或非抗性牡蛎的配子直接实施杂交。养殖知识可通过性别控制、通过产卵牡蛎的个体成熟、通过产卵牡蛎之间的同步产卵和化学物质交换来控制所鉴定个体的人工繁殖。这些知识见于科学综合刊物中：Gerard A.，Naciri-Graven Y.，Boudry P.，Launey S.，Heutebise S.，Ledu C.，Phelipot P.，(1997).
de lagamétogénèse des
creuses et plates.In：La productionnaturelle et
des Bivalves cultivés en France，Devauchelle N.，Barret J.，Salaun G.，(1997)，DRV/RA/RST97-11，Ifremer Brest，217页[8]。
根据本发明的一个具体实施方案，杂交可包括下述步骤：
a)提供抗所述病原体的地中海牡蛎食用牡蛎；
b)提供不抗所述病原体的非抗性牡蛎，其性别与所述抗性牡蛎食用牡蛎相反；
c)将所述牡蛎一起放入含水的池中，所述水具有能够进行杂交的盐度；
d)使所述牡蛎在所述池中成熟，其中为所述成熟提供逐渐增加的光周期和充足的食物供应；
e)使用应用于所述牡蛎的诱导剂来诱导雄配子排出；
f)用步骤e)中排出的雄配子使雌配子受精；
g)孵育步骤f)中所得的幼体8～10天；
h)向步骤g)中所得的幼体喂食浮游植物，从而得到有眼幼体(eyedlarvae)；
i)收集所得的有眼幼体；以及
j)将所述幼体固定于发育支持物(support de développement)上，从而得到至少一个抗所述病原体的牡蛎。
根据本发明的方法，步骤a)中提供的抗病原体的地中海牡蛎食用牡蛎是上文所述的抗性牡蛎。
根据本发明的方法，步骤b)中提供的不抗病原体的牡蛎是上文所述的非抗性牡蛎。
根据本发明的方法，步骤c)是将步骤a)中所得的至少一只牡蛎与步骤b)中所得的至少一只牡蛎一起放入池中。例如，可将步骤a)中所得的若干只牡蛎与步骤b)的一只牡蛎一起放入池中；反之亦然。也可以将步骤a)中所得的若干只牡蛎与步骤b)中所得的若干只牡蛎一起放入池中。
优选地，在本发明方法的步骤c)中，本发明方法步骤a)和b)中提供的所述牡蛎两两分离，即每个池中仅包含两只牡蛎，一只对应于步骤a)中所得的牡蛎，另一只对应于步骤b)中提供的牡蛎。
本发明方法中所用的池可以是上文所述的池。
可通过上述实施手段进行步骤d)～i)。这些手段可适用于本发明方法的每个步骤。
根据本发明的方法，本发明方法步骤d)中实施的成熟可通过本领域技术人员公知的使牡蛎成熟的任何方法来进行。优选地，通过逐渐增加光周期来使牡蛎成熟。这种增加可进行1周至6个月，优选1个月至3个月。最小光照时间为1小时至12小时，最大光照时间可以为12小时至23小时。该成熟步骤可能在实施本发明方法的任意温度下进行。优选地，所述成熟可通过逐渐升高温度直至优选20～30℃的温度来进行。优选地，所述成熟在20～30℃的温度下进行。更具体地，对最终成熟温度的选择取决于杂交方法中使用的品系及其对成熟的响应。可根据待杂交的牡蛎来调节温度。可通过控制生殖腺的成熟和配子形成来控制此步骤中牡蛎的应答。牡蛎具有不同的成熟期，从0(相当于性潜伏期)至4b(相当于配子排出期)。可利用本领域技术人员公知的方法来控制成熟，例如使用氯化镁(MgCl2)观察麻醉浴中的壳打开。在本发明的方法中，当牡蛎的生殖腺成熟度达到第3期时，认为牡蛎已成熟。
在该成熟步骤中，可通过本领域技术人员公知的任何合适方法进行食物供应。其可以是例如先前所定义的食物供应。其可以是例如单细胞藻类、浮游植物、水底细菌、食物微粒等。
在一个具体实施方案中，其中在成熟步骤中向所述池提供水循环，池与池之间的所述循环可以是隔离的。此外，隔离的水循环可避免池与池之间的水交换，从而避免物质(例如蛋白质和/或病原体和/或由饲养在其它池中的成熟牡蛎排出的化学物质)的交换。这些物质可能决定产卵牡蛎的性别。饲养在其它池中的成熟牡蛎所排出配子的交换是实施本发明所不期望的，其可导致姐妹品系之间的不期望的自受精。
根据本发明，本发明方法步骤e)中所定义的配子排出的诱导优选地针对成熟牡蛎来进行，例如生殖腺成熟度为3期的牡蛎。这些成熟牡蛎可例如是在本发明方法步骤d)中所得的牡蛎。本发明方法步骤e)中所用的诱导剂可以是本领域技术人员公知的任何诱导手段，例如，至少一种热休克和/或至少一种蛋白质(例如激素、化学物质或神经递质(例如5-羟色胺))。
优选地，所述诱导剂可以是一次或几次热休克。其相当于相继降低和升高温度，其中温度变化适于本发明方法的实施。例如，最高温度可以为25～55℃，最低温度为5～20℃。
诱导(例如热休克)首先使雄配子排出，这刺激雌配子产出。对雌配子排出的诱导是雄配子通过化学方式来实现的。其可以例如是激素或神经递质(例如5-羟色胺)。
对雌配子排出的诱导也可以通过本领域技术人员公知的诱导雌配子排出的任何物质来进行。例如，化学物质、激素或神经递质(例如5-羟色胺)，例如含雄配子的水、含有配子的过滤水和/或含有来自冷冻保藏的活性精子的稀释介质。
在一个具体实施方案中，诱导牡蛎配子排出的步骤e)优选在不具有任何水循环的池中进行，以防止所述配子分散。在该情形中，如果在先前步骤中进行了水循环，则在该步骤e)中将水循环关闭。
在步骤e)的另一具体实施方案中，池与池之间的水循环也可以是隔离的，从而防止物质(例如激素或雄配子)分散到其它池中。
根据本发明的方法，步骤f)对应于用雄配子使雌配子受精，所述雄配子先前被所述雌性牡蛎过滤。受精发生在牡蛎的外套腔(cavitépalléale)中。实施该步骤的手段可以是先前所述的手段或者本领域技术人员公知的任何手段。当然，这些手段优选地适于实现受精。
根据本发明的方法，幼体的孵育(例如步骤g)中所定义的)可优选地在牡蛎的外套腔中进行。在该幼体孵育步骤中，实施该步骤的手段可以是先前所述的手段或者本领域技术人员公知的任何其它手段。这些手段优选地适于实现此种孵育。该孵育步骤可进行8～10天。在该孵育步骤中，可例如用上文所述的浮游植物或任何其它合适的食物饲喂牡蛎和幼体。该孵育期之后，将所述幼体放入所述介质中。
根据本发明的方法，对应于诱导产卵、受精和幼体孵育的步骤e)～g)可以在体外、雌性外套腔外或者在体内雌性外套腔内进行。当步骤g)在体内进行时，即在雌性牡蛎的外套腔中进行，配子在雌性牡蛎的外套腔中被过滤、受精并孵育。以可在步骤g)中排出幼体的方式进行孵育。
在体外，可通过划开生殖腺(“剥离”技术)获得配子，这可以计划并控制发育和受精的时期。
根据本发明的方法，步骤h)对应于饲喂步骤g)中排出到介质中的幼体，以获得有眼幼体。能饲喂幼体的浮游植物(如上文所述)可以是本领域技术人员公知的能实施该步骤的任何浮游植物。用于实施该步骤的手段可以是先前所述的手段或者本领域技术人员公知的任何手段。这些手段优选地适于进行幼体饲喂。
根据本发明的方法，步骤i)对应于收集步骤h)中获得的有眼幼体。有眼幼体的收集可例如在幼体排出后8～10天进行。收集有眼幼体的手段可以是本领域技术人员公知的任何手段，例如滤器、具有能收集幼体之直径的孔的筛。例如，筛的网眼尺寸可以为10μm～180μm，优选50μm～150μm。可根据所排出幼体的大小来选择网眼尺寸，并且网眼尺寸必须小于所排出幼体的大小。
根据本发明的方法，步骤j)对应于将所述幼体固定于发育支持物上。所述固定可在如上所述的池中实施。用于该步骤的实施手段可以是上文所述的手段或者本领域技术人员公知的任何手段。这些手段优选地适于实施受精。所述池的壁上可包含相同的或不同的发育支持物。幼体发育支持物可以是能够实现本发明方法的任何支持物。例如，所述发育支持物可以是微粉碎的牡蛎壳或蚌壳或者微粉碎的玻璃和/或所筛出的例如250μm～500μm的任意物质，其能使通过本发明方法获得的幼体进行演替(procédé)并且获得游离的牡蛎苗。
固定步骤之后，牡蛎苗进行发育，从而获得至少一个杂交牡蛎。用于实施该发育步骤的手段可以是先前所述的手段或者本领域技术人员公知的任何其它手段。这些手段优选地适于幼体发育。
根据本发明，可例如仅在一个繁殖季节进行杂交，例如在最初成熟当年的6个月期间。可选择温度和饲喂条件，从而使每只牡蛎在其最初成熟期间数次改变性别。所述牡蛎能以10～70天的间隔排出新配子。
有利地，在最初成熟当年实施本发明的方法可获得质量最佳的配子和源于幼牡蛎的幼体。
根据本发明方法获得的杂交牡蛎是“同胞兄弟(plein-frères)”类型，它们仅来源于具有特定遗传多态性的亲本，所述遗传多态性是由通过杂合方式使它们独特及互补的地理特征和生态特性结合起来而导致的。这种杂交和杂交体的形成可获得具有抗病原体之特性的杂交体。
本发明方法的杂交不会在自然界中发生，更特别地，这是由牡蛎属的繁殖生物学特性以及遗传学上不同的野生型种群之间的地理距离所致。所述养殖系统通常仅使用F1杂交体，这是因为，由于牡蛎特别容易发生近亲退化(dégénérescence consanguine)，杂交特征在后代中很快丢失。因此，本发明的方法可获得第一代抗性牡蛎。
抗性杂交牡蛎可在多种条件下生长。根据所获得的杂交性能，它们可在亲本的原始环境中生长。例如，科西嘉岛抗性牡蛎食用牡蛎与来自大西洋的非抗性牡蛎杂交得到能在大西洋沿岸以及地中海沿岸生长的抗病原体的杂交体。本发明的这一方面相对于现有技术具有很大的优势，已知所述抗性科西嘉岛牡蛎不能在大西洋沿岸生长，因为科西嘉岛牡蛎不适应例如潮汐现象，并因此不适应“浸没和浮出(d’immersion etd’émersion)”现象、介质(例如盐度、温度)改变。
通过杂交获得的抗性牡蛎由于其抗性及其对介质的适应能力可降低成本并且显著提高被病原体感染之牡蛎养殖场中的牡蛎产量。
利用本发明方法获得的抗性牡蛎还具有适应天气变化(例如培养介质温度升高)的特性。
此外，与其来源的亲本相比，杂交体每天生长可提高多达30％。该方面增加了在牡蛎养殖场中利用所述抗性杂交体的意义。
这些通过杂交获得的抗性牡蛎还可使被输入性病原体感染的区域或者并非通过人为养殖受感染之牡蛎而感染的区域复原，以及能够恢复海洋生态系统。
这些通过杂交获得的抗性牡蛎还可重新建立在牡蛎养殖场中生长的近亲性(consanguinité)越来越严重的品系的生物多样性。所述近亲性是品系退化的根源以及牡蛎养殖场产率降低的原因。
牡蛎的近亲性可导致牡蛎对病原体的抗性降低，这是因为从二十世纪二十年代以来已在牡蛎养殖场中观察到动物流行病现象成倍增加[16]。
根据本发明获得的抗性杂交牡蛎具有对本领域技术人员而言公知的病毒性、细菌性和/或寄生虫性病原体的抗性增强。抗性增强可以是例如细胞和体液免疫应答提高，就血细胞防御而言尤为如此。这些性质可例如由杂合性引起的遗传多样性而导致[15]。
根据本发明获得的抗性杂交牡蛎可解决牡蛎养殖场中反复性的动物流行病问题，例如由于水温升高引起的动物流行病或者由于1型牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)引起的动物流行病。事实上，与近亲牡蛎相比，根据本发明方法获得的牡蛎的遗传多样性使得它们适应性更强(rusticité)并且具有更高的免疫力，从而可抵抗由于环境改变以及更特别地由于天气变化而引起的偶发性感染[10]。
对于本领域技术人员而言，通过阅读下文中作为示例给出的实施例，其它优点也将显现。
实施例
实施例1：来自科西嘉岛黛安娜湖的抗性牡蛎食用牡蛎
从黛安娜湖(普遍认为该湖从二十世纪八十年代起被寄生虫牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫污染)收集野生型牡蛎，在孵化场所中成功繁殖。生长至0.2g的牡蛎苗可在该湖中获得良好品质的实验产量。从该成功可得出以下结论：
-在被牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫污染的区域中不存在市场规模(taille de commercialisation)的发病，这表明平牡蛎食用牡蛎的科西嘉岛品系特有的遗传多态性具有针对寄生虫病的抗性。
-在第18个月获得了第一批大小为n°1～n°0的0.2g的牡蛎苗，表明科西嘉岛品系具有高生长潜力。与大西洋中Belon平牡蛎的生长周期相比，科西嘉岛品系的生长周期缩短了超过50％。
-状态指数(indice de condition)是16％(可食用肉的重量相比于总重量)，这高于南布列塔尼的Belon牡蛎的状态指数。味觉满意度测试证实了科西嘉岛品系具有从商业角度看的优异品质。
然后，测试了所述品系的健康状态以及对病原体的抗性。这些测试根据O.I.E.(世界动物卫生组织(Organisation Mondiale de la SantéAnimale)，针对包拉米虫病和马泰氏孢子虫病)的方案进行：
-利用显微镜对心室和腮的组织照片(empreinte tissulaire)进行细胞学检查：着色后，未观察到血细胞内存在2～5μm的小的球形或卵形生物(包拉米虫)。
-利用显微镜对腮、消化腺、经固定并着色的生殖腺的组织样品进行组织病理学检查。未观察到游离状态的或血细胞内的2～5μm的寄生虫细胞(包拉米虫)。未观察消化腺异常，也未观察到表明马泰氏孢子虫存在的20～30μm的球形生物。
-使用单克隆抗体免疫荧光技术的检测表明科西嘉岛品系对存在于自然环境中的寄生虫包拉米虫和马泰氏孢子虫具有抗性。
-聚合酶链式反应(PCR)：利用靶向马泰氏孢子虫ITS1区域的特异性DNA探针，未检测到该寄生虫。
-PCR-RFLP分析(限制性片段长度多态性)：从牡蛎组织中提取的、靶向寄生虫牡蛎包拉米虫特征性片段SSU rDNA的DNA为阴性结果，表明科西嘉岛品系中不存在污染。
-分子原位杂交技术(ISH)：将牡蛎包拉米虫之片段SSU rDNA的DNA特异性探针和马泰氏孢子虫之片段ITS1的DNA特异性探针与牡蛎组织的组织学样品接触。利用显微镜观察得到的阴性结果表明，科西嘉岛品系的组织中不存在牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫。这一研究显示，来自黛安娜湖的平牡蛎野生种群在该自然环境下与牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫接触后，不被这些寄生虫所感染。
将这些寄生虫进行人工接种测试。
-将来自科西嘉岛的平牡蛎与被牡蛎包拉米虫严重污染的牡蛎一起限制于池中数月。所述牡蛎没有发生疾病，并且对上述检测试验呈阴性。
-将含有5×106个活寄生虫牡蛎包拉米虫(根据Mialhe等人(1988)的方法进行分离)的50μl过滤海水注射到科西嘉岛牡蛎的外套腔中。预先在3.5％MgCl2-6H2O溶液中对牡蛎进行麻醉浴，以使其打开壳。
将污染剂量的接种体注射到外套腔中后，将牡蛎在水外保持1小时，然后放回充满海水的培养池中，其中通过吹泡向所述海水充气。培养1个月后，未观察到死亡，并且所述牡蛎对上文所述的牡蛎包拉米虫检测试验呈阴性。在缺乏直接水平传递该寄生虫的情况下，通过浸浴或通过注射进外套腔的该实验性感染技术不能用于测试针对马泰氏孢子虫的抗性。
这些实验表明，来自科西嘉岛和撒丁岛(更特别地来自黛安娜湖、乌尔比诺湖、波尔图维基奥海湾和Santa Manza海湾、撒丁岛潟湖)的野生型平牡蛎能100％抵抗寄生虫牡蛎包拉米虫(一种单孢子虫家族的原生动物)。这些实验与现有的以下科学知识是非常矛盾的：食用牡蛎的本地品系会被原生动物引起的疾病大量杀死，这种错误的记载可见于文献(MINICONI R.，2000，Les fruits de mer des
de Corse，Editions Alain Piazzola，P.90[9])中，其实际上是指从大西洋输入的无抗性和/或被感染的牡蛎苗试验培养物。
对来自科西嘉岛的平牡蛎进行的所有研究的交叉验证表明，野生型品系对启动双壳类动物之细胞免疫(血细胞)和体液免疫一般机制的单孢子虫、原生动物、马泰氏孢子虫(martelias)、寄生虫、机会性致病病原体以及外部污染物具有抗性，其免疫系统是非获得性的，即无任何免疫记忆。
根据前述方案测试了来自地中海的其它野生型平牡蛎种群，结果显示所有种群都能抵抗寄生虫牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫。这涉及了来自科西嘉岛、摩洛哥(纳多尔潟湖)、突尼斯(加贝斯海湾)、利比亚(邻接突尼斯边界和希腊的潟湖)的野生型种群。
实施例2：来自科西嘉岛黛安娜湖的抗性牡蛎食用牡蛎
从黛安娜湖(该区域被病原体牡蛎包拉米虫和马泰氏孢子虫污染)收集野生型牡蛎，在孵化场所中繁殖。所述野生型牡蛎直接取自天然场所，并且对病原体具有抗性。
所取野生型牡蛎的直径大于60mm，并且处于第一繁殖期。
一经取得样品，便将牡蛎置于容积为20L、充满20L海水的容器中并送至孵化场所，所述海水的盐度为37‰，温度为13℃，pH为8.1。在进行包装之前，使用环氧树脂胶粘贴的标签对所得牡蛎进行标记。
实施例3：非抗性牡蛎
在该实施例中，从天然收集物中选择Belon品质的未成熟牡蛎(“Quiberon”品系，南布列塔尼)，其大小为60mm。用于实施本发明方法的牡蛎是未表现出发病的牡蛎。
实施例4：用于受精的牡蛎的成熟
在对实施例2和3中待杂交的牡蛎取样之后，将它们分离并两两组合，这意味着敏感型牡蛎与抗性牡蛎相组合。从而组成20对。然后将所述配对置于20个预先充满的池中，每个池的单元容积为20L。每个池预先充满20升盐度为37‰的海水。水的pH为8.1。水的初始温度为13℃，并在2周内升至20℃。通过泵系统向每个池的水中充氧气，气流速度为20L/小时。
在成熟期间，通过封闭水循环来供水，并且每个池的水循环是隔离的。在整个成熟期间，水的物理化学特性保持恒定。
通过将光周期从9小时提高到15小时，并且将水温逐渐升高至20～30℃，经15～90天使牡蛎成熟。
在该成熟期中，通过向介质中添加来源于孵化场所的单细胞藻类品系金藻、中肋骨条藻、路氏杷夫藻、钙质角毛藻或者来自SATMAR公司之冷冻浓缩糊来提供食物。随意供应食物，一日三次，只要观察到牡蛎进食即可。通过添加有机物质(更特别地来源于幼鱼饲养池的废弃物)来同时补充食物供应。
利用本领域技术人员公知的技术在使用氯化镁(MgCl2)的麻醉浴中通过观察生殖腺成熟期来检查成熟度。Gagnaire B.，2005，“Etudedes effets de polluants sur les paramètres hémocytaires de creuse Crassostrea gigas-Interactions entre environnement，mécanismes de défense，et maladies infectieuses”，博士论文，LaRochelle University，412页[10]。
当生殖腺成熟度达到3期时，就诱导配子产生而言，牡蛎是成熟的。
实施例5：诱导配子排出和配子受精
对根据实施例4已成熟的牡蛎进行诱导配子排出。
利用与实施例4同样的条件、手段和同样的牡蛎对进行诱导配子排出。
在诱导之前，停止水循环以避免配子在培养介质中分散。
通过热休克来诱导配子排出。温度在最低值23～30℃和最高值30～37℃之间交替降低和升高4～7℃。
雄性首先产生配子，其通过化学方式诱导雌性牡蛎的雌配子排出。
释放在介质中的精子被雌性过滤。受精发生在其外套腔中，在所述外套腔中孵育幼体8～10天，然后幼体被排出。每只雌性排出以百万计之数量的幼体。
在外套腔中孵育幼体的步骤期间，再次使水循环起来。用浮游植物饲喂幼体。用于饲喂所述幼体的浮游植物由来源于孵化场所以外的池中培养物(cultures en masse)的金藻、路氏杷夫藻、Chaetoceros formapumilum组成；必要时，补充来自SATMAR公司的藻类浓缩糊。对于第一阶段的幼体而言，所用浮游植物的尺寸为20～40μm；对于成体阶段变形后而言，所用浮游植物的尺寸为50～200μm。每天向介质中随意添加浮游植物，同时在进食过程中中止水循环来观察池中的食物循环。
实施例6：幼体的收集和固定
通过筛来收集实施例5的介质中排出的幼体。所述幼体的收集和固定条件与实施例3中的相同。所用筛的直径为120μm。使用筛可收集培养介质中存在的幼体。依据它们的亲本，将它们归类到同源批次中。在池中进行分组，所述池的底部覆盖有微粉碎的牡蛎壳和蚌壳，通过250μm～500μm的筛来标定所述壳。
所述池的容积为2～5m3。所述池内充满盐度37‰、pH8.2、温度20～25℃的水。用泵以2～5m3/小时的气流速度向封闭循环中的池充氧。孵育8～10天后，将幼体固定在发育支持物上。固定幼体的方法是用于将幼体固定在支持物上的常规方法，更特别地是描述于IFREMER的技术文献(Ifremer，2007，Datasheet on aquaculture，2007年3月17日，“Lesécloseries：cas de
creuse”[11])中的方法以及Helm，M.M.，Bourne，N.，Lovatelli，A.，(comp./éd.)Ecloseries de bivalves，Un manuelpratique.FAO document technique sur les 
No471.Rome，FAO.2006.184页[12]的方法。
实施例7：抗性和非抗性牡蛎
下文表中示出用于本发明方法的抗性和非抗性牡蛎的其它实例。
表1：抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表2：抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表3：非抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表4：非抗性牡蛎食用牡蛎
表5：其它非抗性牡蛎
表1：抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表2：抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表3：非抗性地中海牡蛎食用牡蛎
表4：来自大西洋、太平洋和印度洋的非抗性牡蛎食用牡蛎
表5：与食用牡蛎不同属或不同种的非抗性牡蛎
8.其它杂交实施例
下文表中显示了本发明范围内的其它实例。对于在一段时间内扩大开发驯养牡蛎(先前已选择其特征以满足所涉及培养介质的物理、生物学和商业限制)来说，实施本发明的杂交可获得针对发病的抗性。
表6：根据本发明方法杂交获得抗性牡蛎的实例
+：杂交体
?：未检测
表6：根据本发明方法杂交获得抗性牡蛎的实例(续)
+：杂交体
?：未检测
利用本发明方法(例如之前所述的方法)获得的杂交体具有这种杂交所需的特定特征，这满足了对常规生产平牡蛎的需求。所述杂交体对包拉米虫病和马泰氏孢子虫病具有抗性。此外，它们对机会性致病病原体具有抗性。所述杂交体对于介质变化幅度不敏感且耐受，例如陆地浮出或被潮汐浸没、温度和盐度。它们的生长潜力大。它们适于培养在潮间区域的富含营养物和有机物的水中，并克服由于天气原因使沿海的水升温的限制。最后，杂交体能耐受缺氧、干涸和运输限制。
实施例9：来自科西嘉岛中湖的野生型牡蛎与来自摩洛哥纳多尔潟湖的牡蛎之间的杂交
根据本发明的方法使来自科西嘉岛中湖的野生型牡蛎与来自纳多尔潟湖的牡蛎进行杂交。在该情形中，这是两种抗性牡蛎之间的杂交。纳多尔与直布罗陀海峡邻近，使得潟湖中的潮汐可达到2米，并造成摩洛哥牡蛎天然种群的短时浮出水面。来自黛安娜湖的牡蛎与来自纳多尔的牡蛎的杂交可得到对致命性疾病具有抗性、具有适应于来自大西洋潮汐之限制的生长、对由于天气变暖引起的温度升高耐受以及对售出前运输中干燥具有抗性的杂交体。
对杂交体牡蛎苗的产量与同时在孵化场所中产生的来自于纳多尔牡蛎苗的产量进行了比较。在变形后的当月中，杂交体的平均日生长比摩洛哥牡蛎苗对照批次的高出30％。此外，驯养的杂交体牡蛎苗的相关大小比对照批次的均匀得多，所述对照批次的大小看上去非常不均匀。对照杂交诱导的杂种优势效应(杂交体优势)证实，在驯养平牡蛎生产的范畴内，其具有强大的养殖潜力。
由此产生的驯养杂交体F1解决了大西洋沿岸牡蛎养殖场中平牡蛎“Belon”的退化问题。
因此，由本发明方法的这种杂交所获得的广泛适应性满足了葡萄牙、加利西亚、布列塔尼、诺曼底、爱尔兰和荷兰常规生产平牡蛎的需求。杂交体对包拉米虫病和马泰氏孢子虫病具有抗性。它们对机会性致病病原体也具有抗性。杂交体对潮汐幅度和介质(例如温度和盐度)变化不敏感且耐受。它们的生长潜力大。它们适于培养在潮间区域(潮间带培养)的富含营养物和有机物(在溺湾中提纯、在牡蛎凹陷中提纯)的水中，并克服由于天气原因使沿海的水升温的限制。最后，杂交体能耐受缺氧、干涸和与运输有关的限制——当从科西嘉岛寄送包裹至布列塔尼时表现出的抗性。
参考文献列表
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[16]Anon.，2008，“L’ostréiculture marquée par Ies épizooties”，Le Marin n°3183，vendredi 11 juillet 2008，5.
Claims (24)
1.获得抗病原体之牡蛎的方法，其特征在于包括将抗所述病原体的地中海牡蛎食用牡蛎(Ostrea edulis)与异性非抗性牡蛎杂交。
2.根据权利要求1的方法，其中所述病原体选自细菌、寄生虫和病毒。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述非抗性牡蛎选自以下物种：食用牡蛎(Ostrea edulis)、扁牡蛎(Ostrea angasi)、奥林匹亚牡蛎(Ostrea conchaphila)、浅黄牡蛎(Ostrea luridea)、密鳞牡蛎(Ostreadenselamellosa)、Ostrea puelchana、叶片牡蛎(Ostreafolium)、Ostreastentina、智利平牡蛎(Tiostrea chilensis)、美洲牡蛎(Crassosteravirginica)、巨牡蛎(Crassostera gasar)和红树牡蛎(CrassostreaRhizophorae)。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病原体引起选自以下的疾病：包拉米虫病、马泰氏孢子虫病、单孢子虫病、小红细胞症、派琴虫病和/或irivovirose。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述病原体引起包拉米虫病和/或马泰氏孢子虫病。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述杂交包括下述步骤：
a)提供抗所述病原体的地中海牡蛎食用牡蛎；
b)提供不抗所述病原体的非抗性牡蛎，其性别与所述抗性牡蛎食用牡蛎相反；
c)将所述牡蛎一起放入含水的池中，所述水具有能够进行杂交的盐度；
d)使所述牡蛎在所述池中成熟，其中为所述成熟提供逐渐增加的光周期和充足的食物供应；
e)使用应用于所述牡蛎的诱导剂来诱导雄配子排出；
f)用步骤e)中排出的雄配子使雌配子受精；
g)孵育幼体8～10天；
h)向步骤g)中所得的幼体喂食浮游植物，从而得到有眼幼体；
i)收集所得的有眼幼体；以及
j)将所述幼体固定于发育支持物上，从而得到至少一个抗所述病原体的牡蛎。
7.根据权利要求6的方法，其中所述步骤e)至g)在体外进行，通过划开生殖腺获得所述配子。
8.根据权利要求6的方法，其中所述步骤e)至g)在体内进行，使步骤e)中排出配子受精的步骤f)在配子于雌性牡蛎外套腔中过滤后进行，步骤g)的孵育在雌性牡蛎外套腔中进行从而实现幼体排出。
9.根据权利要求6-8中任一项的方法，其中向所述池连续供应所述水循环，其中对于实施步骤e)而言，所述水循环关闭。
10.根据权利要求9的方法，其中所述水循环是隔离的。
11.根据权利要求6-10中任一项的方法，其中所述步骤d)的成熟在20～30℃之间的温度下进行。
12.根据权利要求6-11中任一项的方法，其中所述池是孵化池。
13.根据权利要求6-12中任一项的方法，其中例如步骤e)中所定义的诱导手段是热休克和/或至少一种蛋白质。
14.根据权利要求13的方法，其中所述热休克通过相继降低和升高温度至5～55℃之间来进行。
15.根据权利要求6-14中任一项的方法，其中所述食物供应由孵化场所中生长的活的单细胞藻类组成。
16.根据权利要求15的方法，其中所述单细胞藻类选自金藻(Isochrysis galabana)、中肋骨条藻(Skeletonema costanum)、路氏杷夫藻(Pavlova lutheri)、钙质角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、扁藻(Tetraselmis sp.)。
17.根据权利要求6-16中任一项的方法，其中步骤i)在幼体排出后8～10天进行。
18.根据权利要求6-17中任一项的方法，其中步骤i)的发育支持物选自250μm～500μm的微粉碎的壳和/或过筛材料。
19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗性牡蛎食用牡蛎具有适于杂交的碳水化合物储备物质水平。
20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述地中海抗性牡蛎食用牡蛎处于第一繁殖期且直径大于60mm。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在性潜伏期之后选择所述抗性牡蛎食用牡蛎和所述非抗性牡蛎。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述杂交仅在一个养殖季节进行。
23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述非抗性牡蛎是来自大西洋、太平洋或印度洋的牡蛎品系。
24.根据权利要求1-23中任一项的方法获得的牡蛎。
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