KR101605448B1 - Ｓａｐ 제거제 및 항-ｓａｐ 항체의 조합 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 아밀로이드증의 치료 또는 예방을 위한, 혈청 아밀로이드 P 성분에 특이적인 항체와 함께 순환계로부터 혈청 아밀로이드 P 성분을 감소시키는 화합물의 용도를 기재하고 있다.

Description

ＳＡＰ 제거제 및 항-ＳＡＰ 항체의 조합{COMBINATIONS OF SAP DEPLETING AGENTS AND ANTI-SAP ANTIBODIES}

참조로의 통합

본 출원은 2007년 6월 27일자 출원된 영국특허출원 0712503.2호의 우선권을 주장한다.

상기 출원 및 이에 인용되거나 이들의 진행 동안 인용된 모든 문서("출원 인용된 문서") 및 출원 인용된 문서에 인용되거나 참조된 모든 문서, 및 본원에 인용되거나 참조된 모든 문서("본원에서 인용된 문서"), 및 본원에서 인용된 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서가, 본원 또는 본원에 참조로 통합된 어떠한 문서에 언급된 어떠한 제품을 위한 어떠한 제조자의 지시, 설명, 제품 명세사항, 및 제품 설명서와 함께, 본원에서 참조로 통합되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 아밀로이드 침착과 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 아밀로이드증의 치료에 관한 것이다.

발명의 배경

아밀로이드증은 아밀로이드 원섬유로 공지된 비정상의 불용성 단백질 섬유의 조직내 축적에 의해서 야기되는 심각하고 일반적인 치명적 질환이다¹. 이러한 섬유는 상이한 형태의 질환에서 상이한 단백질로부터 유래되지만, 모든 아밀로이드 원섬유(amyloid fibril)가 공통의 크로스-β 코어(cross-β core) 구조를 공유하며 모두가 정상적인 가용성 전구체 단백질의 미스폴딩(misfolding )에 의해서 유래된다¹.

아밀로이드 원섬유 자체에 추가로, 아밀로이드 침착물이 항상 프로테로글리칸에 풍부하며, 그러한 프로테오글리칸중 일부는 원섬유에 단단히 결합된다². 정상의 비-원섬유 혈장 단백질, 즉, 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)이 또한 모든 유형의 아밀로이드 원섬유에 대한 이의 강한 특이적 칼슘 의존성 결합 때문에 아밀로이드 침착물에 항상 존재한다^{3 ,4}.

인간 SAP는 혈장내의 구성 단백질⁵이며, 정상의 개체 및 아밀로이드증이 아닌 질환을 앓고 있는 환자 둘 모두의 조합된 혈장 및 혈관외 구획에 약 20 내지 40mg/l의 농도로 존재하며 전체 약 50 내지 100mg의 SAP가 존재한다⁶. 반면, 아밀로이드를 지니는 환자에서는, SAP는 또한 아밀로이드 침착물중에 특이적으로 집중되며, 심한 전신 아밀로이드증을 앓고 있는 개체에서는 아밀로이드내 20,000mg의 SAP까지 많을 수 있다⁷.

아밀로이드 침착물은 세포외성이며, 이는 이들이 구조를 손상시키고, 그리하여, 이들이 점유하는 어떠한 조직의 기능을 손상시킬 때까지의 점진적인 축적에 의해서 질환을 유발시킨다¹. 조직에서 국소적으로 나타나거나 염증의 전신 마커(marker)에 의해서 제시되는, 아밀로이드 침착에 대한 어떠한 염증성 또는 '이물(foreign body)' 반응은 극히 드물다. 소위 전신 아밀로이드증에서, 침착물은 체내의 어떠한 조직 또는 기관에 존재할 수 있지만, 그러한 침착물은 이들 형태의 질환에서의 뇌 물질(brain substance)내에서 결코 보이지 않는다. 전신 아밀로이드증은 선진국에서 전체 사망의 1000명당 약 1명의 원인이며, 아밀로이드 원섬유의 전구체인 단백질의 과다한 양을 충분히 그리고 지속적으로 줄여주지 않는 한, 항상 치명적이다. 이는 많의 형태의 아밀로이드증에서 달성하기 어려우며, 불가능할 수 있고, 그로 인해서, 충족되지 않는 의료 요구가 존재한다^1,8. 침착물이 단일의 해부학적 부위 또는 단일의 조직 또는 기관계로 한정되는 아밀로이드증의 국소 형태가 또한 발생하며 심각한 질환을 유발시킬 수 있다^{1 ,8}.

아밀로이드증에서, 임상적 질환을 유도하는 조직 및 기관의 구조 및 기능에 대한 손상은 명백하게는 아밀로이드 침착물 자체의 점진적인 축적에 의해서 야기된다. 그러나, 아밀로이드 침착물이 항상 존재하는 그 밖의 질환, 가장 중요하게는 알쯔하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 인슐린 비의존형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus)이 존재하며, 이러한 질환에서, 질환, 특히, 인식 기능 및 췌도(pancreatic islet) 기능의 상실에 대한 아밀로이드 침착의 기여는 공지되지 않았다¹. 그러나, 체내의 어느 부위에서든지의 아밀로이드 침착은 명백한 병인이며, 알쯔하이머 질환의 대뇌 아밀로이드 침착 및 인슐린 비의존형 당뇨병의 췌도 아밀로이드 침착이 또한 유해하다. 전신 및 국소 아밀로이드증에서의 아밀로이드 침착물을 제거하는 치료가 확실하게 치료하는 것일 수 있기 때문에¹, 알쯔하이머 질환 및 인슐린 비의존형 당뇨병에서의 아밀로이드 침착물의 제거가 또한 임상적으로 유익할 것이다.

전신 아밀로이드 A 단백질(AA) 아밀로이드증은 아밀로이드 증가 인자(amyloid enhancing factor)로 알려진 아밀로이드 원섬유를 함유한 아밀로이드성 조직의 추출물의 정맥내 주입에 이어진 만성 염증에 의해서 마우스에서 쉽게 유도된다⁹. 이러한 모델은 비장 및 간에서 주된 아밀로이드 침착을 보이는 인간 AA 아밀로이드증과 아주 유사하게 유사하다¹⁰. 예를 들어, 본원에서 기재된 실험에서 사용된 바와 같은, 비교적 간단한 아밀로이드 유도 기간에 의해서, 어느 부위에서든지 아주 약간의 아밀로이드 침착이 존재한다. 아밀로이드 원섬유를 형성하는 AA 단백질은 이의 순환성 전구체, 즉, 급성 상 단백질(acute phase protein)인 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA)로부터 유래된다. SAA의 혈장 농도는 대체로 어떠한 형태의 염증 및 조직 손상에 대한 반응으로 5mg/l 미만의 그 정상의 미미한 값으로부터 급속하게 증가하며, 지속된 자극에 주어지는 경우 1000mg/l 또는 그 초과까지의 값으로 지속될 수 있다. 이러한 증가된 SAA의 생성은 AA 아밀로이드증의 발병에 대한 필수 전조(necessary precondition)이며, 인간 및 마우스 둘 모두에서, SAA 농도가 정상으로 떨어지는 경우, 아밀로이드 침착이 중단되고 기존의 아밀로이드 침착물이 퇴행될 수 있다^{10 -12}. 계속된 SAA 생성의 부재하에, 자발적인 AA 아밀로이드 침착물의 퇴행이 마우스 모델에서 전신적이지만¹¹, 치료 실험의 설계에서 적절히 적응되어야 하는 가변적 속도로 진행된다.

유럽 특허 출원 EP 0 915 088호는 아밀로이드 원섬유에 대한 SAP의 결합에 대한 경쟁적 억제제인 화합물, 및 그 제조 방법을 개시하고 있다. EP 0 915 088호에 개시된 바람직한 화합물은 (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC)이지만, 상기 출원에 기재된 화합물중 어떠한 화합물 또는 순환성 SAP를 감소시키는 어떠한 다른 화합물이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본원에서 참조로 통합되는 국제특허출원 WO 2004/099173호는 본 발명의 실시에서 또한 사용될 수 있는 회문형(palindromic) 화합물을 기재하고 있다.

인간 SAP 트랜스제닉 마우스(transgenic mice)에서, 인간 SAP는 순환계 및 아밀로이드 침착물 둘 모두에 존재한다. 약물, (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC)가 두 가지의 본래의 펜타머성(pentameric) SAP 분자와 5 CPHPC 분자로 구성된 복합체로 인간 SAP에 의해서 특이적으로 결합된다¹⁶. 이러한 복합체는 간에 의해서 비정상으로 인식되며, 간세포에 의해서 아주 신속하게 흡수되고 분해되며, 그에 따라서, 순환계로부터 SAP를 효율적으로 제거한다¹⁶. 혈장 SAP 농도는 약물이 투여되는 동안 아주 낮게 유지된다¹⁶. CPHPC는 극도로 관용적이며, 약물 그 자체뿐만 아니라 이것이 생성시키는 SAP 제거도 어떠한 부작용을 유발시키지 않았다¹⁶. 인간 전신 아밀로이드증 환자, 특히 주로 신장 아밀로이드증을 앓고 있는 개체에서의 신장 기능의 보존과 관련하여, 상기 환자에서의 CPHPC 치료에 의한 임상적 이점에 대한 증거가 존재한다.

그러나, CPHPC에 의한 이러한 유망한 관찰에도 불구하고, 전신 아밀로이드증의 환자에서 기관 기능을 보존하고 환자의 생명을 연장시킬 수 있는 신속하고 최적의 치료 효능은 아밀로이드 침착물의 실질적이거나 완벽한 제거를 필요로 할 것이다.

국제 특허 출원 WO 04/059318호는 SAP와 결합하는 조성물의 제공을 포함하는 섬유세포 형성을 향상시키는 것으로 주장하는 방법을 개시하고 있다. 그러한 조성물은 항-SAP 항체와 CPHPC를 포함한다. 그러나, WO 04/059318호는 아밀로이드 침착과 관련된 질환의 치료를 기재하지 않고 있다. 게다가, WO 04/059318호는 항-SAP 항체와 CPHPC의 특이적 조합을 기재하지 않고 있다. 또한, 최근의 데이터는 SAP가 섬유세포 억제와 관련되지 않음을 나타내고 있으며, 그에 따라서, SAP 제거는 섬유세포 생성을 향상시키지 않음을 나타내고 있다²⁰.

따라서, 본 기술 분야에서는 기관 기능을 유지시키며 생명을 연장시키기 위해서 전신 아밀로이드증을 앓고 있는 환자에게서 개선된 치료학적 효능에 대한 요구가 있다.

본원에서의 어떠한 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서가 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것이 아니다.

발명의 요약

본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명이 인간 SAP를 순환계로부터 효과적으로 감소시키는 화합물에 의한 치료, 및 SAP에 특이적인 항체에 의한 추가적인 치료에 의해서 달성될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다.

따라서, 첫 번째 특징으로, SAP에 특이적인 항체와 함께, 순환계로부터 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)을 감소시키는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

바람직하게는 순환계로부터 SAP를 감소시키는 화합물은 SAP 가교제이다. 순환계에서 다수의 SAP 분자를 가교시킬 수 있는 화합물은 SAP가 순환계에서 신속하게 제거되게 함이 밝혀졌다(참조: WO03/013508). 그러한 화합물의 예는 SAP에 특이적인 다가 리간드, 예를 들어, 다가의 경쟁성 SAP 결합 억제제를 포함한다. 아밀로이드에 대한 SAP의 결합에 대한 경쟁성 억제제가, 예를 들어, 본원에서 참조로 통합되는 EP 0 915 088호에 기재되어 있으며; 이들의 사용, 및 순환계로부터 SAP를 감소시키는 그 밖의 분자가, 예를 들어, WO03/013508호 및 페피스(Pepys) 등의 문헌¹⁶에 기재되어 있으며, 본원에서는 이들의 모든 내용을 참조로 통합한다. 본원에서 참조로 통합된 국제특허출원 WO 2004/099173호는 또한 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 회문형 화합물을 기재하고 있다. 대안적으로 순환 SAP를 감소시키는 어떠한 화합물이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 순환계로부터 SAP를 감소시키는 화합물은 D-프롤린이며; 하기 화학식의 D-프롤린, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 모노- 또는 디-에스테르가 바람직하다:

상기 식에서,

R은

이고;

기 R¹은 수소 또는 할로겐이고;

X-Y-X'는 4개 이상, 유리하게는 5개 이상, 더욱 유리하게는 6개 이상, 20개 이하의 선형 또는 직쇄 탄소 원자를 지니는 링커이고,

X는 -(CH₂)_n-; -CH(R²)(CH₂)_n-; CH₂0(CH₂)_n-; CH₂NH-; 벤질, -C(R²)=CH-; -CH₂CH(OH)-; 또는 티아졸-2,5-디일이고;

Y는 -S-S-; -(CH₂)_n-; -O-; -NH-; -N(R²)-; -CH=CH-; -NHC(O)NH-; -N(R²)C(O)N(R²)-; -N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-; -N(CH₂C₆H₅)-; -N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-; -N(알콕시알킬)-; N(시클로알킬-메틸)-; 2,6-피리딜; 2,5-푸라닐; 2,5-티에닐; 1,2-시클로헥실; 1,3-시클로헥실; 1,4-시클로헥실; 1,2-나프틸; 1,4-나프틸; 1,5-나프틸; 1,6-나프틸; 바이페닐렌; 또는 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌 및 1,4-페닐렌이고, 여기서, 페닐렌 기는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록실, 카르복시, -COO-저급 알킬, 니트릴로, 5-테트라졸, (2-카르복실산 피롤리딘-1-일)-2-옥소-에톡시, N-히드록시카르밤이미오딜(N-hydroxycarbamimiodyl), 5-옥소[1,2,4]옥사디아졸릴, 2-옥소[1,2,3,5]옥사티아디아졸릴, 5-티옥소[1,2,4]옥사디아졸릴 및 5-tert-부틸설파닐-[1,2,4]옥사디아졸릴로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체에 의해서 치환되거나 치환되지 않으며;

X'는 -(CH₂)_n-; -(CH₂)_nCH(R²)-; -(CH₂)_nOCH₂-; -NHCH₂-; 벤질, -CH=C(R²)-; CH(OH)CH₂; 또는 티아졸-2,5-디일이고;

R²는 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 벤질이고;

n은 0 내지 3이다.

상기된 바람직한 구체예를 포함하는, 순환계로부터 SAP를 감소시키는 화합물은 이하 SAP-제거 화합물이라 칭한다.

한 가지 구체예에서, 화학식(I-A)의 D-프롤린은 리간드-링커-리간드로서 기재될 수 있으며, 여기서, 화학식(I-A)의 X-Y-X' 부분은 링커를 형성한다. 본 발명의 범위 내에서, 링커(X-Y-X')는 길이 4 내지 15개의 선형 탄소원자, 5 내지 10개의 선형 탄소원자, 및 6 내지 8개의 선형 탄소원자를 포함한 길이 4 내지 20개의 선형 탄소원자일 수 있다. 링커는 직쇄 또는 분지쇄이거나, 임의로 하나 이상의 고리 구조를 형성할 수 있고, 단, 4개 이상의 선형 또는 직쇄 탄소원자가 링커에 존재한다. 한 가지 구체예에서, 선형 또는 직쇄 C 원자중 하나 이상은 N, O, 또는 S, 유리하게는 O 또는 S, 바람직하게는 O로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.

한 가지 구체예에서, D-프롤린은 (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC)이다.

바람직하게는, 조성물은 에탄올아민 및/또는 포스포에탄올아민 및/또는 β-D 갈락토피라노스의 4,6-피루베이트 아세틸 및/또는 칼슘 및/또는 IL-4 및/또는 IL-3을 포함하지 않는다.

바람직하게는, 조성물은 섬유세포 형성을 향상시키기 위해서 처방되지 않는다. 유리하게는, 조성물은 섬유세포 형성을 향상시키지 않는다. 바람직하게는, SAP에 특이적인 상기 항체는 단구(monocyte)로부터의 섬유세포 형성을 억제하는데 있어서 작용성인 것으로 주장된 SAP의 일부를 표적하지 않는다.

추가의 구체예에서, 조성물은 아밀로이드 질환의 치료에서의 사용에 처방되며, 따라서, 아밀로이드 질환의 치료에 사용하기 위한 SAP-제거 화합물(SAP-depleting compound) 및 SAP에 특이적인 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본원에서 언급되고 있는 아밀로이드 질환은 조직에서의 아밀로이드 원섬유의 세포외 침착과 관련되는 어떠한 질환일 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 질환은 전신(내장) 또는 국소 아밀로이드증, 인슐린 비의존형 당뇨병, 및 알쯔하이머 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환이다.

바람직한 구체예에서, SAP는 인간 SAP이고, 항-SAP 항체 및 SAP-제거 화합물에 대한 참조는 바람직하게는 인간 SAP를 표적하고/거나 이를 감소시키는 화합물을 참조하는 것이다.

추가의 특징으로, 아밀로이드 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 제조에서 SAP에 특이적인 항체와 함께 SAP-제거 화합물의 용도가 제공된다.

본원에서 정의된 SAP-제거 화합물에 의한 치료는 거의 모든 순환성 인간 SAP를 제거하지만, 조직에서의 아밀로이드 침착물과 연관된 실질적인 양의 SAP를 남긴다. 인간 환자에서 관찰되는 아밀로이드 침착물로부터 SAP의 최대한의 제거는 수 개월의 계속된 CPHPC 투여 후에 약 90%이다. 순환성 SAP가 제거된 환자내로의 인간 SAP에 대한 항체의 정맥내 주입은 항체를 아밀로이드 침착물에 위치시키고 그에 특이적으로 결합되게 하고, 그러한 침착물의 신속하고 광범위한 퇴행을 상응하는 임상적 이익으로 촉진시킬 수 있다.

SAP-제거 화합물과 항-SAP 항체를 사용한 확립된 전신 아밀로이드 침착물을 지닌 개체의 병합 치료는 침착물의 신속하고 기본적으로는 완전한 제거를 안전하고 효과적으로 유발시킨다. 발명자의 최상의 지식으로는, 확립된 아밀로이드 침착물의 그러한 안전하고 신속한 표적 제거는 어떠한 환자 또는 동물 모델에서 또는 어떠한 그 밖의 방법에 의해서 이전에 달성된 적이 없다.

유리하게는 SAP는 아밀로이드증, 알쯔하이머 질환 및 인슐린 비의존형 당뇨병을 포함한 아밀로이드 침착과 연관된 인간 질환의 모든 유형의 모든 아밀로이드 침착물에 존재하기 때문에, 이러한 치료 방법은 모든 그러한 병태에 적용 가능하다. 바람직하게는, 본 발명은 아밀로이드증의 치료를 위한 것이다.

추가의 특징으로, 아밀로이드 질환을 앓고 있거나 그러한 질환의 위험에 있는 대상자를 치료하는 방법으로서, 그러한 치료를 필요로 하는 대상자에게 SAP-제거 화합물 및 SAP에 특이적인 항체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는 방법이 제공된다.

SAP-제거 화합물 및 항체는 동시에, 예를 들어, 별도로 또는 혼합된 상태로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 치료 요법은 SAP-제거 화합물을 단독으로 투여한 다음, 항체를 투여함을 포함한다. 임의로, SAP-제거 화합물 투여는 항체의 투여 동안 계속될 수 있다.

세 번째 특징으로, SAP-제거 화합물 및 SAP에 특이적인 항체를 포함하는 아밀로이드증의 치료에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 그러한 키트 성분은 동시, 동시적 별도 또는 순차적 투여, 또는 이의 조합을 위해서 제공될 수 있다.

바람직한 구체예에서, SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체는 순차적으로 투여되어, SAP-제거 화합물이 항체 전에 투여되게 한다. 투여는 연장된 시간에 걸쳐서, 주입, 반복된 거환약(bolus) 투여에 의해서 또는 어떠한 다른 방법으로 수행되거나, SAP-제거 화합물 및/또는 항체가 단지 한번 투여되는 단일 용량 투여가 이용될 수 있다.

특정의 구체예에서, SAP-제거 화합물은 지연된 시간에 걸쳐서 투여되지만, 항체는 단일 용량으로 투여된다.

네 번째 특징으로, 아밀로이드증의 치료를 위한 SAP-제거 화합물과 함께 사용될 수 있는 작용제를 확인하는 방법으로서, (a) 전신 AA 아밀로이드증이 유도된 인간 SAP의 트랜스제닉 발현이 있는 비-인간 동물을 SAP-제거 화합물과 접촉시켜서 순화성 SAP를 감소시키는 단계; (b) 트랜스제닉 비-인간 동물을 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 작용제(들)가 비-인간 동물에서의 아밀로이드 침착물의 실질적인 또는 완전한 퇴행을 촉진하는 지를 측정하는 단계를 포함하며, 비-인간 동물에서의 아밀로이드 침착물의 실질적인 퇴행을 유발시키는 작용제가 아밀로이드증의 치료에 사용될 수 있는 작용제의 지표가 되는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 형질전환 비-인간 동물은 마우스, 적합하게는 마우스 SAP 유전자가 결실되고 인간 SAP에 대해서 트랜스제닉인 C57BL/6 마우스이다.

본원의 개시사항에서, 특히 특허청구범위 및/또는 문단에서, 용어, 예컨대, "포함한다", "구성된", 및 "포함하는" 등은 미국특허법에서의 그러한 것들에 대한 의미를 지닐 수 있으며; 예를 들어, 이들 용어는 "포함한다", "포함된", 및 "포함하는" 등을 의미할 수 있다는 것을 주지해야 하며, 용어, 예컨대, "을 기본 구성으로 하는" 및 "을 기본 구성으로 한다"는 미국특허법에서의 그러한 것들에 대한 의미를 지니며, 예를 들어, 이들은 명백하게 열거되지 않은 구성요소를 허용하며, 종래 기술에서 밝혀졌거나 본 발명의 기본 또는 새로운 구성에 영향을 주는 구성요소를 배제하지 않음을 주지해야 한다.

이들 및 그 밖의 구체예가 하기 상세한 설명에 개시되거나, 그러한 것으로부터 명백하고, 그러한 것에 의해서 포함된다.

예를 들어 설명하고 있으며 특정의 기술된 구체예로 본 발명을 단지 한정하고자 하는 것이 아닌 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께하는 경우에 최상으로 이해될 수 있다.
도 1. 치료 후 마우스 비장에서의 아밀로이드 침착물 .
신체 전체 ¹²⁵I-SAP 보유에 의해서 도시된 바와 같은 동일한 아밀로이드 부하에 의해서, 확립된 전신 AA 아밀로이드증을 지닌 유사하게 매칭된 C57BL/6마우스 SAP 녹아웃 인간 SAP 트랜스제닉 순수 혈통 마우스의 세 그룹을, 각각 CPHPC와 양 항-인간 항-SAP 항체의 단일 용량, CPHPC 단독, 아무 것도 없는 처리로 처리하고, 이어서 아밀로이드 부하 28일 후 평가를 위해서 치사시켰다. 각각의 지점은 단일 동물에 대한 아밀로이드 스코어를 나타낸다: 0, 아밀로이드가 검출되지 않음; 10⁰, 미량의 스펙(speck); 10¹, 모낭주위에서 미량(perifollicular trace); 10², 모낭주위에서 일반적인 양; 10³, 모낭주위에서 많은 양(heavy perifollicular); 10⁴, 모낭주위 및 모낭 사이에서 많은 양. 그룹들에서의 스코어들 사이의 차이에 대한 맨 휘트니 U 시험(Mann Whitney U)에서, P 값은 다음과 같다: 그룹 1 대 그룹 2 P=0.0000; 그룹 1 대 그룹 3 P=0.0000; 그룹 2 대 그룹 3 P=0.2635. 그룹들 중 어느 그룹내에서 웅성 마우스와 자성 마우스 사이의 아밀로이드 스코어에서의 차이는 없었다(도시되지 않음).
도 2. 치료 후의 마우스의 간에서의 아밀로이드 침착물.
신체 전체 ¹²⁵I-SAP 체류에 의해서 도시된 바와 같은 동일한 아밀로이드 부하에 의해서, 확립된 전신 AA 아밀로이드증을 지닌 유사하게 매칭된 C57BL/6마우스 SAP 녹아웃 인간 SAP 트랜스제닉 순수 혈통 마우스의 세 그룹을, 각각 CPHPC와 양 항-인간 항-SAP 항체의 단일 용량, CPHPC 단독, 아무 것도 없는 처리로 처리하고, 이어서 아밀로이드 부하 28일 후 평가를 위해서 치사시켰다. 각각의 지점은 단일 동물에 대한 아밀로이드 스코어를 나타낸다: 0, 아밀로이드가 검출되지 않음; 10⁰, 미량의 스펙; 10¹, 대부분의 문맥관에서/주위에서 미량; 10², 모든 문맥관에서/주위에서 상당한 침착물; 10³, 문맥 및 실질(parenchymal) 침착물; 10⁴, 과도한 문맥 및 실질 침착물. 그룹들에서의 스코어들 사이의 차이에 대한 맨 휘트니 U 시험(Mann Whitney U)에서, P 값은 다음과 같다: 그룹 1 대 그룹 2 P=0.0000; 그룹 1 대 그룹 3 P=0.0000; 그룹 2 대 그룹 3 P=0.4740. 그룹들 중 어느 그룹 내에서 웅성 마우스와 자성 마우스 사이의 아밀로이드 스코어에서의 차이는 없었다(도시되지 않음).
도 3. 콩고 레드(Congo red)로 염색되고 크로스 편광에서 보여진 아밀로이드 침착물.
아밀로이드는 조직 및 외래의 신체, 더스트(dust) 등의 인공물에서의 콜라겐의 화이트 또는 그 밖의 밝은 복굴절로부터 구별되어야 하는 질병 특유 그린(green) 복굴절에 의해서 확인된다. 비장 아밀로이드 스코어: 7722, 0(아밀로이드 존재하지 않음); 7723, 10⁰ (단일 스펙 존재); 7482, 10¹; 6865, 10²; 7481, 10³; 8272, 10⁴. 간 아밀로이드 스코어: 6980, 0(무 그린 복굴절 아밀로이드, 단직 백색-황색 콜라겐 복굴절); 7482, 10¹; 8028, 10²; 8156, 10³; 8272, 10⁴.
도 4. 항- SAP 항체의 투여 후의 세포 침윤 및 아밀로이드 파괴의 시간 과정.
항체 처리 후에 보여진 시간에서 치사된 동물로부터의 콩고 레드로 염색되고 편광(좌측)으로 나타낸 및 해마토실린 및 에오신(우측)으로 염색된 비장 섹션(section). 1 일째(도 4a)에, 전형적인 모낭주위 경계 영역에서의 광범위한 그린 복굴절 아밀로이드가 존재하지만, 이의 통상의 비세포 외관과는 대조적으로, 이는 우세하게 단핵 염증성 세포에 의해 조밀하게 침윤된다. 2일째(도 4b)에, 아밀로이드를 둘러싼 대식세포가 이미 융합되어 다핵 자이언트 세포(giant cell)를 형성한다. 4일까지(도 4c), 아밀로이드 침착은 명백하게 덜 광범위하고, 강한 대식세포 탐식 활성 및 아밀로이드 섬(the islands of amyloid)을 둘러싸고 식작용(engulfing)하는 많은 다핵 자이언트 세포와 연관되어 단편화된다. 7일째(도 4d)에, 아주 더 적은 아밀로이드가 존재하며, 몇몇의 자이언트 세포가 존재하지만, 이들은 여전히 명백하게 분해된 아밀로이드 단편을 함유한다.
도 5. 항- SAP 항체 처리 1일 후 취한 비장의 전자현미경사진.
도 5a, 전형적인 원섬유 아밀로이드 침착물(중앙 및 좌측)을 둘러싼 대식세포(우측 상부); 배율 x4,500. 도 5b, 과립세포(영상의 상부 절반) 및 아밀로이드 침착물(영상의 하부 절반); 호중구 및 대식세포는 다커 세포질(darker cytoplasm)을 지니며; 하나의 호산구가 영상의 중앙에서 보여지고 있고; x3,000. 도 5c, 아밀로이드 침착물의 확대된 단편, 과립구 및 대식세포(또한, 5b에서 도시됨); x 7,000.
도 6. AA 아밀로이드 침착물의 항- SAP 항체 매개된 제거에서의 세포 및 단백질의 면역화학적 확인
상부 두 패널이 비장 및 간에서의 모든 친콩고성 아밀로이드 침착물중의, 항-F4/80로 강하게 염색함으로써 확인되는, 강한 대식세포 침윤을 나타낸다. 그러한 염색은 항-SAP 항체로 처리되지 않은 마우스의 아밀로이드 침착물중에는 완전히 존재하지 않는다(도시되지 않음). 세 번째 패널은 AA 아밀로이드, CD68(식세포계 세포내이입 활성의 마커), 및 마우스 C3의 공동-편재화를 나타낸다. 하부 패널은 마우스 AA 아밀로이드의 단편을 둘러싸고 식작용하는 식세포 활성 대식세포를 나타낸다. 도 6a는 콩고 레드(좌측); 항-F4/80(우측)으로 처리된 1일째 비장이며; 도 6b는 콩고 레드(좌측); 항-F4/80(우측)으로 처리된 1일째 간이고; 도 6c는 항-AA 단백질(좌측); 항-CD68(중앙); 항-마우스 C3(우측)으로 처리된 4일째 비장이고; 도 6d는 항-CD68(레드); 항 AA 단백질(그린); 핵 카운터 염색(블루)으로 처리된 4일째 공초점 영상(confocal image)이다.
도 7. 단리된 순수한 인간 SAP 의 주입 후의 아밀로이드증 야생형 마우스의 비장에서의 항-인간 SAP 항체에 의한 면역조직화학적 염색.
전형적인 변연부(marginal zone) 분포에서의 모든 아밀로이드 침착물의 강한 양성 염색이 존재한다. 이러한 경계 인간 SAP가 본 발명에 따른 치료학적 항-SAP 항체의 표적이다.

발명의 상세한 설명

아밀로이드증

본 발명의 특징은 아밀로이드증으로 알려진 조직내 아밀로이드 침착에 의해서 유발되는 질환의 치료 및/또는 방지에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "예방", "방지", "방지하다", "방지하는", "억제", "억제하다" 및 "억제하는"은 아밀로이드증의 임상적 증거의 발생을 일시적으로 또는 영구적으로 방지, 억제 또는 감소시키기 위해서 개시된(예, 아밀로이드증의 임상적 증상의 발생 전에) 활동의 과정(예컨대, 하나 이상의 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여함)을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 아밀로이드증의 임상적 증거 또는 진행을 일시적으로 또는 영구적으로 제거 또는 감소시키기 위해서 아밀로이드증의 임상적 증거의 발생 후에 개시된 활동의 과정(예컨대, 하나 이상의 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여함)을 나타낸다.

아밀로이드증은 신체의 다양한 기관 및 조직에서의 아밀로이드의 세포외 축적에 특징이 있는 어떠한 질환이다.

용어 "아밀로이드"는 특징적 초미세구조 형태, 크로스-β 시트 코어 구조(cross-β sheet core structure), 및 알칼리 알코올 용액으로부터의 콩고 레드 염료와 결합하고 강한 크로스 편광하에 현미경으로 관찰할 때 레드-그린 이색성(dichroism)을 나타내는 질병 특징적 조직 화학 착색성을 지니는 원섬유로 구성된 불용성 단백질 섬유의 조직에서의 세포외 침착물을 나타낸다. 약 25 가지의 상이한 비혈연 단백질이 인간 조직에 침착되고 모든 이들의 전형적인 성질을 공유하는 아밀로이드 원섬유를 형성시키는 것으로 공지되어 있다. 뇌내 물질에서의 아밀로이드 침착물, 즉, 대뇌 아밀로이드는 신체 내의 어느 부분에서의 아밀로이드 침착물과 다소 상이한데, 이들이 항상 병소에 침착되고 그 크기가 미세하며, 일반적으로 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)로 일컬어지는 점에서 상이하다.

조직에서의 아밀로이드의 침착에 의해서 직접적으로 유발된 질환인 아밀로이드증은 침착물이 하나의 해부학적 부위 및/또는 하나의 조직 또는 기관계에 한정되는 국소 아밀로이드증과 침착물이 혈관 및 결합 조직을 포함한 신체내의 어떠한 기관 또는 조직에서 발생하는 전신 아밀로이드증 둘 모두를 포함한다. 아밀로이드증의 원인은 후천적이거나 유전적일 수 있다. 후천적 아밀로이드증은 후천적이거나 유전적일 수 있는 선행된 의학적 상태의 합병증로서 발생한다. 따라서, 아밀로이드 A 단백질(AA) 유형으로 공지된 반응성 전신 아밀로이드증은 만성 염증성 질환(chronic active inflammatory disease), 예컨대, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 유년성 류마티스성 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 크론 질환(Crohn's disease), 만성 감염증(chronic infection) 및 만성 패혈증(chronic sepsis)의 합병증이며, 유전적인 주기성 발열 증후군(hereditary periodic fever syndrome), 예컨대, 가족성 지중해 열(familial Mediterranean fever), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells Syndrome) 및 CINCA 증후군의 합병증이다. 투석 관련된 아밀로이드증은 말기 신부전으로 인한 β₂-마이크로글로불린의 축적에 의해서 유발된다. 모노클로날 면역글로불린 경쇄(AL) 아밀로이드증은 다발성 골수종 또는 그 밖의 양성 모노클로날 감마병증(benign monoclonal gammopathy)(의의불분명 모노클로날 감마병(monoclonal gammopathy of uncertain significance, MGUS))의 합병증이다. 트랜스티레틴(transthyretin) 유형의 후천적 아밀로이드증은 어떠한 선행된 질환 없이 발생할 수 있으며, 단지 고령에 따른 합병증이다. 유전적 아밀로이드증은 아밀로이드 원섬유를 형성시키는 증가된 경향을 지닌 변형 단백질의 발현을 엔코딩하는 다양한 단백질에 대한 유전자에서의 돌연변이에 의해서 유발되며, 트랜스티레틴, 아포지단백질 AI(apolipoprotein AI), 겔졸린(gelsolin), 리소자임(lysozyme), 시스타틴 C(cystatin C) 및 아밀로이드 β-단백질에 의해서 유발된 질환을 포함한다. 아밀로이드증의 모든 상이한 형태 및 이와 연관된 단백질에 대한 포괄적 설명은 교재 및 과학 문헌에서 찾아볼 수 있다^{1 ,8,21}.

하나의 기관 또는 조직에 한정된 국소 아밀로이드 침착은 임상적으로 사일런트(silent)이거나, 심각한 조직 손상 및 질환을 유발시킬 수 있다. 예를 들어, 혈관 아밀로이드 침착물이 Aβ 단백질로 구성되는 대뇌 아밀로이드 병증은 일반적으로는 어떠한 다른 병인의 부재하에 이해되지 않는 이유로 발생하는 돌발성 후천적 병태이며, 대뇌 출혈 및 뇌졸중(stroke)의 주된 원인이다. 아밀로이드 침착물이 항상 존재하지만, 이들 각각의 질환을 유발시키는 명확한 메카니즘이 아직 알려지지 않은 몇가지의 아주 중요하고 일반적인 질환, 특히, 알쯔하이머 질환 및 인슐린 비의존형 당뇨병이 있다. 그럼에도 불구하고, 알쯔하이머 질환에서의 뇌 및 대뇌 혈관에서 및 당뇨병에서의 췌장섬(pancreatic islet)에서 아밀로이드의 국소 침착은 병인 및 질환을 진정으로 악화시키는 듯하다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 본 발명은 사실 조직에서의 아밀로이드 침착물의 존재와 연관된 어떠한 상태에 대한 알쯔하이머 질환 및 인슐린 비의존형 당뇨병 둘 모두의 치료에 관한 것이다.

전염성 해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy)(프리온 질환)의 많은 형태가 뇌에서의 아밀로이드 침착물과 연관되어 있으며, 그에 따라서, 본 발명은 사람에서의 변종 크로이츠펠트 야곱병(variant Creutzfeldt- Jakob disease), 크로이츠펠트 야곱병 그 자체, 쿠루병 및 인간 프리온 질환의 다양한 그 밖의 형태, 및 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 검은꼬리사슴(mule-deer) 및 엘크(elk)의 만성 소모성 질환(chronic wasting disease) 및 밍크의 전염성 상뇌증(transmissible encephalopathy)을 포함한 모든 이들 병태에 관한 것이다.

가축, 예컨대, 닭, 오리, 칠면조 및 거위를 포함한 동물, 바람직하게는 사람뿐만 아니라, 개, 말, 소, 양, 피그(pig), 기니아 피그, 마우스 및 래트를 포함한 포유동물의 치료가 고려된다. 특히, 사람의 치료가 바람직하다.

따라서, 한 가지 특징으로, 아밀로이드증의 치료에 사용하기 위한 SAP에 특이적인 항체와 함께 SAP-제거 화합물이 제공된다.

항- SAP 항체

항-SAP 항체, SAP-결합 항체 및 SAP에 특이적인 항체에 대한 본원에서의 참조는 동일한 의미이며, 특이적인 방법으로 SAP에 결합하고, 실질적으로는, 순환계에 존재하는 다른 분자와 가교 반응을 하지 않는 항체, 또는 그러한 항체로부터 유래된 결합 단편을 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 조직 아밀로이드 침착물중의 아밀로이드 원섬유에 결합하는 SAP를 표적한다.

SAP는 분자의 하나의 평탄 면, 결합(B) 면상에 단일의 칼슘 의존성 리간드 결합부위를 각각 지니는 5 개의 동일한 비-공유적으로 회합된 프로토머(protomer)를 지니는 펜타머(pentamer)이다. 칼슘의 부재하에, 인간 SAP는 가능하게는 A-면 대 A-면 상호작용을 통해서 안정한 데카머성 디머(decameric dimer)를 형성한다. 칼슘의 존재하에, 단리된 인간 SAP는 한 SAP 분자상에서 또 다른 SAP 분자의 칼슘 의존성 리간드 결합 부위에 의한 Glu167 잔기의 노출된 카르복실레이트의 결합에 기인한 분자 격자의 형성에 의해서 신속하게 회합되고 침전된다. SAP의 자동 회합은 SAP가 결합하는 다른 리간드에 의해서 억제된다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 이로 한정되는 것은 아니지만, 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 상보성 결정 영역 (CDR)-이식된, 단일 사슬, 이특이성(bi-specific), FAb 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해서 생성된 단편을 포함한다. 그러한 단편은 SAP에 대한 결합 활성을 보유하는 전체 항-SAP 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')2 단편, 및 F(v) 항체 단편뿐만 아니라 항-SAP 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질 및 그 밖의 합성 단백질을 포함한다. 추가로, 항체 및 이의 단편은 이하 추가로 상세히 기재된 바와 같은 인간화된 항체일 수 있다.

항체 서열중의 가변 영역 및 CDR은 공지된 가변 영역의 데이타베이스에 대해서 서열을 정렬시킴으로써 동정될 수 있다. 이들 영역을 동정하는 방법이, 예를 들어, 문헌[Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001]에 기재되어 있다. 항체 서열의 데이타베이스는, 예를 들어, 문헌[Retter et al ., Nucl . Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005)]에 기재된 바와 같은 www.vbase2.org에서 VBASE2에 기재되어 있다.

마우스에서 생성된 모노클로날 항-SAP 항체는 다양한 공급원, 예컨대, 영국 도르셋 길링햄 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(Catalogue # A9191); US 바이올로지컬(US Biological)(catalogue # Sl 003-3, 1003-4); 아크리스안티보디스(Acris Antibodies)(catalogue # BM225); 캄야 바이오메티컬 컴파니(Kamya Biomedical Co.)(catalogue # MC-978); 셀 사이언스(Cell Sciences)(catalogue # MON 6006); 아브노바 코포레이션(Abnova Corp.)(catalogue # H00000325-MO7)로부터 얻을 수 있다.

용어 "모노클로날 항체"는 단일의 중쇄 및 경쇄류 및 에피토프 특이성의 동종 항체를 생성시키는 B 림프구 유래된 혈장 세포의 단일 클론으로부터 얻은 항체를 나타낸다.

모노클로날 항체는 전형적으로는 아주 특이적이며, 특정의 항원에 의한 면역화에 의한 전체 동물에서 유도된 항혈청내의 통상의 항체와는 대조적으로, 단일의 항원성 부위(에피토프)에 대해서 유도된다. 그러한 통상의 항체는 면역화 항원 상의 동일 또는 상이한 에피토프를 인식하는 B 림프구의 많은 상이한 클론으로부터 유래되며, 폴리클로날 항체로 알려져 있다. 이들의 아주 제한된 특이성에 추가로, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해서 비오염된 순수한 형태로 용이하게 생성되지만, 폴리클로날 항혈청으로부터의 특이적 항체의 단리는 면역정제 과정(immunopurification procedure)을 필요로 한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마(hybridoma) 방법[참조: Kohler et al ., Nature, 256:495-7, 1975]에 의해서, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 공지된 기술을 이용함으로써 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

하이브리도마 방법에서, 호스트 동물, 전형적으로는 마우스는 요구된 항원으로 면역화되어 그 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시킬 수 있거나 생성시키는 B 림프구의 클론의 생성을 유도한다. 면역화된 동물로부터 수거된 림프구는 이어서 시험관내에서 시험관내 성장한 연속성 골수종 세포주와 융합되어 소위 하이브리도마 세포를 형성시킨다. 이들은 이어서 융합된 세포의 생존만을 허용하고 비융합된 모체 골수종 세포의 생존은 허용하지 않는 적합한 배양 배지에서의 성장에 의해서 선택된다. 골수종 세포의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해서 기재된 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주를 포함한다.

성장 하이브리도마 세포로부터의 배양 배지는 항원에 대해서 유도된 모노클로날 항체에 대해서 검정될 수 있다. 세포에 의해서 생성된 항체의 결합 특이성은 다양한 방법, 예컨대, 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대, 방사성면역검정(radioimmunoassay(RIA)) 또는 효소 결합 면역흡수 검정(enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA))에 의해서 측정될 수 있다.

요구된 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포가 동정된 후에, 클론이 희석 과정을 제한함으로써 서브클론화될 수 있으며, 표준 방법에 의해서 성장할 수 있다. 서브클론에 의해서 분비된 모노클로날 항체는 공지된 면역글로불린 정제 과정, 예컨대, 단백질 A-세파로즈, 겔 전기영동, 투석, 히드록시 라파타이트 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해서 배양 배지 또는 혈청으로부터 분리된다.

모노클로날 항체는 관련 항원 및 애주번트(adjuvant)의 다중 피하, 근육내 또는 복강내 주입에 의해서 동물에서 발생될 수 있다. 개선된 항체 반응은 면역화되는 종에서 면역성인 단백질에 관련 항원을 컨주게이팅(conjugating)시킴으로써 얻을 수 있다. 동물은 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 컨주게이트(conjugate)(각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 프러인드 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant)와 조합하고 용액을 다수 부위에 피부내 주입함으로써 항원, 면역성 컨주게이트 또는 유도체에 대해서 면역화될 수 있다. 동물은 이어서 다수 부위에 피하 주입에 의해서 프러인드 완전 애주번트중의 최초량의 1/5의 펩티드 또는 컨주게이트에 의해서 부스팅(boosting)될 수 있다. 부스터(booster) 주입 후 7 내지 14일째에, 동물을 출혈시킬 수 있으며, 혈청이 항체 역가에 대해서 검정된다.

항-SAP 항체 및 단편은 또한 항-SAP 항체 및 이의 단편의 변이체를 포함한다. 변이체는 항-SAP 항체 또는 이의 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프 결합의 친화성 및 특이성을 지니는 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실, 및/또는 첨가를 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환은 사일런트 변화(silent change)를 생성시키고 기능적으로 등가인 물질을 생성시킬 수 있다. 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성에서의 유사성을 기초로 하여 신중한 아미노산 치환이 수행될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며, 유사한 친수성 값을 지닌 비하전된 극성 헤드 기를 지니는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 포함한다.

보존성 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라서 수행될 수 있다. 두 번째 컬럼에서의 동일한 블록내, 바람직하게는 세 번째 컬럼에서 동일한 라인내의 아미노산은 서로에 대해서 치환될 수 있다:

동종 치환(치환 및 대체가 둘 모두 기존의 아미노산 잔기의 대안 잔기에 의한 교환을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다), 즉, 유사 치환(like-for-like substitution), 예컨대, 염기성 대 염기성, 산성 대 산성, 극성 대 극성 치환 등이 발생될 수 있다. 비-동종 치환, 즉, 잔기의 한 종류에서 다른 종류로의 치환 또는 대안적으로 비천연 아미노산, 예컨대, 오르니틴(이하 Z로서 일컬어짐), 디아미노부티르산 오르니틴(이하 B로서 일컬어짐), 노르류신 오르니틴(이하 O로서 일컬어짐), 피리일알라닌(pyriylalanine), 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신의 포함과 관련된 치환이 또한 발생될 수 있다.

대체가 또한 비천연 아미노산; 예를 들어, 알파^* 및 알파-이치환된^* 아미노산, N-알킬 아미노산^*, 락트산^*, 비천연 아미노산의 할라이드 유도체, 예컨대, 트리플루오로티로신^*, p-Cl-페닐알라닌^*, p-Br-페닐알라닌^*, p-I-페닐알라닌^*, L-알릴-글리신^*, β-알라닌^*, L-α-아미노 부티르산^*, L-γ-아미노 부티르산^*, L-α-아미노 이소부티르산^*, L-ε-아미노 카프로산^*, 7-아미노 헵타노산^*, L-메티오닌 설폰^#*, L-노르류신^*, L-노르발린^*, p-니트로-L-페닐알라닌^*, L-히드록시프롤린^#, L-티오프롤린^*, 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 예컨대, 4-메틸-Phe^*, 펜타메틸-Phe^*, L-Phe (4-아미노)^#, L-Tyr (메틸)^*, L-Phe (4-이소프로필)^*, L-Tic (1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산)^*, L-디아미노프로피온산^# 및 L-Phe (4-벤질)^*에 의해서 수행될 수 있다. 표시 *은 유도체의 소수성을 나타내기 위해서 상기 설명 목적(동종 또는 비-동종성 치환과 관련됨)으로 사용되고 있으며, #은 유도체의 친수성을 나타내기 위해서 사용되고 있다. #*는 양쪽성을 나타낸다.

따라서, 변이체는 항-SAP 항체 및 이의 단편에 대한 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실, 및/또는 첨가를 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 그러한 치환, 결실, 및/또는 첨가는 에피토프 결합의 친화성 및 특이성의 실질적인 변화를 유발시키지 않는다. 예를 들어, 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 변이체는 항-SAP 항체 또는 이의 단편에 대한 하나 이상의 변화로부터 유발될 수 있으며, 여기서, 변화된 항-SAP 항체 또는 이의 단편은 출발 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프 결합의 친화성 및 특이성을 지닌다. 변이체는 천연, 예컨대, 대립 변이체(allelic variant) 또는 스플라이스 변이체(splice variant)일 수 있거나, 인위적으로 구성될 수 있다. 변이체는 그러한 변이체를 엔코딩하는 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 변이체는 천연이거나 재조합 DNA 기술을 사용한 본래 서열의 시험관내 공학처리에 의해서 도입되는 경쇄 및/또는 중쇄 아미노산 서열에서의 변화를 지닐 수 있다. 천연 변이체는 외래 항원에 대한 항체 반응의 생성 동안에 상응하는 생식선 누클레오티드 서열에서 생체내 생성되는 "체세포(somatic)" 변이체를 포함한다.

SAP 결합 항체 및 결합 단편의 변이체가 또한 돌연변이유발 기술에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 변화는 항체 코딩 영역 전체에 걸쳐서 무작위로 도입될 수 있고, 생성되는 변이체는 SAP에 대한 결합 친화성 또는 또 다른 성질에 대해서 스크리닝될 수 있다. 대안적으로, 아미노산 변화는 항-SAP 항체의 소정의 영역내로, 예컨대, 경쇄 및/또는 중쇄 CDR에서, 및/또는 골격 영역에서 도입될 수 있으며, 생성되는 항체는 SAP에 대한 결합 또는 일부 그 밖의 활성에 대해서 스크리닝될 수 있다. 아미노산 변화는, 단일 아미노산 차이로부터 주어진 CDR내의 아미노산의 다중 과돌연변이(permutation)의 도입에 이르는, CDR내의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산을 삽입시켜 CDR의 크기를 증가시킴으로써 생성된 변이체가 또한 포함된다.

항-SAP 항체 또는 이의 단편은 천연 Fc 영역이 변형되어 생물학적 환경에서의 항체 또는 단편의 반감기, 예를 들어, 혈청 반감기 또는 시험관내 검정에 의해서 측정된 반감기를 증가시키도록 변형된 변형 Fc 영역과 함께 제공될 수 있다.

변이체는 또한 변형된 Fc 영역을 포함하는데, 그러한 변형된 Fc 영역이 야생형 Fc 영역에 비해서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하도록 구성되는 변형된 Fc 영역을 포함한 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 변형 Fc 영역은, 야생형 Fc 영역을 포함한 비교 분자에 비해서, 더 크거나 더 작은 친화성을 지니는 Fc 수용체와 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, SAP 결합 항체 및 이의 단편은 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. Fc 영역은 IgG의 파파인 소화시에 생성되는 IgG C-말단 도메인에 동종성인 천연 또는 합성 폴리펩티드를 나타낸다. IgG Fc는 약 50kD의 분자량을 지닌다. 항체 및 단편에서, 전체 Fc 영역 또는 단지 반감기 향상 부분이 사용될 수 있다. 또한, 본래의 활성이 모든 경우에서 필수적이거나 요구되는 것이 아니므로, 아미노산 서열에서의 많은 변형이 허용될 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 본원에 개시된 항체, 단편 및 서열의 유도체를 포함한다. 유도체는 화학적으로 변형되는 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 이들의 변이체, 단편 또는 유도체이다. 그러한 예에는 하나 이상의 폴리머, 예컨대, 수용성 폴리머, N-결합된 또는 O-결합된 탄수화물, 당, 포스페이트 및/또는 그 밖의 그러한 분자들의 공유 결합을 포함한다. 유도체는 결합된 분자의 유형 또는 위치에서 천연 또는 출발 펩티드 또는 폴리펩티드와는 다른 방법으로 변형된다. 유도체는 추가로 펩티드 또는 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 화학적 그룹의 결실을 포함한다.

본 발명은 또한 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하는 SAP 결합 항체를 포함한다. 대안적으로, SAP 결합 항체는 SAP에 대한 결합 활성을 보유하는 구성물, 예컨대, 단일 사슬 항체 또는 "미니(mini)" 항체일 수 있다. 그러한 구성물은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

모노클로날 항체의 생성을 우회하는, 항체 분자의 항원-결합 영역의 재조합 DNA 버젼을 생성시키는 방법이 SAP 결합 항체 및 이의 단편을 위해서 고려된다. DNA는 박테리아 발현 시스템내로 클로닝된다. 그러한 기술중 한 예는 발현된 Fab 단백질을 혈장주변 공간(박테리아 세포 막과 세포 벽 사이)으로 이동되게 하거나 분비되게 하는 리더 서열(leader sequence)을 지닌 박테리오파아지 람다 벡터 시스템을 사용한다. 많은 수의 기능성 Fab 단편을 신속하게 생성시키고 SAP와 결합하는 것들에 대해서 스크리닝될 수 있다. 그러한 SAP 결합 작용제(SAP 폴리펩티드에 대한 특이성을 지닌 Fab 단편)가 특별히 SAP 결합 항체 및 이의 단편내에 포함된다.

SAp 결합 항체 및 이의 단편은 인간화된 항체 또는 인간 공학처리된(engineered) 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 "인간화된 항체" 또는 이의 항원 결합 단편은 비-인간 항체로부터의 항원 결합 부위의 일부와 인간 항체의 골격 및/또는 불변 영역의 일부를 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 인간 공학처리된 항체 또는 항체 단편은, 사람에서의 변형된 항체의 어떠한 검출 가능한 면역원성을 감소 또는 제거하기 위해서, 특정의 위치에서 아미노산을 변형(예, 결실, 삽입 또는 치환)시킴으로써 공학처리되는 비-사람(예, 마우스) 항체이다.

인간화된 항체는 키메라 항체 및 CDR-이식된 항체(CDR-grafted antibody)를 포함한다. 키메라 항체는 인간 불변 영역에 결합된 비-인간 항체 가변 영역을 포함하는 항체이다. 따라서, 키메라 항체에서, 가변영역은 대체로 비-사람이고, 불변 영역은 사람이다. 키메라 항체 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6841-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 키메라 항체가 마우스 모노클로날 항체보다 덜 면역성일 수 있지만, 그러한 키메라 항체의 투여는 항체의 비-인간 부분에 대한 인간 면역 반응(HAMA)과 연관되어 있다. 키메라 항체는 또한 적절한 항원-결합 특이성을 지닌 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성, 예컨대, 인간 보체를 활성화시키고 항체 의존성 세포성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC))을 매개하는 능력을 지닌 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱(splicing)시킴으로써 생성될 수 있다. 한 가지 예는 Fc 영역을 상이한 이소타입의 Fc 영역으로 대체하는 것이다.

CDR-이식된 항체는 인간 "수용" 항체로부터의 골격 영역에 연결된 비-인간 "공여" 항체로부터의 CDR을 포함하는 항체이다. 일반적으로, CDR-이식된 항체는 키메라 항체보다 더 많은 인간 항체 서열을 포함하는데, 그 이유는 CDR-이식된 항체가 인간 항체로부터의 불변영영 서열 및 가변영역(골격) 서열 둘 모두를 포함하기 때문이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 CDR-이식된 인간화된 항체는 인간 항체의 골격 영역(예, 인간 항체의 FR-1, FR-2, 또는 FR-3) 또는 임의로, 인간 항체의 대부분 또는 모든 전체 골격 영역으로부터의 연속 아미노산 서열(예, 약 5개 또는 그 초과, 10개 또는 그 초과, 또는 15개 또는 그 초과의 연속 아미노산 잔기)을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. CDR-이식된 항체 및 이를 제조하는 방법은 문헌[Nature, 321: 522-525 (1986)]에 기재되어 있다. 인간화된 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 방법은, 예를 들어, US 5,721,367호 및 US 6,180,377호에 기재되어 있다.

"베니어드 항체(Veneered antibody)"는 이들의 면역성을 감소시키거나 이들의 기능을 향상시키기 위해서 특정의 용매-노출된 아미노산 잔기를 대체하도록 공학처리된 비-인간 또는 인간화된(예, 키메라 또는 CDR-이식된 항체)이다. 키메라 항체의 베니어링(Veneering)은 키메라 항체의 비-인간 골격 영역내의 용매-노출된 잔기를 동정하고, 이들중 하나 이상을 인간 골격 영역으로부터의 상응하는 표면 잔기로 대체함을 포함할 수 있다. 베니어링은 어떠한 적합한 공학처리 기술에 의해서 수행될 수 있다.

항체, 인간화된 항체, 인간 공학처리된 항체, 및 이들의 제조를 위한 방법에 대한 추가의 상세사항이 문헌[Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001]에 기재되어 있다.

인간화되거나 인간 공학처리된 항체의 예로는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD 항체가 있다. 항체는 어떠한 부류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 이소타입일 수 있으며, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 규정된 단편, 예컨대, 이소타입, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 항체 또는 이의 단편은 IgG1 중쇄 및 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다.

항-SAP 항체 및 이의 단편은 인간 항체, 예컨대, SAP 폴리펩티드와 결합하며 인간 생식세포 면역글로불린 핵산 서열, 및 이의 단편, 합성 변이체, 유도체 및 융합체의 천연 체세포 변이체일 수 있는 핵산 서열에 의해서 엔코딩되는 항체일 수 있다. 그러한 항체는 본 기술분야에 공지된 어떠한 방법, 예컨대, 본래의 면역글로불린이 포유동물 염색체내의 인간 V-유전자로 대체된 트랜스제닉 포유동물(트랜스제닉 마우스)의 사용을 통해서 생성될 수 있다.

SAP를 표적하는 인간 항체는 또한, WO 98/24893 및 WO 91/00906호에 기재된 바와 같이, 내생성 면역글로불린 생성을 하지 않으며 인간 면역글로불린 loci를 함유하도록 공학처리된 트랜스제닉 동물을 사용함으로써 생성될 수 있다.

상기된 트랜스제닉 동물을 사용하면, 면역 반응이 소정의 항원성 분자에 대해서 생성될 수 있으며, 항체 생성 세포가 동물로부터 제거될 수 있고, 그러한 항체 생성 세포가 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다. 면역화 원안, 및 애주번트 등은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스의 면역화에서 사용된다.

재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 제조하는 기술의 개발 및 섬유상 박테리오파아지(filamentous bacteriophage)의 표면상에 엔코딩된 항체 단편의 디스플레이는 인간 항체를 직접적으로 제조하는 수단을 제공한다. 파아지 기술에 의해서 생성된 항체는 박테리아내 항원 결합 단편-일반적으로는 Fv 또는 Fab 단편-으로서 생성되고, 그에 따라서, 이펙터 기능이 결여되어 있다. 이펙터 기능은 다음 두 방법중 한 방법에 의해서 도입될 수 있다: 단편이 포유동물 세포에서의 발현을 위한 완전 항체내로, 또는 이펙터 기능을 촉발시킬 수 있는 제 2 결합 부위를 지닌 이특이적(bispecific) 항체 단편내로 공학처리될 수 있다.

인간 항체는 항체 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝을 통해서 생성될 수 있다[문헌: J MoI . Biol . (1991) 227: 381]. 다양한 항체-함유 파아지 디스플레이 라이브러리가 기재되어 있으며 용이하게 제조될 수 있다. 라이브러리는 적절한 표적에 대해서 스크리닝될 수 있는 다양한 인간 항체 서열, 예컨대, 인간 Fab, Fv, 및 scFv 단편을 함유할 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리는 SAP에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 작용제를 동정하도록 스크리닝될 수 있는 항체 외의 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다.

파아지-디스플레이는 섬유상 박테리오파아지의 표면상의 항체 레퍼토리의 디스플레이를 통한 모의 면역 선택(mimic immune selection), 및 선택 항원에 대한 이들의 결합에 의한 후속 파아지 선택을 처리한다. 그러한 한 가지 방법이 WO 99/10494호에 기재되어 있다. 항-SAP 항체는 재조합 조합성 항체 라이브러리, 바람직하게는 인간 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조되는 인간 V_L 및 V_H cDNA를 사용함으로써 제조된 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해서 단리될 수 있다. 그러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성시키는 시판중의 키트가 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 SAP와 결합하지 않지만 다른 기능, 예컨대, 순환 반감기, 직접적인 세포독성 효과, 검출 가능한 표지화, 및 수용자의 내생성 보체 연쇄반응(complement cascade)의 활성화 또는 내생성 세포성 세포독성에 원인이 되는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 불변영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고, IgA (예, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 또는 IgM을 포함한 어떠한 이소타입일 수 있다. 불변영역을 포함하는 것에 추가로, 또는 이를 대신해서, 본 발명의 항원-결합 화합물은 에피토프 tag, 구제 수용체 에피토프(salvage receptor epitope), 진단 및 정제 목적의 라벨 부분, 또는 세포독성 부분, 예컨대, 방사성핵 또는 독소를 포함할 수 있다.

항-SAP 항체 또는 이의 단편은, 이의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서, 예를 들어, 분자, 예컨대, 반감기를 증가시키는 폴리사카라이드 폴리머를 포함한 PEG 또는 그 밖의 수용성 폴리머를 첨가하여 반감기를 증가시킴으로써 변형될 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 이특이적(bispecific)이다. 예를 들어, 이특이적 항체는 단일 항체(또는 항체 단편)과 유사할 수 있지만, 두 개의 상이한 항원 결합 부위(가변영역)을 지닌다. 이특이적 항체는 다양한 방법, 예컨대, 화학적 기술, "폴리도마(polydoma)" 기술 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 생성될 수 있다. 이특이적 항체는 둘 이상의 상이한 에피토프로서 이들중 하나 이상이 SAP의 에피토프인 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 이종항체일 수 있다. 이종항체는 둘 또는 그 초과의 항체, 또는 함께 연결된 항체 결합 단편(Fab), 상이한 특이성을 지니는 각각의 항체 또는 단편이다.

본원에서 사용된 용어 "항체 단편"은 온전한 전장 항체의 부분, 예컨대, 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 다이아보디(diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예, scFv); 다중 특이적 항체 단편, 예컨대, 이특이적, 삼특이적 및 다중 특이적 항체(예, 다이아보디, 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody)); 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질; 카멜라이즈드 항체(camelized antibod); 밈보디(mimbody); 킬레이트화 재조합 항체; 트리보디(tribody) 또는 바이보디(bibody); 인트라보디(intrabody); 나노보디(nanobody); 작은 모듈러 면역약제(small modular immunopharmaceuticals(SMIP)), V_HH 함유 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 그 밖의 어떠한 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 상황에서, 용어 항-SAP 항체 및 SAP 결합 항체는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 서열의 어떠한 부분을 포함하며 SAP와 결합하는 SAP 결합 항체 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "단편"은 SAP와 결합할 수 있는 단편, 예를 들어,항원 결합에 관련되는 항체의 3개 이상의 연속 아미노산(예, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 연속 아미노산, 예를 들어, CDR로부터의 그러한 연속 아미노산)중 어떠한 아미노산을 나타내며, Fab, Fab', F(ab')₂, 및 F(v) 단편, 또는 개개의 경쇄 또는 중쇄 가변영역 또는 그 일부를 포함한다. SAP 결합 단편은, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 scFv를 포함한다. 이들 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있으며, 순환계로부터 더욱 신속하게 제거되고, 온전한 항체보다 덜한 비-특이적 조직 결합을 나타낼 수 있다. 이들 단편은 온전한 항체로부터 공지된 방법을 이용함으로써, 예를 들어, 효소, 예컨대, 파파인(Fab 단편을 생성기키기 위함) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편을 생성시키기 위함)에 의한 단백질 분해성 분해에 의해서 생성될 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 SAP에 결합하는 단일-사슬 항체 단편(scFv)를 포함한다. scFv는 항체 경쇄 가변영역(V_L)에 작동적으로 연결된 항체 중쇄 가변영역(V_H)를 포함하며, 여기서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은, 함께 또는 개별적으로, SAP와 결합하는 결합 부위를 형성시킨다. scFv는 아미노-말단에서의 V_H 영역과 카르복시-말단에서의 V_L 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, scFv는 아미노-말단에서의 V_L 영역과 카르복시-말단에서의 V_H 영역을 포함할 수 있다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인, VL과 VH가 별도의 유전자에 대해서 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용함으로써 이들이 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해서 연결될 수 있으며, 그러한 단일 단백질 사슬에서, VL과 VH 영역이 쌍을 이뤄서 일가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 공지됨)를 형성시킨다. scFv는 임의적으로는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 V_H 도메인으로 이루어진 문헌[Nature 341 : 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같은 도메인 항체(dAb) 단편을 포함한다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 중쇄 항체(HCAb)를 포함한다. 이들 항체는 자명하게는, 이들 기능성 항체가 단지 중쇄의 디머(dimer)("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로 일컬어짐)인 점에서, 단지 중쇄 가변영역을 사용하여 항원-결합 영역을 형성시킬 수 있다. 따라서, SAP 결합 항체 및 이의 단편은 SAP에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체(HCAb)일 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 SAP 단백질에 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체를 포함한다. 이들 구성물은 항체 이펙터 기능을 수행하는데 필요한 면역글로불린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드이다(참조: WO03/041600).

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 다이아보디를 포함한다. 이들은 V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만 너무 짧아서 동일한 사슬상의 두 도메인 사이에 쌍을 이루게 할 수 없는 링커를 사용함으로써 발현되는 이가 항체이다. 이러한 항체는 도메인이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 하고, 그리하여, 두 개의 항원 결합 부위(참조예: WO 93/11161))를 생성시킨다. 다이아보디는 이특이적 또는 일특이적(monospecific)일 수 있다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 이뮤노아드헤신(immunoadhesin)을 포함한다. 하나 또는 그 초과의 CDR이 공유 또는 비공유적으로 분자내로 혼입되어 분자가 이뮤노아드헤신이 되게 한다. 이뮤노아드헤신은 더 큰 펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 통합할 수 있거나, CDR(들)을 또 다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합적으로 연결시킬 수 있거나, 비공유적으로 CDR(들)을 통합할 수 있다. CDR은 이뮤노아드헤신이 SAP에 특이적으로 결합되게 한다.

SAP 결합 항체 및 이의 단편은 또한 유기 또는 분자 스캐폴드(scaffold)(예컨대, 단백질, 또는 탄수화물 스캐폴드)상에 구성된 하나 이상의 SAP 결합 단백질을 포함하는 항체 의태체(antibody mimic)를 포함한다. 일반적으로 단백질 스캐폴드로 일컬어지는 비교적 한정된 3-차원 구조를 지니는 단백질이 항체 의태체의 설계를 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로는 특이적이거나 무작위적인 서열 변화에 취약한 하나 이상의 영역을 함유하고, 그러한 서열 무작위화(sequence randomization)는 종종 요구된 생성물이 선택될 수 있는 단백질의 라이브러리를 생성시키도록 수행된다. 예를 들어, 항체 의태체는 둘 또는 그 초과의 용매 노출된 루프를 지니는 면역글로불린형 도메인 함유 스캐폴드를 지니는데, 상기 용매 노출된 루프가 그 용매 노출된 루프 각각에 삽입된 모체 항체로부터의 상이한 CDR을 함유하게 하여, 면역글로불린형 도메인 함유 스캐폴드를 지니며, 모체 항체에 의해서 결합된 리간드를 향한 선택적 결합 활성을 나타내는 키메라 비-면역글로불린 결합 폴리펩티드를 포함한다. 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드는 새로운 결합 성질을 지니는 단백질을 얻기 위해서 제안되었다.

항-SAP 항체 또는 이의 항체 단편은 전형적으로는 인간 SAP에 높은 친화성(예, BIOCORE로 측정되는 경우), 예컨대, 약 15nM 또는 그 미만, 10 nM 또는 그 미만, 약 5 nM 또는 그 미만, 약 1 nM 또는 그 미만, 약 500 pM 또는 그 미만, 약 250 pM 또는 그 미만, 약 100 pM 또는 그 미만, 약 50 pM 또는 그 미만, 또는 약 25 pM 또는 그 미만, 약 10 pM 또는 그 미만, 약 5 pM 또는 그 미만, 약 3 pM 또는 그 미만, 약 1 pM 또는 그 미만, 약 0.75 pM 또는 그 미만, 또는 약 0.5 pM 또는 그 미만의 SAP에 대한 평형 결합 해리 상수(Kp)로 결합된다.

적합하게는, 항-SAP 항체 또는 이의 항체 단편은 SAP가 아닌 어떠한 표적과 가교반응하지 않는다.

본원에 기재된 항체 및 항체 단편은 어떠한 적합한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 그러한 항체 및 항체 단편을 제조하는 적합한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 항체 또는 항체 단편은 단리되거나 어떠한 정도로 정제될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단리된 화합물"은 그 천연 환경으로부터 제거된 화합물이다.

"정제된 화합물"은 순도가 증가되어 그 천연 환경에서 존재하고/거나 실험실 조건에서 최초 합성되거/거나 증폭된 때의 것 보다 더 순수한 형태로 존재하는 화합물이다. 순도는 상대적인 용어이며 반드시 절대적인 순도를 의미하는 것이 아니다.

SAP -제거 화합물

본 발명의 화합물은 순환 SAP의 제거를 초래하는 화합물을 포함한다.

그러한 화합물은 (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC)을 포함한, 유럽특허출원 EP 0 915 088호에 기재된 바와 같은, 아밀로이드 원섬유에 대한 SAP의 결합에 대한 경쟁적 억제제인 화합물을 포함하지만, 본원에 기재된 화합물중 어떠한 화합물 또는 순환 SAP를 감소시키는 어떠한 그 밖의 화합물이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.

본원에서 참조로 통합된 국제특허출원 WO 2004/099173호는 본 발명에서 사용될 수도 있는 회문형 화합물(palindromic compound)을 기재하고 있다.

바람직한 구체예에서, SAP-제거 화합물은 D-프롤린이며; 하기 화학식의 D-프롤린, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 모노- 또는 디-에스테르가 바람직하다:

상기 식에서,

R은

이고;

기 R¹은 수소 또는 할로겐이고;

X-Y-X'는 4개 이상, 유익하게는 5개 이상, 더욱 유익하게는 6개 이상, 20개 이하의 선형 또는 직쇄 탄소 원자를 지니는 링커이고,

X는 -(CH₂)_n-; -CH(R²)(CH₂)_n-; CH₂0(CH₂)_n-; CH₂NH-; 벤질, -C(R²)=CH-; -CH₂CH(OH)-; 또는 티아졸-2,5-디일이고;

Y는 -S-S-; -(CH₂)_n-; -O-; -NH-; -N(R²)-; -CH=CH-; -NHC(O)NH-; -N(R²)C(O)N(R²)-; -N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-; -N(CH₂C₆H₅)-; -N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-; -N(알콕시알킬)-; N(시클로알킬-메틸)-; 2,6-피리딜; 2,5-푸라닐; 2,5-티에닐; 1,2-시클로헥실; 1,3-시클로헥실; 1,4-시클로헥실; 1,2-나프틸; 1,4-나프틸; 1,5-나프틸; 1,6-나프틸; 바이페닐렌; 또는 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌 및 1,4-페닐렌이고, 여기서, 페닐렌 기는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 히드록실, 카르복시, -COO-저급 알킬, 니트릴로, 5-테트라졸, (2-카르복실산 피롤리딘-1-일)-2-옥소-에톡시, N-히드록시카르밤이미오딜(N-hydroxycarbamimiodyl), 5-옥소[1,2,4]옥사디아졸릴, 2-옥소[1,2,3,5]옥사티아디아졸릴, 5-티옥소[1,2,4]옥사디아졸릴 및 5-tert-부틸설파닐-[1,2,4]옥사디아졸릴로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체에 의해서 치환되거나 치환되지 않으며;

X'는 -(CH₂)_n-; -(CH₂)_nCH(R²)-; -(CH₂)_nOCH₂-; -NHCH₂-; 벤질, -CH=C(R²)-; CH(OH)CH₂; 또는 티아졸-2,5-디일이고;

R²는 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 벤질이고;

n은 0 내지 3이다.

상기된 바람직한 구체예를 포함한, 순환계로부터 SAP를 감소시키는 화합물은 이하 SAP-제거 화합물이라 칭한다.

한 가지 구체예로, 상기 화학식(I-A)의 D-프롤린은 리간드-링커-리간드로서 기재될 수 있으며, 여기서, 화학식(I-A)의 X-Y-X' 부분은 링커를 형성한다. 본 발명의 범위 내에서, 링커(X-Y-X')는 길이 4 내지 15개의 선형 탄소원자, 5 내지 10개의 선형 탄소원자, 및 6 내지 8개의 선형 탄소원자를 포함한 길이 4 내지 20개의 선형 탄소원자일 수 있다. 링커는 직쇄 또는 분지쇄이거나, 임의로 하나 이상의 고리 구조를 형성할 수 있고, 단, 4개 이상의 선형 또는 직쇄 탄소원자가 링커에 존재한다. 한 가지 구체예에서, 선형 또는 직쇄 C 원자중 하나 이상은 N, O, 또는 S, 유리하게는 O 또는 S, 바람직하게는 O로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.

따라서, "치환되거나 치환되지 않은 링커"는 링커의 선형 또는 직쇄 탄소원자의 탄소원자(들)의 분지 및/또는 하나 이상의 치환을 유도할 수 있는 하나 이상의 치환체를 지닐 수 있으며, 예를 들어, 링커는 에테르 또는 치환된 에테르일 수 있다.

약제학적 조성물

적합하게는, 본원에 기재된 바와 같은 SAP-제거 화합물 및 본원에 기재된 바와 같은 항-인간 SAP 항체 또는 이의 단편이 치료 유효량을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은, 환자에게 투여(예, 하나 이상의 용량으로서)되는 경우에 아밀로이드증의 어떠한 증상, 특징, 또는 특성에 대한 어떠한 검출 가능한 양성 효과를 나타낼 수 있는, SAP-제거 화합물 및 항-(인간) SAP 항체 또는 이의 단편의 양 또는 약제학적 조성물의 일부로서의 이의 양을 나타낸다.

SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 조합물은 별도로, 동시에, 연속적으로, 공동으로 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 조합물은 하나의 약제학적 제형의 형태로 존재할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 아밀로이드증의 치료학적 또는 예방학적 처리에서의 동시, 별도 또는 연속 사용을 위한 조합된 제제로서 SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편과 관련이 있다.

SAP-제거 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 항-SAP 항체 또는 이의 단편과는 별도로 투여될 수 있으며, 그러한 별도 투여는 동일한 시점 또는 상이한 시점에, 예를 들어, 동일 날짜 또는 상이한 날짜에 수행될 수 있다. SAP-제거 화합물과 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 조합물이 연속적으로 투여되어야 하는 경우, SAP-제거 화합물이 먼저 투여되어서 SAP-제거 화합물 처리가 거의 모든 순환 SAP를 제거할 수 있게 한다. 이러한 투여는 조직내의 아밀로이드 침착물과 관련된 실질적인 양의 SAP를 남게 하기 때문에, 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 후속 투여가 아밀로이드 침착물에 대한 편재화 및 특이적 결합을 가능하게 하여 이들의 신속하고 광범위한 퇴행을 촉진시킨다. 적합하게는, 항-SAP 항체 또는 이의 단편은 SAP-제거 화합물에 의한 처리(들) 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1O, 12, 15, 20 또는 25일 또는 그 초과의 일 동안 투여될 수 있다.

순차적 투여는 SAP-제거 화합물에 의한 둘 이상의 연속 처리에 이어진 항-SAP 항체 또는 이의 단편에 의한 둘 이상의 연속 처리를 포함할 수 있다.

순차적 투여는 1회 이상 반복되는 SAP-제거 화합물에 의한 1회 처리에 이어진 항-SAP 항체 또는 이의 단편에 의한 1회 순차적 처리를 포함한다.

순차적/후속 용량은 최초/이전의 용량보다 많거나 최초/이전의 용량 보다 적은 양일 수 있다.

SAP-제거 화합물 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 최초 용량의 투여 다음에는 SAP-제거 화합물 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 1회 이상의 순차적(예, 후속) 용량의 투여가 이어질 수 있으며, 여기서, 그러한 1회 이상의 순차적 용량은 최초 용량과 대체로 동일하거나 그보다 적은 양일 수 있다.

SAP-제거 화합물 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 최초 용량의 투여 다음에는 1회 이상의 순차적(예, 후속) 용량의 투여가 이어질 수 있으며, 여기서, 후속 용량 중 하나 이상은 최초 용량보다 많은 양이다.

따라서, 투여는 예정되거나 통상적인 투여 스케줄을 이용하여 용량 투여 사이에 예정된 시간이 있게 할 수 있다. 스케줄은, 스케줄이 예정되는 한, 기간이 동일하거나 상이한 시간을 포함할 수 있다. 적절한 스케줄이 특정 날짜에서의 투여를 포함하는 것으로 스케줄이 사전에 결정되는 한, 어떠한 특정의 조합이 그러한 스케줄에 의해서 커버될 수 있다.

약제학적 조성물은 인간 및 수의학적 의약에서의 인간 또는 동물 사용을 위한 것일 수 있으며, 전형적으로는 어떠한 하나 이상의 약제학적으로 하용되는 화합물, 예컨대, 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석 작용제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌킹제(bulking agent), 완충제, 전달 비히클, 등장성 작용제, 보조용매, 습윤화제, 착화제, 완충화제, 항생제, 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 치료용으로 허용되는 화합물이 약제학적 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R, Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다.

약제학적 조성물은 항산화제, 예컨대, 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민 및/또는 젤라틴, 친수성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 및/또는 소르비톨; 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 그 밖의 탄수화물; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(Tween), 플루로닉(pluronic), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 적합한 등장성 향상제는 알칼리금속 할라이드(바람직하게는, 소듐 또는 포타슘 클로라이드), 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘 펜에틸 알코올 및 소르브산을 포함한다. 적합한 보조용매는 글리세린 및 프로필렌 글리콜을 포함한다. 적합한 착화제는 카페인 및/또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 적합한 계면활성제 또는 습윤화제는 소르비탄 에스테르 및/또는 폴리소르베이트를 포함한다. 완충제는 통상의 완충제, 예컨대, 시트레이트, 아세테이트, 보레이트, 바이카보네이트, 또는 트리스-HCl일 수 있다. 아세테이트 완충제는 pH 약 4 내지 5.5일 수 있으며, 트리스 완충제는 pH 약 7 내지 8.5일 수 있다. 추가의 약제학적 작용제가 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990]에 기재되어 있다.

약제학적 담체, 부형제 또는 희석제 등은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 실무을 기초로 하여 선택될 수 있다.

조성물/제형 요건은 상이한 전달 시스템(들)에 따라서 상이할 수 있다.

조성물은 액체, 냉동건조, 또는 동결-건조된 형태일 수 있으며, 하나 이상의 동결건조보호제, 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조 첨자제 및/또는 벌킹제를 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 비-환원당, 예컨대, 수크로오스 및/또는 락토오스인 동결건조보호제가 포함될 수 있다. 일반적으로 포함된 동결건조보호제의 양은 재구성 시에 생성되는 제형이 전형적으로는 등장성이게 하는 양이다. 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제와 같은 계면활성제가 포함될 수 있다. 사전-동결건조된 제형에 존재할 수 있는 계면활성제의 예시적인 양은 약 0.001 내지 0.5%이다. 고분자량 구조 첨가제(예, 충전제, 결합제)가 포함될 수 있다. 고분자량 구조 첨가제의 예시적인 농도는 0.1중량% 내지 10중량%이다. 다른 구체예에서, 벌킹제(예, 만니톨, 글리신)가 포함될 수 있다.

조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 조성물은 당업자가 이용할 수 있는 어떠한 경로, 예컨대, 관절내(intraarticular), 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 대뇌내(뇌실질내), 뇌혈관내, 근육내, 안내, 동맥내, 병변내, 경구 및 흡입 경로에 의해서 동물내로 주사 또는 주입하기에 적합할 수 있다. 비경구 제형은 전형적으로는 약제학적으로 허용되는 보존제를 임의로 함유하는 무균, 무-피로겐(pyrogen-free), 등장성 수용액일 수 있다.

약제학적 조성물은 특정의 국소 환경에서 지연된 방출 및/또는 증가된 안정성 또는 반감기로 생성물(예, 거환약(bolus), 데포 효과(depot effect))의 국소 농도를 제공하는 방식으로 조절되거나 지속된 전달을 위해서 제형화될 수 있다. 특정의 구체예에서, 그러한 조성물은 초기 침착물 중에 상당히 더 많은 양의 SAP-제거 화합물 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있지만, 어느 시점에서 실질적으로 방출되고 이용 가능한 유효량의 항체 또는 이의 단편은 초기 침착물 보다 훨씬 더 적은 양으로 포함된다. 조성물은 폴리머 화합물의 미립자 제제뿐만 아니라, 작용제, 예컨대, 생분해성 매트릭스, 주사 가능한 미소구체, 마이크로캡슐 입자, 마이크로캡슐, 생분해성 입자 비드, 리포좀, 및 활성 작용제의 조절된 또는 지속된 방출에 이어서 데포 주입으로서 전달되게 할 수 있는 이식 가능한 전달 장치를 포함할 수 있다.

그러한 지속된- 또는 조절된-전달 수단을 제형화하는 기술은 공지되어 있고, 다양한 폴리머가 약물의 조절된 방출 및 전달을 위해서 사용되었다. 그러한 폴리머는 전형적으로는 생분해성이고 생적합성(biocompatible)이다. 거울상이성체 폴리머 또는 폴리펩티드 세그먼트의 복합화에 의해서 형성된 것들을 포함한 폴리머 하이드로겔, 및 온도 또는 pH 민감성 하이드로겔이 약물 데포 효과를 제공하기에 바람직할 수 있는데, 그 이유는 생활성 단백질 작용제(예, 항체)를 포집하는 것과 관련된 유연하고 수성인 상태 때문이다.

생체접착성 폴리머가 또한 조성물중에 사용될 수 있다. 생체접착제(Bioadhesive)는 장시간 동안 생물학적 물질에 접착할 수 있는 합성 및 천연 물질이다. 예를 들어, 카르보폴 및 폴리카르보필(polycarbophil)은 둘 모두 폴리(아크릴산)의 합성 가교된 유도체이다.

약제학적 조성물은 흡입을 위해서, 예컨대, 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 흡입 용액이 또한 에어로졸 전달을 위한 액화된 추진체내에 제형화될 수 있다. 또 다른 제형으로, 용액이 분무될 수 있다. 폐 투여를 위한 추가의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 개시하고 있는 PCT 출원 공보 WO 94/20069호에 기재된 것을 포함한다. 폐 전달의 경우에, 입자 크기는 원위 폐로의 전달에 적합해야 한다. 예를 들어, 입자 크기는 1 ㎛ 내지 5 ㎛일 수 있지만, 각각의 입자가 적당히 다공성이라면, 더 큰 입자가 사용될 수 있다.

또 다른 제제는 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물을 포함할 수 있다. 무균수, 또는 또 다른 적절한 비히클 중에 정제를 용해시킴으로써, 용액이 단위 용량형으로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 불활성 희석제, 예컨대, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트 또는 바이카보네이트, 락토오즈, 또는 칼슘 포스페이트; 또는 결합제, 예컨대, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크를 포함한다.

특정의 제형이 경구로 투여될 수 있다. 이러한 형태로 투여되는 제형은 고체 용량형, 예컨대, 정제 및 캡슐의 컴파운딩에 통상 사용되는 담체와 함께 또는 그러한 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용성이 최대화되고 사전-전신 분해가 최소화 되는 때의 위장관내의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출시키도록 설계될 수 있다. 추가의 작용제가 선택적인 결합제의 흡수를 촉진하도록 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 약제학적 조성물은 치료 유효량 또는 예방 유효량의 SAP-제거 화합물 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

"치료 유효량"은 요구된 치료 결과를 달성하도록 용량형에서 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 항체 또는 항체 부분의 치료 유효량은 질환상태, 연령, 성별, 및 개체의 체중, 및 그러한 개체에서의 요구된 반응을 유발시키는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 인자에 따라서 다양할 수 있다. 치료 유효량은 또한 어떠한 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 유리한 효과가 더 큰 양이다.

"예방 유효량"은 요구된 예방적 결과를 달성하도록 용량형에서 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 나타낸다.

약제학적 조성물의 치료 또는 예방 유효량은, 예를 들어, 치료 객체, 예컨대, 조성물이 사용되는 처방, 투여 경로, 및 대상자의 상태에 좌우될 것이다. 약제학적 조성물은 치료 또는 예방 유효량으로 투여되어 아밀로이드증을 치료한다. "치료 또는 예방 유효량"은 대상자에서의 아밀로이드증의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하는 양이다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 또한 아밀로이드증에 대한 통상의 치료와 병행해서 사용될 수 있다.

약제학적 염

SAP-제거 화합물은 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 염은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Berge et al, in J. Pharm . Sci., 66, 1-19 (1977)]에서 언급된 염을 포함한다. 적합한 산부가염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 형성되며, 히드로클로라이드, 히드로브로미드, 히드로요오디드, 니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 히드로겐포스페이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 글루코네이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 포르메이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트 및 p-톨루엔설포네이트 염을 포함한다.

하나 이상의 산성 부분이 존재하는 경우에, 적합한 약제학적으로 허용되는 염기부가염이 비독성 염을 형성하는 염기로부터 형성될 수 있으며, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소듐, 징크(zinc), 및 약제학적-활성 아민, 예컨대, 디에탄올아민, 염을 포함한다.

약제학적으로 허용되는 염은 SAP-제거 화합물과 요구된 산 또는 염기의 용액을 적절하게 함께 혼합함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 그러한 염은 용액으로부터 침전될 수 있으며, 여과에 의해서 수집될 수 있거나 용매의 증발에 의해서 회수될 수 있다.

투여

성분은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있으며, 예를 들어, 성분이 의도된 투여 경로 및 표준 약제 실무와 관련하여 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와의 혼합물로서 존재하는 경우에, 그러한 조성물로서 투여될 수 있다.

예를 들어, 성분은, 즉시방출, 지연방출, 변형방출, 지속방출, 펄스식 방출 또는 조절된 방출 적용을 위한, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있는, 정제, 캡슐, 소란(ovule), 엘릭시르(elixir), 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다.

약제학적 조성물이 정제인 경우, 정제는 부형제, 예컨대, 미세 결정상 셀룰로오즈, 락토오즈, 소듐 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 이염기성 칼륨 포스페이트 및 글리신, 붕해제, 예컨대, 전분(바람직하게는, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 타피오카 전분), 소듐 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 소듐(croscarmellose sodium) 및 특정의 복합체 실리케이트, 과립화 결합제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오즈(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오즈(HPC), 스크로오즈, 젤라틴 및 아카시아를 함유할 수 있다. 추가적으로, 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크가 포함될 수 있다.

유사한 유형의 고체 조성물이 또한 젤라틴 캡슐내의 충전제로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토오즈, 전분, 셀룰로오즈, 유당, 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엑릭시르의 경우에, 작용제는 다양한 감미제 또는 향미제, 착색제 또는 염료와, 유화제 및/또는 현탁제와, 희석제, 예컨대, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린 및 이들의 조합물과 조합될 수 있다.

투여(전달) 경로는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 경구(예, 정제, 캡슐, 또는 소화 가능한 용액으로서), 국소, 점막(예, 흡입을 위한 비내 스프레이 또는 에어로졸), 비내, 비경구(예, 주입 가능한 형태에 의해서), 위장관, 척수내, 복강내, 근육내, 정맥내, 자궁내, 안내(intraocular), 피부내, 두개내(intracranial), 기관내(intratracheal), 질내, 대뇌혈관내, 대뇌내, 피하, 안구(유리체내 또는 앞방내(intracameral)), 경피, 직장, 구강, 질, 경막외(epidural) 및 설하중 하나 이상을 포함할 수 있다.

한 가지 특이적 구체예에서, 투여 방식은 정맥내 방법이다.

용량 수준

적합한 및/또는 바람직한 약제학적 제형은, 의도된 투여 경로, 전달 형태, 및 요구된 용량에 따라서, 본 개시사항 및 제형화 기술에 대한 일반적인 지식을 고려하여 결정될 수 있다.

전형적으로, 의사가 개별 대상자에 가장 적합할 수 있는 실질적인 용량을 결정할 수 있다.

어떠한 특정의 환자에 특이적인 용량 수준 및 용량 횟수는 다양할 것이며, 사용되는 특정의 화합물의 활성, 그 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식사, 투여 방식 및 시간, 배설율, 약물 조합, 특정의 상태의 중증도, 및 개별적인 진행중인 요법를 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 예를 들어, SAP-제거 화합물은 그 활성에 따라서 2mg/kg 내지 0.1mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

항-SAP 항체 또는 이의 단편은 대상자 체중당 용량의 비와는 무관하게 고정된 용량으로 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 3000mg 또는 그 미만과의 항체 또는 이의 단편, 2700mg 또는 그 미만과의 항체 또는 이의 단편, 2500mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 2200mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 2100mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 1700mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 1500mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 1200mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 1100mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 1000mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 700mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 500mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 200mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편, 100mg 또는 그 미만의 항체 또는 이의 단편의 하나 이상의 별도, 동시 또는 순차적 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 20mg 이상의 항체 또는 이의 단편의 하나 이상의 용량으로 투여된다.

SAP-제거 화합물은 대상자 체중당 용량의 비와는 무관하게 고정된 용량으로 투여될 수 있다. SAP-제거 화합물은 100 mg 또는 그 미만, 50 mg 또는 그 미만, 25 mg 또는 그 미만, 또는 10 mg 또는 그 미만의 하나 이상의 별도, 동시 또는 순차적 비경구 용량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, SAP-제거 화합물은 본 기술분야의 전문가에 의해서 용이하게 결정되는 대상자 체중당 용량의 비로 투여될 수 있다.

제형화

성분(들)은 약제학적 조성물내로, 예를 들어, 적합한 담체, 희석제 또는 부형제중 하나 이상과 혼합함으로써, 본 기술분야에서 공지된 기술을 이용함으로써 제형화될 수 있다.

발현

광범위하게 다양한 발현 시스템이 항-SAP 항체 및 Fab 단편, scFv 및 V_HHs를 포함한 항체 단편의 제조에 이용 가능하다. 예를 들어, 원핵 및 진핵 기관 둘 모두의 발현 시스템이 항체 단편 및 항체 융합 단백질의 대규모 생성을 위해서 사용될 수 있다.

그램-음성 박테리움 이. 콜라이(gram-negative bacterium E. coli)가 이종 유전자 발현을 위한 숙주로서 광범위하게 사용된다. 그러나, 다량의 이종 단백질이 세포 내부에 축적되는 경향이 있다. 이. 콜라이 세포내 단백질의 벌크로부터의 요구된 단백질의 후속 정제가 종종 어려울 수 있다.

이. 콜라이와는 대조적으로, 바실러스(Bacillus) 속로부터의 박테리아가 배양 배지내로 단백질을 분비하는 이들의 능력으로 인해서 이종 숙주로서 아주 적합하다. 숙주로서 적합한 다른 박테리아는 스트렙토마이세스(Streptomyces ) 및 수도모나스(Pseudomonas) 속으로부터의 박테리아이다.

폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누쿨레오티드의 특성 및/또는 발현된 단백질의 추가의 처리를 위한 적합성에 따라서, 효모 또는 다른 균류와 같은 진핵 숙주가 바람직할 수 있다. 일반적으로, 효모 세포가 균류 세포에 비해서 바람직한데, 그 이유는 효모 세포가 조작이 더 용이하기 때문이다. 그러나, 일부 단백질은 효모 세포로부터 불량하게 분비되거나, 일부의 경우에, 적절히 처리되지 않는다(예, 효소에서의 과글리코실화). 이러한 경우에, 상이한 균류 숙주 유기체가 선택될 있다.

본 발명의 범위내의 적합한 발현 숙주의 예는 균류, 아스페르길러스 종(Aspergillus)(예컨대, EP-A-O184438 및 EP-A-0284603에 기재된 것들) 및 트리코데마(Trichoderma) 종; 박테리아, 예컨대, 바실러스(Bacillus) 종(예컨대, EP-A-0134048 and EP-A-0253455에 기재된 것들), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 및 수도모나즈(Pseudomonas) 종; 및 효모, 예컨대, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종(예컨대, EP-A-0096430 및 EP-A-0301670에 기재된 것들) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 종이다.

적합한 숙주 세포, 예컨대, 효모, 균류 및 식물 숙주 세포의 사용은, 재조합 발현 생성물에 최적의 생물학적 활성을 부여하는데 필요할 수 있는, 전사후 변형(예, 미리스토일화, 글리코실화, 트렁케이션(truncation), 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 포스포릴화)을 위해서 제공될 수 있다.

배양 배지내로 다량의 항체 단편의 분비를 허용하는 발현 시스템이 특히 유리하다.

키트

본 발명의 특정의 구체예에서, 아밀로이드증의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품 또는 "키트(kit)"가 제공된다.

적합하게는, 키트가 D-프롤린 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 별도 또는 순차적 투여를 위해서 제형될 수 있다.

한 가지 구체예에서, 키트는 SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 키트는 SAP-제거 화합물을 포함하는 제 1 용기와 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함하는 제 2 용기를 포함한다.

적합하게는, SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편은 아밀로이드증의 치료 및/또는 예방을 위한 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 존재한다.

적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩(Blister Pack) 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다.

용기는 SAP-제거 화합물 또는 이의 약제학적 제형 및/또는 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 아밀로이드증을 치료하기에 유효한 양으로 포함하며, 무균 접근 포트를 지닐 수 있다(예, 용기는 피하주사 바늘에 관통되는 스토퍼를 지닌 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다).

키트는 용기상에 그와 연관된 라벨 또는 의약품 설명서(package insert)를 포함할 수 있다. 라벨 또는 의약품 설명서는 조성물(들)이 아밀로이드증을 치료하기 위해서 사용됨을 명시할 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 키트는 약제학적으로 허용되는 완충액, 예컨대, 주사를 위한 정균수(bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거액(Ringer's solution) 및 텍스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함한 시판 및 사용자 입자에 바람직한 그 밖의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

키트는 추가로 아밀로이드증을 치료 또는 예방하기 위한 SAP-제거 화합물 및 항-SAP 항체 또는 이의 단편의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트가 SAP-제거 화합물을 포함하는 제 1 조성물과 항-SAP 항체를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 경우, 키트는 추가로 이를 필요로 하는 대상자에게 제 1 및 제 2 약제학적 조성물의 동시, 순차 또는 별도 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 키트는 조성물의 고체 경구 형태, 예컨대, 정제 또는 캡슐의 전달에 적합할 수 있다. 그러한 키트는, 예를 들어, 다수의 단위 용량형을 포함한다. 그러한 키트는 그들의 의도된 사용의 순서로 배향된 용량형들을 지니는 카드를 포함할 수 있다. 그러한 키트의 예는 "블리스터 팩(blister pack)"이다. 블리스터 팩은 포장 분야에서 공지되어 있으며, 약제학적 단위 용량형을 포장하는데 광범위하게 사용되고 있다. 요구되는 경우, 기억 보조요소가, 예를 들어, 용량형이 투여되는 치료 스케쥴의 날짜를 지정하는 숫자, 문자, 또는 그 밖의 표시의 형태로 또는 일정 설명서와 함께 제공될 수 있다.

키트가 SAP-제거 화합물의 약제학적 제형과 항-SAP 항체 또는 이의 단편을 포함하는 제 2 제형을 포함하는 특정의 구체예에서, 키트는 별도의 제형을 함유하는 별도의 용기, 예컨대, 분리된 병 또는 분리된 호일 패킷을 포함할 수 있지만; 별도의 조성물은 하나의 분리되지 않은 용기내에 함유될 수도 있다. 전형적으로는, 키트는 별도의 성분의 투여를 위한 설명서를 포함한다. 이러한 키트 형태는 별도의 성분이 상이한 용량형으로 투여되거나(예, 경구 및 비경구), 상이한 용량 간격으로 투여되거나, 조합물의 개별적인 성분의 적정이 처방 의사에 의해서 요구되는 경우에 특히 유리하다.

검정 방법

추가의 특징으로, 본 발명은 아밀로이드증의 치료, 특히 아밀로이드 침착물의 기본적으로는 완전한 제거를 위해서 본원에 기재된 SAP-제거 화합물과 함께 사용될 수 있는 하나 이상의 작용제를 확인하는 검정 방법을 제공한다.

작용제는 유기 화합물 또는 그 밖의 화학약품일 수 있다. 작용제는 천연이든지 또는 합성이든지 어떠한 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있거나 그에 의해서 생성되는 화합물일 수 있다. 작용제는 아미노산 분자, 폴리펩티드 또는 이의 화학적 유도체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 작용제는 또한 센스(sense) 또는 항-센스 분자일 수 있는 폴리누클레오티드 분자, 또는 항체, 예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 모노클로날 인간화된 항체일 수 있다.

한 가지 구체예에서, 작용제는 항체, 예컨대, 항-SAP 항체로부터 유래되거나 유래될 수 있는 항체이다.

작용제는 화학적 합성 기술에 의해서 제조될 수 있다.

일반적인 재조합 DNA 방법

본 발명은, 달리 명시하지 않는 한, 본 기술분야의 전문가의 능력내에 있는 통상의 화학 기술, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학을 이용한다. 그러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 참조예[J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing : Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IrI Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology : DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press]. 이러한 일반적인 문헌 각각이 본원에서 참조로 통합된다.

본 발명은 본 발명을 수행하는데 있어서 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자를 돕는 것으로 작용하는 의미를 지니는 실시예에 의해서 추가로 설명될 것이며, 이는 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨지지 않는다.

실시예

실시예 1: 트랜스제닉 마우스 발현 인간 SAP 에서의 전신 아밀로이드 침착물의 제거.

본 연구에서, AA 아밀로이드증은 아밀로이드 향상 인자 주사에 이어서 카제인을 반복 주입하여 지속적인 급성 염증을 유발시키고, 그에 의해서, SAA 생성의 증가를 충분히 지속시켜서 모든 동물에서 AA 아밀로이드 침착을 촉진시킴으로써 마우스에서 유도되었다. 마우스 SAP 유전자가 결실되고¹³ 인간 SAP 트랜스진이 도입된^{14 ,15} 순수한 혈통 C57BL/6 동물의 독특한 혈통을 사용하였다. 따라서, 이들은 어떠한 마우스 SAP를 발현하지 못하지만, 사람에게서 보여지는 농도보다 현저하게 더 큰 농도로 인간 SAP를 발현한다. 본 발명자들은 아밀로이드가 없는 비처리 대조 마우스에 비해서 방사성표지된 인간 SAp의 상당히 증가된 전체 신체 보유를 확인함으로써 모든 마우스가 과잉의 전신 아밀로이드 침착물을 전개하였음을 확인하였다. 본 발명자들은 이어서 아주 유사하게 매칭된 세 그룹을 다음과 같이 처리하였다:

그룹 1. (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC), SAP 제거 약물^{16 ,17}, 및 양 항-인간 SAP 항체의 단일 용량; 비혈연관계 혈청으로부터의 대조 양 IgG

그룹 2. CPHPC 및 비혈연 혈청으로부터의 대조 양 IgG;

그룹 3. 비처리.

이들 대조 그룹은 염증이 중단된 경우의 아밀로이드 침착물의 공지된 자발적 퇴행에 관한 비교를 제공하기에 필수적이다. 이러한 그룹들은 또한 상이한 개별적인 마우스에서, 또한 이들의 동계교배 순수 혈통 동물에서, 상이한 아밀로이드 퇴행 속도에 대한 상쇄를 위해서 충분히 클 것이 요구된다. 유사하게는, 실험은 수행될 수 없지만, 아밀로이드 유도는 계속되는데, 그 이유는 아밀로이드 침착이 발생하는 다양한 래트 때문이다. 본원에 기재된 바와 정확히 동일한 원안에 따라서 및 동일한 시약으로 수행된 15 마리의 마우스 각각의 그룹에 대한 예비적인 실험에서, 본 발명의 발명자들은 이하 나타낸 바와 동일한 결과를 얻었다. 본 실험은 이어서 각각의 그룹에서의 더 큰 수로 수행되어 관찰된 효과가 재현 가능하고 주어진 처리와 관련되지 않은 그룹중 한 그룹에서의 가속된 아밀로이드 퇴행의 우발사건(chance occurrence)에 기인하지 않음을 확인하였다.

인간 SAP 트랜스제닉 마우스에서, 인간 SAP는 순환계 및 아밀로이드 침착물 둘 모두에 존재한다. 약물 CPHPC는 두 가지의 본래의 펜타머 SAP 분자 및 5 CPHPC 분자로 구성된 복합체중의 인간 SAP에 의해서 특이적으로 결합된다¹⁶. 이러한 복합체는 간에 의해서 비정상으로 인식되며 간세포에 의해서 아주 신속하게 흡수되고 분해되어서, 순환계로부터 SAP를 효과적으로 제거한다¹⁶. 약물이 투여되는 한, 혈장 SAP 농도는 아주 낮게 유지된다¹⁶. CPHPC는 극히 관용적이며, 약물 자체뿐만 아니라 이것이 생성시키는 SAP 제거도 어떠한 부작용을 유발.시키지 않는다¹⁶(및 공개되지 않은 결과) 특히, 두드러진 신장 아밀로이드증을 지니는 개체에서의 신장 기능의 보존과 관련하여, 인간 전신 아밀로이드증 환자에서의 CPHPC 처리에 의한 임상적 이점의 증거가 있다(공개되지 않은 결과). 이러한 유망한 관찰에도 불구하고, 전신 아밀로이드증을 지닌 환자에서 기관 기능을 보존하고 수명을 연장시킬 수 있는 신속하고 최적인 치료 효능은 아밀로이드 침착물의 실질적이거나 완벽한 제거를 필요로 할 것이다. 본 발명자들이 입증하고 있는 바와 같이, 이러한 제거가 본 발명에 따라서 CPHPC와 항-인간 SAP 항체의 조합에 의한 처리에 의해서 달성될 수 있다.

CPHPC 처리는 거의 모든 순환 인간 SAP를 제거하지만, 조직내의 아미로이드 침착물과 관련된 실질적인 양의 SAP를 남긴다(공개되지 않은 관찰). 인간 환자에서 관찰되는 아밀로이드 침착물로부터의 SAP의 최대한의 제거는 수 개월의 연속 CPHPC 투여 후에 약 90%이다. 순환 SAP가 제거된 환자내로 인간 SAP에 대한 일특이적 항체의 정맥내 주입은 항체가 아밀로이드 침착물에 위치하게 하여 그에 특이적으로 결합하고 이들의 신속하고 광범위한 퇴행을 촉진하면서 상응하는 임상적 이익이 나타나게 한다. 본 발명자들은 본원에서 AA 아밀로이드증의 인간 SAP 트랜스제닉 마우스 모델에서의 이러한 과정의 효능을 나타내고 있다.

실험 원안 및 방법

전신 AA 아밀로이드증은 마우스 SAP 유전자가 결실되고 인간 SAP에 대해서 트랜스제닉인 성숙한 웅성(n=61) 및 자성(n=32)의 순수한 혈통 C57BL/6 마우스에서 유도되었다¹⁵. 각각의 마우스에게 단일 용량의 아밀로이드 향상 인자⁹를 정맥내 주입에 의해서 투여한 4일 후에 매일 10회의 0.1M NaHCO₃ 중의 용액으로 10% w/v 카제인의 피하 주입을 12일 동안 수행하였다¹³. 마지막 카제인 주사 7일 후에, K1을 모든 마우스의 식수에 도입하고, 3일 후에 각각의 마우스에게 표준 용량의 ¹²⁵I-표지된 인간 SAP를 정맥내 주입하였다^{6 ,18}. 동일한 집단이지만 어떠한 다른 처리가 수행되지 않은 4 마리의 성숙한 웅성 및 4 마리의 자성 마우스에게 대조로서 K1 및 ¹²⁵I-SAP를 투여하였다. 모든 마우스는 트레이서(tracer) 주입 후 24, 48, 72, 96 및 168시간 후에 전체 신체 계수를 수행하여 전체 신체 아밀로이드 부하의 지표로서 방사성 활성의 보유를 측정하였다. 모든 시점에서 대조군에 비해서 모든 처리된 마우스에서 일관되게 더 많은 보유를 나타내어서, 이들이 모두 실질적인 전신 아밀로이드 침착물을 지님을 나타냈다^{1 8}. 마우스는 이어서 각각의 그룹에서 동일한 전체 수 및 성 분포로 가능한 한 가깝게 아주 유사하게 매칭된 세 개의 그룹으로 할당되었다. ¹²⁵I-SAP 주입 10일 후에, 그룹 1과 2를 이들의 식수중에 CPHPC에 대해서 1mg/ml로 시작하고, 시험 마지막까지 계속하였다. 그룹 3은 본 연구 단계 또는 어떠한 이후의 연구 단계에서 이러한 처리를 수행하지 않았다. CPHPC를 시작한 5일 후에, 그룹 1중의 각각의 동물은 포스페이트 완충된 생리 식염수 중의 용액으로 7mg/ml의 특이적 항체를 함유하는 50mg/ml의 일특이적 양 항-인간 SAP 항혈청의 1ml의 전체 IgG 분획을 포함하는 복강내 주입액이 투여되었다. 항혈청은 100% 순수한 인간 SAP를 지니는 양의 면역화에 의해서 생성되었다. 동시에, 그룹 2중의 모든 동물은 포스페이트 완충된 생리 식염수중의 용액으로 50mg/ml의 일특이적 양 항-인간 온코스타틴 M 수용체 항혈청의 1ml의 전체 IgG 분획을 포함하는 복강내 주입액이 투여되었다. 항-SAP 시약에 대한 대조군으로서 사용된 이러한 항혈청은 표준 면역화학적 및 면역조직화학적 시험에 의한 인간 SAP와, 마우스 혈장과 또는 정상 마우스 조직과의 반응성을 나타내지 않았다. 복강내 주입 28일 후에, 모든 마우스는 최종적인 마취하에 출혈시킴으로써 치사시키고, 각각으로부터 간 및 비장을 제거하였다. 각각의 기관은 칭량하고, 이어서 세 부분으로 분할하고, 그중 하나를 또한 칭량하고, SAP의 추출에 사용하면서, 두 번째 부분은 고정 없이 후속 면역조직화학적 및 세포화학적 분석을 위해서 순간 동결시키고, 나머지 부분은 콩고 레드 염색에 의한 아밀로이드의 통상적인 조직연구 및 평가를 위해서 완충된 포르말린에 고정시켰다¹⁹. 모든 마우스를 아밀로이드증의 유도후에 그러나 ¹²⁵I-SAP의 투여 전에 그룹으로 할당시에 칭량하였다. 이들은 모두 실험의 마지막에 치사되기 전에 다시 칭량되었다. 모든 마우스를 4회 출혈시키는데: (1) 그룹 2 및 3이 CPHPC를 시작하기 직전에; (2) 그룹 2 및 3에서 IgG 제제를 주입하기 전날에; (3) IgG 주입 14일 후에; (4) 치사시에 출혈시켰다. 콩고 레드로 염색된 모든 동물의 비장과 간의 단편은 각각의 마우스에게 투여된 처리에 대해서 맹검으로 세 명의 상이한 전문 관찰자에 의해서 독립적으로 시험되고, 이전에 보고된 바와 같이 아밀로이드 존재의 양에 대해서 기록되었다. 10⁰-10⁴의 스코어는 특정의 기관의 수 개의 섹션중 1 또는 2의 아주 작은 아밀로이드증의 스펙에 상응하는 10⁰으로부터 약 10,000 배의 더 많은 아밀로이드를 포함하는 과도한 광범위 침착물에 상응하는 10⁴에 이르는 대략적인 log 기반 10 랭킹 규모(log base 10 ranking scale)를 나타낸다¹³. 상이한 관찰자의 스코어들 사이에 거의 100% 일치가 있었으며, 따라서, 가장 많은 경험의 관찰자의 스코어가 본 분석에 사용되었다. 혈청 및 기관의 기관 추출물중의 인간 SAP의 농도가 전기면역검정법에 의해서 측정되었다⁵.

원안의 시간표를 이하 요약한다:

날짜 과정

-41 모든 마우스에게 정맥내 AEF 주입

-36 내지 -31 모든 마우스에 매일 피하 카제인 주입

-29 내지 -24 모든 마우스에 매일 피하 카제인 주입

-20 모든 마우스 칭량

-17 모든 마우스를 위한 식수중 KI 시작

-14 모든 마우스에게 정맥내 ¹²⁵I-SAP 주입

-13 내지 -10

및 -7 각 날짜에 모든 마우스의 전체 신체 계수

-5 처리전 샘플을 위한 모든 마우스 출혈

-4 그룹 1 및 2에 대한 식수중의 CPHPC 1mg/ml 시작; 그룹 3은 비처리

-1 CPHPC후 항체전 처리 샘플을 위한 출혈

0 그룹 1의 양 IgG 항-인간 SAP 항체 주입

그룹 2의 대조 양 IgG 주입

그룹 3의 비처리

14 모든 마우스 출혈

23 모든 마우스 칭량

28 모든 마우스의 출혈 및 치사, 기관 수거

결과

체중 및 생존

그룹간의 체중은 그리 큰 차이가 없었다. 아밀로이드 유도후 및 트레이서 주입전의 -20 일에서의 그램으로 나타낸 평균(SD) 체중은 다음과 같다:

그룹 1, 28.0(2.7)

그룹 2, 27.7(3.2)

그룹 3, 27.3(3.1)

연구 마지막 직전의 23일째에서 그램으로 나타낸 평균(SD) 체중은 다음과 같다:

그룹 1, 28.5(2.8)

그룹 2, 28.4(3.6)

그룹 3, 27.8(3.3)

실험 처리 단계 동안 죽은 동물은 없었다. 일정한 체중과 결부시키면, CPHPC와 항-SAP 항체의 투여는 현저한 임상적 부작용이 없었음이 명백하다.

인간 SAP 값. 인간 SAP의 혈청 농도는 아밀로이드증의 유도 후에 및 어떠한 처리 전에 취한 첫 번째 출혈에서 모든 그룹이 동일하였으며, 이러한 혈통에서의 이전에 본 발명자들이 관찰한 바와 같이 웅성 마우스보다 자성 마우스에서 현저하게 더 높은 값을 나타냈다(표 1). 두 번째 출혈에서, CPHPC 처리 4일 후에 그룹 1 및 2에서 취하였으며, 항-SAP 항체 또는 대조 양 IgG의 투여 전에, 이전에 본 발명자들이 보고한 바와 같이 순환 인간 SAP의 90% 제거보다 더 높았다(표 1)^{16 ,17}. 인간 SAP 농도의 산정은 양 항-SAP 항체 또는 대조 IgG의 주입 14일 및 28일 후에 그룹 1 및 2 동물로부터의 혈청에서 불가능하였는데, 그 이유는 순환계에서의 이들 시약의 지속에 의해서 검정이 방해되기 때문이다. 다른 처리가 수행되지 않은 그룹 3에서, 인간 SAP 값은 14일째에 변화되지 않았지만, 가능하게는 아밀로이드증에 의한 간의 손상으로 인해서, 28일째에는 현저하게 낮았다(표 1).

실험의 마지막에 제거된 비장에 존재하는 인간 SAP의 양이 표 3에 기재되어 있다. 이들 마우스에서의 트랜스제닉 인간 SAP를 포함하는 SAP는 간에서 생성된다. 따라서, 실험의 마지막에서 간에서의 인간 SAP의 검정 결과에 대한 설명은, 이들이 존재하는 경우, 일부 SAP가 간내의 아밀로이드 침착물에 대한 순환 SAP의 결합에 기인한 것이 아니라 간세포에 의한 합성에 의해서 불가피하게 존재한다는 사실에 의해서 복잡하다. 또한, 자성 마우스는 웅성 마우스보다 인간 SAP의 일관되게 현저하게 더 높은 순환(표 1) 및 간 농도(표 3)를 지닌다. 그럼에도 불구하고, 상이한 그룹중의 간의 인간 SAP 함량은 명백한 인간 SAP 비장 함량 결과와 동일한 차수에 랭크되어 있다.

아밀로이드 부하. 전체 신체 아밀로이드 부하는 아밀로이드 유도 후에 및 상이한 처리를 시작하기 전에 세 그룹에서 동일하였다. ¹²⁵I-SAP 트레이서의 주입 72시간 후에, 방사성활성의 전체 신체 보유는 각각의 8 마리의 비-아밀로이드성 대조군에서 주입된 용량의 단지 10 내지 11%였다. 아밀로이드 마우스에서 평균(SD) 보유는 다음과 같았다:

그룹 1, 57.1%(21.6)

그룹 2, 44.0%(19.5)

그룹 3, 50.1%(21.5)

이들 차이는 현저하지 않았다. 일방 ANOVA에 의한 경우 P=0.054.

실험의 마지막 단계에서, 비장 및 간에서의 아밀로이드의 조직학적 검정은 그룹들 사이에 아주 현저한 차이를 나타냈다. 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis)의 비-파라메타 분산 분석에 의해서 P=0.0000. 그룹 1(CPHPC 및 항-SAP)에서는 다른 두 그룹에서 보다 아밀로이드가 극히 더 적었지만 그룹 2(CPHPC 단독)및 그룹 3(비처리 대조군) 사이에는 차이가 없었다(도 1 및 도 2). 그룹 1중의 31 마리의 마우스중에, 23 마리에서 아밀로이드가 검출되지 않았으며, 나머지 8 마리는 단지 이따금씩의 미세 스펙을 지녔다. 반면, 항-SAP를 투여하지 않은 두 대조군 중의 62 마리중에 아밀로이드를 전혀 지니지 않는 동물은 없었다. 이러한 차이는 피셔 추출물 시험(Fisher's exact test)에 의해서 아주 현저하였다. P<0.0001.

아밀로이드 존재 아밀로이드 부재

그룹1 : CPHPC + 항-SAP 8 23

그룹 2: CPHPC + 대조 IgG 30 0

그룹 3 : 비처리 32 0

62 마리의 대조 마우스중에, 단지 12마리가 미량 또는 소량의 아밀로이드를 나타냈으며, 모든 시험에서의 침착물은 중간정도이거나 심했다. 각각의 랭킹 스코어에 상응하는 아밀로이드에 대한 조직학적 염색이 도 3에 도시되어 있다.

조직학적 외견. 모든 비장 및 간 조직의 헤마톡실린(Haematoxylin) 및 에오신 염색된 섹션을 그룹 및 처리에 대해서 유니버시티 컬리지 런던(University College London)의 조직학 교수인 AP 딜런(AP Dhillon) 교수에 의해서 "맹검"으로 시험하였다. 그룹 2 및 3에 존재하고 그룹 1에 부재하는 아밀로이드 침착물과는 달리, 전부는 아니지만 많은 조직에서 만성 염증과 일치하는 적당한 변화가 있었으며, 이들은 그룹들 사이에 차이가 없었다.

검토

마우스를 최종 카제인 주입 60일 후에 및 항-SAP 항체에 의한 시험 그룹의 처리 20일 후에 이들의 아밀로이드 부하의 산정을 위해서 모두 치사시였다. 모든 마우스는 최종 카제인 주입 10일 후에 측정된 ¹²⁵I-SAP 보유에 의해서 입증되는 바와 같이, 항-SAP 또는 대조 처리 전에 실질적인 아밀로이드 침착물을 지녔다. 그룹들 사이의 현저한 차이는 없었으며, 예상된 바와 같이, 연구 마지막까지 몇몇의 대조 마우스에서는 아밀로이드 침착물의 어떠한 자발적 퇴행이 있었다. 그러나, 그룹 2 및 그룹 3중의 62 대조 동물중 아밀로이드가 전혀 없는 마우스는 1 마리도 없었다. 대조적으로, 항-SAP 항체뿐만 아니라 CPHPC가 투여된 31 마리의 마우스중 23 마리는 그들의 비장 또는 간에서 검출 가능한 아밀로이드가 없었다. 어떠한 항-SAP 처리된 동물에서 발견되는 유일한 아밀로이드 침착물은 항-SAP가 투여되지 않은 62 마이의 마우스중 50 마리에 존재하는 주요 침착물에 비해서 몇 차수의 크기로 적은 몇몇의 미세 스펙이었다. 항-SPA 처리가 그룹 1에서의 아밀로이드 침착물의 상당한 제거를 유도하였으며, 그 이유는 CPHPC와 비혈연 항혈청(그룹 2)으로부터의 대조 양 IgG 분획을 투여한 마우스가 전혀 처리되지 않은 그룹 3 대조군으로부터의 양적으로 식별할 수 없는 과도한 아밀로이드를 지니기 때문임이 명확하다.

콩고 레드 염색에 의한 조직화학적 분석으로부터의 결과는 비장 및 간의 인간 SAP 함량의 평가에 의해서 확인되었다. 그룹 1중의 31 마리의 마우스중 29 마리의 비장에서 검출 가능한 인간 SAP가 없었으며, 나머지 두 마리에서 단지 미량이 있었다. 그룹 3의 대조 동물은 이들의 심한 아밀로이드 부하에 상응하게 존재하는 실질적인 양의 인간 SAP를 지녔고, 그룹 2 마우스는, 동일한 아밀로이드 부하를 지님에도 불구하고, 약 1/4의 인간 SAP 함량을 지녔는데, 그 이유는 이들이 치사되기 전에 33일 동안 CPHPC가 연속적으로 투여되었기 때문이다. 인간 SAP 농도는 대조 그룹 3에 비해서 그룹 1 및 그룹 2 둘 모두에서 CPHPC가 투여된 모든 마우스의 혈청에서 >90%까지 감소되었다. 이러한 결과는 순환계로부터의 인간 SAP를 감소시키는 CPHPC의 능력을 입증하지만, 실질적인 양의 인간 SAP가 아밀로이드 침착물중에 유지되어 항-SAP 항체의 치료학적 효과를 위한 표적을 제공한다. 따라서, CPHPC 및 항-SAP 항체의 조합은 본 발명에 필수적이다: 소분자 약물은 인간 SAP의 혈장 및 혈관외 체액 구분들을 제거하여 후속적으로 투여된 항-SAP 항체가 아밀로이드 침착물중에 특이적으로 위치하는 SAP에 도달할 수 있고, 거기서 아밀로이드 원섬유의 퇴행 및 제거를 촉발시키는 그 결정적인 기능을 수행한다.

결론

CPHPC 및 항-SAP 항체를 사용한 확립된 전신 아밀로이드 침착물에 의한 개체의 조합 처리는 안전하고 효과적으로 침착물의 신속하고 기본적으로는 완전한 제거를 유발시킨다. 이는 어떠한 환자 또는 동물 모델에서 또는 어떠한 다른 방법에 의해서 이전에는 결코 달성되지 않았다. 본 발명은 후천적 및 유전적 전신 및 국소 아밀로이드증의 모든 형태에, 및 알쯔하이머 질환 및 인슐린 비의존형 당뇨병을 포함한 아밀로이드 침착과 연관된 다른 모든 질환에 적용 가능할 것이다.

실시예 2: CPHPC 및 항- SAP 항체를 사용한 전신 아밀로이드증을 지닌 환자의 치료

전신 아밀로이드증을 앓고 있는 환자가 아밀로이드증의 의심을 유도하는 임상 평가 및 통상의 조사에 이어진 감염된 조직의 생검에 대한 전문가에 의한 조직화학적 시험에 의한 특이적 확인에 의해서 진단된다. 방사성표지된 SAP 신티그래프(scintigraphy)가 로얄 프리 호스피탈(Royal Free Hospital)의 디파트먼트 오브 메디신 오브 유니버시티 컬리지 런던(Department of Medicine of University College London)에서의 아밀로이드증 및 급성상 단백질에 대한 센터의 UK NHS 내셔널 아밀로이도시스 센터(UK NHS National Amyloidosis Centre)에서 수행된다. 조직 시험은 특정 유형의 아밀로이드 존재를 확인시키고, 심장의 심장 초음파 시험(echo cardiographic examination)과 연결된 스캔은 아밀로이드가 존재하는 위치를 나타내고 그 범위를 정량한다. 기관 기능의 통상의 임상적 조사는 아밀로이드 침착물에 의해서 야기된 조직 및 기관 손상의 범위 및 중증도뿐만 아니라, 아밀로이드 침착을 유도할 수 있는 어떠한 기저 일차 질환의 존재 및 중증도를 확립시킨다.

통상적으로는, 그러한 환자의 치료에서의 두 필수적인 제 1 단계는 (1) 적절한 약물 요법을 포함한 모든 가능한 수단에 의한 기관 기능의 유지 및 필요한 경우 신장 투석을 포함한 기관 대체 및 기관 이식, 및 (2) 아밀로이드 원섬유를 형성시키는 과량의 전구체 단백질을 감소시키는 것이 가능할 수 있는 어떠한 요법의 수행으로 이루어진다. 후자의 경우는 달성하기가 아주 어렵고, 때로는 불가능하여, 기관 손상이 심각한 병적 상태인 기관 부전증으로 진행되고 일반적으로는 사망에 이르게 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 이러한 예에서, 환자는 아밀로이드 침착이 멈추도록 처리되고 기존의 고착된 아밀로이드 침착물을 조직으로부터 제거하여 임상적 이익을 유도한다.

환자는 100mg의 용량의 거환약으로 정맥내 주입에 의해서 투여된 SAP 제거 약물, 즉 CPHPC로 처리된다. 다음날 혈액 샘플이 취해진다. 이는 특이적 면역검정에 의해서 혈청중의 SAP 농도가 90%까지 감소됨을 확인시킨다. 이어서, 항-SAP 항체의 정맥내 주입이 개시되고, 수 시간에 걸쳐서, 신체 전체의 아밀로이드 침착물내의 SAP에 결합되기에 충분한 1000mg의 항체 용량이 투여된다. CPHPC는 다음 2주 동안 일일 2회 비경구 투여되어서 혈장 SAP 값이 억제된 상태로 유지되게 한다. 환자의 임상적 상태 및 기관 기능의 모든 특징이 일일 기준으로 면밀히 모니터링되고, 기관 기능에서의 개선이 항체 주입 수일 후에 검출된다. 치료 1개월 후에, CPHPC가 신체로부터 세척되고 항-SAP 항체가 이화되는 경우, 환자는 SAP 신티그래피에 주어져서 어떠한 잔류 아밀로이드 침착물의 존재 및 범위를 평가한다. 그 후에, 일일 2회 0.5mg/kg을 피하 주입하는 CPHPC 처리가 재개되어 가능한 한 적은 SAP가 조직내의 어떠한 잔류 아밀로이드에 재축적되게 한다. 이어서, SAP 신티그래피가 각각의 스캔 1주 전에 CPHPC를 중단하고 그 후 즉각적으로 재개하는 방식으로 월 3회 반복되어 아밀로이드의 계속된 퇴행을 모니터링한다. 환자가 아밀로이드 침착물이 없는 것으로 여겨진 후에, CPHPC 투여를 멈추지만, 모니터링은 어떠한 추가의 아밀로이드 침착을 검출하는 SAP 신티그래피에 의해서 계속된다. 환자는 관찰 동안 질환이 없는 것으로 유지되지만, 아밀로이드 침착이 재발하면 CPHPC와 항-SAP에 의한 치료가 아밀로이드의 제거 및 제거의 유지에 요구되는 대로 반복된다.

표 1. 혈청중의 인간 SAP 농도[평균( SD ) mg /l]

NI, 혈청중의 항-SAP 항체의 지속으로 인해서 설명 불가능; 미량, 혈청중의 양 IgG의 지속에 의한 방해로 인해서 정량화는 불가능하지만 아주 낮은 농도.

* 이전의 혈액에 비해서 현저하게 낮은 농도, ANOVA에 의한 경우 P=0.0047.

** 이전의 혈액에 비해서 현저하게 낮은 농도, ANOVA의한 경우 P=0.0131.

표 2. 실험의 마지막 단게에서 비장의 인간 SAP 함량(㎍/전체 기관)

SAP는 비장에서 발현되지 않으며, 세 그룹중 어느 그룹내에서의 비장 아밀로이드의 양 또는 인간 SAP의 양과 관련하여 웅성과 자성 사이에 차이가 없다. 따라서, 비장의 SAP 함량은 본 표에서 각각의 그룹 전체에 대해서 나타낸다. 그룹들 사이의 차이에 대한 통계학적 유의수준(맨 휘트니 시험(Mann Whitney test)): 그룹 1 대 그룹 2, P=0.0000; 그룹 1 대 그룹 3, P=0.0000; 그룹 2 대 그룹 3, P=0.0000.

표 3. 실험 마지막 단계에서 간의 인간 SAP 함량(㎍/전체 기관)

* 한 마리의 마우스로부터의 샘플은 검정에 이용될 수 없었다. 그룹들 사이의 차이에 대한 통계학적 유의수준(맨 휘트니 시험): 웅성 그룹 1 대 그룹 2 또는 그룹 3, P=0.000; 그룹 2 대 그룹 3, P=0.0337; 자성 그룹 1 대 그룹 2, P=O.0413; 그룹 1 대 그룹 3, P=0.0069; 그룹 2 대 그룹 3, P=0.0698.

실시예 3. 아밀로이드 제거에 대한 항- SAP 항체의 상이한 용량 효과

실험 원안 및 방법

정확하게는 상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 원안 및 시약을 이용하는 실험에서, 5 마리의 마우스 각각의 상이한 그룹에게 하기 용량의 실시예 1에서와 동일한 양 항-인간 SAP 항혈청의 IgG 분획을 투여하였다: 50 mg (실시예 1에서 동일한 용량); 10 mg; 2 mg; 0.4 mg; 비투여. 이들 용량에서의 항-SAP 항체의 양은 각각 7 mg, 1.4 mg, 0.28mg, 0.056 mg 및 0(zero)이였다.

결과

최대의 항-SAP 항체 용량이 투여된 2 그룹에서, 기본적으로는 비장 및 간의 모든 아밀로이드 침착물이 제거되었다. 다른 항체 처리된 그룹중 어느 그룹에서도 아밀로이드 침착물의 어떠한 감소가 없었으며, 항체가 투여되지 않은 대조 그룹과 차이가 없었다.

검토

실시예 1에 기재된 원안에서의 단일 용량으로 투여된 이러한 특정의 양 폴리클로날 항-SAP 항체의 최소 유효 용량은 0.28mg 보다 많았으며, 1.4mg의 용량이 최대 효능을 나타냈다.

상기 실시예를 이용하면, 본 기술분야의 전문가라면 두 종 사이의 제거 및 대사에서의 공지된 차이를 고려하여 인간에 대한 투여를 위한 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다.

실시예 4. 항- SAP 항체에 의한 아밀로이드 제거의 시간표, 메카니즘 및 임상적 효과.

실험 원안 및 방법

정확하게는 상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 원안 및 시약을 사용하는 실험에서, 5 마리의 마우스 각각의 상이한 그룹에게 7mg의 항-SAP 항체를 함유한 50mg 용량의 IgG 분획을 포함한, 그 실험에서와 동일한 처리를 수행하고, 이어서, 항체 투여 후 각각 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21 및 25일째에 치사시켰다. 각 그룹의 마우스가 치사된 시점에서의 각 동물로부터 얻은 혈장 샘플을 실험의 마지막 단계에서 단일 배치(batch)로 생화학 분석 전에 동결시켜 저장하였다. 비장 및 간을 치사시에 각각의 마우스로부터 제거하고, 정확히 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석을 위해서 처리하였다. 아밀로이드 침착의 범위를 측정하기 위한 콩고 레드 염색에 추가로, 헤마톡실린 및 에오신에 의해 표준 방식으로 염색된 고정된 조직 섹션을 조직병리학적 검정을 위해서 시험하고, 적합하게 가공된 조직을 공인된 통상의 이용 가능한 시약 및 방법을 이용하는 관련 단백질 및 세포 마커를 위한 면역조직화학 및 면역세포화학 염색에 의해서 분석하였다. 일부 조직은 또한 표준 투과전자현미경(transmission electron microscopy)에 의해서 시험되었다. 모든 시험, 슬라이드의 해독 및 기록은 샘플의 근본에 대해서는 모르는 전문 관찰자에 의해서 수행되었다. 대조 조직은 전신 AA 아밀로이드증의 동일한 유도가 정확하게 수행되었지만 항-SAP 항체 없이 대조 양 IgG가 투여된 마우스에 의해서 제공되었다.

결과

최초의 시점에서, 항-SAP 항체의 주입 24 시간 후에, 일부 과립구를 지닌 대식 세포로서 우세하게 헤마톡실린과 에오신 염색에 의해서 확인되는, 염증성 세포에 의한 아밀로이드 침착물의 방대한 침윤이 이미 있었다(도 4). 이러한 외관은 항체가 투여되지 않은 대조 마우스에서의 전형적인 비세포 아밀로이드 침착물과 현저한 대조를 이뤘다. 1 일째 조직의 전자 현미경 사진은 아밀로이드 침착물을 지니는 대식세포 및 과립구의 상세한 확대를 나타냈다(도 5). 다음 몇 일에 걸쳐서, 지속된 아밀로이드 침착물의 세포 침윤은 압도적으로 단핵이 되었으며, 점진적으로 단편화되고 감소되는 덩어리(clump)를 둘러싸고 명백하게 식작용하는 증가된 수의 다핵 자이언트 세포를 함유하였다(도 4). 세포 침윤 및 아밀로이드의 양은 7 내지 10일까지 현저하게 감소되었으며, 15일까지 아밀로이드 침착물 및 침윤 세포가 거의 사라졌다. 21 및 25일에서의 조직학적 외관은 정상의 비아밀로이드증 조직으로부터 거의 구분이 불가능하였다.

F4/80, 즉, 전신 대식세포 마커에 대한 항체의 면역조직화학적 염색은 이들을 아밀로이드 침착물의 과도한 조기 세포 침습의 우세한 성분으로서 확인시켰다(도 6). 항-SAP 항체가 투여되지 않은 대조 마우스의 아밀로이드 침착물에서의 F4/80에 대한 염색은 거의 없을 뿐만 아니라, 아밀로이드 침착물중 및 그 주위에서가 아닌 항-SAP 처리된 마우스의 조직에서의 F4/80에 대한 증가된 염색이 없었다. 4일까지, 면역과산화효소(immunoperoxidase) 조직화학 및 공초점 현미경 둘 모두에 의해서 나타나는 바와 같이, 아밀로이드 침착물중에 및 그 둘레에 있는 모든 세포에서, CD68, 즉, 대식세포에 의한 식균활성의 마커에 대한 강한 염색이 있었다(도 6). 아밀로이드의 단편화된 잔류물은 이어서 항-인간 SAP, 항-양 IgG 및 항-마우스 C3 항체에 의해서 염색과 함께 공동-편재된 마우스 AA에 대한 항체로 염색된 대식세포 및 자이언트 세포에 의해서 대부분 둘러싸이거나 내재화된다(도 6). C3는 가장 풍부한 보체 성분이며, 보체계의 중요한 화학주성 및 옵소닌 활성에 대한 원인이다.

나트륨, 칼륨, 클로라이드, 우레아, 크레아티닌, 칼슘, 포스페이트, 알칼리성 포스페이트, 알라닌, 트랜스아미나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제, 총 단백질, 알부민, 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 글루코오스, 총 빌리루빈, 크레아틴 키나아제, 락테이트 데하이드로게나제를 포함한 시험된 혈장 분석물중의 어느 분석물에서의 그룹들 사이의 상당한 비정상성뿐만 아니라 어떠한 상당한 차이가 없었다.

검토

순환 SAP가 CPHPC에 의해서 제거된 아밀로이드증 마우스에 대한 항-SAP 항체의 투여는 아밀로이드 침착물의 아주 신속하고 강한 주요 대식세포 침윤을 유도하였다. 다수의 이들 세포는 신속하게 융합되어 아밀로이드 섬을 둘러싸고 식장용하는 다핵 자이언트 세포를 형성시키며, 이는 신속하고 거의 완벽한 침착물의 제거를 유도하였다. 항체 투여 15일 후에, 아밀로이드는 실질적으로 사라졌으며, 조직의 세포 집단은 신속하게 정상으로 회복되었다. 처리에 대한 임상적으로 명백한 부작용이 없었으며, 각 그룹내의 모든 마우스로부터 치사시에 취한 혈장 샘플은 신장 또는 간 기능, 혈장 지질, 총 단백질 또는 알부민의 교란, 또는 근육 손상의 생화학적 증거가 없었다. 따라서, 기본적으로는, 이들 동물에서의 실질적인 내장 아밀로이드 침착물의 완벽한 제거가 임상적으로 사일런트(silent)였으며 해롭지 않았다.

아밀로이드 침착물을 지속적으로 침습하는 우세한 세포 유형이 대식세포로서 헤마톡실린과 에오신 염색에 의해서 확인되었으며, 이는 전자 현미경, 및 아밀로이드의 식균 작용 및 파괴에서의 이들의 활성 역할인 면역 세포화학에 의해서 확인되었다. 대식세포 내 및 그에 의해서 둘러싸인 AA 아밀로이드 침착물 상의 인간 SAP, 양 IgG 및 마우스 C3의 존재는 다음 메카니즘과 일치한다. 항-인간 SAP 항체는 아밀로이드 침착물과 연관된 인간 SAP에 결합되고 보체를 활성화시켜서 효능적 화학주성 유인물질, C3a 및 C5a를 생성시킨다. 식균 세포, 대부분 대식세포는 이어서 아밀로이드 침착물을 둘러싸고 침윤하고, 보체 및 IgG 항체에 의해서 옵소닌화된 아밀로이드를 능동적으로 분해하고, 대식세포 매개된 분해는 침착물을 신속하게 제거한다.

실시예 5. 항- SAP 항체의 사용을 위한 단순화된 원안의 확인.

실시예 1에 상세히 기재된 표준원안은 마우스 SAP 유전자가 결실되고 인간 SAP 트랜스젠이 삽입되어 인간 SAP의 발현을 제공하는 마우스를 사용한다. 또한 이는 항-SAP 항체의 투여 직전부터 시작하여 나머지 실험 전체에 걸쳐서 계속되는 식수중의 CPHPC의 투여를 이용하였다. CPHPC에 의한 그러한 연장된 처리에 대한 필요를 시험하기 위해서, 단일 용량의 비경구 CPHPC가 이전의 실시예에서와 같은 마우스 SAP 녹아웃이 아닌 야생형 배경에 대해 인간 SAP 트랜스제닉인 마우스에서 이용되었다. SAP에 대한 비혈연의 유전 변화를 지니는 마우스에서의 연구에 중요한 또 다른 방법에서, 아밀로이드증의 야생형 비-트랜스제닉 마우스는 단리된 순수한 인간 SAP의 단일 비경구 주입에 의한 인간 SAP로 "부하된(loaded)" 이들의 아밀로이드 침착물을 지녔다.

실험 원안 및 방법

AA 아밀로이드증을 유도하고 상기 실시예 1에서와 같이 정밀하게 야생형 배경에 대한 인간 SAP 트랜스제닉 마우스에서 확인하였다. 이어서, 이들 마우스에게 1mg의 CPHPC의 단일 복강내 주입을 수행한 다음, 시험 그룹(n=10)에서 5 시간 후에 이전의 모든 실시예에서 사용된 바와 동일한 양 항-인간 SAP 혈청의 25mg의 IgG 분획을 복강내 주입하였다. 대조 마우스(n=8)에게는 항-SAP 활성 없는 양 IgG를 주입하였다. 16일 후에, 모든 마우스를 콩고 레드 염색에 의한 아밀로이드 부하의 평가를 위해서 치사시켰다.

후속해서, AA 아밀로이드증이 유도되고 실시예 1에 기재된 바와 같이 정확하게 확인된 15 마리의 야생형 마우스에게 단리된 순수한 인간 SAP의 마우스당 10mg의 단일 복강내 주입에 의해서 인간 SAP를 부하시켰다. 아밀로이드증 마우스 내로 주입된 인간 SAP는 아밀로이드 침착물에 편재되고, 거기에서 약 3 내지 4일의 반감기로 유지되면서(도 7), 아밀로이드에 결합되지 않은 어떠한 인간 SAP는 약 3 내지 4 시간의 반감기로 순환계로부터 제거된다^{16 ,18}.

인간 SAP 주입 3일 후에, 인간 SAP가 순환계에서 더 이상 검출 가능하지 않은 경우, 각각의 마우스에게 양 항-SAP 항혈청의 50mg의 IgG 분획의 단일 복강내 주입을 수행하고, 모든 마우스를 그 후 15일 후에 콩고 레드 염색에 의한 아밀로이드 부하의 평가를 위해서 치사시켰다.

결과

야생형 배경에 대한 인간 SAP 트랜스제닉 마우스에서의 아밀로이드 침착물은 인간 SAP 트랜스제닉 마우스 녹아웃 마우스에서의 모든 이전 실험에서 보여지는 바와 같이 효과적으로 항-SAP 항체의 단일 용량에 의해서 제거되었다.

유사하게, 수동적으로 투여된 인간 SAP를 지니는 야생형 마우스에서의 마우스 AA 아밀로이드 침착물의 부하 후에, 항-SAP 항체의 투여는 앞서 나타낸 바와 동일한 상당한 제거를 유도하였다.

검토

이들 결과는 아밀로이드 침착물상의 인간 SAP의 존재 및 순환계내의 상당한 농도의 인간 SAP의 부재가 본 발명에 따른 항-SAP 항체의 치료 효능에 충분함을 입증하고 있다. 이러한 충분한 상태는 대부분 초기에 인간 SAP 트랜스제닉 동물에서의 CPHPC의 단일 비경구 용량을 사용함으로써 또는 이의 단일 비경구 주입을 통해 인간 SAP를 지닌 야생형 마우스에 아밀로이드 침착물을 부하시킴으로써 달성되었다. 후자의 모델이 아주 유용한데, 그 이유는 그러한 모델이 연장된 상호 교배를 필요로 하지 않으면서 유전적으로 변화된 마우스(참조: 이하 실시예 6)에서의 항-SAP 항체의 작용 메커니즘을 분석하는 것을 가능하게 하기 때문이다.

중요하게는, CPHPC는 항상 일일 50 내지 100mg의 SAP를 연속적으로 생성시키며⁶ 항-SAP 항체를 투여하기 전에 혈장 SAP를 감소시키는 것이 절대적으로 필요한 인간 대상자에 필수적이다.

실시예 6. 항- SAP 항체에 의한 아밀로이드 제거의 보체 의존성.

항-SAP 항체에 의한 아밀로이드 제거에 대한 보체 역할이 보체 결핍 야생형 동물 및 정상의 보체 충분한 야생형 동물의 마우스 사이의 처리에 대한 효능을 비교함으로써 조사되었다. C1q를 위한 유전자의 표적된 결실은 항체-항원 복합체에 대한 C1q의 결합에 의해서 개시되는 통상의 보체 경로의 활성화를 차단하지만, 보체의 주요 생물학적 기능인 화학주성 및 옵소닌화에 책임이 있는 C3 활성화는 대안적인 레시틴 경로를 통해서 뿐만 아니라, 비-보체 세린 단백질분해효소에 의한 직접적인 C3 분해에 의해서 여전히 진행될 수 있다. C3에 대한 유전자의 표적된 결실은 이들 기능을 저지한다.

실험 원안 및 방법

AA 아밀로이드증은, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 정확하게, 보체 결핍 마우스의 두 그룹: C3 녹아웃(n=14) 및 C1q 녹아웃(n=12)에서 유도되고 확인되었다. 이어서, 모든 마우스에게 인간 SAP를 부하하고, 각각의 그룹에서 두 마리를 제외한 모든 마우스를, 15일째에 치사킨 후에 아밀로이드 부하를 평가하기 전에, 실시예 5에 기재된 바와 같이 항-SAP로 처리하였다.

결과

항-SAP로 앞서 처리되고 실시예 1 내지 5에 기재된 모든 보체 충분한 마우스에서의 아밀로이드 침착물의 효과적인 제거와는 현저하게 대조적으로, 보체 결핍 동물의 두 그룹 모두에 존재하는 풍부한 아밀로이드가 여전히 존재하였는데, 그러한 아밀로이드는 각각의 유형의 두 보체 결핍 대조 마우스에서 보다 더 단편화된 외관을 지니는 경향이 있었다. 비장 아밀로이드 스코어는 C3 결핍 마우스(중간값 10³, 범위 10² 내지 10⁴)에서 보다 C1q 결핍 마우스(중간값 10⁴, 범위 10² 내지 10⁴)에서 약간 더 높았지만, 이는 통계적 유의수준에는 도달하지 않았다.

검토

C1q 또는 C3가 결여된 마우스에서, 항-SAP 처리는 아밀로이드 침착물을 제거하지 못하였다. 따라서, 항-SAP의 치료학적 효능은 아주 실질적으로 보체 의존성이며, 이들은 Fc(γ) 수용페를 통해서 식균 세포와 이론상 결합할 수 있는 IgG 항체 단독에 의해서 매개되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 보체 결핍 마우스에서의 지속적인 아밀로이드 침착물의 더욱 단편화된 외관은 항체 단독에 의한 적어도 약간의 효과를 제시하였다. 또한, C3 결핍 동물에 비한 C1q 결핍 동물에서의 더욱 많은 제거에 대한 경향은, C3 활성화가 중요하며, C1q의 부재하에 및 IgG 항체에 의해서 전형적으로 활성화되는 통상의 경로에서 일부 보체 활성화가 수행될 수 있음을 제시하였다.

실시예 7. 전체 IgG 항- SAp 항체에 대한 요건.

IgG 항체에 의한 보체 활성화는 Fc 영역을 포함한 전체의 온전한 분자를 필요로 하며, C1q의 결합에 의해서 개시되는 통상의 경로를 통해서 진행된다. 일부 항체-항원 시스템에서, 대안적인 경로를 통한 덜 효율적인 보체 활성화가 F(ab)₂에 의해서 매개될 수 있다. 항-SAP 항체에 의한 아밀로이드 제거의 보체 의존성을 확인하기 위해서 및 항체의 Fc 영역에 대한 잠재적 요건을 조사하기 위해서, F(ab)₂ 항-SAP 항체의 효과가 시험되었다.

원안 및 방법

AA 아밀로이드증은 상기 실시예 1에 상세된 바와 같이 정확하게 야생형 C57BL/6 마우스에서 유도되고 확인되었다. 실시예 5에 상세된 바와 같이 인간 SAP를 지닌 아밀로이드 침착물을 부하시킨 후에, 동물 그룹들을 양 폴리클로날 항-인간 SAP 항혈청(n=8)의 전체 IgG 분획, 완충액 비히클 단독(n=10) 또는 pH4.0의 펩신 소화에 의해서 생성된 IgG 분획의 F(ab)₂ 단편(n=5)으로 처리하였다. 주입된 항-SAP 항체 활성의 용량은 F(ab)₂가 투여된 마우스당 7.28mg 및 전체 IgG가 투여된 마우스당 7mg(통상적으로 50mg의 전체 IgG)이었다. 모든 마우스를 14일 후에 콩고 레드 염색에 의한 아밀로이드 부하의 평가를 위해서 치사시켰다.

결과

아밀로이드 침작물의 제거는 IgG 항-SAP 항체가 투여된 마우스에서 거의 완벽하였으며, 그러한 마우스는, 10⁵(10⁴ 내지 10⁵)의 중간(범위) 비장 아밀로이드 스코어를 지닌 대조 마우스에서의 과도한 아밀로이드 침착물에 비해서, 10⁰(10⁰ 내지 10³)의 중간(범위) 비장 아밀로이드 스코어를 지녔다. F(ab)₂가 투여된 마우스는 비처리된 대조군에 비해서 더 적은 아밀로이드, 중간 스코어 10², 범위 10⁰ 내지 10⁴를 지녔지만, 전체 IgG 항-SAP 항체로 처리된 마우스보다 여전히 실질적으로 더 높았다.

검토

본 연구에서 사용된 F(ab)₂ 항-SAP 항체의 몰 용량은, 전체 IgG에 비한 F(ab)₂ 단편의 더 작은 분자량을 고려하여, IgG 항체의 용량에 비해서 약 1/3 더 많은 용량이었다. 그러나, 아밀로이드 제거에 대한 효과는 실절적으로 덜하여, 항-SAP 항체의 주요 작용은 Fc 영역을 필요로 함을 입증하고 있다. 이는 Fc(γ) 수용체의 세포 인식의 직접적인 관여 때문이 아닌데, 그 이유는 전체 IgG가 또한 보체 충분한 마우스에서의 F(ab)₂인 경우 보다 보체 결핍 동물에서 덜 효과적이기 때문이다. 사용된 F(ab)₂의 높은 용량은 대안적인 경로를 통해 일부 보체를 활성화시킬 수 있는 듯하다.

실시예 8. 대식세포의 요건.

본 실시예에 기재된 조직학적 및 조직화학적 연구는 항-SAP 항체로 처리된 마우스에서 아밀로이드 침착물에 침윤되고, 그러한 침착물을 둘러싸며 식작용하는 세포는 대식세포임을 나타내고 있다. 이들이 사실 아밀로이드의 제거에 원인이 됨을 확인하기 위해서, 리포좀 클로드로네이트(liposomal clodronate)의 투여에 의해서 모든 대식세포 활성이 억제된 마우스에서 항-SAP 처리에 대한 효과를 시험하였다. 리포좀 클로드로네이트의 대식세포 작용에 대한 시약, 실험 원안 및 효과는 잘 확립되어 있으며 문헌화되어 있다²².

원안 및 방법

상기된 실시예 1에 상세된 원안을 정확하게 이용하여 야생형 마우스에서의 AA 아밀로이드증의 유도 및 확인 후에, 모든 동물에게 10mg의 단리된 순수한 인간 SAP의 단일 복강내 용량을 투여하여 인간 SAP를 지닌 이들의 아밀로이드 침착물을 부하시켰다. 이어서, 시험 그룹(n=13)에게 0.3ml의 리포좀 클로드로네이트를 복강내 즉각적으로 및 그 후 2, 7 및 14일째에 투여하였다. 한 대조 그룹(n=12)과 시험 그룹에게 인간 SAP 주입 3일 후에 50mg의 양 항-인간 SAP 혈청의 IgG 분획의 단일 복강내 용량을 투여하였다. 제 2 대조 그룹(n=12)에게는 항-SAP 및 그 밖의 추가의 처리를 수행하지 않았다. 모든 마우스를 시험 및 항체 대조 그룹에 대한 항-SAP의 투여 14일 후에 콩고 레드 염색에 의한 아밀로이드 부하를 평가하기 위해서 치사시켰다.

결과

항-SAP에 의한 처리는 항체가 투여되지 않은 그룹에 비해서 거의 완벽한 아밀로이드 침착물 제거를 유도하였으며, 중간(범위) 비장 아밀로이드 스코어는 각각 10⁰(0 내지 10³) 및 10³(10³ 내지 10⁴)이었다. 대식세포 기능이 완전히 제거된 것으로 공지된 요법에서 리포좀 클로드로네이트가 투여된 마우스에서, 아밀로이드 침착물의 제거는 없었으며, 아밀로이드 부하 스코어는 10⁵(10² 내지 10⁵)이었다.

검토

본 실험에서의 결과는 대식세포 기능이 항-인간 SAP 항체에 의한 아밀로이드 침착물의 제거에 필수적임을 확인시키고 있다.

실시예 3 내지 실시예 8로부터의 결론

항-SAP 항체의 투여는, CPHPC에 의한 인간 SAP 트랜스제닉 마우스의 처리를 통해서 또는 야생형 마우스에 대한 인간 SAP의 수동적 투여 후의 자연적 제거에 의해서, 인간 SAP가 아밀로이드 침착물에 존재하지만 순환계에는 부재하는 AA 아밀로이드증 마우스에서의 내장 아밀로이드 침착물의 신속하고 거의 완벽한 제거를 아주 재현가능하게 유발시킨다.

임상적 또는 생화학적 부작용이 없다.

항-SAP 항체의 주입은 대식세포에 의한 아밀로이드 침착물의 강한 침윤이 신속하게 유도되며, 그러한 대식세포는 아밀로이드를 둘러싸고 식작용하고, 많은 다핵 자이언트 세포를 형성하며, 침착물을 파괴한다.

아밀로이드 분해는 15일 이내에 완료되며, 단일 용량의 항-SAP 항체 투여 21 내지 25일에 조직이 정상으로 회복된다.

아밀로이드 제거는 온전한 보체계를 필요로 하며, 대식세포에 절대적으로 의존한다.

참고문헌

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따라서, 본 발명의 상세하기 기재된 바람직한 구체예를 참조하면, 상기 명세서에 정의된 발명이 상기된 설명에 기재된 특정의 상세사항으로 한정되는 것이 아니며, 이의 많은 자명한 변화가 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 가능함이 이해될 것이다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 본 기술분야의 전문가에게는 자명할 것이다. 발명이 특정의 바람직한 구체예와 관련하여 기재되고 있지만, 청구된 발명은 그러한 특정의 구체예로 과도하게 제한되지 않음을 이해해야 한다. 사실, 약제학 및 분자 생물학 또는 이와 관련된 분야의 전문가에게는 자명한 본 발명을 수행하는 기재된 방법에 대한 다양한 변화는 하기 특허청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (25)

1. 항-인간 혈청 아밀로이드 P 항체와 함께, (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 모노- 또는 디-에스테르를 포함하는 아밀로이드 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, β-D 갈락토피라노스의 4,6-피루베이트 아세틸, 칼슘, IL-4 및 IL-3 중 하나 이상을 포함하지 않는 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 항-인간 혈청 아밀로이드 P 항체가 단구로부터의 섬유세포 형성을 억제하는데에 있어 작용성인 SAP의 일부를 표적하지 않는 약제학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 아밀로이드 질환이 전신 아밀로이드증(systemic amyloidosis), 국소 아밀로이드증, 아밀로이드 침착과 연관된 질환, 알쯔하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 인슐린 비의존형 당뇨병(type 2 diabete)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
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7. 항-인간 혈청 아밀로이드 P 항체와 함께, (R)-1-[6-[(R)-2-카르복시-피롤리딘-1-일]-6-옥소-헥사노일]피롤리딘-2-카르복실산(CPHPC) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 모노- 또는 디-에스테르를 포함하는 아밀로이드 질환의 치료에 사용하기 위한 키트.
   
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