ES2582389T3 - Combinaciones de agentes que disminuyen SAP y anticuerpos antiSAP - Google Patents

Abstract

Una D-prolina de la fórmula:**Fórmula** donde R es**Fórmula** y el grupo R1 es hidrógeno o halógeno; X-Y-X' es un enlace opcionalmente sustituido que tiene de 4-20 átomos de carbono de cadena lineal o recta, donde X es (CH2)n; -CH(R2)(CH2)n-; CH2O(CH2)n-; CH2NH-; bencil, -C(R2)>=CH-; CH2CH(OH)-; o tiazol-2,5-diil; Y es -S-S-; -(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-; -CH>=CH-; -NHC(O)NH-; -N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]-; - N(CH2C6H5)-; -N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; N(alcoxialquil)-; N(cicloalquil-metil)-; 2,6-piridil; 2,5-furanil; 2,5- tienil; 1,2-ciclohexil; 1,3-ciclohexil; 1,4-ciclohexil; 1,2-naftil; 1,4-naftil; 1,5-naftil; 1,6-naftil; bifenilen; o 1,2- fenilen, 1,3-fenilen y 1,4-fenilen, donde los grupos fenilen opcionalmente se sustituyen por sustituyentes 1- 4, seleccionados de halógenos, alquilo más corto, alcoxi más corto, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo más corto, nitrilo, 5-tetrazol, (ácido 2-carboxílico pirrolidin-1-il)-2-oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodil, 5-oxo-[1,2,4- oxadiazolil, 2-oxo[1,2,3,5]oxatiadiazolil, 5-tioxo[1,2,4]oxodiazolil y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxodiazolil; y X' es -(CH2)n-; -(CH2)nCH(R2)-; -(CH2)nOCH2-; -NHCH2-; benzil, -CH>=C(R2)-; CH(OH)CH2; o tiazol-2,5-diil; R2 es alquilo inferior, alcoxi inferior o bencilo y n es 0-3, o una sal o su mono o diéster farmaceúticamente aceptable, que disminuye el componente amiloide P del suero de la circulación y un anticuerpo específico para el componente amiloide P del suero, para simultáneamente, simultáneamente por separado o secuencialmente usar en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad amiloide.

Description

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Figura 6. Identificación inmunoquímica de células y proteínas en anticuerpo antiSAP con liberación de depósitos de amiloide AA. Los dos paneles superiores muestran infiltración macrófaga intensa, identificada por tinción fuerte con anti-F4/80, en todos los depósitos de amiloide congofílicos en bazo e hígado. Tal tinción está completamente ausente en depósitos de amiloide de ratones no tratados con anticuerpo antiSAP (no se muestra). El tercer panel muestra la colocalización de amiloide AA, CD68 (un marcador de actividad fagocita endocitócica), y ratón C3. El panel inferior muestra macrófagos fagocitamente activos que rodean y envuelven un fragmento de amiloide AA de ratón. Figura 6A es el día 1 de bazo con rojo Congo, izquierda; anti-F4/80, derecha; Figura 6B es el día 1 de hígado con rojo Congo, izquierda; anti-F4/80, derecha; Figura 6C es el día 4 de bazo con proteína anti AA, izquierda; anti-CD68, centro; anti-ratón C3, derecha; Figura 6D es imagen confocal del día 4 con anti-CD68, rojo; proteína antiAA, verde; contrateñido nuclear, azul.

Figura 7. Tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti SAP humano en bazo de un ratón de tipo salvaje amiloidótico después de inyección de SAP humano puro aislado.

Hay una tinción fuertemente positiva de todos los depósitos de amiloide en su distribución de zona marginal típica. Ente enlace de SAP humano es el objetivo del anticuerpo antiSAP terapéutico de la presente invención.

Descripción detallada de la invención.

Amiloidosis.

Aspectos de la presente invención se refieren al tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por deposición de amiloide en los tejidos, tal enfermedad es conocida como amiloidosis.

Los términos “profilaxis”, “prevención”, “prevenir”, “que previene”, “supresión”, “suprimir” y “que suprime” como se usan en la presente memoria se refieren al transcurso de una acción (tal como administrar uno o más compuestos o composiciones farmacéuticas) iniciadas (p. ej. antes del comienzo de un síntoma clínico de amiloidosis) de modo que prevenga, suprima o reduzca, o bien temporalmente o permanentemente, el comienzo de una manifestación clínica de amiloidosis.

Los términos “tratamiento”, “tratar” y “que trata” como se usan en la presente memoria se refieren al transcurso de una acción (tal como administrar uno o más compuestos o composiciones farmacéuticas) iniciadas después del comienzo de manifestaciones clínicas de amiloidosis de modo que se elimine o reduzca, o bien temporalmente o permanentemente, una manifestación clínica o evolución de amiloidosis.

La amiloidosis es cualquier enfermedad caracterizada por la acumulación extracelular de amiloide en varios órganos y tejidos del cuerpo.

El término “amiloide” se refiere a depósitos extracelulares en los tejidos de fibras de proteína insoluble compuestas por fibrillas con morfología ultraestructural característica, una estructura de núcleo β-cruzado y la propiedad de tinción histoquímica patognomónica de fijarse al tinte rojo Congo de disolución alcohólica alcalina y después dar dicroísmo rojo-verde cuando se ve con microscopio en luz polarizada cruzada fuerte. Se sabe que aproximadamente 25 proteínas diferentes no relacionadas forman fibrillas amiloides que se depositan en tejidos humanos y comparten todas esas propiedades típicas. Los depósitos de amiloide en la materia del cerebro, amiloide cerebral, difieren de alguna manera de los depósitos de amiloide de otras partes del cuerpo en que siempre son de tamaño focal y microscópico, y comúnmente se nombran como placas de amiloide.

Amiloidosis, que es una enfermedad causada directamente por deposición de amiloide en los tejidos, comprende tanto amiloidosis local, en la que los depósitos se confinan en una región anatómica y/o un tejido o sistema de órgano, como amiloidosis sistémica en la que los depósitos se pueden dar en cualquier órgano o tejido en el cuerpo, que incluye vasos sanguíneos y tejidos conectivos. La causa de amiloidosis o bien se puede adquirir o heredar. La amiloidosis adquirida aparece como una complicación de un estado médico presente, que puede en sí mismo ser adquirido o heredado. Por tanto amiloidosis sistémica reactiva, conocida como tipo proteína (AA) amiloidea A es una complicación de enfermedades inflamatorias activas crónicas tales como artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Crohn, infecciones crónicas y sepsis crónicas, y síndromes de fiebre periódica hereditaria tales como fiebre mediterránea familiar, síndrome de Muckle-Wells y síndrome CINCA. Amiloidosis relacionada con diálisis está causada por acumulación de β2-microglobulina como resultado de fallo renal terminal. Amiloidosis de cadena ligera (AL) de inmunoglobulina monoclonal es una complicación de mieloma múltiple o si no gammapatía monoclonal benigna (gammapatía monoclonal de significado incierto, MGUS). Amiloidosis adquirida de tipo transtiretina se puede dar sin una enfermedad precedente y simplemente es una complicación de edad madura. Amiloidosis hereditaria se causa por mutaciones en los genes por diversas proteínas que codifican la expresión de proteínas variables que tienen un incremento de propensión a formar fibrillas amiloides, y que incluye enfermedades causadas por transtiretina, apoliproteína AI, gelsolina, lisozima, cistatina C y β-proteína amiloide. En libros de texto y literatura científica1, 8, 21 están disponibles descripciones completas de todas las formas diferentes de amiloidosis y las proteínas implicadas.

La deposición local de amiloide, confinada a un órgano o tejido, puede ser clínicamente silente o puede causar graves daños a tejidos y enfermedad. Por ejemplo, angiopatía amiloide cerebral en la que los depósitos de amiloide

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vascular están compuestos de proteína Aβ, normalmente es un estado adquirido esporádico que aparece por razones que no se entienden en ausencia de cualquier otra patología, y es una causa mayor de hemorragia y derrame cerebral. Hay muchas enfermedades muy importantes y comunes, particularmente enfermedad de Alzheimer y diabetes tipo 2, en las que los depósitos de amiloide están siempre presentes pero en los que aún no se conocen los mecanismos precisos que respectivamente causan esas enfermedades. Aun así la deposición local de amiloide en el cerebro y vasos sanguíneos cerebrales en la enfermedad de Alzheimer, y en las islas pancreáticas en diabetes es muy probable que empeoren la patología y enfermedad. Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere al tratamiento tanto de la enfermedad de Alzheimer como de diabetes tipo 2, en realidad a cualquier estado asociado con la presencia de depósitos de amiloide en los tejidos.

Muchas formas de encefalopatía espongiforme transmisible (enfermedades priónicas) están asociadas a depósitos de amiloide en el cerebro, y por lo tanto la presente invención se refiere a todos estos estados, que incluyen la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en sí misma, kuru y varias otras formas de enfermedad priónica humana, y también encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad debilitante crónica de mulo-ciervo y alce, y encefalopatía transmisible de visón.

Se contempla el tratamiento de animales, que incluye aves tales como pollo, patos, pavos y gansos, y, preferentemente, mamíferos, que incluyen humanos, así como perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cerdos de guinea, ratones y ratas. En particular, el tratamiento de humanos es preferente.

En consecuencia, en un aspecto, se proporciona un compuesto que disminuye SAP en combinación con un anticuerpo específico para SAP para usar en el tratamiento de amiloidosis.

Anticuerpo antiSAP.

Las referencias en la presente memoria a anticuerpos antiSAP, anticuerpos que fijan SAP y anticuerpos específicos para SAP son coincidentes y se refieren a anticuerpos, o fragmentos que se fijan que derivan de anticuerpos, que se fijan a SAP de una manera específica y significativamente no hacen reacción cruzada con otras moléculas presentes en la circulación. En particular, los anticuerpos según la presente invención se dirigen a SAP que está unido a fibrillas amiloideas en los depósitos de amiloide de tejidos.

SAP es un pentámero con 5 promotores idénticos asociados de forma no covalente que cada uno tiene un lugar de fijación dependiente de calcio para ligandos sobre una cara de un plano, la cara de fijación (B), de la molécula. En ausencia de calcio, SAP humano forma dímeros decaméricos estables, probablemente vía interacciones cara-A a cara-A. En presencia de calcio, SAP humano aislado rápidamente se agrega y precipita, como resultado de formación molecular cristalina debido a la fijación al carboxilato expuesto del resto Glu167 sobre una molécula SAP por el lugar de fijación dependiente de calcio para ligandos de otra molécula SAP. Esta autoagregación de SAP se inhibe por otros ligandos a los que se fija SAP.

Un “anticuerpo” como se usa en la presente memoria incluye, pero no está limitado a, policlonal, monoclonal, recombinante, quimérico, región determinante de complementariedad (CDR) injertado, cadena simple, biespecífica, fragmentos FAB y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab. Tales fragmentos incluyen fragmentos de anticuerpos antiSAP completos que retienen su actividad de fijación a SAP, Fv, F(ab’), fragmentos F(ab’)2, y fragmentos de anticuerpo F(v) así como proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que comprenden el lugar de fijación del antígeno del anticuerpo antiSAP. Además, los anticuerpos y sus fragmentos pueden ser anticuerpos humanizados, como se describe en más detalle a continuación.

Regiones variables y CDRs en una secuencia de anticuerpos se pueden identificar alineando las secuencias frente a una base de datos de regiones variables conocidas. Métodos para identificar estas regiones se describen en, por ejemplo, Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001. Bases de datos de secuencias de anticuerpos se describen en, por ejemplo, VBASE2 en www.vbse2.org, según se describe en Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005).

Anticuerpo antiSAP monoclonal producido en ratones está disponible comercialmente de diversas fuentes – tales como Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset UK (catálogo número A9191); US Biological (catálogo número S1003-3, 1003-4); Acris Antibodies (catálogo número BM225); Kamya Biomedical Co. (catálogo número MC-978); Cell Sciences (catálogo número MON 6006); Abnova Corp. (catálogo número H00000325-MO7).

El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se obtiene de un único clon de linfocito B que deriva de células de plasma que produce un anticuerpo homogéneo de una clase de cadena pesada y ligera y un epítopo específico.

Los anticuerpos monoclonales típicamente son muy específicos, y se dirigen contra un sitio antígeno único (epítopo), al contrario que anticuerpos convencionales en un antisuero inducido en un animal entero por inmunización con un antígeno particular. Tales anticuerpos convencionales derivan de clones muy diferentes de linfocitos B que reconocen o bien el mismo o diferentes epítopos del antígeno a inmunizar, y se conocen como anticuerpos policlonales. Además de su especificidad muy restringida, los anticuerpos monoclonales se producen rápidamente en forma pura sin contaminar por otras inmunoglobulinas, mientras que el aislamiento de anticuerpos específicos a

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Sustituciones homólogas (sustitución y reemplazo se usan ambos en la presente memoria para referirse al intercambio de un resto de aminoácido que existe, con un resto alternativo) se pueden dar p. ej sustitución de igual a igual tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se pueden dar sustituciones no homólogas p. ej. de una clase de resto a otra o alternativamente que implica la inclusión de aminoácidos no naturales – tales como ornitina (de aquí en adelante referido como Z) ornitina ácido diaminobutírico (de aquí en adelante referido como B), ornitina norleucina (de aquí en adelante referido como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

También se pueden hacer reemplazos mediante aminoácidos no naturales que incluyen; aminoácidos alfa* y alfadisustituidos*; N-alquil aminoácidos*, ácido láctico*, derivados halogenuros de aminoácidos naturales tales como trifluortirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil-glicina*, β-alanina*, ácido L-α-amino butírico*, ácido L-γamino butírico*, ácido L-α-amino isobutírico*, ácido L-ε-amino caproico#, ácido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, N-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, metil derivados de fenilalanina (fe) tales como 4-metil-fe*, pentametil-fe*, L-fe (4-amino)#, L-tir-(metil)*, L-fe (4isopropil)*, L-tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico), ácido L-diaminopropiónico# y L-fe-(4-bencil)*. La nota * se ha utilizado con el propósito de la discusión anterior (relacionada con sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado mientras # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características anfipáticas.

Por tanto, variantes pueden incluir péptidos y polipéptidos que comprenden uno o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de aminoácidos en los anticuerpos antiSAP y sus fragmentos en las que tales sustituciones, deleciones y/o adiciones no causan cambios significativos en afinidad y especificidad del epítopo de fijación. Por ejemplo, una variante de un anticuerpo antiSAP o su fragmento puede resultar de uno o más cambios de un anticuerpo antiSAP o su fragmento, donde el anticuerpo antiSAP o su fragmento cambiado tiene la misma o significativamente la misma afinidad y especificidad del epítopo de fijación que la secuencia inicial. Las variantes se pueden dar de manera natural, tales como variantes alélicas o empalmadas, o se pueden crear artificialmente. Se pueden preparar variantes a partir de las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes que codifican dichas variantes. Variantes de anticuerpos antiSAP o sus fragmentos pueden tener cambios en cadenas de secuencias de aminoácidos ligera y/o pesada que se dan de manera natural o se introducen por ingeniería in vitro de secuencias nativas que usan técnicas de ADN recombinante. Variantes que se dan de manera natural incluyen variantes “somáticas” que se generan in vivo en la correspondiente línea inicial de secuencia de nucleótidos durante la generación de una respuesta de anticuerpo a un antígeno extraño.

También se pueden preparar variantes de anticuerpos que se fijan a SAP por técnicas de mutagénesis. Por ejemplo, se pueden introducir cambios en aminoácidos al azar a través de una región que codifica un anticuerpo y las variantes que resultan se pueden examinar la afinidad de fijación para SAP u otra propiedad. Alternativamente, se pueden introducir cambios en aminoácidos en regiones seleccionadas del anticuerpo antiSAP, tal como en la cadena CDRs ligera y/o pesada, y/o en las regiones marco, y los anticuerpos que resultan se pueden examinar la afinidad de fijación para SAP u otra propiedad. Los cambios en aminoácidos incluyen uno o más sustituciones de aminoácidos en un CDR, que va desde una diferencia de aminoácido único hasta la introducción de permutaciones múltiples de aminoácidos en un CDR dado. También están incluidas variantes generadas por inserción de aminoácidos para incrementar el tamaño de un CDR.

Se pueden proporcionar anticuerpos antiSAP o sus fragmentos con una región Fc modificada donde una región Fc que se da de manera natural se modifica para incrementar la vida media del anticuerpo o fragmento en un medio biológico, por ejemplo, la vida media del suero o un vida media medida mediante un ensayo in vitro.

Variantes también incluyen anticuerpo antiSAP o sus fragmentos que comprenden una región Fc modificada, donde la región Fc modificada comprende al menos una modificación de aminoácido en relación a la región Fc de tipo salvaje. La región Fc variante se puede diseñar, en relación a moléculas comparables, de modo que se fije a receptores FC con mayor o menor afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos y sus fragmentos que fijan Fc pueden comprender una región Fc modificada. Región Fc se refiere a polipéptidos que se dan de manera natural o sintética homólogos al dominio C-terminal de IgG que se produce tras digestión de papaína de IgG. IgG Fc tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kD. En los anticuerpos y fragmentos, se puede usar una región Fc completa, o solo una parte que mejore la vida media. Además, son aceptables muchas modificaciones en secuencias de aminoácidos, ya que la actividad original no es necesaria o deseada en todos los casos.

Los anticuerpos y sus fragmentos que se fijan a SAP también incluyen los derivados de los anticuerpos, fragmentos y secuencias descritos en la presente memoria. Derivados incluyen polipéptidos o péptidos, o variantes, fragmentos

o sus derivados, que se han modificado químicamente. Ejemplos incluyen adjuntos covalentes de uno o más polímeros – tales como polímeros solubles en agua, hidratos de carbono unidos a N, o unidos a O, azúcares, fosfatos, y/o otra de tales moléculas. Los derivados se modifican de un modo que es diferente de péptidos o polipéptidos que se dan de manera natural o iniciales, o bien en el tipo o en la localización de las moléculas adjuntas. Derivados además incluyen deleción de uno o más grupos químicos que están presentes de manera natural sobre el péptido o polipéptido.

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técnica, tal como a través del uso de mamíferos transgénicos (tales como ratones transgénicos) en los que las inmunooglobulinas originales se han sustituido por genes V humanos en el cromosoma del mamífero.

También se pueden producir cromosomas humanos dirigidos a SAP usando animales transgénicos que no tienen producción de inmunoglobulina endógena y que se someten a ingeniería para contener loci para inmunoglobulina humana, según se describe en WO 98/24893 y WO 91/00906.

El uso de un animal transgénico descrito anteriormente, se puede producir una respuesta inmune a una molécula antígena seleccionada, un anticuerpo que produce células se puede eliminar del animal y usar para producir hibridomas que ocultan anticuerpos monoclonales humanos. Los protocolos inmunización, adyuvantes, y similares se conocen en la técnica y se usan en inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico.

El desarrollo de técnicas para fabricar receptores de genes de anticuerpo humano recombinante y la colocación de los fragmentos de anticuerpo codificados sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, ha proporcionado un medio para fabricar anticuerpos humanos directamente. Los anticuerpos producidos por tecnología de fagos se producen como fragmentos que fijan antígenos – normalmente fragmentos Fv o Fab – en bacterias y por tanto carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras se pueden introducir mediante una o dos estrategias: los fragmentos por ingeniería pueden transformarse en o bien anticuerpos completos para expresión en células de mamíferos, o bien en fragmentos de anticuerpos biespecíficos con un segundo sitio de fijación capaz de desencadenar una función efectora.

Se pueden generar anticuerpos humanos a través de cribado in vitro de bibliotecas que exponen anticuerpos (J. Mol. Biol. (1991) 227:381). Se han descrito varias bibliotecas que exponen fagos que contienen anticuerpos y se pueden preparar rápidamente. Las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv, y scFv humano, que se pueden cribar con un objetivo adecuado. Las bibliotecas que exponen fagos pueden comprender péptidos o proteínas distintas de anticuerpos que se pueden cribar para identificar agentes capaces de fijación selectiva a SAP.

Los procesos que exhiben fagos imitan selección inmune a través de repertorios de anticuerpos sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, y posterior selección de fagos por su fijación a un antígeno elegido. Uno de tales métodos se describe en WO 99/10494. Se pueden aislar anticuerpos antiSAP por cribado de una biblioteca combinatorial de anticuerpo recombinante, preferentemente una biblioteca que exponga un fago scFv, que se prepara usando cADNs VL y VH humano preparado a partir de mARN que deriva de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y cribar tales bibliotecas se conocen en la técnica. Comercialmente están disponibles kits para generar bibliotecas que exponen fagos.

Los anticuerpos y sus fragmentos que fijan SAP pueden comprender una o más partes que no fijan SAP pero que son responsables de otras funciones, tales como vida media circulante, efecto citotóxico directo, etiquetado detectable, o activación del complemento endógeno en cascada del recipiente o citotoxicidad celular endógena. Los anticuerpos o sus fragmentos pueden comprenden todo o una parte de la región constante y puede ser cualquier isótopo, que incluye IgA (p. ej., IgA1, o IgA2), IgD, IgE, IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), o IgM. Además, o en vez de, comprende una región constante, compuestos que fijan antígenos de la invención pueden incluir una etiqueta de epítopo, un epítopo receptor rescatado, una fracción marcada con propósitos de diagnóstico o purificación, o una fracción citotóxica tal como un radionucleido o toxina.

Por tanto el anticuerpo o su fragmento antiSAP se puede modificar para incrementar su vida media en suero, por ejemplo, añadiendo moléculas, tales como PEG u otros polímeros solubles en agua, que incluyen polímeros de polisacáridos para incrementar la vida media.

Por tanto los anticuerpos que fijan SAP y sus fragmentos pueden ser biespecíficos. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden parecer anticuerpos sencillos (o fragmentos de anticuerpos) pero tienen dos sitios que fijan antígenos diferentes (regiones variables). Se pueden producir anticuerpos biespecíficos por varios métodos – tal como técnicas químicas, técnicas “polidoma” o técnicas de ADN recombinante. Anticuerpos biespecíficos pueden tener especificidad de fijación para al menos dos epitopos diferentes, al menos uno de los cuales es un epítopo de SAP.

Los anticuerpos y fragmentos que fijan SAP pueden ser heteroanticuerpos. Los heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos, o fragmentos que fijan anticuerpos (Fab) unidos juntos, cada anticuerpo o fragmento tiene una especificidad diferente.

Como se usa en la presente memoria, el término “fragmentos de anticuerpo” se refiere a partes de un anticuerpo de longitud completa intacto – tal como un fijador de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (p. ej., scFv); fragmentos de anticuerpos multiespecíficos tales como biespecíficos, triespecíficos, y anticuerpos multiespecíficos (p. ej., diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos); fijador de proteínas de dominio de fusión de inmunoglobulinas; anticuerpos camelizados; minicuerpos; anticuerpos quelantes recombinantes; tricuerpos o bicuerpos; intracuerpos; nanocuerpos; inmunofármacos modulares pequeños (SMIP); anticuerpos que contienen VHH; y cualquier otro polipéptido que se forma a través de fragmentos de anticuerpos.

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y 1,4-fenilen, donde los grupos fenilen opcionalmente se sustituyen por sustituyentes 1-4, seleccionados de halógenos, alquilo más corto, alcoxi más corto, hidroxilo, carboxi, -COO-alquilo más corto, nitrilo, 5-tetrazol, (ácido 2carboxílico pirrolidona-1-il)-2-oxo-etoxi, N-hidroxicarbamimiodil, 5-oxo[1,2,3,5]oxatiadiazolil, 5-tioxo[1,2,4]oxodiazolil y 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxodiazolil;

X’ es -(CH2)n-; -(CH2)nCH(R2)-; -(CH2)nOCH2-; -NHCH2-; benzil, -CH=C(R2)-; CH(OH)CH2; o tiazol-2,5-diil;

R2 es alquil inferior, alcoxi inferior o bencil y

n es 0-3,

o una sal o su mono o diéster farmaceúticamente aceptable. El compuesto que disminuye SAP de la circulación, según la reivindicación 1 se refiere de aquí en adelante como un compuesto que disminuye SAP.

En una realización, D-prolina de la fórmula IA anterior se puede escribir como ligando-enlace-ligando, donde el medio de X-Y-X’ de IA formales forma el enlace. Está en el ámbito de la presente invención que el enlace (X-Y-X’) puede ser de 4 a 20 átomos de carbono lineales en longitud, que incluye de 4-15 átomos de carbono lineales, 5-10 átomos de carbono lineales, y 6-8 átomos de carbono lineales en longitud. El enlace puede ser una cadena recta o ramificada, o opcionalmente puede formar una o más estructuras de anillo, con la condición de que al menos 4 átomos de carbono de cadena lineal o recta estén presentes en el enlace. En una realización, al menos uno de los átomos de C de la cadena lineal o recta opcionalmente se puede sustituir por al menos un heteroátomo seleccionado de N, O, o S, ventajosamente O o S, preferentemente O.

Por tanto, un “enlace opcionalmente sustituido” puede tener una o más sustituciones que llevan a ramificar y/o una o más sustituciones de átomo(s) de carbono de la cadena de átomos de carbono linear o recta de la unión, p. ej., la unión puede ser un éter o un éter sustituido.

Composiciones farmacéuticas.

Adecuadamente, el compuesto que disminuye SAP como se describe en la presente memoria y el anticuerpo o su fragmento antiSAP humano descritos en la presente memoria se administrarán como composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces.

Como se usa en la presente memoria el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP humano o como una parte de una composición farmacéutica, que es capaz de tener cualquier efecto detectable, positivo sobre cualquier síntoma, aspecto o característica de amiloidosis cuando se administra a un paciente (p. ej., como una o más dosis).

La combinación de un compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP se puede administrar separadamente, simultáneamente, secuencialmente, concurrentemente o consecutivamente, o la combinación puede estar presente en la forma de una formulación farmacéutica.

Por tanto, la presente invención también implica el compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento terapéutico

o profiláctico de amiloidosis.

La composición farmacéutica que comprende el compuesto que disminuye SAP se puede administrar separadamente de los anticuerpos o sus fragmentos antiSAP, y tal administración por separado se puede llevar a cabo en el mismo momento o en diferentes momentos en el tiempo, tal como el mismo o diferentes días. Si la combinación del compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP se administran secuencialmente entonces el compuesto que disminuye SAP se administra primero de modo que el tratamiento con compuesto que disminuye SAP puede eliminar casi todo el SAP circulante. Ya que esto deja cantidades significativas de SAP asociado con los depósitos de amiloide en los tejidos la administración secuencial del anticuerpo o su fragmento antiSAP permite la localización y fijación específica de los depósitos de amiloide para fomentar su disminución rápida y extensa. Adecuadamente, el anticuerpo o su fragmento antiSAP se puede administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o 25 o más días después del tratamiento(s) con el compuesto que disminuye SAP.

La administración secuencial puede implicar dos o más tratamientos secuenciales con compuesto que disminuye SAP seguido de dos o más tratamientos secuenciales con el anticuerpo o su fragmento antiSAP.

La administración secuencial puede implicar un tratamiento con compuesto que disminuye SAP seguido de un tratamiento secuencial con el anticuerpo o su fragmento antiSAP, que después se repite una o más veces.

La dosis secuencial/posterior puede ser una cantidad que es más que la dosis inicial/previa o menos que la dosis inicial/previa.

La administración de una dosis inicial de compuesto que disminuye SAP y/o el anticuerpo o su fragmento antiSAP puede seguir por la administración de una o más dosis (p. ej., posteriores) secuenciales del compuesto que

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partículas biocorrosibles, liposomas, y aparatos que liberan implantables que proporcionan liberación controlada o prolongada del agente activo que se puede liberar como una inyección de almacén.

Se conocen técnicas para formular tales medios de liberación prolongada – o controlada-y se han desarrollado una variedad de polímeros y se usan para el lanzamiento y liberación de fármacos. Hidrogeles de polímeros, incluyendo los que se forman por complejo de un polímero enantiomérico, o segmentos de polipéptido y hidrogeles con propiedades de percibir temperatura o pH, pueden ser deseables para proporcionar efecto de almacén de fármaco debido a las condiciones suaves y acuosas implicadas en mantener los agentes proteicos bioactivos (p. ej., anticuerpos).

Polímeros bioadhesivos también se pueden usar en las composiciones. Los bioadhesivos son materiales que se dan de manera sintética o natural capaces de adherirse a sustratos biológicos durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, Carbopol y policarbofil son ambos derivados sintéticos reticulados de poli (ácido acrílico).

La composición farmacéutica se puede formular por inhalación, tal como por ejemplo, como un polvo seco. Las disoluciones por inhalación también se pueden formular en un propelente licuado para liberación por aerosol. En aún otra formulación, las disoluciones se pueden nebulizar. Composiciones farmacéuticas adicionales para administración pulmonar incluyen, las descritas, por ejemplo, en la publicación de solicitud de PCT WO 94/20069, que describe liberación pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Para liberación pulmonar, el tamaño de partícula debería ser adecuado para liberar en el pulmón distal. Por ejemplo, el tamaño de partícula puede ser de 1 μm a 5 μm; sin embargo, se pueden usar partículas más grandes, por ejemplo, si cada partícula es bastante porosa.

Otra preparación puede implicar una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Por disolución de las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, se pueden preparar disoluciones en forma de dosis única. Excipientes adecuados incluyen, pero no son limitantes, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico o bicarbonato, lactosa o fosfato cálcico; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato magnésico, ácido esteárico, o talco.

Ciertas formulaciones se pueden administrar oralmente. Formulaciones administradas de este modo se pueden formular con o sin esos vehículos que habitualmente se usan en las composiciones de formas de fármacos sólidos tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula se puede diseñar para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de un agente aglutinante específico. También se pueden emplear diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de tabletas, y aglutinantes.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz

o una cantidad profilácticamente eficaz del compuesto que disminuye SAP y/o el anticuerpo o su fragmento antiSAP.

“Una cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede variar según factores tales como estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o parte de anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es la que cualquier efecto tóxico o perjudicial se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

“Una cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado.

Una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos – tales como la indicación por la que se usa la composición, la vía de administración, y el estado del sujeto. Composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz para tratar amiloidosis. Una “cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz” es esa cantidad que puede tratar o prevenir uno o más síntomas de amiloidosis en un sujeto.

La composición farmacéutica descrita en la presente memoria también se puede usar en combinación con tratamientos convencionales para amiloidosis.

Sales farmacéuticas.

El compuesto que disminuye SAP se puede administrar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Sales farmacéuticamente aceptables son conocidas por los expertos en la técnica, y por ejemplo, incluidos los que se mencionan en Berge et al, en J. Pharm, Sci, 66, 1-19 (1977). Sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas y que incluyen las sales de hidrocloruro, hidrobromuro, hidroioduro, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, hidrogenfosfato, acetato, trifluoroacetato, gluconato, lactato, salicilato, citrato, tartrato, ascorbato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, formato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, benzenosulfonato y p-toluenosulfonato.

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Cuando están presentes uno o más restos ácidos, sales de adición de bases adecuadas farmacéuticamente aceptables se pueden formar a partir de bases que forman bases no tóxicas e incluyen sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, zinc, y aminas farmacéuticamente activas tal como dietalonamina.

Una sal farmacéuticamente aceptable se puede preparar rápidamente mezclando disoluciones del compuesto que disminuye SAP y el ácido o base deseado, según convenga. La sal puede precipitar a partir de una disolución y se puede recolectar por filtración o se puede recuperar por filtración del disolvente.

Administración.

Los componentes se pueden administrar solos pero generalmente se administrarán como una composición farmacéutica – p. ej., cuando los componentes están como una mezcla con el excipiente farmacéutco, diluyente o vehículo adecuado seleccionado en relación con la vía de administración que se pretende y práctica farmacéutica estándar.

Por ejemplo, los componentes se pueden administrar en la forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elixires, disoluciones

o suspensiones, que pueden contener agentes edulcorantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retrasada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.

Si el fármaco es una tableta, entonces la tableta puede contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato dibásico de calcio y glicina, desintegrantes tales como almidón (preferentemente almidón de maíz, patata o tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilclulosa (HPC), sacarosa, gelatina y acacia. Además, se pueden incluir agentes lubricantes tal como estearato magnésico, ácido esteárico, gliceril behenato y talco.

También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenados en cápsulas de gelatina. Excipientes preferentes en este sentido incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietileno glicol de alto peso molecular. Para suspensiones acuosas y/o elixires, el agente se puede combinar con diversos edulcorantes y agentes saborizantes, materias colorantes o tintes, con agentes emulsionantes o de suspensión y con diluyentes como agua, etanol, propilén glicol y glicerina, y sus combinaciones.

Las vías de administración (liberación) pueden incluir, pero no están limitadas, uno o más oral (p. ej., tableta, cápsula, o como una disolución que se puede ingerir), topical, mucosal (p. ej., como un spray nasal o aerosol por inhalación), nasal, parenteral (p. ej., mediante una forma inyectable), gastrointestinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenoso, intrauterina, intraocular, intradermal, intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutáneo, oftálmico (que incluye intravitreal o intracameral) transdermal, rectal, bucal, vaginal, epidural o sublingual.

En una realización específica, el modo de administración es infusión intravenosa.

Niveles de dosis.

Formulaciones farmacéuticas adecuadas y/o preferentes se pueden determinar en vista de la presente descripción y conocimiento general de tecnología de formulación, dependiendo de la vía de administración que se pretende, formato de liberación, y dosis deseada.

Típicamente un físico determinará la dosis real que será más adecuada para un sujeto individual.

El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular puede variar y dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y longitud de acción de tal compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, grado de excreción, combinación de fármacos, la gravedad del estado particular, y la terapia particular a la que se somete. Por ejemplo, el compuesto que disminuye SAP se puede administrar en una dosis entre 2 mg/kg y 0,1 mg/kg, dependiendo de su actividad.

El anticuerpo o su fragmento antiSAP se puede administrar como una dosis fija, independiente de la dosis por proporción del peso del sujeto. El anticuerpo o su fragmento se puede administrar en una o más dosis separadas, simultáneas o secuenciales de 3.000 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 2.700 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 2.500 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 2.200 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, o

2.100 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 1.700 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 1.500 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 1.200 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, o 1.100 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 1.000 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 700 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 500 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, 200 mg o menos de anticuerpo o su fragmento, o 100 mg

o menos de anticuerpo o su fragmento. En otra realización, el anticuerpo o fragmento se administra en una o más dosis de al menos 20 mg de anticuerpo o su fragmento.

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El compuesto que disminuye SAP se puede administrar como una dosis fija, independientemente de una dosis por proporción de peso del sujeto. El compuesto que disminuye SAP se puede administrar en una o más dosis parenteral separadas, simultáneas o secuenciales de 100 mg o menos, de 50 mg o menos, 25 mg o menos, o 10 mg

o menos. Alternativamente, el compuesto que disminuye SAP se puede administrar en una dosis por proporción de peso del sujeto según se determina fácilmente por un experto en la técnica.

Formulación.

El componente(s) se puede formular en una composición farmacéutica, tal como mezclando con uno o más vehículo, diluyente o excipiente adecuado, mediante el uso de técnicas que son conocidas en la técnica.

Expresión.

Están disponibles una amplia variedad sistemas de expresión para la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos antiSAP que incluye fragmentos Fab, scFv, y VHHs. Por ejemplo, se pueden usar sistemas de expresión de origen tanto procariótico como eucariótico para la producción a gran escala de fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpos.

La bacteria gram negativa de E. coli se usa ampliamente como huésped para genes de expresión heterólogos. Sin embargo, cantidades grandes de proteína heteróloga tienden a acumularse dentro de la célula. La posterior purificación de la proteína deseada a partir del grueso de proteínas intracelulares de E. coli a veces puede ser difícil.

Al contrario que E. coli, las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos debido a su capacidad de segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido, y/o el deseo de posterior procesado de la proteína expresada, pueden ser preferentes huéspedes eucarióticos tales como levadura u otros hongos. En general, son preferentes células de levadura sobre células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas o bien se segregan pobremente de la célula de levadura, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (p. ej., hiperglicosilación en levadura). En estos casos, se debería seleccionar un organismo huésped fúngico diferente.

Ejemplos de huésped de expresión adecuada en el ámbito de la presente invención son levaduras tales como especie Aspergillus (tales como las descritas en EP-A-0184438 y EP-A-0284603) y especie Trichoderma; bacterias tales como especie Bacillus (tales como las descritas en EP-A-0134048 y EP-A-0253455), especie Streptomyces y especie Pseudomonas; y levaduras tales como especie Kluyveromyces (tales como las descritas en EP-A-0096430 y EP-A-0301670) y especie Saccharomyces.

El uso de células huésped adecuadas – tales como células huésped de levaduras, hongos y plantas-puede proporcionar modificaciones post translacionales (p. ej., miristoilación, glicosilación, truncación, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según se necesite para conferir actividad biológica óptima sobre productos de expresión recombinante.

Particularmente ventajosos son sistemas de expresión que permiten la secreción de grandes cantidades de fragmentos de anticuerpo en el medio de cultivo.

Kit.

En otra realización de la invención, se proporciona un conjunto de fabricación, o “kit”, que contiene materiales útiles para el tratamiento de la amiloidosis.

Adecuadamente, el kit está formulado para la administración separada o secuencial de la D-prolina o el anticuerpo o uno de sus fragmento antiSAP.

En una realización, el kit comprende un contenedor que comprende el compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP. En otra realización, el kit comprende un primer contenedor que comprende el compuesto que disminuye SAP y un segundo contenedor que comprende el anticuerpo o su fragmento antiSAP.

Adecuadamente, el compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP están presentes en cantidades eficaces terapéuticamente o profilácticamente para el tratamiento y/o prevención de amiloidosis.

Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botes, viales, jeringas, bláster, etc. El contenedor se puede formar a partir de una variedad de materiales tal como cristal o plástico.

El contenedor mantiene el compuesto de disminuye SAP o su formulación farmacéutica y/o el anticuerpo o su fragmento antiSAP, en una cantidad eficaz para tratar amiloidosis, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede estar en una bolsa o un vial de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja hipodérmica de inyección).

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El kit además puede comprender una etiqueta o envase inserto sobre o asociado al contenedor. La etiqueta o envase inserto puede indicar que la composición(es) se usa para tratar amiloidosis.

Alternativamente, o adicionalmente, el kit además puede comprender un contenedor adicional que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacterióstatica para inyección, sal fosfato tamponada, disolución Ringer, y disolución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial o del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, agujas y jeringas.

El kit además puede comprender instrucciones para la administración del compuesto que disminuye SAP y el anticuerpo o su fragmento antiSAP para tratar o prevenir amiloidosis. Por ejemplo, si el kit comprende una primera composición que comprende el compuesto que disminuye SAP y una segunda composición que comprende el anticuerpo antiSAP, el kit además puede comprender instrucciones para la administración simultanea, secuencial o separada de la primera y segunda composición farmacéutica a un sujeto que lo necesita.

En otra realización, el kit puede ser adecuado para la liberación de formas orales sólidas de la composición – tal como tabletas o cápsulas. Tal kit incluye, por ejemplo, un número de dosis unitarias. Tales kit pueden incluir una carta que tenga la dosificación orientativa ordenada para el uso que se pretende. Un ejemplo de tal kit es un “envase blíster”. Los envases blíster son conocidos en la industria de envasado y son ampliamente usados para envasar formas farmacéuticas de dosificación unitaria. Si se desea, se puede proporcionar un ayudante para recordar la toma, por ejemplo en la forma de números, letras, u otras marcas o con un calendario inserto, que señala los días del programa del tratamiento en los que se puede administrar la dosis.

En ciertas otras realizaciones en las que el kit comprende una formulación farmacéutica del compuesto que disminuye SAP y una segunda formulación que comprende el anticuerpo o su frangmento antiSAP, el kit puede comprender un contenedor separado para contener las formulaciones separadas, tal como una botella dividida o un envase de papel dividido; sin embargo, las composiciones separadas también pueden estar contenidas en un contenedor único, sin dividir. Típicamente, el kit comprende instrucciones para la administración de los componentes separados. Esta forma de kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados se administran en formas de dosificación diferentes (p. ej., oral y parenteral), se administran en intervalos de dosificación diferentes, o cuando se desea la titulación de los componentes individuales de la combinación por el físico que hace la prescripción.

Método de ensayo.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método de ensayo para identificar uno o más agentes que se pueden usar en combinación con un compuesto que disminuye SAP como se describe en la presente memoria para el tratamiento de amiloidosis, en particular, para la eliminación esencialmente completa de los depósitos de amiloide.

El agente puede ser un compuesto orgánico u otro químico. El agente puede ser un compuesto, que se obtiene o se produce a partir de cualquier fuente disponible, bien sea natural o artificial. El agente puede ser una molécula de aminoácido, un polipéptido, o un derivado químico de ellos, o una combinación de ellos. El agente puede incluso ser una molécula de polinucleótido – que puede ser una molécula sentido o antisentido, o un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal humanizado.

En una realización, el agente es un anticuerpo – tal como un anticuerpo que deriva o es derivable de un anticuerpo antiSAP.

El agente se puede preparar mediante técnicas de síntesis química.

Técnicas generales de metodología de ADN recombinante.

La presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Books 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biologoy, ch. 9, 13, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gail (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; y, D. M. J. Lilley y J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Cada uno de estos textos generales se incorpora en la presente memoria como referencia.

A continuación la invención se describirá con más detalle a modo de ejemplos que tienen la intención de asistir al experto en la técnica en llevar a cabo la invención y no se pretende que limiten el ámbito de la invención.

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EJEMPLOS

Ejemplo 1: eliminación de depósitos de amiloide sistémicos en ratones transgénicos que expresan SAP humano.

En el presente estudio se indujo amiloidosis AA en ratones por inyección de factor que realza amiloide seguido de inyecciones de caseína repetidas para provocar inflamación aguda persistente y por tanto incremento suficientemente sustancial en producción de SAP para favorecer la deposición de amiloide AA en todos los animales. Se usó un única cepa de animales de línea pura C57BL/6 en los que se había borrado13 el gen de ratón SAP y se había introducido14, 15 un transgen SAP humano. Por lo tanto no expresan ningún SAP de ratón si no que expresan SAP humano y a unas concentraciones significativamente más altas que las vistas en humanos. Se confirma que todos los ratones han desarrollado depósitos de amiloide sistémicos abundantes demostrando positivamente el incremento de retención en todo el cuerpo de una traza de SAP humano radiomarcada comparado con los ratones control sin tratar sin amiloide. Después se trataron tres grupos muy cercanos como sigue:

Grupo 1, ácido (R)-1-[6-[(R)-2-carboxi-pirrolidina-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidina-2-carboxílico (CPHPC), el fármaco16, 17 que disminuye SAP, y una única dosis de anticuerpo antihumano SAP de ovino;

Grupo 2, CPHPC y IgG control de ovino de antisuero no relacionado;

Grupo 3, sin tratamiento.

Estos grupos control son esenciales para proporcionar una comparación con el retroceso espontáneo de depósitos de amiloide cuando cesa la inflamación. Los grupos también necesitan ser suficientemente grandes para compensar las diferentes proporciones de retroceso de amiloide en ratones individuales diferentes, incluso en estos animales de línea pura endogámica. Igualmente el experimento no se puede realizar mientras continua la inducción de amiloide debido a las proporciones variables a las que se da la deposición de amiloide. En un experimento preliminar sobre grupos de 15 ratones cada uno, realizado según el mismo preciso protocolo y con los mismos reactivos según se describe en la presente memoria, obtenemos los mismos resultados que se muestran a continuación. Después el presente experimento se llevó a cabo con más ejemplares en cada grupo para confirmar que el efecto observado se reproducía y no se debía a un suceso casual de retroceso acelerado de amiloide en uno de los grupos no relacionado con el tratamiento dado.

En los ratones transgénicos con SAP humano, SAP humano está presente tanto en circulación como en depósitos de amiloide. El fármaco CPHPC está específicamente ligado mediante SAP humano a un complejo compuesto por dos moléculas de SAP pentaméricas nativas y 5 moléculas16 CPHCP. Este complejo es reconocido como anormal por el hígado y se toma muy rápidamente por los hematocitos y se degrada, eliminándolo así eficazmente de la circulación16. Las concentraciones de SAP en plasma permanecen muy bajas durante mucho tiempo siempre que el fármaco se administre16. CPHPC se tolera extremadamente bien y ni el fármaco en sí mismo ni la disminución de SAP que produce causan ningún efecto adverso16 (y resultados no publicados). Hay evidencia de beneficios clínicos a partir de tratamiento con CPHPC en pacientes humanos con amiloidosis sistémica, especialmente con respecto a la conservación de la función renal en individuos con amiloidosis predominantemente renal (resultados sin publicar). A pesar de estas observaciones prometedoras, la eficacia terapéutica rápida y óptima capaz de conservar función orgánica y prolongar la vida en pacientes con amiloidosis sistémica requerirá eliminación significativa o completa de los depósitos de amiloide. Como se demuestra en la presente memoria, esto se puede lograr ahora según la presente invención por tratamiento con una combinación de CPHPC y anticuerpos antiSAP.

El tratamiento con CPHPC elimina casi todo el SAP circulante humano pero deja cantidades significativas de SAP asociado con los depósitos de amiloide en los tejidos (observaciones sin publicar). La disminución más grande de SAP de depósitos de amiloide que se ha observado en pacientes humanos se da aproximadamente 90% después de meses de administración continua de CPHPC. La infusión intravenosa de anticuerpos monoespecíficos contra SAP humano en pacientes cuyo SAP circulante ha disminuido permite a los anticuerpos localizar y fijarse específicamente a los depósitos de amiloide y favorecen su retroceso rápido y extenso. Aquí se muestra la eficacia de este procedimiento en amiloidosis AA del modelo de ratón transgénico con SAP humano.

Protocolo y métodos experimentales.

Se indujo amiloidosis AA sistémica en machos (n=61) y hembras (n=32) adultos de ratones de línea pura C57BL/6 con el gen SAP borrado y que eran transgénicos para SAP15 humano. Cada ratón recibió una dosis única de factor9 que realza amiloide por inyección intravenosa seguido 4 días después de 10 inyecciones diarias subcutáneas de 10% p/v de caseína en disolución de NaHCO3 0,1 M administrado durante un periodo13 de 12 días. Siete días después de la última inyección de caseína, se introdujo KI en el agua de bebida de todos los ratones y 3 días después cada ratón recibió una inyección intravenosa de una dosis estándar de125 SAP6, 18 humano I-etiquetado. Cuatro machos y cuatro hembras adultos de ratones de la misma colonia pero que no habían recibido ningún otro tratamiento también se les dio KI y125 I-SAP como controles. Todos los ratones se sometieron a conteo en todo el cuerpo 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la inyección de contraste para determinar la retención de radiactividad como un índice de carga de amiloide en todo el cuerpo. Constantemente había más retención en todos los ratones tratados comparado con los controles en todos los momentos del tiempo, indicando que todos ellos tenían depósitos18 de amiloidosis sistémica significativos. Después los ratones se recolocaron en tres grupos muy cercanos

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y lo más parecidos posible en cuanto al número total y distribución de sexos en cada grupo. Diez días después de125 inyección de I-SAP los grupos uno y dos comenzaron con CPHPC en su agua de bebida a 1 mg/ml y continuaron con ese tratamiento hasta el final del experimento. El grupo tres no recibió tratamiento en esta o ninguna etapa posterior del estudio. Cinco días después del comienzo de CPHPC cada animal del grupo uno recibió una inyección peritoneal que comprende 1 ml de la fracción IgG completa del antisuero SAP antihumano ovino monoespecífico a 50 mg/ml que contenía 7 mg/ml de anticuerpos específicos en disolución en sal fisiológica tamponada con fosfato. El antisuero se cultivó por inmunización de ovino con SAP humano 100% puro. Al mismo tiempo todos los animales del grupo 2 recibieron una inyección intraperitoneal que comprende 1 ml de la fracción IgG completa del antisuero receptor de oncostatina M antihumano ovino monoespecífica a 50 mg/ml en disolución en sal fisiológica tamponada con fosfato. Este antisuero, usado en la presente memoria como un control para el reactivo antiSAP, no mostró reacción con SAP humano, con plasma de ratones o con tejidos de ratones normales por ensayos estándar inmunoquímicos y inmunohistoquímicos. Veinte días después de las inyecciones intraperitoneales todos los ratones se sacrificaron por sangrado bajo anestesia terminal y se sacó el hígado y el bazo de cada uno. Cada órgano se pesó y se dividió en tres partes, una de ellas también se pesó y se usó para extracción de SAP, mientras que la segunda parte se congeló instantáneamente para posterior análisis inmunohistoquímico y histoquímico sin fijación, y la última parte se fijó en formalina tamponada para rutina histiológica y estimación de amiloide por tinción con rojo Congo. Todos los ratones se pesaron al mismo momento de asignación a los grupos después de inducción de amiloidosis pero antes de la administración de125 I-SAP. Todos se pesaron otra vez antes del sacrificio y al final del experimento. Todos los ratones se sangraron cuatro veces: (1) inmediatamente antes de que los grupos dos y tres comenzaran con CPHPC; (2) el día antes de la inyección de las preparaciones IgG en los grupos dos y tres; (3) 14 días antes de las inyecciones IgG; (4) en el momento del sacrificio. Las secciones de bazo e hígado de todos los animales teñidas con rojo Congo se examinaron independientemente por tres observadores expertos diferentes ciegos al tratamiento que cada ratón había recibido y puntuaron la cantidad de amiloide presente como se indicó previamente. Las puntuaciones 100-104 representan un logaritmo aproximado de base 10 en una escala desde 100, que corresponde a uno o dos diminutas motas de amiloidosis entre muchas secciones de un órgano particular, hasta 104 que corresponde a amplios depósitos abundantes que comprenden aproximadamente 10.000 veces más amiloide13. Había casi 100% de concordancia entre las puntuaciones de los diferentes observadores, y las puntuaciones de la mayoría de los observadores experimentados se usaron por tanto para el presente análisis. Las concentraciones de SAP humano en el suero y extractos de órganos se midieron por electroinmunoensayo5.

El cronograma del protocolo se resume a continuación:

Día Procedimiento

-41 Inyección AEF i.v. en todos los ratones

-36 a -31 Inyecciones s.c. de caseína diarias en todos los ratones

-29 a -24 Inyecciones s.c. de caseína diarias en todos los ratones

-20 Pesado de todos los ratones

-17 Iniciar KI en agua de bebida en todos los ratones

-14 Inyección125 I-SAP i.v. en todos los ratones

-13 a -10 y -7 Recuento de cuerpo completo de todos los ratones cada día

-5 Sangrado de todos para muestra de pretratamiento

-4 Iniciar CPHPC 1 mg/ml en agua de bebida para los grupos 1 y 2; no tratamiento para el grupo 3

-1 Sangrado para muestra de tratamiento post CPHPC pre anticuerpo

0 Inyección IgG anticuerpo antihumano SAP de ovino en grupo 1

Inyección control IgG ovino para grupo 2

Grupo 3 sin tratamiento

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Sangrado de todos

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Pesado de todos

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Desangrar y sacrificar tomar los órganos a todos los ratones,

Resultados.

Peso corporal y supervivencia. El peso corporal no era significativamente diferente entre los grupos. Los pesos medios (SD) en gramos el día -20, esto es después de la inducción de amiloide y antes de la inyección de contraste, eran:

Grupo 1, 28,0 (2,7)

Grupo 2, 27,7 (3,2)

Grupo 3, 27,3 (3,1)

Los pesos medios (SD) en gramos el día 23, justo antes del final del estudio eran:

Grupo 1, 28,5 (2,8)

Grupo 2, 28,4 (3,6)

Grupo 3, 27,8 (3,3)

Ningún animal murió durante la fase de tratamiento del experimento. Sumado a los pesos corporales constantes está claro que la administración de CPHPC y anticuerpo antiSAP no tuvo efectos clínicos significativamente adversos.

Valores de SAP humano. Las concentraciones en suero de SAP humano eran las mismas en todos los grupos en la primera toma de sangre después de la inducción de amiloidosis y antes de cualquier otro tratamiento, con valores significativamente más altos entre los ratones hembras que entre los machos (tabla 1), como se ha observado previamente en esta cepa. En el segundo sangrado, tomado 4 días después del comienzo del tratamiento CPHPC en los grupos uno y dos, y antes de la administración de anticuerpo antiSAP o IgG ovino control, había más de 90% de disminución de SAP humano circulante (tabla 1) como se ha informado16, 17 previamente. Estimaciones de la concentración de SAP humano no eran posibles en suero de animales del grupo uno y dos en los días 14 y 28 después de la inyección de anticuerpo antiSAP ovino o IgG control debido a que había interferencias en el ensayo por persistencia de esos reactivos en la circulación. En el grupo tres, que no recibían ningún otro tratamiento, los valores de SAP humano no cambiaron en el día 14 pero eran significativamente más bajos en el día 28 (tabla 1), posiblemente debido al daño en el hígado por la amiloidosis.

Las cantidades de SAP humano presentes en los bazos que se eliminaron al final del experimento se muestran en la tabla 3. SAP, incluyendo SAP transgénico humano en estos ratones, se produce en el hígado. La interpretación de los resultados del ensayo de SAP humano en los hígados al final del experimento es por tanto complicada por el hecho de que algo de SAP está inevitablemente presente como resultado de su síntesis por hepatocitos y no sólo debido a la fijación de SAP circulante a depósitos de amiloide en el hígado, si es que están presentes. También las hembras tienen consistentemente más alta circulación (tabla 1) y concentraciones en hígado de SAP humano que los machos (tabla 3). Aun así, el contenido de SAP humano de los hígados en los diferentes grupos estaba en el mismo orden que los resultados del contenido de SAP inequívocamente humano en bazo.

Carga de amiloide. La carga de amiloide del cuerpo entero era la misma en los tres grupos después de la inducción de amiloide y antes del comienzo de los diferentes tratamientos. A 72 h después de la inyección del125 marcador I-SAP la retención de radioactividad del cuerpo entero era justo 10-11% de la dosis inyectada en cada uno de los 8 controles no amiloidóticos. Entre los ratones amiloidóticos la retención media (SD) era:

Grupo 1, 57,1% (21,6)

Grupo 2, 44,0% (19,5)

Grupo 3, 50,1% (21,5)

Estas diferencias no eran significativas, P=0,054 mediante ANOVA de una vía.

Al final del experimento, las valoraciones histológicas de amiloide en el bazo e hígado mostraron diferencias muy significativas entre los grupos, P=0,0000 mediante análisis de varianza no paramétrica de Kruskal-Wallis. Había radicalmente menos amiloide en el grupo 1 (CPHPC más antiSAP) que en los otros dos grupos pero no había

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diferencia entre los grupos 2 (CPHPC sólo) y 3 (sin tratamiento control) (figs 1 y 2). Entre los 31 ratones del grupo 1 no se detectó amiloide en 23 y los 8 restantes tenían ocasionalmente motas microscópicas. Por el contrario no había animales entre los 62 individuos en los dos grupos control que no recibieron antiSAP que no tuvieran nada de amiloide. Esta diferencia era muy significativa mediante la prueba exacta de Fisher, P<0,0001.

Amiloide presente

Amiloide ausente

Grupo 1: CPHPC + antiSAP

8 23

Grupo 2: CPHPC + control IgG

30 0

Grupo 3: sin tratamiento

32 0

Entre los 62 ratones control, sólo 12 tenían trazas o pequeñas cantidades de amiloide, los depósitos del resto eran moderados o fuertes. Ejemplos típicos de la tinción histioquimica para amiloide se corresponden con cada uno de las puntuaciones que se muestran en la tabla 3.

Apariencias histológicas. Las secciones teñidas de hematoxilina y eosina de todos los tejidos de bazo e hígado fueron examinados “en ciego” a los grupos y tratamientos por el Profesor AP Dhillon, Profesor de Histopatología de University College London. A parte de los depósitos de amiloide presentes en los grupos dos y tres, y ausencia en el grupo 1, había cambios modestos que eran coherentes con inflamación crónica, aunque no todos, de los tejidos y no había diferencia entre los grupos.

Discusión.

Los ratones fueron todos sacrificados para estimar su carga amiloidea en el día 60 después de la última inyección de caseína y 28 días después del tratamiento de los grupos de prueba con anticuerpos antiSAP. Todos los ratones tenían depósitos de amiloide significativos antes de los tratamientos antiSAP o control, como se demuestra por125 retención de I-SAP medida 10 días después de la última inyección de caseína. No había diferencias significativas entre los grupos y había, como se esperaba, algún retroceso de depósitos de amiloide en unos pocos ratones de control al final del estudio. Sin embargo no había un único ratón entre los 62 animales control en grupos dos y tres que no tuviera nada de amiloide. Por el contrario 23 de los 31 ratones que recibieron anticuerpo antiSAP así como CPHPC no tenían amiloide detectable en el bazo o hígado. Los únicos depósitos de amiloide encontrados en animales tratados con antiSAP eran unas pocas motas microscópicas, de magnitud de orden menor que la mayoría de los depósitos presentes en 50 de 62 ratones que no recibieron antiSAP. Queda inequívocamente claro que el tratamiento antiSAP era responsable de esta notoria eliminación de los depósitos de amiloide en el grupo uno, mientras que los ratones que recibieron CPHPC y facciones IgG de ovino control de un antisuero no relacionado (grupo dos) tenían abundante amiloide idéntico en cantidad a los controles del grupo tres que no recibieron ningún tratamiento.

Los resultados del análisis histoquímico por tinción con rojo Congo se confirmaron por estimación del contenido de SAP humano de los bazos e hígados. No había SAP humano detectable en los bazos de 29 de 31 ratones en el grupo uno y solo cantidades traza en los dos animales restantes. Los animales del grupo tres control tenían cantidades significativas de SAP presente, que corresponde a su alta carga de amiloide, y los ratones del grupo dos tenían aproximadamente un cuarto del contenido de SAP humano, a pesar de que tenían la misma carga amiloide, ya que habían recibido CPHPC continuamente durante 33 días antes del sacrificio. Las concentraciones de SAP humano se redujeron en >90% en el suero de todos los ratones que recibieron CPHPC en ambos grupos uno y dos, comparado con el grupo control tres. Estos resultados demuestran la capacidad de CPHPC de disminuir SAP humano de la circulación mientras que cantidades significativas de SAP humano permanecen en los depósitos de amiloide para proporcionar el objetivo de los efectos terapéuticos de los anticuerpos antiSAP. La combinación de CPHPC y anticuerpos antiSAP por tanto es esencial para la presente invención: el fármaco de molécula pequeña limpia el plasma y los compartimentos de fluido extravascular de SAP humano de modo que la posterior administración de anticuerpo antiSAP puede alcanzar el SAP específicamente localizado en los depósitos de amiloide y allí realiza su función crucial de desencadenar el retroceso y eliminación de las fibrillas amiloideas.

Conclusión.

La combinación de tratamientos de individuos con depósitos de amiloide sistémico establecidos usando CPHPC y anticuerpos antiSAP causa de manera segura y eficaz la eliminación rápida y esencialmente completa de los depósitos. Nunca se ha logrado antes en ningún paciente o modelo animal o mediante cualquier método. La invención será aplicable a todas las formas de amiloidosis sistémica y local adquirida y heredada, y también a todas las otras enfermedades que están asociadas con depósitos de amiloide, que incluye enfermedad de Alzheimer y diabetes tipo 2.

Ejemplo: tratamiento de un paciente con amiloidosis sistémica usando CPHPC y anticuerpo antiSAP.

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Claims (1)

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