EA026959B1

EA026959B1 - Набор, содержащий агент, устраняющий sap, и анти-sap антитело, и способ лечения или профилактики амилоидной болезни

Info

Publication number: EA026959B1
Application number: EA201070063A
Authority: EA
Inventors: Марк Брайан Пепис
Original assignee: Пентрексин Терапьютикс Лимитед
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2017-06-30
Also published as: JP2010531338A; CA2691054C; CN101801372A; CA2729034C; EP2173341A1; CN101801372B; MX2009013840A; KR20100050495A; EA201070063A1; US20090191196A1; EP2173341B1; GB0712503D0; US20110166329A1; ES2582389T3; ES2729648T3; MX342991B; AU2008267148B2; JP5695903B2; AU2008267148A1; BRPI0813655A2

Abstract

Изобретение описывает применение соединения, которое устраняет сывороточный амилоидный P-компонент из циркуляции, в комбинации с антителом, специфичным в отношении сывороточного амилоидного P-компонента, для лечения или профилактики амилоидоза.

Description

Заявка на данное изобретение заявляет приоритет перед патентной заявкой Соединенного Королевства № 0712503.2, зарегистрированной 27 июня 2007 г.

Вышеупомянутая заявка и все документы, процитированные в ней во время рассмотрения (прилагающиеся процитированные документы), и все документы, процитированные или ссылочные в прилагающихся процитированных документах, и все документы, процитированные или ссылочные в настоящем документе (документы, процитированные в настоящей заявке), и все документы, процитированные или ссылочные в документах, процитированных в настоящей заявке, а также инструкции, описания и спецификации продуктов от производителей, и инструкции по применению любых продуктов, упомянутых в настоящем документе или в любом документе, включенном в настоящую заявку в качестве ссылки, включены в настоящую заявку в качестве ссылки и могут использоваться при практическом осуществлении настоящего изобретения.

Область техники

Изобретение, в основном, относится к лечению и/или профилактике заболеваний, при которых происходит отложение амилоида. В частности, изобретение относится к лечению амилоидоза.

Уровень техники

Амилоидоз представляет собой тяжелое и обычно смертельное заболевание, вызванное накоплением в тканях патологических нерастворимых белковых волокон, известных как амилоидные фибриллы.¹Последние происходят от различных белков при различных формах заболевания, но все амилоидные фибриллы имеют общую перекрестную-β сердцевинную структуру, и все возникают в результате неправильной укладки белков-предшественников с нормальной растворимостью.¹

Помимо самих амилоидных фибрилл, амилоидные отложения всегда содержат большое количество протеогликанов, некоторые из которых прочно связаны с фибриллами.² Нормальный нефибриллярный белок плазмы, сывороточный амилоидный Р-компонент (ЗАР), также присутствует в амилоидных отложениях в силу его авидного специфичного кальцийзависимого связывания со всеми типами амилоидных фибрилл.^{3, 4}

Человеческий §АР представляет собой конститутивный белок плазмы,⁵ в концентрации около 20-40 мг/л, и при общем содержании около 50-100 мг §АР в объединенных плазменных и экстраваскулярных компартментах как у нормальных индивидуумов, так и у пациентов, имеющих заболевания, не являющиеся амилоидозом.⁶ Напротив, у пациентов с амилоидозом §АР также специфичным образом концентрируется в амилоидных отложениях, а у индивидуумов с распространенным системным амилоидозом в амилоиде может содержаться до 20000 мг §АР.⁷

Амилоидные отложения являются внеклеточными, и они вызывают заболевание в результате прогрессирующего накопления до тех пор, пока они не повредят структуру и, таким образом, функцию, той ткани, которую они занимают.¹ Очень редко наблюдается воспалительная реакция или реакция по типу инородного тела на отложение амилоида как местно, в тканях, так и предположительная, по наличию системных маркеров воспаления. При так называемом системном амилоидозе отложения могут присутствовать в любой ткани или органе тела, но при указанных формах заболевания отложения никогда не наблюдаются в веществе головного мозга. Системный амилоидоз является причиной приблизительно 1 из 1000 всех смертей в развитых странах, и он всегда является смертельным, если не удается в достаточной степени и стойко уменьшить излишки белка, который является предшественником амилоидных фибрилл. Этого трудно добиться при многих формах амилоидоза и может вообще оказаться невозможным, и, таким образом, это представляет собой главную неудовлетворенную медицинскую потребность.¹’⁸ Локальные формы амилоидоза, при которых отложения ограничены одной анатомической областью или одной тканью или системой органов также существуют и могут вызывать серьезной заболева_ние. ^{1, 8}

При амилоидозе повреждение структуры и функции тканей и органов, которое приводит к клиническому заболеванию, определенно вызывается прогрессирующим накоплением самих амилоидных отложений. Однако существует ряд других состояний, при которых амилоидные отложения всегда присутствуют, из которых наиболее важными являются болезнь Альцгеймера и сахарный диабет 2 типа, при которых вклад отложения амилоида в патогенез заболевания, особенно, в утрату когнитивной функции и функции панкреатических островков, соответственно, не известен.¹ Однако амилоидные отложения в любом другом месте являются явно патогенными, и, возможно, что церебральные амилоидные отложения при болезни Альцгеймера и амилоидные отложения в островках при диабете 2 типа также приносят вред. Поскольку лечение, которое избавляет от амилоидных отложений при системном и локальном амилоидозе, несомненно будет оказывать лечебное действие,¹ удаление амилоидных отложений при болезни Альцгеймера и диабете 2 типа также должно быть клинически благоприятным.

Системный амилоидоз с отложением амилоидного А белка (АА) легко индуцировать у мышей с помощью хронического воспаления после внутривенной инъекции экстракта пораженной амилоидозом ткани, содержащей амилоидные фибриллы, и известной как фактор усиления амилоидоза.⁹ Указанная модель очень близко напоминает амилоидоз АА человека с основным отложением амилоида в селезенке и печени.¹⁰ При относительно коротком периоде индукции амилоида, например, как в экспериментах,

- 1 026959 описанных в настоящем документе, имеют место очень маленькие отложения амилоида в других местах. Белок АА, который образует амилоидные фибриллы, формируется из его циркулирующего предшественника, сывороточного амилоидного А белка (8АА), который представляет собой белок острой фазы. Концентрация 8АА в плазме резко повышается по сравнению с исходными следовыми величинами менее 5 мг/л в ответ на почти любую форму воспаления и повреждения ткани и может сохраняться на уровне 1000 мг/л или даже более, при постоянной стимуляции. Указанная повышенная продукция 8АА является необходимым предварительным условием для развития амилоидоза АА как у людей, так и у мышей, когда концентрация 8АА падает до нормальной, отложение амилоида останавливается, а существующие отложения амилоида могут регрессировать.^10-12 В отсутствие продолжительной продукции 8АА спонтанная регрессия отложений амилоида АА является универсальной на мышиной модели,¹¹ но продолжается с различной скоростью, которая должна быть должным образом подобрана к схеме терапевтических экспериментов.

Европейская патентная заявка ЕР 0915088 описывает соединения, которые представляют собой конкурентные ингибиторы связывания 8АР с амилоидными фибриллами, а также способы их изготовления. Предпочтительное соединение, описанное в ЕР 0915088 представляет собой (К)-1-[6-[(К)-2карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС), однако, любое из соединений, описанных в указанном источнике, или любое другое соединение, которое устраняет циркулирующий 8АР, можно использовать в практике настоящего изобретения. Международная патентная заявка \¥О 2004/099173, включенная в настоящий документ в качестве ссылки, также описывает палиндромные соединения, которые также можно использовать в практике настоящего изобретения.

У мышей, трансгенных по человеческому 8АР, человеческий 8АР присутствует как в циркуляции, так и в амилоидных отложениях. Лекарственное средство (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновая кислота (СРНРС) специфичным образом связызается с человеческим 8АР в комплекс, состоящий из двух нативных пентамерных молекул 8АР и 5 молекул СРНРС. Указанный комплекс распознается как отклонение от нормы печенью и очень быстро захватывается гепатоцитами и деградирует, что обеспечивает эффективное устранение 8АР из циркуляции.¹⁶ Концентрации 8АР в плазме остаются очень низкими на все время введения лекарственного средства.¹⁶ СРНРС чрезвычайно легко переносится, и ни само лекарственное средство, ни истощение 8АР, которое оно вызывает, не оказывают никакого неблагоприятного действия.¹⁶

Существует свидетельство клинического благоприятного действия лечения с использованием СРНРС пациентов-людей с системным амилоидозом, особенно в том, что касается сохранения функции почек у лиц с преимущественно почечным амилоидозом.

Однако несмотря на указанные многообещающие наблюдения, касающиеся СРНРС, быстрая и оптимальная эффективность, способная сохранять функцию органов и продлевать жизнь пациентов с системным амилоидозом, потребует значительного или полного клиренса амилоидных отложений.

Международная патентная заявка \¥О 04/059318 описывает способы, обеспечивающие усиление образования фиброцитов, которые включают в себя предоставление композиций, которые связывают 8АР. Указанные композиции включают в себя анти-8АР антитела и СРНРС. Однако \¥О 04/059318 не описывает лечение заболеваний, связанных с отложениями амилоида. Более того, 059318 не описывает конкретной комбинации анти-8АР антитела и СРНРС. Помимо этого, недавно полученные данные показывают, что 8АР не связан с ингибированием фиброцитов, и, следовательно, что 8АР не усиливает образование фиброцитов.²⁰

Соответственно, существует потребность в улучшенной терапевтической эффективности у пациентов с системным амилоидозом для сохранения функции органов и продления жизни.

Цитирование или идентификация любого документа в данной заявке не является допущением того, что указанный документ доступен в качестве прототипа настоящего изобретения.

Сущность изобретения

Изобретение основывается, по меньшей мере, частично, на неожиданном открытии того факта, что указанные выше цели в настоящее время могут достигаться лечением с использованием соединения, которое эффективно уменьшает количество человеческого 8АР в циркуляции, и дополнительным лечением с использованием антитела, специфичного в отношении 8АР.

Настоящее изобретение относится к набору для лечения амилоидоза, включающему соединение, которое устраняет сывороточный амилоидный Р-компонент из циркуляции, и антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС) и где указанный набор содержит инструкцию по последовательному введению указанных СРНРС и антитела, специфичного в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, для лечения амилоидоза. В одном из вариантов осуществления антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, представляет собой гуманизированное антитело.

Предпочтительно соединение, которое устраняет 8АР из циркуляции, представляет собой агент, осуществляющий поперечную сшивку 8АР. Было установлено, что соединения, способные осуществлять поперечную сшивку множества молекул 8АР в циркуляции, обеспечивают быструю элиминацию 8АР из

- 2 026959 циркуляции; см. ШО 03/013508. Примеры указанных соединений включают в себя мультивалентные лиганды, специфичные для 8АР, например мультивалентные конкурентные ингибиторы связывания 8АР. Конкурентные ингибиторы связывания 8ЛР с амилоидом представлены, например, в ЕР 0915088, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки; описано их применение и другие молекулы для извлечения 8АР из циркуляции, например, в ШО 03/013508 и в Реруз е! а1.,¹⁶ которые также целиком включены в настоящий документ в качестве ссылки. Международная патентная заявка ШО 2004/099173, включенная в настоящий документ в качестве ссылки, также описывает палиндромные соединения, которые также могли бы быть использованы в практике настоящего изобретения. Альтернативно, любое соединение, которое приводит к истощению циркулирующего 8АР, можно использовать в практике настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение, которое устраняет 8АР из циркуляции, представляет собой Ό-пролин; предпочтительными являются Ό-пролины формул

где К представляет собой

и группа К¹ представляет собой водород или галоген;

Χ-Υ-Χ' представляет собой линкер, имеющий по меньшей мере 4, преимущественно по меньшей мере 5, преимущественно по меньшей мере 6, до 20 линейных или прямоцепочечных атомов углерода, где X представляет собой -(СН₂)_п-; -Сн(К²)(СН2)п-; -СН2О(СН2)П-; СН2КН-; бензил, -С(К²)=СН-; СН2СН(ОН)-; или тиазол-2,5-диил;

Υ представляет собой -8-8-; -(СЩп-; -О-; -ΝΉ-; -Ν(Κ²)-; -СН=СН-; -ПНС(О)ПН-; -Ν(Κ²)Ο(Ο)Ν(Κ²)-; -Л[СН₂С₆Н₃(ОСН₃)₂]-; -Л(СН₂С₆Н₅)-; Д(СН₂С₆Н₅)С(ОЖСН₂С₆Н₅)-; Д(алкоксиалкил)-; Д(циклоалкилметил)-; 2,6-пиридил; 2,5-фуранил; 2,5-тиенил; 1,2-циклогексил; 1,3-циклогексил; 1,4-циклогексил; 1,2-нафтил; 1,4-нафтил; 1,5-нафтил; 1,6-нафтил; бифенилен; или 1,2-фенилен, 1,3-фенилен и 1,4-фенилен, где фениленовые группы необязательно замещены 1-4 заместителями, выбранными из галогена, низшего алкила, низшего алкокси, гидроксила, карбокси, -СОО-низшего алкила, нитрило, 5-тетразола, (2-карбоновая кислота пирролидин-1-ил)-2-оксоэтокси, Ν-гидроксикарбамимиодила, 5-оксо[1,2,4]оксадиазолила, 2-оксо[1,2,3,5]оксатиадиазолила, 5-тиоксо[1,2,4]оксадиазолила и 5-трет-бутилсульфанил[1,2,4]оксадиазолила;

X' представляет собой -(СН2)п-; -(СН2)пСН(К²)-; -(СН2АСН2-; -^ЫНСН-; бензил, -СН=С(К²)-; СН(ОН)СН2- или тиазол-2,5-диил;

К² представляет собой низший алкил, низший алкокси или бензил, и п представляет собой 0-3, или их фармацевтически приемлемую соль или моно- или диэфир. Соединение, которое изымает 8АР из циркуляции, включая предпочтительные варианты, упомянутые выше, в настоящем документе называется 8АР-устраняющим соединением.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения Ό-пролин формулы Ι-А, выше, можно записать как лиганд-линкер-лиганд, где часть Χ-Υ-Χ' формулы Ι-А образует линкер. В объем настоящего изобретения входит то, что линкер (Χ-Υ-Χ') может составлять от 4 до 20 линейных атомов углерода в длину, включая 4-15 линейных атомов углерода, 5-10 линейных атомов углерода и 6-8 линейных атомов углерода в длину. Линкер может представлять собой прямую или разветвленную цепь или может необязательно образовывать одну или более кольцевых структур, при условии, что по меньшей мере 4 линейных или прямоцепочечных атомов углерода присутствуют в линкере. В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из линейных или прямоцепочечных атомов С может быть необязательно замещен по меньшей мере одним гетероатомом, выбранным из Ν, О или 8, преимущественно О или 8, предпочтительно О.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения Ό-пролин представляет собой (К)-1-[6[(К)-2-карбоксипирролидин-1 -ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС).

Предпочтительно набор не содержат этаноламины, и/или фосфоэтаноламины, и/или 4,6-пируватацетил-3-О-галактопиранозу, и/или кальций, и/или 1Ь-4, и/или 1Ь-3.

Предпочтительно набор не предназначен для усиления образования фиброцитов.

Преимущественно набор не усиливает образование фиброцитов. Предпочтительно указанное антитело, специфичное в отношении 8АР, не нацелено на часть 8АР, которая, как утверждается, является

- 3 026959 функциональной для ингибирования образования фиброцитов из моноцитов.

Амилоидное заболевание, упоминающееся в настоящем документе, может представлять собой любое заболевание, которое связано с внеклеточным отложением амилоидных фибрилл в тканях. Например, амилоидное заболевание представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из любой формы системного (висцерального) или локального амилоидоза, диабета 2 типа и болезни Альцгеймера.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 8АР представляет собой человеческий 8АР, а ссылки на анти-8АР антитела и 8АР-устраняющие соединения, предпочтительно, представляют собой соединения, которые нацелены и/или устраняют человеческий 8АР.

Настоящее изобретение относится также к применению соединения, которое устраняет сывороточный амилоидный Р-компонент из циркуляции, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС), для последовательного введения с антителом, специфичным в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, для лечения или профилактики амилоидоза. В одном из вариантов осуществления антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, представляет собой гуманизированное антитело.

Лечение с использованием 8АР-устраняющего соединения, определенного в настоящем документе, почти полностью устраняет человеческий 8АР из циркуляции, но оставляет значительные количества 8АР, связанного с амилоидными отложениями в тканях. Наибольшее изъятие 8АР из амилоидных отложений, которое наблюдалось у пациентов-людей, составляет 90% после месяцев непрерывного введения СРНРС. Внутривенная инфузия антител против человеческого 8ЛР пациентам, у которых циркулирующий 8ЛР был изъят, делает возможной локализацию и специфичное связывание антител с амилоидными отложениями и способствует их быстрой и распространенной регрессии, с соответствующим клиническим улучшением.

Комбинированное лечение лиц с установившимися системными амилоидными отложениями с использованием 8АР-устраняющего соединения и анти-8АР антител безопасно и эффективно вызывает быстрое и практически полное устранение отложений. Настолько известно заявителям, подобный намеренный, быстрый и прицельный клиренс установившихся амилоидных отложений никогда ранее не достигался ни у каких пациентов или экспериментальных животных или посредством любого другого способа.

Преимущественно, поскольку 8АР присутствует зо всех амилоидных отложениях всех типов при заболеваниях человека, связанных с отложением амилоида, включая амилоидоз, болезнь Альцгеймера и диабет 2 типа, указанный подход к лечению является применимым при всех указанных состояниях. Предпочтительно настоящее изобретение предназначено для лечения амилоидоза.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики амилоидной болезни, включающему последовательное введение субъекту, который в этом нуждается, соединения, которое устраняет сывороточный амилоидный Р-компонент из циркуляции, и антитела, специфичного в отношении сывороточного амилоидного Р-компонента, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексансил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС). В предпочтительном варианте осуществления изобретения амилоидная болезнь выбрана из группы, состоящей из системного амилоидоза, локального амилоидоза, заболеваний, связанных с отложением амилоида, болезни Альцгеймера и диабета 2 типа.

8АР-устраняющее соединение и антитело можно вводить одновременно, например, по отдельности, или в смеси, или последовательно. В одном варианте осуществления настоящего изобретения схема лечения включает в себя введение лишь одного 8АР-устраняющего соединения, с последующим введением антитела. Необязательно, введение 8АР-устраняющего соединения можно продолжать во время введения антитела.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения 8АР-устраняющее соединение и анти8АР антитело вводят последовательно, таким образом, что 8АР-устраняющее соединение вводят до введения антитела. Введение можно осуществлять в течение продолжительного периода времени, путем инфузии, повторных болюсных доз или любым другим путем; или можно использовать введение однократной дозы, при котором 8АР-устраняющее соединение и/или антитело вводят только один раз.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения 8АР-устраняющее соединение вводят в течение продолжительного периода времени, но антитела вводят в виде однократной дозы.

Отмечается, что в данном описании и, особенно, в формуле и/или пунктах формулы изобретения такие термины как включает в себя, включающий в себя и т.п. могут иметь значение, которое придается им в патентном законе США; например, они могут означать содержит, содержащий и т.п.; и что такие термины, как состоящий преимущественно из и состоит преимущественно из, имеют значение, которое придается им в патентном законе США; например, они предусматривают элементы, не перечисленные подробно, но исключают элементы, которые находятся в прототипах, или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения.

Указанные и другие варианты осуществления настоящего изобретения описаны в следующем подробном описании или с очевидностью вытекают из него или охватываются им.

- 4 026959

Краткое описание фигур

Следующее подробное описание, приведенное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения настоящего изобретения только конкретными описанными вариантами, будет наилучшим образом понятно в сочетании с прилагающимися чертежами, на которых показано:

фиг. 1 - амилоидные отложения в селезенке мышей после лечения. Три группы близко подобранных мышей чистой линии С57ВЬ/6, трансгенной в отношении человеческого ЗАР, с нокаутом мышиного 8ЛР, с установившимся системным АА-амилоидозом, с одной и той же первоначальной амилоидной нагрузкой по результатам задержки ¹²⁵1-8АР во всем теле, лечили, соответственно, с использованием СРНРС и однократной дозы овечьего античеловеческого анги-ЗАР антитела, только СРНРС или вообще не лечили, а затем их умерщвляли для оценки амилоидной нагрузки 28 днями позже. Каждый пункт представляет сумму баллов амилоида для одного животного: 0, амилоид не выявлен; 10⁰, следовые пятна; 10¹, перифолликулярные следы; 10², генерализованные перифолликулярные отложения; 10³, выраженные перифолликулярные отложения; 10⁴, генерализованные перифолликулярные и внутрифолликулярные отложения. По и-критериям Манна-Уитни для разницы между суммами баллов в группах величины Р были следующими: группа 1 по сравнению с группой 2 Р=0,0000; группа 1 по сравнению с группой 3 Р=0,0000; группа 2 по сравнению с группой 3 Р=0,2635. Не наблюдалось разницы в суммах баллов амилоида между самцами и самками во всех группах (не показано);

фиг. 2 - амилоидные отложения в печени мышей после лечения. Три группы близко подобранных мышей чистой линии С57ВЬ/6, трансгенной в отношении человеческого ЗАР, с нокаутом мышиного ЗАР, с установившимся системным АА-амилоидозом, с одной и той же первоначальной амилоидной нагрузкой по результатам задержки ¹²⁵1-ЗАР во всем теле, лечили, соответственно, с использованием СРНРС и однократной дозы овечьего античеловеческого анти-ЗАР антитела, только СРНРС или вообще не лечили, а затем их умерщвляли для оценки амилоидной нагрузки 28 днями позже. Каждый пункт представляет сумму баллов амилоида для одного животного: 0, амилоид не выявлен; 10⁰, следовые пятна; 10¹, следы в/вокруг большинства воротных путей; 10², значительные отложения в/вокруг большинства воротных путей; 10³, воротные и паренхимальные отложения; 10⁴, массивные воротные и паренхимальные отложения. По и-критериям Манна-Уитни для разницы между суммами баллов в группах величины Р были следующими: группа 1 по сравнению с группой 2 Р=0,0000; группа 1 по сравнению с группой 3 Р=0,0000; группа 2 по сравнению с группой 3 Р=0,4740. Не наблюдалось разницы в суммах баллов амилоида между самцами и самками во всех группах (не показано);

фиг. 3 - амилоидные отложения, окрашенные конго красным и просмотренные в ортогональном поляризованном свете. Амилоид идентифицировали по его патогномоничному зеленому двойному лучепреломлению, которое следует отличать от белого или другого светлого двойного лучепреломления коллагена в тканях и артефактов инородных тел, пыли и т.п. Сумма баллов амилоида в селезенке: 7722, ноль (амилоид отсутствует); 7723, 10⁰ (присутствует одиночное пятно); 7482, 10¹; 6865, 10²; 7481, 10³; 8272, 10⁴. Сумма баллов амилоида в печени: 6980, ноль (зеленое двойное лучепреломление амилоида отсутствует, только белое-желтое двойное лучепреломление коллагена); 7482, 10¹; 8028, 10²; 8156, 10³; 8272, 10⁴; фиг. 4 - клеточная инфильтрация и деструкция амилоида с течением времени после введения антиЗАР антитела. Срезы селезенки, окрашенные конго красным и просмотренные в поляризованном свете (слева) и окрашенные гематоксилин-эозином (справа), от животных, умерщвленных в определенное время после лечения антителом. На день 1 (фиг. 4А) в изобилии имелось зеленое двойное лучепреломление амилоида в типичной перифолликулярной маргинальной зоне, но, в противоположность его обычному бесклеточному внешнему виду, он был плотно инфильтрирован преимущественно мононуклеарными клетками воспаления. На день 2 (фиг. 4В) макрофаги, окружающие амилоид, уже сливались, образуя многоядерные гигантские клетки. На день 4 (фиг. 4С) отложения амилоида отчетливо меньше распространены и фрагментированы в связи с интенсивной фагоцитарной активностью макрофагов и многочисленными многоядерными гигантскими клетками, окружающими и поглощающими островки амилоида. На день 7 (фиг. 4Ό) присутствовало значительно меньше амилоида и меньше гигантских клеток, однако они все еще отчетливо содержали деградировавшие фрагменты амилоида;

фиг. 5 - электронные микрофотографии селезенки, сделанные через 1 день после лечения с использованием анти-ЗАР антитела; фиг. 5А, макрофаги (вверху справа), окружающие типичное фибриллярное отложение амилоида (в центре и слева); увеличение х4500. фиг. 5В, гранулоциты (верхняя половина изображения) и отложение амилоида (нижняя половина изображения); нейтрофилы и макрофаги имеют более темную цитоплазму; один эозинофил виден в центре изображения; х3000. фиг. 5С, увеличенный фрагмент амилоидного отложения, гранулоциты и макрофаги (также видно на 5В); х7000;

фиг. 6 - иммунохимическая идентификация клеток и белков при опосредованном анти-ЗАР антителом клиренсе амилоидных отложений. Две верхние панели показывают интенсивную инфильтрацию макрофагами, идентифицированную сильным окрашиванием с использованием анти-Р4/80, всех конгофильных амилоидных отложений в селезенке и печени. Указанное окрашивание полностью отсутствует в амилоидных отложениях мышей, не получавших лечения анти-ЗАР антителом (не показано). Третья панель показывает совместную локализацию АА-амилоида, СЭ68 (маркера фагоцитарной эндоцитозной

- 5 026959 активности) и мышиного С3. Нижняя панель показывает фагоцитарно активные макрофаги, окружающие и поглощающие фрагмент мышиного АА-амилоида. фиг. 6А показывает на день 1 селезенку с конго красным, слева; с анти-Р4/80, справа; фиг. 6В показывает на день 1 печень, с конго красным, слева; с анти-Р4/80, справа; фиг. 6С показывает на день 4 селезенку с анти-АА белком, слева; с анти-СН68, в центре; с антимышиным С3, справа; фиг. 6И представляет собой на день 4 конфокальное изображение с анти-С.Н68. красное; с анти-АА белком, зеленое; ядерное контрастное окрашивание, синее;

фиг. 7 - иммуногистохимическое окрашивание античеловеческим §АР антителом в селезенке мышей дикого типа с амилоидозом после инъекции изолированного чистого человеческого 8АР. Имеется выраженное положительное окрашивание всех амилоидных отложений в их типичной маргинальной зоне распределения. Указанный связанный человеческий §АР представляет собой мишень для терапевтического анти-§АР антитела по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Амилоидоз.

Аспекты настоящего изобретения относятся к лечению и/или предупреждению заболевания, вызванного отложением амилоида в тканях; указанное заболевание известно как амилоидоз.

Термины профилактика, предотвращение, предотвращать, подавление, подавлять, используемые в настоящем документе, относятся к образу действия (такому как введение одного или более соединений или фармацевтических композиций), инициированному (например, до появления клинических симптомов амилоидоза), чтобы предотвратить, подавить или уменьшить, как на временной, так и на постоянной основе, возникновение клинической манифестации амилоидоза.

Термины лечение, лечить, используемые в настоящем документе, относятся к образу действия (такому как введение одного или более соединений или фармацевтических композиций), инициированному после появления клинических манифестаций амилоидоза, чтобы устранить или уменьшить, как на временной, так и на постоянной основе, клиническую манифестацию или прогрессирование амилоидоза.

Амилоидоз представляет собой любое заболевание, характеризующееся внеклеточным накоплением амилоида в различных органах и тканях тела.

Термин амилоид относится к внеклеточным отложениям в тканях нерастворимых белковых волокон, состоящих из фибрилл с характерной ультраструктурной морфологией, перекрестной β слоистой структурой сердцевины и патогномоничным гистохимическим свойством окрашиваться краской конго красным из щелочного спиртового раствора, а затем давать красно-зеленый дихроизм при микроскопическом просмотре в сильном перекрестном поляризованном свете. Известно около 25 различных неродственных белков, формирующих амилоидные фибриллы, которые откладываются в тканях человека и имеют все указанные общие типичные свойства. Амилоидные отложения в веществе головного мозга, церебральный амилоид, несколько отличаются от амилоидных отложений в других областях тела в том, что они всегда являются очаговыми и имеют микроскопические размеры, и обычно называются амилоидными бляшками.

Амилоидоз, т.е. заболевание, непосредственно вызванное отложением амилоида в тканях, включает в себя как локальный амилоидоз, при котором отложения ограничены одной анатомической областью и/или одной тканью или системой органов, так и системный амилоидоз, при котором отложения могут наблюдаться в любом органе или ткани тела, включая кровеносные сосуды и соединительные ткани. Причина амилоидоза может быть приобретенной или наследственной. Приобретенный амилоидоз возникает как осложнение предшествующего медицинского состояния, которое само по себе может быть как приобретенным, так и наследственным. Так, реактивный системный амилоидоз, известный как амилоидоз с отложением амилоидного А белка (АА), представляет собой осложнение хронических активных воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Крона, хронические инфекции и хронический сепсис, или наследственных периодических лихорадочных синдромов, таких как семейная средиземноморская лихорадка, синдром Макла-Уэльса и синдром СГИСА. Амилоидоз, связанный с диализом, вызывается накоплением в₂-микроглобулина как результата терминальной почечной недостаточности. Амилоидоз с участием моноклональных легких цепей иммуноглобулинов (АЬ-амилоидоз) представляет собой осложнение множественной миеломы или другой моноклональной гаммапатии (моноклональной гаммапатии неопределенного значения, МСИ8). Приобретенный амилоидоз транстиретинового типа может наблюдаться в отсутствии какого бы то ни было предшествующего заболевания и является лишь осложнением старческого возраста. Наследственный амилоидоз вызывается мутациями в генах различных белков, которые кодируют экспрессию вариантных белков, имеющих повышенную склонность к образованию амилоидных фибрилл, и включает в себя заболевание, вызванное транстиретином, аполипопротеином А1, гелзолином, лизоцимом, цистатином С и амилоидным β-белком. Всесторонние описания всех различных форм амилоидоза и участвующих в нем белков доступны в учебниках и научной литературе.¹’⁸’²¹

Локальное амилоидное отложение, ограниченное одним органом или тканью, может не проявляться клинически или может вызывать тяжелое повреждение тканей и заболевание. Например, церебральная амилоидная ангиопатия, при которой сосудистые амилоидные отложения состоят из Αβ-белка, обычно

- 6 026959 представляет собой спорадическое приобретенное состояние, возникающее по непонятным причинам в отсутствии любой другой патологии, и представляет собой главную причину кровоизлияния в мозг и инсульта. Существует несколько весьма важных и распространенных заболеваний, в частности болезнь Альцгеймера и диабет 2 типа, при которых амилоидные отложения всегда имеют место, но при которых точные механизмы, вызывающие указанные соответствующие заболевания, до сих пор не известны. Тем не менее локальное отложение амилоида в головном мозге и церебральных кровеносных сосудах при болезни Альцгеймера, а также в панкреатических островках при диабете, весьма вероятно, вызывают обострение патологии и заболевания. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение относится к лечению как болезни Альцгеймера, так и диабета 2 типа, на самом деле, любого состояния, связанного с наличием амилоидных отложений в тканях.

Многие формы инфекционной губчатой энцефалопатии (прионные заболевания) связаны с амилоидными отложениями в головном мозге, и настоящее изобретение, таким образом, относится ко всем указанным состояниям, включая вариантную болезнь Крейцфельда-Якоба у людей, саму болезнь Крейцфельда-Якоба, куру и различные другие формы человеческих прионных заболеваний, а также коровье бешенство, хроническую гомологичную болезнь мулов-оленей и лосей и инфекционную энцефалопатию норок.

Предполагается также лечение животных, включая домашнюю птицу, такую как цыплята, утки, индейки и гуси, и, предпочтительно, людей, а также собак, кошек, лошадей, коров, овец, свиней, морских свинок, мышей и крыс. В частности, лечение людей является предпочтительным.

Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к δΑΡ-устраняющему соединению в комбинации с антителом, специфичным в отношении 8ΑΡ, для применения для лечения амилоидоза.

Анти-δΑΡ антитело.

Упоминающиеся в настоящем документе ссылки на анти-δΑΡ антитела, δΑΡ-связывающие антитела и антитела, специфичные в отношении 8ΑΡ, являются сходными и относятся к антителам или связывающим фрагментам, полученным из антител, которые связываются с 8ΑΡ специфичным образом и практически не вступают в перекрестные взаимодействия с другими молекулами, присутствующими в циркуляции. В частности, антитела по настоящему изобретению нацелены на 8ΑΡ, который связан с амилоидными фибриллами в тканевых амилоидных отложениях.

8ΑΡ представляет собой пентамер с 5 идентичными, нековалентно связанными протомерами, на каждом из которых располагается один кальцийзависимый лигандсвязывающий сайт на плоской передней поверхности, связывающей (В) передней поверхности, молекулы. В отсутствии кальция человеческий 8ΑΡ образует стабильные декамерные димеры, возможно, посредством взаимодействия Αповерхностей. В присутствии кальция выделенный человеческий 8ΑΡ быстро образует агрегаты и выпадает в осадок, в результате образования молекулярной решетки благодаря связыванию открытого для взаимодействия карбоксилата остатка С1и167 на одной молекуле 8ΑΡ с кальцийзависимым лигандсвязывающим сайтом на другой молекуле 8ΑΡ. Указанная аутоагрегация 8ΑΡ ингибируется другими лигандами, с которыми 8ΑΡ связывается.

Антитело, используемое в настоящем документе, включает, без ограничения, поликлональные, моноклональные, рекомбинантные, химерные, с трансплантированной определяющей комплементарность областью (СОК), одноцепочечные, биспецифичные, фрагменты РаЬ, полученные из библиотеки экспрессии РаЬ. Указанные фрагменты включают в себя фрагменты полных анти-8ΑΡ антител, которые сохраняют свою связывающую активность в отношении 8ΑΡ, Ρν, Р(аЬ'), Р(аЬ')₂ фрагменты и Ρ(ν) антительные фрагменты, а также слитые белки и другие синтетические белки, которые включают в себя антиген-связывающий сайт анти-8ΑΡ антитела. Помимо этого, антитела и их фрагменты могут представлять собой гуманизированные антитела, как более подробно описано ниже.

Вариабельные области и СОК в последовательности антитела можно идентифицировать путем выстраивания последовательностей в ряд и сравнения их с базой данных известных вариабельных областей. Способы идентификации указанных областей описаны, например, в Койегтаии и ОнЬс1. изд., ЛпиЬобу Еидшеегтд, 8ргт§ег, Νον Уогк, ΝΥ, 2001. Базы данных антительных последовательностей описаны, например, в νΒΑ8Ε2 на №№№^Ьаке2.огд, как описано в Кейег е1 а1., Νηο1. Αείάκ Кек., 33 (Па1аЬаке 15кие): Ό671-Ό674 (2005).

Моноклональное анти-8ЛΡ антитело, полученное от мышей, является коммерчески доступным из различных источников, таких как 8^дта-Α1ά^^сЬ, ОШшдйат, Оогке!, ИК (№ в каталоге А9191); И8 Вю1одюа1 (№ в каталоге 81003-4); Αετίκ ΑΛ^^κ (№ в каталоге ВМ225); Катуа Вютебюа1 Со. (№ в каталоге МС-978); Се11 8с1еисек (№ в каталоге ΜΟΝ 6006); ΑЬиоνа Согр. (№ в каталоге Н00000325-М07).

Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из одного клона плазматических клеток, полученных из В-лимфоцитов, продуцирующих гомогенное антитело одного класса тяжелой и легкой цепи и эпитопной специфичности.

Моноклональные антитела обычно являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта (эпитопа), в противоположность стандартным антителам в составе антисыворотки, индуцированной в целом организме животного путем иммунизации конкретным антигеном. Указанные стандартные антитела получают из множества различных клонов В-лимфоцитов, которые распознают

- 7 026959 одни и те же или разные эпитопы на иммунизирующем антигене, и которые известны как поликлональные антитела. Помимо их весьма ограниченной специфичности, моноклональные антитела легко продуцируются в чистой форме, не контаминированной другими иммуноглобулинами, в то время как выделение специфичных антител из поликлональной антисыворотки требует трудоемких процедур иммунной очистки. Моноклональные антитела можно получать с использованием гибридомного метода (см. КоЫег е! а1., №1иге, 256:495-7, 1975) или с использованием методов рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела можно выделять даже из фаговых библиотек антител с использованием хорошо известных методик.

В гибридомном методе животное-хозяина, обычно мышь, иммунизируют желаемым антигеном для генерации клонов В-лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфичным образом связываются с указанным антигеном. Лимфоциты, собранные у иммунизированного животного, затем гибридизируют ίη νίΐΐΌ с непрерывной линией миеломных клеток, выращенных ίη νίίΓΟ, с образованием так называемых гибридомных клеток. Затем их отбирают путем выращивания на подходящей культуральной среде, которая позволяет выживать только гибридизированным клеткам, но не неслитым, родительским миеломным клеткам. Примеры миеломных клеток включают в себя, без ограничения, человеческие миеломные и мышиные-человеческие гетеромиеломные клеточные линии, которые были описаны для продукции человеческих моноклональных антител.

Культуральную среду от растущих гибридомных клеток можно подвергать анализу на предмет моноклональных антител, направленных против антигена. Связывающую специфичность антител, выработанных клетками, можно определить различными способами, такими как иммунопреципитация или анализ связывания ίη νίίΓΟ, такой как радиоиимуноанализ (ΚΙΑ) или твердофазный иммуносорбентный анализ (ΕΕΙδΑ).

После того как гибридомные клетки идентифицировали как продуцирующие желаемые антитела, клоны можно подвергать субклонированию путем ограничивающих процедур разведения и выращивать с использованием стандартных методик. Моноклональные антитела, секретированные субклонами, выделяют из культуральной среды или сыворотки с использованием хорошо известных процедур выделения иммуноглобулинов, таких как белковая Α-сефароза, электрофорез в геле, диализ, гидроксиапатитная хроматография или аффинная хроматография.

Поликлональные антитела могут вырабатываться животными после многократных подкожных, внутримышечных или интраперитонеальных инъекций релевантного антигена и адъюванта. Улучшенный антительный ответ можно получить конъюгированием релевантного антигена с белком, который является иммуногенным для вида, подвергающегося иммунизации. Животных можно иммунизировать против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем комбинирования, например, 100 или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов и мышей, соответстзенно) с полным адъювантом Фрейнда и внутрикожной инъекции раствора во многие места. Животных затем подвергают антигенной стимуляции с использованием 1/5 оригинального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции во многие места. На 7-14-й день после бустерной инъекции у животных можно получать кровь, а сыворотку исследовать на предмет титра антител.

Анти-δΑΡ антитела и фрагменты также включают в себя варианты анти-δΑΡ антител и их фрагмнты. Варианты включают в себя пептиды и полипептиды, включающие в себя одно или более замещений, делеций и/или добавлений в аминокислотных последовательностях, которые имеют ту же или практически ту же аффинность и специфичность связывания с эпитетом, как анти-δΑΡ антитело или его фрагменты.

Делеции, инсерции или замещения аминокислотных остатков могут вызвать молчащие изменения и давать функционально эквивалентное вещество. Намеренные аминокислотные замещения можно осуществлять на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; а аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, обладающие сходными величинами гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин. Г лутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.

Консервативные замещения можно осуществлять, например, в соответствии с таблицей, приведенной ниже. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут замещать друг друга:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неполярные	САР
1ЬУ
Полярные-незаряженные	сзтм
N0
Полярные- заряженные	ΏΕ
КН
АРОМАТИЧЕСКИЕ		НЕМУ

- 8 026959

Может иметь место гомологичное замещение (замещение и замена в настоящем документе обозначают замену существующего аминокислотного остатка альтернативным остатком), т.е. замещение подобного подобным, такое как основного на основное, кислотное на кислотное, полярное на полярное и т.п. Также может иметь место негомологичное замещение, т.е. остатка одного класса на остаток другого класса или, альтернативно, включение ненатуральных аминокислот, таких как орнитин (далее в настоящем документе называемый Ζ), соль орнитина и диаминомасляной кислоты (далее в настоящем документе называемой В), норлейцинорнитин (далее в настоящем документе называемый О), пириилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.

Замещения также можно осуществлять с использованием ненатуральных аминокислот, включая а* и α-дизамещенные* аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты*, молочную кислоту*, галоидные производные натуральных аминокислот, такие как трифтортирозин*, р-С1-фенилаланин*, р-Вг-фенилаланин*, р-1-фенилаланин*, Ь-аллилглицин*, β-аланин*, Ь-а-аминомасляную кислоту*, Ь-у-аминомасляную кислоту*, Ь-а-аминоизомасляную кислоту*, Ь-е-аминокапроновую кислоту#, 7-аминогептановую кислоту*, Ь-метионинсульфон#*, Ь-норлейцин*, Ь-норвалин*, р-нитро-Ь-фенилаланин*, Ь-гидроксипролин#, Ь-тиопролин*, метильные производные фенилаланина (РЬе), такие как 4-метил-РЬе*, пентаметил-РЬе*, Ь-РЬе(4-амино)#, Ь-Туг(метил)*, Ь-РЬе(4-изопропил)*, Ь-Т1е(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3карбоновую кислоту)#, Ь-диаминопропионовую кислоту# и Ь-РЬе(4-бензил)*. Пометка * используется для целей приведенного выше обсуждения (относящегося к гомологичному и негомологичному замещению) для обозначения гидрофобной природы производного, в то время как # используется для обозначения гидрофильной природы производного, #* указывает на амфипатические свойства.

Таким образом, варианты могут включать в себя пептиды и полипептиды, включающие в себя одно или более замещений, делеций и/или добавлений в аминокислотной последовательности анти-ЗЛР антител и их фрагментов, в которых указанные замещения, делеции и/или добавления не вызывают существенных изменений в аффинности и специфичности связывания с эпитопом. Например, вариант анти-ЗЛР антитела или его фрагмента может получаться благодаря одному или более изменениям анти-ЗЛР антитела или его фрагмента, когда измененное анти-ЗЛР антитело или его фрагмент имеет ту же или практически ту же аффинность и специфичность связывания с эпитопом, что и исходная последовательность. Варианты могут встречаться в естественных условиях, такие как аллельные или сплайсинг-варианты, или могут быть искусственно сконструированы. Варианты могут быть изготовлены из соответствующих молекул нуклеиновых кислот, кодирующих указанные варианты. Варианты анти-ЗЛР антител или их фрагментов могут иметь изменения в аминокислотных последовательностях легких и/или тяжелых цепей, которые встречаются в естественных условиях или внедрены путем ίη νίίτο изменения нативных последовательностей с использованием методики рекомбинантной ДНК. Встречающиеся в естественных условиях варианты включают в себя соматические варианты, которые генерируются ίη νίνο в соответствующих нуклеотидных последовательностях зародышевых линий во время генерации антительного ответа на инородный антиген.

Варианты 8АР-связывающих антител и связывающих фрагментов также можно изготавливать с использованием методики мутагенеза. Например, аминокислотные изменения можно вводить случайным способом в кодирующую антитело область, а полученные варианты можно подвергать скринингу на предмет аффинности связывания 8АР или другого свойства. Альтернативно, аминокислотные изменения можно вводить в выбранные области анти-8АР антитела, такие как СОК легких и/или тяжелых цепей и/или каркасная область, а полученные антитела можно подвергать скринингу на предмет аффинности связывания §АР или какой-либо другой активности. Аминокислотные изменения заключают в себе одно или более замещений в СОК, от различия по единственной аминокислоте до введения множественных перестановок аминокислот в пределах данной СОК. Также охватываются варианты, генерированные инсерцией аминокислот с увеличением размера СОК.

Можно создавать анти-8АР антитела и их фрагменты с модифицированной областью Ре, когда нативную область Рс модифицируют для увеличения полупериода существования антитела или фрагмента в биологическом окружении, например, полупериода существования в сыворотке крови или полупериода существования по измерениям ίη νίίτο.

Варианты также включают в себя анти-8АР антитела или их фрагменты, включающие в себя модифицированную область Рс, в которых модифицированная область Рс включает в себя по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с областью Рс дикого типа. Вариантную область Рс можно конструировать относительно сравнимой молекулы, включающей в себя область Рс дикого типа, таким образом, чтобы связывать рецепторы Рс с большей или меньшей аффинностью. Например, 8АРсвязывающие антитела и их фрагменты могут включать в себя модифицированную область Рс. Область Рс относится к встречающимся в естественных условиях или синтетическим полипептидам, гомологичным С-терминальному домену 1§О, который образуется в результате расщепления 1§О папаином. Рс 1§О имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. В антителах и фрагментах можно использовать полную область Рс или только увеличивающую полупериод существования часть. Помимо этого, множество модификаций в аминокислотной последовательности являются приемлемыми, поскольку нативная ак- 9 026959 тивность не во всех случаях является необходимой или желательной.

δΑΡ-связывающие антитела и их фрагменты также охватывают производные антител, фрагментов и последовательностей, описанные в настоящем документе. Производные включают в себя полипептиды или пептиды или их варианты, фрагменты или производные, которые были химически модифицированы. Примеры включают в себя ковалентное присоединение одного или более полимеров, таких как водорастворимые полимеры, Ν-присоединенные или О-присоединенные углеводы, сахара, фосфаты и/или другие подобные молекулы. Производные модифицированы таким образом, что отличаются от встречающихся в естественных условиях или исходных пептидов или полипептидов как по типу, так и по локализации присоединенных молекул. Производные также включают в себя делецию одной или более химических групп, которые встречаются в естественных условиях в пептиде или полипептиде.

Настоящее изобретение относится также к δΑΡ-связывающим антителам, которые включают в себя две тяжелые цепи полной длины и две легкие цепи полной длины. Альтернативно, δΑΡ-связывающие антитела могут представлять собой такие конструкции как одноцепочечные антитела или миниантитела, которые сохраняют связывающую активность в отношении δΑΡ. Указанные конструкции можно изготавливать способами, хорошо известными специалистам.

Способы создания версий рекомбинантной ДНК антиген-связывающих областей молекул антител, которые избегают генерации моноклональных антител, рассматриваются для δΑΡ-связывающих антител и их фрагментов. ДНК клонируют в бактериальную экспрессирующую систему. В одном примере указанной методики используют систему лямбда-вектора бактериофага, имеющую лидерную последовательность, которая вызывает миграцию экспрессированного белка РаЬ в периплазматическое пространство (между клеточной мембраной и клеточной стенкой бактерии) или его секрецию. Можно быстро генерировать и подвергнуть скринингу большие количества функциональных фрагментов РаЬ на предмет связывания с δΑΡ. Указанные δΑΡ-связывающие агенты (фрагменты РаЬ со специфичностью в отношении полипептида δΑΡ) специфичным образом входят в состав δΑΡ-связывающих антител и их фрагментов.

δΑΡ-связывающие антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными, т.е. гуманизированными способами генной инженерии антителами. Используемый в настоящем документе термин гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляет собой рекомбинантный полипептид, который включает в себя часть антиген-связывающего сайта из нечеловеческого антитела и части рамки и/или константных областей человеческого антитела. Гуманизированное способами генной инженерии антитело или фрагмент антитела представляет собой нечеловеческое (например, мышиное) антитело, которое было сконструировано модификацией (например, делецией, инсерцией и/или замещением) аминокислот на конкретных позициях таким образом, чтобы уменьшить или устранить любую поддающуюся определению иммуногенность модифицированного антитела для человека.

Гуманизированные антитела включают в себя химерные антитела и антитела с трансплантированными СОК. Химерные антитела представляют собой антитела, которые включают в себя вариабельную область нечеловеческого антитела, присоединенную к человеческой константной области. Таким образом, в химерных антителах вариабельная область является, обычно, нечеловеческой, а константная область является человеческой. Химерные антитела и способы их получения описаны, например, в Ρτοο. Ναΐΐ. ЛсаТ δα. υδΑ, 81:6841-6855 (1984). Несмотря на то что они могут быть менее иммуногенными, чем мышиное моноклональное антитело, введение химерных антител было связано с человеческими иммунными ответами (ΗΑΜΑ) на нечеловеческую часть антител. Химерные антитела также можно изготавливать сплайсингом генов из молекулы мышиного антитела с подходящей антиген-связывающей специфичностью с генами из молекулы человеческого антитела с подходящей биологической активностью, такой как способность активировать человеческий комплемент и опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность ^06(6.¹). Одним примером является замена области Рс областью отличающегося изотипа.

Антитела с трансплантированной СОК представляют собой антитела, которые включают в себя СОК нечеловеческого донорского антитела, соединенную с каркасной областью человеческого реципиентного антитела. Обычно антитела с трансплантированной СОК включают в себя больше человеческих антительных последовательностей, чем химерные антитела, поскольку они включают в себя как последовательности константных областей, так и последовательности вариабельных областей (каркасных) человеческих антител. Так, например, гуманизированное антитело с трансплантированной СОК по настоящему изобретению может включать в себя тяжелую цепь, которая включает в себя последовательность смежных аминокислот (например, приблизительно 5 или более, 10 или более или даже 15 или более смежных аминокислотных остатков) из каркасной области человеческого антитела (например, РК-1, РК-2 или РК-3 человеческого антитела), или, необязательно, большую часть или всю целиком каркасную область человеческого антитела. Антитела с трансплантированной СОК и способы их получения описаны в №Дигс. 321:522-525 (1986). Способы, которые можно использовать для получения гуманизированных антител, также описаны, например, в патентах США № 5721367 и 6180377.

Венированные антитела представляют собой нечеловеческие или гуманизированные (например, химерные или с трансплантированной СОК) антитела, которые были сконструированы для замены опре- 10 026959 деленных подвергающихся действию растворителя аминокислотных остатков, чтобы уменьшить их иммуногенность или усилить их функцию. Венирование химерного антитела может включать в себя идентификацию подвергающихся действию растворителя остатков в нечеловеческой каркасной области химерного антитела и замену по меньшей мере одного из них соответствующими поверхностными остатками из нечеловеческой каркасной области. Венирование можно осуществлять с использованием любой подходящей методики инженерии.

Дополнительные детали, касающиеся антител, гуманизированных антител, человеческих антител, полученных методами инженерии, и способов их изготовления, можно найти в ЛийЪойу Епдшеегтд, 8ргтдег, №ν Уогк, ΝΥ, 2001.

Примерами гуманизированных антител или человеческих антител, полученных методами инженерии, являются антитела 1§О, 1дМ, 1дЕ, 1§Л и 1§ϋ. Антитела могут относиться к любому классу (1§О, 1дА, 1дМ, 1дЕ, 1§ϋ и т.п.) или изотипу и могут включать в себя каппа или лямбда легкую цепь. Например, человеческое антитело может включать в себя тяжелую цепь или определенный фрагмент 1§С, такой как по меньшей мере один из изотипов 1дС1, 1дС2, 1§О3 или 1дС4. В качестве еще одного примера антитела или их фрагменты могут включать в себя тяжелую цепь 1§О1 и каппа или лямбда легкую цепь.

Анти-8АР антитела и их фрагменты могут представлять собой гуманизированные антитела, такие как антитела, которые связываются с 8АР полипептидами и кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, которые могут представлять собой встречающиеся в естественных условиях соматические варианты иммуноглобулиновой последовательности нуклеиновых кислот человеческой зародышевой линии, а также их фрагменты, синтетические варианты, производные и гибриды. Указанные антитела можно изготавливать любым способом, известным специалистам, таким как использование траксгенных млекопитающих (таких как трансгенные мыши), при котором нативные иммуноглобулины были заменены человеческими У-генами в хромосоме млекопитающего.

Человеческие антитела для нацеливания на 8АР также можно изготавливать с использованием трансгенных животных, которые не имеют эндогенной продукции иммуноглобулинов и получены методами инженерии с приобретением человеческих иммуноглобулиновых локусов, как описано в νθ 98/24893 и νθ 91/00906.

С использованием трансгенного животного, описанного выше, можно получить иммунный ответ на выбранную молекулу антигена, и клетки-антителопродуценты можно извлечь из организма животного и использовать для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела. Протоколы иммунизации, адъюванты и т.п. известны специалистам и используются для иммунизации, например, трансгенной мыши.

Развитие технологий для изготовления репертуаров генов рекомбинантных человеческих антител и дисплей-кодированных фрагментов антитела на поверхности нитчатых бактериофагов создает средства для прямого изготовления человеческих антител. Антитела, продуцированные с использованием фаговой технологии, продуцируются в виде антиген-связывающих фрагментов, обычно фрагментов Ρν или РаЪ, в бактериях, и, таким образом, лишены эффекторных функций. Эффекторные функции можно внедрять с использованием одной их двух стратегий: фрагменты можно доводить с использованием способов инженерии до полных антител для экспрессии в клетках млекопитающих, или до биспецифичных антител со вторым сайтом связывания, способных запускать эффекторную функцию.

Человеческие антитела можно генерировать посредством ίη νίίτο скрининга антительных дисплейбиблиотек (1. Мо1. ΒίοΙ. (1991), 227:381). Различные антителосодержащие фаговые дисплей-библиотеки описаны и могут быть легко изготовлены. Библиотеки могут содержать последовательности разнообразных человеческих антител, такие как фрагменты РаЪ, Ρν и 8сΡν, которые можно подвергать скринингу против соответствующей мишени. Фаговые дисплей-библиотеки могут включать в себя пептиды или белки, не являющиеся антителами, которые можно подвергать скринингу для идентификации агентов, способных селективно связываться с 8АР.

Процессы дисплея фагов имитируют иммунную селекцию через дисплей антительных репертуаров на поверхности нитчатого бактериофага, и последующую селекцию фага по их связыванию с антигеном выбора. Один подобный способ описан в νθ 99/10494. Анти-8АР антитела можно изолировать скринингом библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, предпочтительно, фаговой дисплейбиблиотеки δсΡν, изготовленной с использованием молекул кДНК человеческих У_ъ и У_н, полученных из мРНК человеческих лимфоцитов. Методики изготовления и скрининга указанных библиотек известны специалистам. Имеются в продаже наборы для генерации фаговых дисплей-библиотек.

- 11 026959

ЗАР-связывающие антитела и их фрагменты могут включать в себя одну или более частей, которые не связываются с ЗАР, но вместо этого отвечают за другие функции, такие как полупериод существования в циркуляции, прямое цитотоксическое действие, выявляемая метка или активация эндогенного комплементного каскада реципиента или эндогенная клеточная цитотоксичность. Антитела или их фрагменты могут включать в себя всю константную область или ее часть и могут принадлежать к любому изотипу, включая 1§А (например, 1§Л1 или 1§А2), 1§ϋ, 1§Е, 1§О (например, 1§О1, 1§О2, 1§О3 или 1§О4) или 1дМ. Помимо этого, или вместо этого, включая в себя константную область, антиген-связывающие соединения по настоящему изобретению могут включать в себя эпитопную метку, эпитоп реутилизации рецепторов, меточную часть для целей диагностики или очистки или цитотоксическую часть, такую как радионуклид или токсин.

Анти-ЗАР антитело или его фрагмент можно модифицировать с целью увеличения полупериода его существования в плазме крови, например, путем добавления молекул, таких как РЕО или другие водорастворимые полимеры, включая полисахаридные полимеры, для увеличения полупериода существования.

ЗАР-связывающие антитела и их фрагменты могут были биспецифичными. Например, биспециоичные антитела могут напоминать простые антитела (или фрагменты антител), но иметь отличающиеся антиген-связывающие сайты (вариабельные области). Биспецифичные антитела можно получать различными способами, такими как химическая методика, полидомная методика или методика рекомбинантной ДНК. Биспецифичные антитела могут обладать специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов, по меньшей мере один из которых представляет собой эпитоп ЗАР.

ЗАР-связывающие антитела и их фрагменты могут представлять собой гетероантитела. Г етероантитела представляют собой два или более антител или связывающих фрагментов антител (РаЬ), связанных друг с другом; каждое антитело или фрагмент имеет отличающуюся специфичность.

Используемый в настоящем документе термин фрагменты антител относится к частям интактного антитела полной длины, таким как антиген-связывающая или вариабельная область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ и Ρν; диатела; линейные антитела; одноцепочечные антительные молекулы (например, 8θΡν); мультиспецифичные антительные фрагменты, такие как биспецифичные, триспецифичные и мультиспецифичные антитела (например, диатела, триатела, тетратела); домен-связывающие иммуноглобулиновые гибридные белки; верблюжьи антитела; мимические антитела; хелатные рекомбинантные антитела; тритела или битела; интратела; нанотела; малые модулярные иммунофармацевтические агенты (ЗМ1Р), У_нн-содержащие антитела; и любые другие полипептиды, образованные из антительных фрагментов.

В контексте настоящего изобретения термины анти-ЗАР антитело и ЗАР-связывающее антитело включают в себя ЗАР-связывающее антительные фрагменты, которые включают в себя любую часть последовательностей тяжелых или легких цепей антител полной длины и которые связываются с ЗАР.

Термин фрагменты, используемый в настоящем документе, относятся к фрагментам, способным связываться с ЗАР, например, к любым из по меньшей мере 3 смежных аминокислот (например, по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более смежных аминокислот, например, из СЭР) антитела, участвующего в связывании антигена, и включает в себя фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ и Ρν, или его отдельные вариабельные области легких или тяжелых цепей или их части. ЗАР-связывающие фрагменты включают в себя, например, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ρν и 8θΡν. Указанные фрагменты не имеют фрагмента Рс интактного антитела, быстрее исчезают из циркуляции и могут иметь меньше неспецифичного связывания, чем интактное антитело. Указанные фрагменты могут быть изготовлены из интактных антител с использованием хорошо известных способов, например, путем протеолитического расщепления такими ферментами как папаин (для получения фрагментов РаЬ) или пепсин (для получения фрагментов Р(аЬ')2).

ЗАР-связывающие антитела и фрагменты также охватывают одноцепочечные антительные фрагменты (δсΡν)’ которые связываются с ЗАР. 8сΡν включает в себя вариабельную область (У_н) тяжелой цепи антитела, оперативно связанную с вариабельной областью (У_ь) тяжелой цепи антитела, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, вместе или по отдельности, образуют сайт связывания, который связывается с ЗАР. 8сΡν может включать в себя область У_н на аминотерминальном конце и область У_ъ на карбокситерминальном конце. Альтернативно, 8сΡν может включать в себя область У_ъ на аминотерминальном конце и область У_н на карбокситерминальном конце. Помимо этого, несмотря на то что два домена фрагмента Γν, У|, и У_н кодируются отдельными генами, их можно соединить, используя рекомбинантные способы, синтетическим линкером, который делает возможным изготовить их в виде единой белковой цепи, в которой пара областей У_ъ и У_н образует одновалентные молекулы (известные как одноцепочечная Ρν (δсΡν)). 8сΡν может, необязательно, содержать также полипептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи.

ЗАР-связывающие антитела и фрагменты также охватывают фрагменты доменных антител (бАЬ), как описано в ЫаШге, 341:544-546 (1989), которые состоят из домена У_н.

ЗАР-связывающие антитела и фрагменты также охватывают тяжелоцепочечные антитела (нСАЬ). Указанные антитела могут, несомненно, формировать антиген-связывающие области, используя вариабельную область только тяжелой цепи; указанные функциональные антитела представляют собой диме- 12 026959 ры только тяжелых цепей (тяжелоцепочечные антитела или НСЛЬ). Соответственно, ЗАРсвязывающие антитела и фрагменты могут представлять собой тяжелоцепочечные антитела (НСАЬ), которые специфичным образом связываются с ЗАР.

ЗАР-связывающие антитела и фрагменты также охватывают антитела, который представляют собой ЗМ1Р или домен-связывающие иммуноглобулиновые гибридные белки, специфичные в отношении белка ЗАР. Указанные конструкции представляют собой одноцепочечные полипептиды, включающие в себя антиген-связывающие домены, слитые с иммуноглобулиновыми доменами, чтобы осуществлять эффекторные функции антитела (см. \УО 03/041600).

ЗАР-связывающие антитела и фрагменты также охватывают диатела. Последние представляют собой бивалентные антитела, в которых домены У_Н и Уь экпрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание двух доменов на одной и той же цепи. Это вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и, таким образом, возникают два антиген-связывающий сайта (см., например, \УО 93/11161). Диатела могут быть биспецифичными или моноспецифичными.

ЗАР-связывающие антитела и их фрагменты также охватывают иммуноадгезины. Одна или более СИК могут быть инкорпорированы в молекулу, как ковалентно, так и нековалентно, чтобы сделать ее иммуноадгезином. Иммуноадгезин может инкорпорировать СИК как часть более длинной полипептидной цепи, может ковалентно связывать СИК с другой полипептидной цепью или может инкорпорировать СИК нековалентно. СИК позволяют иммуноадгезину специфичным образом связываться с ЗАР.

ЗАР-связывающие антитела и их фрагменты также охватывают антительные мимики, включающие в себя одну или более ЗАР-связывающих частей, построенных на органическом или молекулярном каркасе (таком как белковый или углеводный каркас). Белки, имеющие относительно определенные пространственные структуры, обычно называемые белковыми каркасами, можно использовать в качестве реагентов для построения антительных мимиков. Указанные каркасы обычно содержат одну или более областей, которые поддаются специфичному или случайному изменению последовательности, и указанную рандомизацию последовательностей часто осуществляют, чтобы получить библиотеки белков, из которых можно отобрать желаемые продукты. Например, антительный мимик может включать в себя химерный неиммуноглобулиновый связывающий полипептид, имеющий иммуноглобулиноподобный домен-содержащий каркас, имеющий две или более подвергшихся действию растворителя петель, содержащих отличную СИК из родительского антитела, инсерцированную в каждую из петель и демонстрирующую селективное связывание с лигандом, соединенным с родительским антителом. Неиммуноглобулиновые белковые каркасы были предложены для получения белков с новыми связывающими свойствами.

Анти-ЗАР антитела или фрагменты антител обычно связываются с человеческим ЗАР с высокой аффинностью (например), как определено с использованием В1АСОКЕ), как, например, с константой диссоциации равновесного связывания (К_с) для ЗАР приблизительно 15 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 5 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее, приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 250 пМ или менее, приблизительно 100 пМ или менее, приблизительно 50 пМ или менее, приблизительно 25 пМ или менее, приблизительно 10 пМ или менее, приблизительно 5 пМ или менее, приблизительно 3 пМ или менее, приблизительно 1 пМ или менее, приблизительно 0,75 пМ или менее или приблизительно 0,5 пМ или менее.

Соответственно, анти-ЗАР антитело или фрагмент антитела не взаимодействует перекрестным образом с любой мишенью, отличной от ЗАР.

Антитела и фрагменты антител, описанные в настоящем документе, можно изготовить с помощью любого подходящего способа. Подходящие способы изготовления указанных антител и фрагментов антител известны специалистам. Антитело или фрагмент антитела может быть изолирован или очищен до любой степени.

Используемый в настоящем документе термин изолированное соединение означает соединение, которое было изъято из его натуральной среды.

Очищенное соединение представляет собой соединение, чистота которого была повышена таким образом, что оно существует в форме, которая является более чистой, чем оно существует в его натуральной среде, и/или когда оно исходно синтезировано и/или амплифицировано в лабораторных условиях. Чистота является относительным понятием и не обязательно означает абсолютную чистоту.

ЗАР-устраняющее соединение.

Соединения по настоящему изобретению включают в себя такие соединения, которые приводят к устранению циркулирующего ЗАР.

Указанные соединения включают в себя такие соединения, которые являются конкурентными ингибиторами связывания ЗАР с амилоидными фибриллами, как описано в европейской патентной заявке ЕР 0915088, включая (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту (СРНРС), однако, любое из соединений, описанных в указанном источнике, или любое другое соединение, которое истощает циркулирующий ЗАР, можно использовать в практике настоящего изобретения.

- 13 026959

Международная патентная заявка ШО 2004/099173, включенная в настоящий документ в качестве ссылки, также описывает палиндромные соединения, которые также можно использовать в практике настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 8АР-устраняющее соединение представляет собой Ό-пролин; предпочтительными являются Ό-пролины формул

где К представляет собой °у^н

-ό и группа К¹ представляет собой водород или галоген;

Χ-Υ-Χ' представляет собой линкер, имеющий по меньшей мере 4, преимущественно по меньшей мере 5, преимущественно по меньшей мере 6, до 20 линейных или прямоцепочечных атомов углерода, где

X представляет собой -(СЩп-; -СН(К²)(СН2)П-; -СВДОЩ,,-; ϋ^ΝΗ-; бензил, -С(К²)=СН-; СН2СН(ОН)-; или тиазол-2,5-диил;

Υ представляет собой -8-8-; -(СЩп-; -О-; -Ν№; -Ν(Κ²)-; -СН=СН-; ^НС(О^Н-; -Ν(Κ²)ϋ(Θ)Ν(Κ²)-; -^СН₂С₆Н₃(ОСН₃)₂]-; -УСН₂С₆Н₅)-; -УСН₂С₆Н₅)С(О)УСН₂С₆Н₅)-; ^(алкоксиалкил)-; ^(циклоалкилметил)-; 2,6-пиридил; 2,5-фуранил; 2,5-тиенил; 1,2-циклогексил; 1,3-циклогексил; 1,4-циклогексил; 1,2-нафтил; 1,4-нафтил; 1,5-нафтил; 1,6-нафтил; бифенилен; или 1, 2-фенилен, 1,3-фенилен и 1,4-фенилен, где фениленовые группы необязательно замещены 1-4 заместителями, выбранными из галогена, низшего алкила, низшего алкокси, гидроксила, карбокси, -СОО-низшего алкила, нитрило, 5-тетразола, (2-карбоновая кислота пирролидин-1-ил)-2-оксоэтокси, Ν-гидроксикарбамимиодила, 5-оксо[1,2,4]оксадиазолила, 2-оксо[1,2,3,5]оксатиадиазолила, 5-тиоксо[1,2,4]оксадиазолила и 5-третбутилсульфанил- [ 1,2,4] оксадиазолила;

X' представляет собой -(СН₂)_П-; -(СН₂)_ПСН(К²)-; -(СН2)ПОСН2-; ^НСН2-; бензил, -СН=С(К²)-; СН(ОН)СН2- или тиазол-2,5-диил;

К² представляет собой низший алкил, низший алкокси или бензил, и η представляет собой 0-3, или их фармацевтически приемлемую соль или моно- или диэфир.

Соединение, которое изымает 8АР из циркуляции, включая предпочтительные варианты, упомянутые выше, в настоящем документе называется 8АР-устраняющим соединением.

Таким образом, необязательно замещенный линкер может иметь одно или более замещений, которые приводят к разветвлению, и/или одно или более замещений атома (атомов) углерода линейных или прямоцепочечных атомов углерода линкера, например линкер может представлять собой эфир или замещенный эфир.

Фармацевтические композиции.

Соответственно, 8АР-устраняющее соединение, как описано в настоящем документе, и антитело против человеческого 8АР или его фрагмент, описанные в настоящем документе, будут вводиться в виде фармацевтических композиций, включающих в себя терапевтически эффективные количества.

Используемый в настоящем документе термин терапевтически эффективное количество относится к количеству 8АР-устраняющего соединения и анти-(человеческого)8АР антитела или его фрагмента или в виде части фармацевтической композиции, которое способно оказывать поддающееся выявлению положительное действие на любой симптом, аспект или характеристику амилоидоза при введении пациенту (например, в виде однократной или более доз).

- 14 026959

Комбинацию δΑΡ-устраняющего соединения и анти-δΑΡ антитела или его фрагмента можно вводить по отдельности, одновременно или последовательно, или комбинация может быть представлена в форме одной фармацевтической композиции.

Таким образом, изобретение также относится к δΑΡ-устраняющему соединению и анти-δΑΡ антителу или его фрагменту в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для терапевтического или профилактического лечения амилоидоза.

Фармацевтические композиции, включающие в себя δΑΡ-устраняющее соединение, можно вводить отдельно от анти-δΛΡ антител или их фрагментов, и указанное раздельное введение можно осуществлять в одно и то же или в разное время, например, в один и тот же день или в разные дни. Если комбинацию δΑΡ-устраняющего соединения и анти-δΑΡ антитела или его фрагмента нужно вводить последовательно, то δΑΡ-устраняющее соединение вводят первым, таким образом, чтобы лечение δΑΡ-устраняющим соединением могло устранить почти весь δΑΡ из циркуляции. Поскольку после этого остаются значительные количества δΑΡ, связанного с амилоидными отложениями в тканях, последующее введение антиδΑΡ антитела или его фрагмента делает возможным локализацию и специфичное связывание с амилоидными отложениями, что способствует их быстрой и обширной регрессии. Соответственно, анти-δΑΡ антитело или его фрагмент можно вводить через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 или 25 или более дней после введения δΑΡ-устраняющего соединения.

Последовательное введение может включать в себя два или более последовательных введений δΑΡустраняющего соединения с последующими двумя или более последовательными введениями анти-δΑΡ антитела или его фрагмента.

Последовательное введение может включать в себя одно введение δΑΡ-устраняющего соединения с последующим введением анти-δΑΡ антитела или его фрагмента, которое затем повторяется один или более раз.

Последовательная/последующая доза может представлять собой количество, которое превышает первоначальную/предыдущую дозу или меньшей первоначальной/предыдущей дозы.

После введения первоначальной дозы δΑΡ-устраняющего соединения и/или анти-δΑΡ антитела или его фрагмента можно осуществлять введение одной или более последовательных (например, последующих) доз δΑΡ-устраняющего соединения и/или анти-δΑΡ антитела или его фрагмента; при этом указанная одна или более последовательных доз могут быть в количестве, которое приблизительно равняется или меньше первоначальной дозы.

После введения первоначальной дозы δΑΡ-устраняющего соединения и/или анти-δΑΡ антитела или его фрагмента можно осуществлять введение одной или более последовательных (например, последующих) доз δΑΡ-устраняющего соединения и/или анти-δΑΡ антитела или его фрагмента; при этом по меньшей мере одна из последующих доз может быть в количестве, которое превышает первоначальную дозу.

Соответственно, при введении можно использовать заранее определенную или рутинную схему введения, в результате чего используется заранее определенный период времени между введениями доз. Схема может включать в себя периоды времени, которые являются идентичными, или которые отличаются по продолжительности, в рамках заранее определенной схемы. Любая конкретная комбинация будет соответствовать схеме до тех пор, пока она определена раньше того срока, в течение которого подходящая схема предусматривает введение в определенный день.

Фармацевтические композиции могут предназначаться для применения для человека или животных в медицине и ветеринарии и обычно будут включать в себя одно или более фармацевтически приемлемых соединений, таких как носители, наполнители, разбавители, антиоксиданты, консерванты, красящие, вкусо-ароматические и разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты, растворители, филлеры, агенты, создающие массу, буферы, средства для доставки, агенты, влияющие на тоничность, сорастворители, увлажняющие агенты, комплексообразующие агенты, антимикробные агенты и поверхностно-активные агенты. Приемлемые соединения для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Кештдои'к Ρ1ι;·ιπη;·ι<χιιΙίο;·ι1 δοίοηοοκ. Маек ΡιιόИкЫид Со. (изд. Α.Κ. Сеииаго 1985).

Фармацевтические композиции могут включать в себя антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин и/или желатин; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; хелатирующие агенты, такие как ΕΌΤΑ; сахарные спирты, такие как маннит и/или сорбит; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные агенты, такие как Т\уееп, плюроник или полиэтиленгликоль (ΡΕΟ). Также в качестве примера подходящие агенты, влияющие на тоничность, включают в себя галогениды щелочных металлов (предпочтительно, хлорид натрия или калия), маннит, сорбит и т.п. Подходящие консерванты включают в себя хлорид бензалкония, тимерозал, метилпарабен, пропилпзрабен, хлоргексидин, фенилэтиловый спирт и сорбиновую кислоту. Подходящие сорастворители включают в себя глицерин и/или пропиленгликоль. Подходящие комплексообразующие агенты включают в себя кофеин и/или поливинилпирролидон. Подходящие поверхностно-активные агенты или увлажняющие агенты включают в себя сложные эфиры сорбитана

- 15 026959 и/или полисорбаты. Буферы могут представлять собой обычные буферы, такие как цитрат, ацетат, борат, бикарбонат или ТГ15-НС1. Ацетатный буфер может иметь рН приблизительно 4-5,5, а Тпк буфер может иметь рН приблизительно 7-8,5. Дополнительные фармацевтические агенты описаны в КетшдФп'к РЬагтасеиДса1 8с1еисек, 18-е издание, изд. А.К Оеииаго, Маек РиЪккЫпд Сотрапу, 1990.

Фармацевтический носитель, наполнитель или разбавитель и т.п. можно выбирать с учетом планируемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.

Требования к композиции могут различаться в зависимости от использования различных систем доставки.

Композиция может находиться в жидкой или лиофилизированной форме и может включать в себя один или более криопротекторов, наполнителей, поверхностно-активных агентов, высокомолекулярных структурных добавок и/или агентов, создающих массу. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в состав включен криопротектор, который представляет собой невосстанавливающий сахар, такой как сахароза и/или лактоза. Количество обычно включаемого в состав криопротектора таково, что после повторного растворения полученная композиция обычно является изотоничной. В состав может быть включен поверхностно-активный агент, такой как неионогенные поверхностно-активные агенты и ионогенные поверхностно-активные агенты. Примеры количества поверхностно-активного агента, которые могут содержаться в композиции до лиофилизации, составляют приблизительно 0,001-0,5%. В состав могут быть включены высокомолекулярные структурные добавки (например, филлеры, связующие агенты). Примеры концентрации высокомолекулярных структурных добавок составляют от 0,1 до 10 мас.%. В других вариантах осуществления настоящего изобретения в состав может быть включен агент, создающий массу (например, маннит, глицин).

Композиции могут являться подходящими для парентерального введения. Композиции могут являться подходящими для инъекции или инфузии животному любым путем, доступным специалисту, таким как внутрисуставной, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, интрацеребральный (интрапаренхимальный), интрацеребровентрикулярный, интраокулярный, интраартериальный, пероральный, ингаляционный пути и введение непосредственно в область повреждения. Парентеральные композиции обычно будут представлять собой стерильный, апирогенный, изотонический водный раствор, необязательно содержащий фармацевтически приемлемые консерванты.

Фармацевтические композиции можно изготавливать для контролируемой или замедленной доставки таким образом, который обеспечивает локальную концентрацию продукта (например, болюс, депоэффект), замедленное высвобождение и/или повышенную стабильность или полупериод существования в конкретной локальной окружающей среде. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения указанные композиции могут включать в себя значительно большее количество 8АРустраняющего соединения и/или анти-8АР антитела или его фрагмента в исходном депо, в то время как эффективное количество антитела или фрагмента, в действительности высвобождающееся и доступное в любой момент времени, представляет собой количество, которое значительно меньше, чем в исходном депо. Композиции могут включать в себя состав с препаратами в форме частиц полимерных соединений, а также такие агенты, как биоразлагаемый матрикс, микросферы для инъекций, микрокапсулярные частицы, микрокапсулы, биоэрозируемые гранулы, липосомы и имплантируемые устройства для доставки, которые предусматривают контролируемое или замедленное высвобождение активного агента, который затем может доставляться в виде депо-инъекции.

Технологии изготовления указанных средств замедленной или контролируемой доставки известны специалистам, и разнообразные полимеры можно разрабатывать и использовать для контролируемого высвобождения и доставки лекарственных средств. Указанные полимеры обычно являются биоразлагаемыми и биологически совместимыми. Полимерные гидрогели, включая гидрогели, образуемые комплексированием энантиомерного полимера или полипептидных сегментов, а также гидрогели, чувствительные к температуре или рН, могут быть желательными для создания эффекта депо лекарственного средства, благодаря мягким и водным условиям, участвующим в захвате биологически активных белковых агентов (например, антител).

Биоадгезивные полимеры также могут присутствовать в композициях. Биоадгезивные агенты представляют собой синтетические или природные материалы, способные приклеиваться к биологическим субстратам на продолжительные периоды времени. Например, СагЪоро1 и поликарбофил представляют собой синтетические поперечно сшитые производные поли(акриловой кислоты).

Фармацевтические композиции можно изготавливать для ингаляций, как, например, в виде сухого порошка. Ингаляционные растворы также можно изготавливать в ожиженном пропелленте для аэрозольной доставки. В еще одной композиции растворы можно распылять. Дополнительные фармацевтические композиции для внутрилегочного введения включают в себя, например, композиции, описанные в РСТ патентной публикации \¥О 94/20069, которая описывает внутрилегочную доставку химически модифицированных белков. Для внутрилегочной доставки размер частиц должен быть подходящим для доставки в дистальные области легкого. Например, размер частиц может составлять от 1 до 5 мкм; однако можно использовать частицы большего размера, например, если каждая частица является довольно пористой.

- 16 026959

Другой препарат может включать в себя смесь с нетоксичными наполнителями, которые являются пригодными для изготовления таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другом подходящем носителе можно изготавливать растворы в виде стандартной дозы. Подходящие наполнители включают в себя, без ограничения, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Некоторые композиции можно вводить пероральным путем. Композиции, подходящие для введения указанным путем, можно изготавливать с использованием или без использования тех носителей, которые обычно используются при составлении композиций твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, капсулу можно изготавливать для высвобождения активной части композиции в конкретном отделе желудочно-кишечного тракта, в котором биодоступность является максимальной, а деградация до поступления в системный кровоток является минимальной. Дополнительные агенты могут быть включены в композицию для облегчения всасывания селективного связывающегося агента. Можно использовать также разбавители, вкусо-ароматические агенты, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазывающие агенты, разрыхлители и связующие агенты.

Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут включать в себя терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество 8АРустраняющего соединения и/или анти-§АР антитела или его фрагмента.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может варьировать в соответствии с такими факторами, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желаемый ответ в организме индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.

Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата.

Терапевтически или профилактически эффективное количество фармацевтической композиции будет зависеть, например, от терапевтических параметров, таких как показания, при рсоторых используется композиция, путь введения и состояние субъекта. Фармацевтические композиции вводят в терапевтически или профилактически эффективном количестве для лечения амилоидоза. Терапевтически или профилактически эффективное количество представляет собой количество, которое может лечить или предотвращать один или более симптомов амилоидоза у субъекта.

Фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, можно использовать также в комбинации с обычными средствами для лечения амилоидоза.

Фармацевтическая соль.

§АР-устраняющее соединение можно вводить в форме фармацевтически приемлемой соли.

Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны специалистам, и включают в себя, например, соли, упоминающиеся Всгдс с1 а1., в ί. РЬагга. δοί.. 66, 1-19 (1977). Подходящие кислотно-аддитивные соли образуются из кислот, которые образуют нетоксичные соли и включают в себя гидрохлоридные, гидробромидные, гидроиодидные, нитратные, сульфатные, бисульфатные, фосфатные, гидрофосфатные, ацетатные, трифторацетатные, глюконатные, лактатные, салицилатные, цитратные, тартратные, аскорбатные, сукцинатные, малеатные, фумаратные, глюконатные, формиатные, бензоатные, метансульфонатные, этансульфонатные, бензолсульфонатные и п-толуолсульфонатные соли.

При наличии одной или более кислотных частей подходящие фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут образовываться из оснований, которые образуют нетоксичные соли и включают в себя соли алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка и соли фармацевтически активных аминов, таких как диэтаноламин.

Фармацевтически приемлемую соль можно легко изготовить смешиванием должным образом растворов §АР-устраняющего соединения и желаемой кислоты или основания. Соль можно осаждать из раствора и собирать фильтрованием или можно получать выпариванием растворителя.

Введение.

Компоненты можно вводить по отдельности, но обычно они будут вводиться в виде фармацевтической композиции, например, когда компоненты находятся в смеси с подходящим фармацевтическим наполнителем, разбавителем или носителем, выбранным с учетом предназначенного пути введения и стандартной фармацевтической практики.

Например, компоненты можно вводить в форме таблеток, капсул, шариков, эликсиров, раствором или суспензий, которые могут содержать вкусо-ароматические или окрашивающие агенты, для применения с немедленным, отсроченным, модифицированным, замедленным, прерывистым или контролируемым высвобождением.

Если фармацевтический препарат представляет собой таблетку, то таблетка может содержать наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двух- 17 026959 основный фосфат кальция и глицин, разрыхлители, такие как крахмал (предпочтительно, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиоки), гликолят натрий-крахмала, натрий-крокармеллоза и некоторые комплексные силикаты, и связующие агенты для гранулирования, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и гуммиарабик. Помимо этого, в состав могут быть включены смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.

Твердые композиции сходного типа также можно использовать в качестве филлеров в желатиновых капсулах. Предпочтительные наполнители в этом отношении включают в себя лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и/или эликсиров агент можно комбинировать с различными подсластителями или вкусо-ароматическими агентами, окрашивающими агентами или красителями, с эмульгирующими и/или суспендирующими агентами и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, и их комбинациями.

Пути введения (доставки) могут включать в себя, без ограничения, один или более из перорального (например, с использованием таблетки, капсулы или раствор для приема внутрь), местного, чресслизистого (например, с использованием назального спрея или аэрозоля для ингаляции), назального, парентерального, (например, с использованием формы для инъекций), гастроинтестинального, интраспинахъного, интраперитонеального, внутримышечного, внутривенного, внутриматочного, интраокулярного, внутрикожного, интракраниального, интратрахеального, интравагинального, интрацеребровентрикулярного, интрацеребрального, подкожного, глазного (включая введение в стекловидное тело или камеру), чрескожного, ректального, буккального, вагинального, эпидурального и сублингвального путей.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ введения представляет собой внутривенную инфузию.

Уровни доз.

Подходящие и/или предпочтительные фармацевтические композиции можно определить с точки зрения настоящего описания и общего знания технологии изготовления композиций в зависимости от планируемого пути введения, формата доставки и желаемой дозы.

Обычно врач будет определять реальную дозу, которая будет наиболее подходящей для конкретного субъекта.

Конкретный уровень дозы и частота введения для любого конкретного пациента может варьировать к будет зависеть от ряда факторов, включая конкретное используемое соединение, метаболическую стабильность и продолжительность действия указанного соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, характер питания, способ и время введения, скорость экскреции, комбинацию лекарственных средств, тяжесть конкретного состояния и индивидуальное осуществляемое лечение. Например, 8АР-устраняющее соединение можно вводить в дозе от 2 до 0,1 мг/кг в зависимости от его активности.

Анти-8АР антитело или его фрагмент можно вводить фиксированной дозой, независимо от соотношения дозы и массы тела субъекта. Антитело или его фрагмент можно вводить одной или более отдельными, одновременными или последовательными дозами в 3000 мг или менее антитела или его фрагмента, 2700 мг или менее антитела или его фрагмента, 2500 мг или менее антитела или его фрагмента, 2200 мг или менее антитела или его фрагмента, 2100 мг или менее антитела или его фрагмента, 1700 мг или менее антитела или его фрагмента, 1500 мг или менее антитела или его фрагмента, 1200 мг или менее антитела или его фрагмента, 1100 мг или менее антитела или его фрагмента, 1000 мг или менее антитела или его фрагмента, 700 мг или менее антитела или его фрагмента, 500 мг или менее антитела или его фрагмента, 200 мг или менее антитела или его фрагмента или 100 мг или менее антитела или его фрагмента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело или его фрагмент вводят одной или более дозами по меньшей мере в 20 мг антитела или его фрагмента.

8АР-устраняющее соединение можно вводить фиксированной дозой, независимо от соотношения дозы и массы тела субъекта. 8АР-устраняющее соединение можно вводить одной или более отдельными. одновременными или последовательными парентеральными дозами в 100 мг или менее, 50 мг или менее, 25 мг или менее или 10 мг или менее. Альтернативно, 8АР-устраняющее соединение можно вводить с использованием соотношения дозы и массы тела субъекта, которое легко определяется специалистом.

Составление композиций.

Компонент (компоненты) можно объединять в фармацевтическую композицию, например, смешиванием с одним или более носителем, разбавителем или наполнителем, с использованием технологий, известных специалистам.

Экспрессия.

Обширный ряд экспрессионных систем доступен для получения анти-8АР антител или фрагментов антител, включая фрагменты РаЬ, 8сРу и У_НН. Например, экспрессионные системы как прокариотического, так и эукариотического происхождения можно использовать для широкомасштабного производства фрагментов антител и антительных слитых белков.

Грамотрицательную бактерию Е.сой широко используют в качестве организма-хозяина для гетерологичной экспрессии генов. Однако большие количества гетерологичного белка имеют тенденцию накапливаться внутри клетки. Последующая очистка желаемого белка из массы внутриклеточных белков

- 18 026959

Е.соП иногда может быть трудной.

В противоположность Е.соИ, бактерии из рода ВасШиз являются весьма подходящими в качестве гетерологичных хозяев в силу их способности секретировать белки в культуральную среду. Другие бактерии, пригодные в качестве хозяев, происходят из родов 81герЮтусез и Рзеийотопаз.

В зависимости от природы полинуклеотида, кодирующего полипептид, и/или желательности дальнейшего процессинга экспрессированного белка предпочтительными могут быть эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы. Обычно дрожжевые клетки являются предпочтительными по сравнению с другими грибковыми клетками, поскольку ими проще манипулировать. Однако некоторые белки плохо секретируются дрожжевыми клетками или, в некоторых случаях, подвергаются процессингу не должным образом (например, гипергликозилированию в дрожжевых клетках). В указанных случаях следует выбрать другой грибковый организм-хозяин.

Примеры подходящих хозяев для экспрессии в объеме настоящего изобретения представляют собой грибы, такие как грибы виды АзрегдШиз (такие, которые описаны в ЕР-А-0184438 и ЕР-А-0284603) и виды ТпсНойегта; бактерии, такие как виды ВасШиз (такие, которые описаны в ЕР-А-0134048 и ЕР-А-0253455), виды 81гер1отусез и виды Рзеийотопаз; и дрожжи, такие как виды К1иууеготусез (такие как те, которые описаны в ЕР-А-0096430 и ЕР-А-0301670) и виды 8ассЬаготусез.

Использование подходящих клеток-хозяев, таких как дрожжевые, грибковые и растительные клетки-хозяева, могут предусматривать посттрансляционные модификации (например, миристоилирование, гликозилирование, усечение, лапидизацию и тирозиновое, сериновое или треониновое фосфорилирование), которые могут потребоваться для сообщения оптимальной биологической активности ремомбинантным продуктам экспрессии.

Особенно выгодными являются экспрессионные системы, которые позволяют осуществлять секрецию больших количеств фрагментов антител в культуральную среду.

Набор.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описано изделие или набор, содержащий материалы, пригодные для лечения амилоидоза.

Соответственно, набор изготавливают для отдельного или последовательного введения Ό-пролина и анти-8АР антитела или его фрагмента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор включает в себя 8АРустраняющее соединение и анти-8АР антитело или его фрагмент. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор включает в себя первый контейнер, содержащий 8АР-устраняющее соединение, и второй контейнер, содержащий анти-8АР антитело или его фрагмент.

Соответственно, 8АР-устраняющее соединение и анти-8АР антитело или его фрагмент присутствуют в терапевтически или профилактически эффективных количествах для лечения и/или профилактики амилоидоза.

Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылочки, флаконы, шприцы, блистерную упаковку и т.п. Контейнер может быть изготовлен из ряда материалов, таких как стекло или пластик.

Контейнер заключает в себе 8АР-устраняющее соединение или его фармацевтическую композицию и/или анти-8АР антитело или его фрагмент в количестве, эффективном для лечения амилоидоза, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок или флакон с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций).

Набор может дополнительно включать в себя этикетку или вкладыш, расположенный в контейнере или связанный с контейнером. Этикетка или вкладыш может указывать, что композиция (композиции) используется для лечения амилоидоза.

Альтернативно или дополнительно набор может также включать в себя дополнительный контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций, физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера или раствор декстрозы. Он может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой или потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Набор может также включать в себя инструкции по введению 8АР-истощающего соединения и анти-8АР антитела или его фрагмента для лечения или профилактики амилоидоза. Например, если набор содержит первую композицию, включающую в себя 8АР-устраняющее соединение, и вторую композицию, включающую в себя анти-8АР антитело или его фрагмент, набор может также включать в себя инструкции по одновременному, последовательному или отдельному введению первой и второй фармацевтических композиций субъекту, который в этом нуждается.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения наборы могут быть пригодными для доставки твердых пероральных лекарственных форм композиций, таких как таблетки или капсулы. Указанный набор включает в себя, например, ряд стандартных доз. Указанные наборы могут включать в себя таблицу с дозами, расположенными в соответствии с их использованием. Примером указанного набора является блистерная упаковка. Блистерные упаковки хорошо известны в упаковочной промышленности и широко используются для упаковки фармацевтических стандартных лекарственных форм. Если это

- 19 026959 желательно, можно изготавливать памятки, например, в форме номеров, букв или других обозначений, или в форме календарика, обозначающего дни в схеме лечения, в которые можно вводить дозы лекарственных средств.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых набор включает в себя фармацевтическую композицию ЗАР-истощающего соединения и вторую композицию анти-ЗАР антитела или его фрагмента, набор может включать в себя отдельный контейнер для размещения отдельных композиций, такой как бутылочка с перегородками или пакет из фольги с отделениями; однако отдельные композиции также могут содержаться в одном, неразделенном на части, контейнере. Обычно набор включает в себя инструкции по введению отдельных компонентов. Указанная форма набора является особенно выгодной, в случае, когда отдельные компоненты вводят в виде различных лекарственных форм (например, пероральной и парентеральной), вводят с различными интервалами между введениями, или когда лечащий врач желает титровать отдельные компоненты комбинации.

Аналитический способ.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к аналитическому способу для идентификации одного или более агентов, которые можно использовать в комбинации с ЗАР-истощающим соединением, как описано в настоящем документе, для лечения амилоидоза, в частности, для практически полного клиренса амилоидных отложений.

Агент может представлять собой органическое соединение или другое химическое вещество. Агент может представлять собой соединение, которое можно получить или произвести с использованием любого подходящего источника как природного, так и искусственного. Агент может представлять собой молекулу аминокислоты, полипептид или их химическое производное или их комбинацию. Агент может представлять собой даже молекулу полинуклеотида, которая может представляет собой смысловую или антисмысловую молекулу, или антитело, например поликлональное антитело, моноклональное антитело или моноклональное гуманизированное антитело.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения агент представляет собой антитело, такое как антитело, которое получено или которое возможно получить из анти-БАР-антитела.

Агент можно изготавливать методами химического синтеза.

Общие методики рекомбинантной ДНК.

В настоящем изобретении, если не указано иное, используются обычные методики химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые входят в возможности специалиста. Указанные методики описаны в литературе. См., например, 1. ЗагаЬгоок, Е.Р. РгПкск апб Т. Матакк, 1989, Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогайгу Мапиа1, Зесопб Ебкюп, Воокк 1-3, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬогайгу Ргекк; АикиЬе1 Р.М. е1 а1. (1995 и периодические приложения; СиггеШ Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, сй. 9, 13, и 16, 1ойи \УПеу & Зопк, Νον Уогк, Ν.Υ.); В. Кое, 1. СгаЫгее, апб А. Кайп, 1996, ПЫА 1ко1акоп апб Зециепсшд: Еккепка1 ТесЬтциек, 1ойп \УПеу & Зопк; М.1. Оак (Ебког), 1984, Окдопис1еокбе ЗуШкекк: А Ргаскса1 Арргоасй, 1г1 Ргекк; апб Э.М.1. ЬШеу апб РЕ. ИаЫЬегд, 1992, Мебюбк оГ Еп/уто1оду: ΩΝΛ З1гис1иге Рай А: ЗуШйекк апб Ркукюа1 Апа1ук1к оГ ΩΝΛ Мебюбк ш Еп/уто1оду, Асабетк Ргекк. Каждый из указанных основных текстов включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Далее настоящее изобретение будет описано с использованием примеров, которые предназначены для помощи специалисту при практическом осуществлении настоящего изобретения и не предназначены для какого бы то ни было ограничения объема изобретения.

Примеры

Пример 1. Клиренс системных амилоидных отложений у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий ЗАР.

В настоящем исследовании АА-амилоидоз индуцировали у мышей посредством инъекции фактора, усиливающего амилоид, с последующими повторными инъекциями казеина для получения персистирующего острого воспаления и, таким образом, достаточно устойчивого повышения выработки ЗАА, для ускорения отложения амилоида АА у всех животных. Использовали уникальную расу чистой линии животных С57ВЬ/6, у которых был удален ген мышиного ЗАР¹³ и введен трансген человеческого ЗАР.¹⁴’¹⁵Животные, таким образом, экспрессировали не мышиный ЗАР, а человеческий ЗАР, и в концентрациях, значительно превышающих концентрации ЗАР у человека. Авторы подтвердили, что у всех мышей развилось множество системных отложений амилоида, что было показано сильно повышенной задержкой во всем теле изотопного индикатора человеческого ЗАР с радиоактивной меткой по сравнению с не подвергавшимися воздействию контрольными мышами без амилоида. Авторы затем лечили три тщательно подобранные аналогичные группы следующим образом:

группа 1: (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновая кислота (СРНРС), ЗАР-устраняющее лекарственное средство^16,17 и однократная доза овечьего антитела против человеческого ЗАР;

группа 2: СРНРС и контрольный овечий 1§О из неродственной антисыворотки; группа 3: без лечения.

Указанные контрольные группы играют существенную роль для сравнения с известной спонтанной регрессией амилоидных отложений после исчезновения воспаления. Группы также должны быть доста- 20 026959 точно большими, чтобы компенсировать различные скорости регрессии амилоида у отдельных мышей, даже у животных указанной инбредной чистой линии. Подобно этому эксперимент не может быть осуществлен, если индукция амилоида продолжается из-за различающихся скоростей, с которыми образуются амилоидные отложения. В предварительном эксперименте на группах по 15 мышей в каждой, проведенном в соответствии с точно таким же протоколом и с использованием тех же реагентов, которые описаны в настоящем документе, авторы получили тот же результат, который показан ниже. Настоящий эксперимент затем осуществляли с использованием больших количеств животных в группах, чтобы подтвердить, что полученный эффект является воспроизводимым, а не обусловлен вероятностью существования ускоренной регрессии амилоида в одной из групп, не связанной с проводимым лечением.

У мышей, трансгенных по человеческому §АР, человеческий §АР присутствует как в циркуляции, так и амилоидных отложениях. Лекарственное средство СРНРС специфичным образом связывается с человеческим §АР, образуя комплекс, состоящий из двух нативных пентамерных молекул 8АР и 5 молекул СРНРС.¹⁶ Указанный комплекс распознается печенью как отклонение от нормы и очень быстро захватывается гепатоцитами и распадается, что эффективно устраняет §АР из циркуляции.¹⁶ Плазменные концентрации §АР остаются очень низкими, пока лекарственное средство вводится.¹⁶ СРНРС чрезвычайно хорошо переносится, и ни само лекарственное средство, ни истощение 8АР, которое им вызывается, не оказывают никакого неблагоприятного действия¹⁶ (неопубликованные результаты). Существует свидетельство клинического благоприятного действия лечения с использованием СРНРС у пациентов-людей с системным амилоидозом, особенно с точки зрения сохранения почечной функции у лиц с преимущественно почечным амилоидозом (неопубликованные результаты). Несмотря на указанные многообещающие наблюдения, быстрая и оптимальная терапевтическая эффективность, способная сохранять функцию органов и продлевать жизнь пациентам с системным амилоидозом, потребует значительного или полного клиренса амилоидных отложений. Как показали авторы в настоящем документе, в настоящее время этого можно достигнуть, благодаря настоящему изобретению, с помощью лечения комбинацией СРНРС и антител против человеческого 8АР.

Лечение с использованием СРНРС устраняет почти весь циркулирующий человеческий §АР, но оставляет значительные количества 8АР, связанного с амилоидными отложениями в тканях (неопубликованные наблюдения). Наибольшее истощение 8АР из амилоидных отложений, которое авторы наблюдали у пациентов-людей, составляет приблизительно 90% после месяцев непрерывного введения СРНРС. Внутривенная инфузия моноспецифичных антител против человеческого 8АР пациентам, у которых циркулирующий §АР был истощен, делает возможной локализацию и специфичное связывание антител с амилоидными отложениями и способствует их быстрой и обширной регрессии, с соответствующим клиническим улучшением. Авторы показали в настоящем документе эффективность указанной процедуры для модели АА-амилоидоза на мышах, трансгенных в отношении человеческого 8АР.

Протокол и методы эксперимента.

Системный АА-амилоидоз индуцировали у взрослых самцов (п=61) и самок (п=32) мышей чистой линии С57ВЬ/6 с делецией гена мышиного 8АР, трансгенных в отношении человеческого 8АР.¹⁵ Каждая мышь получала однократную дозу фактора, усиливающего амилоид,⁹ внутривенной инъекцией, а затем, спустя 4 дня, 10 ежедневных подкожных инъекций 10 мас./об.% казеина в растворе 0,1М ИаНСОз, которые вводили в течение 12-дневного периода.¹³ Через семь дней после последней инъекции казеина в питьевую воду всем мышам добавляли ΚΙ, и спустя 3 дня каждая мышь получала внутривенную инъекцию стандартной дозы человеческого 8АР, меченного ¹²⁵Ι.^6,18 Четырем взрослым самцам и четырем самкам из той же колонии, но которые не получали никакого лечения, также давали ΚΙ и ¹²⁵1-§АР в качестве контролей. Всем мышам производили подсчет радиоактивности всего тела через 24, 48, 72, 96 и 168 ч после инъекции изотопного индикатора, чтобы определить задержку радиоактивности как показателя амилоидной нагрузки во всем теле. Наблюдалась устойчивая более выраженная задержка у всех подвергшихся воздействию мышей по сравнению с контролями во всех временных точках, что показывает, что все они имели значительные системные амилоидные отложения.¹⁸ Мышей затем распределяли на три группы, как можно более близко подобранные друг к другу по общему количеству и распределению по полу в группе. Спустя десять дней после инъекции ¹²⁵1-§АР группы один и два начинали получать СРНРС в питьевой воде в концентрации 1 мг/мл, и продолжали указанное воздействие до самого конца эксперимента. Группа три ничего не получала ни на указанной, ни на более поздней стадии исследования. Через пять дней после начала введения СРНРС каждое животное в группе один получало интраперитонеальную инъекцию, включавшую в себя 1 мл цельной фракции 1§О моноспецифичной овечьей антисыворотки против человеческого 8АР в количестве 50 мг/мл, содержавшем 7 мг/мл специфичного антитела в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Антисыворотку получали иммунизацией овец 100% чистым человеческим §АР. В это же время все животные в группе 2 получали интраперитонеальную инъекцию, включавшую в себя 1 мл цельной фракции 1§О моноспецифичной овечьей антисыворотки против человеческого рецептора онкостатина М в количестве 50 мг/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Указанная антисыворотка, использовавшаяся в данном эксперименте в качестве контроля для анти-§АР реагента, не демонстрировала реактивности в отношении человеческого 8АР, с мышиной плазмой или с нормальными мышиными тканями по результатам стандартных иммунохимиче- 21 026959 ских и иммуногистохимических анализов. Спустя двадцать восемь дней после интраперитонеальных инъекций всех мышей умерщвляли обескровливанием под терминальным наркозом, и печень и селезенку у каждого животного извлекали. Каждый орган взвешивали, а затем разделяли на три части, одну из которых также взвешивали и использовали для экстрагирования δΑΡ, в то время как вторую часть быстро замораживали для дальнейшего иммуногистохимического и цитохимического анализа без фиксации, а последнюю часть фиксировали в формалине с буфером для обычного гистологического анализа и оценки амилоида окрашиванием с использованием конго красного.¹⁹ Всех мышей взвешивали ко времени распределения по группам после индукции амилоидоза, но до введения ¹²⁵Ι-δΑΡ. Животных повторно взвешивали перед умерщвлением в конце эксперимента. У всех мышей брали кровь четыре раза: (1) непосредственно перед тем как группы два и три начинали получать ΟΡΗΡΟ; (2) за день до инъекции препаратов 1§О в группах два и три; (3) через 14 дней после инъекций 1§О; (4) во время умерщвления. Срезы селезенки и печени от всех животных, окрашенные конго красным, исследовали три различных экспертных наблюдателя, неосведомленных о воздействии, которое получала каждая мышь, и определяли сумму баллов амилоида, как описывалось ранее. Суммы баллов 10⁰-10⁴ представляют приблизительно 1од 10 шкалы ранжирования от 10⁰, что соответствует одному или двум очень маленьким пятнышкам амилоидоза среди нескольких срезов конкретного органа, до 10⁰, что соответствует избытку широко распространенных отложений, включающих в себя приблизительно в 10000 раз больше амилоида.¹³ Наблюдалось почти 100% совпадение между суммами баллов, подсчитанных разными наблюдателями, и суммы баллов наиболее опытного наблюдателя были, таким образом, использованы для настоящего анализа. Концентрации человеческого δΑΡ в сыворотках и экстрактах органов измеряли с помощью электроиммуноанализа.⁵ Временная линия протокола приведена ниже

День от -36 до -31 от -29 до -24 от -13 до -10 и -7

Процедура

Инъекция АЕР в/в всем мышам

Ежедневные инъекции п/к всем мышам Ежедневные инъекции п/к всем мышам Взвешивание всех мышей

Начало введения ΚΙ с питьевой водой всем мышам

Инъекция ¹²⁵1-ЗАР в/в всем мышам

Подсчет радиоактивности всего тела у всех мышей каждый день

Забор крови у всех мышей для анализа перед лечением

Начало введения СРНРС 1 мг/мл с питьевой водой для групп 1 и 2; группа 3 не получает лечения

Забор крови у всех мышей для анализа после лечения СРНРС и перед лечением антителами Инъекция овечьего 1дС против человеческого ЗАР группе 1

Инъекция контрольного овечьего 1дО группе 2 Группа 3 не получает лечения Забор крови у всех мышей Взвешивание всех мышей

Обескровливание и умерщвление всех мышей, забор органов

Результаты.

Масса тела и выживание. Масса тела значимым образом не различалась между группами. Средние (δΌ) массы в граммах на день -20, который представляет собой день после индукции амилоида и до инъекции изотопного индикатора, были следующими:

группа 1: 28,0 (2,7); группа 2: 27,7 (3,2); группа 3: 27,3 (3,1).

Средние (δΌ) массы в граммах на день 23, который представляет собой день непосредственно перед окончанием эксперимента, были следующими:

группа 1: 28,5 (2,8); группа 2: 28,4 (3,6); группа 3: 27,8 (3,3).

Ни одно животное не погибло во время фазы лечения эксперимента. В совокупности с постоянной

- 22 026959 массой тела это говорит о том, что введение СГНГС и анти-8ΑΡ антитела не оказывает значимого неблагоприятного клинического действия.

Величины человеческого 8ΑΡ. Сывороточные концентрации человеческого 8ΑΡ были одинаковыми во всех группах при первом заборе крови, предпринятом после индукции амилоидоза и до какого бы то ни было другого воздействия; при этом величины среди самок были достоверно выше, чем у самцов (табл. 1), как наблюдали авторы ранее в данной расе. При втором заборе крови, предпринятом через 4 дня после начала введения СΡНΡС в группах один и два и до введения анти-8ΑΡ антитела или контрольного овечьего 1§О, наблюдалось более чем 90% истощение циркулирующего человеческого 8ΑΡ (табл. 1), как ранее сообщали авторы.^16,17 Оценка концентрации человеческого 8ΑΡ не представлялось возможной в сыворотках из группы один и два на дни 14 и 28 после инъекции овечьего анти-8ΑΡ антитела или контрольного 1§О, в силу помех для анализа из-за персистенции указанных реагентов в циркуляции. В группе три, которая не получала другого воздействия, величины человеческого 8ΑΡ оставались без изменений на день 14, но были достоверно ниже на день 28 (табл. 1), возможно, в силу повреждения печени амилоидозом.

Количества человеческого 8ΑΡ, присутствующего в селезенках, изъятых в конце эксперимента, показаны в табл. 3. 8ΑΡ, включая трансгенный человеческий 8ΑΡ у указанных мышей, вырабатывается в печени. Интерпретация результатов анализа человеческого 8ΑΡ в печени к концу эксперимента, таким образом, осложняется тем фактом, что некоторое количество 8ΑΡ неизбежно присутствует, благодаря его синтезу гепатоцитами, а вовсе не связыванию циркулирующего 8ΑΡ с амилоидными отложениями в печени, если таковые имеют место. Также у самок наблюдаются устойчиво значимые более высокие, чем у самцов, концентрации человеческого 8ΑΡ в циркуляции (табл. 1) и в печени (табл. 3). Тем не менее содержание человеческого 8ΑΡ в печени животных в различных группах ранжируется в том же порядке, что и однозначные результаты по содержанию человеческого 8ΑΡ в селезенке животных.

Амилоидная нагрузка. Амилоидная нагрузка во всем теле была одинаковой в трех группах после индукции амилоида и до начала воздействия разных видов. Через 72 ч после инъекции изотопного индикатора ¹²⁵Ι-8ΑΡ задержка радиоактивности во всем теле составляла всего 10-11% инъецированной дозы у каждого из 8 контролей, не имевших амилоидоза. Среди мышей с амилоидозом средняя (8Ώ) задержка составляла:

группа 1: 57,1% (21,6); группа 2: 44,0% (19,5); группа 3: 50,1% (21,5).

Указанные различия не были достоверными, Ρ=0,054 по результатам одностороннего ΑΝΟνΑ.

К концу эксперимента гистологическая оценка амилоида в селезенке и печени показала высокодостоверные различия между группами, Ρ=0,0000 по результатам непараметрического дисперсионного анализа КгиккаГШаШк. Наблюдалось резкое уменьшение амилоида в группе 1 (СΡНΡС плюс анти-8ΑΡ) по сравнению с остальными двумя группами, но отсутствовала разница между группами 2 (только СΡНΡС) и 3 (контроль без воздействия) (фиг. 1 и 2). Среди 31 мыши в группе 1 амилоид не обнаружили у 23 животных, а у остальных 8 животных имелись лишь редкие микроскопические пятнышки. Напротив, среди 62 животных в двух контрольных группах, не получавших анти-8ΑΡ, не было ни одного животного, у которого амилоида не было бы вовсе. Указанная разница была высокодостоверной по результатам точного критерия Фишера, Ρ<0,0001._______

Группа	Амилоид присутствует	Амилоид отсутствует
Группа 1: СРНРС + анти-ЗАР	8	23
Группа 2: СРНРС+контрольный 1дС	30	0
Группа 3; без воздействия	32	0

Среди 62 контрольных мышей только у 12 наблюдались следы или малые количества амилоида; отложения у всех оставшихся животных были умеренными или тяжелыми. Типичные примеры гистохимического окрашивания на амилоид, соответствующие каждой их сумм баллов, показаны на фиг. 3.

Гистологическая картина. Срезы всех тканей селезенки и печени, окрашенные гематоксилинэозином, исследовали слепым в отношении групп и видов воздействия способом профессором гистопатологии университетского колледжа Лондона А.Р. ЭйШоп. Помимо амилоидных отложений, присутствовавших в группах два и три, и отсутствовавших в группе один, имелись умеренные изменения, соответствовавшие хроническому воспалению во многих, если не во всех, тканях, и указанные изменения не отличались друг от друга в группах.

Обсуждение.

Все мыши были умерщвлены с целью оценки амилоидной нагрузки на 60-й день после последней инъекции казеина и через 28 дней после лечения животных экспериментальной группы анти-8ΑΡ антителами. У всех мышей имели место значительные амилоидные отложения до воздействия с использованием анти-8ΑΡ или контрольного лечения, как показано задержкой ¹²⁵Ι-8ΑΡ, измеренной через 10 дней после последней инъекции казеина. Не наблюдалось достоверной разницы между группами, и имела ме- 23 026959 сто, как ожидалось, некоторая спонтанная регрессия амилоидных отложений у нескольких контрольных мышей к концу исследования. Однако не было ни одной мыши из 62 контрольных животных в группах два и три, у которых амилоида не было бы вовсе. Напротив, у 23 из 31 мыши, которые получали антиδΑΡ антитело, а также ΟΡΗΡΟ, амилоид в селезенке или печени выявлен не был. Единственными амилоидными отложениями, обнаруженными у животных, которых лечили с использованием анти-δЛΡ, были несколько микроскопических пятнышек, что на порядки величины меньше большей части отложений, присутствовавших у 50 из 62 мышей, которые не получали анти-δΑΡ. Совершенно понятно, что лечение с использованием анти-δΑΡ обеспечивало указанный замечательный клиренс амилоидных отложений в группе один, поскольку у мышей, получавших ΟΡΗΡΟ и контрольную фракцию овечьего 1дС из неродственной антисыворотки (группа два), наблюдался избыток амилоида, не отличимый от количества у контролей в группе три, которые вовсе не получали лечения.

Результаты гистохимического анализа после окрашивания конго красным подтвердили оценку содержания человеческого δΑΡ в селезенке и печени животных. Не был выявлен человеческий δΑΡ в селезенке 29 из 31 мыши в группе один и только следовые количества у остальных двух животных. Контрольные животные из группы три имели значительные количества человеческого δΑΡ, которые соответствовали их тяжелой амилоидной нагрузке, а мыши из группы два имели приблизительно четверть содержания человеческого δΑΡ, несмотря на то что амилоидная нагрузка была такой же, поскольку они получали ΟΡΗΡΟ непрерывно в течение 33 дней перед умерщвлением. Концентрации человеческого δΑΡ были уменьшены более чем на 90% в сыворотках всех мышей, получавших ΟΡΗΡΟ в группах один и два, по сравнению с контрольной группой три. Данный результат показывает способность ΟΡΗΡΟ истощать человеческий δΑΡ из циркуляции; в то же время значительные количества человеческого δΑΡ остаются в амилоидных отложениях и представляют собой мишень терапевтического эффекта анти-δΑΡ антител. Комбинация ΟΡΗΡΟ и анти-δΑΡ антитела, таким образом, является важнейшей для настоящего изобретения: низкомолекулярное лекарственное средство очищает плазму крови и внесосудистые жидкости от человеческого δΑΡ таким образом, что впоследствии введенное анти-δΑΡ антитело может достигать δΑΡ, располагающегося в амилоидных отложениях, и там осуществляет свою ключевую функцию, запуская регрессию и клиренс амилоидных фибрилл.

Заключение.

Комбинированное лечение лиц с установленными системными амилоидными отложениями с использованием ΟΡΗΡΟ и анти-δΑΡ антител безопасно и эффективно обеспечивает быстрый и практически полный клиренс отложений. Ранее этого не удавалось добиться ни у одного пациента или экспериментального животного или каким бы то ни было иным способом. Изобретение является применимым при всех формах приобретенного и наследственного системного и локального амилоидоза, а также при всех других заболеваниях, которые связаны с отложениями амилоида, включая болезнь Альцгеймера и диабет 2 типа.

Пример 2. Лечение пациента с системным амилоидозом с использованием ΟΡΗΡΟ и анти-δΑΡ антитела.

Диагноз пациенту, страдавшему системным амилоидозом, был поставлен после клинического обследования и обычных исследований, дающих возможность заподозрить амилоидоз, с последующим особым подтверждением экспертным гистохимическим исследованием биоптатов пораженных тканей. Сцинтиграфию с использованием δΑΡ с радиоактивной меткой осуществляли в Национальном Центре амилоидоза Великобритании при Центре амилоидоза и белков острой фазы в медицинском отделении университетского колледжа Лондона при госпитале Коуа1 Ргее. Исследование тканей идентифицирует конкретный тип амилоида, а томография, в сочетании с эхокардиографическим исследованием сердца, показывает, где расположен амилоид, и количественно определяет его распространенность. Обычные клинические исследования функции органов устанавливают распространенность и тяжесть повреждения тканей и органов, вызванного амилоидными отложениями, а также наличие и тяжесть любого первичного заболевания, которое могло привести к отложению амилоида.

Условно, два основных первых этапа лечения подобного пациента состоят из: (1) поддержания функции органов всеми возможными средствами, включая необходимую медикаментозную терапию и замену органа, если это необходимо, включая гемодиализ и трансплантацию органа, и (2) применение любой доступной терапии для уменьшения избыточного количества белка-предшественника, который образует амилоидные фибриллы. Последней цели бывает очень трудно добиться, а иногда и невозможно, так что повреждение органа прогрессирует до недостаточности органа, тяжелого заболевания и обычно приводит к смерти.

В соответствии с настоящим изобретением в указанном случае пациента лечат для приостановки отложения амилоида и устранения уже существующих амилоидных отложений из тканей, что приводит к клиническому улучшению.

Пациента лечат δΑΡ-истощающим лекарственным средством, ΟΡΗΡΟ, которое вводят болюсной внутривенной инъекцией в дозе 100 мг. На следующий день берут кровь на анализ. Посредством специфичного иммуноанализа подтверждают, что концентрация δΑΡ в сыворотке крови уменьшилась на 90%. Затем осуществляют внутривенную инфузию анти-δΑΡ антитела, и в течение нескольких часов вводят

- 24 026959 антитело в дозе 1000 мг, достаточной для связывания с 8АР в амилоидных отложениях по всему телу. СРНРС вводят парентерально два раза в день в течение следующих двух недель, чтобы гарантировать, что уровни 8АР в плазме останутся пониженными. Все аспекты клинического состояния и функции органов пациента тщательно мониторируют на ежедневной основе, и улучшения функции органов выявляют в течение дней после инфузии антитела. Через месяц после лечения, когда СРНРС выведена из организма, а анти-8АР антитело подверглось распаду, пациент проходит повторную сцинтиграфию с использованием 8АР для оценки наличия и распространенности любых остаточных амилоидных отложений. После этого лечение с использованием СРНРС возобновляют с использованием подкожных инъекций дважды в день в дозе 0,5 мг/кг, что гарантирует, что как можно меньше 8АР повторно накапливается в любом остаточном амилоиде в тканях. Сцинтиграфию с использованием 8АР затем повторяют 3 раза в месяц для мониторинга продолжающейся регрессии амилоида, с прекращением введения СРНРС за одну неделю до каждой томографии и его возобновлением немедленно после нее. После того как пациента оценивают как не имеющего амилоидных отложений, введение СРНРС прекращают, но мониторинг продолжают сцинтиграфией с использованием 8АР для выявления любого дальнейшего патологического отложения амилоида. В течение периода наблюдения заболевания у пациента не отмечается, но если отложение амилоида возобновляется, лечение с использованием СРНРС и анти-8АР повторяют, как это требуется для клиренса амилоида и поддержания его отсутствия.

Таблица 1

Концентрации человеческого 8АР в сыворотке [среднее (80) мг/л]

	самцы	самки
группа	1 (п=21)	2 (п=20)	3 (п=20)	1 (п=10)	2 (п=10)	3 (п=12)
лечение	СРНРС + анти- ЗАР	СРНРС	ничего	СРНРС + анти- ЗАР	СРНРС	ничего
до забора крови день -2	37,1 (14,1)	35,1 (7,9)	35,8 (12,0)	72,0 (14,3)	82,6 (20,2)	78,2 (21,3)
после СРНРС до антитела день 0	2,6 (2,5)	2,9 (1,3)	35,4 (14,6)	3,1 (1,9)	4,0 (1,4)	74,3 (17,3)
после антитела день 14	N1	следы	33,2 (11,1)	N1	следы	67,9 (20,9)
после антитела день 28	N1	следы	*24,0 (6,4)	N1	следы	⁺*54,0 (.12,6)

N1, не интерпретируется из-за персистенции анти-8АР антитела в сыворотке; следы, очень низкая концентрация, но не поддается количественному определению. Из-за помех, связанных с персистенцией овечьего 1§О в сыворотке.

* Достоверно ниже, чем в предыдущих анализах крови, Р=0,0047 по результатам АNΟУА.

** Достоверно ниже, чем в предыдущих анализах крови, Р=0,0131 по результатам АNΟУА.

Таблица 2. Содержание человеческого 8АР в селезенке к концу эксперимента (мкг на целый орган)

	самцы и самки
группа	1 (п=31)	2 (п=30)	3 (п=32)
лечение	СРНРС + анти- ЗАР	СРНРС + контрольный 1дС	ничего
медиана	0	15	69
ранг Ιβ	0-0	1-18	38-113
ранг	0-4	0-35	3-304

8АР не экспрессируется в селезенке, и не наблюдалось разницы между самцами и самками в отношении количества амилоида в селезенке или количество человеческого 8АР в любой из трех групп. Содержание 8АР в селезенке, таким образом, показано в настоящем документе в целом для каждой группы. Статистическая значимость для разницы между группами (критерии Манна-Уитни): группа 1 по сравнению с группой 2, Р=0,0000; группа 1 по сравнению с группой 3, Р=0,0000; группа 2 по сравнению с группой 3, Р=0,0000.

Таблица 3. Содержание человеческого 8АР в печени к концу эксперимента (мкг на целый орган)

- 25 026959

	самцы	самки
группа	1 (п=20)	2 (п=20)	3 (п=20)	1 (п=10*)	2 (п=10)	3 (п=12)
лечение	СРНРС + анти- ЗАР	СРНРС + контрольный 1дС	ничего	СРНРС + анти- ЗАР	СРНРС + контрольный 1дС	ничего
медиана	0	59	82	58	78	142
ранг Ιζ>	0-0	42-75	56-117	40-76	60-112	76-289
ранг	0-56	0-100	7-150	24-87	52-148	35-735

* Образец от одной мыши не был пригоден для анализа. Статистическая значимость для разницы между группами (критерии Манна-Уитни): группа самцов 1 по сравнению с группой 2 или группой 3, Р=0,000; группа 2 по сравнению с группой 3, Р=0,0337; группа самок 1 по сравнению с группой 2, Р=0,0413; группа 1 по сравнению с группой 3, Р=0,0069; группа 2 по сравнению с группой 3, Р=0,0698.

Пример 3. Влияние различных доз анти-ЗАР антитела на клиренс амилоида.

Протокол и методы эксперимента.

В эксперименте с использованием точно такого же протокола и реагентов, как описано в примере 1 выше, различные группы по 5 мышей в каждой получали следующие дозы одной и той же фракции 1§О овечьей антисыворотки против человеческого ЗАР, как в примере 1: 50 мг (та же доза, что в примере 1); 10 мг; 2 мг; 0,4 мг; ничего. Количество анти-ЗАР антитела в указанных дозах составляло 7 мг, 1,4 мг, 0,28 мг, 0,056 мг и ноль, соответственно.

Результаты.

В двух группах, получавших самые высокие дозы анти-ЗАР антитела, практически все амилоидные отложения в селезенке и печени исчезли. Ни в одной из леченных другим антителом групп не наблюдалось никакого сокращения амилоидных отложений, и не наблюдалось разницы по сравнению с контрольной группой, которая не получала антитела.

Обсуждение.

Минимальная эффективная доза указанного конкретного овечьего поликлонального анти-ЗАР антитела, взеденная однократной дозой по протоколу, описанному в примере 1, была больше 0,28 мг, а доза 1,4 мг показала максимальную эффективность.

Используя приведенный выше пример, специалист сможет определить подходящие дозировки для введения людям, принимая во внимание известные различия в клиренсе и метаболизме между двумя видами.

Пример 4. Течение во времени, механизм и клинические эффект клиренса амилоида, вызываемого действием анти-ЗАР антитела.

Протокол и методы эксперимента.

В эксперименте с использованием точно такого же протокола и реагентов, как описано в примере 1 выше, различные группы по 5 мышей в каждой получали точно такое же лечение, как в указанном эксперименте, включая 50 мг дозу фракции 1§О, содержавшую 7 мг анти-ЗАР антитела, а затем животные были умерщвлены через 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21 и 25 дней после введения антитела. Образцы плазмы, полученные от каждого животного во время умерщвления, хранили в замороженном виде до проведения биохимического анализа одной серией к концу эксперимента. Во время умерщвления у каждой мыши удаляли селезенку и печень и обрабатывали для анализа точно так же, как описано в примере 1. Помимо окрашивания конго красным для определения распространенности отложения амилоида, фиксированные срезы тканей, окрашенные стандартным способом с использованием гематоксилин-эозина, исследовали для гистопатологической оценки, и должным образом подготовленные ткани анализировали с помощью иммуногистохимического и иммуноцитохимического окрашивания на предмет релевантных белков и клеточных маркеров, с использованием надежных стандартных доступных реагентов и методов. Некоторые ткани исследовали также с использованием стандартного электронного микроскопа. Все исследования, считывание и определение суммы баллов срезов производились экспертными наблюдателями, неосведомленными по поводу происхождения образцов. Контрольные ткани получали от мышей, у которых точно так же индуцировали системный амилоидоз АА, но которые получали контрольный овечий 1§О, лишенный анти-ЗАР активности.

Результаты.

В самую раннюю временную точку, через 24 ч после инъекции анти-ЗАР антитела, уже наблюдалась массивная инфильтрация амилоидных отложений клетками воспаления, идентифицированными окрашиванием гематоксилин-эозином, преимущественно, как макрофаги с некоторым количеством гранулоцитов (фиг. 4). Указанная картина представляла собой разительный контраст с обычными бесклеточными амилоидными отложениями у контрольных мышей, не получавших антитела. Фотографии тканей, сделанные под электронным микроскопом на день 1, показали тесный контакт макрофагов и гранулоцитов с амилоидными отложениями (фиг. 5). В течение нескольких следующих дней клеточная ин- 26 026959 фильтрация амилоидных отложений сохранялась, становилась подавляюще мононуклеарной и содержала возрастающие количества многоядерных гигантских клеток, окружающих и отчетливо поглощающих прогрессирующе фрагментированные и уменьшенные скопления амилоида (фиг. 4). Клеточный инфильтрат и количество амилоида выраженно уменьшались в 7-10-му дню, а к 15-му дню амилоидные отложения и инфильтрирующие клетки почти полностью исчезли. Гистологические картины на 121- и 25-й день почти не отличались от нормальных, неамилоидных, тканей.

Иммуногистохимическое окрашивание антителом против Р4/80, глобального маркера макрофагов, идентифицировало картину как преобладающий компонент массивной ранней клеточной инвазии амилоидных отложений (фиг. 6). Почти не наблюдалось окрашивания на Р4/80 в амилоидных отложениях у контрольных мышей, которые не получали анти-8АР антитела, не было также повышенного окрашивания на Р4/80 в тканях леченных анти-8АР мышей, кроме как в амилоидных отложениях и вокруг них. На день 4 наблюдалось интенсивное окрашивание на СЭ68. маркер фагоцитарной активности макрофагов, во всех клетках в амилоидных отложениях и вокруг них, как показано иммунопероксидазной гистохимией и конфокальной микроскопией (фиг. 6). Фрагментированные остатки амилоида, к тому времени окруженные или усвоенные макрофагами или гигантскими клетками, окрашивались антителом к мышиному АА, которые были локализованы совместно с окрашиванием антителом против человеческого 8АР, антиовечьим 1дС и антимышиным С3 антителами (фиг. 6). С3 представляет собой наиболее распространенный компонент комплемента и является ответственным за ключевую хемотактическую и опсоническую активность системы комплемента.

Не наблюдалось ни достоверных отклонений от нормы, ни какой бы то ни было достоверной разницы между группами во всех исследованных при анализе веществах плазмы, включавших в себя: натрий, калий, хлорид, мочевину, креатинин, кальций, фосфат, щелочную фосфатазу, аланинтрансаминазу, аспартаттрансаминазу, общий белок, альбумин, общий холестерин, триглицериды, глюкозу, общий билирубин, креатинкиназу, лактатдегидрогеназу.

Обсуждение.

Введение анти-8АР антитела мышам с амилоидозом, у которых циркулирующий 8АР был истощен посредством СРНРС, вызывало очень быструю и интенсивную инфильтрацию амилоидных отложений, главным образом, макрофагами. Многие из указанных клеток быстро сливались, образуя многоядерные гигантские клетки, которые окружали и поглощали островки амилоида, и это сопровождалось быстрым и почти полным клиренсом отложений. Через 15 дней после введения антитела амилоид практически исчезал, а клеточная популяция тканей быстро возвращалась к норме. Не наблюдалось клинически очевидных неблагоприятных эффектов лечения, а образцы плазмы, взятые во время умерщвления у всех мыией во всех группах, не показали нарушений функции почек или печени, отклонений в липидах плазмы, общем белке или альбумине, или биохимических свидетельств повреждения мускулатуры. Таким образом, практически полный клиренс значительных висцеральных амилоидных отложений у указанных животных не вызывал клинических симптомов и не причинял вреда.

Преобладающий клеточный тип, устойчиво инвазировавший амилоидные отложения, идентифицировали окрашиванием гематоксилин-эозином как макрофаги, и это подтверждалось электронной микроскопией и иммуноцитохимическими анализами, а также их активной ролью в фагоцитозе и деструкции амилоида. Наличие человеческого 8АР, овечьего 1дС и мышиного С3 в амилоидных АА отложениях внутри и окруженных макрофагами соответствовало следующему механизму. Антитело против человеческого 8АР связывается с человеческим 8АР, связанным с амилоидными отложениями, и активирует комплемент, генерируя мощные хемотактические аттрактанты, С3а и С5а. Фагоцитарные клетки, главным образом макрофаги, затем окружают и инфильтрируют амилоидные отложения и активно переваривают амилоид, который был опсонизирован комплементом и 1дС антителом, и опосредованная макрофагами деградация быстро устраняет отложения.

Пример 5. Утверждение упрощенных протоколов по использованию анти-8АР антитела.

В стандартном протоколе, подробно описанном в примере 1, используются мыши, у которых ген мышиного 8АР был устранен, а трансген человеческого 8АР был внедрен для обеспечения экспрессии человеческого 8АР. Также использовали введение СРНРС с питьевой водой, которое начинали вскоре после введения анти-8АР антитела и продолжали в течение всего оставшегося времени эксперимента. Для того чтобы изучить потребность в указанном продолжительном лечении с использованием СРНРС, использовали однократную парентеральную дозу СРНРС у мышей, которые были трансгенными в отношении человеческого 8АР на основе дикого типа, а не мышей с нокаутом 8АР, как в предыдущих примерах. При другом подходе, который является критически важным для исследований на мышах с генетическими модификациями, не имеющими отношения к 8АР, амилоидные отложения нетрансгенных мышей дикого типа с амилоидозом нагружали человеческим 8АР с помощью однократной парентеральной инъекции изолированного чистого человеческого 8АР.

Протоколы и методы эксперимента.

АА-амилоидоз индуцировали и подтверждали у мышей, трансгенных в отношении человеческого 8АР, на основе дикого типа в точности, как описано в примере 1 выше. Затем они получали однократную интраперитонеальную инъекцию 1 мг СРНРС; спустя 5 ч в экспериментальной группе (п=10) осуществ- 27 026959 ляли интраперитонеальную инъекцию 25 мг фракции 1§С той же овечьей сыворотки против человеческого 8АР, которую использовали во всех предыдущих примерах. Контрольные мыши (п=8) получали овечий 1§С, не обладавший анти-8АР активностью. Спустя шестнадцать дней всех мышей умерщвляли для оценки амилоидной нагрузки с использованием окрашивания конго красным.

Впоследствии 15 мышей дикого типа, у которых индуцировали и подтверждали амилоидоз АА, точно таким же образом, как описано в примере 1, нагружали человеческим 8АР с использованием однократной интраперитонеальной инъекции 10 мг изолированного чистого человеческого 8АР. Человеческий 8АР, инъецированный мышам с амилоидозом, локализуется и персистирует в амилоидных отложениях (фиг. 7) с полупериодом существования приблизительно 3-4 дня, в то время как человеческий 8АР, не связавшийся с амилоидом, исчезает из циркуляции с полупериодом существования приблизительно 3_{4 ч}.¹⁶·¹⁸

Спустя три дня после инъекции человеческого 8АР, когда человеческий 8АР более не определялся в циркуляции, каждая мышь получала однократную интраперитонеальную инъекцию 50 мг фракции 1§С овечьей антисыворотки против человеческого 8АР, а затем их всех умерщвляли спустя 15 дней для оценки амилоидной нагрузки с использованием окрашивания конго красным.

Результаты.

Амилоидные отложения у мышей, трансгенных в отношении человеческого 8АР, на основе дикого типа, были устранены так же эффективно однократной дозой анти-8АР антитела, как и во всех предыдущих экспериментах на нокаутных мышах, трансгенных в отношении человеческого 8АР.

Подобно этому после нагрузки мышиных АА амилоидных отложений у мышей дикого типа пассивно введенным человеческим 8АР, введение анти-8АР антитела вызывало такой же выраженный клиренс отложений, как наблюдалось ранее.

Обсуждение.

Данные результаты показывают, что наличие человеческого 8АР в амилоидных отложениях и отсутствие значительной концентрации человеческого 8АР в циркуляции является достаточным для терапевтической эффективности анти-8АР антитела по настоящему изобретению. Указанные достаточные условия наиболее просто достигались или использованием однократной парентеральной дозы СРНРС животным, трансгенным в отношении человеческого 8АР, или нагрузкой амилоидных отложений у мышей дикого типа человеческим 8АР посредством его однократной парентеральной инъекции. Последняя модель является чрезвычайно полезной, поскольку она делает возможным анализ механизма действия анти-8АР антитела у генетически модифицированных мышей (см. пример 6, ниже) без необходимости длительного интербридинга.

Важно, что СРНРС является необходимой для субъектов-людей, у которых всегда имеет место непрерывная выработка 8АР в количестве 50-100 мг в день,⁶ и у которых она абсолютно необходима для истощения плазменного 8АР перед введением анти-8АР антитела.

Пример 6. Зависимость клиренса амилоида анти-8АР антителом от комплемента.

Роль комплемента в клиренсе амилоида анти-8АР антителом изучали путем сравнения эффективности лечения у мышей с дефицитом комплемента и у животных дикого типа с нормальным достаточным содержанием комплемента. Направленная делеция гена С.'1с| блокирует активацию классического пути комплемента, который инициируется связыванием С1с| с комплексами антиген-антитело, но активация С3, кардинальный функциональный этап, ответственный за хемотаксис и опсонизацию, главные биологические функции комплемента, все равно может продолжаться посредством альтернативных и лектиновых путей, а также посредством прямого расщепления С3 серин-протеиназами, не принадлежащими к системе комплемента. Направленная делеция гена С1с| полностью аннулирует указанные функции.

Протоколы и методы эксперимента.

АА-амилоидоз индуцировали и подтверждали, в точности как описано в примере 1 выше, в двух группах мышей с дефицитом комплемента: нокауты С3 (п=14) и нокауты С1с| (п=12). Всех мышей затем нагружали человеческим 8АР и всех, за исключением двух, лечили с использованием анти-8АР, как описано в примере 5, перед тем как их умертвить на день 15 для оценки амилоидной нагрузки.

Результаты.

Выраженная противоположность эффективному клиренсу амилоидных отложений у всех мышей с нормальным содержанием комплемента, которых ранее лечили с использованием анти-8АР, как описано в примерах 1-5, заключалась в том, что в обеих группах животных с дефицитом комплемента имели место распространенные амилоидные отложения, хотя они имели тенденцию более фрагментированного внешнего вида, чем у двух контрольных мышей каждого типа с дефицитом комплемента. Суммы баллов амилоида в селезенке были незначительно выше у мышей с дефицитом С1с| (медиана 10⁴, ранг 10²-10⁴), чем у мышей с дефицитом С3 (медиана 10³, ранг 10²-10⁴), но указанная разница не достигала статистической значимости.

Обсуждение.

У мышей с отсутствием С1с| или С3 лечение с использованием анти-8АР не вызывало устранения амилоидных отложений. Терапевтическая эффективность анти-8АР, таким образом, очень сильно зависит от комплемента и не опосредуется только антителом 1§С, которое может, теоретически, привлекать

- 28 026959 клетки фагоцитоза через их рецепторы Рс(у). Тем не менее более фрагментированный вид устойчивых амилоидных отложений у мышей с дефицитом комплемента предполагает, по меньшей мере, некоторый эффект антитела в отдельности. Также тенденция к более выраженному клиренсу у животных с дефицитом С1с| по сравнению с животными с дефицитом С3 наводит на мысль о том, что активация С3 является ключевой и что даже в отсутствии С1с| и классического пути, который обычно активируется антителом 1дС. некоторая активация комплемента может иметь место.

Пример 7. Потребность в цельном анти-§АР антителе 1дС.

Активация комплемента антителом 1дС требует цельной интактной молекулы, включающей область Рс, и происходит через классический путь, инициируемый связыванием С1с|. В некоторых системах антитело-антиген менее эффективная активация комплемента через альтернативный путь может опосредоваться фрагментом Р(аЬ)₂. Для того чтобы подтвердить зависимость клиренса амилоида анти§АР антителом от комплемента и изучить потенциальную потребность в Рс области антитела, изучали эффект Р(аЬ)₂ анти-§АР антитела.

Протоколы и методы.

АА-амилоидоз индуцировали и подтверждали у мышей С57ВЬ/6 дикого типа, в точности как описано в примере 1 выше. После нагрузки амилоидных отложений человеческим §АР, как подробно описано в примере 5, группы мышей лечили цельной фракцией 1дС овечьей поликлональной антисыворотки против человеческого 8АР (п=8), только носителем с буфером (п=10) или фрагментом Р(аЬ)₂ фракции 1дС (п=5), полученным расщеплением пепсином при рН 4,0. Доза активности инъецированного анти-§АР антитела составляла 7,28 мг на мышь, получавшую Р(аЬ)₂, и 7 мг (50 мг общего 1дС, как обычно) на мышь, получавшую цельный 1дС. Всех мышей умерщвляли спустя 14 дней для оценки амилоидной нагрузки с использованием окрашивания конго красным.

Результаты.

Клиренс амилоидных отложений был почти полным у мышей, получавших анти-§АР антитело 1дС, который имел среднюю (ранг) сумму баллов амилоида в селезенке 10⁰ (10⁰-10³), по сравнению с массивными амилоидными отложениями у контрольных мышей со средней (ранг) суммой баллов амилоида в селезенке 10⁵ (10⁴-10⁵). Мыши, получавшие Р(аЬ)₂, имели меньше амилоида, чем нелеченные контроли, средняя сумма баллов 10², ранг 10⁰-10⁴, но все же значительно больше, чем у мышей, леченных цельным анти-§АР антителом 1дС.

Обсуждение.

Молярная доза Р(аЬ)₂ анти-§АР антитела, использовавшаяся в данном исследовании, была приблизительно на одну треть больше дозы антитела 1дС, с учетом меньшей молекулярной массы фрагмента Р(аЬ)₂ по сравнению с цельным 1дС. Влияние на клиренс амилоида, однако, было значительно меньше, что показывает, что основное действие анти-§АР антитела требует наличия области Рс. Это происходит не потому, что в процессе участвует прямое распознавание клетками рецепторов Рс(у), поскольку цельный 1дС был даже менее эффективным у животных с дефицитом комплемента, чем Р(аЬ)₂. У мышей с нормальным содержанием комплемента. Возможно, высокая доза Р(аЬ)2, которую использовали, способна активировать некоторое количество комплемента через альтернативный путь.

Пример 8. Потребность в макрофагах.

Гистологические и гистохимические исследования, описанные в настоящем документе, показывают, что клетки, которые инфильтрируют, окружают и фагоцитируют амилоидные отложения у мышей, леченных анти-§АР антителом, являются макрофагами. Для того чтобы подтвердить, что они на самом деле отвечают за клиренс амилоида, изучали эффект лечения с использованием анти-§АР мышей, у которых активность всех макрофагов была ингибирована введением липосомального клодроната. Реагенты, протокол эксперимента и влияние липосомального клодроната на функцию макрофагов хорошо разработаны и обширно задокументированы.²²

Протоколы и методы.

После индукции и подтверждения АА-амилоидоза у мышей дикого типа с использованием точно такого же протокола, который подробно описан в примере 1 выше, все животные получали однократную интраперитонеальную дозу 10 мг изолированного чистого человеческого 8АР для нагрузки их амилоидных отложений человеческим §АР. Экспериментальная группа (п=13) затем получала 0,3 мл липосомального клодроната интраперитонеально немедленно и на дни 2, 7 и 14 дней спустя. Одна контрольная группа (п=12) и экспериментальная группа получали однократную интраперитонеальную дозу 50 мг фракции 1дС овечьей антисыворотки против человеческого 8АР на день 3 после инъекции человеческого §АР. Вторая контрольная группа (п=12) не получала ни анти-§АР, ни другого дополнительного лечения. Всех мышей умерщвляли спустя 14 дней после введения анти-§АР для оценки амилоидной нагрузки с использованием окрашивания конго красным.

Результаты.

Лечение с использованием анти-§АР обеспечивало почти полный клиренс амилоидных отложений по сравнению с группой, которая не получала антитело, средние (ранг) суммы баллов амилоида в селезенке составляли 10⁰ (0-10³) и 10³ (10³-10⁴) соответственно. У мышей, которые получали липосомальный

- 29 026959 клодронат по схеме, известной для полного устранения функции макрофагов, не наблюдалось клиренса амилоидных отложений, сумма баллов амилоидной нагрузки составляла 10⁵ (10²-10⁵).

Обсуждение.

Результат данного эксперимента подтвердил, что функция макрофагов является важной для клиренса амилоидных отложений антителом против человеческого 8АР.

Выводы из примеров 3-8.

Введение анти-8АР антитела весьма воспроизводимым образом вызывает быстрый и почти полный клиренс висцеральных амилоидных отложений у мышей с АА-амилоидозом, у которых человеческий 8АР присутствует в амилоидных отложениях, но отсутствует в циркуляции, как благодаря лечению мышей, трансгенных в отношении человеческого 8АР, с использованием СРНРС, так и благодаря природному клиренсу после пассивного введения человеческого 8АР мышам дикого типа.

В связи с лечением клинических или биохимических неблагоприятных эффектов не наблюдалось.

За инъекцией анти-8АР антитела быстро следует интенсивная инфильтрация амилоидных отложений макрофагами, которые окружают и поглощают амилоид, образуют множество многоядерных гигантских клеток и разрушают отложения.

Деградация амилоида завершается к 15-му дню, а нормальная гистология восстанавливается к 2125-му дню после введения однократной дозы анти-8АР антитела.

Клиренс амилоида требует интактной системы комплемента и является абсолютно зависимым от макрофагов.

Принимая во внимание подробно описанные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение, определенное приведенными выше разделами, не ограничивается конкретными представленными подробностями описания, поскольку множество очевидных изменений являются возможными без отступления от идеи или объема настоящего изобретения. Различные модификации и вариации описанных способов и системы по настоящему изобретению будут очевидны для специалистов без отступления от идеи или объема настоящего изобретения. Несмотря на то что изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение в том виде, в котором оно заявлено, не должно незаконно ограничиваться указанными конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые являются очевидными для специалистов в области фармакологии и молекулярной биологии или в родственных областях, подразумеваются как входящие в объем следующей формулы изобретения.

Ссылки

- 30 026959

1. Реруз, М.В. (2006) Αηιγίοίάοδΐδ. Аппи. Κβν. МеА., 57: 223-241.

2. Νείδοη, 8.Ю, Ьуоп, Μ., ОаПадЬег, Ι.Τ., ШЬпзоп, Ε.Α. апс! Реруз, М.В. (1991) 1зо1айоп апй сЬагас1епгайоп οίШе Ш1ерга1 §1усозаттод1усап сопзШиепЦ οί Нитап атукяй А апй топос1опа1 НдШ-сЬат ату1оЫ ЙЬгИз. Вюскет. 7, 275: 67-73.

3. Реруз, М.В., Оуск, К.Р., йе Веег, Р.С., 8к1ппег, М. апй СоЬеп, А.8. (1979) ВтсЬпд οί зегит ату1о1й Р сотропеп! (ЗАР) Ьу ату1о1й ЙЬгИз. СИп. Ехр. 1ттипо1., 38:

284-293.

4. Реруз, М.В., ВооШ, О.Р., НШсЫпзоп, АУ.Ь., ОаШтоге, Ι.Κ., СоШпз, Р.М. апй НоЬепезХег,

Е. (1997) Атукпй Р сотропепй А спйса1 Γβνϊενν. АтукнА: Ιηί. А Ехр. СИп.

4:274-295.

5. Νεΐ3οη, 8.К., Теппет, О.А., 8е1Ы, ϋ., Οον/ег, Р.Е., ВаПагШе, Ρ.Ψ., Ата1ауаки1-СЬап11ег,

8. апй Реруз, М.В, (1991) Зегит ату!о1Й Р сотропеп! ίη сЬгошс гепа! ГаПиге апй

Ша1уз1з. СИп. Скгт. Ас ία, 200: 191-200.

6. На'Мйпз, Ρ.Ν., ЗУооЬоп, К. апй Реруз, М.В. (1990) Ме1аЪоИс зШШез οίгайююйтаШй зегит атуЫй Р сотропеп! ίη погта! зиЬ]ес1з апй райеШз МШ зуз!ет1с ату1ок1о513.

7. СИп. Ιηνβχί., 86: 1862-1869,

7. Реруз, М.В., КайетасЬег, Τ.Ψ., Ата1ауаки1-СНапЙег, 8., ДУПЬатз, Р., ΝοΗΙβ, О.Е.,

НиТсЫпзоп, XV.Ь., Налуктз, Ρ.Ν., Νβίβοη, 8.К., ОаШтоге, ЕЮ, НегЬей, I., НиЬоп, Т. апй Ον/ек, К.А. (1994) Нитап зегит ату1о1Й Р сотропеп! Ϊ3 ап шуапап! сопзШиеп! οί ату1о1Й Йерозкз апй Ьаз а итцие1у Ьотодепеоиз р1усоз1гис1иге. Ргос. ΝαίΙ. АсаА.

Зег. и8А, 91: 5602-5606.

8. Реруз, М.В. апй НалукШз. Ρ.Ν. (2003) АтуЫйозк. 1п: Ох/огА ТехЛоок о/МесИсте, 41к

ЕА, ΥοΙ. 2 0Уагге11, Э.А., Сох, Т.М., РЬШ, ΕΏ. апй Βεηζ, ЕЛ., Ш., ейз.), ОхГогй ишуегзйу Ргезз, ОхШгй, рр. 162-173.

- 31 026959

9. ВаНг, М.Ь., Сааре О·, Ηίηά, С.К.К., Ρβίηβίείη, А. апс! Реруз, М.В. (1986) 1зо1айоп апё сЬагайепзаНоп оР ату1о!(1 епкапстд Рас1ог. 1п: Атукнсккй (О1еппег, О.О., Оззегтап, Е.Р., Ββηάϊίΐ, Е.Р., Са1ктз, Е., СоЬеп, А.8. апд 2искег-Ргапк1т, I)., едз.), Р1епит Ргезз, Νσνν Уогк, рр. 115-121.

10. ЗУесЬа1екаг, ΑΌ., Оообтап, Н.ЕВ., Еасктапп, НД., Ойег, М., На\уктз, Ρ.Ν. апё

ОШтоге, .ΙΌ. (2007) 8аРе1у апб еРйсасу оР пзк-ас!ар1сс1 сусЛорНозрЬатМе, 1Ьа1Ыопц(1е, апЦ ДехатеШазопе ίη зуз1ет1С АЬ ату1о1<1оз13. ΒΙοοά, 109: 457-464.

11. На\уктз, Ρ.Ν. апс! Реруз, М.В. (1991) А ρηιηβά з!а!е βχΪ5ί3 гп νίνο Ρο11ο\νίη§ ге§гезз1оп оГтиппе АА ашу1о10оз13.1п: ΑπινίοίΑ αηάАту1оШоы5 1990 (ΝηΙνί^, ЕВ., Рогге, О.,

НизЪу, О., НизеЪекк, А., 8ко§еп, В., 81еПеп, К. агО '\Уез1егтагк, Р., ебз.), Κΐιπνβτ Асабепис РиЪНзЪегз, ОоШгесШ, рр. 264-267.

12. ОШтоге, Εϋ., Ъоуар Ь.В., Регзеу, М.К., Реруз, М.В. апб Наууктз, Ρ.Ν. (2001) Αηρ/Ιοίά

1оаё апс! сНтса1 ои1соте ΐη АА ату1о10оз15 ΐη ге1а!лоп ίο сксШаТтд сопсепТгайоп оР зегит ату1оШ А рго1ет. Ьстсе1, 358: 24-29.

13. Βοϋΐο, М., Нахуктз, Ρ.Ν., В1скегз1аРГ, М.С.М., НегЪеЛ, I., Вудгаче. А.Е., МсВгЫе, А.,

НШсЫпзоп, ν/.Ь., ТеппепЕ, О.А., \¥а!рог1, МД. апЪ Реруз, М.В. (1997) Αηψίοίά ёерозШоп Ϊ3 ёе1ауед ίη ппсе \νίίή 1аг§е1е<3 άβίείίοη оР Ше зегит ату1о10 Р сотропеп! репе. ΝαΙ-иге Μβά., 3: 855-859.

14. Уататига, К.-Е, ТазЫго, Г., Υί, 8., \Уакази£1, 8., Атак!, 8., Маеда, 8. ап<3 8Шта<За, К.

(1993) Тгапз§еп1с тоизе ιηοάεΐ Рог Ьитап §епейс сНзеазез. ΜοΙ. КергоА. ΰεν., 36:

248-250.

15. ОШтоге, Εϋ., НШсЫпзоп, ΨΌ., НегЬсП, 1., ВуЬее, А., МЬсЪеИ, ϋ.Α., Наззеграп, К.Р.,

Уататига, К., Зигикр М., 8аЬт, С.А. αηά Реруз, М.В. (2004) АШолттигШу ап<1 §1отеги1оперЬгШз ίη пйсе λνίίΚ 1аг§е1е<1 άβίείίοη оГ !Ъе зегит ату1оМ Р сотропеп! §епе: 8АР ОеГгаепсу ог з!гат сотЬтайоп? 1ттипо1о%у, 112: 255-264.

- 32 026959

16. Реруз, М.В., НегЬеЦ, I., ПШсЫпзоп, УЛЬ., ТеппеЩ, О.А., Ьасктапп, Н.Т, ОаШтоге,

Ι.Κ.., Ьо\'а1, Ь.В., Вагйгй, Т., А1атпе, А., Нейе1, С., Нойтапп, Т., 1акоЬ-Шое1пе, К.,

Ыогсгозз, Κ..ϋ., Кетр, Ι.Α., Уататига, К., Зигикр М., Тау1ог, ОЛУ., Миггау, 8.,

Ткотрзоп, ϋ., Рипчз, А., Ко1з1ое, 8., Ψοοά, 8.Р. апй Надуктз, Ρ.Ν. (2002) Таг§е1е4 рЬагтасо1оо1са1 άερίεύοη оГ зегит атуЫй Р сотропеШ Гог 1геа1теЩ оГЬитап ату1оЫоз1з. Ναί-иге, 417: 254-259.

17. Реруз, М.В. Ткегареийе а§еп1. Реп1гах1п Ткегареийсз Шткек, ЬотЗоп (ОВ). 113 Ра1еп1

Νο. и8 7,045,499 В2,15зиес1 Мау 16, 2006.

18. Нау-Ттэ, Ρ.Ν., Муегз, Μ.Ί., Ерепе1оз, А.А., Сазр1, ϋ. апс! Реруз, М.В. (1988) ЗресШс

123

1осаНгайоп агхЗ Ш1а§т§ оГ атуЫй керозкз ίη νίνο изш§ 1-1аЬе1ей зегит ату1оШ Р сотропеп!. Л Ехр. Мед,, 167: 903-913.

19. РискЙег, Н., Зу/сар Р. ап<1 Ьеуте, М. (1962) Оп 1ке Ътс1т§ оГ Соп§о ге<3 Ьу атуШМ. ,1.

НЕ1оскет. Су1оскет,, 10: 355-364.

20. Теппепр О.А., Οζΐηάζίο, М,, ТНаЩайШйои, Е., Оау1ез, Р., ОаШтоге, К., ОеШоп, Р. апй

Реруз, М.В., (ШРгезз) Νοππαϊ С1гси1айпё Зегит Ату1о1с1 Р Сотропеп!

Сопсепйайоп ίη 8уз1ет1С 8с1егоз1з. ЛпкгШх & Ккеитакхт 56: 2013-7.

21. Реруз, М.В. апк На\уктз, Ρ.Ν. (2001) Ату1о10оз1з. 1п: 8ат1ег’х 1ттипо1о§1С Егзеазех,

8ίχίΗ Εά., Уо1. 1 (Аиз1еп, К.Р., Ргапк, М.М., Аййпзоп, Ι.Ρ. апй СаШог, Н., есЬ.),

Шрртсой УкШатз & ЗУПктз, РЫ1ас1е1рЫа, рр. 401-412.

22. Уап Кооуеп Ν., Уап Кез1егеп-Неп<1пкх, Е„ 2002. С1оШопа1с Нрозотез: регзресйуез т гезеагск апй 1кегареийсз. Л. Ырозоте Кезеагск. νοί. 12. рр. 81-94.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение соединения, которое устраняет сывороточный амилоидный Ρ-компонент из циркуляции, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]-6оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту ΥΡΗΡΟ), для последовательного введения с антителом, специфичным в отношении сывороточного амилоидного Ρ-компонента, для лечения или профилактики амилоидоза.
2. Применение по п.1, где антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Ρ-компонента, представляет собой гуманизированное антитело.
3. Способ лечения или профилактики амилоидной болезни, включающий последовательное введение субъекту, который в этом нуждается, соединения, которое устраняет сывороточный амилоидный Ρ-компонент из циркуляции, и антитела, специфичного в отношении сывороточного амилоидного Ρ-компонента, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1-ил]6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту ΥΡΗΡΟ).
4. Способ по п.3, где амилоидная болезнь выбрана из группы, состоящей из системного амилоидоза, локального амилоидоза, заболеваний, связанных с отложением амилоида, болезни Альцгеймера и диабета 2 типа.
5. Набор для лечения амилоидоза, включающий соединение, которое устраняет сывороточный амилоидный Ρ-компонент из циркуляции, и антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Ρ-компонента, где указанное соединение представляет собой (К)-1-[6-[(К)-2-карбоксипирролидин-1ил]-6-оксогексаноил]пирролидин-2-карбоновую кислоту ^ΡΗΡΟ) и где указанный набор содержит инструкцию по последовательному введению указанных СΡΗΡС и антитела, специфичного в отношении сы- 33 026959 вороточного амилоидного Р-компонента, для лечения амилоидоза.
6. Набор по п.5, где антитело, специфичное в отношении сывороточного амилоидного Ркомпонента, представляет собой гуманизированное антитело.