KR20240042443A - 신경계 질환을 치료하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 특정 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하여, 베타-아밀로이드 (Aβ) 플라크의 제거를 촉진시키는 방법, 신경염증을 감소시키는 방법, 및 신경계 장애 (예컨대, 알츠하이머병)를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 또한 예시적인 항체, 이의 특징, 및 추가의 치료 항체를 스크리닝하는 방법도 기술한다.
Description
본 출원은 2021년 7월 13일 출원된 미국 가출원 번호 63/221,261에 대한 우선권을 주장하며, 상기 가출원은 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
1.
기술분야
본 발명은 분자 생물학 및 신경생물학에 관한 것이며, 구체적으로, 예컨대, 알츠하이머병, 아밀로이드증 및 β-아밀로이드 병리와 같은 아밀로이드-β 및/또는 신경염증(neuroinflammation)과 관련된 다양한 다양한 신경계 장애의 치료에서 항체의 확인 및 용도에 관한 것이다.
2.
배경
알츠하이머병 (AD)은 아밀로이드 β (Aβ) 함유 세포외 플라크(plaque)를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 장애이다. 이러한 병태를 일으키는 원인은 일반적으로 알려져 있지 않다. Aβ 플라크를 제거하면 AD 환자에게 임상적 이점을 가져올 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 일반적으로 예컨대, ARIA-E 및 ARIA-H와 같은 혈관 부작용과 연관된 Aβ 플라크 제거에는 제한된 치료 옵션만이 이용가능하다다. 따라서, Aβ 플라크를 보다 효율적으로 제거하기 위한 새로운 방법과 부작용이 적은 AD에 대한 치료 옵션이 크게 요구되고 있다. 본 개시내용에서 제공된 방법을 통해 이러한 요구가 충족되며, 관련된 이점을 제공한다.
3.
요약
본원에서는 베타-아밀로이드 (Aβ) 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체(subject)에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시 스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화(internalization)를 유도하는 것인, Aβ 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체에서 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본원에서는 또한 신경염증 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증 감소를 필요로 하는 대상체에서 신경염증을 감소시키는 방법도 제공한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 임상 또는 임상전 알츠하이머병, 전구증상(prodromal) 알츠하이머병, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증(amyloid angiopathy) (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매(multi-infarct dementia), 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증(pre-eclampsia), 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애를 갖는 대상체이다.
본원에서는 또한 Aβ-관련 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, Aβ-관련 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법도 제공한다.
본원에서는 또한 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법도 제공한다.
일부 실시양태에서, Aβ-관련 또는 신경염증-관련 질환 또는 장애는 임상 또는 임상전 알츠하이머병, 전구증상 알츠하이머병, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애이다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애는 알츠하이머병이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 항원 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 및 IgG4 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, 단일 도메인 항체 (sdAb), 및 중쇄 항체 (HCAb)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합부(antigen-binding)는 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 항원 결합부, 인간화 항체(humanized antibody) 또는 항원 결합부, 또는 인간 항체 또는 항원 결합부이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 CD22의 CLLNFSCYGYPIQ (서열 번호: 11) 및 VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC (서열 번호: 12)에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 및 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH는 각각 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체 또는 항원 결합 단편은 SM03이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH는 각각 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 SM06이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 두개내로, 척수강내로, 뇌실내로, 복강내로, 비내로, 비경구적으로, 국소적으로, 또는 피내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 피하로 투여된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 1-50 mg/kg (대상체의 체중) 범위의 치료 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 약 1, 약 2, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 또는 약 30 mg/kg (대상체의 체중)이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 300 - 1,200 mg/용량(dose)의 치료 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 격주로 또는 매월 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 다회 용량(multiple dose)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 3개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년의 기간에 걸쳐 다회 용량으로 투여된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 제2 치료제와 함께 조합하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-베타-아밀로이드 항체, 항-CD33 항체, 타우(Tau) 응집 억제제, 타우 단백질 조정제(modulator), 콜린에스테라제 억제제, 아세틸콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, β-세크레타제 억제제, 또는 인슐린 감작제(insulin sensitizer)이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-베타-아밀로이드 항체는 아두카누맙, 도나네맙, 간테네루맙, 레카네맙, 바피뉴주맙, 및 솔라네주맙으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 AL003, 젬투주맙, 린투주맙, 오조가미신, 바다스툭시맙 탈리린, 및 BI836858로 구성된 군으로부터 선택되는 항-CD33 항체이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
본원에서는 또한 마이크로글리아 세포(microglia cell)를 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 마이크로글리아 세포에 의한 Aβ의 내재화를 유도하는 방법도 제공한다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1은 Aβ의 재조합 CD22 단백질에의 결합을 보여주는 옥텟(Octet) 시험관내 결합 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, Aβ는 6x10-8 M의 KD로 CD22에 결합하였다.
도 2는 Aβ의 CD22 발현 세포에의 결합을 보여주는 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, HEK293 세포에서의 인간 CD22의 과다발현은 HEK293 세포 표면 상의 FITC-Aβ의 결합을 증가시켰다.
도 3은 Aβ 처리 후 HMC-3 세포의 면역세포화학 PLA 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 양성 신호 (화살표 표시)는 HMC-3 세포의 세포 표면 상의 CD22와 Aβ 사이의 물리적 상호작용을 나타낸다.
도 4는 HMC3 세포에서의 CD22의 면역형광 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03의 처리는 CD22의 신속한 내재화를 유도하였다.
도 5는 항-CD22 항체의 내재화를 보여주는 공초점 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, FITC-SM03은 HMC3 세포에 첨가된 후 30 min 이내에 내재화되었다.
도 6은 HMC-3 세포 상에서의 다양한 항-CD22 항체에 의해 유도된 CD22 내재화 속도에 대한 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06은 가장 높은 내재화율을 유도하였다.
도 7은 Aβ의 내재화를 보여주는 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06에 의한 처리는 각각 FITC-Aβ의 식세포작용을 증진시켰다.
도 8은 NFκB 신호전달을 측정하는 루시페라제 검정법으로부터의 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03 Fab의 처리는 HMC-3 세포에서의 NFκB 신호전달을 감소시켰다.
도 9는 IL-6 분비를 측정하는 ELISA로부터의 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03 Fab의 처리는 HMC 세포에 의한 IL-6 분비를 감소시켰다.
도 10은 HMC-3 세포 상에서의 2,6-시알산 트랜스 결합의 면역세포화학 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06은 HMC-3 세포에서의 2,6-시알산 프로브의 트랜스 결합을 촉진시켰다.
도 1은 Aβ의 재조합 CD22 단백질에의 결합을 보여주는 옥텟(Octet) 시험관내 결합 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, Aβ는 6x10-8 M의 KD로 CD22에 결합하였다.
도 2는 Aβ의 CD22 발현 세포에의 결합을 보여주는 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, HEK293 세포에서의 인간 CD22의 과다발현은 HEK293 세포 표면 상의 FITC-Aβ의 결합을 증가시켰다.
도 3은 Aβ 처리 후 HMC-3 세포의 면역세포화학 PLA 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 양성 신호 (화살표 표시)는 HMC-3 세포의 세포 표면 상의 CD22와 Aβ 사이의 물리적 상호작용을 나타낸다.
도 4는 HMC3 세포에서의 CD22의 면역형광 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03의 처리는 CD22의 신속한 내재화를 유도하였다.
도 5는 항-CD22 항체의 내재화를 보여주는 공초점 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, FITC-SM03은 HMC3 세포에 첨가된 후 30 min 이내에 내재화되었다.
도 6은 HMC-3 세포 상에서의 다양한 항-CD22 항체에 의해 유도된 CD22 내재화 속도에 대한 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06은 가장 높은 내재화율을 유도하였다.
도 7은 Aβ의 내재화를 보여주는 유세포 분석법 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06에 의한 처리는 각각 FITC-Aβ의 식세포작용을 증진시켰다.
도 8은 NFκB 신호전달을 측정하는 루시페라제 검정법으로부터의 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03 Fab의 처리는 HMC-3 세포에서의 NFκB 신호전달을 감소시켰다.
도 9는 IL-6 분비를 측정하는 ELISA로부터의 데이터를 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, 항-CD22 항체 SM03 Fab의 처리는 HMC 세포에 의한 IL-6 분비를 감소시켰다.
도 10은 HMC-3 세포 상에서의 2,6-시알산 트랜스 결합의 면역세포화학 염색을 제공하는 것이다. 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06은 HMC-3 세포에서의 2,6-시알산 프로브의 트랜스 결합을 촉진시켰다.
5.
상세한 설명
알츠하이머병 (AD)은 아밀로이드-β (Aβ) 함유 세포외 플라크를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 장애이다. 효과적인 치료 옵션이 계속해서 크게 요구되고 있다. 본원에서는 독성 올리고머 Aβ1-42가 인간 마이크로글리아에 발현된 CD22에 결합하고, 특정 항-CD22 항체가 CD22의 내재화를 유도함으로써 Aβ 플라크의 제거를 촉진시킬 수 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견을 개시한다. 추가로, 본원에 개시된 항-CD22 항체는 또한 중추신경계 (CNS)에서 자가면역을 억제하여 추가적인 치료 이익을 제공할 수 있다는 것도 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ 축적 및 신경염증을 감소시키는 방법, CD22-매개 기전을 통해 관련 질환 또는 장애 (예컨대, AD)를 치료하는 방법을 제공한다.
치매는 전세계적으로 2010년 5,000만 명에서 2050년까지 1억 1,300만 명으로 증가할 것으로 추산된다. AD는 치매의 주요 원인이며, 종종 다른 신경퇴행성 및 뇌척수 병리로 악화된다. 신경병리학적 특징은 명백한 인지 증상이 나타나기 15 내지 20년 전에 시작된다. AD를 앓는 개체에서 전임상 단계의 미묘한 변화를 통해 정상적인 기본 인지 능력에서 전구성 AD라고 불리는 뇌 기능 장애의 명백한 증상으로, 마지막으로 AD 치매로 진행되며, 이는 결국 인지 결함으로 인해 이전에는 독립적으로 수행했던 일상 활동 (ADL) 수행 능력을 손상시킨다. AD의 전임상 단계는 종종 인지 장애의 임상적 진단이 고려되기 전에 발생하는 단계로 간주된다. AD 치매는 분자, 세포 및 커넥톰 수준의 변화를 포함하는 시냅스 기능 장애 질환이다. AD 환자의 임상 소견으로는 기억상실 또는 비기억상실 증상을 동반한 치매를 포함한다. 이는 종종 언어적, 시공간적 프로세싱 및 실행 기능 장애를 동반하다 (문헌 [Scharre, Practical Neurology (2019)]; [Dubois et al., Alzheimers Dement (2016), 12(3): 292-323]). AD의 신경병리학적 특징은 과도한 신경염증, 세포외 Aβ 함유 플라크 축적 및 과인산화된 타우 단백질을 특징으로 하다. Aβ 플라크는 피질 및 해마 부위에 널리 퍼져 있으며, 신경 손실을 유발하고, 마이크로글리아를 통해 신경염증을 촉진하여 신경망을 파괴시킨다.
Aβ는 신경 표면 막에 풍부한 막횡단 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질에 의해 유래된다. 생리학적으로 이는 α-세크레타제에 의해 절단된 후, 나중에 γ-세크레타제에 의해 절단되어 APPsα를 형성하다. 이는 칼슘 플럭스 및 칼륨 채널 조정을 통해 시냅스 강도를 조절하는 기능을 하다. 아밀로이드 생성 경로에서, Aβ는 β-세크레타제에 의해 절단된 후, 이어서, γ-세크레타제에 의해 절단되어 Aβ1-42를 형성하다. Aβ1-42는 β-시트 입체형태로 미스폴딩되어, 독성 올리고머 형태로 응집된다. 아밀로이드 캐스케이드 가설에 따르면, 독성 올리고머 Aβ1-42는 플라크로 응집되어 신경독성 및 치매를 유발하다. 올리고머 Aβ1-42는 대사성 글루타메이트 수용체 5 (mGluR5), N-메틸-D-아스파르트산 (NMDA) 수용체 및 다른 신경 수용체, 예컨대, α-7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 및 인슐린 수용체에 직접 결합하여 수지상 돌기의 시냅스 강도 및 형태에서 병리학적 변화를 유도하다. 올리고머 Aβ1-42는 또한 패턴 인식 수용체, 즉, 톨-유사(Toll-like) 수용체 (TLR), Nod-유사 수용체 (NLR), RIG-유사 수용체 (RLR), AIM2-유사 수용체 (ALR)를 통해 마이크로글리아 세포를 자극하여 신경염증을 유발하다. Aβ1-42는 마이크로글리아에 의해 분비되는 염증유발성 사이토카인, 즉, IL-1β, IL-8 및 TNFα를 유도한다. 또한, 이는 Aβ1-42의 추가 응집 핵 생성을 위해 NLRP3 인플라마좀 캐스케이드를 활성화하여 ASC 스펙(speck) 단백질 (카스파제-1 동원 도메인을 포함하는 아폽토시스-연관 스펙-유사 단백질)을 분비한다.
AD 환자에서 임상적 이익을 제공하기 위해 독성 올리고머 Aβ 제거가 제안되었다. 2021년과 마찬가지로 III상의 17개의 질환 조정 치료제 중 29%가 Aβ를 이의 작용 기전 (MOA)으로 표적화한다. 아두카누맙, 도나네맙, 간테네루맙, 레카네맙, 바피뉴주맙 및 솔라네주맙을 포함하는 항-Aβ 항체는 Fc 수용체 매개 식세포작용 및 비-Fc 수용체 매개 Aβ 제거를 통해 다양한 독성 형태의 Aβ를 표적화한다.
아두카누맙은 Aβ의 가용성 올리고머 및 불용성 원섬유를 선택적으로 표적화하는 IgG1 mAb이다. 아두카누맙은 아미노산 3-6에 결합하고, 응집된 Aβ의 입체형태적 에피토프를 인식하지만, 단량체 형태는 인식하지 못한다. 항체의 Aβ 응집체에의 결합은 Fc 감마 수용체 매개 식세포작용에 의한 제거를 유발하여 AD 환자에서의 신경망의 칼슘 항상성을 회복시킨다. 아두카누맙은 임상 연구에서 아밀로이드 플라크의 감소가 지속적으로 나타났기 때문에 AD 치료용으로 2021년 6월 FDA의 승인을 받았다.
AD 이외에, Aβ의 비정상적 축적과 연관된 다른 질환 또는 장애로는 예를 들어, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애를 포함한다.
본 개시내용을 추가로 설명하기에 앞서, 본 개시내용은 본원에 설명된 특정 실시양태에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 하며, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것도 이해하여야 한다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 개시내용에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업계의 숙련가가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함하여야 한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 유전학 및 단백질, 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 사용되는 것이다.
"한"("a" 또는 "an") 엔티티라는 용어는 하나 이상의 상기 엔티티를 지칭하며; 예를 들어, "벡터"는 하나 이상의 벡터들을 나타내는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 2개의 언급된 특징 또는 구성성분을 각각 나머지 다른 하나와 함께 또는 이의 부재하에 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예컨대, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독) 및 B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 예컨대, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 하기 측면을 각각 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
범위: 본 개시내용 전역에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷으로 기술하는 것은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범주에 대한 확고한 제한으로 해석되지 않아야 한다는 점을 이해하여야 한다. 따라서, 범위로 기술하는 것은 가능한 모든 하위범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치 값도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예컨대, 예컨대, 1 내지 6과 같은 범위로 기술한 것은 하위범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
예시적인 유전자 및 폴리펩티드는 진뱅크(GenBank) 번호, GI 번호 및/또는 서열 번호(SEQ ID NOS)를 참조하여 본원에 기술된다. 당업자는 진뱅크 (ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL (embl.org/)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 서열 소스를 참조하여 상동성 서열을 쉽게 확인할 수 있다는 것이 이해된다.
5.1 Aβ
제거 및 신경염증 감소
CD22는 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 B 세포 제한 항원이다. CD22는 시알산 결합 면역글로불린형 렉틴 (Siglecs)으로도 알려진 타입 I 막횡단 시알로당단백질이다. 인간 CD22는 조혈 세포, 간 세포, 폐 상피 세포, 비삭(splenic cord) 및 소포, 회장 스토마, 심장 간질, 혈관, 에크린 땀샘의 피부 상피 세포 분비물, 결장 간질 세포, 간 시누소이드 및 간질 세포, 예컨대, 뇌 백질의 마이크로글리아 세포와 같은 중추 신경계(CNS) 세포에서 발현되는 것으로 알려진 N-아세틸뉴라민산 α(2-6) 갈락토스 (NeuAc-α(2-6)Gal) 구조에 특이적으로 결합한다 (문헌 [Gagneux et al., Journal of Biological Chemistry (2003), 278(48):48245-50]; [Safaiyan et al., Neuron (2021), 109(7):1100-17.e10]). CD22는 동일한 세포 (시스-결합) 또는 다른 세포 (트랜스-결합)에 분포된 특정 리간드에 결합한다. CD22의 시스-결합은 CD22 분자의 글리칸 결합 부위가 동일한 세포 상의 또 다른 CD22 또는 당단백질의 글리칸 분자에 라이게이션되어 동종올리고머 또는 동종다량체를 형성하는 이웃 분자 사이에서 흔히 발견된다. CD22의 시스-결합은 분자에 차폐 효과를 발휘하여 Siglec이 세포간 라이게이션 (트랜스-결합)을 형성하는 것을 방지하는 것으로 입증되었다. 휴지 B 세포에서, CD22는 CD22 동종올리고머를 형성하는, 그 자체로 탁월한 시스-리간드이다. CD22의 트랜스-결합을 통해 Siglec과 B 세포 수용체 (BCR)가 물리적으로 결합하게 되고, 이로써, 최대 억제 반응이 발휘되는데, 이는 억제 면역학적 신호를 유도함으로써 면역 관용에 필요하다 (문헌 [Pessutto et al., 1987. J. Immunol . 138:98-103]; [Doody et al. 1995. Science 269:242-344]; [Lanoue et al. 2002. Eur . J. Immunol . 32:348-355]; [Courtney et al. 2009. PNAS 106:2500-2505]). 예시적인 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD22에 대한 추가 정보는 공용 데이터베이스, 예컨대, UniProt (UniProt KB/Swiss-Prot ID: P20273) 및 GENBANK (NCBI Ref. NP_001172028.1, NP_001172029.1, NP_001172030.1, NP_001265346.1, NP_001762.2)에서 살펴볼 수 있다. 예시적인 서열 또한 하기에 제공되어 있다.
CD22는 CNS의 주요 항원 제시 세포인 마이크로글리아 세포에서 고도로 발현된다. 제시된 항원 (예컨대, Aβ 또는 다른 자기 항원)은 IL-10의 분비를 통해 마이크로글리아의 활성화를 약화시키는 조절 T 세포에 침투함으로써 인식될 수 있다. 특정 항-CD22 항체가 인간 마이크로글리아에서 CD22의 내재화를 유도할 수 있다는 것이 본 개시내용의 발명자들에 의해 발견되었다. 또한, CD22는 올리고머 Aβ1-42에 결합하고, CD22의 내재화는 CD22 결합 Aβ1-42의 식세포작용 뿐만 아니라, 가용성 Aβ의 마크로피노사이토시스, 이 둘 모두를 통해 Aβ의 제거를 촉진시킨다는 것도 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 항-CD22 항체를 이용하여 Aβ의 제거를 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 항-CD22 항체를 이용하여 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애 질환은 AD이다.
본원에서 사용되고, 당업계에서 이해되는 바와 같이, CD22의 "내재화"란, 세포가 함입하여 CD22 분자를 포식하는 프로세스인 CD22의 엔도사이토시스를 지칭한다. 엔도사이토시스 프로세스에는 3가지 유형이 있다: 피노사이토시스, 식세포작용 및 수용체 매개 엔도사이토시스. 피노사이토시스는 함입 프로세스를 통해 세포가 소량의 세포외 유체 (존재할 수도 있는 작은 입자와 함께)를 포식하는 프로세스로서, 이는 "세포 음용"으로도 지칭된다. 식세포작용은 비교적 큰 분자 또는 유기체 (예컨대, 박테리아 세포)가 세포에 포식되는 프로세스이다. 수용체 매개 엔도사이토시스는 물질이 세포막의 수용체 단백질에 직접 결합하여 이를 통해 함입 프로세스 뿐만 아니라, 클라트린-코트로 알려진 단백질-커버층 형성이 개시되는 프로세스이다. 수용체 매개 엔도사이토시스에서 형성되는 소포체는 상기 클라트린 단백질 코팅을 포함한다. 세포막 상의 CD22는 구성적 클라트린 매개 엔도사이토시스를 통해 내재화된다. 일단 엔도솜 구획에 들어가고 나면, 낮은 pH 환경은 이의 특정 리간드 (예컨대, 시스에서 CD22 결합)에의 결합을 해제시키고, 유리 CD22는 시스- 또는 트랜스-리간드 결합을 위해 세포 표면으로 돌아간다.
AD를 위한 현행 항-Aβ 항체 요법은 원치않는 부작용과 연관된 아밀로이드 부담을 감소시키기 위해 FcγR 매개 식세포작용에 크게 의존한다. 구체적으로, 아밀로이드 변형 치료제 (항-Aβ 항체)를 용량에 의존하는 방식으로 투여받은 환자에서 예컨대, "혈관성 부종" (VE) 및 미세출혈 (mH)을 나타내는 신호 변화와 같은 자기 공명 영상 (MRI) 이상이 관찰되었다. 아밀로이드 관련 영상 이상 (ARIA)은 알츠하이머 협회 연구 라운드테이블 워크그룹(Alzheimer's Association Research Roundtable Workgroup)에 의해 혈관성 부종 (ARIA-E) 및 미세출혈 및 및 헤모시데린침착증(hemosiderosis) (ARIA-H)을 설명하기 위해 제안된다. ARIA-E는 주로 염증에 의해 유발되고, Aβ의 원섬유 형태에 결합하는 mAb에 단단히 결합된다. 마이크로글리아에서의 FcγR 매개 염증은 주요 역할을 할 수 있다. 예를 들어, FcγR 유도 염증유발성 사이토카인에 의해 매개되는 염증은 혈관 무결성에 대한 손상을 악화시킨다. 모든 형태의 Aβ를 표적화하는 인간화 IgG4 항체인 크레주맙은 IgG4 Fc 영역이 예를 들어, IgG1 Fc에 비해 마이크로글리아의 FcγR에 대한 연관성을 감소시켰기 때문에 더 적은 ARIA-E 이벤트와 연관이 있다.
따라서, 본원에 제공된 항-CD22 항체는 매우 효율적일 뿐만 아니라, ARIA-E 및/또는 ARIA-H와 같은 혈관 부작용 감소와 연관된 신규한 Aβ 제거 기전을 제공한다. Aβ-표적화 항체와 달리, 본원에 개시된 항-CD22 항체는 치료 항체와 FcγR의 가교결합을 포함하지 않는 CD22 내재화를 통해 Aβ 제거를 촉진시킴으로써 후속되는 염증유발성 반응을 회피할 수 있다. 따라서, 본원에서는 혈관 부작용이 감소된 효율적인 Aβ 제거 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 혈관 부작용을 유발하지 않는다.
본원에 개시된 항-CD22 항체 (예컨대, SM03 또는 SM06)는 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도한다. 본원에 개시된 항-CD22 항체는 B 세포 또는 마이크로글리아 세포 표면 상의 CD22의 시스-결합을 방해할 뿐만 아니라, 표면 CD22의 내재화를 가속화시킴으로써 CD22의 시스 - 트랜 스 전환을 촉진시킨다. CD22 분자가 호모-클러스터의 시스-결합을 방해하는 항체로 내재화되면, CD22 분자는 항체와 함께 세포 표면으로 재사이클링되고, 여기서 항체는 추가 시스-결합을 입체적으로 방해하여 재사이클링된 CD22의 트랜스-결합을 촉진시킨다. 따라서, 본원에 개시된 항-CD22 항체는 또한 B 세포, B 세포 유래 세포주 및 마이크로글리아 상의 CD22의 시스-결합을 방해하고, 자기 조직의 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스 전환을 촉진시킴으로써 중추 및 말초 면역계, 둘 모두에서 면역-내성을 촉진시킬 수 있으며, 이를 통해 자기 조직의 면역 내성을 회복시키고, 염증유발성 사이토카인 방출을 약화시킬 수 있다. 뉴런 2,6-시알산에의 CD22의 트랜스-결합을 촉진시킴으로써, 본원에 개시된 항-CD22 항체는 시냅스의 식세포작용 및 뉴런 사멸을 억제시킬 뿐만 아니라, 마이크로글리아 세포에서 NF-κB 신호전달 및 인터루킨-6 (IL-6) 분비를 억제시킨다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 신경염증을 감소시키는 추가의 치료적 이익을 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 항-CD22 항체를 이용하여 신경염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 항-CD22 항체를 이용하여 신경염증-연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서는 Aβ 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, Aβ 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체에서 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법을 제공한다. 본원에서는 또한 Aβ-관련 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, Aβ-관련 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애는 AD이다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애는 임상전 AD이다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ 플라크를 제거하기 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ 플라크 제거용 의약 제조를 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ-관련 질환 또는 장애의 치료에서의 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ-관련 질환 또는 장애 치료용 의약 제조를 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 상기 기술된 용도에서, 항체 또는 항원 결합 단편 (a)은 CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도한다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애는 AD이다. 일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애는 임상전 AD이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
본원에 개시된 CD22 항체의 처리로, Aβ 처리된 마이크로글리아 세포 용해물의 ELISA를 사용하여 측정된 바, Aβ의 내재화 속도는 5.86 x 10- 6 pg/s/세포에 도달하였다 (데이터는 제시되지 않음). 본원에 제공된 용도 또는 방법의 일부 실시양태에서, Aβ는 5.86 x 10- 6 pg/s/세포의 속도로 제거된다.
본원에 제공된 방법은 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료할 수 있다. Aβ-관련 질환 또는 장애는 임상 또는 임상전 AD, 전구증상 AD, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 AD를 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 기술되고, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 올리고머 Aβ의 제거가 AD에서 임상적 이익을 제공하는 것으로 공지되어 있다. AD는 임상 AD, 임상전 AD 또는 전구증상 AD일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임상 AD를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임상전 AD를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 전구증상 AD를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 다운 증후군을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임상 또는 임상전 CAA를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 파킨슨병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 다경색 치매를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 뇌 아밀로이드 혈관병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 녹내장을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 전자간증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 인지 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 기억 상실을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에서는 또한 신경염증 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증 감소를 필요로 하는 대상체에서 신경염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 본원에서는 또한 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 방지한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 적어도 20%, 적어도 30, 적어도 40%, 적어도 50% 초과, 또는 적어도 60% 초과만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 적어도 50%만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 신경염증을 감소시키기 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 신경염증 감소용 의약 제조를 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료에서의 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료용 의약 제조를 위한 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 상기 기술된 용도에서, 항체 또는 항원 결합 단편 (a)은 CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22의 내재화를 유도한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고, 및 CD22의 내재화를 유도한다.
본원에서 사용되는 바, 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태를 갖는 대상체와 관련하여 "치료하다"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 증상, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질환 또는 장애와 연관된 증상의 빈도를 억제, 제거, 감소 및/또는 호전시키는 조치를 지칭한다. 예를 들어, AD와 관련하여 사용될 때, "치료하다"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 (a) Aβ 플라크의 양을 감소시키거나, 또는 병리학적 Aβ의 축적 속도를 저속화시키거나, 또는 (b) 예컨대, 치매 또는 인지 장애와 같은 AD와 연관된 하나 이상의 증상을 지연, 호전 또는 최소화하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 질환의 중증도를 감소시키거나, 또는 질환의 진행을 지연시키거나, 또는 저속화시키는 조치를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "투여하다"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 본원에 기술되거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 방법에 의해 대상체의 신체에 치료제 또는 제약 조성물을 전달하거나, 또는 전달되도록 하는 조치를 지칭한다. 치료제는 화합물, 폴리펩티드 또는 세포일 수 있다. 치료제 또는 제약 조성물을 투여하는 것은 대상체의 신체 내로 전달하고자 하는 치료제 또는 제약 조성물을 처방하는 것을 포함한다. 예시적인 투여 형태로는 경구 투여 형태, 예컨대, 정제, 캡슐, 시럽, 현탁제; 예컨대, 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 또는 복강내 (IP)와 같은 주사가능한 투여 형태; 크림, 젤리, 산제 또는 패치를 비롯한, 피하 (SC), 경피 투여 형태; 협측 투여 형태; 흡입 산제, 스프레이, 현탁제 및 직장용 좌제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "유효량," "치료 유효량," 및 이의 문법적 동등어는 대상체에게 투여되었을 때, 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상, 측면 또는 특징에 대해 임의의 검출가능하고, 긍정적인 효과를 발휘할 수 있는 양으로 작용제를 단독으로 또는 제약 조성물의 일부로서, 및 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 치료 유효량은 관련된 생리학적 효과를 측정함으로써 확인할 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 임상의의 판단 등에 따라 대상체마다 달라진다. 치료 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효량"은 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 달라질 수 있으며, 통상의 실험을 사용하여 당업계의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. "예방 유효량"은 원하는 예방적 결과, 예를 들어, 질환 또는 장애의 발병을 지연 또는 예방하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 이전 또는 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 일반적으로 치료 유효량보다 적다.
본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 특정 치료의 수용자가 되는, 인간, 비인간 영장류, 개과, 고양이과, 설치류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 동물 (예컨대, 포유동물)을 지칭한다. 대상체는 인간일 수 있다. 대상체는 특정 질환을 앓는 환자일 수 있다.
5.2 CD22 항체
상기 섹션에서 기술된 바와 같이, 본원에서는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 방법 및 용도를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 일반적으로 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 통해 적어도 하나의 항원 결합 부위를 통해 표적, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 인식하고, 그에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 단일-도메인 항체 (sdAbs; 예컨대, 낙타류 항체, 알파카 항체), 단일-쇄 Fv (scFv) 항체, 중쇄 항체 (HCAbs), 경쇄 항체 (LCAbs), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자 (예컨대, 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자)를 포함한다. 항체는 또한 마우스 항체, 토끼 항체, 낙타 항체, 영장류 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이의 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티에 기초하여 면역글로불린의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 서브부류 (이소타입) (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)인 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서는 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서는 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다.
달리 명확하게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 무손상 항체의 "항원 결합 단편"을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 무손상 항체의 항원성 결정 가변 영역인 무손상 항체의 부분 또는 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예로는 Fab (힌지 영역 없이, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편), Fab' (힌지 영역과 부착된, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편), F(ab')2 (힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), Fd (VH 및 CH1 도메인으로 구성된 단편), Fv (항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 단편), 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, 재조합 수단에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 단일 폴리펩티드 쇄인 scFv), 중쇄 항체 (HCAbs), 경쇄 항체 (LCAbs), 디술피드-연결된 scFv (dsscFv), 디아바디 (2가, 이중특이적 항체), 트리바디, ??라바디, 미니바디, 이중 가변 도메인 항체 (DVD), 단일 가변 도메인 항체 (sdAbs 또는 dAbs; 예컨대, 낙타류 항체, 알파카 항체), 및 중쇄 항체의 단일 가변 도메인 (VHH), 및 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 또는다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "이중특이적" 항체는 2개의 상이한 표적을 인식하고, 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin . Exp . Immunol . 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]를 참조한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 상기 면역부착 분자의 예는 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하여 사량체 scFv 분자를 제조하는 것 (문헌 [Kipriyanov et al. (1995) Human antibodies and Hybridomas 6:93-101]) 및 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 것 (문헌 [Kipriyanov et al. (1994) Mol . Immunol. 31:1047-1058])을 포함한다. 항원 결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편은 예컨대, 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 종래 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항원 결합 단편 및 면역부착 분자는 본원에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "인간화 항체"는 최소한의 비-인간 서열을 포함하는 특이적인 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린, 또는 이의 단편인 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 인간 면역글로불린이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 비-인간 종으로부터의 항체 중 상응하는 잔기로 대체된다. 일부 경우에서, CDR의 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 낙타)의 CDRs로부터의 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 개선하고, 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가 잔기를 치환함으로써 추가로 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체, 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
항체와 관련하여 사용된 용어 "중쇄"는 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 쇄를 지칭하며, 여기서 아미노 말단부는 약 120 내지 130개 이상의 아미노산으로 구성된 가변 영역 (VH)을 포함하고, 카르복시 말단부는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개 도메인으로 구성되고, CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 짧은 가요성 힌지 영역이 있다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열 기준으로 알파 (a), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지칭되는, 5가지 별개의 유형 중 하나일 수 있다. 별개의 쇄는 크기가 상이하며: α, δ 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하는 반면, μ 및 ε은 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 경쇄와 조합될 때, 상기 별개의 중쇄 유형은 IgG의 4가지 서브부류, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 널리 공지된 5개 항체 부류, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 생성한다. 중쇄는 인간 중쇄일 수 있다.
항체와 관련하여 사용될 때, 용어 "경쇄"는 약 25 kDa의 폴리펩티드 쇄를 지칭하며, 여기서 아미노-말단부는 약 100 내지 약 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시-말단부는 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL이라는 하나의 도메인으로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개의 아미노산 길이이다. 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로 지칭되는 별개의 2가지 유형이 존재한다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 경쇄는 인간 경쇄일 수 있다.
용어 "가변 도메인" 또는 "가변 영역"은 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 길이가 중쇄의 경우, 약 120 내지 130개의 아미노산 길이이고, 경쇄의 경우, 약 100 내지 110개의 아미노산 길이이고, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부분을 지칭한다. 가변 도메인은 상이한 항체 사이에서 서열이 크게 상이하다. 서열의 가변성은 CDR에 집중되어 있는 반면, 가변 도메인에서 덜 가변적인 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 주로 항체와 항원의 상호작용을 담당한다. 일부 실시양태에서, 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 본원에 사용된 아미노산 위치의 넘버링은 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5thed]에서와 같이 EU 인덱스에 따라 이루어진다.
CDR은 면역글로불린 (Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역 (H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역 L1, L2 또는 L3) 중 하나를 지칭한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다. CDR 영역은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 다양한 방법/체계에 의해 정의되어 왔다. 이러한 체계 및/또는 정의는 수년에 걸쳐 개발되고, 개선되었으며, 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), IMGT, AbM, 및 Contact를 포함한다. 예를 들어, 카바트는 항체 가변 (V) 도메인 내에서 가장 초가변성이 큰 영역을 정의한다 (문헌 [Kabat et al, J. Biol . Chem. 252:6609-6616 (1977)]; [Kabat, Adv . Prot . Chem. 32: 1-75 (1978)]). 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, 이는 CDR 영역 서열을 보존된 β-시트 프레임워크의 일부가 아니며, 따라서, 상이한 입체형태에 맞게 적합화될 수 있는 잔기로 정의한다 (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)]). 두 용어 모두 당업계에 널리 공지되어 있다. 추가로, IMGT 체계는 서열 가변성 및 가변 영역 구조 내 위치를 기반으로 한다. AbM 정의는카바트와 코티아 간의 절충안이다. Contact 정의는 이용가능한 항체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 소프트웨어 프로그램 (예컨대, abYsis)은 항체 서열 분석 및 CDR 결정에 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 정규 항체 가변 도메인 내의 CDR의 위치는 수많은 구조의 비교에 의해 결정되었다 (문헌 [Al-Lazikani et al, J. Mol . Biol . 273:927-948 (1997)]; [Morea et al, Methods 20:267-279 (2000)]). 초가변 영역 내의 잔기수는 항체마다 다르기 때문에, 정규 위치 기준으로 추가 잔기는 통상적으로 정규 가변 도메인 넘버링 방식에서 잔기 번호 옆에 a, b, c 등으로 넘버링된다 (문헌 [Al-Lazikani et al. al., 상기 문헌 동일 (1997)]). 이러한 명명법은 당업자에게 유사하게 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 카바트 (초가변) 또는 코티아 (구조) 명칭에 따라 정의된 CDR은 하기 표에 제시되어 있다.
하나 이상의 CDR은 또한 공유적으로 또는 비공유적으로 분자에 통합되어 면역어드헤신이 될 수도 있다. 면역어드헤신은 CDR(들)을 더 큰 폴리펩티드 쇄의 일부로 통합할 수 있거나, CDR(들)을 다른 폴리펩티드 쇄에 공유적으로 연결시킬 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비공유적으로 통합할 수 있다. CDRs은 면역어드헤신이 특정 관심 항원에 결합하도록 허용한다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 표적 분자 표면 상의 부위, 예컨대, 항원 표면 상의 국재화된 영역을 지칭한다. 표적 분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물 또는 지질을 포함할 수 있다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 면역 반응을 유도하는 표적 분자의 일부이다. 항원 활성을 갖는 표적 분자의 에피토프는 예를 들어, 면역검정법을 비롯한, 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체가 결합하는 표적 분자의 일부분이다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 에피토프는 종종 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 구성되며, 특정 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특정 전하 특징을 갖는다. "에피토프"라는 용어는 선형 에피토프 및 입체형태적 에피토프를 포함한다. 에피토프에 기여하는 표적 분자 (예컨대, 폴리펩티드)의 영역은 폴리펩티드의 연속된 아미노산일 수 있거나, 에피토프는 표적 분자의 2개 이상의 비연속 영역로부터 함께 생겨날 수 있다. 에피토프는 표적 분자의 3차원 표면 특징일 수도 있거나, 또는 아닐 수도 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 지칭)는 전형적으로 단백질 변성시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형태적 에피토프로도 지칭)는 전형적으로 단백질 변성시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 입체형태로 적어도 3개, 더 일반적으로는 적어도 5, 6, 7 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용되는 바, "특이적으로 결합하다"라는 용어는 폴리펩티드 또는 분자가 에피토프, 단백질 또는 표적 분자에 대해 관련 단백질 및 비관련 단백질을 포함한 대체 물질보다 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 지속 시간으로, 더 큰 친화도로 또는 상기의 일부 조합으로 상호작용한다는 것을 의미한다. 표적 분자 (예컨대, 항원)에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티 (예컨대, 항체)는 예를 들어, 면역검정법, ELISA, 생물층 간섭계 ("BLI"), SPR (예컨대, 비아코어(Biacore)), 또는 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 확인될 수 있다. 전형적으로, 특정 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배이며, 배경의 10배 초과일 수 있다. 항체 특이성에 관한 고찰을 위해 예컨대, 문헌 [Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336]을 참조한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티는 상이한 분자에 대한 이의 친화도보다 더 높은 친화도로 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티는 상이한 분자에 대한 이의 친화도보다 적어도 20배 더 큰, 적어도 30배 더 큰, 적어도 40배 더 큰, 적어도 50배 더 큰, 적어도 60배 더 큰, 적어도 70배 더 큰, 적어도 80배 더 큰, 적어도 90배 더 큰, 또는 적어도 100배 더 큰 친화도로 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티는 결합이 본원에 기술되거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 검정법을 사용하여 검출될 수 없을 정도로 낮은 친화도로 상이한 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는 것은 예를 들어, 결합 모이어티가 약 0.1 mM 이하의 KD로 분자 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는 것은 폴리펩티드 또는 분자가 약 10 μM 이하 또는 약 1 μM 이하의 KD로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "특이적으로 결합한다"는 것은 폴리펩티드 또는 분자가 약 0.1 μM 이하, 약 0.01 μM 이하, 또는 약 1 nM 이하의 KD로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종의 상동성 단백질 사이의 서열 동일성으로 인해 특이적 결합은 1 초과의 종에서 단백질 또는 표적을 인식하는 폴리펩티드 또는 분자를 포함할 수 있다. 유사하게, 상이한 단백질의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내의 상동성으로 인해 특이적 결합은 1 초과의 단백질 또는 표적을 인식하는 폴리펩티드 또는 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티 (예컨대, 항체)는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수도 있는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 (비록 포함할 수는 있지만) 반드시 배타적 결합, 즉, 단일 표적에의 결합일 필요는 없다. 따라서, 일부 실시양태에서, 결합 모이어티 (예컨대, 항체)는 1 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에, 항체는 각각의 것이 2개 이상의 단백질 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 2개의 동일한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 상이한 특이성을 갖는 적어도 2개의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "결합 친화도"는 일반적으로 결합 모이어티와 표적 분자 (예컨대, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 결합 모이어티와 표적 분자의 결합은 가역적 프로세스이며, 결합 친화도는 전형적으로 평형 해리 상수 (KD)로 기록된다. KD는 회합 속도 (k온 또는 ka) 대비 해리 속도 (k오프 또는 kd)의 비이다. 결합 쌍의 KD가 낮을수록, 친화도는 높아진다. KA는 평형 회합 상수이며, 이는 평형 해리 상수의 역수, 즉, = 1/KD이다. 항체-항원 상호작용의 경우, KD는 항체-항원 복합체 농도 대비 유리 항체 농도와 유리 항원 농도의 곱의 비, 즉, [항원] x [항체] / [항원-항체]로 계산될 수 있다.
결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 하기를 포함한다. 일부 실시양태에서, "KD" 또는 "KD 값"은 당업계에 공지된 검정법, 예를 들어, 결합 검정법에 의해 측정될 수 있다. KD는 방사성표지된 항원 결합 검정법 (RIA)에 의해 측정될 수 있다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]). KD 또는 KD 값은 또한 예를 들어, 게이토(Gator) 시스템 (프로브 라이프(Probe Life)) 또는 옥텟-96 시스템 (사토리우스 AG(Sartorius AG))을 사용하는 생물층 간섭계 (BLI)을 사용하여 측정될 수 있다. KD 또는 KD 값은 또한 BIA코어(BIAcore) 시스템 (예컨대, 파마시아 바이오센서 AB(Pharmacia Biosensor AB: 스웨덴 웁살라 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 사용하여 표면 플라스몬 공명 검정법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
특정 서열 특징을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드 "참조 단백질" 또는 "참조 폴리펩티드")와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 참조 단백질 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 (예컨대, 예를 들어, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5개의) 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가를 갖는 상이한 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 아미노산 서열에 대한 변화는 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 서열에 대한 변화는 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드의 기능성 단편 또는 기능성 변이체는 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 기본적인 구조적 및 기능적 특성을 유지한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드," "펩티드," "단백질," 및 이의 문법적 동등어는 선형 또는 분지형일 수 있는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 이는 비천연 또는 변형된 아미노산을 포함하거나, 또는 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질은 또한 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형을 통해 변형될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드," "핵산," 및 이의 문법적 동등어는 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "코딩하다(encoding)"라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 프로세스에서 다른 중합체 및 거대분자 합성을 위해 주형으로서 작용하는 예컨대, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 중 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생성한다면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연상에서는 발견되지 않은 형태의 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 더 이상 자연상에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수한 것이다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 "동일한," "동일성(%)"이라는 용어 및 이의 문법적 동등어는 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 비교하고, 최대 일치하도록 정렬되었을 때 (필요한 경우, 갭 도입), 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 언급된 비율(%)로 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 동일성(%)은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나, 또는 육안 검사를 통해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 널리 공지되어 있다. 이는 BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) 및 이의 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하며, 이는 비교하고, 최대 일치하도록 정렬되었을 때, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 육안 검사에 의해 측정된 바, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 실시양태에서 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 40-60개의 잔기, 적어도 약 60-80개의 잔기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개의 잔기보다 더 긴 영역, 예컨대, 적어도 약 80-100개의 잔기에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 전장의 서열, 예컨대, 표적 단백질 또는 항체의 코딩 영역(coding region)에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 염기, 적어도 약 20개의 염기, 적어도 약 40-60개의 염기, 적어도 약 60-80개의 염기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개의 염기보다 더 긴 영역, 예컨대, 예컨대, 적어도 약 80-1000개 이상의 염기에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 전장의 서열, 예컨대, 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
본원에서 사용되는 바, "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 본원에 사용된 "보존적으로 유사한" 아미노산 또는 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 동일하지 않은 아미노산 잔기를 지칭한다. 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당업계에서 정의되었다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "벡터," 및 이의 문법적 동등어는 복제되고/거나, 발현될 수 있는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는, 유전 물질 (예컨대, 폴리뉴클레오티드 서열)을 운반하는 데 사용되는 비히클을 지칭한다. 사용하기에 적합한 벡터로는 예를 들어, 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함하며, 이는 숙주 세포의 염색체로의 안정한 통합을 위해 작동가능한 선별 서열 또는 마커를 포함할 수 있다. 추가로, 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선별가능한 마커 유전자는 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 저항성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 배양 배지에 없는 중요한 영양분을 공급한다. 발현 제어 서열은 당업계에 널리 공지되어 있는 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결인자 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 공동 발현시키고자 하는 경우, 두 폴리뉴클레오티드 모두가 공동 발현되어야 하는 경우, 두 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 단일 발현 벡터 내로 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 코딩 폴리뉴클레오티드는 하나의 공통 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되거나, 또는 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터와 같은 다른 발현 제어 서열에 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로의 도입은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 당업자는 폴리뉴클레오티드가 원하는 생성물 (예컨대, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해하고, 발현 수준은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 수득하도록 최적화될 수 있다는 것도 이해한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "숙주 세포"는 예컨대, 재조합 발현 벡터와 같은 유전 물질이 도입될 수 있거나, 또는 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 외인성 유전 물질이 도입된 대상체 세포 뿐만 아니라, 상기 세포의 자손도 포함한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있는 바, 상기 자손은 모체 세포와 동일하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되고, 당업계에서 이해되는 바, "EC"는 작용제 (예컨대, 항체)의 유효 농도를 의미하며, 일반적으로 용량-반응 곡선에 사용된다. 작용제의 "효과"는 긍정적 (활성화) 효과일 수도 있고, 부정적인 효과일 수도 있다. "EC50"이라는 용어는 최대 반응의 절반을 제공하는 활성제 (예컨대, 항체)의 농도를 지칭한다. 또한 본원에서 사용되고, 당업계에서 이해되는 바, "IC"는 억제 효과를 갖는 작용제의 농도를 의미하고, 이 또한 일반적으로 용량-반응 곡선에 사용된다. "IC50"이라는 용어는 억제되는 활성이 절반으로 감소되는 작용제 (예컨대, 항체)의 농도를 지칭한다.
5.2.1 예시적인 CD22 항체
상기 섹션에서 기술된 바와 같이, 본원에서는 (a) CD22의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 방법, 및 CD22에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 Aβ 제거, 신경염증의 감소, 또는 그 둘 모두에서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 또한 Aβ 및/또는 신경염증과 연관된 질환 또는 장애의 치료에서도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 항체는 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgA 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgD 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgE 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgM 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 중쇄 불변 영역, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역 또는 글리코실화 부위 및/또는 글리코실화 부위에서 변형된 글리코폼을 갖는 상기 불변 영역 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체의 항원 결합 단편이 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체 (sdAb), 중쇄 항체 (HCAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 또는 (scFv)2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체 (sdAb)이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 중쇄 항체 (HCAb)이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 Fab'이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 F(ab')2이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 Fv이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 디술피드 연결된 scFv [(scFv)2]이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22의 항원 결합 단편은 디아바디 (dAb)이다.
일부 실시양태에서, 재조합 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편이 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 낙타 (예컨대, 낙타, 단봉낙타 및 라마) 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 항-CD22 인간화 scFv를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 항-CD22 인간 인간화 Fab를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 단리된 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 실질적으로 순수한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 1가 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 단일특이적 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 2가 결합 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 대체 항체를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 키메라 항체를 생성하기 위해 인간 항체의 불변 영역으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 모노클로날 항체의 원하는 항체 단편을 생성하기 위해 말단절단되거나, 또는 제거된다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체의 특이성 및/또는 친화성을 최적화시키기 위해 가변 영역(들)의 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이유발이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이다. 인간화 항체를 생성하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 인간화 항체와의 높은 친화도 결합을 달성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법의 비제한적인 예로는 가변 영역의 과돌연변이 및 상기 고친화성 항체를 발현하는 세포의 선택 (친화성 성숙화)이 있다. 디스플레이 라이브러리의 사용 이외에도, 특정 항원 (예컨대, 재조합 CD22 또는 이의 에피토프)을 사용하여 비인간 동물, 예컨대, 설치류를 면역화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 설치류 항원 결합 단편 (예컨대, 마우스 항원 결합 단편)은 당업계에 공지되어 있고/거나 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성되고, 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스는 항원 (예컨대, 재조합 CD22 또는 이의 에피토프)으로 면역화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 시험관내에서 면역화된 불멸화 인간 B 림프구로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 면역화된 개체로부터 단리된 림프구로부터 생성된다. 어느 경우에서든, 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 세포가 생성되고, 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 면역되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일단 항체가 확인되고 나면, 쇄 셔플링 및 부위 지정 돌연변이유발을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 친화성 성숙화 전략법을 사용하여 더 높은 친화도의 인간 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 생산된다. 면역화시, 상기 마우스는 내인성 면역글로불린 생산 없이도 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있다.
본원에 정의된 특정 CDR 서열은 일반적으로 카바트 및 코티아 정의의 조합을 기반으로 한다. 그러나, 특정 항체의 중쇄 CDR 또는 CDRs 및/또는 경쇄 CDR 또는 CDRs에 대한 언급은 당업자에게 공지된 모든 CDR 정의를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 SM03 및 SM06, 및 이의 변형 및 유도체를 포함한다.
"SM03"이라는 용어는 인간 CD22 (hCD22)에 대한 키메라 항체를 지칭한다. SM03의 서열 특징은 하기 표에 제공되어 있다. SM03의 구조적 및 기능적 특징에 대한 추가 설명은 예컨대, 문헌 [Yang et al. (2006), Chinese J New Drug 15(3):186-92]; 및 중국 특허 번호 ZL03123054.7 (상기 문헌들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함)에서 살펴볼 수 있다.
"SM06"이라는 용어는 키메라 항체 SM03의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 재조작되고, hCD22에 대한 친화성 및 특이성을 보이는, 프레임워크 패치 또는 인간화 버전의 키메라 항체 SM03을 지칭한다. SM06의 서열 특징은 하기 표에 제공되어 있다. SM06의 구조적 및 기능적 특징에 대한 추가 설명은 예컨대, 문헌 [Liang et al. (2006) Chinese J New Drug 15(21):1832-36]; 중국 특허 번호 ZL 01144894.6, 및 미국 특허 번호 7,321,026 B2 & 7,338,659 B2 (상기 문헌들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함)에서 살펴볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 SM03/SM06의 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6개의 CDRs를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1로부터의 1, 2, 및/또는 3개의 VL CDRs를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1로부터의 1, 2, 및/또는 3개의 VH CDRs를 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1로부터의 1, 2, 및/또는 3개의 VL CDRs 및 1, 2, 및/또는 3개의 VH CDRs를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (1) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (VL CDR1); (2) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (VL CDR2); 또는 (3) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 또는 VL CDRs 중 최대 약 3, 약 5, 약 8, 약 10, 약 12, 또는 약 15개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 VL CDRs 중 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (1) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; (2) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 또는 (3) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 VL CDRs 중 최대 약 3, 약 5, 약 8, 약 10, 약 12, 또는 약 15개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 VL CDRs 중 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 (1) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (VH CDR1); (2) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (VH CDR2); 또는 (3) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 또는 VH CDRs 중 최대 약 3, 약 5, 약 8, 약 10, 약 12, 또는 약 15개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 VH CDRs 중 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 (1) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; (2) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 또는 (3) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 VH; 또는 VH CDRs 중 최대 약 3, 약 5, 약 8, 약 10, 약 12, 또는 약 15개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 VH CDRs 중 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 (a) (1) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; (2) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 또는 (3) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는 VL CDRs 중 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체; 및 (b) (1) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; (2) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 또는 (3) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 VH; 또는 VH CDRs 중 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
VH CDR3 및 VL CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 중요한 역할을 한다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22와 적절한 회합/해리 동역학적 성질을 가질 수 있고, SM03 및/또는 SM06의 것과 구조적으로 동일하거나, 또는 그와 관련된 VH CDR3 및 VL CDR3을 가질 수 있다. 아미노산 서열: Q-Q-G-N-T-L-P-W-T (서열 번호: 3)를 포함하는 SM03 VL CDR3에 대한 컨센서스 모티프는 이의 결합 특이성을 변경하지 않으면서, 항체 친화성을 조정하기 위해 하나 이상의 아미노산(들)을 치환함으로써 변형될 수 있거나, 또는 대안적으로, 중국 특허 번호 ZL200880024788.2 (이는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은 기준을 사용하여 SM03 VL CDR3과 충분한 유사성을 보이는 관련없는 인간 항체의 VL CDR3으로 대체될 수 있다. 유사하게, 아미노산 서열: H-S-G-Y-G-S-S-Y-G-V-L-F-A-Y (서열 번호: 6)를 포함하는 SM03 VH CDR3에 대한 컨센서스 모티프는 이의 결합 특이성을 변경하지 않으면서, 항체 친화성을 조정하기 위해 하나 이상의 아미노산(들)을 치환함으로써 변형될 수 있거나, 또는 대안적으로, 중국 특허 번호 ZL200880024788.2 (이는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은 기준을 사용하여 SM03 VH CDR3과 충분한 유사성을 보이는 관련없는 인간 항체의 VH CDR3으로 대체될 수 있다. 당업자는 CDR3 도메인 내의 아미노산의 특정 치환(들)이 항체의 에피토프 특이성을 변화시키지 않을 것이며, 특히 보존적 아미노산으로의 치환을 인식할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)의 CDR3은 (1) SM03 CDR3과 잔기수가 동일하고, 50% 이상의 서열 상동성을 나타내고/거나, (2) SM03 CDR3의 상응하는 위치(들)에 있는 잔기와 동일하거나, 또는 보존적으로 유사한 방향족 잔기(들)를 적어도 하나의, 바람직하게, 그 초과로 함유하고/거나, (3) SM03 CDR3의 상응하는 위치(들)에 있는 잔기와 동일하거나, 또는 보존적으로 유사한 하전된 잔기(들)를 적어도 하나의, 바람직하게, 그 초과로 함유하고/거나, (4) 결정 구조 및/또는 컴퓨터 데이터베이스 분석에 의해 결정된 항-CD22 항체의 결합 부위 구조/접촉 유지에 중요한 것으로 알려진 위치에 있는, SM03 CDR3의 상응하는 위치(들)에 있는 잔기와 동일하거나, 또는 보존적으로 유사한 잔기(들)를 적어도 하나의, 바람직하게, 그 초과로 함유하는 인간 또는 영장류 항체로부터의 CDR3으로 대체될 수 있다 (중국 특허 번호 ZL200880024788.2 (이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 일부 실시양태에서, 1 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환은 SM03 VL 및/또는 VH CDR3 도메인으로 이루어지거나, 또는 1 내지 5개 이하의 보존적으로 유사한 잔기를 함유하는 관련없는 영장류 또는 인간 항체로부터의 VL 및/또는 VH CDR3은 SM03 또는 SM06의 VL 및/또는 VH CDR3을 대체하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환은 SM03 VL 및/또는 VH CDR3 도메인으로 이루어지거나, 또는 1 내지 3개 이하의 보존적으로 유사한 잔기를 함유하는 관련없는 영장류 또는 인간 항체로부터의 VL 및/또는 VH CDR3은 SM03 또는 SM06의 VL 및/또는 VH CDR3을 대체하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL; 및 (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 8과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 8과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 8과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 8과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL; 및 (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 9와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 9와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 9와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 9와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 10과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 10과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 10과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 10과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 각각 서열 번호: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, VL 및 VH는 각각 서열 번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 갖는다.
항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 임의의 VL 및 본원에 개시된 임의의 VH의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VL 및 VH는 링커에 의해 연결된다. 링커는 가요성 링커 또는 강성 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (n = 3, 4, 또는 5) (서열 번호: 19)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 GSAGSAAGSGEF (서열 번호: 38)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열 번호: 39)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 EGKSSGSGSESKS (서열 번호: 40)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH (서열 번호: 41)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGGG (서열 번호: 42)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 강성 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (EAAAK)n (n = 3, 4, 또는 5) (서열 번호: 20)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 (PA)nP (n = 1, 2, 3, 4, 또는 5) (서열 번호: 21)의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 (a) 서열 번호: 7 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL; 및/또는 (b) 서열 번호: 8 또는 10의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL; 및/또는 (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 VL 및 VH를 포함하는 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 VL은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하고, VH는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 VL로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하고, VH는 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 VH로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로 지정된 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로부터의 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로부터의 VH를 갖는다. 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로부터의 VL 및 VH, 둘 모두 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03으로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 갖는다. 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 SM03의 VL 및 VH로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL 및 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM03의 변이체이다. SM03 변이체는 서열 번호: 7 중에 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 SM03의 VL의 변이체인 VL을 가질 수 있다. SM03 변이체는 서열 번호: 8 중에 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 SM03의 VH의 변이체인 VH를 가질 수 있다. 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실은 VH CDRs 또는 VL CDRs 중에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실은 CDRs 중에 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, SM03의 변이체는 최대 약 5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, SM03의 변이체는 최대 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로 지정된 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로부터의 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로부터의 VH를 갖는다. 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로부터의 VL 및 VH, 둘 모두 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06으로부터의 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 갖는다. 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 SM06의 VL 및 VH로부터의 VL CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VL 및 VH CDRs 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SM06의 변이체이다. SM06 변이체는 서열 번호: 9 중에 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 SM06의 VL의 변이체인 VL을 가질 수 있다. SM06 변이체는 서열 번호: 10 중에 최대 약 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 갖는 SM06의 VH의 변이체인 VH를 가질 수 있다. 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실은 VH CDRs 또는 VL CDRs 중에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실은 CDRs 중에 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, SM06의 변이체는 최대 약 5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, SM06의 변이체는 최대 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 하나의 프레임워크 (FR) 영역을 갖는 VH 또는 VL을 포함한다. VL에 대한 FR 영역은 Vκ10 뮤린 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, VL에 대한 FR1, FR2, FR3, 및 FR4는 각각 서열 번호: 30, 31, 32, 및 33의 아미노산 서열 (SM03 VL 프레임워크 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, VH에 대한 FR 영역은 VH5 뮤린 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, VH에 대한 FR1, FR2, FR3, 및 FR4는 각각 서열 번호: 34, 35, 36, 및 37의 아미노산 서열 (SM03 VH 프레임워크 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, VL에 대한 FR1 영역은 VκID 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고, VL에 대한 FR2 영역은 Vκ1 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고, VL에 대한 FR3 영역은 Vκ1 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고, VL에 대한 FR4 영역은 VκJ1 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, VL에 대한 FR1, FR2, FR3, 및 FR4는 각각 서열 번호: 22, 23, 24, 및 25의 아미노산 서열 (SM06 VL 프레임워크 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, VH에 대한 FR1 영역은 VH3 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고; VH에 대한 FR2 영역 영역은 VH3 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고; VH에 대한 FR3 영역은 VH3 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있고; VH에 대한 FR4 영역 영역은 VHJ5 인간 생식세포계열 패밀리로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, VH에 대한 FR1, FR2, FR3, 및 FR4는 각각 서열 번호: 26, 27, 28, 및 29의 아미노산 서열 (SM06 VH 프레임워크 서열)을 가질 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기술된 재조합, 모노클로날, 키메라, 인간화, 및 인간 항체, 또는 이의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 추가의 변이체 및 등가물을 추가로 고려한다. 일부 실시양태에서, 항체의 결합 친화도를 개선시키는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 특이성, 열안정성, 발현 수준, 이펙터 기능(들), 글리코실화, 면역원성 및/또는 용해도를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 항체의 생물학적 특성을 조정하는 것이 바람직하다. 당업자는 아미노산 변화가 예컨대, 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변경하거나, 또는 막 고정 특성을 변경하는 것과 같이 항체의 번역 후 프로세스를 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
변이는 천연 항체 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 특성이 유사한 또 다른 아미노산으로 대체한 결과, 예컨대, 류신을 세린으로 대체하는 것, 예컨대, 보존적 아미노산 대체이다. 삽입 또는 결실은 약 1 내지 5개 범위의 아미노산에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환, 결실, 또는 삽입은 모체 분자와 비교하여 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적으로 유용하고/거나, 관련된 아미노산 서열의 변이는 서열에 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고, 생성된 변이체 단백질의 활성을 모체 단백질과 비교하여 시험함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편으로부터의 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 30개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 25개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 20개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 15개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 10개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 5개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에 1 내지 3개의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환(들)은 항체 또는 항원 결합 단편의 CDR에 존재한다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환(들)은 항체 또는 항원 결합 단편의 CDR에 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환(들)은 항체 또는 항원 결합 단편의 프레임워크 영역에 존재한다.
항체의 불변 영역(들)이 여러 이펙터 기능을 매개하고, 이러한 이펙터 기능은 항체의 이소타입에 따라 달라질 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 오디. 예를 들어, 보체의 C1 구성성분이 (항원에 결합된) IgG 또는 IgM 항체의 Fc 영역에 결합하면 보체계가 활성화된다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극시키고, 자가면역 과민증에 관여할 수 있다. 추가로, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 포함하여 상이한 부류의 항체에 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 항체의 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 결합은 항체 코팅 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체 제거, 살해 세포에 의한 항체 코팅 표적 세포의 용해(항체 의존성 세포 세포 독성 또는 ADCC로 불림), 염증성 매개인자 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생산 제어를 비롯한, 중요하고, 다양한 생물학적 반응을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgA 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgD 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgE 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgM 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG1 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG2 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG3 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG4 항체의 적어도 하나의 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편에서 불변 영역 중 적어도 하나 이상은 변형되거나 결실되었다. 일부 실시양태에서, 항체는 3개의 중쇄 불변 영역s (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상의 것 및/또는 경쇄 불변 영역 (CL)에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 중쇄 불변 영역은 1 초과의 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 영역에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 영역은 변형된 항체의 불변 영역으로부터 부분적으로 또는 전체적으로 결실된다. 일부 실시양태에서, 전체 CH2 도메인은 항체로부터 제거되었다 (ΔCH2 구축물). 일부 실시양태에서, 결실된 불변 영역은 부재하는 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서로 대체된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 항체의 힌지 영역에 직접 융합된 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된 펩티드 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 힌지를 통해 융합된다. 힌지는 IgG1 힌지, IgG2 힌지, 또는 IgG3 힌지일 수 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 일부 경우에서, 천연 항체에서 아미노산 변이가 있는 Fc 영역이 확인되었다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체 (예컨대, 변형된 Fc 영역)는 변경된 이펙터 기능을 제공하고, 이는 결국 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 준다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편의 Fc 영역은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과하는 이의 능력을 증진시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역의 결실 또는 불활성화 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 변형된 항체가 순환함에 따라 Fc 수용체 결합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 면역원성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 혈청 반감기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 ADCC 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 감소시키거나, 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, 상응하는 IgG2 또는 IgG4 잔기로의 인간 IgG1 Fc 영역의 특정 아미노산 치환은 변형된 항체에서 이펙터 기능 (예컨대, ADCC 및 CDC)을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다 (예를 들어, "이펙터 결여(effectorless)" 항체). 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 이펙터 기능(들)을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 ADCC 및/또는 CDC를 증가시키거나, 또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 디술피드 연결 또는 올리고당 모이어티를 제거하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 하나 이상의 세포독소, 올리고당 또는 탄수화물 부착 부위를 제공하기 위해 하나 이상의 아미노산을 부가/치환하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 천연 Fc 영역과 비교하여 특정 아미노산 위치에서 치환으로 조작된 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 EU 넘버링에 따라 K214R, L234A, L235E, G237A, D356E, 및 L358M으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링에 따라 K214R, L234A, L235E, G237A, A330S, P331S, D356E, 및 L358M으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링에 따라 K214R, C226S, C229S, 및 P238S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링에 따라 K214R, D356E, 및 L358M으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링에 따라 S131C, K133R, G137E, G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R, C226S, C229S, 및 P238S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변이체는 항체 또는 폴리펩티드의 아미노- 및/또는 카르복실-말단에 아미노산 잔기의 부가를 포함할 수 있다. 추가의 아미노산 잔기의 길이는 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기까지 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 N-말단 메티오닐 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 융합 단백질을 생성하기 위한 추가의 폴리펩티드/단백질 (예컨대, Fc 영역)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 검출가능하도록 조작되고, 검출가능한 표지 및/또는 단백질 (예컨대, 형광 태그 또는 효소)을 포함할 수 있다.
치료 항체는 예를 들어, 수용체 매개 트랜스사이토시스, 흡착 트랜스사이토시스, 담체 매개 수송, 세포주위 수송 및 확산을 비롯한 다양한 기전을 통해 BBB를 통한 수송을 촉진시키도록 재조작될 수 있다. 그 중에서도 항체의 유입을 촉진하기 위해 수용체 매개 트랜스사이토시스 (R.M.T.)가 널리 연구되었다. R.M.T.의 사용은 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 저밀도 지질단백질 수용체 (LDL 수용체), CD98, TMEM50A 및 결합시 트랜스사이토시스를 수행할 수 있는 내피 세포의 다른 표면 수용체를 포함한다. 트랜스페린, 인슐린 수용체, CD98 및 TEME50A에의 항체 결합은 전체 복합체의 트랜스사이토시스를 유도할 수 있다. LDL 수용체의 경우, 아포지단백질의 결합이 트랜스사이토시스 프로세스를 일으킬 수 있다. 따라서, 항체 단편 또는 아포지단백질에 연결된 치료 항체가 동물 모델에서 BBB 통과를 증진시키기 위해 제안되고, 검증되어 있다.
따라서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 BBB를 통과하는 이의 능력을 증진시키도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 트랜스페린, 인슐린 수용체, CD98 또는 TEME50A에 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 단편에 융합된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 트랜스페린에 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 단편에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 트랜스페린 수용체 결합 Fab 단편에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인슐린 수용체에 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 단편에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD98에 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 단편에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 TEME50A에 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 단편에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 아포지단백질에 융합된다.
본원에 기술된 변이체 항체 또는 항원 결합 단편은 부위 지정 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 및 PCR 돌연변이유발을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 모체 항체 또는 항원 결합 단편과 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 더 높은 정도로 CD22에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 모체 항체 또는 항원 결합 단편과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과로 동일할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있고, 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 한 아미노산이 동일하거나, 또는 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산 대신으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 결합 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환은 변이체의 하나 이상의 생물학적 활성 (예컨대, CD22 결합)을 방해 또는 억제시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환은 변이체의 생물학적 활성을 증진시킬 수 있고, 이로써, 기능성 변이체의 생물학적 활성은 모체 결합 모이어티와 비교하여 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 자연적으로 또는 개입에 의해 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 및/또는 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결에 의해 화학적으로 변형되었다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것이 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 포함) 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 변형을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 공지된 다양한 방법에 의해 이의 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 특성에 대해 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체는 CD22 (예를 들어, 인간 CD22)에 결합하는 능력에 대해 시험된다. 결합 검정법은 표면 플라스몬 공명 (예컨대, 비아코어), ELISA, 및 FACS를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, CD22에 대한 결합제 (예컨대, 항체)의 해리 상수는 표면 플라스몬 공명 (예컨대, BIA코어)에 의해 측정된 해리 상수이다. 추가로, 항체는 용해도, 안정성, 열안정성, 점도, 발현 수준, 발현 품질 및/또는 정제 효율성에 대해 평가될 수 있다.
SM03 및 SM06, 둘 모두 약 1.2 nM의 해리 상수 (KD)로 인간 CD22에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 50 pM 이하, 10 pM 이하, 또는 1 pM 이하의 해리 상수 (KD)로 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 약 20 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 10 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 5 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 2 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 1.5 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 1 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 0.5 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 0.1 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 50 pM 이하이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 10 pM 이하이다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.1-1 nM, 0.5-5 nM, 1-10 nM, 1-5 nM, 5-50 nM, 10-100 nM, 또는 50-500 nM 범위 내의 KD로 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 0.1-1 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 0.5-5 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 1-10 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 1-5 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 5-50 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 10-100 nM 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KD는 50-500 nM 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.8x109 M-1의 회합 상수 (KA)로 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1x106 M-1 이상, 약 1x107 M-1 이상, 약 1x108 M-1 이상, 약 5x108 M-1 이상, 약 8x108 M-1 이상, 약 1x109 M-1 이상, 약 5x109 M-1 이상, 약 1x1010 M-1 이상, 약 5x1010 M-1 이상, 약 1x1011 M-1 이상, 약 5x1011 M-1 이상, 또는 약 1x1012 M-1 이상의 KA로 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 결합한다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x107 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x107 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 8x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x109 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x109 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x1010 M-1 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1x106-1x107 M-1, 5x106-5x107 M-1, 1x107-1x108 M-1, 5x107-5x108 M-1, 1x108-5x108 M-1, 1x108-1x109 M-1, 5x108-1x109 M-1, 5x108-5x109 M-1, 1x109-1x1010 M-1, 5x109-5x1010 M-1, 1x1010-1x1011 M-1, 5x1010-5x1011 M-1, 1x1011-1x1012 M-1, 또는 5x1011-5x1012 M-1 범위 내의 KA로 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 결합한다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x106-1x107 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x107-1x108 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x108-1x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108-1x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108-5x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x109-1x1010 M-1 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 SPR (예컨대, BIA코어)에 의해 측정된 바, 0.0685 RU s-1 이하, 또는 0.0137 RU s-1 이하의 kd로 인간 CD22로부터 해리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.5 RU s-1 이하, 약 0.2 RU s-1 이하, 약 0.1 RU s-1 이하, 약 0.08 RU s-1 이하, 약 0.06 RU s-1 이하, 약 0.05 RU s-1 이하, 약 0.04 RU s-1 이하, 약 0.03 RU s-1 이하, 약 0.02 RU s-1 이하, 약 0.01 RU s-1 이하, 약 0.008 RU s-1 이하, 약 0.005 RU s-1 이하, 또는 약 0.001 RU s-1 이하의 kd로 인간 CD22로부터 해리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.5 RU s-1 이하의 kd로 인간 CD22로부터 해리된다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.2 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.1 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.08 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.06 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.05 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.02 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.01 RU s-1 이하이다. 일부 실시양태에서, kd는 약 0.005 RU s-1 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.001-0.5 RU s-1, 0.001-0.1 RU s-1, 0.001-0.05 RU s-1, 0.005-0.5 RU s-1, 0.005-0.1 RU s-1, 0.01-0.5 RU s-1, 0.01-0.1 RU s-1, 또는 0.01-0.05 RU s-1 범위의 kd로 인간 CD22로부터 해리된다. 일부 실시양태에서, kd는 0.005-0.05 RU s-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, kd는 0.01-0.1 RU s-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, kd는 0.005-0.1 RU s-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, kd는 0.01-0.5 RU s-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, kd는 0.01-0.1 RU s-1 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 SPR (예컨대, BIA코어)에 의해 측정된 바, 1.13 x 107 RU S-1 이상의 ka로 인간 CD22와 회합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1.0 x 105 RU S-1 이상, 약 5.0 x 105 RU S-1 이상, 약 1.0 x 106 RU S-1 이상, 약 5.0 x 106 RU S-1 이상, 약 1.0 x 107 RU S-1 이상, 약 2.0 x 107 RU S-1 이상, 약 3 x 107 RU S-1 이상, 약 4.0 x 107 RU S-1 이상, 약 5.0 x 107 RU S-1 이상, 약 1.0 x 108 RU S-1 이상, 약 5.0 x 108 RU S-1 이상, 또는 약 1.0 x 109 RU S-1 이상의 ka로 인간 CD22와 회합한다. 일부 실시양태에서, ka는 약 1.0 x 106 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 5.0 x 106 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 1.0 x 107 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 of 2.0 x 107 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 5.0 x 107 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 1.0 x 108 RU S-1 이상이다. 일부 실시양태에서, ka는 약 1.0 x 109 RU S-1 이상이다.
일부 실시양태에서, ka는 1.0 x 105 - 1.0 x 106 RU S-1, 1.0 x 106 - 1.0 x 107 RU S-1, 5.0 x 106 - 5.0 x 107 RU S-1, 1.0 x 107 - 5.0 x 107 RU S-1, 1.0 x 107 - 1.0 x 108 RU S-1, 또는 1.0 x 108 - 1.0 x 109 RU S-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, ka는 1.0 x 106 - 1.0 x 107 RU S-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, ka는 5.0 x 106 - 5.0 x 107 RU S-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, ka는 1.0 x 107 - 5.0 x 107 RU S-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, ka는 1.0 x 107 - 1.0 x 108 RU S-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, ka는 1.0 x 108 - 1.0 x 109 RU S-1 범위 내에 있다.
에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 표적 단백질 상의 결합 부위, 영역 또는 에피토프를 확인하는 방법이다. 표적 단백질 상의 에피토프를 맵핑하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 샷건 돌연변이유발, 부위 지정 돌연변이유발, 및 알라닌 스캐닝을 포함하나, 이에 제한되지 않는 돌연변이유발; 도메인 또는 단편 스캐닝; 펩티드 스캐닝 (예컨대, 펩스캔(Pepscan) 기술); 디스플레이 방법 (예컨대, 파지 디스플레이, 미생물 디스플레이, 및 리보솜/mRNA 디스플레이); 단백질분해 및 질량 분광학을 포함하는 방법; 및 구조 결정 (예컨대, X선 결정학 및 NMR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 N-말단 시퀀싱, 아미노산 분석, HPLC, 질량 분석법, 이온 교환 크로마토그래피, 및 파파인 분해를 포함하나, 이에 제한되지 않는 검정법에 의해 특징화된다.
문헌 [Leung et al. (2015) Mabs 7(1):66-76]; [Zhao et al. (2014) PLOS ONE 9(5): e96697]; 미국 특허 번호 US 9371396B2; 및 중국 특허 번호 ZL201210286457.4 (상기 문헌들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, SM03 및 SM06은 높은 친화도로 인간 CD22의 도메인 2에, 구체적으로, 0.82x109 M-1 범위의 친화도 (Ka)로 서열 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함하는 불연속 입체형태적 에피토프에 결합한다. 이러한 입체형태적 에피토프의 결합은 CD22의 신속한 내재화를 유도할 수 있고 (예컨대, 표면 CD22의 50%가 10분 이내에 내재화될 수 있고), CD22의 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스-전환을 촉진시킬 수 있고, 면역내성을 회복시킨다. 또한, SM03 및 SM06, 둘 모두 79.9±27.6 ng/ml 범위의 EC50으로 SM03 및 SM06 (예컨대, LRID)의 항원 결합 부위 (ABS)에 대한 항-이디오타입 항체에 결합할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22와 Aβ와의 상호작용을 입체적으로 방해하지 않는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22와 Aβ와의 상호작용을 입체적으로 방해하지 않는 특이적 입체형태적 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체형태적이고, 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18), 둘 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.8x109 M-1의 KA로 상기 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1x107 M-1 이상, 약 1x108 M-1 이상, 약 5x108 M-1 이상, 약 1x109 M-1 이상, 약 5x109 M-1 이상, 약 1x1010 M-1 이상, 약 5x1010 M-1 이상, 약 1x1011 M-1 이상, 약 5x1011 M-1 이상, 또는 약 1x1012 M-1 이상의 KA로 상기 입체형태적 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x107 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x107 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 8x108 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x109 M-1 이상이다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x109 M-1 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1x106-1x107 M-1, 5x106-5x107 M-1, 1x107-1x108 M-1, 5x107-5x108 M-1, 1x108-5x108 M-1, 1x108-1x109 M-1, 5x108-1x109 M-1, 5x108-5x109 M-1, 1x109-1x1010 M-1, 5x109-5x1010 M-1, 1x1010-1x1011 M-1, 5x1010-5x1011 M-1, 1x1011-1x1012 M-1, 또는 5x1011-5x1012 M-1 범위 내의 KA로 상기 입체형태적 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x106-1x107 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x106-1x107 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x107-1x108 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x108-1x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108-1x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 5x108-5x109 M-1 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, KA는 약 1x109-1x1010 M-1 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 높은 친화도로 항-이디오타입 항체에 결합한다 (예컨대, 문헌 [Leung 2015 상기 문헌 동일]; [Zhao 2014 상기 문헌 동일]에 기술). 항-이디오타입 항체는 각각의 것이 각각 서열 번호: 13 및 14의 아미노산 서열을 갖는 VL 및 VH ("LRID")를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.40 ㎍/ml 이하의 EC50으로 LRID에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.08 ㎍/ml의 EC50으로 LRID에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 5.0 ㎍/ml, 약 2.0 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml, 약 0.8 ㎍/ml, 약 0.5 ㎍/ml, 약 0.2 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml, 약 0.08 ㎍/ml, 약 0.05 ㎍/ml, 약 0.02 ㎍/ml, 약 0.01 ㎍/ml, 약 0.008 ㎍/ml, 약 0.005 ㎍/ml, 또는 약 0.001 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 2.0 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1.0 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.8 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.2 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.08 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.05 ㎍/ml이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.01 ㎍/ml이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.01-5 ㎍/ml, 0.01-1 ㎍/ml, 0.01-0.5 ㎍/ml, 0.05-5 ㎍/ml, 0.05-1 ㎍/ml, 0.05-0.5 ㎍/ml, 0.1-5 ㎍/ml, 또는 0.1-1 ㎍/ml 범위의 EC50으로 LRID에 결합한다. 일부 실시양태에서, EC50은 0.01-1 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 0.01-0.5 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 0.05-1 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 0.05-0.5 ㎍/ml 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에의 결합에 대해 상기 제공된 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. "표적에의 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁하는" 항체란, 다른 항체의 표적에의 결합을 (부분적으로 또는 전체적으로) 억제시키는 항체를 지칭한다. 두 항체가 표적에의 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉, 한 항체가 나머지 다른 한 항체의 표적에의 결합을 억제시키는지 여부와 그 정도는 공지된 경쟁 실험, 예컨대, BIACORE® 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 또 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하고, 이의 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 억제시킨다. 경쟁 검정법은 예를 들어, 문헌 [Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: l0.H0l/pdb.prot4277] 또는 [Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 인간 CD22에의 결합에 대해 SM03과 경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 인간 CD22에의 결합에 대해 SM06과 경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 Ramos 세포, 인간 버킷 림프종 세포주 상의 천연 CD22에의 방사성표지된 I125-SM03 결합과 약 5.01 ㎍/ml 이하, 또는 약 1.02 ㎍/ml의 EC50으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 Ramos 세포 상의 천연 CD22에의 방사성표지된 I125-SM03 결합과 약 0.1 ㎍/ml 이하, 약 0.2 ㎍/ml 이하, 약 0.5 ㎍/ml 이하, 약 0.8 ㎍/ml 이하, 약 1 ㎍/ml 이하, 약 2 ㎍/ml 이하, 약 5.0 ㎍/ml 이하, 약 8 ㎍/ml 이하, 약 10 ㎍/ml 이하, 또는 약 50 ㎍/ml 이하의 EC50으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 2 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 5 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 10 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 Ramos 세포 상의 천연 CD22에의 방사성표지된 I125-SM03 결합과 약 0.1-50 ㎍/ml, 약 0.1-10 ㎍/ml, 약 0.1-5 ㎍/ml, 약 0.5-10 ㎍/ml, 약 0.5-5 ㎍/ml, 약 1-10 ㎍/ml 또는 약 1-5 ㎍/ml 범위 이내의 EC50으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-50 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-5 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5-5 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1-5 ㎍/ml 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 마이크로글리아 세포 (예컨대, HMC-3 세포) 상의 천연 CD22에의 방사성표지된 I125-SM03 결합과 약 0.1 ㎍/ml 이하, 약 0.2 ㎍/ml 이하, 약 0.5 ㎍/ml 이하, 약 0.8 ㎍/ml 이하, 약 1 ㎍/ml 이하, 약 2 ㎍/ml 이하, 약 5.0 ㎍/ml 이하, 약 8 ㎍/ml 이하, 약 10 ㎍/ml 이하, 또는 약 50 ㎍/ml 이하의 EC50으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.2 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 2 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 5 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 10 ㎍/ml 이하이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 마이크로글리아 세포 (예컨대, HMC-3 세포) 상의 천연 CD22에의 방사성표지된 I125-SM03 결합과 약 0.1-50 ㎍/ml, 약 0.1-10 ㎍/ml, 약 0.1-5 ㎍/ml, 약 0.5-10 ㎍/ml, 약 0.5-5 ㎍/ml, 약 1-10 ㎍/ml 또는 약 1-5 ㎍/ml 범위 이내의 EC50으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-50 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.1-5 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 0.5-5 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1-10 ㎍/ml 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, EC50은 약 1-5 ㎍/ml 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 (예컨대, B 세포, 또는 마이크로글리아 세포)와의 접촉시 10분 (min) 이내에 표면 CD22의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 30%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 40%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 60%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 접촉시 10 min 이내에 표면 CD22의 약 20% 내지 70%, 약 30% 내지 70%, 약 40% 내지 70%, 약 30% 내지 60%, 또는 약 40% 내지 60%의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 20% 내지 70%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 40% 내지 70%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 30% 내지 60%이다. 일부 실시양태에서, 내재화율은 10 min 이내의 표면 CD22의 약 40% 내지 60%이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 (예컨대, B 세포, 또는 마이크로글리아 세포)와의 접촉시 약 2 min, 약 5 min, 약 10 min, 약 15 min, 약 20 min, 약 30 min, 또는 약 1시간 이내에 표면 CD22의 약 50%의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 2 min 이내에 내재화된다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 5 min 이내에 내재화된다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 10 min 이내에 내재화된다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 15 min 이내에 내재화된다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 20 min 이내에 내재화된다. 일부 실시양태에서, 표면 CD22의 50%는 30 min 이내에 내재화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.1 Х 10- 6 pg/s/세포, 약 0.2 Х 10- 6 pg/s/세포, 약 0.5 Х 10- 6 pg/s/세포, 약 0.8 Х 10- 6 pg/s/세포, 약 1.0 X 10- 6 pg/s/세포, 약 2.0 X 10- 6 pg/s/세포, 약 4.0 X 10-6, 약 5.0 X 10- 6 pg/s/세포, 약 6.0 X 10-6 pg/s/세포, 약 7.0 X 10- 6 pg/s/세포, 약 8.0 X 10- 6 pg/s/세포, 약 1.0 X 10- 5 pg/s/세포, 약 2.0 X 10- 5 pg/s/세포, 약 5.0 X 10- 5 pg/s/세포, 또는 약 8.0 X 10- 5 pg/s/세포의 속도로 Aβ의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.2 Х 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.5 Х 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.8 Х 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 1.0 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 2.0 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 4.0 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 6.0 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 1.0 X 10- 5 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 5.0 X 10- 5 pg/s/세포. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.1-50 X 10- 6 pg/s/세포, 약 0.1-20 X 10- 6 pg/s/세포, 약 0.1-10 X 10- 6 pg/s/세포, 약 0.5-50 X 10- 6 pg/s/세포, 약 0.5-20 X 10- 6 pg/s/세포, 약 0.5-10 X 10- 6 pg/s/세포, 약 1-50 X 10- 6 pg/s/세포, 약 1-20 X 10- 6 pg/s/세포, 약 1-10 X 10- 6 pg/s/세포, 또는 약 1-6 Х 10- 6 pg/s/세포의 속도로 Aβ의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.1-50 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.5-50 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 0.5-10 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 1-50 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 1-10 X 10- 6 pg/s/세포이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 이다. 일부 실시양태에서, 속도는 약 1-6 Х 10- 6 pg/s/세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 유도체화되거나, 또는 또 다른 기능성 분자 (예컨대, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결되어 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 항체 및 항원 결합 단편은 면역부착 분자를 포함하여 본원에 기술된 인간 항-CD22 항체의 유도체화된 형태 및 다르게 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 항체 및 항원 결합 단편은 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 부위 특이적 접합에 적합한 인공 아미노산/작용기의 도입에 의해) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 또 다른 항체 (예컨대, 이중특이적 항체 또는 이중항체), 검출제, 세포독성제, 약제, 및/또는 항체 또는 항원 결합 단편과 또 다른 분자 (예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 기능적으로 연결될 수 있다.
한 유형의 유도체화된 항체는 (동일한 유형의, 또는 예컨대, 이중특이적 항체를 생성하기 위해 상이한 유형의) 2개 이상의 항체를 가교결합시킴으로써 생산된다. 적합한 가교결합제는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 이종이작용성인 것 (예컨대, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종이작용성인 것 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트)를 포함한다. 상기 링커는 써모 사이언티픽(Thermo Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬)으로부터 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 세포독성제 또는 세포독성 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 세포독성제에 접합되어 ADC (항체-약물 접합체)를 형성한다. 일부 실시양태에서, 세포독성 모이어티는 메토트렉세이트, 아드리아마이신/독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카르마이신, 다우노루비신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 또는 다른 삽입제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 모이어티는 아우리스타틴, 메이탄시노이드 (예컨대, DM1 및 DM4) 및 튜부리신을 포함하나, 이에 제한되지 않는 미세소관 억제제이다. 일부 실시양태에서, 세포독성 모이어티는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 작용제가 진단 및/또는 검출에 사용될 수 있도록 하는 검출가능한 물질 또는 분자 접합된다. 검출가능한 물질은 또한 효소, 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 및 아세틸콜린에스테라제; 보결분자단, 예컨대, 비오틴 및 플라빈(들); 형광 물질, 예컨대, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 시아닌 (Cy3), 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 및 피코에리트린; 생물발광 물질 예컨대, 루시페라제; 방사성 물질, 예컨대, 212Bi, 14C, 57Co, 51Cr, 67Cu, 18F, 68Ga, 67Ga, 153Gd, 159Gd, 68Ge, 3H, 166Ho, 131I, 125I, 123I, 121I, 115In, 113In, 112In, 111In, 140La, 177Lu, 54Mn, 99Mo, 32P, 103Pd, 149Pm, 142Pr, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 47Sc, 75Se, 153Sm, 113Sn, 117Sn, 85Sr, 99mTc, 201Ti, 133Xe, 90Y, 69Yb, 175Yb, 65Zn; 양전자 방출 금속; 및 자성 금속 이온 양전자 방출 금속; 및 자성 금속 이온을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 고정화된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 면역검정법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 고정화된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 항원 (예컨대, 인간 CD22)의 정제에 사용된다.
5.2.2 추가의 CD22 항체
본원에서는 치료 유효량의, 본원에 개시된 항-CD22 (예컨대, 인간 CD22) 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대, SM03, SM06 또는 이의 변이체 또는 등가물을 이용하여, Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법, 신경염증을 감소시키는 방법, 시냅스 식세포작용 및/또는 뉴런 사멸을 방지하는 방법, Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 및 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 개시한다. 이론에 얽매이지 않고, 본원에 개시된 SM03, SM06, 및 다른 항-CD22 항체는 하기 기능 또는 활성: (1) Aβ와 CD22 상호작용을 입체적으로 방해하지 않는 에피토프에 결합; (2) 인간 CD22의 도메인 2에 결합; (3) 서열 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함하는 인간 CD22의 입체형태적 에피토프에 결합; (4) CD22 호모-클러스터의 시스-결합 방해; (5) CD22의 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스 전환 촉진; (6) CD22의 뉴런 2,6-시알산에의 트랜 스-결합 촉진; (7) 예컨대, 마이크로글리아 세포, Ramos 세포 및/또는 B 세포에서 CD22 내재화를 임의적으로 표면 CD22의 50%가 10분 이내에 내재화되는 속도로 촉진; (8) 마이크로글리아 세포에서 Aβ 내재화 촉진; (9) 염증유발성 사이토카인, 예컨대, NFκB 신호전달, 및 IL-6 분비 억제; 및 (10) 신경염증 감소 중 적어도 하나를 갖기 때문에, 상기 언급된 치료 효과를 달성하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
인간 CD22의 도메인 2, 및/또는 서열 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함하는 인간 CD22의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22의 뉴런 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스 전환을 촉진시켜 마이크로글리아 세포에서의 CD22의 신속한 내재화를 유도할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이어서, CD22의 신속한 내재화는 세포 표면의 FcγR과 결합하지 않으면서, 마이크로글리아 세포에 의한 CD22 결합 Aβ 및 가용성 Aβ, 둘 모두의 신속한 내재화를 유도하여 FcγR 관여로 인해 발생하는 ARIA-E 및 ARIA-H를 방지한다. 추가로, CD22의 내재화 및 Aβ의 제거, 둘 모두 염증성 사이토카인, 예컨대, NFκB 신호전달, 및 IL-6 분비를 억제하여 신경염증을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본원에서는 또한 하기 기능 또는 활성: (1) Aβ와 CD22 상호작용을 입체적으로 방해하지 않는 에피토프에 결합; (2) 인간 CD22의 도메인 2에 결합; (3) 서열 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함하는 인간 CD22의 입체형태적 에피토프에 결합; (4) CD22 호모-클러스터의 시스-결합 방해; (5) CD22의 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스 전환 촉진; (6) CD22의 뉴런 2,6-시알산에의 트랜스-결합 촉진; (7) 예컨대, 마이크로글리아 세포, Ramos 세포 및/또는 B 세포에서 CD22 내재화를 임의적으로 50% CD22가 10분까지 내재화되는 속도로 촉진; (8) 마이크로글리아 세포에서 임의적으로 5.86x10-6 pg/s/세포 속도로 Aβ 내재화 촉진; (9) 신경염증 감소; 및 (10) 염증유발성 사이토카인, 예컨대, NFκB 신호전달, 및 IL-6 분비 억제 중 적어도 하나에 대하여 CD22 (예컨대, 인간 CD22)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 선택하는 방법으로서, 여기서 선택된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법, 신경염증을 감소시키는 방법, 시냅스 식세포작용 및/또는 뉴런 사멸을 방지하는 방법, Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 및 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 항체 또는 항원 결합 단편은 신경염증을 감소시키는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 항체 또는 항원 결합 단편은 시냅스 식세포작용 및/또는 뉴런 사멸을 방지하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 항체 또는 항원 결합 단편은 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
예시 목적으로, 에프라투주맙 (Emab)은 CD22 내재화를 유도할 수 있는 것으로 확인되었으며, 마이크로글리아 세포에서 Aβ 제거도 촉진시키는 것으로 확인되었다. 따라서, Emab 및 이의 기능성 변이체는 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법, 신경염증을 감소시키는 방법, 시냅스 식세포작용 및/또는 뉴런 사멸을 방지하는 방법, Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 및/또는 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 비롯한, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하고자 하는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 CD22의 도메인 2 또는 서열 161CLLNFSCYGYPIQ173 (서열 번호: 17) 및 198VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC219 (서열 번호: 18)를 포함하는 인간 CD22의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하고자 하는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 이의 LRID (예컨대, 미국 특허 번호 US 9,371,396 B2)에의 결합에 대해 선택된다.
상이한 항-인간 CD22 항체 중에서 이의 결합 에피토프가 세포막에 가까울수록, 항체가 유도하는 내재화 속도가 저속화된다는 것이 본 개시내용의 발명자들에 의해 밝혀졌다. 따라서, 에피토프 기반 선택에 의해, 즉, 세포막에서 멀리 떨어진 에피토프에 결합하는 항-CD22 항체를 선택함으로써 신속한 내재화를 유도하는 항체를 확인할 수 있다. 본원에 개시되거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 임의의 에피토프 맵핑 방법, 예컨대, 샷건 돌연변이유발, 부위 지정 돌연변이유발, 및 알라닌 스캐닝을 포함하나, 이에 제한되지 않는 돌연변이유발; 도메인 또는 단편 스캐닝; 펩티드 스캐닝 (예컨대, 펩스캔 기술); 디스플레이 방법 (예컨대, 파지 디스플레이, 미생물 디스플레이, 및 리보솜/mRNA 디스플레이); 단백질분해 및 질량 분광학을 포함하는 방법; 및 구조 결정 (예컨대, X선 결정학 및 NMR)이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이 도메인 2 중의 불연속 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하여 신속한 내재화를 유도하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조된, 재조합 조합 항체 라이브러리, 바람직하게, scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 상기 라이브러리를 제조하고, 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 상업적으로 이용가능한 키트 (예컨대, GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스(Healthcare Life Sciences) 재조합 항체 파지 시스템(Recombinant Antibody Phage System: RAPS); 및 뉴 잉글랜드 바이오랩 Ph.DTM 파지 디스플레이 라이브러리 키트(New England Biolab Ph.DTM Phage Display Library Kit), 카탈로그 번호 E8100S) 이외에도, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 스크리닝하는 데 사용하는 데 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409 (래드너(Ladner) 등); 문헌 [Fuchs et al. (1991) Biotechnology 9:1369-1372]; [Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85]; [Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281]; [McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554]; [Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734]; [Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896]; [Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]; [Gram et al. (1992) PNAS 89:3579-3580]; [Garrard et al. (1991) Biotechnology 9:1373-1377]; [Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137]; 및 [Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982]에서 살펴볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하고자 하는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.8x109 M-1 이상의 Ka로 인간 CD22에 결합하는 것에 대해 추가로 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1.2 nM 이하의 KD로 인간 CD22에 결합하는 것에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하고자 하는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.07 RU s-1 이하의 kd 또는 0.015 RU s-1 이하의 kd로 인간 CD22로부터 해리되는 것에 대해 선택된다. 본원에서 언급된 결합 파라미터는 본원에 개시되거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하고자 하는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 0.2 ㎍/ml 이하의 EC50으로 LRID의 표면 결합 모이어티를 발현하는 대용 표적 세포에 대해 CMC 활성을 유도하는 이의 기능에 대해 추가로 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 CD22에 대해 높은 친화도 및 낮은 오프 속도 상수를 갖는 뮤린, 재조합 또는 인간 항체를 단리시키기 위해, 먼저 인간 CD22에 대해 높은 친화도 및 낮은 오프 속도 상수를 갖는 모체 뮤린 또는 키메라 항-CD22 항체 (예컨대, 수탁 번호: 7621로 ATCC에 기탁된 뮤린 항-CD22 항체에 대한 하이브리도마)를 사용하여 PCT 공개 번호 WO 93/06213에 기술된 에피토프 각인 방법을 이용함으로써 인간 CD22에 대하여 결합 활성이 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선택한다. 본 방법에서 사용된 항체 라이브러리는 바람직하게, PCT 공개 번호 WO 92/01047, 문헌 [McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554]; 및 [Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734]에 기술된 바와 같이 제조되고, 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게, 항원으로서 재조합 인간 CD22 (2-4 도메인), 및/또는 항-CD22 항체의 항원 결합 부위 (ABS)에 특이적인 항-이디오타입 항체 (예컨대, 미국 특허 번호 9371396B에 기술된 바와 같은 LRID)를 사용하여 스크리닝된다.
일단 초기 인간 VL 및 V H 세그먼트를 선택하고 나면, 처음 선택된 VL 및 VH 세그먼트의 상이한 쌍을 인간 CD22 결합에 대해 스크리닝하는 "믹스 및 매치" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 특정 항원에 대한 항체 결합의 친화성 및/또는 특이성은 문헌 [Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)] (상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 방법와 같이 "유도 진화" 방법을 사용하여 증가될 수 있다. 추가로, 인간 CD22 (또는 재조합 CD22 (2-4) 도메인) 결합에 대한 친화성 및/또는 더 낮은 오프 속도 상수를 추가로 개선시키기 위해, 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 세그먼트를 천연 면역 반응 동안 항체의 친화성 성숙화를 담당하는 생체내 체세포 돌연변이화 프로세스와 유사한 프로세스로 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서 무작위로 돌연변이화할 수 있다. 이러한 시험관내 친화성 성숙화는 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써 달성될 수 있으며, 상기 프라이머는 특정 위치에서 4개 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이킹"되어 생성된 PCR 생성물은 VH 및/또는 VL CDR3 CDR3 영역에 무작위 돌연변이가 도입된 VH 및 VL 세그먼트를 코딩한다. 상기 무작위로 돌연변이화된 VH 및 VL 세그먼트는 인간 CD22에의, 바람직하게, CD22의 도메인 2-4를 함유하는 재조합 단백질에의 결합에 대해, 및/또는 항-CD22 항체의 항-이디오타입 항체 (예컨대, LRID)에의 결합에 대해 재스크리닝될 수 있고; 인간 CD22, 바람직하게, 재조합 CD22 (2-4) 도메인, 및/또는 CD22에 대한 항-이디오타입 항체 (예컨대, LRID) 결합에 대하여 높은 친화성 및 낮은 오프 속도를 보이는 서열이 선택될 수 있다.
파지 디스플레이 외에도, 스크리닝을 위한 후보 모노클로날 항체는 또한 당업자에게 널리 공지되어 있는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기 기술된 바와 같이 면역화한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 시험관내에서 면역화된다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 인간 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 인간 단백질 또는 이의 단편이다.
면역화 후, 림프구를 단리시키고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 특수 배지를 사용하여 선택되며, 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포는 선택 프로세스에서 생존하지 못한다. 선택된 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 면역침강, 면역블롯팅 및 시험관내 결합 검정법 (예컨대, 유세포 분석법, FACS, ELISA, BLI, SPR (예컨대, 비아코어, 및 방사면역검정법)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 일단 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되고 나면, 제한 희석 또는 다른 기술에 의해 클론을 서브클로닝할 수 있다. 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 시험관내 배양물에서 또는 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 증식될 수 있다. 모노클로날 항체는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 투석을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계의 표준 방법에 따라 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.
시스로 진행되는 CD22 결합을 방해하는 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 추가의 스크리닝 방법은 본 개시내용의 발명자들에 의해 이전에 개시된 바 있다 (예컨대, WO2020078453A1 (이 전문은 본원에서 참조로 포함)). 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 항체의 존재 및 부재하에서 다중 2,6-시알산을 함유하는 외인성 프로브의 조작된 세포주에의 결합을 비교함으로써 비내재화, 인간 CD22 도메인 1 내지 7 및 2,6-시알산 리간드를 함유하는 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 조작된 세포주를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 항체가 외인성 프로브의 조작된 세포주에의 결합을 회복시킨다면, 항체는 CD22 시스-결합을 방해할 수 있는 것으로 확인된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 인간 CD22 도메인 1 내지 7 및 글리코포린 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 글리코포린 A의 막횡단 및 세포질 부분에 융합된 인간 CD22의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 붕괴 가속 인자 (DAF) 단백질로부터 단리된 글리코포스파티딜이노시톨 신호 서열에 융합된 인간 CD22의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 15와 적어도 95% 동일한 것을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 15와 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 16과 적어도 95% 동일한 것을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 16과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 외인성 프로브는 α2-6-시알릴락토스 (6'PAA-B; 글리코테크(Glycotech))로 치환된 비오틴-접합된 폴리아크릴아미드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 스크리닝 방법을 통해 본원에 개시된 치료 용도를 갖는 것으로 확인된 비인간 항체는 인간화될 수 있으며, 여기서 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생성된 항체와의 유사성을 증가시키기 위해 변형된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 부분은 인간화된다.
종종, 프레임워크 영역 중의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예컨대, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예컨대, 미국 특허 번호 5,585,089 (퀸(Queen) 등; 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323] (상기 문헌들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
인간화 항체에는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기가 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 획득된다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDRs 및 인간으로부터의 프레임워크 영역을 포함한다. CDR-그라프팅을 비롯한 항체 인간화 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]; 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 및 6,548,640 (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 인간화 항체에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다. 인간화 항체를 생산하는 방법은 또한 베니어링(veneering) 또는 재표면화 (예컨대, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; [Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814]; 및 [Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조), 쇄 셔플링 (예컨대, 미국 특허 번호 5,565,332 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조), 및 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌 [Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002)], [Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)], [Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)], [Baca et al., J. Biol . Chem., 272(16):10678-84 (1997)], [Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)], [Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)], [Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)], [Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)], 및 [Pedersen et al., J. Mol . Biol., 235(3):959-73 (1994)] (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 기술을 포함한다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄, 둘 모두의 인간 가변 도메인 선택은 항원성을 감소시키고자 하는 것이다. 소위 "최적 적합"이라는 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류 서열에 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol . Biol ., 196:901 (1987)] (상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 수개의 다른 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol ., 151:2623 (1993)] (상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
항체는 표적 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 프로세스를 통해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고, 디스플레이 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 검사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 가능한 잔기의 역할을 분석할 수 있고, 즉, 후보 면역글로불린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 예컨대, 표적 항원에 대한 친화성 증가와 같은 원하는 항체 특징이 달성되도록 수용자 및 도입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고, 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여하다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본원에 개시된 항-CD22 항체를 스크리닝하고, 단리시킨 후, 선택된 항체를 코딩하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터 (예를 들어, 파지 게놈으로부터) 회수하고, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 원하는 경우, 핵산을 추가로 조작하여 본원에 개시되거나, 또는 당업계에 공지된 다른 항체 형태를 생성할 수 있다 (예컨대, 추가의 면역글로불린 도메인, 예컨대, 추가의 불변 영역을 코딩하는 핵산에 연결할 수 있다). 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터에 클로닝하고, 포유동물 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하여, 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 항체를 발현시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 (1) Aβ와 CD22 상호작용을 입체적으로 방해하지 않는 에피토프에 결합하는 것, 및 (2) CD22 호모-클러스터의 시스-결합을 방해하여 CD22의 2,6-시알산 결합의 시스 -트랜스 전환을 촉진시키고/거나, 뉴런 2,6-시알산에의 CD22의 트랜스-결합을 촉진시키는 것에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22 내재화를 촉진시키거나, 바람직하게는 세포 표면 상에서 FcγR과 결합하지 않으면서, 마이크로글리아 세포에서 Aβ의 내재화를 촉진시키거나, 신경염증을 감소시키거나, 마이크로글리아 세포에서 NFκB 신호전달을 억제시키거나, 마이크로글리아 세포에 의한 IL-6 분비를 억제시키는 이의 기능, 또는 이의 임의의 조합에 대해 직접적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 CD22 내재화를 촉진시시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 바람직하게는 세포 표면 상에서 FcγR과 결합하지 않으면서, 마이크로글리아 세포에서 Aβ의 내재화를 촉진시시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 신경염증을 감소시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 마이크로글리아 세포에서 NFκB 신호전달을 억제시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 마이크로글리아 세포에 의한 IL-6 분비를 억제시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 신경염증을 억제시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 시냅스 식세포작용을 억제시키는 이의 기능에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 뉴런 사멸을 억제시키는 이의 기능에 대해 선택된다.
본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 표준 ELISA에 의해 인간 CD22에의 결합에 대해 시험될 수 있다. 간략하면, 마이크로타이터 플레이트를 정제된 CD22로 코팅한 후, 이어서, 소 혈청 알부민으로 차단한다. 항체 희석액 (예컨대, CD22 면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액)을 각 웰에 첨가하고, 인큐베이션시킨다. 플레이트를 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 2차 시약 (예컨대, 인간 항체의 경우, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 함께 인큐베이션시킨다. 세척 후, 플레이트를 현상하여 분광광도계로 분석할 수 있다. 이어서, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 인간 CD22를 발현하는 세포주에 결합하지만, CD22를 발현하지 않는 대조군 세포주에는 결합하지 않는 것에 대하여 유세포 분석법에 의해 추가로 스크리닝할 수 있다. 간략하면, CD22 발현 CHO 세포를 항-CD22 항체와 함께 인큐베이션시킴으로써 항-CD22 항체 결합을 평가할 수 있다. 세포를 세척할 수 있고, 결합은 항-인간 IgG Ab로 검출할 수 있다. FACScan 유세포 분석법 (벡톤디킨슨(Becton Dickinson: 미국 캘리포니아주 산호세))을 이용하여 유세포 분석법에 의한 분석을 수행할 수 있다. 가장 높은 역가를 나타내는 마우스를 융합에 사용할 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 ELISA 검정법을 이용하여 항체에 대해 스크리닝할 수 있고, 이로써, CD22 면역원과 양성 반응성을 보이는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 이어서, CD22에 높은 친화도로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 서브클로닝하고, 추가로 특징화할 수 있다. 이어서, (ELISA에 의하면) 모체 세포의 반응성을 유지하는 각 하이브리도마로부터 하나의 클론을 선택하여 세포 은행을 만들고, 항체를 정제할 수 있다.
항-CD22 항체를 정제하기 위해, 모노클로날 항체 정제를 위해 선택된 하이브리도마를 성장시킬 수 있다. 친화성 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고, 농축시킬 수 있다. 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 확인하여 순도를 확인할 수 있다. 완충제 용액을 교환하고, 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, 보관할 수 있다.
항체 및 항원 결합 단편의 구조적 및 기능적 특성을 측정하는 다양한 방법 및 검정법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 선택된 항-CD22 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 각 항체를 상업적으로 이용가능한 시약 (피어스(Pierce: 미국 일리노이주 록퍼드))을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 CD22 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다.
CD22를 발현하는 살아있는 세포에의 모노클로날 항체의 결합을 시험하기 위해, 유세포 분석법을 사용할 수 있다. 간략하면, CD22 발현 세포주 (표준 성장 조건하에서 성장)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 모노클로날 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 혼합한다. 세척 후, 1차 항체 염색과 동일한 조건하에서 세포를 플루오레세인으로 표지된 항-IgG 항체와 반응시킨다. 샘플을 광 산란 및 측면 산란 특성을 사용하여 FACScan 기기에 의해 분석하여 단일 세포에 대해 게이팅하고, 표지된 항체의 결합을 측정할 수 있다. 유세포 분석법 검정법에 추가로 또는 그를 대신하여 형광 현미경 검사법을 사용하는 대체 검정법이 사용될 수 있다. 세포를 상기 기술된 바와 같이 정확하게 염색할 수 있고, 형광 현미경법으로 검사할 수 있다. 이 방법을 통해 개별 세포를 시각화할 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 민감도가 감소할 수 있다.
다양한 항-CD22 항체의 결합 친화도, 교차 반응성 및 결합 동역학적 성질을 분석하는 방법은 당업계에 공지된 표준 검정법, 예를 들어, 게이토 시스템 (프로브 라이프) 또는 옥텟-96 시스템 (사토리우스 AG)을 사용하는 생물층 간섭계 (BLI), 또는 BIACORE™ 2000 SPR 기기 (비아코어 AB(Biacore AB: 스웨덴 웁살라))를 사용하는 BIACORE™ 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 포함한다.
상기 개시된 기능적 특성에 대해 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 시험하거나, 또는 스크리닝하는 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본원에 개시되어 있거나, 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법은 본원에 개시된 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 기능적 검정법은 NFκB 신호전달을 측정하기 위한 루시페라제 검정법, IL-6 방출을 측정하기 위한 ELISA 검정법, 시냅스 식세포작용을 측정하기 위한 ELISA 또는 웨스턴 블롯 검정법 및 뉴런 사멸을 측정하기 위한 MTT 검정법을 포함하며, 상기 검정법들은 모두 하기 실험 섹션에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 본원에 기술된 방법을 사용하여 확인되거나, 또는 제조된 항-CD22 항체 및 항원 결합 단편 뿐만 아니라, 이의 치료 용도를 제공한다.
5.3 생산 방법
모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있다.
항체 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563, 681 (Elsevier, N.Y., 1981)] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편은 재조합되고, 즉, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 단리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 제조될 수 있거나, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리 항체는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리되거나 (예컨대, [Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl . Acid Res. 20:6287-95] 참조), 또는 항체는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 제조, 발현, 생산 또는 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되게 하고, 바람직하게, 숙주 세포가 배양된 배지 내로 분비되게 하고, 그 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook, Fritsch 및 Maniais (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoviates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397에 기술된 것과 같은 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터에 통합하고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다.
재조합 항체 또는 항원 단편, 예컨대, SM03, SM06 또는 SM03/SM06 관련 항체를 발현시키기 위해, 먼저 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 수득한다. 이들 DNA는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 뮤린 항체 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 대한 하이브리도마를 증폭 및 변형하거나, 또는 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 디자인된 경쇄 및 중쇄 가변 서열의 코딩된 아미노산 서열을 기반으로 하는 올리고합성에 의해 수득할 수 있다. 코딩 DNA 서열은 생성된 항체의 포유동물 발현을 촉진하도록 추가로 최적화될 수 있다.
일단 뮤린 항체에 대한 VH 및 VL 단편을 수득하고 나면, 상기 서열을 SM03의 프레임워크 패치 버전 (즉, SM06)을 코딩하도록 돌연변이화할 수 있고, 그 방법은 중국 특허 번호 01144894.6 및 031 23054.7 및 미국 특허 번호 7,321,026 B2 & 7,338,659 B2 (상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함)에 기술되었다.
일단 (예컨대, 상기 기술된 바와 같이, 원래의 뮤린 VH 및 VL 유전자의 증폭 및 돌연변이 유발에 의해) SM03 또는 SM06, 또는 SM03/SM06 관련 VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 수득하고 나면, 상기 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로, 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 상기 조작에서, VL 또는 VH 코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동적으로 연결된다. 이러한 맥락에서 사용되는 바, "작동적으로 연결된"이라는 용어는 두 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되도록 두 DNA 단편이 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH 코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예컨대, 문헌 [Kabat, E.A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, Ig4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH 코딩 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL 코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라, Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예컨대, 문헌 [Kabat, E.A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다.
scFv 유전자를 제조하기 위해, VH 및 VL 코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편, 예컨대, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결되어 VH 및 VL 서열이 VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 연속 단일 쇄 단백질로 발현될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al.(1990) Nature 348:552-554] 참조).
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 항체, 또는 항원 결합 단편을 발현시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이 수득된 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 연결되도록 한다. 이러한 맥락에서, "작동적으로 연결된"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터에 라이게이션된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립가능하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있으며, 더욱 일반적으로는 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적 제한 부위 라이게이션, 또는 제한 부위가 없는 경우 블런트 말단 라이게이션)을 통해 발현 벡터에 삽입된다. 일부 실시양태에서,SM03, SM06 또는 SM03/SM06 관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 보유한다. 예를 들어, SM03 또는 SM06 또는 SM03/SM06 관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키는 한 접근법은 이를 각각 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터에 삽입하고, 이로써, VH 세그먼트는 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동적으로 연결되고, VL 세그먼트는 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동적으로 연결되도록 하는 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에도, 본원에 제공된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유할 수 있다. "조절 서열"이라는 용어는 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라진다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대, 면역글로불린 중쇄(IgH) 인핸서 (문헌 [Gillies et al. (1983) Cell 33:717-728]), 메탈로티오네인 (MT), 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예컨대, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터의 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가 설명에 대해서는 예컨대, 미국 특허 번호 5,665,578; 5,168,062; 4,510,245; 및 4,968,615를 참조한다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에도, 본원에 제공된 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예컨대, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예컨대, 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예컨대, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 예컨대, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하는 dhfr- 숙주 세포에 사용하기 위한 것), 글루타메이트 신타제 (GS) 유전자 및 neo 유전자 (G418 선별)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예컨대, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 리포펙션, 원형질체 융합 등을 포함하는 것으로 의도된다. 항체 및 항원 결합 단편은 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 생산될 수 있지만, 진핵성 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 바람직한데, 그 이유는 상기 숙주 세포가 어셈블리하여 적절하게 폴딩되고, 면역학적으로 활성인 항체를 분비할 가능성이 원핵성 세포보다 더 높기 때문이다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 재조합 항체를 발현시키기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 SP2/0 골수종 세포, NSO 골수종 세포, COS 세포, 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (dfhr- CHO 세포 포함, 문헌 [Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4200]에 기술, DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용, 예컨대, 문헌 [R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp (1982) J. Mol . Biol . 159:601-621]에 기술)가 포함된다. 재조합 항체 코딩 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현, 또는 더욱 바람직하게, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
숙주 세포는 또한 무손상 항체의 일부, 예컨대, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본원에서는 상기 절차의 변형이 명백히 고려된다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 사용되는 항체의 경쇄 또는 중쇄 (그 둘 모두 아님)를 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 CD22에 결합하는 데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 그 둘 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 그 모두를 제거하는 데에도 사용될 수 있다. 상기 말단절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 또한 본원에 제공된 항체에 포함된다. 추가로, 표준 화학적 가교결합 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 가교결합시킴으로써 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄는 인간 CD22에 특이적으로 결합하는 항체이고, 나머지 다른 중쇄 및 경쇄는 CD22 이외의 다른 항원에 특이적인 이작용성 항체를 생산할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재조합 발현 시스템의 일부 실시양태에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 둘 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 전기천공에 의해 SP2/0 세포 내로 도입된다. 발현 시스템의 일부 실시양태에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄, 둘 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터는 예컨대, 리포펙션과 같은 표준 기술에 의해 CHO 세포 내로 도입된다.
재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 뮤린 또는 인간 면역글로불린 중쇄 (IgH), CMV 인핸서, 메탈로티오네인 또는 AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 연결되어 유전자의 높은 수준의 전사를 유도한다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 SP2/0 세포가 선별될 수 있도록 허용하는 DHFR 유전자를 보유한다. 대안적으로, 뮤린 또는 인간 IgH, CMV 인핸서/AdMLP/메탈로티오네인 프로모터 조절 요소에 작동적으로 연결된 항체 중쇄 및 경쇄 유전자 및 DHFR 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터는 dhfr-인 SP2/0 또는 CHO 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터로 형질감염된 SP2/0 또는 CHO 세포를 선별할 수 있고, 배양물 내 메토트렉세이트 수준을 증가시켜 벡터 내 유전자 발현 수준을 증폭시킬 수 있다. 선별된 형질전환체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하도록 배양되고, 무손상 항체는 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다.
5.4 제약 조성물
본원에서는 또한 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03, SM06)을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 유효량의, 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 Aβ-관련 질환 또는 장애 또는 신경염증-관련 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 AD 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예컨대, 인간 환자)에서 AD 진행을 억제시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예컨대, 인간 환자)에서 인지 장애를 호전시키는 데 유용하다.
본원에 개시된 제약 조성물에서 담체 물질과 함께 조합될 수 있는 치료 항체의 양은 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물 중에 존재하는 항체의 양은 치료 효과를 생성하는 양이다. 일반적으로, 100% 중 상기 양은 제약상 허용되는 담체와 함께 조합하여 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분 범위일 것이다.
본원에 제공된 제약 조성물은 예컨대, SM03, SM06, 또는 SM03/SM06 관련 항체와 같은 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 것을 포함한다. 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 다양한 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 본원에 제공된 가용성 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 1-1000 mg/ml로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 제공된 가용성 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 10-500 mg/ml, 10-400 mg/ml, 10-300 mg/ml, 10-200 mg/ml, 10-100 mg/ml, 20-100 mg/ml, 또는 50-100 mg/ml로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 약 10 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 300 mg/ml, 약 500 mg/ml, 약 800 mg/ml, 또는 약 1000 mg/ml로 포함한다. 투여량은 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있고; 예를 들어, 순도가 감소하면 투여량은 증가하여야 한다.
본원에 제공된 제약 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액상 액제 (예컨대, 주사용 및 주입용 액제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 모드 및 치료 적용에 따라 달라진다. 본원에 기술된 제약 조성물 또는 제제에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트를 포함한다.
적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴을 사용함으로써, 분산제인 경우, 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 주사용 또는 주입용 액제 형태이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 수성 제제이다. 상기 제제는 전형적으로 액제 또는 현탁제이지만 콜로이드, 분산제, 에멀젼 및 다중상 물질 또한 포함할 수 있다. "수성 제제"라는 용어는 적어도 50% w/w 물을 포함하는 제제로 정의된다. 마찬가지로, "수성 액제"라는 용어는 적어도 50% w/w 물을 포함하는 액제로 정의되고, "수성 현탁제"라는 용어는 적어도 50% w/w 물을 포함하는 현탁제로 정의된다. 조성물은 액제, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 냉동 건조되고, 의사 또는 환자는 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
본원에 제공된 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 생리학적으로 화합성인, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충처리된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상의 것 뿐만 아니라, 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 조성물 중 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 항체 또는 항원 결합 단편의 저장 수명 또는 유효성을 증진시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량으로 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 담체는 (예컨대, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분 (즉, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편)은 활성 성분을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 활성 성분을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다.
본원에서는 또한 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대, SM03, SM06, 또는 SM03/SM06 관련 항체를 갖는 제약 조성물 제조를 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 중에 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 대상체에게 투여하기 위한 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 키트는 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 및/또는 투여에 관한 지침서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물 또는 제제는 (a) 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편; (b) 완충화제; (c) 안정화제; (d) 염; (e) 벌크화제; 및/또는 (f) 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 5년 또는 그 초과의 기간 동안 안정적이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 보관되었을 때, 안정적이다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편이 장기간 보관될 수 있도록 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편의 안정성을 개선시키는 제약 조성물 또는 제제를 제공한다. 본원에 개시된 제약 조성물은 보존제, 장성제, 킬레이트화제, 안정제 및/또는 계면활성제 중 하나 이상의 것 뿐만 아니라, 이의 다양한 조합을 추가로 포함할 수 있다. 제약 조성물 중 보존제, 등장화제, 킬레이트화제, 안정제 및 계면활성제의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]를 참조할 수 있다.
본원에 개시된 제약 조성물 또는 제제에서 유용한 완충화제는 또 다른 산 또는 염기의 첨가 후 용액의 산도 (pH)를 선택된 값에 가깝게 유지시키는 데 사용되는 약산 또는 염기일 수 있다. 적합한 완충화제는 제제의 pH 조절을 유지함으로써 제약 제제의 안정성을 최대화시킬 수 있다. 적합한 완충화제는 또한 생리학적 적합성을 보장하거나, 또는 용해도를 최적화시킬 수 있다. 유변학, 점도 및 다른 특성도 제제의 pH에 따라 달라질 수 있다. 일반 완충화제로는 히스티딘, 시트레이트, 숙시네이트, 아세테이트 및 포스페이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 완충화제는 등장화제 및 잠재적으로 당업계에 공지된 산 또는 염기를 사용한 pH 조정과 함께 히스티딘 (예컨대, L-히스티딘)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘이다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 약 2 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 8로 유지된다.
안정화제는 의약품을 안정화하기 위해 의약품에 첨가된다. 상기 작용제는 상이한 방식으로 단백질을 안정화시킬 수 있다. 일반적인 안정화제로는 아미노산, 예컨대, 글리신, 알라닌, 리신, 아르기닌 또는 트레오닌, 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 라피노 또는 말토스, 폴리올, 예컨대, 글리세롤, 만닛톨, 소르비톨, 사이클로덱스트린 또는 임의 종류 및 분자량의 덱스트란, 또는 PEG를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 동결건조 제제에서 FIX 폴리펩티드의 안정성을 최대화하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 수크로스 및/또는 아르기닌이다.
벌크화제를 제약 조성물 또는 제제에 첨가하여 생성물에 부피 및 질량을 추가함으로써 이의 정확한 계량 및 취급을 용이하게 할 수 있다. 일반적인 벌크화제는 락토스, 수크로스, 글루코스, 만닛톨, 소르비톨, 탄산칼슘 또는 스테아르산마그네슘을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
계면활성제는 친액성 및 소액성 기를 갖는 양친매성 물질이다. 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비이온성일 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예에는 알킬 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 아민 에톡실레이트, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드, 지방 알콜 (예컨대, 세틸 알콜 또는 올레일 알콜), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트 또는 도데실 디메틸아민 옥시드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.
본원에 개시된 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 황산수소나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
상기 조성물은 또한 애주번트, 예컨대, 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 포함할 수 있다. 상기 멸균 절차에 의해, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함, 이 둘 모두에 의해 미생물의 존재를 확실하게 방지할 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이, 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사용 제약 형태가 장기간 동안 흡수될 수 있도록 할 수 있다.
제약 조성물 또는 제제는 전형적으로 제조 및 보관 조건하에서 멸균성이고, 안정하여야 한다. 제약상 허용되는 담체는 멸균 수성 액제 또는 분산제 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 멸균 주사용 액제는 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매중에 필요한 양으로 치료 항체 또는 항원 결합 단편을 혼합한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 제약 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 액제 제조를 위한 멸균 산제인 경우, 일부 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 액제로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 산제를 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조 (동결건조)이다.
본원에 개시된 제약 조성물은 임플란트, 경피용 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 예컨대, 방출 조절형 제제와 같이 활성 성분을 빠른 방출로부터 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제제를 제조하기 위한 다수의 방법은 특허를 받았거나, 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 생체내에서 확실하게 적절히 분포될 수 있도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, BBB는 고도로 친수성인 다수의 화합물을 제외시킨다. 본원에 기술된 치료 항체가 BBB를 통과하는 것을 촉진시키기 위해, 이는 예를 들어, 리포솜으로 제제화될 수 있다. 리포솜 제조 방법에 대해서는 예컨대, 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예컨대, 미국 특허 5,416,016 (로우(Low) 등) 참조), 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res. Commun. 153: 1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett . 357: 140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother . 39: 180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134]); pl20 (문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem . 269:9090])을 포함하고; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346: 123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
5.5 치료 방법
상기 섹션에서 기술된 바와 같이, 본원에서는 Aβ 또는 신경염증 관련 질병 또는 장애를 치료하는 데 있어서 항-CD22 항체 및 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)의 의학적 용도를 제공한다. 본원에 개시되거나, 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법을 사용하여 확인된 임의의 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 항체는 SM03이다. 일부 실시양태에서, 치료 항체는 SM06이다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 Aβ 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체에서 Aβ 플라크 제거를 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 Aβ-관련 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 신경염증 감소를 필요로 하는 대상체에서 신경염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 또한 신경염증과 연관된 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 방지한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 적어도 20%, 적어도 30, 적어도 40%, 적어도 50% 초과, 또는 적어도 60% 초과만큼 방지한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD22에 특이적으로 결합한다.
Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법, 신경염증을 감소시키는, Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 및/또는 본원에 개시된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도한다.
일부 실시양태에서, Aβ-관련 질환 또는 장애 및/또는 신경염증-관련 질환 또는 장애는 임상 또는 임상전 AD, 전구증상 AD, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애일 수 있다.
본 방법에 적합한 대상체로는 Aβ 플라크의 제거 및/또는 신경염증의 감소가 바람직한 인간 환자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료하고자 하는 대상체는 임상 또는 임상전 AD, 전구증상 AD, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애일 수 있는 Aβ-관련 또는 신경염증-관련 질환 또는 장애 진단을 받은 대상체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료하고자 하는 대상체는 임상 또는 임상전 AD, 전구증상 AD, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애일 수 있는 Aβ-관련 또는 신경염증-관련 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상체이다. 대상체는 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 AD 진단을 받은 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 AD가 발생할 위험이 있는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임상전 AD를 갖는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임상 AD를 갖는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 전구증상 AD를 갖는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법으로 치료하고자 하는 대상체는 AD에 대한 치료 요법을 받은 적이 있는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 치료받은 적이 없는 대상체이다.
본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06) 또는 제약 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 두개내 투여, 척수강내 투여, 뇌실내 투여, 복강내 투여, 척수 투여, 비내 투여, 흉강내 투여, 국소 투여, 또는 피내 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06) 또는 제약 조성물은 비경구적 투여를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "비경구적 투여"라는 어구는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관지, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외 및 간강내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 근육내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 피하 주사에 의해 투여된다.
혈액 뇌 장벽은 뇌 안팎으로의 물질 수송을 엄격하게 조절한다. 당업계에 공지된 바와 같이, AD 환자는 혈관 누출과 연관되어 있으며, 뇌로의 IgG 침투는 대략 0.2%에 도달할 수 있다. 따라서, 전신으로 전달된 치료 항체는 BBB를 통과하여 병변 부위에 도달할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 두개내 투여를 사용하여 국소적으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌실내 투여가 채택된다.
본원에 제공된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06) 또는 제약 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 예컨대, 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치와 같은, 무바늘 피하 주사 장치가 사용될 수 있다. 본원에 기술된 용도의 널리 공지된 임플란트 및 모듈의 예로는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식형 미세 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 유동 이식형 주입 장치를 개시하는 미국 특허 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획이 있는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 상기 특허들은 본원에서 참조로 포함된다. 이러한 많은 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 치료 항체는 또한 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐에 동봉되거나, 정제로 압착되거나, 대상체의 식단에 직접 포함될 수 있다. 경구적 치료 투여의 경우, 치료 항체를 부형제와 함께 혼합하여 섭취가능한 정제, 협측용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 치료 유효량의, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료 항체의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서, 특정 환자에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 양을 얻기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 본원에 기술된 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 배설 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전 병력을 비롯한 다양한 약동학적 인자, 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 투여량은 예컨대, 단일 용량당 약 0.1 내지 100 mg/kg (호스트 체중) 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)은 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 5 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 10 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 20 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 40 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 60 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 100 mg/kg으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)은 약 1 내지 5 mg/kg, 약 1 내지 10 mg/kg, 약 1 내지 20 mg/kg, 약 1 내지 50 mg/kg, 약 1 내지 100 mg/kg, 약 5 내지 10 mg/kg, 약 5 내지 20 mg/kg, 약 5 내지 50 mg/kg, 약 5 내지 100 mg/kg, 약 10 내지 50 mg/kg, 또는 약 10 내지 100 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1 내지 5 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1 내지 10 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 1 내지 50 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 약 10 내지 50 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 약 10 내지 100 mg/kg 범위 내의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 약 10-2000 mg의 용량으로 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용량은 약 10 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 또는 약 2000 mg이다. 일부 실시양태에서, 항체는 100 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 300 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 600mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 900 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1200 mg의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 약 10-50 mg, 10-100 mg, 10-200 mg, 100-300 mg, 100-500 mg, 300-600 mg, 300-900 mg, 300-1200 mg, 600-1200 mg, 600-1800 mg, 또는 1000-2000 mg 범위 내의 용량으로 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 100-500 mg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 300-600 mg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 300-900 mg 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 600-1200 mg 범위 내의 용량으로 투여된다.
치료 동안, 더 낮은 용량으로 시작하여 추후에 표적 용량까지 증가시키는 것이 일반적이다. 예시적인 목적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 약 100 mg의 용량으로 투여하고, 약 600 mg의 표적 용량까지 점진적으로 증가시키는 것을 포함한다.
대상체는 매일, 격일, 매주, 격주로, 매월 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케줄에 따라 상기 용량으로 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 장기간, 예를 들어, 적어도 6개월에 걸쳐 다중 투여량으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 매주 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 격주로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 매월 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)은 매주, 격주로 또는 매월 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)은 매주, 격주로 또는 매월 정맥내로 투여된다.
항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06)은 필요에 따라 적절하게 최대 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 또는 36개월까지 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 적어도 3개월 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 치료는 적어도 6개월 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 치료는 적어도 12개월 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 치료는 적어도 24개월 동안 지속된다.
예컨대, 투여 라운드, 투여량, 치료 빈도 및 치료 기간의 다양한 실시양태의 모든 순열 및 조합이 본원에서 명백히 고려되고, 본원에 개시된 치료 방법에 채택될 수 있다.
예시 목적으로, 본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, SM03 또는 SM06) 또는 본원에 개시된 방법에서 확인된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 본원에 개시된 방법에서 하기 치료 요법이 채택될 수 있다:
일부 실시양태에서, 치료 항체는 매 4주마다 및 적어도 21일 간격으로 약 10 mg/kg의 용량으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 하기 적정 스케줄을 포함한다: 주입 1-2: 1 mg/kg IV; 주입 3-4: 3 mg/kg IV; 주입 5-6: 6 mg/kg IV; 주입 7 이상: 10 mg/kg IV.
일부 실시양태에서, 치료 항체는 10, 20 또는 40 mg/kg의 단일 용량, 24주 동안 격주로 10 mg/kg의 제2 용량, 및 16개월 동안 매월 10 또는 20 mg/kg의 제3 용량으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료 항체는 최대 2년 동안 매주 약 250 mg, 또는 격주로 500 mg의 용량으로 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료는 약 120 mg의 월간 주사로 시작된다.
최적의 원하는 반응 (예컨대, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 투여량 요법은 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있고, 시간이 경과함에 따라 여러 분할된 용량을 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 감량 또는 증량할 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구용 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태란 치료하고자 하는 포유동물 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위로; 각 단위는 필요한 제약 담체와 연관하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 치료 항체를 포함하는 것을 지칭한다. 적절한 투여는 완화시키고자 하는 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라진다는 점에 유의하여야 한다. 임의의 특정 대상에 대해, 특정 투여량 요법은 개인의 필요 및 조성물을 투여하거나, 조성물 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하고, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이며, 청구된 조성물의 범주 또는 실시를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 추가로 이해하여야 한다.
Aβ-관련 질환 또는 장애 또는 신경염증 관련 질환 또는 장애의 치료에서, 때때로 질환 또는 장애는 본원에 제공된 방법으로 치료될 수 있지만, 임의의 임상적 개선이 이익을 구성한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 평균 약 50 센틸로이드 (CL), 약 60 CL, 약 70 CL, 약 80 CL, 약 90 CL, 약 95 CL, 또는 약 99 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 평균 약 50 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 평균 약 80 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 평균 약 90 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 평균 50 내지 100 CL, 60 내지 100 CL, 70 내지 100 CL, 80 내지 100 CL, 또는 90 내지 100 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 50 내지 100 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드를 90 내지 100 CL만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 혈관성 부종을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을 방지한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 AD의 발병을 예방하거나, 또는 AD의 진행을 지연시키거나, 또는 중단시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 AD의 증상을 호전시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 인지 장애를 호전시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 인지 장애의 발병을 지연시킨다.
FcγR을 가교결합시키는 치료 항체와 비교하여, 본원에 개시된 항-CD22 항체는 혈관 부작용이 없거나 감소되었다 (즉, ARIA-E, ARIA-H). 추가적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 혈관성 부종을 감소시킨다.
본원에 개시된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드느 원하는 결과에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 치료 항체는 임플란트, 경피용 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 예컨대, 방출 조절형 제제와 같이 치료 항체를 빠른 방출로부터 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제제를 제조하기 위한 다수의 방법은 특허를 받았거나, 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 치료 적용에서, 질환 진행이 감소되거나, 또는 종결될 때까지 및 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 보일 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다.
상이한 작용 기전을 갖는 제제를 사용하는 조합 요법은 상가 또는 시너지 효과를 가져올 수 있다. 조합 요법을 통해 단일요법에 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 각 제제를 사용할 수 있고, 이로써, 본원에 개시된 작용제의 독성 부작용을 감소시키고/거나, 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 약물 내성이 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물의 치료 지수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편 또는 제약 조성물의 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제약 조성물은 추가 요법과 함께 조합하여 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-Aβ 항체, 항-CD33 항체, 타우 응집 억제제, 타우 단백질 조정제, 콜린에스테라제 억제제, 아세틸콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, β-세크레타제 억제제, 또는 인슐린 감작제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 염증유발성 사이토카인의 방출을 억제하는 제2 항체, 또는 마이크로글리아 세포 식세포작용 활성을 증진시키는 작용제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-Aβ 항체이다. 항-Aβ 항체는 아두카누맙, 도나네맙, 간테네루맙, 레카네맙, 바피뉴주맙, 및 솔라네주맙으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아두카누맙이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 도나네맙이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 간테네루맙이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항-CD33 항체이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 AL003 (애브비(AbbVie)), 젬투주맙, 린투주맙, 오조가미신, 바다스툭시맙 탈리린, 및 BI836858로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 AL003이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 젬투주맙이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 린투주맙이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 타우 응집 억제제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 메틸렌 블루 유도체 LMTX (LMTM 또는 TRx0237로도 공지), 또는 커큐민이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 타우 단백질 조정제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 메만틴, 셀렌산나트륨, 알보시딥, 셀리시클립, 타이드글루십, 리튬, 살살레이트, 또는 MK-8719이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 콜린에스테라제 억제제 또는 아세틸콜린에스테라제 억제제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 도네페질, 리바스티그민, 또는 갈란타민이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 NMDA 길항제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 메만틴이다.
제2 치료제는 본원에 기술된 항-CD22 항체 또는 항원 결합 단편 또는 제약 조성물의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제 또는 별도의 제제를 사용하여 공동 투여하거나, 또는 어느 순서로든 그러나, 일반적으로는 모든 활성제가 이의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내에 연속 투여하는 것을 포함할 수 있다. 당업자는 치료받는 대상체의 필요에 기초하여 조합 요법에서 사용되는 추가 작용제의 시기 및 투여를 비롯한, 본원에 기술된 제약 조성물 및 추가 요법을 조합하여 투여하기 위한 적절한 요법을 쉽게 결정할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 논문, 공개문헌 및 특허는 공개문헌이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고, 기술하기 위해, 마치 각각의 개별 논문, 공개문헌 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시되고, 본원에서 참조로 포함되는 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다. 그러나, 본원에서 언급된 임의의 참고문헌, 논문, 공개문헌, 특허, 특허 공보 및 특허 출원에 대한 언급은 해당 내용이 유효한 선행 기술을 구성하거나, 또는 세계 어느 나라에서나 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나, 또는 어느 형태로든 제안하는 것으로 간주되지 않으며, 그러한 것으로 간주되지도 않아야 한다.
문맥상 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술된 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
5.6
실험부
5.6.1
실시예
1:
마이크로글리아
세포에서의 CD22 발현.
면역조직화학 절차, 면역세포화학 절차 및 데이터베이스 검색을 사용하여, CD22는 Ramos 세포, B 세포, 및 마이크로글리아 세포 (예컨대, HMC-3 세포, 및 BV-2 세포)를 비롯한 여러 유형의 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
일관되게, 하기 표에 제시된 바와 같이, 마이크로글리아 세포 (예컨대, HMC-3 세포, 및 BV-2 세포)를 비롯한 상기 세포주에의 다양한 항-CD22 항체의 결합 또한 검출되었다.
5.6.2
실시예
2:
시험관내에서의
CD22의 올리고머
Aβ1
-42에의 결합.
옥텟 96e SPR 시스템을 사용하여 시험관내에서의 CD22의 Aβ1-42에의 결합을 분석하였다. 스트렙타비딘 바이오센서에 50 ㎍/mL 비오티닐화된 올리고머 Aβ1-42를 로딩하고, 다양한 농도의 CD22와의 상호작용을 바이오센서로 검출하였다. 단계는 하기와 같다: 제1 단계, 스트렙타비딘에 50 ㎍/mL 비오티닐화된 올리고머 Aβ1-42를 4분 동안 로딩하였고, 제2 단계, 바이오센서를 동적 완충제 (PBS+ 0.02% 트윈20, 0.1% BSA)로 10초 동안 세척하였고; 제3 단계, 회합을 위해 2분 동안 바이오센서에 다양한 농도의 CD22 (페프로테크(Peprotech))의 세포외 도메인을 로딩하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, CD22는 약 2.79 nM의 KD로 올리고머 Aβ1-42에 결합하였다.
5.6.3
실시예
3: 올리고머
Aβ1
-42의 CD22 발현 세포에의 결합
1일째에 HEK293 세포를 6 웰 플레이트에 0.03125 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 시딩하였다. 2일째, HEK293 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 3000 (인비트로겐(Invitrogen))으로 형질감염시켜 2일 동안 전장 인간 CD22를 과다발현시켰다. 4일째, 형질감염된 세포를 성장 배지 중에서 1 ㎍/mL FITC-Aβ와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 트립신 처리하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, HEK293 세포에서의 인간 CD22의 과다발현은 HEK293 세포 표면에서의 FITC-Aβ의 결합을 증가시켰으며, 이는 세포 표면에서의 Aβ와 CD22 사이의 결합을 입증한다.
5.6.4
실시예
4: HMC-3 세포 상에서의 CD22의 올리고머
Aβ1
-42에의 결합
근접-라이게이션 검정법 (PLA)을 사용하여 HMC-3 세포 상에서의 CD22의 Aβ1-42에의 결합을 평가하였다. HMC-3 세포를 0.026 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 1% 젤라틴 코팅 커버슬립에 시딩하였다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 올리고머 Aβ로 처리하였다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 이어서, 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 5분간 고정시켰다. 세포를 항-CD22 항체 및 항-Aβ 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. PLA 검정법은 제조업체의 프로토콜 (듀오링크® 근접 결찰 검정법(Duolink® Proximity Ligation Assay), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 따라 수행하였다. 자이스(Zeiss) 710 정립 현미경으로 형광 이미지를 촬영하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, HMC-3 세포는 점선으로 둘러싸여 있다. 화살표로 표시된 양성 신호는 CD22와 Aβ 사이의 물리적 상호작용을 보여주었다.
5.6.5
실시예
5: 항-CD22 항체는 CD22의 내재화를 유도하였다.
HMC3 세포를 0.026 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 1% 젤라틴 코팅 커버슬립에 시딩하였다. 세포를 10 ㎍/mL SM03으로 처리하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 37℃에서 인큐베이션시켜 내재화를 유도하였다. 지정된 시점에서 배지를 제거하고, 세포를 4% PFA로 고정시켰다. 표면 CD22 발현은 마우스 항-인간 CD22 항체 (압캠(Abcam)) 및 알렉사플루오르488(AlexaFluor488)-접합된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, HMC-3 세포를 3분, 5분, 10분, 30분, 및 60분 동안 SM03으로 처리하였다. SM03은 처리 후 단 3분 만에 표면 CD22 발현을 20%만큼 감소시켰다.
5.6.6
실시예
6: 인간
마이크로글리아
세포에서의 항-CD22 항체의 내재화
HMC-3 세포를 0.026 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 1% 젤라틴 코팅 커버슬립에 시딩하고, FITC-SM03으로 30 min 동안 처리하였다. HMC3 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 공초점 이미지를 자이스 800 현미경으로 획득하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, FITC-SM03은 HMC3 세포에서 처리 후 30분 이내에 내재화되었다.
HMC-3 세포를 0.03 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 10 ㎍/mL로 명시된 항-CD22 항체와 함께 얼음 상에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 37℃에서 인큐베이션시켜 내재화를 유도하였다. 지정된 시점에서 배지를 제거하고, 세포를 4% PFA로 고정시켰다. 표면 항-CD22 항체, 즉, SM03, SM06, Emab 또는 M971을 각각 알렉사플루오르 488-접합된 항 인간 IgG 항체 (인비트로겐)를 사용하여 검출하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 상이한 항-CD22 항체는 HMC-3 세포에 의한 상이한 속도의 내재화를 보여주었다. SM03 및 SM06은 HMC-3 세포에 의한 최고 속도의 내재화를 유도하였다.
5.6.7
실시예
7: 항-CD22 항체에 의해 증진된 올리고머
Aβ의
내재화
HMC-3 세포를 0.06 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 6 웰 플레이트에 시딩하였다. HMC-3 세포를 성장 배지 중에서 1 ㎍/mL FITC-Aβ로 24시간 동안 전처리하였다. 이어서, 세포를 지정된 시간, 예컨대, 4시간, 8시간, 16시간, 및 24시간 동안 10 ㎍/mL SM03, SM06, Emab 및 M971 또는 IgG 이소타입 대조군으로 처리하였다. 세포를 트립신 처리하고, 실온에서 5분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 세포를 마우스 항-인간 CD22 항체 (압캠)로 염색하고, FITC-Aβ 내재화를 유세포 분석기로 분석하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, SM03, SM06 및 Emab (M971 제외)는 FITC-Aβ의 증진된 식세포작용을 보여주었다. SM03 및 SM06, 둘 모두 시험된 모든 항체 중에서 가장 높은 식세포작용 능력을 보여주었다.
5.6.8
실시예
8: 항-CD22 항체는
마이크로글리아
세포에서
NFκB
신호전달 경로를 억제시켰다.
HMC-3 세포를 0.05 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 24 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 NFκB 루시페라제 리포터 플라스미드로 형질감염시켰다 (인비트로겐, 리포펙타민 3000). 이어서, 형질감염된 세포를 LPS로 자극하고, 다양한 농도의 SM03 Fab 단편으로 공동 처리하였다. 처리 24시간 후에 루시페라제 판독치를 기록하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, SM03 Fab는 용량에 의존하는 방식으로 NFκB 신호전달을 감소시켰으며, 이는 SM03 처리로 마이크로글리아의 활성화가 감소되었다는 것을 입증한다.
5.6.9
실시예
9: 항-CD22 항체는
마이크로글리아
세포에서 IL-6 분비를
억제시켰다
.
HMC-3 세포를 0.125 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하였다. HMC-3 세포를 LPS로 자극하고, 상이한 농도의 SM03 Fab 단편으로 공동 처리하였다. 처리 24시간 후, 배지를 수집하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 IL-6 ELISA 키트 (R&D 시스템즈(R&D systems))로 시험하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, SM03 Fab는 IL-6 분비를 감소시켰고, 이를 통해 SM03 처리로 마이크로글리아의 활성화가 감소되었다는 것을 추가로 확인하였다.
5.6.10
실시예
10: 항-CD22 항체는 HMC-3 세포에서 2,6 시알산의
트랜스-
결합을
촉진시켰다
.
HMC3 세포를 0.026 x 106개의 세포/㎠의 밀도로 1% 젤라틴 코팅 커버슬립에 시딩하였다. 세포를 지정된 시간 동안 항-CD22 항체로 처리하였다. 배지를 제거하고, 세포를 실온에서 5분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 고정된 세포를 FITC-접합된 2,6-시알산 프로브 (글리코테크(GlycoTech))와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 레이카(Leica) DMI6000B 현미경으로 형광 이미지를 촬영되었다. 도 10에 제시된 바와 같이, SM03 및 SM06은 HMC-3 세포에서 2,6-시알산 프로브의 트랜스-결합을 촉진시켰다.
5.6.11
실시예
11: 항-CD22 항체는 시냅스 식세포작용 및 뉴런 사멸을
감소시킨다
SM03 및 SM06을 포함한 항-CD22 항체를 시냅스 식세포작용 및/또는 뉴런 사멸을 감소시키는 이의 활성을 시험하기 위해 그에 대해 기능성 검정법을 수행한다. 시냅스 식세포작용을 평가하기 위해, HMC-3 세포를 분화된 SH-SY5Y 신경 세포와 공동 배양한다. 분화된 SH-SY5Y에서 발생한 시냅스는 PSD-95 단백질의 발현으로 나타난다. HMC-3 마이크로글리아 세포에서의 PSD-95 발현은 마이크로글리아 세포에 의한 시냅스 식세포작용의 속도를 나타내는 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. SM03 및/또는 SM06으로 처리하면, HMC-3 세포에서 PSD-95 발현은 감소되고, 이는 이들 항-CD22 항체가 마이크로글리아 세포에 의한 시냅스 식세포작용을 억제시킬 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
뉴런 사멸을 측정하기 위해, 분화된 SH-SY5Y 세포를 지정된 항-CD22 항체의 존재 또는 부재하에 LPS 자극 후 HMC-3 세포의 배양 배지로 처리하였다. SH-SY5Y의 사멸은 MTT 검정법으로 측정한다. SM03 및/또는 SM06으로 처리하면, SH-SY5Y의 사멸은 감소된다.
6. 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2022년 7월 1일 작성되고, 크기가 56,981 바이트인 "022A003WO01.XML"이라는 명칭의 서열 목록을 참조로 포함한다.
Claims (34)
- 베타-아밀로이드 (Aβ) 플라크(plaque)의 제거를 필요로 하는 대상체(subject)에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화(internalization)를 유도하는 것인, Aβ 플라크의 제거를 필요로 하는 대상체에서 Aβ 플라크의 제거를 촉진시키는 방법.
- 신경염증(neuroinflammation)의 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증의 감소를 필요로 하는 대상체에서 신경염증을 감소시키는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 임상 또는 임상전 알츠하이머병, 전구증상(prodromal) 알츠하이머병, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증(amyloid angiopathy) (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매(multi-infarct dementia), 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증(pre-eclampsia), 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애를 갖는 것인 방법.
- Aβ-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, Aβ-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 Aβ-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 신경염증과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 신경염증과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경염증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, Aβ-관련 또는 신경염증-관련 질환 또는 장애가 임상 또는 임상전 알츠하이머병, 전구증상 알츠하이머병, 다운 증후군, 임상 또는 임상전 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 파킨슨병, 다경색 치매, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 녹내장, 전자간증, 인지 장애, 기억 상실, 또는 혈관 내 병원성 Aβ 펩티드에 의해 유발되는 혈관 장애인 것인 방법.
- 제6항에 있어서, Aβ-관련 질환 또는 장애가 알츠하이머병인 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 항원 결합 단편인 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 및 IgG4 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, 단일 도메인 항체 (sdAb), 및 중쇄 항체 (HCAb)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합부(antigen-binding)가 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 항원 결합부, 인간화 항체(humanized antibody) 또는 항원 결합부, 또는 인간 항체 또는 항원 결합부인 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 CD22의 CLLNFSCYGYPIQ (서열 번호: 11) 및 VFTRSELKFSPQWSHHGKIVTC (서열 번호: 12)에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL); 및 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 방법.
- [00102]항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 키메라 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 키메라 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH가 각각 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 키메라 항체 또는 항원 결합 단편이 SM03인 것인 방법.
- [00102]항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH가 각각 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이 SM06인 것인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 정맥내로, 근육내로, 피하로, 두개내로, 척수강내로, 뇌실내로, 복강내로, 비내로, 비경구적으로, 국소적으로, 또는 피내로 투여되는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 1-50 mg/kg (대상체의 체중) 범위 내의 치료 유효량으로 투여되는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 치료 유효량이 약 1, 약 2, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 또는 약 30 mg/kg (대상체의 체중)인 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 300 - 1,200 mg/용량(dose)의 치료 유효량으로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 격주로 또는 매월 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 다회 용량(multiple dose)으로 투여되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 적어도 3개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년의 기간에 걸쳐 다회 용량으로 투여되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 제2 치료제와 함께 조합하여 투여되는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 제2 치료제가 항-베타-아밀로이드 항체, 항-CD33 항체, 타우(Tau) 응집 억제제, 타우 단백질 조정제(modulator), 콜린에스테라제 억제제, 아세틸콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, β-세크레타제 억제제, 또는 인슐린 감작제(insulin sensitizer)인 것인 방법.
- [00259]항에 있어서, 제2 치료제가 아두카누맙, 도나네맙, 간테네루맙, 레카네맙, 바피뉴주맙, 및 솔라네주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 항-베타-아밀로이드 항체인 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 제2 치료제가 AL003, 젬투주맙, 린투주맙, 오조가미신, 바다스툭시맙 탈리린, 및 BI836858로 구성된 군으로부터 선택되는 항-CD33 항체인 것인 방법.
- 제1항 내지 [00261]항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 것인 방법.
- 마이크로글리아 세포(microglia cell)를 유효량의, CD22에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) CD22의 시스-트랜스 전환을 촉진시키고/거나, (b) CD22의 내재화를 유도하는 것인, 마이크로글리아 세포에 의한 Aβ의 내재화를 유도하는 방법.
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