ES2318195T3 - Metodos y composiciones para potenciar la formacion de fibrocitos. - Google Patents

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Abstract

Uso de una composición seleccionada del grupo que consiste en: CPHPC (ácido R-1-[6-[R-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxílico), el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa, una etanolamina, fosfoetanolamina, un anticuerpo anti-SAP o fragmento funcional del mismo, y combinaciones de los mismos en la preparación de un medicamento que puede hacerse funcionar para reducir el SAP o suprimir la actividad de SAP en un mamífero que tiene una herida que contiene SAP; para suprimir la capacidad del SAP para suprimir la diferenciación de monocitos en fibrocitos y para promover la cicatrización.

Description

Métodos y composiciones para potenciar la formación de fibrocitos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la capacidad de SAP para suprimir la diferenciación de monocitos en fibrocitos. Por consiguiente, incluye composiciones y métodos para aumentar tal diferenciación. Estas composiciones y estos métodos pueden ser útiles en una variedad de aplicaciones en las que es beneficioso un aumento de la formación de fibrocitos, tal como en la cicatrización de heridas.
Antecedentes Fibrocitos
La inflamación es la respuesta coordinada frente a infección o lesión tisular. Los acontecimientos iniciadores están mediados por la liberación local de factores quimiotácticos, la activación plaquetaria y las iniciaciones de las rutas del complemento y la coagulación. Estos acontecimientos estimulan el endotelio local, promoviendo la extravasación de neutrófilos y monocitos. La segunda fase de la inflamación está caracterizada por el flujo de entrada hacia el tejido de células del sistema inmunitario adaptativo, incluyendo linfocitos. La fase de resolución posterior, en la que tiene lugar la apoptosis de los leucocitos en exceso y la fagocitosis por los macrófagos tisulares, está caracterizada también por la reparación del daño tisular por células del estroma, tales como los fibroblastos.
Tanto la IL-4 como la IL-13 son activadores potentes de la respuesta fibrótica. Se sabe que la IL-4 potencia la cicatrización y reparación de heridas. La IL-13 tiene un alto grado de homología con la IL-4 y en muchos sistemas actúan de manera similar. Sin embargo, se han encontrado diferencias claves en la función de estas dos proteínas en diversas circunstancias. Por ejemplo, la IL-13 es más dominante para resistir la infección por nematodos intestinales y parásitos intracelulares, tales como Leishmania. La IL-13 desempeña también un papel mucho más significativo que la IL-4 en el asma. Por el contrario, la IL-4 es más dominante que la IL-13 para estimular la producción de células B de inmunoglobulina y en la diferenciación y supervivencia de células T.
Se había demostrado que el TGF\beta, que también se sabe que desempeña un papel en la cicatrización de heridas, facilita la diferenciación de fibrocitos en miofibroblastos, que están asociados además a la cicatrización de heridas.
Aunque se sabe que IL-4, IL-13, TGF\beta y otros factores diversos desempeñan un papel en la respuesta fibrótica, es controvertida la fuente de fibroblastos responsable de la reparación de lesiones de heridas o en otras respuestas fibróticas. La hipótesis convencional sugiere que los fibroblastos inactivos locales migran hacia la zona afectada, producen proteínas de la matriz extracelular y promueven la fibrosis o contracción de la herida. Una hipótesis alternativa es que los precursores de fibroblastos circulantes (denominados fibrocitos) presentes dentro de la sangre migran hacia los sitios de daño o fibrosis, en los que se diferencian y median en la reparación tisular y otras respuestas fibróticas.
Se sabe que los fibrocitos se diferencian a partir de una población de precursores de monocitos de sangre periférica CD14+. Los fibrocitos expresan marcadores tanto de células hematopoyéticas (CD45, CMH de clase II, CD34) y células del estroma (tipos I y III de colágeno y fibronectina). Los fibrocitos maduros entran rápidamente en los sitios de daño tisular en los que secretan citocinas inflamatorias. Una vez allí, los fibrocitos pueden funcionar como células presentadoras de antígenos (CPA), induciendo de ese modo inmunidad específica de antígeno. Los fibrocitos también pueden secretar proteínas de la matriz extracelular, citocinas y moléculas proangiogénicas, que pueden ayudar en la reparación de heridas.
Los fibrocitos están asociados también a una variedad de otros procesos y trastornos. Están asociados a la formación de lesiones fibróticas tras la infección por Schistosoma japonicum en ratones y están implicados también en la fibrosis asociada a enfermedades autoinmunitarias. Los fibrocitos se han implicado también en la fibrosis patógena asociada a daño por radiación, enfermedad de Lyme y fibrosis pulmonar. Los fibrocitos CD34+ se han asociado también a la reestructuración del estroma en la pancreatitis y a la fibrosis del estroma, mientras que la ausencia de tales fibrocitos está asociada a tumores pancreáticos y adenocarcinomas. Esta correlación puede estar relacionada con la capacidad de los fibrocitos para funcionar como CPA. Finalmente, se ha demostrado que los fibrocitos promueven la angiogénesis actuando en células endoteliales.
Amiloide sérico P
Dada la amplia gama de procesos y enfermedades en los que los fibrocitos desempeñan un papel, son de gran interés los mecanismos que regulan su diferenciación a partir de monocitos de sangre periférica. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la diferenciación de fibrocitos de sangre periférica a partir de monocitos se suprime mediante un factor en suero y plasma. El fraccionamiento de plasma humano identificó este factor como amiloide sérico P (SAP). El SAP, un miembro de la familia de proteínas de las pentraxinas que incluyen la proteína C reactiva (CRP), se secreta por el hígado y circula en la sangre como pentámeros estables. Aún no se ha esclarecido el papel exacto de SAP, aunque parece que desempeña un papel tanto en las fases de iniciación como de resolución de la respuesta inmunitaria. SAP se une a residuos de azúcar sobre la superficie de bacterias conduciendo a su opsonización y fagocitosis. SAP se une también al ADN libre y a la cromatina generada por las células apoptóticas en la resolución de una respuesta inmunitaria, evitando así una respuesta inflamatoria secundaria. Las moléculas unidas mediante SAP se eliminan de las zonas extracelulares debido a la capacidad de SAP para unirse a los tres receptores de Fc\gamma clásicos (Fc\gammaR), con una preferencia por Fc\gammaRI (CD64) y Fc\gammaRII (CD32). Tras la unión al receptor, es probable que SAP y cualquier molécula unida se fagociten por la célula.
Los Fc\gammaR son necesarios para la unión de IgG a una amplia variedad de células hematopoyéticas. Los monocitos de sangre periférica expresan tanto CD64 como CD32, mientras que los macrófagos tisulares expresan los tres Fc\gammaR clásicos. Una subpoblación de monocitos también expresa CD16.
El agrupamiento de Fc\gammaR sobre monocitos por IgG, o bien unida a patógenos o bien como parte de un complejo inmunitario, inicia una amplia variedad de acontecimientos bioquímicos. Los acontecimientos iniciales tras la agregación de receptor incluyen la activación de una serie de proteínas cinasa src. En los monocitos, éstas incluyen lyn, hck y fgr, que fosforilan residuos de tirosina en el motivo ITAM de la cadena \gamma del FcR asociada a Fc\gammaRI y Fc\gammaRIII, o el motivo ITAM con el dominio citoplasmático de Fc\gammaRII. Los ITAM fosforilados conducen a la unión de un segundo conjunto de cinasas src, incluyendo syk. Se ha demostrado que syk es vital para la fagocitosis de partículas recubiertas con IgG. Sin embargo, la amplia distribución de syk en células no hematopoyéticas y la evidencia de que syk está implicada tanto en la señalización de receptores acoplados a proteína G como de integrinas, indica que esta molécula tiene muchas funciones.
Tanto SAP como CRP aumentan la fagocitosis y se unen a receptores de Fc\gamma sobre una variedad de células. La CRP se une con una alta afinidad a Fc\gammaRII (CD32), con una afinidad menor a Fc\gammaRI (CD64), pero no se une a Fc\gammaRIII (CD16). El SAP se une a los tres receptores de Fc\gamma clásicos, con una preferencia por Fc\gammaRI y Fc\gammaRII, particularmente Fc\gammaRI. Aunque existen observaciones conflictivas sobre la unión de CRP a Fc\gammaR, se ha demostrado que tanto SAP como CRP se unen a receptores de Fc e inician acontecimientos de señalización intracelular que concuerdan con el ligamiento a Fc\gammaR.
En suero de sangre humana, los hombres tienen normalmente de manera aproximada 32 \mug/ml +/-7 \mug/ml de SAP, siendo normal un intervalo de 12-50 \mug/ml. Las mujeres tienen en general aproximadamente 24 \mug/ml +/- 8 \mug/ml de SAP en el suero sanguíneo, siendo normal un intervalo de 8-55 \mug/ml. En líquido cefalorraquídeo humano existe normalmente de manera aproximada SAP 12,8 ng/ml en los hombres y aproximadamente 8,5 ng/ml en mujeres. Combinando los datos de hombres y mujeres, el nivel normal de SAP en suero humano es de 26 \mug/ml +/- 8 \mug/ml siendo normal un intervalo de 12-55 \mug/ml. (Los niveles en suero anteriores se expresan como la media +/- la desviación estándar).
Se ha investigado SAP principalmente en relación a su papel en la amiloidosis. Recientemente, se desarrolló un fármaco, ácido R-1-[6-[R-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxílico (CPHPC) para reducir SAP y tratar de ese modo la amiloidosis. Sin embargo, parece que este fármaco se ha aplicado sistémicamente y no se ha usado para tratar la cicatrización de heridas ni que tenga otros efectos localizados o sistémicos.
Aspectos de la presente invención se refieren al uso de agarosa en la reducción de SAP. Anteriormente se ha usado agar-agar como vendaje para heridas. Sin embargo, no está claro si tales vendajes para heridas anteriores podían reducir SAP debido a que pueden no haber contenido restos químicos adecuados o pueden haberse usado de manera inapropiada. En cualquier caso, no parece que estos vendajes para heridas anteriores tengan incorporado ningún factor de cicatrización de heridas adicional. Además, parece que los vendajes se han usado solamente para heridas externas. Finalmente, no parece que estos vendajes incorporaran productos químicos de reducción de SAP purificados o niveles aumentados de los mismos.
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Sumario de la invención
La presente invención incluye el uso de composiciones en la preparación de un medicamento para la unión a SAP. Las composiciones que pueden hacerse funcionar para unirse a SAP pueden incluir CPHPC, el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa, fosfoetanolaminas y anticuerpos anti-SAP o fragmentos de los mismos. Tal unión puede producirse in vitro o in vivo.
La invención incluye también composiciones y métodos para la reducción de los niveles de SAP en una muestra. La muestra puede ubicarse in vitro o in vivo. La muestra in vivo puede incluir un organismo completo o una parte del mismo y la reducción puede ser sistémica o puede estar limitada a una zona particular, tal como un órgano o una herida. Las composiciones pueden incluir aquéllas suministradas directamente o producidas en la muestra, por ejemplo a través de la expresión de un transgén. Las composiciones que pueden hacerse funcionar para reducir SAP pueden incluir CPHPC, el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa, fosfoetanolamina y anticuerpos anti-SAP o fragmentos de los mismos. Los niveles de SAP en una muestra pueden reducirse también interfiriendo su producción inicial o aumentando la degradación.
La invención incluye también composiciones y métodos para la supresión de la actividad de SAP. La supresión puede ser en una muestra y puede producirse in vitro o in vivo.
Las composiciones incluyen también composiciones suministradas directamente a una muestra y aquéllas producidas en la muestra, tal como mediante la expresión de un transgén. Estas composiciones pueden actuar disminuyendo la formación de SAP, disminuyendo la capacidad de las proteínas de SAP para interaccionar con monocitos, disminuyendo la capacidad de las proteínas de SAP para interaccionar con cofactores o disminuir el nivel de tales cofactores, e interfiriendo la señalización inducida por SAP en monocitos, tal como una ruta provocada por la unión de SAP a un Fc\gammaR. Las composiciones que pueden hacerse funcionar para suprimir la actividad de SAP pueden incluir anticuerpos anti-SAP y fragmentos de los mismos, particularmente aquéllos que seleccionan como diana la región de unión a Fc.
La invención incluye métodos y composiciones para promover la cicatrización de heridas reduciendo o suprimiendo SAP en la región de una herida. Las composiciones pueden incluir también factores de cicatrización de heridas adicionales. En realizaciones específicas de la invención, las composiciones de cicatrización de heridas pueden incluir agarosa de alta EEO, fosfoetanolamina-agarosa o Ca^{2+} y combinaciones de los mismos. Pueden añadirse citocinas tales como IL-13, IL-4 y TGF\beta a estas composiciones.
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Breve descripción de los dibujos
Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada presentada en el presente documento.
La figura 1 ilustra los efectos del suero y el plasma sobre la rápida diferenciación de células similares a fibroblasto.
En la figura 1A se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a 2,5 x 10^{5} por ml en medio libre de suero durante 3 ó 6 días en presencia o ausencia de suero humano al 0,1% y entonces se examinaron mediante microscopía para detectar la aparición de células similares a fibroblastos. La barra es 100 \mum.
En la figura 1B se cultivaron PBMC a 2,5 x 10^{5} por ml en medio libre de suero durante 6 días en diluciones de plasma humano. Entonces se secaron las células con aire, se fijaron, se tiñeron y se enumeraron los fibrocitos por su morfología. Los resultados se expresan como la media \pm DE del número de fibrocitos por 2,5 x 10^{5} PBMC (n=5 experimentos). Los asteriscos indican valores que son diferencias estadísticamente significativas del valor 0 de SAP.
La figura 2 ilustra la expresión de moléculas de superficie sobre células similares a fibroblastos. Se cultivaron PBMC sobre portaobjetos de vidrio en medio libre de suero durante 6 días. Se secaron las células con aire y se analizaron mediante inmunohistoquímica. Se usan anticuerpos monoclonales tal como se indica, y se identifican mediante Ig de cabra anti-ratón conjugada con biotina seguido de extravidina-peroxidasa. Se contratiñeron las células con hematoxilina de Mayer para identificar los núcleos. La tinción positiva se identificaba mediante tinción marrón, los núcleos se contratiñen de azul. Se usó un inserto para CD83 para indicar la tinción positiva en una célula dendrítica.
La figura 3 ilustra la caracterización de la molécula presente en plasma que inhibe la diferenciación de fibrocitos. Se trató plasma citrado con BaCl_{2} y se recogió el material precipitado mediante centrifugación y se dializó frente a fosfato de sodio 10 mM que contenía EDTA 10 mM e inhibidores de proteasa. Entonces se fraccionó este material mediante cromatografía de intercambio iónico y heparina.
En la figura 3A se analizaron las fracciones mediante PAGE sobre un gel reductor al 4-20% y se tiñeron con azul de coomassie. M indica marcadores de peso molecular. El carril 1 contenía plasma, el carril 2 contenía sobrenadante de BaCl_{2}, el carril 3 contenía el lavado 1, el carril 4 contenía el lavado 2, el carril 5 contenía precipitado de BaCl_{2}, el carril 6 contenía precipitado de BaCl_{2}, el carril 7 contenía la fracción no retenida de heparina, el carril 8 contenía la fracción de heparina, el carril 9 contenía la fracción no retenida de High Q, el carril 10 contenía la fracción de High Q, el carril 11 contenía la fracción purificada de gel. Los carriles 1-5 estaban diluidos 1:500 en tampón fosfato de sodio, los carriles 6-11 estaban sin diluir.
Se analizaron las fracciones activas eluidas de la columna de intercambio iónico High Q y los cortes de gel mediante PAGE al 4-20% sobre un gel nativo en la figura 3B y un gel reductor en la figura 3C. NM indica marcadores de gel nativo, RM indica marcadores de gel reducido, en 3B los carriles 1-3 son muestras de gel control, el carril 4 contenía la fracción activa. En la figura 3D se evaluaron las fracciones mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando un anticuerpo de conejo anti-SAP. Los carriles 1-11 corresponden a los de la figura 3A.
La figura 4 muestra la inhibición de la formación de fibrocitos mediante SAP, pero no CRP u otras proteínas plasmáticas. Se cultivaron PBMC a 2,5 x 10^{5} por ml en medio libre de suero durante 6 días en presencia de SAP purificado comercialmente disponible (cuadrado en negro), CRP (cuadrado en blanco), proteína S (rombo en blanco) o C4b (círculo en blanco) y entonces se examinaron para detectar la presencia de células similares a fibroblastos. Entonces se secaron las células con aire, se fijaron, se tiñeron y se enumeraron los fibrocitos por su morfología. Los resultados son la media \pm DE de fibrocitos por 2,5 x 10^{5} PBMC (n=3 experimentos separados).
La figura 5 muestra el efecto de la reducción de SAP del plasma en un ensayo de diferenciación de fibrocitos.
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La figura 5A muestra el efecto sobre la diferenciación de fibrocitos de la reducción de SAP del plasma con perlas de agarosa BioGel. Se muestra el número de fibrocitos encontrados en un ensayo en el que se ha suministrado o bien plasma (cuadrado en blanco) o plasma reducido con BioGel (cuadrado en negro) a una variedad de diluciones.
La figura 5B muestra el número de fibrocitos formados en el ensayo realizado previamente sin plasma o con diluciones iguales de plasma, plasma reducido en SAP con BioGel, o plasma reducido con anticuerpos anti-SAP. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas.
La figura 6 muestra incisiones en la piel iniciales en tres ratas diferentes que van a tratarse con solución salina, solución salina con CaCl_{2}, o agarosa con solución salina y CaCl_{2}.
La figura 7 muestra la cicatrización de las incisiones en la piel mostradas en la figura 6. La figura 7A muestra la cicatrización de las incisiones en la piel en tres ratas diferentes tras un día de tratamiento o bien con solución salina, solución salina con CaCl_{2}, o bien agarosa con solución salina y CaCl_{2}. La figura 7B muestra una comparación de las incisiones en la piel iniciales en las tres ratas diferentes y la cicatrización tras un día de tratamiento o bien con solución salina, solución salina con CaCl_{2}, o bien agarosa con solución salina y CaCl_{2}.
La figura 8 muestra también la cicatrización de las incisiones en la piel en ratas. La figura 8A muestra la cicatrización de las incisiones en la piel en tres ratas diferentes tras dos días de tratamiento o bien con solución salina, solución salina con CaCl_{2}, o bien agarosa con solución salina y CaCl_{2}. La figura 8B muestra una comparación de las incisiones en la piel iniciales en tres ratas diferentes y la cicatrización tras uno y dos días de tratamiento o bien con solución salina, solución salina con CaCl_{2}, o bien agarosa con solución salina y CaCl_{2}.
La figura 9 muestra los efectos de diversas citocinas sobre la estimulación de la diferenciación de fibrocitos.
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Descripción detallada
Los fibrocitos son una población diferenciada de células similares a fibroblastos derivadas de monocitos de sangre periférica. El cultivo de monocitos de sangre periférica CD14+ en ausencia de suero o plasma conduce a la rápida diferenciación de fibrocitos. Este proceso se produce normalmente en el plazo de 48-72 horas y se suprime mediante la presencia de suero o plasma. Experimentos descritos adicionalmente en el presente documento han determinado que esta supresión se produce por SAP. Experimentos adicionales han determinado que, cuando se cultivan monocitos en medio libre de suero, se potencia la diferenciación en fibrocitos mediante la presencia de IL-4 o IL-13.
Unión de SAP
La presente invención incluye el uso de composiciones en la preparación de un medicamento para la unión a SAP. Las composiciones pueden incluir CPHPC, el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa, etanolaminas y anticuerpos anti-SAP o fragmentos de los mismos. Estas composiciones pueden incluir productos químicos purificados, o los productos químicos pueden estar unidos a un compuesto mucho más grande, tal como agarosa. La unión puede producirse in vitro o in vivo.
En una realización específica, SAP puede unirse mediante una composición que incluye aproximadamente agarosa de alta EEO al 1% p/v. La composición puede incluir también un catión, tal como Mg^{+} o Ca^{2+}. Por ejemplo, la agarosa puede incluir CaCl_{2} aproximadamente 5 mM.
La composición puede incluir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que selecciona como diana la parte de SAP funcional para inhibir la formación de fibrocitos a partir de monocitos. En un ejemplo, la parte funcional de SAP se selecciona de la región que no comparte homología de secuencia con CRP, que no tiene ningún efecto sobre la formación de fibrocitos. Por ejemplo, los aminoácidos 65-89 (KERVGEYSLYIGRHKVTPKVIEKFP - SEQ. ID. NO. 1) de SAP no son homólogos con respecto a CRP. Los aminoácidos 170-181 (ILSAYQGTPLPA - SEQ. ID. NO. 2) y 192-205 (IRGYVIIKPLV - SEQ. ID. NO. 3) tampoco son homólogos. Adicionalmente se conocen varias diferencias de aminoácidos individuales entre las dos proteínas y pueden dar como resultado diferencias funcionales.
Reducción de SAP
Otros aspectos de la invención se refieren a composiciones y métodos para la reducción de los niveles de SAP en una muestra. La muestra puede ubicarse in vitro o in vivo. Las muestras in vitro pueden incluir biorreactores, cultivos tisulares, biopsias y estructuras principales de modificación mediante ingeniería genética de tejidos. In vivo la muestra puede incluir un organismo completo o una parte del mismo tal como un órgano o un sitio de lesión. La reducción in vivo puede ser sistémica o puede estar limitada a una zona particular, tal como un órgano o una herida.
Las composiciones para la reducción de SAP pueden incluir aquéllas suministradas directamente a la muestra. Por ejemplo, pueden suministrarse todos los agentes de unión mencionados anteriormente directamente a la muestra. Pueden suministrarse en cualquier forma o formulación aunque se prefieren aquéllos que no interfieren sustancialmente con los resultados deseados para la muestra.
Las composiciones para la reducción de SAP pueden producirse también en la muestra, o en un organismo que contiene la muestra. Por ejemplo, puede introducirse en la muestra un transgén que codifica para un anticuerpo anti-SAP.
Finalmente, pueden reducirse también los niveles de SAP interfiriendo su producción inicial o aumentando su degradación. En una realización específica, se reducen los niveles de SAP in vivo administrando una composición que inhibe la producción de SAP. Debido a que SAP se produce principalmente en el hígado, la supresión in vivo de la producción de SAP debe conseguirse fácilmente, pero será sistémica. Las composiciones que interfieren la producción de SAP pueden actuar tras una ruta de señalización que modula la producción de SAP.
Supresión de actividad de SAP
La invención incluye también composiciones y métodos para la supresión de la actividad de SAP. La supresión puede ser en una muestra y puede producirse in vitro o in vivo. Las composiciones incluyen también composiciones suministradas directamente a una muestra y las producidas en la muestra. Muchas composiciones de este tipo son las composiciones de unión a SAP descritas anteriormente. En particular, las composiciones para la supresión de la actividad de SAP pueden incluir anticuerpos seleccionados tal como se describió anteriormente para unirse a regiones específicas de SAP no homólogas a CRP. Los anticuerpos pueden seleccionar como diana también la región de SAP que se une a Fc\gammaR.
Las composiciones que suprimen la actividad de SAP pueden actuar mediante una variedad de mecanismos incluyendo, pero sin limitarse a: disminuir la capacidad de las proteínas de SAP para interaccionar con monocitos, disminuir la capacidad de las proteínas de SAP para interaccionar con cofactores o disminuir el nivel de tales cofactores, e interferir la señalización inducida por SAP en monocitos, tal como una ruta provocada por la unión de SAP a un Fc\gammaR. Esta ruta se describe en detalle en Daeron, Marc, "Fc Receptor Biology", Annu. Rev. Immunology 15: 203-34 (1997). En una realización a modo de ejemplo, se selecciona una parte de la ruta que no se comparte con otras cascadas de señalización o solamente un número limitado de cascadas de señalización no críticas para la interferencia para minimizar los efectos secundarios.
Usos de la modulación de la formación de fibrocitos
La reducción o la supresión de SAP o el suministro de IL-4 o IL-13 en una muestra pueden usarse para aumentar la diferenciación de fibrocitos a partir de monocitos. Este efecto tiene muchos usos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, el aumento de la formación de fibrocitos in vitro puede ser útil en la modificación mediante ingeniería genética de tejidos. La producción de fibrocitos en zonas que requieren vascularización puede inducir angiogénesis. El aumento de la diferenciación de monocitos in vitro, para formar fibrocitos puede usarse también para la modificación mediante ingeniería genética de tejidos internos o para inducir angiogénesis en zonas que necesitan nueva vasculatura.
Adicionalmente, una diferenciación creciente de monocitos en fibrocitos in vivo puede promover la cicatrización de heridas o aplicaciones de cirugía estética. La cicatrización de heridas puede beneficiarse, entre otras cosas, de la capacidad de los fibrocitos para diferenciarse adicionalmente en otras células tales como miofibroblastos y de los efectos angiogénicos de los fibrocitos así como de su capacidad para funcionar como CPA, ayudando de ese modo a la prevención o el control de la infección.
Debido a la capacidad de los fibrocitos para funcionar como CPA, las zonas de infección crónica o las zonas que están infectadas pero que el sistema inmunitario no alcanza fácilmente, tales como cartílago, pueden beneficiarse también del aumento de la diferenciación de monocitos en fibrocitos.
Debido a que los tumores pancreáticos y adenocarcinomas muestran niveles inferiores de fibrocitos, la diferenciación creciente de monocitos en fibrocitos en estos tejidos puede ayudar a ralentizar la progresión tumoral o ayudar a la remisión.
En un ejemplo específico, la invención incluye métodos y composiciones para promover la cicatrización de heridas reduciendo o suprimiendo SAP en la región de una herida. Estas composiciones de cicatrización de heridas pueden incluir CPHPC, anticuerpos anti-SAP, 4,6-piruvato-acetilo de B-D-galactopiranosa, tal como se encuentra en agarosa de alta EEO, etanolaminas, tales como las encontradas en fosfoetanolamina-agarosa, o Ca^{2+} y combinaciones de los mismos. Pueden añadirse citocinas tales como IL-13, IL-4, FGF y TGF\beta a estas composiciones.
En muchos pacientes solamente será deseable la reducción o la inhibición o la interferencia de SAP localizadas con una ruta modulada por SAP. Muchas composiciones dentro del alcance de la presente invención pueden administrarse localmente a pacientes de este tipo. Por ejemplo, la administración de una composición puede ser tópica, tal como una pomada, crema, sólido, pulverización, vapor o vendaje para heridas. Tales formulaciones tópicas pueden incluir alcohol, agua, desinfectantes, otras sustancias volátiles o cualquier otro agente farmacéuticamente activo o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La administración local puede ser también mediante inyección localizada de una composición sola o en combinación con otro agente farmacéuticamente activo o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los pacientes para los que puede ser aconsejable la administración localizada de composiciones que aumentan la diferenciación de monocitos en fibrocitos incluyen, pero no se limitan a: pacientes con quemaduras de leves a moderadas; pacientes que han padecido laceraciones, incluyendo las ocasionadas durante procedimientos quirúrgicos; pacientes que padecen complicaciones diabéticas, tales como úlceras; pacientes con úlceras de decúbito o zonas de baja circulación de manera interna; pacientes con abrasiones, contusiones menores o heridas punzantes; pacientes con heridas de bala o de metralla; pacientes con fracturas abiertas; pacientes que necesitan crecimiento de tejido para la modificación mediante ingeniería genética de tejidos o motivos estéticos; y pacientes inmunosuprimidos, hemofílicos u otros pacientes que es probable que se beneficien de una cicatrización más rápida de la mayoría de las
heridas.
Para pacientes con heridas numerosas o graves u otros trastornos, puede ser apropiada una administración más general de una composición para promover la formación de fibrocitos a través de inyección i.v. u otra sistémica. Los pacientes para los que la administración sistémica de un agente de inhibición o reducción de SAP puede ser de ayuda incluyen, pero no se limitan a: pacientes con quemaduras graves; pacientes con enfermedad oclusiva arterial periférica en estadio posterior; y pacientes con trastornos de cicatrización de heridas generales.
Algunas formulaciones pueden ser apropiadas para la administración local o sistémica. Adicionalmente, SAP puede suministrarse en una forma sólida, tal como un polvo, luego reconstituirse para producir la formulación administrada en última instancia a un paciente.
En una realización a modo de ejemplo para el tratamiento de cicatrización de heridas, pueden administrarse agarosa de alta EEO o fosfoetanolamina-agarosa como vendaje para heridas. En esta realización, la agarosa puede estar a una concentración de aproximadamente el 1% (p/v) y pueden contener también CaCl_{2} aproximadamente 5 mM. El vendaje para heridas puede aplicarse durante cualquier periodo de tiempo. Aunque puede aplicarse continuamente hasta que la herida se ha cerrado (aproximadamente dos días o más), también puede aplicarse solamente durante un periodo inicial corto, tal como 12 horas. Esta eliminación inicial de SAP de la herida puede ser suficiente para inducir un aumento de la diferenciación de monocitos en fibrocitos y mejorar la cicatrización de heridas.
En otra realización a modo de ejemplo, CPHPC puede administrarse sistémicamente para promover la cicatrización de heridas resistentes o extendidas. CPHPC se ha administrado anteriormente en un intervalo de 1,5 a 15 mg/kg/día mediante bombas osmóticas en ratones en experimentos de amiloidosis. CPHPC se ha administrado también en concentraciones acuosas de 1 mg/ml en agua de beber para los ratones. Un ratón de 20 g bebe aproximadamente 3 ml de agua al día, dando como resultado una ingestión de aproximadamente 0,15 mg de CPHPC/kg/día. Por tanto, tales intervalos son probablemente seguros en seres humanos para reducir los niveles de SAP, aunque diferentes intervalos pueden proporcionar un beneficio óptimo para la cicatrización de heridas.
Ensayos de diferenciación de monocitos
En medio libre de suero, los monocitos normales forman fibrocitos en de dos a tres días. El suero, la sangre u otros líquidos biológicos normales suprimen la formación de fibrocitos a partir de monocitos normales a lo largo de un intervalo de dilución específico. Por tanto, puede usarse un ensayo para someter a prueba si una muestra puede modular la diferenciación de monocitos en fibrocitos en medio libre de suero. Puede usarse también para determinar si los monocitos de la muestra se diferencian normalmente en fibrocitos en medio libre de suero y si responden normalmente al suero, SAP u otros factores que afectan a esta diferenciación.
El ensayo puede usarse para determinar si el líquido biológico de un paciente tiene un aumento o una disminución de la capacidad para suprimir la diferenciación de monocitos en fibrocitos. Si va a someterse a prueba la supresión mediante SAP, en la presente invención puede usarse cualquier líquido biológico en el que SAP está presente normalmente o de manera transitoria, incluyendo sangre completa, suero, plasma, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo y líquido bronquial. Un aumento de la capacidad para suprimir la diferenciación de monocitos puede ser indicativo de un trastorno de cicatrización de heridas u otros trastornos, o la propensión a desarrollar un trastorno de este tipo. Aunque en muchos pacientes un aumento de la capacidad de un líquido biológico para suprimir la formación de fibrocitos puede deberse a bajos niveles de SAP, éste no es necesariamente el caso. SAP puede estar presente a niveles normales, pero mostrar una disminución de la actividad de supresión debida a los defectos en el propio SAP o la ausencia o presencia de un cofactor u otra molécula. Métodos de determinación de la naturaleza más precisa del problema de supresión, tal como el uso de ELISA, electroforesis y fraccionamiento, serán evidentes para un experto en la técnica.
La metodología descrita anteriormente puede usarse también para determinar si ciertos posibles fármacos que afectan a la diferenciación de fibrocitos pueden o no ser apropiados para un paciente.
El ensayo puede usarse para determinar si los monocitos de un paciente pueden diferenciarse en fibrocitos en medio libre de suero y si responden normalmente a un líquido biológico, SAP u otra composición. Más particularmente, si un paciente con problemas de cicatrización de heridas parece tener niveles normales de SAP, puede ser aconsejable obtener una muestra de los monocitos del paciente para determinar si pueden diferenciarse en ausencia de suero o SAP.
Finalmente, en otro ejemplo específico, el ensayo puede usarse para someter a prueba los efectos de un fármaco u otra composición sobre la diferenciación de monocitos en fibrocitos. El ensayo puede usarse de esta manera para identificar posibles fármacos diseñados para modular la formación de fibrocitos, o puede usarse para detectar cualquier posible efecto adverso de fármacos destinados para otros usos.
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Ejemplos Ejemplo 1 Inhibición de la formación de fibrocitos
Mientras se examinaba el posible papel de la densidad celular en la supervivencia de células T de sangre periférica, se observó que en medio libre de suero las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) daban lugar a una población de células similares a fibroblastos. Estas células eran adherentes y tenían una morfología con forma de huso (figura 1A). Aproximadamente el 0,5-1% de PBMC se diferenciaban en células similares a fibroblastos en medio libre de suero, y esto se producía en portaobjetos de vidrio convencionales y de borosilicato y de plástico tratados con cultivo tisular.
Se inhibió la rápida aparición de estas células, en el plazo de 3 días de cultivo, mediante plasma o suero humano. Para examinar este proceso en más detalle, se cultivaron PBMC a 5 x 10^{5} células por ml en medio libre de suero que contenía concentraciones crecientes de plasma humano durante 6 días. Cuando el plasma estaba presente a concentraciones de entre el 10% y el 0,5%, las células similares a fibroblastos no se diferenciaban (figura 1B). Sin embargo, a o por debajo del 0,1% de suero, se desarrollaban rápidamente células similares a fibroblastos. Se conservó la actividad en el suero que inhibía la formación de fibrocitos mediante un filtro rotatorio de punto de corte de 30 kDa (datos no mostrados). Si se calentaba el suero hasta 56ºC durante 30 minutos, se reducía la eficacia 10 veces, y el calentamiento hasta 95ºC suprimía la actividad inhibidora (datos no mostrados).
Estos datos sugieren que el factor inhibidor es una proteína. Ya que el factor inhibidor estaba presente en el suero humano, indicaba que era improbable que la actividad estuviera implicada con el sistema de coagulación. El factor inhibidor también parecía ser una proteína conservada en la evolución tal como bovina, equina, caprina, y sueros de rata podían inhibir también la aparición de estas células similares a fibroblastos (datos no mostrados).
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Ejemplo 2 Caracterización de células similares a fibroblastos
La diferenciación de estas células similares a fibroblastos a partir de sangre periférica sugería que podían ser fibrocitos de sangre periférica. Los fibrocitos son una población derivada de monocitos de sangre periférica que se diferencian in vitro e in vivo en células similares a fibroblastos. Éstos entran rápidamente en los sitios de herida y pueden presentar antígeno a células T. Su fenotipo está compuesto tanto por marcadores hematopoyéticos tales como CD45 y CMH de clase II como marcadores del estroma, tales como colágeno I y fibronectina. Sin embargo con el fin de identificar estas células, se cultivaron generalmente PBMC durante 1-2 semanas en medio que contenía suero.
Para caracterizar si las células observadas en el sistema eran fibrocitos, se redujeron las PBMC de células T con anticuerpo anti-CD3, células B con anticuerpo anti-CD19, monocitos con anticuerpo anti-CD14 o todas las células presentadoras de antígenos con anticuerpo anti-HLA de clase II y entonces se cultivaron en condiciones libres de suero durante 6 días. La reducción de PBMC con anticuerpo anti-CD3 o anticuerpo anti-CD19 no reducía las células similares a fibroblastos a partir de PBMC cuando se cultivaban en cultivos libres de suero (datos no mostrados). La reducción de células presentadoras de antígenos con anticuerpo anti-HLA de clase II o monocitos con anticuerpo anti-CD14 no evitó la aparición de células similares a fibroblastos, lo que indica que las células similares a fibroblastos se derivan de monocitos y no una población de células dendríticas.
Para caracterizar adicionalmente las células similares a fibroblastos, se cultivaron PBMC en medio libre de suero durante 5 días sobre portaobjetos de vidrio. Entonces se secaron las células con aire, se fijaron en acetona y se marcaron con una variedad de anticuerpos (tabla 1 y figura 2). Los fibrocitos expresan CD11a, CD11b, CD45, CD80, CD86, CMH de clase II, colágeno I, fibronectina, los receptores de quimiocinas CCR3, CCR5, CCR7, CXCR4 y actina \alpha de músculo liso. En las condiciones de cultivo anteriores, las células similares a fibroblastos en el presente experimento expresaban también todos estos marcadores. Los fibrocitos son negativos para CD1a, CD3, CD19, CD38 y vWF, tal como lo eran las células similares a fibroblastos en el presente experimento. Basándose en estos datos parece que las células similares a fibroblastos observadas en los experimentos eran fibrocitos. Se realizaron experimentos adicionales para extender este fenotipo. En las condiciones anteriores, los fibrocitos expresaban varias integrinas \beta1 incluyendo \alpha1 (CD49a), \alpha2 (CD49b), \alpha5 (CD49e), \beta1 (CD29) y \beta3 (CD61) junto con altos niveles de \beta2 (CD18), pero eran negativos para \alpha3, \alpha4, \alpha6 \alpha4\beta7, \alphaE y CLA (figura 2 y tabla 1).
TABLA 1 Expresión de marcadores de superficie sobre fibrocitos
1
2
3
Para obtener los datos de la tabla 1, se cultivaron PBMC en los pocillos de portaobjetos de vidrio de 8 pocillos a 2,5 x 10^{5} células por ml (400 \mul por pocillo) en medio libre de suero durante 6 días. Entonces se secaron las células con aire, se fijaron en acetona y se tiñeron mediante inmunoperoxidasa. Se puntuaron las células como positivas o negativas para los antígenos indicados, en comparación con anticuerpos control de isotipo coincidente.
Ejemplo 3 Caracterización del factor inhibidor de fibrocitos
La caracterización inicial del factor sérico que evita la rápida diferenciación de fibrocitos indicó que el factor era una molécula de unión a heparina que se eluía de una molécula de intercambio iónico (High Q) como una de cuatro proteínas. Secuenciando fragmentos trípticos de proteína en un corte de banda de un gel nativo, se identificó una de estas proteínas como la proteína de unión a C4b (C4BP). La proteína de unión a C4b es una proteína de 570 kDa, compuesta por siete cadenas alfa (70 kDa) y habitualmente una sola cadena beta (40 kDa), que está implicada en la regulación de la degradación de los componentes de C4b y C2a del sistema del complemento. C4BP interacciona también con la proteína S anticoagulante dependiente de la vitamina K. El complejo C4BP/proteína S puede purificarse a partir de suero o plasma usando precipitación con BaCl_{2}.
Para evaluar si C4BP, o una proteína asociada, era el factor responsable de la inhibición de la diferenciación de fibrocitos, se trató plasma citrado con BaCl_{2}. El factor inhibidor estaba presente en el precipitado de BaCl_{2} (figura 3 y tabla 2). Se aplicó esta fracción a una columna de heparina y se evaluaron las fracciones, eluidas mediante concentraciones crecientes de NaCl, para determinar su capacidad para inhibir la diferenciación de monocitos en fibrocitos en medio libre de suero. El factor activo se eluyó de la columna de heparina en un pico a NaCl 200 mM (figura 3 y tabla 2). Un ligero aumento en el rendimiento sugería que esta etapa puede haber eliminado un factor que interfería ligeramente con la actividad del factor.
Se combinaron las fracciones del pico de 200 mM y se fraccionaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico de High Q. Un pequeño pico que se eluía a NaCl 300 mM contenía actividad que inhibía la diferenciación de fibrocitos. El análisis de las proteínas presentes en esta fracción indicaba que la banda principal era una proteína de 27 kDa. Aunque la cromatografía de intercambio iónico condujo a una reducción de la cantidad de SAP recuperado (figura 3A, carriles 8-10 y figura 3D, carriles 8-10) esta etapa eliminó varias proteínas contaminantes. Tras la etapa de intercambio iónico el único contaminante apreciable era albúmina a 65 kDa (figura 3A, carril 10).
Se concentró la fracción de High Q y se fraccionó mediante electroforesis sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante, seguido de elución del material en cortes de gel. Una sola banda que migraba a aproximadamente 140 kDa podía inhibir la diferenciación (figura 3B). Esta banda tenía un peso molecular de 27 kDa sobre un gel reductor de poliacrilamida, lo que sugería que la conformación nativa de la proteína era un pentámero (figura 3C). Se cortó esta banda del gel, se digirió con tripsina y se analizó mediante espectrometría de masas MALDI. Se identificaron tres péptidos principales y dos minoritarios: VFVFPR, VGEYSLYIGR, AYSLFSYNTQGR, QGYFVEAQPK e IVLGQEQDSYGGK. Estas secuencias coincidían exactamente con las secuencias de aminoácidos 8-13, 68-77, 46-57, 121-130 y 131-143 del amiloide sérico P.
Para confirmar que las fracciones activas contenían SAP, se analizaron las fracciones recogidas de la cromatografía en columna mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 3D). Se detectó la presencia de SAP a 27 kDa en todas las fracciones que inhibían la diferenciación de fibrocitos (figura 3D, carriles 6, 8, 10 y 11). Estaba presente una cantidad considerable de SAP en el sobrenadante de la etapa de precipitación con BaCl_{2}, lo que indicaba que este procedimiento no era eficaz, con la recuperación de sólo aproximadamente el 10-15% de la actividad inhibidora de fibrocitos en el sedimento de BaCl_{2} (figura 3A, carril 2). Con el fin de eliminar el problema conocido de que los anticuerpos anti-SAP se unen a inmunoglobulinas cuando se usan con inmunotransferencia de tipo Western, se preincubó el anticuerpo con IgG humana unida a agarosa. También se analizaron las fracciones para detectar la presencia de CRP, C4BP y proteína S. La inmunotransferencia de tipo Western indicó que C4BP y la proteína S estaban presentes en el plasma, y en la precipitación con bario, pero estaban ausentes en las fracciones activas recogidas de la cromatografía de heparina (datos no mostrados).
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TABLA 2 Recuperación de la actividad inhibidora de fibrocitos y de proteína de plasma humano fraccionado
4 
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Se fraccionó el plasma mediante precipitación con BaCl_{2}, cromatografía de intercambio iónico y de heparina. Se evaluaron las concentraciones de proteína mediante espectrofotometría a 280 nm. Se evaluó la inhibición de diferenciación de fibrocitos mediante la morfología. Se definió la actividad inhibidora de fibrocitos de una muestra como el recíproco de la dilución a la que inhibía la diferenciación de fibrocitos en el 50%, cuando se añadía a medio libre de suero.
SAP puede detectarse también mediante ELISA usando la siguiente metodología:
Se recubrieron placas de 96 pocillos Maxisorb (Nalge Nunc International, Rochester, NY) durante la noche a 4ºC con anticuerpo anti-SAP monoclonal (SAP-5, Sigma) en tampón carbonato de sodio 50 mM pH 9,5. Entonces se incubaron las placas en solución salina tamponada con Tris pH 7,4 (TBS) que contenía BSA al 4% (TBS-BSA al 4%) para inhibir la unión no específica. Se diluyeron suero y proteínas purificadas hasta 1/1000 en TBS-BSA al 4%, para evitar que SAP se agregara y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC. Entonces se lavaron las placas en TBS que contenía Tween-20 al 0,05%. Se usó anticuerpo anti-SAP policlonal de conejo (BioGenesis) diluido 1/5000 en TBS-BSA al 4% como el anticuerpo de detección. Tras lavar, se añadió durante 60 minutos (Fab)2 de cabra anti-conejo biotinilado 100 pg/ml (Southern Biotechnology Inc.) diluido en TBS-BSA al 4%. Se detectaron los anticuerpos biotinilados mediante extravidina-peroxidasa (Sigma). Se incubó el sustrato de peroxidasa sin diluir 3,3,5,5-tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de detener la reacción mediante HCl 1 N y se leyó a 450 nm (BioTek Instruments, Winooska, VT). El ensayo era sensible hasta 200 pg/ml.
Ejemplo 4 Especificidad del amiloide sérico P
El amiloide sérico P es una proteína plasmática constitutiva y está estrechamente relacionada con CRP, la principal proteína de fase aguda en seres humanos. Para evaluar si otras proteínas plasmáticas podrían inhibir también la diferenciación de fibrocitos, se cultivaron PBMC en medio libre de suero en presencia de SAP, CRP, C4b o proteína S purificados comercialmente disponibles. Se purificó el SAP comercialmente disponible usando cromatografía de afinidad dependiente de calcio sobre agarosa no sustituida. De las proteínas sometidas a prueba, solamente SAP podía inhibir la diferenciación de fibrocitos, con actividad inhibidora máxima a 1 \mug/ml (figura 4). Una curva de dilución indicaba que el SAP comercialmente disponible tiene aproximadamente 6,6 x 10^{3} unidades/mg de actividad (figura 4). El suero y el plasma contienen SAP entre 30-50 \mug/ml. Los fibrocitos comenzaron a aparecer a una dilución del plasma del 0,5%, que sería aproximadamente SAP 0,15-0,25 \mug/ml, que es comparable con la concentración umbral de SAP purificado. Los datos que muestran que SAP purificado usando dos procedimientos diferentes inhibe la diferenciación de fibrocitos sugieren fuertemente que SAP inhibe la diferenciación de fibrocitos.
Aunque estos datos indican que SAP puede inhibir el desarrollo de fibrocitos y SAP se purifica de una manera que indica que es el factor activo en plasma, no se determinó si la reducción de SAP del plasma y el suero invalidaría la inhibición. Se redujo SAP del plasma usando perlas de agarosa (BioGel A, BioRad). Se diluyó el plasma hasta el 20% en tampón Tris 100 mM pH 8, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM y se mezcló con 1 ml perlas de agarosa durante 2 horas a 4ºC. Entonces se separaron las perlas mediante centrifugación y se repitió el proceso. Entonces se evaluó este plasma reducido para determinar su capacidad para inhibir la diferenciación de fibrocitos. El plasma control diluido hasta el 20% en tampón Tris 100 mM pH 8, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM tenía una curva de dilución similar a la observada con plasma sin tratar. Por el contrario, el plasma tratado con perlas podía inhibir menos la diferenciación de fibrocitos a niveles intermedios de plasma. Estos datos, junto con la capacidad del SAP purificado para inhibir la diferenciación de fibrocitos, sugieren fuertemente que SAP es el factor activo en suero y plasma que inhibe la diferenciación de fibrocitos. (Véase la figura 5A).
También se redujo SAP del plasma usando perlas de proteína G recubiertas con anticuerpos anti-SAP. La eliminación de SAP conducía a una reducción significativa de la capacidad del plasma para inhibir la diferenciación de fibrocitos en comparación con plasma, o plasma tratado con perlas recubiertas con anticuerpos control (p<0,05) (figura 5B). Las perlas recubiertas con anticuerpos control eliminaron parte de la actividad inhibidora de fibrocitos del plasma, pero esto no era significativamente diferente de las células cultivadas con plasma. Esto refleja probablemente la unión de SAP a la agarosa en las perlas de proteína G. Estos datos, junto con la capacidad del SAP purificado para inhibir la diferenciación de fibrocitos, sugieren fuertemente que SAP es el factor activo en suero y plasma que inhibe la diferenciación de fibrocitos.
Ejemplo 5 Anticuerpos y proteínas
CRP, amiloide sérico P, proteína S y C4b humanos purificados se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). Los anticuerpos monoclonales frente a CD1a, CD3, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD34, CD40, Pan CD45, CD64, CD83, CD90, HLA-DR/DP/DQ, IgM de ratón, IgG1 de ratón e IgG2a de ratón procedían de BD Pharmingen (BD Biosciences, San Diego, CA). Los anticuerpos frente a receptor de quimiocinas se adquirieron de R and D Systems (Minneapolis, MN). El anticuerpo de conejo anti-colágeno I procedía de Chemicon International (Temecula, CA), el anticuerpo monoclonal anti-proteína de unión a C4b procedía de Green Mountain Antibodies (Burlington, VE), el anticuerpo de cabra anti-proteína de unión a C4b humana procedía de The Binding Site (Birmingham, RU), el anticuerpo monoclonal anti-CRP procedía de Sigma (St. Louis, MO). El anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína S procedía de Biogenesis (Poole, Dorset, RU).
Ejemplo 6 Separación celular
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de capas leucocíticas (Gulf Coast Regional Blood Center, Houston, Texas) mediante centrifugación con Ficoll-Paque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) durante 40 minutos a 400 x g. Se realizó la reducción de subconjuntos de leucocitos específicos usando selección negativa usando perlas magnéticas Dynabeads (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY), tal como se describió anteriormente. En resumen, se incubaron PBMC con anticuerpos primarios durante 30 minutos a 4ºC. Entonces se lavaron las células y se incubaron con perlas Dynabeads recubiertas con IgG de cabra anti-ratón durante 30 minutos, antes de la eliminación de las células recubiertas con anticuerpo mediante selección magnética. Este proceso se repitió dos veces. Las células seleccionadas de manera negativa tenían una pureza normalmente de más del 98% tal como se determina mediante marcaje con anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 7 Ensayo de cultivo celular y diferenciación de fibrocitos
Se incubaron las células en medio libre de suero: RPMI (GibcoBRL Life, Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) complementado con HEPES 10 mM (GibcoBRL/Life), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina
100 \mug/ml, albúmina sérica bovina al 0,2% (BSA, Sigma), insulina 5 \mug/ml (Sigma), transferrina saturada de hierro 5 \mug/ml (Sigma) y selenito de sodio 5 ng/ml (Sigma). Se añadieron suero humano normal (Sigma), plasma humano normal (Gulf Coast Regional Blood Center) o suero de ternero fetal (Sigma), fracciones de la columna, sueros y líquido sinovial de los pacientes o proteínas purificadas a las concentraciones indicadas. Las muestras de los pacientes se obtuvieron de un depósito disponible para los investigadores en la University of Texas Medical School (Escuela de Medicina de la Universidad de Texas) de Houston. Este depósito mantiene confidencial la información de los pacientes, y cumple todas las directrices del NIH.
Se cultivaron PBMC en placas de cultivo tisular de 24 ó 96 pocillos en volúmenes de 2 ml o 200 \mul respectivamente (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 2,5 x 10^{5} células por ml en un incubador humidificado que contenía CO_{2} al 5% a 37ºC durante los tiempos indicados. Se enumeraron los fibrocitos en 5 campos de visión diferentes de 900 \mum de diámetro por su morfología en cultivos viables como células adherentes con una morfología en forma de huso alargado como distintas de los linfocitos pequeños o monocitos adherentes. Alternativamente, se secaron las células con aire, se fijaron en metanol y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Hema 3 Stain, VWR, Houston, TX). Se contaron los fibrocitos usando el criterio anterior y la presencia de un núcleo ovalado. Se realizó la enumeración de fibrocitos sobre células cultivadas durante 6 días en placas de 96 pocillos de fondo plano, con 2,5 x 10^{4} células por pocillo. Además, se confirmó la identidad de los fibrocitos mediante tinción con inmunoperoxidasa (véase a continuación). Se definió la actividad inhibidora de fibrocitos de una muestra como el recíproco de la dilución a la que inhibía la diferenciación de fibrocitos en el 50%, cuando se añadía a medio libre de suero.
Ejemplo 8 Purificación y caracterización de proteínas séricas y plasmáticas
Se descongelaron rápidamente 100 ml de suero o plasma humano congelado a 37ºC y se añadieron 1 x inhibidor de proteasa "completo" (Roche, Indianapolis, EN, EE.UU.), benzamidina HCl 1 mM (Sigma) y Pefabloc 1 mM (AEBSF: clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo, Roche). Se realizaron todas las etapas posteriores sobre hielo o a 4ºC. Se realizó la adsorción con citrato de bario del plasma tal como se describió anteriormente. Se recogió el precipitado mediante centrifugación a 10.000x g durante 15 minutos, se resuspendió en 20 ml de BaCl_{2} 100 mM más inhibidores y se volvió a centrifugar. Tras dos rondas de lavado, se resuspendió el sedimento hasta 20 ml en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 que contenía EDTA 5 mM y benzamidina HCl 1 mM y se dializó durante 24 horas frente a tres cambios de 4 litros del mismo tampón.
Se realizó la cromatografía usando un sistema Econo system (Bio-Rad, Hercules, CA) recogiendo muestras de 1 ml con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se cargó el precipitado de citrato de bario dializado en una columna de heparina Hi-Trap de 5 ml (Amersham Biosciences) y se lavó la columna de manera exhaustiva en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,4 hasta que la absorbancia a 280 nm volvió al nivel inicial. Se eluyó el material unido con un gradiente escalonado de 15 ml cada uno de NaCl 100, 200, 300 y 500 mM en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,4. Las fracciones que inhibían la diferenciación de monocitos en fibrocitos se eluían a NaCl 200 mM. Estas se combinaron (2 ml) y se cargaron en una columna de High Q Econo-Pak de 5 ml. Tras lavar la columna en tampón fosfato 10 mM, se eluyó el material unido con el gradiente escalonado tal como anteriormente, eluyéndose la fracción activa a NaCl 300 mM.
Se concentraron las fracciones activas de la cromatografía de High Q hasta 200 \mul usando Aquacide II (Calbiochem) y entonces se cargaron en un gel de poliacrilamida nativo al 4-20% (BMA, BioWhittaker, Rockland, ME) tal como se describió anteriormente. Tras la electroforesis, se cortaron los carriles de gel en cortes de 5 mm, se mezclaron con 200 \mul de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM pH 7,4 que contenía benzamidina HCl 1 mM, se aplastaron con una mano de almirez pequeña en un tubo Eppendorf y se colocaron en una mezcladora de tambor vertical a 4ºC durante 3 días. Se analizaron las proteínas que se eluyeron del gel para determinar su actividad. Para obtener secuencias de aminoácidos, se cargaron las proteínas de los cortes de gel en un gel al 4-20% con ácido tioglicólico 100 \muM en la cámara superior (Sigma). Tras la electroforesis se tiñó rápidamente el gel con azul brillante de Coomassie, se destiñó y se cortaron las bandas del gel. Se realizó la secuenciación de aminoácidos por el Dr. Richard Cook, Protein Sequencing Facility, Department of Immunology, Baylor College of Medicine.
Ejemplo 9 Inmunotransferencia de tipo western
Para la inmunotransferencia de tipo Western, se diluyeron muestras de plasma y suero 1:500 en fosfato de sodio 10 mM pH 7,4. Las fracciones de las columnas de heparina y High Q no se diluyeron. Se mezclaron las muestras con tampón de muestra de Laemmeli que contenía DTT 20 mM y se calentaron hasta 100ºC durante 5 minutos. Se cargaron las muestras en geles de poliacrilamida con Tris/glicina al 4-20% (Cambrex). Se analizaron las muestras para determinar los geles nativos en ausencia de DTT o SDS. Se transfirieron las proteínas a membranas de PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA) en tampón Tris/glicina/SDS que contenía metanol al 20%. Se bloquearon los filtros con solución salina tamponada con Tris (TBS) pH 7,4 que contenía BSA al 5%, proteína de leche desnatada al 5% y Tween 20 al 0,1% a 4ºC durante 18 horas. Se diluyeron anticuerpos primarios y secundarios biotinilados en TBS pH 7,4 que contenía BSA al 5%, proteína de leche desnatada al 5% y Tween 20 al 0,1% usando diluciones óptimas predeterminadas (datos no mostrados) durante 60 minutos. Se usó extravidina-peroxidasa (Sigma) diluida en TBS pH 7,4 que contenía BSA al 5% y Tween 20 al 0,1% para identificar anticuerpos biotinilados y se usó quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences) para visualizar el resultado.
Ejemplo 10 Inmunohistoquímica
Se secaron con aire células cultivadas en portaobjetos de vidrio para microscopios de 8 pocillos (Lab-Tek, Nalge Nunc International, Naperville, IL) antes de la fijación en acetona durante 15 minutos. Se extinguió la peroxidase endógena durante 15 minutos con H_{2}O_{2} al 0,03% y entonces se bloqueó la unión no específica mediante incubación en BSA al 2% BSA en PBS durante 60 minutos. Se incubaron los portaobjetos con anticuerpos primarios en PBS que contenía BSA al 2% durante 60 minutos. Se usaron como controles anticuerpos irrelevantes con isotipo coincidente. Entonces se lavaron los portaobjetos en tres cambios de PBS a lo largo de 15 minutos y se incubaron durante 60 minutos con Ig de cabra anti-ratón biotinilada (BD Pharmingen). Tras lavar, se detectaron los anticuerpos biotinilados mediante extravidina-peroxidasa (Sigma). Se desarrolló la tinción con DAB (diaminobenzadina, Sigma) durante 3 minutos y se contratiñó durante 30 segundos con hemalum de Mayer (Sigma).
Ejemplo 11 Expresión de marcadores de superficie sobre fibrocitos
Se cultivaron PBMC en los pocillos de portaobjetos de vidrio de 8 pocillos a 2,5 x 10^{5} células por ml (400 \mul por pocillo) en medio libre de suero durante 6 días. Entonces se secaron las células con aire, se fijaron en acetona y se tiñeron mediante inmunoperoxidasa. Se puntuaron las células como positivas o negativas para los antígenos indicados, en comparación con anticuerpos control de isotipo coincidente.
Ejemplo 12 Recuperación de la actividad inhibidora de fibrocitos y de proteína del plasma humano fraccionado
Se fraccionó el plasma mediante precipitación con BaCl_{2}, cromatografía de intercambio iónico y de heparina. Se evaluaron las concentraciones de proteína mediante espectrofotometría a 280 nm. Se evaluó la inhibición de la diferenciación de fibrocitos mediante la morfología. Se definió la actividad inhibidora de fibrocitos de una muestra como el recíproco de la dilución a la que inhibía la diferenciación de fibrocitos en el 50%, cuando se añadía a medio libre de suero.
Ejemplo 13 Estudios de cicatrización de heridas en ratas usando vendas de agarosa de alta EEO
Una aplicación de la presente invención se refiere al tratamiento de heridas pequeñas tales como cortes pequeños e incisiones quirúrgicas así como úlceras crónicas, tales como úlceras diabéticas. Los tratamientos desarrollados para estas aplicaciones y similares pueden modificarse fácilmente para el tratamiento de heridas más grandes y problemas más graves.
La reducción local de SAP es importante en la cicatrización de heridas y experimentos tales como los descritos anteriormente han revelado que SAP se une particularmente bien a un tipo de agarosa conocido en la técnica como agarosa de alta EEO. También se ha determinado que esta unión se ve influida por la presencia de calcio.
Para someter a prueba los efectos de una venda de calcio/agarosa sobre la cicatrización de heridas, se realizaron heridas de 4 cm a través de todo el espesor de la piel en los lomos de tres ratas anestesiadas. (Véase la figura 6). Hubo poco sangrado de las heridas. Se trató una rata solamente con una venda de gasa de 4x4 (gasa esponja de 4x4 Topper, Johnson & Johnson, Skillman, NJ) ligeramente empapada con 1 ml de solución salina (NaCl al 0,9% p/v en agua). Se cubrió esta capa de gasa con una venda de gasa de 4x4 seca, y se mantuvieron en su sitio con varias capas de Vetwrap® (3M Animal Care Products, St. Paul, MN) que se envolvieron alrededor del torso de la rata. Se trató una segunda rata con una venda similar, con la primera capa ligeramente empapada (1 ml) con solución salina/CaCl_{2} 5 mM.
Se trató una tercera rata con una venda de agarosa/CaCl_{2}. Para preparar la primera capa de esta venda, se disolvieron 0,2 g de agarosa de alta EEO (producto de agarosa de alta EEO de grado de electroforesis nº BP-162, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) en 20 ml de la disolución de solución salina/CaCl_{2} descrita anteriormente mediante el calentamiento de la disolución en un tubo de polipropileno de 50 ml (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) en un horno de microondas hasta que la mezcla comenzó a hervir. Tras la agitación para disolver la agarosa, se vertió un 1 ml de la mezcla caliente en una venda de gasa de 4x4 que estaba apoyada en plano en una pieza de Saran Wrap®. Se dejó enfriar la venda de gasa impregnada con agarosa-CaCl_{2}-solución salina. Ésta se usó entonces como la primera capa de la venda para la tercera rata. Se aplicaron una segunda capa de gasa seca y un recubrimiento de Vetwrap® como en las primeras dos ratas.
Se anestesió cada rata por separado, se fotografió y se vendó para minimizar las diferencias en el tiempo entre la aplicación de la anestesia, las heridas y la venda.
Tras 24 horas, se anestesiaron ligeramente las ratas y se pesaron, entonces se retiraron las vendas y se fotografiaron las heridas. (Véase la figura 7). Entonces se volvieron a aplicar nuevas vendas de la misma composición inicial a cada una de las ratas. Tras otras 24 horas se repitió este proceso para obtener imágenes adicionales. (Véase la figura 8). La rata tratada con la venda de agarosa/CaCl_{2} mostró una cicatrización de heridas consideradamente más rápida que cualquiera de las otras dos ratas. (Véase la figura 8B).
Aunque en el presente ejemplo volvió a aplicarse una venda de agarosa cada día, en otras realizaciones de la invención puede aplicarse una venda de agarosa solamente al inicio o al inicio y en el primer día más o menos seguido de una venda seca una vez se ha cerrado sustancialmente la herida. Una vez se ha cerrado la herida, la capacidad de agarosa para absorber SAP puede ser limitada. Las heridas que se han cerrado pueden beneficiarse también de un entorno más seco.
Aunque en el presente ejemplo se usó agarosa hidratada, puede ser posible utilizar también vendas y otras formulaciones con menos agarosa hidratada. La agarosa puede humedecerse mediante suero que sale de la propia herida.
Las preparaciones tópicas de agarosa de la presente invención pueden prepararse también usando antisépticos para permitir tanto la limpieza de la herida como la estimulación de la cicatrización de heridas. En un ejemplo específico, puede prepararse la agarosa con alcohol, que puede limpiar la herida inicialmente, luego evaporarse con el tiempo.
Ejemplo 14 Factores adicionales para su uso en realizaciones de cicatrización de heridas tópicas
Aunque las vendas de agarosa anteriores mostraron ser bastante eficaces para promover la cicatrización de heridas, los efectos observados pueden mejorarse de la manera más probable mediante la adición de otros factores de cicatrización de heridas a las vendas u otras formulaciones de agarosa tópicas. Tales factores pueden incluir cualquier compuesto o composición, tal como moléculas pequeñas o polipéptidos.
En particular, estos factores pueden influir en una ruta de cicatrización de heridas separada, o pueden influir en la ruta de formación de fibrocitos. También pueden influir en la ruta de formación de fibrocitos de una manera diferente que SAP, o pueden influir en la misma mediante un mecanismo similar al de SAP, por ejemplo, los anticuerpos en la formulación de agarosa pueden unirse e inactivar el SAP adicional.
También pueden incluirse factores que tratan otros problemas, de los que algunos pueden afectar también a la cicatrización de heridas. Por ejemplo, las vendas de agarosa para pacientes hemofílicos pueden incluir adicionalmente factores de coagulación para ayudar a detener o evitar el sangrado de la herida.
En una realización particular, puede incluirse IL-4 y/o IL-13 en la formulación de agarosa. Ambos son activadores potentes de la respuesta fibrótica. Anteriormente se ha descrito que IL-4 desempeña un papel en la cicatrización y reparación de heridas.
Experimentos han demostrado que IL-4 e IL-13 pueden promover la diferenciación de fibrocitos in vitro. Específicamente, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica en medio libre de suero en presencia de IL-4 o IL-13. Concentraciones de o bien IL-4 o bien IL-13 de entre 10 y 0,1 ng/ml potenciaban el número de fibrocitos en cultivo. (Véase la figura 9). Esto indica que IL-4 e IL-13 pueden promover la diferenciación de precursores de fibrocitos en fibrocitos maduros. Por tanto, se espera que una venda u otra formulación de agarosa tópica tal como se describió anteriormente que contiene adicionalmente IL-4 y/o IL-13 muestre mejoras adicionales en la cicatrización de heridas.
Otros factores que pueden añadirse a las vendas de agarosa o formulaciones tópicas tal como se describió anteriormente o condiciones fisiológicas que han de imitarse incluyen:
Moléculas que se sabe que se unen a SAP:
Colágeno IV;
Laminina;
Fibronectina;
C4BP;
Fc agregado de IgG;
CD16, CD32 y CD64: Receptores de Fc;
Heparina;
LPS;
Células apoptóticas, especialmente zimozan-ADN y cromatina.
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Condiciones fisiológicas relacionadas con la unión a SAP:
SAP muestra una unión dependiente de calcio a fibras amiloides formadas a partir de, por ejemplo amiloide sérico A (SAA), cadenas ligeras de inmunoglobulina, microglobulina \beta2, transtiretina y los ovillos neurofibrilares;
SAP se une a superficies de bacterias debido a la expresión de piruvato-acetilo de galactosa y a otros azúcares sobre la superficie de bacterias.
SAP se une a los ligandos "artificiales" agarosa de alta EEO y fosfoetanolamina-agarosa, y con baja afinidad a fosfocolina-Sepharose. Estas características dan lugar a dos modos de purificar SAP a partir de suero o plasma. En primer lugar, SAP puede unirse a agarosa de alta EEO por medio del piruvato-acetilo de galactosa, que es un constituyente minoritario de las preparaciones de agarosa. En segundo lugar, SAP puede unirse a fosfoetanolamina-agarosa, que en la actualidad es el método preferido de purificación de SAP en la técnica. Por tanto puede usarse fosfoetanolamina-agarosa para vendas o formulaciones tópicas.
<110> William Marsh Rice University
\hskip1cm Gomer, Richard
\hskip1cm Pilling, Darrell
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<120> Métodos de detección de la inhibición de la formación de fibrocitos y métodos y composiciones para potenciar la formación de fibrocitos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 002376.0975
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<140> No cedida
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<141> 22-12-2003
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<150> Documento US 60/436.046
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<151> 23-12-2002
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/436.027
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 23-12-2002
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/515.776
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<151> 30-10-2003
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/4519.467
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<151> 12-11-2003
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/525.175
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<151> 26-11-2003
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<160> 3
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<170> PatenIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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\hskip1cm
6 
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<210> 2
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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7 
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<210> 3
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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\hskip1cm
8

Claims (10)

1. Uso de una composición seleccionada del grupo que consiste en: CPHPC (ácido R-1-[6-[R-2-carboxi-pirrolidin-1-il]-6-oxo-hexanoil]pirrolidin-2-carboxílico), el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa, una etanolamina, fosfoetanolamina, un anticuerpo anti-SAP o fragmento funcional del mismo, y combinaciones de los mismos en la preparación de un medicamento que puede hacerse funcionar para reducir el SAP o suprimir la actividad de SAP en un mamífero que tiene una herida que contiene SAP; para suprimir la capacidad del SAP para suprimir la diferenciación de monocitos en fibrocitos y para promover la cicatrización.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende CPHPC.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende el 4,6-piruvato-acetilo de beta-D-galactopiranosa.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende fosfoetanolamina.
5. anti-SAP o fragmento funcional del mismo.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medicamento comprende además agarosa.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que la agarosa comprende agarosa de alta EEO.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento comprende además un catión.
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medicamento comprende además un factor de cicatrización adicional.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el factor de cicatrización adicional se selecciona del grupo que consiste en: IL-4, IL-13, FGF, TGFB y combinaciones de los mismos.
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