PT1368060E - Inibidores e/ou antagonistas da proteína hmgb1 para o tratamento de doenças vasculares - Google Patents

Description

Descrição

Inibidores e/ou antagonistas da proteína HMGBl para o tratamento de doenças vasculares A presente invenção insere-se no âmbito da biologia molecular e mais particularmente inibidores da proteína HMGBl e antagonistas de HMGBl para serem utilizados no tratamento de doenças vasculares, incluindo aqueles devidos à angioplastia. A proteína HMGBl (conhecida, antes de 2001, como HMG; Bustin, 2001, Trends Biochem. Sei., 26, 152-153) é a proteína arquetípica da família HMG-box, que é caracterizada pela presença de domínios de ligação ao DNA, denominadas HMG boxes. HMGBl é uma pequena proteína de 25-kD, de 215 aminoácidos, cuja sequência é altamente conservada entre mamíferos. A molécula HMGBl está organizada em três domínios: dois domínios de ligação ao DNA, HMG Box A e Box B, as quais são seguidas por uma terminação COOH composta por cerca de 30 resíduos de ácido glutâmico ou ácido aspártico. As duas boxes de HMG, box A e box B, apresentam segmentos de 80 aminoácidos (29% idênticos, 65% de similaridade), apresentando uma estrutura tridimensional com formato em L (Hardman et al., 1995,

Biochemistry, 34:16536-16607; Read et al., 1993, Nucleic

Acids Res., 21:3427-3436; Weir et al., 1993, EMBO J., 12 :1311-1319) . HMGBl foi originalmente identificada como uma proteína nuclear abundante ubiquamente expressa. Está presente em mais de um milhão de cópias por núcleo único e liga-se à dupla cadeia de DNA sem especificidade de sequência. Em vez disso, HMGBl liga-se com grande afinidade a estruturas de DNA específicas como DNA dobrado ou curvado e junções de quatro vias. No entanto, HMGBl pode ser recrutada para a dupla cadeia de DNA através de interaeções com diversas 1 outras proteínas de ligação ao DNA. Quando ligada à dupla cadeia de DNA, a proteína induz a distorção da estrutura de DNA, permitindo a formação de complexos nucleoproteicos onde diversas proteínas de ligação ao DNA podem contactar umas com as outras enquanto se ligam aos seus respectivos locais no DNA (Muller et al. , 2001, EMBO J., 16: 4337-4340 e outras referências aqui citadas). O fenótipo do rato Hmgbl -/- está de acordo com este modelo (Calogero et al., 1999, Nat. Genet., 22:276-280).

Recentemente, um papel adicional da HMGBl fora do núcleo celular adquiriu novo ênfase: a proteína HMGB1 actua como mediador tardio da endotoxina indutora de letalidade bem como inflamação aguda dos pulmões no rato; bem como elevados níveis de HMGB1 no soro em pacientes sépticos representa um marcador de prognóstico (pedido de patente internacional No. WO 00/47104). A HMGB1 pode ser segregada por macrófagos e pituicitos em cultura em resposta a citocinas e endotoxina bacteriana (Abraham et al., 2000, J. Immunol., 165: 2950-2954; Wang et al., 1999, Surgery (St. Luis), 126:389-392; Wang et al., 1999, Science, 285:248-251) . A libertação de HMGB1 a partir de células eritroleucémicas de murganho está correlacionada com a diferenciação celular e a proteína pode ser encontrada na forma de membrana plasmática associada a essas células (Passalacqua et al., 1997, FEBS Lett., 400:275-279; Sparatore et al., 1996, Biochem. J., 320:253-256). Uma prteína denominada anfoterina, com sequência idêntica à de HMGB1, tem sido descrita no cérebro, onde é encontrada no núcleo e no citoplasma das células neuronais bem como no espaço extracelular. Se adicionada exogenamente, HMGB1 medeia o crescimento de neurites, e a migração dependente de laminina de células de neuroblastoma e glioma é inibida por anticorpos contra HMGBl (Fages et al., 2000, J. Cell Sei., 2 113:611-620; Merenmies et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:16722-16729; Parkkinen et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:19726:19738; Rauvala et al., 1988, J. Cell Biol., 107:2293-2305). Interacções entre HMGB1 e o sistema de activação de plasminogénio, em particular t-PA (activador tipo-tecido de plasminogénio), resultam na formação de plasmina reforçada (Parkkinen and Rauvala, 1991, J. Biol. Chem., 266: 16730-16735. A degradação de proteínas da matriz extracelular é um passo importante no processo de migração celular, e aumentar HMGB1 promovido de actividade de protease extracelular poderia permitir a migração celular. A proteína HMGB1 tem sido identificada como um dos ligandos com ligação ao receptor RAGE (Receptor para produtos finais de glicação avançada) (Hori et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 25752-25761). O RAGE é um receptor multiligandos da superfamília das imunoglobulinas e é expresso em muitos tipos celulares, incluindo células endoteliais, células do músculo liso, fagócitos mononucleares, e neurónios (Brett et al., 1993, Am. J. Phathol., 143: 1699-1712; Neeper et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 14998-15004). Está implicado em diversos processos patológicos diferentes, tais como diabetes, amiloidoses e aterosclerose (Schmidt et al., 1999, Circ. Res., 84: 489-497). Interacções de HMGB1 e RACE induzem o desenvolvimento de neurites, e as duas proteínas colocalizam-se na vanguarda do avanço de neurites durante o desenvolvimento embrionário (Huttunen et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:19919-19924). O bloco de crescimento tumoral e metastização é observado prevenindo a interacção entre HMGB1 e RAGE; para além disso, a inibição desta interacção suprime a activação da proteína cinases activada por mitogénio (MAP) e a expressão de metaloproteinases de matriz, moléculas importantemente 3 ligadas à proliferação tumoral e invasão (Taguchi et ai., 2000, Nature, 405: 354-360) .

Além disso, já se sabe que inibidores de HMGB1 (i.e. Glicirricina) podem ser utilizados como agentes anti-inflamatórios (Sakamoto et al., 2001, Biol. Pharm. Buli., 24(8) 906-911; Yoh et al. , 2002, Dig. Dis. Sei., 47(8), 1775-1781).

Os inventores da presente invenção, demonstraram que HMGB1 apresenta um efeito biológico potente nas células do músculo liso (SMC) , um dos tipos celulares onde o RAGE é expresso à superfície. Células vasculares SMC são as células mais predominantes nos grandes vasos sanguíneos; estão localizadas na túnica média onde são incorporadas na matriz extracelular. Nos vasos intactos, as células SMC estão num estado contráctil e apresentam um fenótipo caracterizado pela ausência de divisão celular e migração responsável pela manutenção da rigidez e elasticidade da parede dos vasos e controlo da pressão celular.

Quando o endotélio é danificado, tanto após ferimentos mecânicos ou inflamatórios, as células SMC alteram para um fenótipo sintético e desencadeiam a divisão celular e a migração celular. A migração das células a partir da túnica média para a túnica íntima, resultando num espessamento da íntima, desempenha uma importante função na patofisiologia de muitas doenças vasculares, tal como aterosclerose e estenose recorrente após angioplastia coronária. No estado sintético, as células SMC também produzem grandes quantidades de proteinases extracelulare, factores de crescimento, e citocinas e segregam uma matriz celular fibrosa. Após lesão da parede do vaso, a libertação de factores de crescimento e/ou quimioatraentes quer pela circulação de monócitos, macrófagos e plaquetas, ou pelas células endoteliais lesadas podem induzir a células SMC a alterar dos fenótipos contráctil para sintético, o que pode 4 direccionar a migração das células SMC através do vaso intima. De entre estes factores, bFGF aparece como sendo um dos mais importantes, no entanto, as células SMC podem também iniciar os fenómenos de migração em resposta a um estimulo angiogénico (Schwartz, 1997, J. Clin. Invest., 99:2814-2816; Van Leeuwen, 1996, Fibrinolysis, 10:59-74).

Na tentativa de definir o efeito e o mecanismo através do qual a HMGB1 induz a migação celular de RSMC, os inventores demonstraram que a HMGB1 é um forte quimioatraente e que induz as suas alterações no formato celular, e na reorganização do citoesqueleto. Estes eventos são inibidos pela adição de um anticorpo anti-RAGE e pela toxina pertussis, sublinhando que tanto a RAGE como a proteína Gi/o podem estar envolvidas na via. Para além disso, a evidência de que a HMGB1 promove a translocação das proteínas ERK1 e 2 fosforiladas para o núcleo, indicam o envolvimento da via da cinase MAP. Assim, tem sido demonstrado que a HMGB1 é libertada por lesão ou necrose de uma grande variedade de tipos celulares, incluindo as células endoteliais.

Assim sendo, a HMGB1 apresenda todos os marcadores de uma molécula que pode promover a aterosclerose e a estenose recorrente após lesão vascular.

Os inventores também demonstraram que fragmentos de HMGB1, correspondente às boxes HMG, são mais eficazes do que a molécula em todo o seu comprimento e mesmo os domínios HMG box de outras proteínas da família das HMG-box podem induzir os mesmos efeitos.

Consequentemente, qualquer tipo de moléculas capazes de bloquear a interacção entre a HMGB1 e o seu receptor RAGE (i.e. todas as moléculas pertencentes à classe de inibidores: anticorpos ou fragmentos de anticorpos, junção de Holliday; e todas as moléculas pertencentes à classe de antagonistas de HMG-box: fragmentos de moléculas de HMGB1 5 contendo o domínio HMG box) podem eficientemente ser utilizados na produção de preparações farmacêuticas de forma a evitar, retardar ou inibir a aterosclerose e a estenose recorrente após lesão do epitélio vascular mesmo derivado de angioplastia.

Moléculas de ligação a HMGB1 ou inibidores de HMGB1 podem ser injectados ou libertados por instrumentos utilizados em cirurgia angioplástica, ou as referidas moléculas podem ser ligadas à superfície de "instrumentos". A presente invenção está definida nas reivindicações.

Um objecto da presente invenção é a utilização de moléculas capazes de bloquear a interacção entre a HMGB1 e a RAGE para a preparação de agentes terapêuticos para o tratamento de doenças vasculares.

Um formato preferencial desta invenção as referidas moléculas são libertadas por cateteres, instrumentos cirúrgicos ou stents para angioplastia, durante ou após a referida operação.

Outras características ou vantagens desta invenção serão mais facilmente perceptíveis a partir da descrição detalhada que se seguirá, com referência aos desenhos que o acompanham. Nos desenhos: A Figura 1 mostra a actividade quimiotáxica da HMGB1 em RSMC em ensaios de quimiotaxia desenvolvidos utilizando câmaras Boyden modificadas. O valor de 100% corresponde ao número de células migrantes na ausência de qualquer estimulador (migração celular aleatória). Os resultados representam a média ± SD (Standard Deviation - Desvio Padrão) (n=3). A Figura 1—A mostra a resposta migratória dependente da concentração de RSMC para HMGB1 purificado de timo de vitela. A Figura 1-B mostra a comparação do efeito quimiotáxico das proteínas HMGB1, tanto das purificadas a partir do timo de vitela ou expressas 6 em leveduras, com os quimioatraentes fMLP e bFGF. A Figura 1-C mostra o efeito dos anticorpos anti-HMGBl em fMLP- e HMGB1- de migração induzida. 0 asterisco (*) indica tratamentos onde a resposta migratória foi estatisticamente diferente do controlo acima do limite p=0,0001 no teste de Student. A Figura 1-D mostra a resposta migratória dependente da concentração de RSMC para HMGB expressa em leveduras (Pichia pastoris). A Figura 2 mostra o efeito de HMGB1 na morfologia de RSMC e na organização do citoesqueleto. A Figura 2-A mostra o efeito de HMGBl purificada de timo de vitela ou expressa em levedura ou em E.coli em culturas subconfluentes de RSMC. Filamentos de actina foram visualizados utilizando TRITC-faloidina. A Figura 2-B mostra como anticorpos de coelho anti-HMGBl inibem a reorganização do citoesqueleto estimulada por HMGBl. Células em repouso (estado 1) exibem numerosas fibras de stress. Células que não estão em repouso (estado 2) apresentam uma reorganização de esqueleto de actina. A Figura 3 mostra a resposta quimiotáxica de RSMC aos domínios HMG box da HMGBl. A Figura 3-A apresenta a resposta dependente da concentração à BOX A e Box B, ambas expressas em E.coli. A migração aleatória é referida como 100% de migração. Os resultados representam a média ± SD (n=3). A significância estatística do resultado é p<0,0001 no modelo ANOVA, para ambas as Box A e Box B. A Figura 3-B mostra os efeito de todo o comprimento de HMGBl expresso em E.coli, Box A+B, Box A ou Box B na organização do citoesqueleto de actina. Os filamentos de actina foram visualizados utilizando TRITC-faloidina. 7 A Figura 4 apresenta os efeitos de HMGB1 e as suas boxes HMG na migração de RSMC numa ferida. O valor de 100% corresponde ao número de células migrantes na ausência de qualguer estimulador (migração basal). Os resultados representam a média ± SD (n=5). A significância estatística é 0,05<p<0,01 para o tratamento com bFGF e todo o comprimento de HMGB1 de origem bacteriana, 0,01<p<0,001 para o tratamento com Box A e Box B e 0,001<p<0,0001 para o tratamento com HMGB1 derivada de timo de vitela. A Figura 5 mostra como a HMGB1 se liga à superfície de RSMC e estimula a mobilidade celular através de RAGE. A Figura 5-A mostra que grandes quantidades de HMGB1 se ligam à superfície de RSMC. Na figura 5-B mostra-se RSMC a expressarem RAGE. A Figura 5-C mostra como anticorpos anti-RAGE inibem a migração de RSMC induzida por HMGB1. A significância estatística é 0,00l<p<0, 0001 para o tratamento com HMGB1 e HMGB1 mais anticorpo inespecífico. A Figura 6 mostra como a toxina pertussis (PT) inibe a migração de RSMC induzida por HMGB1 e a reorganização do citoesqueleto de actina. Na Figura 6-A são apresentados ensaios quimiotáxicos desenvolvidos utilizando câmaras Boyden modificadas. O valor de 100% corresponde à migração celular basal na ausência de qualquer estimulador; os resultados representam a média ± SD. A Figura 6-B mostra uma evidente reorganização do citoesqueleto, filamentos de actina foram visualizados utilizando TRITC-faloidina conjugado. A Figura 7 demonstra que a via da cinase MAP está envolvida na sinalização de HMGB1. As células são coradas com um anticorpo específico contra ERK1/2 fosforiladas e DAPI, e uma amostra independente de 8 células é corada com TRITC-faloidina para visualizar a reorganização do citoesqueleto. A Figura 8 mostra que a HMGB1 é libertadas por células necróticas e danificadas. A Figura 8-A mostra resultados da análise do Western-blot de proteínas libertadas por HeLa necróticas ou permeabilizadas; a presença de HMGB1 é evidente nas linhas 1 e 3. A Figura 8-B mostra os resultados de ensaios de imunofluorescência desenvolvidos em HeLa necróticas e vivas. A Figura 9 mostra que HMGB1 está presente no núcleo de células endoteliais, mas não nas SMC vasculares. Na Figura 9-A e na Figura 9-B é apresentado que a HMGB1 está presente no núcleo das células endoteliais mas que não é detectada no núcleo de células vasculares do músculo liso de uma secção da artéria pancreática humana corada com anticorpo anti-HMGBl e contra-corada com hematoxilina, a ampliação baixa (A) e alta (B) . Os quadros vermelhos indicam a localização da área apresentada na Figura B e as setas apontam para o núcleo de SMC. Na figura 9-C a análise do Western-blot mostra níveis de expressão de HMGB1 em RSMC em comparação com as células HeLa. A Figura 10 mostra o efeito quimiotáxico de HMGB1 em fibroblastos embriónicos de rato em ensaios quimiotáxicos desenvolvidos utilizando câmaras Boyden modificadas, na presença ou na ausência de anticorpos anti-RAGE (1000 ng/ml). 0 valor de 100% corresponde ao número d células migrantes na ausência de qualquer estimulador (migração celular aleatória). Os resultados representam a média ± SD (n=3). 9

Expressão e purificação de HMGB1 e derivados

No primeiro passo, é necessário expressar e purificar HMGB1 e derivados. A expressão do comprimento completo de HMGB1 foi desenvolvido em E.coli transformada com um plasmídeo pT7-7-rHMGlcm (gentilmente cedido pelo Prof. J.O. Thomas, Universidade de Cambridge) e a purificação foram desenvolvidas por um protocolo bem conhecido (Muller et al., 2001, Biochemistry, 40: 10254-10261). A expressão e a purificação do comprimento completo de HMGB1 em levedura Pichia Pastoris foram desenvolvidas seguindo um protocolo bem conhecido (Mistry et al., 1997,

Biotechniques, 22:718-729).

Os plasmideos bem conhecidos pRNHMGl/Ml-V176, pT7HMGlbA e pT7HMGlbB foram utilizados para a expressão e purificação de BoxA + BoxB, BoxA e BoxB respectivamente seguindo procedimentos de purificação já estabelecidos para boxes simples e duplas (Bianchi et al., 1992, EMBO J., 11: 1055- 1063).

Para demonstrar o efeito quimiotáxico de HMGB1, três ensaios independentes de migração celular foram desenvolvidos: ensaio quimiotáxico, ensaio quimiocinésico e ensaio de ferimento in vitro. Foi investigada a relação funcional entre a migração induzida por HMGB1 e alterações morfológicas (i.e. reorganização de fibras de actina, alongamento celular e polarização de formato celular) de células que não se encontram em repouso.

Ensaio Quimiotáxico OS ensaios quimiotáxicos foram desenvolvidos utilizando protocolos conhecidos (Degryse et al., 1999, Blood, 94:649-662). Câmaras Boyden modificadas foram utilizadas com filtros apresentando 0,5μιτι de tamanho de poro (Corning, Acton, MA) e tratados com colagénio I (100 μg/ml em ácido 10 acético 0,5M) e fibronectina (10 μg/ml) (Roche). Células RSMC (gentilmente cedidas por Dr. Marco Bertulli, Bayer Research Laboratories, Milão) foram cultivadas em DMEM sem soro e uma amostra de 20.000-40.000 células foram adicionadas ao poço superior da câmara Boyden. As moléculas a serem testadas foram diluídas no mesmo meio de cultura livre de soro e adicionadas ao poço inferior.

Foram utilizadas diferentes preparações de HMGB1: HMGB1 purificada de timo de vitela (gentilmente cedido por J. Bernués, C.S.I.C., Barcelona, Espanha), HMGB1 recombinante expressa por E.coli, e uma forma de HMGB1 ligeiramente modificada (contendo aminoácidos EAEAYVEF ligados à extremidade N-terminal) produzida pela levedura Pichia pastoris (Mistry et al., 1997, Biotechniques, 22:718-729). Se necessário, o coelho policlonal anti-HMGBl (Pharmingen BD, Torrey Pines, CA) , a toxina pertussis (PT) de Bordetella pertussis (gentilemente cedida por Dr. M.G. Pizza, I.R.I.S., Siena) ou os inibidores foram adicionados em ambos os poços. A migração celular durante a noite (overnight) ocorreu a 37 °C, em seguida, as restantes células da superfície superior dos filtros foram raspadas e os filtros foram fixados em metanol e corados numa solução de 10% violeta cristal em 20% de metanol. Todas as experiências foram desenvolvidas pelo menos duas vezes em triplicado.

Os resultados, como apresentados nas figuras 1-A, 1-B, 1-C, 1-D são a média ± SD do número de células contadas em 10 campos de alta ampliação por filtro e expressas como o dobro do controlo. Para a migração aleatória (i.e. migração na ausência de quimioatraentes) foi dado o valor arbitrário de 100%. A análise estatística foi desenvolvida utilizando o teste T de Student para comparação de pares de tratamentos, ou o 11 modelo ANOVA para a avaliação de tratamentos com aumento de doses de reagente. A HMGB1 obtida a partir do timo de vitela estimula a migração de RSMC de uma forma dependente da concentração, começando com doses tão baixas guanto 0,1 ng/ml e com uma resposta máxima de 2,5 vezes a 100 ng/ml (Figura 1-A) . O efeito de HMGB1 é comparável em amplitude aos efeitos dos bem caracterizados atraentes fMLP e bFGF (Figura 1-B) . Anticorpos policlonais contra HMGB1, mas não anticorpos controlo não específicos, bloqueiam totalmente a resposta migratória (Figura 1-C), mostrando que é especificamente devido a HMGB1. Estes anticorpos não alteram o efeito do péptido quimioatraente fMLP utilizado como controlo positivo. Resultados semelhantes são obtidos com HMGB1 recombinante produzida em levedura P. pastoris (Figura ΙΟ) .

Ensaio Imunofluorescente

Amostras de 15.000-20.000 RSMC, 20-40% confluentes, 2 foram semeadas em lamelas de vidro em poços de 2 cm e cultivadas durante 24h em meio DMEM mais 10% FCS, lavado em PBS, e cultivado mais 24h em meio DMEM sem FCS. As RSMC foram estimuladas com HMGB1 100 ng/ml em intervalos de tempo crescente, desde os 5 aos 120 minutos a 37 °C. Após estimulação, RSMC foram fixadas durante 20 minutos à temperatura ambiente com uma solução de 3% de paraformaldeído, 2% de sucrose em PBS, pH 7,5, seguido de três lavagens com PBS-BSA 0,2%. As células foram permeabilizadas com 20 mM Hepes pH 7,4, 300 mM sucrose, 50 mm NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v/v) Triton X-100 durante 3 minutos a 4 °C, e lavado novamente três vezes com PBS-BSA 0,2%. Depois, as RSMC foram incubadas com PBS-BSA 2% durante 15 minutos a 37 °C, com anticorpos primários

durante 30 minutos a 37 °C, lavado três vezes com PBS-BSA 12 0,2%, e ainda incubado com PBS-BSA 2% durante 15 minutos. No final, as células foram coradas com anticorpo secundário e/ou faloidina conjugada com rodamina para visualização de filamentos de actina; em alguns casos, DAPI (4',6-diamino-2-fenilindolo, Roche) foi utilizado para marcar o núcleo. Após as todas incubações subsequentes, as lamelas foram lavadas três vezes com PBS-BSA 0,2%, duas vezes com água destilada, montada com 20% Mowiol em PBS e analisadas num microscópio Axiophot (Cari Zeiss). As fotografias de fluorescencência foram tiradas tanto num filme T-Max 400 ou num ΕΡΗ P1600X (Eastman Kodak) utilizando lentes neofluar Zeiss 400 e 100.

Imagens pouco ampliadas, na Figura 2-A, mostram que o conteúdo das fibras de stress, formato e tamanho celular, e organização do citoesqueleto sofrem alteração em 30 minutos, mas reverte após 120 minutos. Imagem de maior ampliação (Figura 2-B) mostram que antes da estimulação são bem visíveis numerosas fibras de stress e o formato celular é não polarizado. Dentro de 15-30 minutos, ocorre uma alteração completa de morfologia e de organização do citoesqueleto: RSMC montra uma morfologia alongada, polarizada que reflecte um rearranjo espacial do citoesqueleto de actina. Os efeitos da HMGB1 diminuem lentamente: após 1-2 horas, o conteúdo da fibra de stress aumenta para o nível inicial e a morfologia celular retorna à morfologia das células controlo não estimuladas.

Em determinadas experiências as células foram pré-tratadas durante toda a noite com anticorpos ou PT ou inibidores. Como apresentado na figura 2-B, anticorpos contra HMGB1 inibem totalmente a reorganização do citoesqueleto e a alteração morfológica de RSMC induzida por HMGB1. Anticorpos controlo não têm capacidade para inibir os efeitos de HMGB1. 13

Finalmente, para determinar se os efeitos observados da HMGB1 nas RSMC reflectem realmente uma transição dinâmica do estado de repouso para um estado dotado de mobilidade, foi quantificada a proporção de células em cada estado. As imagens pouco ampliadas foram tiradas e as células foram classificadas em dois estados: - estado 1, onde as células mostram a aparência típica de células não estimuladas caracterizadas por um elevado número de fibras de stress e formato celular não polarizado; - estado 2, onde as RSMC exibem um baixo conteúdo de fibras de stress, membrana ondulante, semi-anéis de actina, ou um formato alongado. É claramente apresentado na Figura 2-C que em cultura nã estimuladas 60% das células se encontram no estado 1 e 40% no estado 2; num espaço de 5 minutos após a estimulação, a proporção de células no estado 2 aumenta para 60%, e atinge os 80% após 15-30 minutos. Uma hora após a estimulação com HMGB1, estas proporções retornam aos valores das culturas não estimuladas, com 60% de RSMC no estado 1 e 40% no estado 2. Estes resultados demonstraram que os efeitos de HMGB1 são transitórios e representam a alteração do estado de repouso para o estado migrante, estes resultados confirmam os resultados quimiotáxicos: HMGB1 é um quimioatraente para RSMC.

Ensaio de ferimento in vitro

Culturas confluentes de RSMC, crescem em lamelas de vidro em poços de 2 cm2, foram lavadas uma vez com PBS e FCS-esgotado durante 24h em DMEM livre de soro. Depois para estimular a ferida, um única linha foi feita com a ponta de uma pipeta na região central das monocamadas. As monocamadas assim tratadas, foram lavadas uma vez com PBS e 14 são possíveis de recuperar durante 48 horas em meio livre de soro suplementado ou não com HMGB1 (100 ng/ml) . Depois as células foram fixadas e coradas com TRITC-faloidina. A quantificação da migração foi feita através de fotogafias de baixa ampliação e pela contagem do número de células que tenham migrado para o espaço livre de células. Os resultados representam a média ± SD e o valor 100% corresponde ao número de células migrantes na ausência de qualquer estimulador (migração basal).

Como apresentado na Figura 4, a estimulação por HMGBl aumenta o número de células migrantes cerca 5,2 vezes. As Box A e Box B (10 ng/ml) foram também testadas e ambas estimularam a migração celular cerca 1,8 vezes. Finalmente, a comparação com bFGF (50 ng/ml) sublinha que as moléculas acima mencionadas são mais eficazes. É possível supor que a cicatrização é baseada na mesma via de sinalização da quimiotaxia e quimiocinése.

Via de sinalização

Posteriormente, foi detectada uma via de sinalização.

Para actuar como sinal migratório, a HMGBl deve chegar à membrana das células sensíveis e ligar-se ao receptor. Para testar se a HMGBl se liga à superfície das RSMC, um milhão de células foram tripsinizadas e incubadas durante 20 minutos a 4 °C em PBS contendo 800 ng de péptido de Box A+B e 5 pg de BSA. O polipéptido BoxA+BoxB é ligeiramente menor que o total comprimento de HMGBl e pode assim ser distinguido facilmente em géis SDS-PAGE. Depois, as células foram centrifugadas e o sobrenadante foi guardado; após duas lavagens em 500 μΐ de PBS frio, as células foram ressuspendidas em tampão SDS-PAGE, aquecidas durante 5 minutos a 100 °C e aplicadas num gel a 12% de tricina-SDS (linha P) , adjacente a 20 μΐ de sobrenadante (linha S) . 15

Seguidamente, o gel foi revelado para um filtro Immobilon o qual foi corado com tinta da índia.

Na Figura 5-A, é apresentado um gel SDS-PAGE, a partir do qual a quantidade de Box A+B recuperada do pellet celular e do sobrenadante pode ser calculado, e pode ser estimado que mais de 500.000 moléculas de Box A+B se ligam a uma única RSMC. Este resultado demonstra que a HMGB1 extracelular se pode ligar a RSMC, mas provavelmente não reflecte o número de receptores real. Para além disso, tem sido demonstrado que HMGB1 se liga à heparina e a proteoglicanos (Bianchi, 1988, EMBO J., 7: 843-849; Nair and Jungalwala, 1997, J. Neurochem., 68: 1286-1297; Salmivirta et al., 1992, Exp. Cell Res., 200: 444-451); assim, a HMGB1 pode também estar associada com a matriz extracelular produzida pelas RSMC, como já foi demonstrado pelos inventores em HeLa, onde apenas pequenas quantidades de HMGB1 se ligam a células porque essas células produzem uma pequena matriz extracelular. HMGB1 tem sido referido de se ligar ao RAGE que é expresso por uma larga gama de tipos celulares. Para demonstrar que o RAGE está presente na membrana de RSMC, um milhão de RSMC foram lisados numa placa contendo amostra de tampão SDS-PAGE (50 mM Tris pH 6,8, 2-mercaptoetanol, 4% SDS, 12% glicerol, 0,05% azul de bromofenol) , desnaturado durante 5 minutos a 100 °C e separado em acrilamida a 12%. As proteínas separadas foram reveladas numa membrana Immobilon (Millipore) utilizando um sistema em tanque de revelação 25 mM Tris pH 7,5, 0,192 M glicina, 20% metanol. 0 blot foi bloqueado durante uma hora à temperatura ambiente em leite desnatado a 5%/TBST (20 mM Tris, pH 7,5, NaCl a 137 mM, 0,1% Tween 20), lavado três vezes em TBST, e incubado com anticorpo anti-HMGBl em TBST-0,01% BSA. Incubação com anticorpo secundário foi desencadeada após lavagem com TBST-0,01% BSA. As proteínas foram detectadas com um 16 sistema ECL (Amersham) . A presença de RAGE foi detectada utilizando anticorpo anti-RAGE (gentilmente cedido por Dr. A.M. Schmidt, Columbia University, NY). Resultados apresentados no Figura 5-B demonstraram que o RAGE está presente nas RSMC. Para além do mais, a chimiotaxia induzida por HMGB1 não é apenas inibida por anticorpo anti-HMGB1 mas também por anticorpos anti-RAGE, como mostra a Figura 5-C. Os anticorpos anti-RAGE bloqueiam a reorganização do citoesqueleto e as alterações morfológicas de RSMC em resposta ao sinal migratório de HMGBl; anticorpos irrelevantes não têm capacidade para bloquear a reorganização do citoesqueleto.

Estes resultados indicam que o receptor RAGE é necessário para as respostas induzidas por HMGBl das RSMC.

Sabendo que muitos quimioatraentes actuam através de receptores de membrana associados às proteínas heterotriméricas de ligação GTP (proteína G) , foi testado se as proteínas G poderão estar implicadas na sinalização de HMGBl. A toxina pertussis (PT) foi utilizada porque inibe uma subclasse específica de proteínas G, as proteínas Gi/o, e revelou o seu envolvimento na via de sinalização (Baggiolini et al., 1994, Adv. Immunol., 55:97-179; Haribabu et al. , 1999, J. Biol. Chem., 274:37007-37092. mPT, um mutante inactivo de PT, foi utilizado como controlo. As RSMC foram pré-tratadas com PT ou com mPT (50 ng/ml) durante 6 horas, assim estimuladas com HMGBl (100 ng/ml) , BoxA ou BoxB (10 ng/ml) durante 30 minutos. Os ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos como descrito previamente. Os dados representam a média ± SD e o valor de 100% corresponde à migração basal na ausência de qualquer estimulador. Na Figura 6-A é mostrado o efeito inibidor de PT na quimiotaxia induzida por HMGBl. Estes dados sugerem o envolvimento de proteína Gi/o na via de sinalização controlada por HMGBl. Na Figura 6-B é apresenta a 17 reorganização do citoesqueleto, são visualizados os filamentos de actina como descrito anteriormente. Posteriormente, foi investigado se a sinalização induzida por HMGB1 envolve a via da MAP cinase; de facto, sabe-se que estas proteínas são activadas por RAGE, e que desempenham uma função directa na regulação da maquinaria intracelular associada à mobilidade. As RSMC foram pré-tratadas com PD98059 (50 mM) durante uma hora ou não forma pré-tratadas, estimuladas durante 30 minutos com HMGB1 de timo de vitela (100 ng/ml) e coradas com anticorpos específicos contra ERK1/2 fosforiladas (New England Biolabs, Beverly, MA) e DAPI. Uma amostra separada de células foi corada com TRITC-faloidina para visualizar a reorganização do citoesqueleto. Na Figura 7 é apresentado como, num periodo de 30 minutos, a estimulação com HMGB1 induz a activação das proteínas ERK1/2 nas RSMC e induz a sua translocação nuclear; em contraste, as proteínas ERK fosforiladas são dificilmente detectáveis e localizadas no citoplasma, em RSMC não estimuladas. Para além disso, PD98059, o inibidor selectivo de MEK, o regulador a montante de ERK, inibe a fosforilação de ERK induzida por HMGB1 e a translocação nuclear, bem como a migraç°ao das RSMC e a reorganização do citoesqueleto. Consequentemente, estes dados mostram que a via da MAP cinase desempenha uma função essencial na migração celular induzida por HMGB1.

Indução da lesão celular

Considerando o estado da arte, tem sido detectado se as células lesadas ou as células em necrose poderiam libertar HMGB1 para o meio extracelular.

As células HeLa e HUVEC foram induzidas a entrar em necrose por tratamento com 5 μΜ de ionomicina (Sigma) e 20 μΜ CCCP, ou mM deoxyglucose e 10 mM de azida de sódio. Após 16 horas a 37 °C, o número de células que entraram em necrose foi 18 avaliado morfologicamente, e quando se aproximou dos 50% recolheu-se o sobrenadante.

Para análise de Western blot, o meio foi tratado e as células não tratadas foram recolhidas e concentradas 50 vezes utilizando filtros Amicon Ultrafree-MC; as células foram dissolvidas numa amostra de tampão SDS-PAGE.

Para análise de imunofluorescência, as células foram fixadas com PFA 4%, incubadas com anticorpo anti-HMGBl, e coradas com anticorpo secundário e DAPI. A permeabilização das células foi desenvolvida utilizando NP-40 0,1% em PBS. Na Figura 8-A, está representada a análise por Western-blot das proteínas nos sobrenadantes (S) e nos pellets celulares (P), HMGB1 foi recuperado no sobrenadante das células necróticas e das células lesadas. Na Figura 8-B está apresentado o ensaio de imunofluorescência desenvolvido em células HeLa vivas e necróticas, HMGB1 não está associado a restos de células necróticas.

Na Figura 9 são apresentados os resultados dos ensaios de imunohistoquímica, estes dados confirmam que HMGB1 está contido nos núcleos das células endoteliais que constituem as artérias humanas mas não no núcleo das RSMC (Figura 9-A baixa ampliação; Figura 9-B grande ampliação), de facto, muitos núcleos das células do músculo liso contém quantidades indetectáveis de HMGB1 (quadro na Figura 9-B) . Na figura 9-C a análise de Western-blot mostra os níveis de expressão de HMGB1 em RSMC em comparação com as células HeLa, e tal demonstra que as culturas in vitro de RSMC contêm pequenas quantidades de HMGB1 em comparação com as células HeLa.

Todos juntos, estes resultados sugerem que as moléculas de HMGB1 que sinalizam para as células vasculares do músculo liso podem originar simplesmente por necrose ou lesão mecânica das células vizinhas. 19

Em conclusão, os dados experimentais descritos acima, fundamentos da presente invenção, demonstram que a proteína nuclear HMGB1 é um forte mediador de remodelação vascular ocorrendo após a lesão mecânica e/ou a inflamação e pode ser passivamente libertada por células lesadas ou necróticas.

Em particular estes resultados sugerem o que se segue:

HMGB1 ACTUA COMO UM QUIMIOATRAENTE HMGB1 é uma quimioatraente potente como o bFGF ou o fMLP em ensaios quimiotaxicos e ensaios de lesão, e promove alterações do formato celular e da organização o citoesqueleto similares aos observados com pró-urocinases; estes efeitos são especificamente devido a HMGB1 e não aos potenciais contaminantes. Em adição, anticorpos direccionados contra HMGBl inibem os seus efeitos na migração celular, considerando que os anticorpos de controlo não específicos são incapazes de fazê-lo.

LIGAÇÃO A RAGE INICIA A VIA DE SINALIZAÇÃO DE HMGBl EM RSMC

As experiências reportadas anteriormente mostram que o RAGE é expresso em RSMC, e anticorpos anti-RAGE inibem o efeito de HMGBl em RSMC.

Foi confirmado que as MAP cinases estão envolvidas na migração celular de RSMC induzida por HMGBl, desde ERK1/2 sejam fosforiladas e translocadas para o núcleo celular por estimulação de HMGBl, e o inibidor MEK PD98059 é capaz de bloquear a migração celular induzida por HMGBl. Os resultados indicam também que a proteína Gi/o está envolvida no processo o qual é activado por HMGBl, desde que a migração celular induzida por HMGBl possa se bloqueada pela toxina Bordetella pertussis. As proteínas G 20 são normalmente associadas a receptores setetransmenbrana-elix (7TM), mas até agora nenhuma associação directa entre RAGE e a proteína G tem sido descrita. Até agora, desconhece-se se HMGB1 necessita de se ligar ao receptor 7TM/receptor proteína G para além do RAGE, ou se a proteína G está envolvida a jusante do RAGE, ou num mecanismo de feedback. FUNÇÃO PARÁCRINA DE HMGB1 HMGB1 é libertado de uma forma irregular, o que significa por estimulação com citocinas ou lipopolisacarídeos, quando as células estão mecanicamente lesadas ou entraram em necrose. Assim, HMGB1 pode sinalizar a lesão ou destruir uma célula individual para a célula vizinha de uma forma parácrina. As células que respondem a HMGB1 extracelular aparentam conter elas próprias muito pouca HMGBl, e praticamente nenhum no núcleo. As RSMC contêm muito pouca HMGBl comparado com as células HeLa ou com as células endoteliais, e a pouca HMGBl que contêm está principalmente localizada no citoplasma. As RSMC migrantes tendem para concentrar HMGBl na sua superfície em redor da célula. Isto pode-se supor que as células sensíveis a HMGBl poderão conter pouca HMGBl para reduzir a possibilidade de respostas inadequadas às suas próprias HMGBl. A concentração de HMGBl em redor das células migrantes pode evocar respostas induzidas por HMGBl nas células vizinhas: deslocalização de moléculas envolvidas na migração celular, tais como integrinas, o receptor urocinase, ou c-Src, é uma característica associada à mobilidade de RSMC. A migração envolve também a activação de proteases extracelulares, e a interacção entre HMGBl e o sistema de activação do plasminogénio pode facilitar a migração celular dentro da matriz extracelular. 21

O PAPEL DE HMGB1 NAS VASCULOPATIAS A sensibilidade das células do músculo liso para HMGBl, a observação de que as células endoteliais contêm elevadas quantidades de HMGB1 enquanto as células vasculares SMC contêm menos, e a libertação de HMGB1 de células que se encontram em lesão mecânica, todos os resultados acima descritos apontam para a possível função de HMGB1 durante a remodelação do tecido que ocorre na aterosclerose e na estenose recorrente.

Os resultados experimentais específicos descritos anteriormente permitiram identificar as moléculas, objecto desta invenção, capazes de inibir a interacção entre HMGB1 e o receptor RAGE; estas moléculas estão classificadas, considerando a sua estrutura e características funcionais, como se apresenta seguidamente: 1. Antagonistas de HMGBl: fragmentos de HMGBl, análogos de HMG box, os quais podem ser mais efectivos do que a molécula de comprimento total, e proteínas contendo domínios de HMG box, os dois últimos são ambos capazes de se ligar ao receptor RAGE . 2. Inibidores de HMGBl: moléculas, como anticorpos ou fragmentos de anticorpo e junções de Holliday, os quais se ligam a domínios HMG box e evitam a ligação de HMGBl ao RAGE.

Estas moléculas são vantajosamente utilizadas para preparações farmacológicas que previnam, retardem ou minimizem aterosclerose e/ou estenose recorrente após lesões vasculares epiteliais, incluindo aqueles eventos que ocorrem após uma angioplastia.

Para além do mais, os inventores da presente da presente invenção demonstraram que HMGBl tem um forte efeito biológico em fibroblastos embriónicos de rato. É sabido que 22 os fibroblastos são os principais componentes celulares do tecido conjuntivo e são responsáveis pela síntese e manutenção da matriz extracelular conjuntiva. Mais particularmente, HMGBl actua in vitro como um potente quimioatraente para fibroblastos e os anticorpos anti-RAGE bloqueiam o referido efeito.

Consequentemente, qualquer tipo de moléculas que apresentem homologia com HMGBl pode ser utilizado, como a proteína no seu comprimento total, para a preparação de agentes farmacológicos que regulem positivamente, assim facilita e/ou induz a migração celular dos fibroblastos. Da mesma forma, qualquer tipo de moléculas capazes d bloquear a interacção entre HMGBl e o seu receptor RAGE (i.e. todas as moléculas pertencentes ao grupo de inibidores: anticorpos ou fragmentos de anticorpos, junção de Holliday; e todas as moléculas pertencentes ao grupo de antagonistas HMG box: fragmentos de HMGBl, moléculas contendo o domínio HMG box) pode ser utilizada eficientemente para a produção d agentes farmacológicos de forma a evitar, retardar ou reduzir a regeneração de tecidos conjuntivos.

Um objectivo adicional da presente invenção é a utilização de HMGBl, fragmentos de HMGBl correspondentes a HMG box, domínios de HMG box de outras proteínas pertencentes à família HMG-box e outras proteínas da família HMG-box, para a preparação de agentes terapêuticos que facilitem e/ou induzam a migração de fibroblastos e consequentemente regulem positivamente a regeneração de tecidos conjuntivos. É uma parte integral da presente invenção a utilização de todas as moléculas, antagonistas e/ou inibidores, que inibam a interacção entre HMGBl e o receptor RAGE, para a preparação de agentes terapêuticos que reduzam, retardem, e evitem a regeneração dos tecidos conjuntivos, como focaliza as experiências que se seguem. 23

ENSAIO QUIMIOTÁXICO EM FIBROBLASTOS

Ensaios quimiotáxicos foram desenvolvidos utilizando protocolos bem conhecidos (Degryse et al., 1999, Blood, 94: 649-662). Câmaras de Boyden modificadas foram utilizadas com filtro com tamanho de poro de 0,5 μΜ (Corning, Acton, MA) e tratada com colagéneo I (100 μg/ml em ácido acético 0,5 M) e fibronectina (10 μg/ml) (Roche). Fibroblastos embriónicos de rato foram cultivados seguindo protocolos conhecidos (Calogero et al., 1999, Nat. Genet., 22:276-280) e após 24 horas de cultura sem soro, uma amostra de 20.000-40.000 células foi adicionada ao poço superior da câmara Boyden. HMGB1 recombinante expressa em E.coli foi diluída no mesmo meio sem soro e adicionada ao poço inferior. Anticorpos anti-RAGE (1000 ng/ml) (gentilmente cedido por Dr. A.M. Schimdt, Columbia University, NY) foram adicionados em ambos os poços. A migração celular overnight ocorreu a 37 °C, em seguida as células restantes na superfície superior dos filtros foram fixadas com metanol e coradas numa solução de violeta cristal 10% em metanol 20%. Todas as experiências foram desenvolvidas pelo menos duas vezes em triplicado.

Os resultados, como mostrado na figura 10 são a média ± SD do número de células contadas em 10 campos de alta ampliação por filtro e expressas como o dobro dos controlos não tratados. À migração celular aleatória (i.e. migração na ausência de quimioatraente) foi dado o valor arbitrário de 100%. A análise estatística foi desenvolvida utilizando o modelo ANOVA para a avaliação dos tratamentos com doses crescentes de um reagente. HMGB1 recombinante expressa em E.coli estimula a migração de fibroblastos de uma forma dependente da concentração, começando com doses tão baixas quanto 0,1 ng/ml e com uma resposta máxima de 100 ng/ml, a doses mais elevadas (1000 24 ng/ml) a resposta é inferior à resposta do controlo. Anticorpos anti-RAGE (1000 ng/ml) bloqueiam totalmente a resposta migratória (lado direito do gráfico na Figura 10) mostrando que tal é especificamente devido a HMGB1.

O PAPEL DE HMGB1 NA REGULAÇÃO DA REGENERAÇÃO DO TECIDO CONJUNTIVO A sensibilidade dos fibroblastos a HMGB1 aponta para a possivel função de HMGB1 durante a remodelação dos tecidos conjuntivos que ocorra após lesões derivadas de eventos traumáticos ou cirurgia. Além disso, o facto dos anticorpos anti-RAGE bloquearem a referida resposta demonstra que a interacção entre HMGB1 e o receptor RAGE na superfície celular é o evento principal para a sensibilidade do fibroblasto para HMGB1.

Em conclusão: - HMGB1 e/ou fragmentos de HMGB1 correspondente a HMG boc, domínios de HMG-box de outras proteínas pertencentes à família HMG-box e outras proteínas da família HMG-box são vantajosamente utilizadas para preparações farmacológicas que regulem positivamente, i.e. facilitem e/ou induzam a regeneração dos tecidos conjuntivos. - qualquer tipo de molécula capaz de inibir a interacção entre HMGB1 e RAGE, pertencendo a um grupo antagonista, (capaz de se ligar ao receptor RAGE), e pertencendo ao grupo de inibidores (i.e. capazes de ligar o domínio HMG box bloqueando a ligação HMGB1 ao receptor RAGE) são vantajosamente utilizados em preparações que regulem negativamente, isto é bloquear, retardar ou reduzir a regeneração dos tecidos conjuntivos) 25

Claims (6)

1. Reivindicações 1. Utilização de um antagonista de HMGBl e de moléculas inibidoras em que a molécula é seleccionada de um grupo constituído por um anticorpo contra HMGBl, ou um fragmento de anticorpo, uma junção de Holliday, ou um fragmento de HMGBl que concorre com HMGBl pela ligação a um receptor e inibe a activação do receptor, para a preparação de agentes terapêuticos para o tratamento da estenose recorrente e/ou aterosclerose.
2. 2. A utilização de moléculas de acordo com a reivindicação 1 em que a estenose recorrente compreende uma estenose que ocorra durante a angioplastia.
3. 3. A utilização de moléculas de acordo com uma ou mais reivindicações anteriores em que as referidas moléculas são libertadas por cateteres, instrumentos cirúrgicos ou stent para angioplastia.
4. 4. A utilização da molécula de HMGBl para a preparação de agentes terapêuticos que promovam a regeneração do tecido conjuntivo.
5. 5. A utilização da molécula de HMGBl para a preparação de agentes terapêuticos que promovam a cicatrização da ferida.
6. 6. A utilização de antagonista de HMGBl e moléculas inibidoras em que a molécula é seleccionada a partir de um grupo que consiste num anticorpo contra HMGBl, ou um fragmento de anticorpo, ou a junção de holliday, ou um fragmento de HMGBl para a preparação de agentes terapêuticos que retardem ou reduzam ou bloqueiem a regeneração do tecido conjuntivo. 1 EP 1 368 060 B1 cell migration (% of control) cell migration (% of control) 300

   0 0.1 1 10 100 1000 calf thymus HMG1 (ng/ml)

   Control- HMG1 ct I00ng/rnl HMG1 fMLP bFGF yeast. o.l μΜ S0 ng/ml 100 ng/ml 200 100 0

   unspecificAb anti-HMG1 2 ug/m! 2 yg/ml 0 0.1 1 10 100 1000 vesst recombinat HMG1 (•iS/ml) Figure 1 12 ΕΡ 1 368 060 Β1

   Figure 2 13 ΕΡ 1 368 060 Β1

   Figure 3

   Figure 4 14

   RAGC^Sif 3¾ HMG1 2? '“'rrít&f—.<- B Cell migration (% of control) eontrol

   +HMG1 +anli-RAG£ +HMG1 +unspecific +anli-RAGE + HMG1 + ariti-HMG1 EP 1 368 060 B1 ®SI*SikDa pg§|p|;-47 tt"" 35 jfJJf-25 Figure 5 cetl migration (% oí control)

   t-0 t = 30~nriin. Figure 6 15 ΕΡ 1 368 060 Β1

   16 ΕΡ 1 368 060 Β1

   DAPI HMG-1 Β live cell

   necrotie cell

   Figure 8

   Figure 9 17 ΕΡ 1 368 060 Β1

   (iqj^uoo ίο %} uojieiBjUJ neo ο ω Ι_ =5 D)ΰΖ 18