KR101598092B1 - 치료제로서의 크로몬 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생산의 상향-조절시킬 수 있는, 식물 공급원으로부터의 크로몬 및 신규 크로몬 조성물의 동정 및 분리 및 사실상 수백 개의 글루코오스 및 지방산 대사 및 신호 경로 관련 유전자의 표준화를 기술한다. 크로몬 조성물은 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생산을 증진시키고, 지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물 대사에 관여하는 유전자를 조절하는 데 효과적이다. 크로몬 조성물은 포유 동물에서 인슐린 감수성을 증가시키고, 글루코오스 내성을 개선시키고, 트리글리세리드 수준을 더 낮추고, 글루코오스 수준의 균형을 잡는 데 사용될 수 있다. 인슐린 저항성, 내당력, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 질환 및 증상의 예방 및 치료 방법이 본 발명에 포함된다.

Description

치료제로서의 크로몬{CHROMONES AS THERAPEUTIC AGENTS}
본 발명은 일반적으로 지방 세포에 의한 아디포넥틴(adiponectin) 생산을 증진시키고, 지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물(xenobiotic) 대사에 관여하는 유전자를 조절하는 데 효과적인 크로몬 및 신규 크로몬 조성물의 분리 및 동정에 관한 것이다. 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증의 예방 및 치료 방법이 포함된다.
비만, 당뇨병 및 대사 증후군은 세계적으로 빠르게 유행되고 있다. 세계 보건 기구(WHO)의 2005년 공개에 따르면, 대략 4억 명의 성인이 비만이고, 2015년까지 7억 명 넘는 성인이 비만일 것이라고 예상했다. 비만은 심혈관 질환 및 당뇨병을 포함하는 수많은 만성 질환에 대한 주요 위험 인자이다.
대사 증후군은 1988년에 Reaven(Reaven (1988) Diabetes 37:1595-1607)에 의해 비만, 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 고혈압 및 이상지질혈증(고중성지방혈증 및 낮은 HDL 콜레스테롤 수준)을 포함하는 상호 관련된 공통의 임상적 장애의 무리로서 처음 기술되었다. 국가 콜레스테롤 교육 프로그램의 성인 치료 패널 III(ATP III)은 2001년에 대사 증후군을 진단하기 위한 기준을 확립하였다(JAMA (2001) 285:2486-249797). 복부 비만, 공복 혈당 장애, 높은 트리글리세리드(TG), 낮은 HDL 콜레스테롤(HDL-C) 농도 및 혈압 증가를 포함하는, 대사 증후군이 있는 개체를 확인하기 위한 다섯 개의 기준이 ATP III에 의하여 선택되었다. 이들 구성 요소 중 임의의 3개가 개체에 존재하는 경우 대사 증후군으로 진단하였다. 대사 증후군은 전세계적으로 널리 퍼져 있으며, 그의 임의의 개별 구성 요소보다 아테롬성 심혈관 질환의 더 큰 위험과 연관된다.
제3차 국가 보건 및 영양 조사(1988-1994)로부터의 20살 이상의 8814명의 남성 및 여성의 데이터의 분석으로, 대사 증후군의 미조정 및 연령-조정된 유병률이 각각 21.8% 및 23.7%인 것으로 나타났다. 2000년 인구 조사 데이터를 이용하여, 약 4천 7백만 명의 미국 거주자가 대사 증후군을 가질 것이다(Ford et al. (2002) JAMA 16:359). 비만 유아 및 청소년에서, 대사 증후군의 유병률은 매우 높고 비만의 중증도와 함께 증가하며, 심각한 비만 젊은이에서 50%에 도달한다(Weiss et al. (2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362-2374). 심혈관의 불리한 결과의 위험 증가에 대한 생물지표가 이미 이들 젊은이들에게 나타났다. 대사 증후군 및 이의 개별의 구성 요소가 비만 집단에서 발견될 뿐만 아니라, 정상 체중과 약간 과체중인 개체에서도 또한 관찰되었다.
납득할만한 증거는 인슐린 저항성이 대사 장애의 문제의 근본임을 제안하였다(Reaven GM. (1998) Diabetes 37:1595-1607). 대사 증후군의 유병률은 인종 또는 민족 및 비만도에 대한 조정 후에, 인슐린 저항성 증가와 함께 유의적으로 증가 하였다(동향에 대하여 P<0.001) (Weiss et al. (2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362-2374). 인슐린 저항성은 인슐린의 정상 순환 농도에 대하여 반응성이 감소된 상태이며(Saltiel AR (2000) J Clin. Invest. 106:163-164), 2형 당뇨병의 주요한 병인이다. 인슐린 저항성은 비만, 생활 양식 인자 및 유전 인자와 관련된다(Kadowaki T (2000) J Clin. Invest. 106:459-465; Stern M (2000) J Clin. Invest. 106:323-327). 동물 연구는 인슐린 수용체 및 인슐린 신호 경로의 유전적 결함이 2형 당뇨병에서 인슐린 저항성의 병인에 관여한다는 것을 명확하게 나타냈다. 예를 들어, 인슐린 활성의 결함은 인슐린 수용체 낙아웃(knockout) 마우스의 근육, 간 및 지방 조직에서 명백하였다. 이들 마우스는 또한 고인슐린혈증 및 심각한 당뇨병을 나타내었다. 인슐린 신호 전달 캐스케이드(cascade)에서 주요한 신호 효소인 PI3 키나아제(PI3K)의 활성이 증가된 마우스는 골격근 및 지방 세포에서 글루코오스 수송의 증가에 기인하여 인슐린 감수성의 증가 및 저혈당증을 나타내었다(Kadowaki T (2000) J Clin. Invest. 106:459-465). 유사하게, PI3K의 키나아제 다운스트림인 Akt2에 결함이 있는 마우스는 인슐린 저항성 감소 및 근육의 글루코오스 수송 증가를 나타내었다(Cho et al. 2001 Science 292:1728).
인간에서 인슐린 저항성 및 당뇨병의 유전 기초 및 생리학에 대한 최근의 연구가 풍부하다. PPAR 감마2-specofoc B 엑손에서 부분적 "기능 손실" Pro 12Ala 돌연변이가 있는 대상은 더 낮은 BMI, 더 큰 인슐린 감수성 및 개선된 지질 프로필의 조합을 가진다(Deeb et al. (1998) Nat Genet 20:284-287; Alhuler et al. (2000) Nat Genet 26:76-80). Pro12Ala 다형성의 생리적 결과는 혼동되는 유전 및 환경 인자에 크게 의존한다. Pro115Gln 기능 획득 돌연변이가 있는 대상은 극도로 비만이며 인슐린 감수성이었고(Ristow et al. (1998) N Engl J Med 339:953-959), 이는 지방 세포 분화를 자극하는 데에서 PPARγ의 효과와 일치한다. 반면, 우성-음성(dominant-negative) 돌연변이, 이를 테면 Pro495Leu, Val318Met, Phe388Leu 및 Arg425Cys는 부분 지방이영양증, 중증 인슐린 저항성, 당뇨병 및 고혈압과 관련된다(Savage et al. (2003) Diabetes 52:910-917; Agawal and Garg (2002) J Clin Endocrinol Metab 87:408-411).
인간 유전 질환인, 연소자의 성인발증형 당뇨병(MODY)은 25세 이전에 당뇨병의 임상적인 발병, 보통 염색체 우성 유전 방식 및 이자 β 세포 기능의 주된 결함을 특징으로 한다. 여섯 개의 MODY 유전자를 동정하였다: MODY1, 간세포 핵 인자-4α(HNF-4α); M0DY2, 글루코키나아제; M0DY3, HNF-1α, M0DY4, 인슐린 프로모터 인자-1(IPF-1); M0DY5, HNF-1β; 및 M0DY6, 베타-세포 E-박스 트랜스액티베이터(transactivator) 또는 NeuroD1(Fajans et al. (2001) N Engl J Med 345:971). MODY 유전자는 비정상적 유전자 발현과 β 세포 기능 장애를 유발하는 이자 β 세포에서의 글루코오스 대사에 관여한다.
II형 당뇨병은 복합성 및 이질성, 다원적인 질환이다. 당뇨병 병리 생리학에 관하여 유익하지만, MODY의 드문 단일 유전자 형태는 인간 당뇨병 병인의 스펙트럼을 포괄할 수 없다. 유전적 다형성을 사용하여 다양한 민감한 인종 집단 중에서 당뇨병 및 인슐린 저항성 유전자 자리를 찾기 위하여 인간 게놈 전체 스캔이 많 은 유전 연구 그룹에 의해 사용되었다(McIntyre and Walker (2002) Clin Endocrinol 57:303). 염색체 15 상의 칼파인-10 유전자는 텍사스에서 멕시코-미국 인종 그룹의 혈연관계가 있는 252개의 쌍에 게놈 전체 스캔을 사용하여 처음 동정된 유전자였으며, 이후에 다른 인종 그룹의 연구를 사용하여 확인하였다. 임상 연구는 칼파인-10이 근육 조직에서의 인슐린의 활동과 이자 β 세포로부터의 인슐린 분비에 영향을 미치는 인자 중 하나라는 것을 제안하였다. 칼파인-10이 결여된 마우스에서의 연구는 칼파인-10이 인슐린-분비 이자 β 세포에서 지방산-유도된 세포 자멸사를 매개한다는 것을 제안하였다(Horikawa et al. (2000) Nat Genet 26:163; Weedon et al. (2003) Am J Hum Genet 73:1208). 인간 당뇨병 유전자에 대한 검색이 끝나지 않았으며, 염색체 16 상의 FTO가 최근 발견되었다. 알려지지 않은 기능을 지닌 FTO는 BMI와 연관되며, 39,000 명의 다양한 당뇨병 연구 집단에서 확인하였다(Kaiser (2007) Science 316:185). 또한, 후보 유전자의 관련성 연구에 의하여, KCNJ11(β-세포 ATP-감수성 칼륨 채널의 내향-정류기(inward-rectifier) 서브유닛) 및 HNF-4α 유전자가 NIDDM 유전자인 것을 발견하였다(Taylor (2007) Diabetes 56:2844).
유리 지방산(FFA)은 아마도 인슐린 저항성의 병리 생리학에서의 가장 중요한 인자일 것이다. 근육 글리코겐 합성, 글루코오스 흡수 및 글루코오스-6-포스페이트 농도를 추적하기 위하여 13C, 31P 및 1H 동위원소를 사용한 비-침습적인 자기 공명 분광법이 예일 대학(Yale University)에서 슐만 그룹(Shulman's group)에 의하 여 임상 연구에서 사용되었다. 정상혈당 고인슐린 클램프(hyperinsulinemic-euglycemic clamp) 하에서의 건강한 인간 대상에서, 높은 혈중 FFA 수준을 유지하기 위한 지질 주입을 사용하여, 지질 주입 4 내지 6 시간 후에, 인슐린 저항성이 점차 발생하였으며, 근육 글리코겐 합성 및 글루코오스 산화가 50% 감소하였고 인슐린-자극된 근육의 글루코오스 흡수가 50% 감소하였으며, 인슐린-자극 IRS-1-관련 PI3K 활성의 >90% 감소를 동반하였다(Roden et al. (1996) J Clin Invest 97:2859; Dresner et al. (1999) J Clin Invest 103:253).
퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR)는 핵 수용체 슈퍼-패밀리의 하위 분류이다. PPAR은 레티노이드 X 수용체와 함께 헤테로다이머로서 특정 DNA 반응 요소에 결합하는 리간드-의존성 전사 인자이다. 이 리간드 결합은 크로마틴-탈압축 보조자극자 복합체의 선택적인 동원을 유발하며, 보조억인자 복합체의 해산을 돕는다(Glass (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:10.1172/JCI129713). 또한, PPAR은 다른 전사 인자와의 경쟁을 통하여 유전자 발현에 간접적으로, 그리고 통상 부정적으로 영향을 미칠 수 있다(Gervois et al. (2001). J. Biol. Chem. 276:33471-33477). PPAR 패밀리에 3개의 구성원이 있다: PPARα, PPARδ(또는 PPARβ) 및 PPARγ. 많은 실험적 증거가 세개의 핵 수용체를 지질 및 탄수화물 대사의 조절 및 조정과 연결시킨다. 세 단백질과 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 및 염증을 포함하는 다양한 질환의 연관성이 잘 확립되어 있다. 세 PPAR은 상이한 조직에서 다르게 발현된다(Semple et al. (2006). J. Clin. Invest. 116:556-560 doi: 10.1172/JCI128003). PPARα는 간, 신장 및 심장에서 가장 많이 발현된다. PPARγ는 지방 조직 및 대식구에서 선택적으로 발현된다. PPARδ의 발현은 넓게 퍼져있으나, 지방 조직, 피부 및 뇌에서 가장 많이 발현된다. 세 핵 수용체는 다양한 세포 과정에 관여한다. PPARα와 PPARδ의 활성화는 지방산 β 산화를 증가시킨다. PPARα는 지단백질 합성과 아미노산 이화 작용에 연루된다. PPARγ는 지방 세포 분화에 중요하다. 단백질은 상이한 생리학적 기능을 갖는다. PPARα는 공복에 대한 조직의 대사 반응을 조정하나, PPARγ의 발현은 식후 증가하고 이의 활성화는 지방 조직에서의 지방산 흡수를 매개하는 유전자의 상향-조절을 유발한다. PPARγ는 지방 세포 분화를 조정하는 주요 전사 인자이다. PPARδ의 생리적 작용은 완전하게 밝혀지지 않았다. 그러나 최근의 증거는 이것이 근육 섬유 유형의 조절자일 수 있으며, 단백질의 활성화가 비만에 대한 저항성과 대사 프로필의 개선을 유발하는 것을 나타낸다(Wang et al. (2004). PloS Biology 2:e294).
다수의 경로가 인슐린 저항성에 수반될 수 있다. 지방 조직에서 PPARγ 활성화는 지방산 트랩핑(trapping)에 수반되는 유전자의 전사를 상향 조절한다(Semple et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:10.1172/JCI128003). PPARγ는 내피 지단백질 리파아제(LPL) 및 지방산 수송 단백질(FATP 및 CD36)을 활성화시키며, 이는 각각 지단백질 트리글리세리드의 가수분해 및 지방 세포로의 FFA의 흡수를 증진시킨다. 상기 과정은 순환 지질과 지질의 근육 및 간과 같은 인슐린 감수성 조직으로의 직접적인 접근을 감소시킴으로써 인슐린 감수성을 증진시킨다((Semple et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:10.1172/JCI128003). PPARγ은 잘 특성화되어 있다. PPARγ의 필수적인 역할은 동형 접합 PPARγ-결함 마우스의 배아 치사율에서 나타났다(Tsuchida et al. (2005) J Pharmacol. Sci. 97: 164-170). 야생형 마우스에서, 비만 및 인슐린 저항성은 고지방 식이에 의해 유도될 수 있다. 그러나 고지방 식이 유도된 비만 또는 인슐린 저항성은 이형 접합 PPARγ-결함 마우스에서 방지되었다(Tsuchida et al. (2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170). 예를 들어, 이형 접합 PPARγ (+/-) 마우스에 고지방 식이를 급식시키면, 이 마우스는 야생형 마우스보다 인슐린 저항성이 덜하고, 더 작은 지방 세포를 가진다. 이 마우스는 혈장 중에 지방산의 수준이 더 낮아졌으며, 렙틴의 수준이 더 증가하였다(Kubota et al. (1999) Mol Cell 4:597-609; Tsuchida et al. (2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170). 그러나 이형 접합 PPARγ-결함의 보호 효과는 마우스를 PPARγ 작용제로 처리함으로써 감소되었다. 인슐린 감작 약물의 티아졸리딘디온(TZD) 분류(Lehmann et al. (1995). J. Biol. Chem. 270:12953-12956)는 역설적이지만, PPARγ (+/-) 마우스의 인슐린 감수성을 감소시킨다. 이들 결과는 PPARγ가 고지방 식이 유도된 비만 및 인슐린 저항성을 매개하며, PPARγ의 억제가 동물, 또는 인간이 인슐린 저항성의 내인성 및 외인성 원인에 덜 민감하게 할 수 있는 것을 나타낸다. 반면, 고지방 식이를 급식한 야생형 마우스에서 TZD에 의한 PPARγ의 초-생리학적 활성화는 또한 인슐린 감수성을 개선시키는 동시에 지방 세포의 분화를 유도한다. 실험적 증거는 PPARγ 활성의 하향-조절 및 상향-조절이 인슐린 감수성을 개선시키는 것을 나타내었다.
PPARα는 내인성 지방산 및 이들의 유도체의 분자 센서이다. 이는 간 및 골 격근에서의 글루코오스 항상성 및 지질 대사에 중요한 역할을 수행한다. PPARα 작용제, 이를 테면 피브레이트가 지질을 낮추는 데 유효한 것으로 나타났다(Lefebvre et al. (2006). J. Clin. Invest. 116:571-580. doi:10.1172/JCI27989). 설치류에서, PPARα 작용제인 Wy 14643는 KKAy 마우스에서 인슐린 감수성을 개선시키고, PPARγ 작용제 로지글리타존의 항-당뇨병 효과를 증진시켰다(Tsuchida et al. (2005) Diabetes 54:3358-3370). 지방 세포 비대는 Wyl4643에 의해 예방되었다(Tsuchida et al. (2005) Diabetes. 54:3358-3370).
PPARδ는 최근 지방, 골격근 및 심장을 포함한 다양한 조직에서의 대사 조절제로 판명되었다(Barish et al. (2006) J. Clin. Invest. 116: 590-597). 이는 지방산 이화 작용 및 에너지 언커플링(uncoupling)을 증진시키고, 이는 트리글리세리드 저장의 감소와 내구성의 개선을 유발한다. 마우스의 골격근에서 PPARδ의 활성화된 형태의 표적화된 발현은 개선된 대사 프로필을 가지고 비만에 대한 저항성을 부여한다(Wang et al. (2004). PloS Biology 2:1532-1539).
신체에서 PPAR 활성을 조절하는 것은 식이 및 다른 환경적 영향에 대한 반응에서 정상 인슐린 감수성을 유지하는 데 중요하다. 마우스의 유전자 연구는 핵 수용체와 환경 인자의 복잡한 상호작용을 이해할 기회를 제공했다. PPAR 활성은 상이한 조절제에 의하여 조절될 수 있다. PPAR은 상이한 리간드들과 상호작용하여, 상이한 세트의 표적 유전자의 활성화를 유발한다. 결과적으로, PPAR에 대한 조절제의 상이한 친화도와 효과에 기인하여 상이한 전사 활성 및 약리학적 프로필이 생성된다. PPAR의 조절제는 완전 작용제, 부분 작용제, 길항제 및 보조작용 제(coagonist)를 포함하는 몇 개의 그룹으로 나뉠 수 있다(Knouff and Auwerx (2004) Endocrine Review 25:899-918).
많은 PPAR 완전 작용제가 개발되었다. 로지글리타존 및 피오글리테아존은 2형 당뇨병의 치료에 임상적으로 사용되는 두 TZD이다(Lehmann et al. (1995) J Biol. Chem 270:12953-12956). 이들 PPARγ 작용제가 인슐린 저항성을 감소시키고, 혈장 글루코오스 수준을 낮추나, 완전 작용제는 최대 15%의 환자에서 지방량 증가에 기인한 체중 증가 및 부종, 유체 정체, 혈액 희석 및 심부전을 포함하는 심각한 부작용을 갖는다(Mudaliar et al. (2003). Endocr. Pract. 9:406-416). 또한 몇몇 TZD는 상당한 간 독성과 관련된다. 대사 증후군의 다양한 면을 예방 또는 치료하는 약물 치료법은 새로운 분자 약물 표적이 활발히 추구되지만, 선택과 성공률이 제한된다.
다른 인슐린 감작 경로는 TNFα, IL-6, CRP, PAI-1, 앤지오텐시노겐, 레지스틴, 렙틴 및 아디포넥틴을 포함하는 지방 세포로부터 생성된 변형된 프로필의 아디포카인(adipokine)을 수반한다(Lau et al. (2004). Am. J. Physiol Heart Cir. Physiol 288:H2031-H2041). 이들 아디포카인은 인슐린 저항성 및 및 혈관 항상성에 많은 영향을 미친다. 이들 단백질 중, 아디포넥틴은 인슐린 감작을 매개하는, 지방 세포로부터 가장 잘-특성화된 호르몬 중 하나이다. TZD는 비만 마우스 및 인슐린 저항성 비만 인간에서 아디포넥틴의 유전자 발현을 자극하고, 순환하는 아디포넥틴 농도를 증가시킨다(Maeda et al. (2001) Diabetes 50:2094-2099). 아디포넥틴이 인슐린 감수성을 증가시킴으로써 내당력을 개선시키기 때문에, 아디포넥틴 분비에서 TZD의 효과는 적어도 부분적으로, 2형 당뇨병이 있는 환자에서 TZD의 혈당강하 효과를 설명할 수 있다.
추가의 경로가 인간의 인슐린 감작에 수반된다. 예를 들어, 렙틴도 설치류에서 인슐린 감수성을 개선시키는 것으로 보인다. 지방위축(lipoatropic) 마우스에서, 아디포넥틴 및 렙틴의 생리적 용량의 병용 투여는 인슐린 감수성의 완전한 회복을 유발하나, 개별적인 아디포넥틴 또는 렙틴의 처리에 의해서는 부분적인 인슐린 감수성만이 관찰되었다(Yamauchi et al. (2001). Nat Med 7:941-946). 렙틴은 지방생성 효소의 발현을 감소시키며, 결과적으로 간, 갈색 지방 조직 및 골격근에서 PPARα 경로를 활성화시키고, UCP-2와 베타-산화에 관여하는 효소의 발현을 증가시킨다. 인간에서, 혈장 아디포넥틴 농도는 인슐린 감수성이 개선된 개체에서 체중 감소에 의하여 변화하지 않았다(Abbasi et al. (2004) Metabolism 53:280-283). 또 다른 연구에서, 운동 훈련에 의한 인슐린 감수성의 개선이 인간의 아디포넥틴 수준의 변화의 결과가 아님이 나타났다(Marcell et al. (2005), Metabolism 54:533-41). 이 데이터는 인슐린 감작을 위한 추가의 경로가 존재하고, 체중 감소 및 TZD 화합물로 처리한 후에 상이한 기작이 인슐린 감수성의 개선에 관여하는 것을 제안한다.
크로몬은 그들의 주요 골격 구조로서 하기 일반식으로 나타낸 벤조피란-4-온을 갖는 방향족 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합 크로몬의 특정 유형이다:
Figure 112009048406599-pct00001
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 -H, -OH, -CH3, -SH, 알킬, 알케닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택된 에스테르; 및 헥소오스 또는 펜토오스로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되며, 여기에서 헥소오스 또는 펜토오스는 탄소, 질소, 황 또는 산소에 의해 크로몬에 연결되며, 헥소오스 또는 펜토오스는 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택되고;
알킬 및/또는 알케닐 그룹은 이중 결합과 -OH, =0 및 -OR로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 그룹(들)을 상이한 위치에서 갖거나/갖지 않는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 및/또는 분지쇄이며;
X는 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 탄산염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 반대 음이온의 그룹으로부터 선택되며;
R은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹이다.
지금까지 오직 183개의 크로몬만이 자연 공급원으로부터 분리되었다(The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001).
크로몬은 모노아민 옥시다아제 억제 활성(Fujimoto et al. (2002) Chem. Pharm. Bull. 50:330-336), 티로시나아제 억제 활성(Oiao et al. (2002) Chem. Pharm. Bull. 50:309-311), 항-혈소판 효과(Leoncini et al. (1991) Pharmacol. Res. 23:139-148), 경구 병원체에 대한 성장 억제 활성(Cai (1996) J. Nat. Prod. 59:987-990), 프로스타글란딘 H 신타아제 억제 활성(Jurenka et al. (1989) Comp. Biochem. 93:253-255)을 보유한다. 크로몬은 또한 랫트에서 II형 콜라겐-유도된 관절염에 대하여 치료적 효능(Inaba et al. (2000) Chem. Pharm. Bull. 48:131-139) 및 저지질혈 활성을 보유한다(Witiak et al. (1975) J. Med. Chem. 18:935-942; Tetko et al. (1995) Bioorg Khim. 21:809-815). 또한 크로몬이 선택적 시그마 수용체 리간드로서 작용할 수 있음이 기록되었다(Erickson et al. (1992) J. Med. Chem. 35:1526-1535). 동물 연구에 기초하여, 크로몬은 용이하게 흡수되며, 대사되고(Crew et al. (1976) Xenobiotica 6:89-100), 알로에신의 c-글루코실 결합은 인간 창자 박테리아에 의해 절단될 수 있다(Che et al. (1991) Chem. Pharm. Bull. 39:704-708).
알로에는 많은 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 복잡한 식물이다(Dagne et al. (2000) Current Org. Chem. 4:1055-1078; Cohen et al. in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects, 1st ed. WB Saunders, Philadelphia (1992)). 300 종이 넘는 알로에가 알려져 있으며, 이 중 대부분은 아프리카 자생종이다. 연구는 생물학적 활성 물질들이 알로에 잎의 개별부 - 잎 중앙에 존재하는 투명한 겔 필렛(fillet), 잎 외피(rind) 또는 잎의 피층(cortex), 및 잎 외피와 내부 겔 필렛 사이에 존재하는 관다발의 내초 세포에 함유된 황색 유체(알로에 라텍스로 호칭됨)에 존재함을 보여준다(Dagne et al. (2000) Current Org. Chem. 4: 1055-1078). 잎의 중앙에 위치하는 투명한 겔 필렛은 수용성 다당류, 유기산, 아미노산 및 무기 염을 함유한다. 알로에 베라 겔은 알로에 식물의 이러한 부분으로부터 생성된다. 잎 외피 또는 잎의 피층 및 관다발의 내초 섬유 세포(pericyclic cell)에 함유되는 황색 유체는 안트라퀴논, 크로몬, 유기산, 효소, 비타민, 염 및 다른 각종 화합물과 같은 방향족 화합물을 함유한다. 알로에 잎 전체 겔은 안트라퀴논, 크로몬, 다당류 및 다른 화합물을 포함하는 모든 수용성 성분의 내용물을 포함하는 전체 알로에 식물을 갈아서 생성된다. 안트라퀴논의 색상 및 광독성, GI 자극, 세포독성 및 다른 부작용 때문에, 알로에 잎 전체 겔을 처리하여 안트라퀴논 및 크로몬을 포함하는 모든 방향족 성분을 제거한다(International J. Toxicology (2007), 26 (suppl.2):1-50).
과거에, 알로에 제품은 화상, 궤양(sore) 및 기타 상처의 치료를 위한 피부과 용도로 사용되었다. 이러한 용도는 임상적 활성, 특히 항-염증 활성을 지닌 알로에 식물로부터의 화합물을 동정하는 다량의 연구를 고무시켰다 [예를 들면, Grindlay and Reynolds (1986) J. of Ethnopharmacology 16:117-151; Hart et al. (1988) J. of Ethnopharmacology 23:61-71 참조]. 이들 연구의 결과로서 항-종양 활성, 항-위궤양 활성, 항-당뇨 활성, 항-티로시나제 활성 및 항산화 활성(International J. Toxicology (2007), 26 (suppl.2):1-50)을 비롯한 여러 생물학적 활성을 갖는 알로에 화합물에 대한 다수의 보고가 있었다.
다양한 알로에 종으로부터 분리된 크로몬이 여러 생물학적 활성을 갖는 것으로 기록되었다. 알로에신은 티로시나아제 활성을 억제하고(Jones et al. Journal of Pigment Cell Research, Acceptance, Feb. 10th. 2002) 사이클린 E-의존성 키나아제 활성을 상향-조절하는 것으로 기록되었다(Lee et al. (1997) Biochem. MoI. Biol. Int. 41.:285-292). 알로에 바바덴시스(Aloe barbadensis)로부터 분리된 c-글리코실 크로몬은 항-염증 활성(Hutter et al. (1996) J. Nat. Prod. 59:541-543) 및 랫트 뇌 균질액(homogenate) 모델에 기초한 알파-토코페롤의 것과 유사한 항산화 활성을 나타내었다(Lee et al. Free Radic Biol. Med. 28:261-265).
알로에 바바덴시스 잎 및 이의 고미질(bitter principle)은 정상 및 알록산 당뇨병 마우스에서 혈당 수준에 영향을 미치며(Ajabnoor (1990) J. Ethnopharmacol. 28:215-220), 다양한 알로에 종의 건조된 수액은 임상 연구에서 항-당뇨병 활성을 나타낸다(Ghannam, (1986) Horm Res. 24:288-294). 알로에 겔 또는 추출물의 항-당뇨병 효과가 저-용량 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 동물 모델에서 기술되었다(Beppu (2006) J Ethnopharmacol. 103(3):468-77; Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232-7). 이러한 항-당뇨병 효과는 B 세포에 대한 10KDa 미만의 분자량의 다른 화합물 및 페놀에 의한 섬의 저-용량 스트렙토조토신-유도된 선택적 독성의 보호로 기록되었다(Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232-7). 무기 미네랄(Rajasekaran (2005) Biol. Trace Elem. Res. 108(1-3):185-195) 및 알로에 베라 겔로부터의 항-산화제와 같은 다른 성분이 항-당뇨병 효과와 관련하여 기록되었다(Rajasekaran (2005) Pharmacol. Rep. 57(1):90-96).
최근, 알로에 베라(aloe vera) 겔로부터의 5개의 피토스테롤이 항-당뇨병 성분으로 확인되었다(Tanaka (2006) Biol. Pharm. Bull. 29(7): 1418-1422). 2007년에, 알로에 페록스(Aloe ferox) 잎 겔의 화학적 성분이 완전히 분석되어, 유력한 항-산화 성능이 기록되고, 징후를 경감시키고/거나 당뇨병을 예방하는 데에서의 유력한 이용이 추측되었다(Loots (2007) J Agric. Food Chem. 55(171:6891-6896).
미국 특허 제6,780,440호는 당뇨병 및 체중 관리를 위한 알로에를 비롯한 식물 조성물을 개시하였다. 그러나 중요 활성 성분 및 활동 기작이 확인되지 않았다. 미국 특허 제5,88,984호에서, 알로에로부터의 복합 탄수화물이 당뇨병 치료용 조성물 중 하나로서 청구되었다. 또한 미국 특허 제4,598,069호에서, 알로에 다당류가 저혈당증의 치료용으로 청구되었다. 미국 특허 제5,627,204호는 당뇨병의 예방 및 치료에 사용하기 위한 알도오스 환원효소의 억제제로서 활동하는 상이한 치환 패턴을 갖는 합성 크로몬 유도체를 개시하였다. 미국 특허 제6,133,305호는 당뇨병을 비롯한 단백질 키나아제 관련 질병을 치료하기 위한 크로몬 골격을 갖는 합성 화합물을 청구하였다.
야기(Yagi) 등은 알로에로부터 분리된 일군의 화합물들, 특히 티로시나제의 효과적인 억제제인 알로에신 및 이의 유도체 중 하나인 2"-O-페룰로일알로에신에 대해 기재했다(Yagi et al. (1987) Plant Medica 515-517). 알로에신은 C-글루코실화 5-메틸크로몬이다(Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I- Aloesin PM 19(4):322-325). 시험관 내에서, 알로에신은 티로시나제 활성의 강한 억제제이다(Yagi et al. (1987) Planta Medica 515-517). 미국 특허 제6,123,959호[발명의 명칭: "Aqueous Composition Comprising Active Ingredients for the De-Pigmentation of the Skin"]는 인지질의 리포좀 및 멜라민 합성을 위한 효소의 적어도 하나의 비-경쟁적 억제제와 배합된 멜라민 합성을 위한 효소의 적어도 하나의 경쟁적 억제제를 포함하는 수성 조성물을 기재하였다. 미국 특허 제6,884,783호는 활성 산소 종(ROS) 손상 및 다른 산화 스트레스와 관련된 질환 및 증상의 예방 및 치료용의 유력한 항산화제로서 알로에신 및 알로에시놀을 포함하는 7-하이드록시 크로몬을 기재하였다.
지금까지, 알로에신 및 다른 크로몬을 정제하는 공지의 방법은 크로마토그래피의 사용을 포함한다(예를 들어, Rauwald and Beil (1993) J. of Chromatography 639:359-362; Rauwald and Beil (1993) Z. Naturforsch 48c:1-4; Conner et al. (1990) Phytochemistry 29:941; Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I-Aloesin PM 19(4):322-325; Mebe (1987) Phytochemistry 26:2646; Haynes et al. (1970) J. Chem. Soc. (C) 2581; McCarthy and Haynes (1967) The Distribution of Aloesin in Some South African Aloe Species; Heft 3 342 참고). 이들 방법은 화학적 합성을 위해 개발되었으며, 알로에신의 준비 규모의 생산에는 실용적이지 않다. 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에서, 결정화를 사용하는 알로에신의 정제 방법이 개시되었다.
발명의 요약
본 발명은 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생성을 상향-조절시키는 식물 공급원으로부터의 크로몬 및 신규 크로몬 조성물의 동정 및 분리 및 글루코오스 및 지방산 대사 및 신호 경로와 연관된 사실상 수백개의 유전자의 표준화를 기재하였다. 크로몬 조성물은 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생성을 증진시키고지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물(xenobiotic) 대사에 관여하는 유전자를 조절하는 데 효과적이다. 크로몬 조성물은 포유 동물에서 인슐린 감수성을 증가시키고, 내당력을 개선시키고, 트리글리세리드 수준을 감소시키고 글루코오스 수준의 균형을 잡기 위하여 사용될 수 있다. 인슐린 저항성, 내당력, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 질환 및 증상을 예방 및 치료하는 방법이 본 발명에 포함된다.
본 발명은 포유 동물에서 대사 증후군 및 인슐린 저항성에 의해 매개되는 질환 및 증상을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 하나 이상의 크로몬을 포함하는 약제학적 또는 기능 식품 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것으로 구성된다. 크로몬 또는 크로몬 혼합물은 합성으로 수득되거나 자연적으로 발생하거나 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나의 공급원, 또는 다수의 공급원으로부터 분리될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 지방 세포로부터 아디포넥틴 생성을 증가시키는 방법을 기재하였다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 고지방 식이 유도된, 지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물 대사의 유전자 발현의 변화를 표준화하는 방법을 기재하였다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 치료 및 예방을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 인슐린 저항성, 내당력, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다.
다음에 따라 사용될 수 있는 크로몬은 다음 일반식으로 나타낸 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합 크로몬이다:
Figure 112009048406599-pct00002
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 -H, -OH, -CH3, -SH, 알킬, 알케닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된 에스테르; 및 헥소오스 또는 펜토오스로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되며, 여기에서 헥소오스 또는 펜토오스는 탄소, 질소, 황 또는 산소에 의해 크로몬에 연결되며, 헥소오스 또는 펜토오스는 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택되고;
알킬 및/또는 알케닐 그룹은 이중 결합과 -OH, =0 및 -OR로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 그룹(들)을 상이한 위치에서 갖거나/갖지 않는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 및/또는 분지쇄이며;
X는 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 탄산염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 반대 음이온의 그룹으로부터 선택되며;
R은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹이다.
일 구체예에서, 크로몬(들)은 하기 일반식을 갖는 화합물 그룹으로부터 선택된 벤조피란-4-온(7-하이드록시크로몬)이다:
Figure 112009048406599-pct00003
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 위에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 크로몬은 구조가 하기 도시된 알로에신 및/또는 알로에시놀로부터 선택된다:
Figure 112009048406599-pct00004
본 발명의 크로몬은 합성 방법에 의해 얻거나, 아카시아(Acacia), 아디나(Adina), 알로에(Aloe), 알터나리아(Alternaria), 아무라(Amoora), 안티데스마(Antidesma), 아르테미시아(Artemisia), 배키아(Baeckia), 카시아(Cassia), 클루세아(Clusea), 크니듐(Cnidium), 콘볼불루스(Convolvulus), 에피메듐(Epimedium), 에리오세마(Eriosema), 에리오스테몬(Eriostemon), 유기니아(Eugenia), 가르시니아(Garcinia), 하이페리큠(Hypericum), 린덴베르기아(Lindenbergia), 판크라튬(Pancratium ), 페니실륨(Penicillium), 폴리고눔(Polygonum), 프타에록실론(Ptaeroxylon), 륨(Rheum), 소포라(Sophora), 스테파니티스(Stephanitis), 시지기움(Syzygium), 탈라로마이세스(Talaromyces) 및 조나리아(Zonaria)를 포함하나 이에 한정되지 않은 많은 식물 패밀리의 속으로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 식물은 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(Acacia concinna), 알로에 아르보레센스(Aloe arborescens), 알로에 바바덴시스(Aloe barbadensis), 알로에 크렘노필라(Aloe cremnophila), 알로에 페록스(Aloe ferox), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria), 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 베라 바르. 치넨시스(Aloe vera var . chinensis), 안티데스마 멤브라나슘(Antidesma membranaceum), 아르테미시아 카필라리에(Artemisia capillaries), 배키아 플루테센스(Baeckia frutescens), 에피메듐 사기타툼(Epimedium sagittatum), 가르시니아 둘시스(Garcinia dulcis), 하이페리쿰 야포니쿰(Hypericum japonicum), 폴리고눔 쿠스피다툼(Polygonum cuspidatum), 소포라 토멘토사(Sophora tomentosa) 및 스테파니티스 로도덴드리(Stephanitis rhododendri)를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 크로몬은 알로에 페록스, 알로에 베라 또는 알로에 바바덴시스의 잎 전체으로부터 분리된다.
크로몬은 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하나 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분에서 관찰될 수 있다.
본 발명은 이들 화합물을 함유하는 식물로부터의 크로몬의 분리 및 정제를 기재한다. 본 발명의 방법은 a) 크로몬, 특히 알로에신 또는 알로에시놀로부터 선택된 크로몬을 함유하는 식물의 분쇄된 바이오매스(biomass)를 추출하고; b) 상기 추출물을 중화 및 농축시키고; c) 폴리아미드, LH-20, XAD 수지, CG-161 수지, 실리카 겔 또는 역상 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되지 않는 크로마토그래피 방법을 사용하여 상기 중화 및 농축된 추출물을 정제하는 것을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 추출물은 재결정화, 침전, 용매 분할 및/또는 크로마토그래피 분리로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 정제된다. 본 발명의 바람직한 생리 활성을 갖는 크로몬의 상업적으로 실용적인 분리 및 정제 방법을 제공한다.
약제학적 제제로 투여하기 위한 제품의 제조는 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 크로몬은 이들의 자연 존재 형태의 허브 분말; 상이한 농도의 용매 및/또는 초임계 유체 추출물; 재결정, 컬럼 분리, 용매 분할, 침전 및 다른 수단을 통해 농축 및 정제된 화합물; 순수한 및/또는 합성 방법에 의해 제조된 실질적으로 정제된 크로몬을 함유하는 혼합물로 제제화될 수 있다.
본 발명자들은 용인되는 동물 모델을 사용하여 알로에 베라 겔 또는 알로에 베라 잎 전체 겔 분말 및 추출물과 함께; 알로에신 및/또는 알로에시놀 또는 다양한 식물 공급원, 예를 들어 알로에 페록스 잎 삼출물로부터 분리된 크로몬 혼합물을 포함하는 추출물과 같은 크로몬 또는 이의 혼합물의 투여가 음식물 섭취 및 체중에 영향을 주지 않고 인슐린 저항성을 줄이고, 자발적으로 인슐린 수준을 감소시키며, 낮은 공복 혈당 수준을 유지하고, 트리글리세리드 수준을 상당히 감소시키는 것을 기재하였다. 인슐린 저항성을 개선하고, 공복 혈당 수준을 낮추는 데에서, 이들 화합물을 함유하는 식물, 이를 테면 알로에 베라 및 알로에 페록스 및 다른 식물 종으로부터 분리된 하나 이상의 크로몬 및/또는 크로몬 표준화된 추출물의 신규 용도는 이전에 기재된 적이 없다. 개시된 크로몬은 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유 동물의 인슐린 저항성, 내당력, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 대사 장애를 방지하기 위한 예방 및 치료제 및 인슐린 감작제로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 해당 분야의 숙련자에게 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 방법은 소화관 내(경구) 투여, 비경구(정맥내, 피하 및 근육내) 투여 및 국소 적용을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 치료 방법은 합성으로 수득되거나 자연적으로 발생하거나 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나의 공급원, 또는 다수의 공급원으로부터 분리된 크로몬 혼합물 및/또는 개별 크로몬의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 내부(internally) 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 개별 크로몬 및/또는 크로몬 혼합물의 순도는 화합물(들)을 얻는데 사용된 방법에 따라 0.01% 내지 100% 범위이다. 경구, 주사, 국소, 에어로졸, 좌제, 진피내 투여에서 크로몬 조성물의 농도는 적절한 제제의 총량의 0.001 중량% 내지 99.99 중량%일 수 있다. 크로몬은 경구, 국소, 에어로졸, 좌제, 진피내, 근육내 및 정맥내 투여로 구성되는 그룹으로부터 선택된 임의의 투여 경로에 의하여 포유 동물, 특히 인간의 체중(kg) 당 0.01 mg 내지 500 mg 범위의 매일 용량으로 사용될 수 있다.
도 1은 이전에 공지된(도 1A) 및 개선된(도 1B) 프로토콜을 사용하여, 배지로 분비되는 아디포넥틴 수준에서 인도메타신의 효과를 그래프로 도시한 것이다. 도 1A. 3T3-L1 세포를 7일 동안 분화하도록 유도하고, 24 시간 동안 인도메타신으로 처리하였다. 아디포넥틴 수준의 가장 높은 평균 배수 증가는 1 μM의 인도메타신에 의한 1.6배였다. 도 1B. 3T3-L1 세포를 2일 동안 분화하도록 유도하고, 2일 동안 인도메타신으로 처리하였다. 아디포넥틴 수준의 가장 높은 평균 배수 증가는 100 μM의 인도메타신에 의한 52배였고, 가장 낮은 배수 변화는 10 μM에서의 7배였다.
도 2는 분화된 3T3-L1 세포의 배지로 분비되는 아디포넥틴 수준에서의 알로에 페록스 식물 추출물(P0017-OE)의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 간단하게, 3T3-L1 세포를 분화하도록 유도한 다음, 0.5, 0.166 및 0.055 mg/ml 농도의 조 유기 추출물, POO17-OE로 48 시간 동안 처리하였다. 원래 조 추출물을 1:3으로 희석한 다음, 1:9로 희석하여 용량-반응을 시험하였다.
도 3은 POO17-OE의 분획 배합 및 HTP-UV 프로필을 나타낸 것이다. 모든 96개의 분획을 8개의 하위-분획으로 결합하였다. P0017-OE-NP-F3는 아디포넥틴 분석에서 8개의 하위-분획 중 가장 활동적이었다.
도 4는 P0017-OE-NP-F3의 C18 컬럼 분획을 나타낸 것이다. P0017-AC1 및 P0017-AC2는 아디포넥틴 분석에서 활성을 보유하였으며, 각각 알로에신 및 알로에시놀로 확인되었다.
도 5는 신뢰할 만한 표준과의 HPLC 정체 시간 비교 및 UV 스펙트럼 해석을 통한 알로에신(UP394)의 동정을 나타낸 것이다.
도 6은 신뢰할 만한 표준과의 HPLC 정체 시간 비교 및 UV 스펙트럼 해석을 통한 알로에시놀(UP396)의 동정을 나타낸 것이다.
도 7은 분화된 3T3-L1 세포의 배지로 분비되는 아디포넥틴 수준에서의 UP394(알로에신) 및 UP396(알로에시놀)의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 간단하게, 3T3-L1 세포가 분화하도록 유도한 다음, 30 μM의 농도에서 UP394(알로에신) 및 UP396(알로에시놀)로 48 시간 동안 처리하였다. 배양 배지 중의 아디포넥틴 농도를 아디포넥틴을 위한 ELISA 키트로 결정하였다.
도 8A는 C57BL/6J 마우스에서 2 g/kg의 투여량으로 처리 후 18일에 수행된 복막내 내당력 시험의 결과를 나타낸 것이다. 간단하게, 동물을 글루코오스 투여 전 3 시간 동안 금식시켰다. 마우스에 GW1929(5 mg/kg)(■), UP394(100 mg/kg)(▲), UP396(100 mg/kg)(x) 및 비히클(◆)을 복막내로 처리하였다. 혈당 수준을 0, 30, 60, 90, 및 120 분의 시간에 측정하였다. 동물에 고지방 식이를 12주 동안 제공하였다. 8주에 처리를 시작하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 6이다. 60, 90 및 120 분에, 비히클에 비하여 GW1929 및 UP396의 상당한 글루코오스 사용이 관찰되었다[p < 0.05(*)]. 비히클에 비한 GW1929, UP394 및 UP396의 P-값은 각각 T0에서 0.00, 0.87 및 0.43; T30에서 0.07, 0.16 및 0.23이었다. 비히클에 비한 UP394의 P-값은 T60에서 0.15; T90에서 0.10 및 T120에서 0.17이었다.
도 8B는 C57BL/6J 마우스에서 0.5 유닛/kg의 투여량으로 활성 처리 24일에 수행된 복막내 인슐린 저항성 시험의 결과를 나타낸 것이다. 간단하게, 동물을 인슐린 주사 전 3 시간 동안 금식시켰다. 마우스에 GW1929(■), UP394(▲), UP396(x) 및 비히클(◆)을 24일 동안 처리하였다. 혈당 수준을 0, 30, 60, 90, 및 120 분의 시간에 측정하였다. 동물에 고지방 식이를 12주 동안 제공하였다. 8주에 처리를 시작하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 6이다. T30, T60 및 T90의 시간에, 비히클에 비하여 UP394 및 UP396 뿐만 아니라 GW1929의 상당한 글루코오스 제거가 관찰되었다[p < 0.05(*)]. 비히클에 비한 GW1929, UP394 및 UP396의 P-값은 각각 T0에서 0.00, 0.14 및 0.67; T120에서 0.08, 0.00 및 0.04이었다.
도 9는 고지방 식이 유도된 당뇨병 모델을 사용한 인슐린 수준에서의 UP394 및 UP396의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 동물을 고지방 식이로 대사 장애를 8주 유도한 후 2주 동안 GW1929(5 mg/kg), UP394(100 mg/kg), UP396(100 mg/kg) 및 비히클로 복막내 처리하였다. 꼬리 상처로 혈액을 수집하고, 혈장을 위해 스핀 다운(spin down)시켰다. 인슐린을 위한 ELISA 키트를 사용하여 혈장 인슐린 수준을 결정하였다(Crystal Chem - Chicago, IL).
도 10은 GW1929(■), N931(▲) 및 비히클(◆)로 10주 동안 처리한 수컷 db/db 마우스의 주 수에 따른 공복 혈당 수준을 그래프로 나타낸 것이다. 금식 시를 제외하고 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 측정을 수행하기 전에 동물을 밤새 금식시켰다. 값은 평균 ± SD, n = 8을 나타내며, 6, 7, 8, 9 및 10주에, 비히클에 비하여 GW1929 및 N-931의 공복 혈당 수준이 상당히 낮아졌다[p < 0.05 (*)].
도 11A는 db/db 마우스에서 3g/kg의 용량으로 10주의 처리 후 수행된 경구 내당력 시험의 결과를 나타낸 것이다. 동물을 밤새 금식시킨 후 글루코오스를 로딩하였다. 마우스를 GW1929(■), N931(▲) 및 비히클(◆)로 10주 동안 처리하였다. 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 금식 시를 제외하고 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 8이다. 시간 0 및 120 분에, 비히클에 비하여 GW1929 및 N-931의 상당한 글루코오스 이용이 관찰되었다[P < 0.05 (*)]. 비히클에 비한 GW1929 및 N931의 P-값은 각각 T30에 0.15 및 0.05; T60에 0.33 및 0.02; T90에 0.002 및 0.083이었다.
도 11B는 db/db 마우스에서 0.5 유닛/kg의 용량으로 6주 간의 처리 후 수행된 복막내 인슐린 내성 시험의 결과를 나타낸 것이다. 동물을 밤새 금식시킨 후 인슐린을 주사하였다. 마우스를 GW1929(■), N931(▲) 및 비히클(◆)로 10주 동안 처리하였다. 혈당 수준을 0, 30, 60, 90 및 120 분에 측정하였다. 금식 시를 제 외하고 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 8이다. 시간 0, 30 및 60 분에 비히클에 비하여 GW1929 및 N-931의 상당한 글루코오스 제거가 관찰되었다[P < 0.05 (*)]. 비히클에 비한 GW1929 및 N931의 P-값은 각각 T90에 0.00 및 0.14, 그리고 T120에 0.00 및 0.09이었다.
도 12는 10주 동안 GW1929, N-931 및 비히클로 처리한 수컷 db/db 마우스의 주 수에 따른 공복 트리글리세리드 수준을 그래프로 나타낸 것이다. 금식 시를 제외하고 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 동물을 밤새 금식시킨 후 측정을 수행하였다. 나타낸 값은 비히클의 트리글리세리드 수준 퍼센트이다, n = 8. 처리 10주 후에, 비히클에 비하여 GW1929 및 N-931를 처리한 동물에서 트리글리세리드 수준의 상당한 감소가 관찰되었다[P < 0.05 (*)].
도 13A 내지 도 13F는 처리 개시 3주 후에 수행된 복막내 내당력 시험 결과를 나타낸 것이다. 시험 일에, 동물을 3 시간 동안 금식시키고, 2 mg/g의 용량으로 글루코오스를 복막내 투여하였다. 글루코오스를 전달하고 0(글루코오스 주사 전), 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당 수준을 결정하였다. 혈액을 꼬리 상처로부터 얻었다. 데이터는 평균 ± SD이다, n = 7. A. 비히클(◆) 대 400 mg/kg Qmatrix®, B. 비히클(◆) 대 GW1929(■), C. 비히클(◆) 대 UP780(100 mg/kg)(■), D. 비히클(◆) 대 UP780(200 mg/kg)(■), E. 비히클(◆) 대 UP780(400 mg/kg)(■) 및 F. 비히클(◆) 대 정상 설치류 식이가 급식된 동물[P < 0.05 (*)]. UP780의 효능이 처리 3주 정도로 빨리 검출되었다. 매일 경구 처리하고 3주 후에, 200 mg/kg의 UP780 및 GW1929로 처리한 동물에 대하여, 복막내 글루코오스 로딩 후 30, 60 및 90 분에 통계적으로 유의적인 글루코오스 제거가 관찰되었다. 유사하게, 400 mg/kg의 UP780로 처리한 동물은 30 분에 상당한 글루코오스 이용을 나타내었다[P ≤ 0.05 (*)].
도 14A 내지 도 14E는 처리 개시 9주 후에 수행된 복막내 내당력 시험 결과를 나타낸 것이다. 시험 일에, 동물을 3 시간 동안 금식시키고, 2 mg/g의 용량으로 글루코오스를 복막내 투여하였다. 글루코오스를 전달하고 0(글루코오스 주사 전), 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당 수준을 결정하였다. 혈액을 꼬리 상처로부터 얻었다. 데이터는 평균 ± SD이다, n = 7. A. 비히클(◆) 대 GW1929(■), B. 비히클(◆) 대 Qmatrix®(400 mg/kg)(■), C. 비히클(◆) 대 UP780(100 mg/kg)(■), D. 비히클(◆) 대 UP780(200 mg/kg)(■) 및 E. 비히클(◆) 대 UP780(400 mg/kg)(■)[P < 0.05 (*)]. 매일 경구 처리 9주 후에, 비히클 대조군에 비하여 400 mg/kg의 UP780 및 Qmatrix®로 처리한 동물은 IP 글루코오스 투여 30, 60, 90 및 120 분 후에 글루코오스 이용에서 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다[P ≤ 0.05 (*)]. 100 mg/kg의 UP780로 처리한 동물은 T30에서만 유의한 차이를 나타내었다. 양성 대조군인 GW1929은 분석된 각 시간 점에서 P-값이 0.05 보다 낮았다.
도 15A 내지 도 15F는 처리 개시 3주 후에 수행된 복막내 인슐린 내성 시험 결과를 나타낸 것이다. 시험 일에, 동물을 3 시간 동안 금식시키고, 0.5 유닛/kg의 용량으로 인슐린을 복막내 투여하였다. 글루코오스를 전달하고 0(글루코오스 주사 전), 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당 수준을 결정하였다. 혈액을 꼬리 상처로부터 얻었다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. A. 비히클(◆) 대 Qmatrix®(400 mg/kg)(■), B. 비히클(◆) 대 UP780(100 mg/kg)(■), C. 비히클(◆) 대 UP780(200 mg/kg)(■), D. 비히클(◆) 대 UP780(400 mg/kg)(■) 및 E. 비히클(◆) 대 GW1929[P < 0.05 (*)]. UP780의 인슐린 감작 효과를 10주의 매일 경구 처리 후에 인슐린 내성 시험에서 입증하였다. 고려된 모든 시간 점에서 400 mg/kg의 UP780로 처리한 동물에 대하여 통계적으로 유의한 인슐린 감작이 관찰되었다[P ≤ 0.05 (*)]. 인슐린 주사 1 시간 후에 GW1929를 제외하고, 나머지의 처리 그룹들에서는 다른 유의한 차이는 관찰되지 않았다[P ≤ 0.05 (*)].
도 16은 200 mg/kg의 용량으로 투여된 UP780의 지속적인 혈당 강하 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 공복 혈당 수준을 꼬리 상처로부터 얻은 15-20 ㎕의 혈액을 사용하여 기준선 및 처리 시작 2, 5 및 7주 후에 측정하였다. 동물에 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군을 처리하였다. 처리 2주 후 만큼 빨리 통계적으로 유의적으로 낮아진 공복 혈당 수준이 관찰되었다[P < 0.05 (*)(￥)]. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. 200 mg/kg의 UP780 및 GW1929로 처리한 동물은 두 주(5주 및 7주)에 미처리된 비히클에 비하여 통계적으로 유의하게 더 낮은 공복 혈당 수준을 나타내었다. 400 mg/kg의 Qmatrix® 및 UP780로 처리한 마우스는 5주에 유사한 낮은 공복 글루코오 스 수준을 보유하였다. 반면, 100 mg/kg의 UP780로 처리한 그룹은 시험한 모든 주에서 미처리된 비히클에 비하여 상대적으로 높은 공복 혈당 수준을 유지하였다[P ≤ 0.05 (*)].
도 17은 처리 시작 2, 5 및 7주 후에 측정한, 비히클 대조군에 비한 공복 혈당 수준의 감소 퍼센트를 그래프로 나타낸 것이다. 동물을 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군으로 처리하였다. 200 mg/kg의 UP780 처리 그룹에 대하여 2주 만큼 빨리 일관된 낮은 수준의 공복 혈당 수준이 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. 200 mg/kg의 UP780로 처리한 동물의 비히클에 비한 공복 혈당 수준의 감소 퍼센트를 결정하였으며, 이는 2, 5 및 7주에 대하여 각각 18%, 20% 및 17%인 것으로 관찰되었다.
도 18은 수컷 C57BL/6J 마우스의 공복 트리글리세리드 수준에서 GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클의 효과를 그래프로 도시한 것이다. 공복 트리글리세리드 수준에서 비히클 대조군의 감소 퍼센트를 처리 시작 2, 5 및 7주 후에 결정하였다. 동물에 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군을 처리하였다. 200 mg/kg의 UP780 처리 그룹에 대하여 2주 만큼 빨리 일관된 낮은 수준의 공복 트리글리세리드 수준이 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. 매일 처리 후 7주에, 비히클에 대한 공복 트리글리세리드 수준의 감소 퍼센트는 400 mg/kg의 Qmatrix®, 200, 400 및 100 mg/kg의 UP780 및 GW1929에 대하여 각각 2%, 22.1%, 22%, 21.7% 및 22.7% 였다.
도 19는 콜레스테롤 수준에서의 GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 꼬리 상처로부터 얻은 15-20 ㎕의 혈액을 사용하여 기준선 및 처리 개시 2, 5 및 7주 후에 공복 총 콜레스테롤 수준을 측정하였다. 동물을 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군으로 처리하였다. 비히클 대조군에 비하여 모든 처리 그룹에서 총 콜레스테롤 수준의 변화가 관찰되지 않았다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. P ≤ 0.05에서 비히클에 비하여 모든 처리 그룹에서 콜레스테롤 수준의 유의한 변화가 기록되지 않았다.
도 20은 GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클의 수컷 C57BL/6J 마우스의 체중에 대한 효과를 나타낸 것이다. 3 또는 4마리의 수컷 C57BL/6J 마우스를 급식 및 물을 위한 구역이 있는 마우스 케이지에 가두었다. 유도 기간 및 처리 주 중에 일주일에 한번 체중을 측정하였다. 동물을 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군으로 처리하였다. GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클로 처리한 임의의 마우스에서 그룹들 사이의 통계적으로 유의한 체중 증가 차이가 관찰되지 않았다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 비히클 및 정상 설치류 식이를 포함하는 각 처리 그룹의 동물에서 연구 기간 동안 체중 증가가 계속되었다. P ≤ 0.05에서 그룹 I(400 mg/kg의 Qmatrix® 및 200 mg/kg의 UP780)과 그룹 II(GW1929, 비히클, 100, 400 mg/kg의 UP780) 사이에 기록 된 체중 증가 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다
도 21은 수컷 C57BL/6J 마우스에서 음식물 소비에 대한 GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클의 효과를 나타낸 것이다. 3 또는 4마리의 수컷 C57BL/6J 마우스를 급식 및 물을 위한 구역이 있는 마우스 케이지에 가두었다. 유도 기간 및 처리 주 중에 일주일에 한번 음식물 섭취를 측정하였다. 처리 주의 음식물 소비 데이터를 나타내었다. 동물을 GW1929(5 mg/kg), Qmatrix®(400 mg/kg), UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클 대조군으로 처리하였다. 그룹들 사이에 음식물 섭취의 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 데이터는 평균 ± SD, n = 7이다. 체중 데이터와 같이, 유사한 패턴의 음식물 소비가 모든 그룹들에 대하여 기록되었다.
도 22A 및 22B는 수컷(도 22A) 및 암컷(도 22B)의 평균 체중을 측정한 급성 독성 연구의 결과를 나타낸 것이다. 대조군과 처리 그룹 사이의 체중 증가률은 연구 내내 일관되게 나타났다. 마우스를 14일 동안 2 g/kg의 UP780 및 비히클 대조군으로 처리하였다. UP780 처리 동물과 비히클 대조군에 대한 검시일 및 기준선 사이의 체중 증가 차이의 통계적 분석은 수컷과 암컷 모두에서 체중 증가에 유의한 차이가 없음을 나타냈다. 유사하게, 비교된 각 데이터 점에서 UP780 처리 동물과 비히클 대조군 동물의 수컷과 암컷 모두에 대하여 평균 체중 증가가 통계적으로 유의하지 않았다. 데이터는 평균 ± SD, n = 5이다.
도 23은 LV 대 LC의 유전자의 일반적 상향-조절(도 23A) 및 LUP 대 LC의 유전자 발현의 하향-조절(도 23B)의 시각적 관찰로부터 그래프로 나타낸 것이다. 이 그래프는 소프트웨어 SigmaPlot에 의해 생성하였다. 처리 그룹들(LV 대 LC 및 LUP 대 LC) 사이에 상이하게 발현되는 유전자를 검출하기 위하여, 표준화 마이크로어레이 데이터에서 ANOVA를 사용하였다. 각각의 비교를 위하여, 상당히 다르게 발현된 유전자를 ANOVA 모델의 결과 및 다중의 비교 보정으로부터 얻었다. 홀름스 시퀀셜 본페로니 방법(Holm's sequential Bonferroni procedure)을 통한 비교를 위한 통계적으로 유의한 프로브 세트의 수를 그래프에 요약하였다, LV 대 LC(도 23A) 및 LUP 대 LC(도 23B).
도 24는 ACC2 전사체 수준에 대한 마이크로어레이 분석의 QPCR 입증을 나타낸 것이다. 도 24A, 마이크로어레이 데이터로부터의 정량화. 도 24B, GAPDH의 발현 수준에 따라 표준화된 발현 수준으로 작도된 QPCR 정량화. 3개의 마른 대조군 RNA 샘플을 QPCR을 위하여 LC로서 풀링하고; 고지방 식이(LV) 및 고지방 식이+UP780(LUP) 처리 RNA 샘플을 각각 QPCR을 위하여 사용하였다. 동일한 RNA 제제를 마이크로어레이 및 QPCR에 대하여 사용하였다. PM+MM 및 PM-유일한 강도 값을 마이크로어레이 데이터 분석을 위하여 독립적으로 사용하였고(실시예 20 참고), 두 값의 비교 및 이용가능한 경우, 동물 변이에 대한 동물의 비교를 위하여 작도하였다.
도 25A 및 도 25B는 도 24에 나타낸 바와 동일한 형식으로 FASN 전사체 수준에 대한 마이크로어레이 분석의 QPCR 입증을 나타낸 것이다.
도 26A 및 도 26B는 도 24에 나타낸 바와 동일한 형식으로 PEPCK1 전사체 수준에 대한 마이크로어레이 분석의 QPCR 입증을 나타낸 것이다.
도 27A 및 도 27B는 도 24에 나타낸 바와 동일한 형식으로 FABP5 전사체 수준에 대한 마이크로어레이 분석의 QPCR 입증을 나타낸 것이다.
도 28A 및 도 28B는 도 24에 나타낸 바와 동일한 형식으로 AMPKα2 전사체 수준에 대한 마이크로어레이 분석의 QPCR 입증을 나타낸 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 지방 세포에 의하여 아디포넥틴의 생성을 상향-조절시키는 식물 공급원으로부터의 크로몬 및 신규 크로몬 조성물의 동정 및 분리 및 글루코오스 및 지방산 대사 및 신호 경로에 관련된 사실상 수백개의 유전자의 표준화를 기재한다. 크로몬 조성물은 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생성을 증진시키고, 지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물 대사에 관여하는 유전자를 제어하는 데 효과적이다. 크로몬 조성물은 인슐린 감수성을 증가시키고, 내당력을 개선시키며, 트리글리세리드 수준을 낮추고, 포유 동물에서 글루코오스 수준의 균형을 잡기 위하여 사용될 수 있다. 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 질환 및 증상을 예방 및 치료하기 위한 방법이 본 발명에 포함된다.
또한, 하나 이상의 크로몬 및 알로에 겔 분말 또는 알로에 잎 전체 겔 분말의 혼합물로 구성된 신규 조성물이 본 발명에 포함된다. 이들 신규 조성물은 글루코오스 수준을 낮추고 인슐린 감수성을 증진시키는 데 매우 효과적이다. 알로에 겔 분말 또는 잎 전체 알로에 겔 분말을 하나 이상의 크로몬의 실질적으로 순수한 혼합물과 혼합함으로써 조성물이 제조되며, 여기에서 상기 하나 이상의 크로몬 혼합물에는 안트라퀴논(전형적으로, 알로인 A 및 B)이 본질적으로 없다. "실질적으로 순수한"은 크로몬 혼합물이 적어도 70 (중량)% 순수함, 바람직하게는 적어도 80 (중량)% 순수함 및 가장 바람직하게는 90 (중량)% 이상 순수함을 의미한다. "본질적으로 안트라퀴논이 없는"은 크로몬 혼합물 중에 안트로퀴논의 총량이 100 ppm 이하, 더욱 바람직하게는 50 ppm 이하임을 의미한다. 알로에 겔 분말 또는 잎 전체 겔 분말(본 명세서에서 모두 "알로에 겔"로 언급됨)은 이들 조성물을 제조하기 위한 임의의 공지의 표준 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일 구체예에서, 알로에 겔은 알로에 바바덴시스 또는 알로에 베라로부터 제조된다. 이들 조성물에서 알로에 겔 대 총 크로몬의 비는 0.1 내지 99.9%의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 90 (중량)% 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 10 (중량)% 의 총 크로몬으로 구성된다. 다른 구체예에서, 조성물은 95 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 5 (중량)%의 총 크로몬으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 98 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 2 (중량)%의 총 크로몬으로 구성된다. 크로몬은 하기 상술되는 바와 같이 분리된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 크로몬은 알로에신, 알로에시놀, 알로에레신 A, 알로에레신 C, 알로에레신 D, 알로에레신 E, 알로에레신 F 및 알로에신 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 크로몬은 자연적으로 발생한 크로몬의 구조를 화학적으로 변화시킴으로써 반-합성되거나, 작은 방향족 출발 물질로부터 완전하게 합성될 수 있다.
본 발명의 양상을 언급하기 위하여 다양한 용어가 본 명세서에 사용된다. 본 발명의 성분의 설명을 명확하게 하기 위하여, 다음의 정의가 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다.
본 명세서에 사용된 용어 "단수"의 실체는 하나 이상의 실체를 말하며; 즉, 하나의 크로몬은 하나 이상의 크로몬을 말한다. 이와 같이, 용어 "단수" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
"크로몬"은 주요 구조적 골격으로서 하기 일반식으로 나타낸 벤조피란-4-온, 이량체, 삼량체 및 다른 중합 크로몬을 갖는 자연 산물의 특정 분류이다:
Figure 112009048406599-pct00005
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 -H, -OH, -CH3, -SH, 알킬, 알케닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된 에스테르; 및 헥소오스 또는 펜토오스로 구성된 그 룹에서 독립적으로 선택되며, 여기에서 헥소오스 또는 펜토오스는 탄소, 질소, 황 또는 산소에 의해 크로몬에 연결되며, 헥소오스 또는 펜토오스는 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택되고;
알킬 및/또는 알케닐 그룹은 이중 결합과 -OH, =0 및 -OR로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 그룹(들)을 상이한 위치에서 갖거나/갖지 않는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 및/또는 분지쇄이며;
X는 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 탄산염을 포함하나 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 반대 음이온의 그룹으로부터 선택되며;
R은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹이다.
일 구체예에서, 크로몬(들)은 하기 일반식을 갖는 화합물 그룹으로부터 선택된 벤조피란-4-온(7-하이드록시크로몬)이다:
Figure 112009048406599-pct00006
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 위에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 크로몬은 알로에신 또는 알로에시놀로부터 선택된다.
본 발명의 크로몬은 합성 방법에 의해 얻거나, 아카시아, 아디나, 알로에, 알터나리아, 아무라, 안티데스마, 아르테미시아, 배키아, 카시아, 클루세아, 크니듐, 콘볼불루스, 에피메듐, 에리오세마, 에리오스테몬, 유기니아, 가르시니아, 하이페리큠, 린덴베르기아, 판크라튬, 페니실륨, 폴리고눔, 프타에록실론, 륨, 소포라, 스테파니티스, 시지기움, 탈라로마이세스 및 조나리아를 포함하나 이에 한정되지 않은 많은 식물 패밀리의 속으로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 식물은 아카시아 카테츄, 아카시아 콘시나, 알로에 아르보레센스, 알로에 바바덴시스, 알로에 크렘노필라, 알로에 페록스, 알로에 사포나리아, 알로에 베라, 알로에 베라 바르. 치넨시스, 안티데스마 멤브라나슘, 아르테미시아 카필라리에, 배키아 플루테센스, 에피메듐 사기타툼, 가르시니아 둘시스, 하이페리쿰 야포니쿰, 폴리고눔 쿠스피다툼, 소포라 토멘토사 및 스테파니티스 로도덴드리를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 크로몬은 알로에 페록스, 알로에 베라 또는 알로에 바바덴시스의 잎 전체으로부터 분리된다.
크로몬은 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하나 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분에서 발견될 수 있다.
용어 "알로에"는 알로에 베라/알로에 바바덴시스(알로에 바바덴시스는 종 알로에 베라에 대한 라틴 명칭임) 또는 알로에 페로스가 종인 백합과의 남아프리카공 화국 식물의 속을 말한다. 알로에 크로몬은 많은 상이한 종의 알로에의 잎 외피에 주로 존재한다.
용어 "알로에 추출물"은 다양한 종의 알로에 식물 잎 전체의 건조된 즙으로 정의된다. 본 발명의 실시예에 사용된 "알로에 추출물"은 신선한 및 농축된 알로에 겔, 잎 전체 겔, 잎 삼출물 및 추출물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 이는 다양한 알로에 종의 잎 전체의 "잎-전체 처리"에 의해 제조된다. 하나의 예에서, 알로에 바바덴시스 식물로부터 얻은 잎 전체를 갈고, 여과하고, (임의로) 셀룰라아제 및 활성화된 탄소로 처리하고, 동결 건조시킨다. 동결 건조된 분말은 이용 전에 크로마토그래피 용매와 함께 재구성시킨다. 또 다른 예에서, 알로에 페록스 잎으로부터의 삼출물을 수 중에 현탁시킨 후, 이용 전에 적절한 크로마토그래피 용매와 접촉시킨다.
본 명세서에 사용되는 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 포함한다. 사용되는 경우, 치료적은 인간 및 다른 포유 동물에 언급된다.
"약제학적 또는 치료적 유효 투여량 및 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 투여량 수준을 의미한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상 및 병인의 완화 또는 생물계의 임의의 다른 바람직한 변화일 수 있다. 정확한 투여량은 대상의 나이 및 크기, 질환 및 발효 중인 치료를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
"숙주" 또는 "환자" 또는 "대상"은 치료가 바람직한 살아있는 포유 동물, 인간 또는 동물이다. "숙주", "환자" 또는 "대상"은 일반적으로 본 발명의 방법에 따라 실시되는 치료법의 수용자를 말한다. 본 명세서에 기술된 발명은 수의학 및 인간 적용에 대하여 사용될 수 있으며, 용어 "숙주"가 한정하는 방식으로 해석되어서는 안된다. 수의적 적용의 경우에, 투여량 범위는 하기 기술되는 바와 같이 동물의 체중을 고려하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 효율성을 간섭하지 않고, 투여되는 숙주에 대하여 비독성인 임의의 담체를 말한다. "약제학적으로 허용되는 담체"의 예는 임의의 표준 약제학적 담체, 이를 테면 염 용액, 즉, 링거액(Ringer's solution), 완충된 염 용액, 물, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 및 정제 및 캡슐 제제를 위한 다른 부형제 및 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 전체를 통해 다양한 인용문이 제공됨을 유의한다. 각각의 인용문은 참고문헌으로서 전체 내용이 상세하게 본 명세서에 인용되었다
본 발명은 포유 동물에서 대사 증후군 및 인슐린 저항성에 의해 매개되는 질환 및 증상을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 하나 이상의 크로몬을 포함하는 약제학적 또는 기능 식품 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것으로 구성된다. 크로몬 또는 크로몬 혼합물은 합성으로 얻은, 자연적으로 발생한, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 단일 공급원 또는 다수의 공급원으로부터 분리될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 지방 세포로부터 아디포넥틴 생산을 증가시키는 방법을 기재한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 지방산 생합성, 지방산의 미토콘드리아 β-산화, 스테로이드 생합성, 글루코오스신생, 지방 수송, PPARα/RXRα 간 신호 및 생체이물 대사의 유전자 발현의 고지방 식이 유도의 변화를 표준화하는 방법을 기재한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 크로몬 또는 크로몬 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다.
하기에 따라 사용될 수 있는 크로몬은 다음 일반식으로 나타낸 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합 크로몬이다:
Figure 112009048406599-pct00007
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 -H, -OH, -CH3, -SH, 알킬, 알케닐, 옥소알킬, 옥소알케닐, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스 테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된 에스테르; 및 헥소오스 또는 펜토오스로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되며, 여기에서 헥소오스 또는 펜토오스는 탄소, 질소, 황 또는 산소에 의해 크로몬에 연결되며, 헥소오스 또는 펜토오스는 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는 그룹으로부터 선택되고;
알킬 및/또는 알케닐 그룹은 이중 결합과 -OH, =0 및 -OR로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환 그룹(들)을 상이한 위치에서 갖거나/갖지 않는 탄소수 1 내지 20의 직쇄 및/또는 분지쇄이며;
X는 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 탄산염을 포함하나 이에 한정되지 않는 약제학적으로 허용되는 반대 음이온의 그룹으로부터 선택되며;
R은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹이다.
일 구체예에서, 크로몬(들)은 하기 일반식을 갖는 화합물 그룹으로부터 선택된 벤조피란-4-온(7-하이드록시크로몬)이다:
Figure 112009048406599-pct00008
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 위에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 크로몬은 구조가 하기 도시된 알로에신 및/또는 알로에시놀로부터 선택된다:
Figure 112009048406599-pct00009
본 발명의 크로몬은 합성 방법에 의해 얻거나, 아카시아, 아디나, 알로에, 알터나리아, 아무라, 안티데스마, 아르테미시아, 배키아, 카시아, 클루세아, 크니듐, 콘볼불루스, 에피메듐, 에리오세마, 에리오스테몬, 유기니아, 가르시니아, 하이페리큠, 린덴베르기아, 판크라튬, 페니실륨, 폴리고눔, 프타에록실론, 륨, 소포라, 스테파니티스, 시지기움, 탈라로마이세스 및 조나리아를 포함하나 이에 한정되지 않은 많은 식물 패밀리의 속으로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 식물은 아카시아 카테츄, 아카시아 콘시나, 알로에 아르보레센스, 알로에 바바덴시스, 알로에 크렘노필라, 알로에 페록스, 알로에 사포나리아, 알로에 베라, 알로에 베라 바르. 치넨시스, 안티데스마 멤브라나슘, 아르테미시아 카필라리에, 배키아 플루테센스, 에피메듐 사기타툼, 가르시니아 둘시스, 하이페리쿰 야포니쿰, 폴리고눔 쿠스피다툼, 소포라 토멘토사 및 스테파니티스 로도덴드리를 포함하나 이에 한 정되지 않는 그룹으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 크로몬은 알로에 페록스, 알로에 베라 또는 알로에 바바덴시스의 잎 전체으로부터 분리된다.
크로몬은 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하나 이에 한정되지 않는 식물의 다양한 부분에서 발견될 수 있다.
본 발명의 크로몬 화합물 및 조성물과 이들의 생화학적 및 생물학적 활성은 하기 기술되는 2059개의 식물 추출물의 무작위적인 스크리닝으로부터 확인될 수 있다. 1차 스크리닝은 배양된 지방 세포로부터 아디포넥틴 생성을 증진시키는 식물 추출물 또는 화합물의 능력에 기초하여 설계된다. 지방 세포는 마우스 섬유아세포(3T3 L1)로부터 분화된다. 지방 세포 배양 배지 중에 주요한 아디포킨(adipokin) 마커 단백질 - 아데포넥틴 수준을 측정하여, PPAR 팬 조절자로 작용하거나 또는 포유 동물, 특히 인간의 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고중성지방혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 대사 장애를 예방 및 치료하는 데에 사용하기 위한 다른 글루코오스 및 지방산 주요 대사 경로를 조절하는 자연적으로 발생한 화합물을 동정할 수 있는 것으로 여겨진다.
식물 추출물 라이브러리(library)를 생성하기 위하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 건조된 식물 물질을 미세 분말로 갈고, ASE 300 자동 추출기를 사용하여 메탄올:디클로로메탄(1:1)으로 추출하였다. 추출물을 회전 증발기 및 스피드-진공 농축기(speed-vacuum)로 건조시켰다. 식물 추출물(대략 75 mg) 각각을 1.5ml의 DMSO(1.5 ml) 중에 용해시켜 농도가 50mg/ml인 용액을 만들었다.
3T3-L1 세포는 PPARγ 활성자에 반응하여 아디포넥틴을 생성하고 배지로 분비하는 것으로 보인다. 그러나 문헌에서 PPARγ 활성자의 처리에 대한 반응으로 아디포넥틴 분비가 오직 2배만 증가하였다. 이 실험을 반복하여, 이 분석의 최상의 신호 대 백그라운드의 비는 0.1 내지 300 μM 농도의 인도메타신과 함께, 공개된 실험 조건(도 1A) 하에서 1.6이었다. 실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이 유도 및 배양 조건을 변경하여 신호 대 노이즈의 비를 상당히 개선시켰다. 3T3-L1 세포를 분화시키기 위하여 2일 동안 유도한 다음, 2일 동안 인도메타신으로 처리하였다. 아디포넥틴의 가장 높은 평균 배수 증가는 100 μM의 인도메타신에서 52배였다(도 1B). 본 분석 시스템은 2059개의 유기 추출물을 스크리닝하기 위하여 사용하였다.
초기 스크리닝으로, 10 μM의 참조 화합물 인도메타신으로 얻어진 것과 당량인 아디포넥틴 유도의 컷오프 역치값을 사용하여 139개의 양성 히트(hit)를 얻었다. 이후의 확인 분석 및 2차 스크리닝의 결과는 P0017로 명시된 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터의 하나의 활성 추출물이 배지 중에서 아디포넥틴 수준을 지속적으로 조절하는 것을 나타내었다(도 2).
그 다음, 이 활성 식물 추출물(P0017-OE)을 활성-가이드된 HTP 분획화 및 화합물 정제로 처리하였다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, POO17의 유기 추출물을 정상(normal phase) 플래쉬 컬럼을 사용하여 분획하였다. 유사한 UV 흡광도 및 체류 시간을 갖는 분획을 하위-분획으로 결합하고, 저 진공 하에서 건조시키고, 원심 분리하였으며, 이를 P0017-OE-HTPF1-8로 명명하였다(도 3). DMSO를 사용하여 각 하위-분획(50 ㎍/㎕)을 용해시키고, 일 부분(2 ㎕)를 아디포넥틴 분석에 사용하였다. 생물분석에서 8개의 하위-분획 중에 P0017-OE-HTPF3이 가장 큰 활성을 나타냈다. 반복된 활성 분획 및 화합물의 대량 추출 및 분리를 실시예 7 및 도 4에 나타내었다. 생물활성 분획을 POO17-AC1 및 P0017-AC2로 확인하였다.
활성 하위-분획의 탈-복제를 LC-MS/PDA를 사용하여 수행하였다. 가장 큰 아디포넥틴 증진 활성에 상응하는 독특한 화합물 피크가 확인되었다. P0017-OE-HTPF3 및 POO17AC1/2에서 가장 활성이 있는 화합물 알로에시놀(mw=396) 및 알로에신(mw=394)은 실시예 8에 기재된 바와 같이 알로에신에 대하여 UP394(도 5) 및 알로에시놀에 대하여 UP396(도 6)으로 코드화된 크로몬 유형 화합물로 확인하였다. 특히, 알로에신 및 알로에시놀은 지방 세포로부터의 아디포넥틴 분비를 증진시키는 활성 크로몬 화합물로 분리되고 확인되었다. 정제된 UP394 및 UP396을 실시예 10에 기재된 바와 같이 시험하였고, 두 크로몬 화합물은 도 7에 나타낸 바와 같이 시험관 내 분석에서 지방 세포로부터 아디포넥틴 생성을 증가시키는 데 활성이 있었다.
실시예 9는 분취 컬럼 크로마토그래피 분리 및 재결정화에 의하여 안트라퀴논 오염물(특히, 알로인 A 및 B)을 제거하기 위하여 조 알로에 삼출물로부터 크로몬을 정제하는 방법을 기재한 것이다. 안트라퀴논은 이들이 설사 및 유전독성(genotoxicity)과 같은 상당한 부작용을 유발할 수 있다는 점에서 바람직하지 않아, 조 크로몬 추출물의 직접 이용을 막는다. 이 방법을 통한 정제 후에 분리된 크로몬의 순도는 70 중량%, 바람직하게는 80 중량%, 가장 바람직하게는 90 중량% 이상이며, HPLC로 정량화되어 "본질적으로 안트라퀴논이 없다". 본질적으로 안트라퀴논이 없다는 것은 정제된 조성물 중에 안트라퀴논의 총량이 100 ppm 미만, 바람직하게는 50 ppm 미만(의 알로인 A 및 B)인 것을 의미한다. 알로에 페록스의 조 삼출물 중에 알로에신(UP394)의 양은 대략 25 중량%이며, 안트라퀴논의 양은 대략 22%이다(Zahn, (2007) Phytochem. Anal. (10);: 1002-1024). 따라서, 알로에 페록스는 크로몬 조성물의 분리를 위한 훌륭하고 바람직한 식물 공급원이다. 실시예 9에 기술된 바와 같이 알로에 페록스 잎 삼출물로부터 분리되는, 분리 및 정제된 알로에신(UP39)(Lot#A-2705 & Lot#I1506AW)의 순도는 각각 93% 및 100.6%이며, 안트라퀴논의 총량은 50 ppm 미만이다. 안트라퀴논이 없는(<50 ppm의 총 안트라퀴논) 알로에신(UP394)을 사용하여 실시예 11 및 18에 기술된 바와 같은 크로몬 농축 조성물 N931 및 UP780을 제조하였다.
그러나 알로에 바바덴시스와 같은 다른 알로에 종(알로에 겔의 바람직한 공급원)에서 크로몬의 양이 훨씬 적고(0.32 mg/g; 0.10%의 총 크로몬과 함께 0.032%) 안트라퀴논(알로인 A 및 B)이 거의 4배 더 높은 것으로 기록되었다(1.14 mg/g 또는 0.114%)(Park (1998) Phytochem. Anal. 9: 186-191). 또한, 크로몬은 알로에 식물의 잎의 외피 또는 외층에만 저장된다. 알로에 베라/알로에 바바덴시스와 같은 알로에 식물로부터 알로에 겔 산물을 수득하는 표준 방법에서, 전형적으로 알로에 잎의 외피를 제거하며, 오직 투명한 겔을 여과하고 농축한다. 심지어 알로에 식물의 잎 전체를 분쇄하고 겔을 수집하고 여과하는 알로에 잎 전체 겔 분말을 생성하는 데에서도, 활성 탄소를 사용하는 탈색 공정과 다른 처리 단계들에서 본질적으로 모든 크로몬 및 안트라퀴논이 제거된다. 따라서 유의적인 양의 크로몬 또는 안트라퀴논이 HPLC를 통해 입증된 표준 알로에 겔 산물에서 발견되지 않았다(DeU1AgU (2007) J. Agric. Food Che. 55(9): 3363-3367; Zonta (1995) Journal of Chromatography A 718(1): 99-106).
본 발명자들은 표준화된 식물 추출물 중에서 크로몬의 농축은 인슐린 감수성을 증가시키고, 내당력을 개선시키며 트리글리세리드 수준을 낮추는 데에 개선되고 더 지속적인 활성을 갖는 조성물을 제공할 것이라고 가정하였다. 상기 가설을 시험하기 위하여, 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 분리된 크로몬 알로에신(UP394)을 알로에 베라로부터 제조된 잎 전체 겔 분말과 결합하여, 실시예 11에 나타낸 바와 같이 독특한 크로몬 조성물 재료를 생성하였다. 알로에의 이들 두 종으로부터의 표준화된 크로몬 조성물은 1.4% 이상의 크로몬 - 즉, 안트라퀴논(<50 ppm의 알로인 A 및 B의)으로부터의 오염되지 않은 알로에신(UP394)을 포함한다. 알로에신(UP394)을 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되는, 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에 기술된 바와 같이, 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 추출하고, 분취 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 다음, 재결정화로 추가 정제하였다. 이러한 독특한 표준화된 크로몬 조성물을 N931로 코드화하고, 다른 인슐린 저항성 모델인 db/db 마우스 모델에서, 혈당 수준, 인슐린 저항성 및 지방 대사에 대한 이의 영향에 대하여 시험하였다.
아디포넥틴이 대사 증후군의 근원으로 여겨지는 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로 기록되었기 때문에, 크로몬 UP394 및 UP396에 의한 인슐린 저항성의 감소가 다양한 대사 장애에서의 개선을 유발할 것이라고 가정된다. 이 이론을 시험하기 위하여, 실시예 12에 나타낸 바와 같이 C57BL/6J 마우스에 고지방 식이를 8주 동안 급식하여, 동물에서 손상된 인슐린 감수성, 내당력 및 대사 장애를 유도하였다(Surwit et al. (1988) Diabetes 37:1163-1167; Laakso et al. (2004). Diabetes Care 27:2253-2259; Kahn et al. (2004) Diabetes 53:3274-3285; Scheurink et al. (1998) European J Endo. 139:461-467). 이어서, 마우스에 UP394, UP396 및 참조 화합물 GW1929(N-(2-벤조일페닐)-O-[2-(메틸-2-피리디닐아미노)에틸]-L-티로신)을 4주 동안 처리하였다(주사 또는 경구).
고지방 식이 마우스의 인슐린 저항성에서 개시된 크로몬의 치료 효과를 두 시험을 사용하여 나타내었다: 내당력 시험(실시예 13) 및 인슐린 내성 시험(실시예 14). 개시된 크로몬 알로에신(UP394) 및 알로에시놀(UP396)로의 처리 18일에 복막내 내당력 시험을 수행하였다. 동물을 글루코오스(2 g/kg) 투여 전에 3 시간 동안 금식시켰다. 글루코오스 투여 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 실시예 13 및 도 8A에 나타낸 바와 같이, UP396로 처리한 동물은 비히클 처리된 동물과 비교하여 순환으로부터 상당한 글루코오스 제거의 개선을 나타냈다. UP394로 처리한 동물은 비히클로 처리한 동물과 비교하여 개선된 제거 경향을 나타냈다(도 8A).
복막내 인슐린 내성 시험을 실시예 14에 나타낸 바와 같이 처리 24일에 수행하였다. 인슐린 주사 전에 3 시간 동안 동물을 금식시켰다. 인슐린 투여(0.5 유 닛/kg) 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 도 8B 및 실시예 14에 나타낸 바와 같이, 비히클 처리된 동물과 비교하여 UP396 및 UP396로 처리한 동물에서 상당한 글루코오스 제거가 관찰되었다[p < 0.05(도 8B)].
개시된 크로몬의 인슐린 감작 활성을 처리된 동물에서 혈장 인슐린 수준을 낮추는 화합물의 능력에 의하여 추가로 나타내었다. 마우스에서 인슐린의 혈장 수준을 ELISA 키트를 사용하여 결정하였다(도 9). 선택적 PPARy 작용제인 참조 화합물 GW1929는 기대한 대로 인슐린 수준을 상당히 감소시켰다. 유사하게, UP394 및 UP396도 또한, 비히클 처리한 마우스와 비교하여 인슐린 수준을 상당히 감소시켰으며(도 9), 이는 개시된 크로몬 화합물이 고지방 식이 유도된 대사 장애 마우스에서 인슐린 민감성을 증가시키는 것을 나타낸다.
당뇨병 자연 돌연변이(Leprdb)에 대한 마우스 동형 접합체는 대략 3 내지 4주령에서 식별가능하게 비만이 된다. 혈장 인슐린의 증가가 10 내지 14일에 시작되었고, 혈당의 증가가 4 내지 8주에 시작되었다. 동형 접합 돌연변이 마우스에는 다식증(polyphasic), 갈증(polydipsic) 및 다뇨증이 있다. 질환의 진행은 유전적 배경에 현저하게 영향을 받는다. 혈당의 비제어된 상승, 이자섬의 인슐린-생성 베타 세포의 심각한 고갈 및 10 개월령의 사망을 포함하는 많은 특성이 db/db 마우스에서 관찰된다. 수컷 db/db 마우스(각 군에서 8 마리)를 GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 10주 동안 처리하고(주사 또는 경구), 실시예 15에 나타낸 바와 같이 마우스의 공복 글루코오스 수준을 주마다 측정하였다. 결과적으 로, N931는 db/db 마우스에서 혈당 수준을 낮추는 데 매우 효과적이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 비히클-처리 마우스에서 글루코오스 수준은 10주의 처리 기간 중에 시간에 따라 증가하였다. 참조 화합물인 GW1929는 기대된 바와 같이 기준선 수준으로 글루코오스를 유지시킬 수 있었다. GW1929와 유사하게, N931는 처리 5주에서 시작하여 글루코오스 수준을 상당히 감소시켰다. 6, 7, 9 및 10주에, 비히클 처리 그룹과 비교하여 N931 처리 그룹에서의 공복 혈당 수준은 상당히 더 낮았다(P < 0.05). 처리 10주 후에, N931로 처리한 동물에서 글루코오스 수준은 비히클 처리 동물 수준의 54%였다.
인슐린 저항성에서 N931의 효과를 실시예 16에 기재된 바와 같이 경구 내당력 시험으로 나타내었다. db/db 마우스(각 그룹에서 8 마리의 마우스)를 GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 10주 동안 처리하였다. 글루코오스를 로딩하기 전에 동물을 밤새 금식시켰다. 글루코오스 투여 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 0 및 120 분에, 비히클 그룹에 비하여 GW1929 또는 N-931로 처리한 그룹에서 순환으로부터의 상당한 글루코오스 제거가 관찰되었다[P < 0.05(도 11A)]. 이 결과는 N931가 내당력을 증가시키는 능력을 가지며, 이에 따라 db/db 마우스의 인슐린 감수성을 개선시키는 것을 나타낸다.
인슐린 저항성에서 N931의 효과를 복막내 인슐린 내성 시험으로 추가로 나타내었다. db/db 마우스(각 그룹에서 8 마리)를 GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 6주 동안 처리하였다. 인슐린 주사 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 다시, GW1929 및 N931로 처리한 마우스에서 인슐린 감수성 이 명백히 개선되었다. 0, 30 및 60 분에 비히클에 비하여 GW1929 및 N931에 대하여 상당한 글루코오스 제거가 관찰되었다[P< 0.05(도 11B)].
또한, N931는 10주 동안의 처리 후에 비히클 그룹에 비하여 트리글리세리드 수준을 상당히 감소시켰다(P <0.05). GW1929, N931 및 비히클로 처리한 수컷 db/db 마우스의 공복 트리글리세리드 수준을 실시예 17에 나타낸 바와 같이 주 마다 측정하였다. 동물에 금식 시를 제외하고 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 처리 10주 후에, 트리글리세리드의 34% 감소가 N931로 처리한 동물에서 관찰되었으며(P < 0.05), 43%의 감소가 참조 화합물 그룹에서 관찰되었다(P < 0.05)(도 12).
크로몬 농축 조성물의 예기치 못한 뛰어난 치료 효능을 나타내기 위하여, 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 분리된 크로몬 알로에신(UP394)과 알로에 베라로부터 제조된 잎 겔 분말(QM400로 코드화된 Qmatrix)을 결합하여 독특한 두번째 조성물 재료를 만들었다. 알로에의 이들 두 종으로부터의 표준화된 크로몬 조성물(UP780)은 2% 이상의 크로몬 - 즉, 알로에신(UP394) 및 HPLC 정량에 의한 50 ppm 이하의 총 안트라퀴논을 포함한다. 크로몬 알로에신(UP394)을 실시예 9에 기재되고 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되는, 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에 기술된 바와 같이, 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 추출하고, 분취 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 다음, 재결정화로 추가 정제하였다. 이러한 신규한 표준화된 크로몬 조성물을 UP780으로 코드화하고, 이를 고지방 식이가 급식된 C57BL/6J 마우스에 연구 조사 투여량 범위로 경 구 투여하였다. 이 연구에서, UP780의 인슐린 감작 활성을 약물 - GW1929 및 실시예 9에서의 HPLC로 정량하여 유의적인 양의 크로몬을 함유하지 않는 원 알로에 겔 분말(Qmatrix QM400)과도 비교하였다.
실시예 19에서 매일 경구 처리 3주 후에, 200 mg/kg의 UP780(도 13D) 및 GW1929(도 13B)로 처리한 동물에 대하여 복막내 글루코오스 로딩 후 30, 60 및 90 분에 통계적으로 유의한 글루코오스 제거가 관찰되었다. 유사하게, 400 mg/kg의 UP780로 처리한 동물은 30 분에 상당한 글루코오스 이용을 나타내었다[P ≤ 0.05 (*)(도 13E)]. 또한, 9주의 경구 처리 후, 400 mg/kg의 UP780를 처리한 동물은 비히클 대조군에 비하여 IP 글루코오스 투여 후 30, 60, 90 및 120 분 후에 글루코오스 이용에서 통계적으로 상당한 차이를 나타내었다[P ≤ 0.05 (*)(도 14E)]. 100 mg/kg의 UP780를 처리한 동물은 T30에서 상당한 차이를 나타내었다(도 14C). 양성 대조군인 GW1929의 P-값은 분석된 각 시간 점에서 0.05 미만이었다. 반면, 유의적인 양의 크로몬을 함유하지 않는 원 알로에 베라 겔 분말(Qmatrix QM400)은 경구 섭취 3주 후에 효능을 나타내지 않았다(도 13A). 이 실험은 크로몬이 없는 조성물에 비하여 크로몬 농축 조성물의 예기치 못한 뛰어난 인슐린 감작 효능을 명확하게 나타내는 것이다.
또한, UP780의 인슐린 감작 효과를 매일 경구 처리 10주 후에 인슐린 내성 시험에서 입증하였다(도 15A 내지 도 15E). 내당력 데이터와 같이, 400 mg/kg의 UP780로 처리한 동물에 대하여 고려된 모든 시간 점에서 통계적으로 상당한 인슐린 감작이 관찰되었다[P ≤ 0.05 (*)(도 15D)]. 이에 반해, 크로몬이 없는 알로에 베라 겔 분말(Qmatrix QM400)은 경구 섭취 10주 후에 오직 온건한 개선과 단일 점의 유의성(도 15A)만을 보였다.
알로에신이 있는 농축 알로에 베라 겔 분말은 또한 낮은 수준의 공복 혈당 수준을 지속적으로 유지시켰다. 공복 글루코오스 수준을 처리 2, 5 및 7주에 따로 모니터하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 200 mg/kg의 UP780 및 GW1929로 처리한 동물은 미처리된 비히클에 비하여 두 주(5주 및 7주)에 통계적으로 상당히 더 낮은 공복 글루코오스 수준을 나타내었다. Qmatrix® 및 400 mg/kg의 UP780를 처리한 마우스는 5주에 유사한 낮은 수준의 공복 혈당 수준을 가졌다. 반면, 100 mg/kg의 UP780을 처리한 그룹은 모니터된 모든 주에서 미처리된 비히클에 비하여 상대적으로 높은 공복 혈당 수준을 유지하였다[P ≤ 0.05 (*)]. 유사한 데이터 분석으로, 비히클에 대하여 200 mg/kg의 UP780로 처리한 동물에서의 공복 글루코오스 수준의 감소 퍼센트가 2, 5 및 7주에 대하여 각각 18%, 20% 및 17%인 것으로 나타났다 (도 17).
실시예 19의 용량 범위 조사 연구에서, UP780 및 GW1929로 처리한 동물에 대하여 공복 트리글리세리드 수준의 낮은 수준이 관찰되었다. 매일 경구 처리 7주 후에, 비히클에 비하여 200, 400 및 100 mg/kg의 UP780 및 GW1929에 대한 공복 트리글리세리드 수준의 감소 퍼센트는 각각 22.1%, 22%, 21.7% 및 22.7%였다(도 18B). 그러나 유의적인 양의 크로몬을 함유하지 않는 알로에 베라 겔 분 말(Qmatrix QM400)은 처리 2주 후에 트리글리세리드 수준에서 2%의 개선만을 나타냈고, 또한 이 효과는 다음의 두 측정에서 사라졌다. 크로몬 농축 식물 추출물에 의한 트리글리세리드 수준 강하에서의 예기치 못한 뛰어난 효능은 본 실험에 의해 명확하게 나타났다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 비히클에 비하여 모든 처리 그룹에 대하여 콜레스테롤 수준의 유의적인 차이가 기록되지 않았다(P ≤ 0.05). 또한, 관찰된 모든 시간에서, GW1929, Qmatrix®, UP780(100, 200 및 400 mg/kg) 및 비히클로 처리한 모든 동물에 대한 그룹 사이에 유의적인 체중 증가 또는 음식물 소비 차이가 없었다. 비히클 및 정상 설치류 식이를 포함하는 각 처리 그룹의 동물들에서 연구 기간 동안 체중 증가가 지속되었지만, 처리 그룹들 사이에 인지된 체중 증가 차이는 P ≤ 0.05에서 통계적으로 유의하지 않았다(도 20). 체중 데이터와 같이, 모든 그룹들에 대하여 유사한 패턴의 음식물 섭취가 기록되었다(도 21).
유전 연구는 종종 모든 발현된 유전자를 포함하는 프로브-세트를 함유하는 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것에 의한 게놈-전체 규모 연구이다. 포유 동물 시스템에 대하여, 25,000개의 유전자가 작용 및 발현되는 것으로 여겨진다. 마이크로어레이 칩을 mRNA로부터 제조된 cRNA/cDNA와 혼성화시킨 후, 마이크로어레이 칩으로부터 검출된 신호는 mRNA의 조직/세포 공급원의 유전자 발현의 스펙트럼을 반영할 것이다. 전형적으로 수천의 발현 변이성을 갖는 유전자를 생물학적 경로에서의 이들의 참여에 대하여 게놈 데이터베이스로 분석하였다.
본 발명자들은 실시예 20에 기재되는 바와 같이 UP780에 대한 마이크로어레 이 연구를 수행하였다. 사용된 마이크로어레이 칩은 45,000개의 프로브-세트를 포함하는 Affymetrix로부터의 마우스 게놈 430 2.0이었다. 유전자 발현 변이성의 입증을 위하여 유전자 발현 변이성의 마이크로어레이 데이터를 ANOVA의 강력한 통계적 방법으로 분석하였다. 발현 변이성을 갖는 주요 유전자를 실시예 21에 기술되는 바와 같이 정량적 역전사효소-PCR(QPCR)에 의해 추가로 입증하였다. 대사 및 신호 경로에 영향을 미치는 유전자 발현 변이성에 의해 검출된 처리 효과를 인져뉴어티(Ingenuity) 경로 분석 소프트웨어 및 데이터베이스(IPA5)로 분석하였다.
고혈당 수준과 함께, 이자 β 세포는 인슐린을 분비시키며, 이는 간 및 근육에서의 글루코오스 수송체를 글루코오스 흡수를 위하여 원형질 막으로 이동시키고, 글리코겐으로서 글루코오스의 저장을 유발한다. 인슐린은 또한 간 및 지방 세포에서 지방산 및 트리글리세리드 합성을 증가시키고지방 세포에서 지방의 저장을 증가시킨다. 인슐린 저항성은 잘못된 인슐린 수용체 신호 캐스케이드로부터 발생하며, 글루코오스 수송체의 원형질 막으로의 이동 감소, 지방 저장 감소 및 혈당 및 유리 지방산 증가를 유발한다. 혈액의 높은 유리 지방산은 인슐린 수용체 기질(IRS)을 불활성화시키며, 이는 인슐린 저항성을 유도하는 인자이다.
UP780 효능 연구에 대해 사용된 C57BL6 전-당뇨병 마우스 모델은 마이크로어레이를 위한 마우스 조직의 공급원이었다. RNA 추출을 위하여 마우스 조직을 3중으로 마른 대조군, 고지방 식이(비히클로도 칭함) 및 고지방 식이+200 mg/Kg의 UP780로부터 취하였다. 에너지 흡수, 대사, 인슐린 저항성, 비만 및 당뇨병에 중요한 조직은 간, 근육 및 지방이다. 간 마이크로어레이의 한 데이터 세트가 완료 되었다. 일반적으로, 고지방 식이(LV)는 마른 대조군(LC)와 비교하여 유전자 발현을 증가시켰으나, 많은 유전자 발현 수준이 고지방 식이+UP780에 의해 감소되었다(LUP, 도 23).
가장 유의적인 마이크로어레이 및 QPCR 연구로부터의 관찰은 실시예 20 및 21에 나타낸 UP780에 의한 지방산 생합성의 감소이다. 속도를 제한하는 효소인 아세틸-CoA 카복시키나아제(ACC2) 및 지방산 신타아제(FASN)의 전사체는 고지방 식이에 비하여 각각 UP780에 의해 3배 및 3.5배로 감소하였다(표 1 및 도 24 및 25). 고지방 식이에서, 글루코오스로부터의 과량의 에너지가 지방으로 전환되며, 이는 근육에서 인슐린 저항성을 유발하는, 혈장 유리 지방산이 증가하는 피할 수 없는 결과를 갖는다. 지방산 생합성의 감소에서 UP780의 직접적인 결과는 동물 모델에서 관찰된 바와 같이 증가된 인슐린 감수성 및 내당력일 것이다.
또한, 폴리-불포화 지방산의 합성을 관여하는 효소인 스테아로일-CoA 탈포화효소(SCD1)에 결함이 있는 마우스는 고지방 식이에 마른 채로 있었다. UP780는 SCDl 전사체를 고지방 식이에 비하여 4.44배 감소시켰다.
마이크로어레이 분석은 또한 UP780가 마른 대조군 및 고지방 식이에 비하여 미토콘드리아 지방산 β-산화에 관여하는 효소의 전사체 수준을 감소시키는 것을 나타내었다(표 1). 감소된 β-산화는 높은 에너지 섭취하에서 미토콘드리아 산화의 총 수준을 표준화할 것이며, 표준화된 미토콘드리아 유리 산소 라디칼 생성의 결과가 가능하다.
높은 스테로이드 수준은 피드백으로 알려져 있으며, 스테로이드 생합성을 감 소시키고, 이들은 고지방 식이 및 UP780 처리에 대해, 특히 속도를 제한하는 효소인 HMG-CoA 환원효소에 대해 관찰된다(표 1). UP780는 증가된 담즙산 생합성의 유익한 결과로, 고지방 식이에 비하여 CYP7A1를 증가시킨다.
글루코오스 분해/글루코오스신생 경로에서 총 유전자 발현의 변이는 대부분의 관련 효소가 양지향성이기 때문에 총 변화가 거의 없는 것으로 나타난다. 간의 글루코오스신생의 속도-제한 효소는 피루베이트 대사를 위한 경로 내의 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제(PEPCK)이다(표 1). 마이크로어레이 및 QPCR은 마른 대조군에 비하여 UP780에 의한 PEPCK 전사체의 증가 경향을 나타내나, 고지방 식이와 동등하였다(도 26). 이는 항-비만 항-당뇨병 치료에서 피해야하는 혈당을 증가시킬 수 있다. 그러나, 근육이 UP780에 의하여 글루코오스 흡수 및 이용의 증가를 나타내는 경우, 순수 효과는 상기 동물 연구에 나타낸 바와 같이 종합적인 균형에 있을 수 있다.
간에서, 지방산 결합 단백질 FABP5에 대한 전사체는 마이크로어레이 및 QPCR에 의해 관찰된 바, 고지방 식이에 비하여 UP780에 의해 1.74배 증가하였다(표 1 및 도 27). 증가된 FABP5는 지방산 수송을 촉진시키고, 인슐린 저항성을 유발하는 유리 혈장 지방산을 감소시킬 것이다. 원형질 막 LDL 수용체는 UP780에 의해 감소되며, 이는 혈액으로부터 LDL 흡수를 감소시킬 수 있으며, 간 트리글리세리드 함량을 감소시킬 수 있다. 또한, 원형질 막 HDL, 산화 LDL 및 지방산 흡수를 위한 CD36이 고지방 식이에 비하여 UP780에 의해 감소되며, 이는 간 지방 함량을 추가로 감소시킬 수 있다(표 1).
고지방 식이는 PPARα/RXRα 간 신호 경로에 속한 유전자의 전사체를 증가시키며, 이는 UP780에 의해 특히 PPAR α, CD36 및 c-Jun에 대하여 감소된다. 간에서 PPARα 활성화는 HDL의 증가 및 LDL의 감소에 의하여 혈장 지질 프로필을 표준화시킨다. 그러나, HDL에 대한 지단백질인 ApoA1 및 ApoA2의 전사체 수준은 고지방 식이 또는 UP780에 의해 감지할 수 있을 정도로 변화하지 않는다. PPARα에서의 UP780의 효과는 더 주의할 가치가 있다.
UP780은 CYP7B1, CYP2B9, CYP2C18, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 및 SOD3를 포함하는 약물 대사 및 해독에 관여하는 효소의 많은 전사체를 감소시키며, 이 효과 또한 더 연구할 가치가 있다(표 1).
AMPK는 에너지 균형을 위한 세포 센서로 여겨진다. 건강한 세포는 항상 높은 ATP 농도를 유지한다. 에너지 스트레스의 징후인 세포 AMP/ ATP 비율이 증가하는 경우 AMPK는 활성화된다(Hardie (2004) J Cell Sci 117:5479). AMPK의 활성화는 글루코오스 및 지방산 합성을 억제시키고, 글루코오스 및 지방 흡수를 증가시키며, 글루코오스 분해 및 지방산 β-산화를 증가시키고, 단백질 합성 및 세포 성장을 감소시킨다(Hardie (2004) Rev Endocrine & Metabolic Disorders 5:119). UP780는 고지방 식이에 의해 유발된 AMPK 전사체 수준의 저하를 역전시킨다(도 28).
크로몬 농축 식물 추출물 UP780의 안정성 프로필을 CD-1 마우스에서 수행하고, 이 조성물이 잘 허용되는 것으로 결정되었다. 실시예 22에 나타낸 바와 같이, CD-1 마우스에서의 14일 동안 2.0 g/kg의 UP780의 매일 투여는 연구 기간에 걸쳐 이환률 또는 사망률의 징후를 유발하지 않았다. 신체 조건 및 웰빙에 대한 마우스 의 전신의 매일 시험은 연구 내내 시험 화합물 관련 독성 또는 이상을 암시하는 징후를 나타내지 않았다. 급성 독성 연구에서, 모든 마우스는 연구 기간에 체중 증가가 계속되었다(도 22A 및 도 22B). 모든 주요한 혈액 생화학 판독물은 참고 범위로부터 전해물 중의 중요하지 않은 오프-판독물이 14일 독성 연구에 관찰된 것을 제외하고, 정상 범위 내에 있었다. 비히클 대조군에 비하여, 암컷에서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST), 나트륨, 칼륨 및 평균 혈색소 농도(MCHC) 및 UP780로 처리한 수컷에서 총 단백질 및 혈중 요소 질소(BUN)에 통계적으로 유의한 차이가 있었다[P ≤ 0.05 (데이터는 나타내지 않음)]. MCHC, 총 단백질 및 BUN에 대하여 관찰된 평균값은 여전히 정상 참고 범위 내에 있었으나; AST, 나트륨 및 칼륨 평균값은 정상 범위 밖에 있었다.
모든 마우스의 전반적인 사후의 시험 결과는 비히클 대조군 및 UP780 처리 동물에 대하여 일반적으로 정상이었다(데이터는 나타내지 않음). 14일간 UP780이 투여된 마우스에서 현미경 시험을 위하여 기술된 임의의 조직에서 시험 항목-관련된 현미경 변화가 관찰되지 않았다. 시험된 기관 및 조직에서 관찰된 몇몇 갖가지의 현미경 변화는 이 연령 및 스트레인의 실험용 마우스에서 자발적으로 발생한 변화로서 종종 관찰된 유형이었다. 관찰된 전해질 불균형은 신장 및 부신 장애 및 구토 및/또는 설사를 유발하는 임의의 병을 포함하는 많은 증상에 의해 유발될 수 있다. AST의 낮은 수치는 임상적으로 유의성이 없었다. 임상적 관찰, 혈액학 수치 및 조직 병리학 결과에서 상응하는 증거의 결여 때문에, 본 발명자들은 정상 값으로부터 이들 변이가 하우징 및 실험 조건 때문일 수 있다고 여겼다. 또한, 심리 적인 스트레스에 기인한 용혈 및 비장 수축의 결과로서 세포 누출과 같은 발생은 분석물 판독에서 잘못된 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 따라서, 혈액학, 혈액 화학 및 조직 병리학에서의 임상적 관찰 및 실험적 기록에 기초하여, 이 용량에서 본 연구의 임의의 마우스에 전신 독성의 증거가 없었던 것으로 결론지어질 수 있다. 비히클 또는 시험 항목은 이들 부수적인 관찰의 유형, 발생률 또는 중증도에 영향을 미치지 않았다.
본 발명의 화합물 및 이 화합물을 함유하는 식물은 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유 동물에서 인슐린 저항성, 글루코오스 불내성, 높은 트리글리세리드 수준 및 글루코오스 수준 불균형에 의해 매개되는 질환 및 증상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 정제, 캡슐, 연질 겔로 제제화된 식이 보충물 및 정상 식이 및/또는 기능성 식품에서, 파워 바(power bar), 과실 음료, 탄산 또는 통상의 음료로 전달될 수 있다.
약제학적 조성물로 투여하기 위한 화합물의 제조는 해당 분야에 잘 알려진 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 크로몬은 이들의 자연 존재 형태의 허브 분말; 상이한 농도의 용매 및/또는 초임계 유체 추출물; 재결정화, 컬럼 분리, 용매 분할, 침전 및 다른 수단을 통해 농축 및 정제된 화합물; 순수한 및/또는 합성 방법으로 제조된 실질적으로 정제된 크로몬을 함유하는 혼합물로 제제화될 수 있다.
경구 투여용 분제, 캡슐, 정제, 팅크쳐(tincture), 설하 전달 시스템, 음식 바, 물, 과실 쥬스 및 탄산 청량 음료, 크림 및 유제를 포함하는 다양한 용액을 포 함한 다양한 전달 시스템이 해당 분야에 알려져 있으며, 본 발명의 치료 조성물을 투여하기 위하여 사용될 수 있다. 조성물은 리포좀, 마이크로입자 및 마이크로캡술에 캡슐화되어 수용액으로 전달될 수 있다. 본 발명의 치료적 조성물은 다른 효과적인 투여 형태, 이를 테면 관절내 주사, 흡입 분무제, 경구 및 국소 활성 제제, 경피 이온삼투요법 또는 좌제가 포함되는 것이 고려될 수 있지만, 주사에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 하나의 바람직한 담체는 생리 염수이나, 다른 약제학적으로 허용되는 담체도 사용될 수 있는 것으로 판단된다. 일 구체예에서, 담체 및 크로몬(들)이 생리적으로 호환가능한, 서방형 제제를 구성하는 것으로 판단된다. 이러한 담체 중의 일차 용매는 자연 상에서 수성 또는 비-수성일 수 있다. 또한, 담체는 제제의 pH, 오스몰농도, 점도, 명도, 색, 멸균성, 안정성, 분해 속도 또는 냄새를 변형시키거나 유지하기 위한 다른 약리학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 유사하게, 담체는 리간드의 안정성, 분해 속도, 방출 또는 흡수를 변형시키거나 유지하기 위한 다른 약리학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 통상 및 관례적으로 단일 투여 또는 다중-투여형으로 비경구 투여하기 위한 투여량을 제제화하는 데 사용되는 물질이다.
치료 조성물이 제제화되면, 이는 용액, 현탁액, 크림, 겔, 유제, 고체 또는 탈수 또는 동결 건조된 분말로서 멸균 바이얼에 보관될 수 있다. 이러한 제제는 즉시 사용형 또는 투여 직전에 재구성을 요하는 형태로 보관될 수 있다. 전신 전달용 조성물을 함유하는 제제의 투여 방식은 경구, 피하, 근육내, 정맥내, 국소, 비강내 또는 질 또는 직장 좌제를 통할 수 있다.
특정 장애 또는 증상의 치료에 효과적일 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있는 장애 및 증상의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, 시험관 내 또는 생체내 분석이 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위하여 임의로 수행될 수 있다. 제제에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환 또는 증상의 심각성 또는 진행도에 따라 달라질 것이며, 환자 각각의 환경 및 개업의에 따라 결정될 것이다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-의존 곡선으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 유효량은 조성물의 단계적인 용량을 투여하고 원하는 효과를 관찰함으로써 즉시 결정된다.
본 발명에 따른 치료 방법은 치료를 필요로 하는 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유 동물에 단일 공급원 또는 다수의 공급원으로부터의 하나 이상의 크로몬의 치료적 유효량을 내부 또는 국소 투여하는 것을 포함한다. 크로몬 또는 이의 혼합물의 순도는 화합물(들)을 수득하는 데 사용되는 방법에 따라 0.01% 내지 100%의 범위일 수 있다. 경구, 주사가능한, 국소, 에어로졸, 좌제, 경피 투여에서 크로몬 조성물의 농도는 적절한 제제 중에 총량이 0.001 중량% 내지 99.99 중량%일 수 있다. 크로몬은 포유 동물, 특히 인간의 체중 kg당 0.01 mg 내지 500 mg 범위의 매일 투여량으로 경구, 국소, 에어로졸, 좌제, 경피, 근육내 및 정맥내 투여로 구성된 군으로부터 선택된 표준 투여 경로에 의하여 사용될 수 있다.
다음 실시예는 다만 예시의 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다.
실시예 1. 건조 식물로부터 유기 및 수성 추출물의 제조
건조된 식물 재료를 2 mm 이하의 입자 크기로 갈고, 20 g의 부분을 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 100 ml의 메탄올:디클로로메탄(1:1)으로 3회 추출하였다. 유기 추출물(OE)을 회전 증발기 및 스피드-진공 건조를 사용하여 용매를 제거하여 얻었다. 식물 추출물 각각의 무게를 재고(대략 75 mg), 1.5 ml의 DMSO 중에 용해시켜 농도가 50mg/ml인 용액을 제조하였다.
실시예 2. 마우스 3 T3 - L1 세포주 및 배양 조건
배아 마우스 세포주인 3T3-L1(American Type Culture Collection, Manas sas, VA)은 전-지방으로부터 지방 상태로 분화시킬 수 있는 3T3 스위스 알비노 라인의 하위-스트레인이다. 이들 전지방세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM) 중에서 배양하였다(Mediatech, Inc., Herndon, VA).
실시예 3. 아디포넥틴 ELISA 분석
분화 프로토콜을 확립하기 위하여, 3T3-L1 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 컨플루언스(confluence)까지 밤새 배양하였다. 컨플루언스 2일 후에 분화시키기 위하여, 컨플루언트 세포를 유도하였다. 배양 배지에 보충된 0.5 mM 이소부틸메틸잔틴, 1.0 μM 덱사메타손 및 1.7 μM 인슐린을 사용하여 유도를 수행하였 다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 7일에, 지방 세포를 대조군 화합물 또는 식물 추출물로 24 시간 동안 처리하였다. 모든 대조군 및 식물 추출물을 DMSO에 용해시키고, 배양 배지에 총 부피의 1%로 가하였다. 세포 배지를 수집하여 아디포넥틴의 수준을 측정하고, 제조자의 프로토콜에 따라 효소 면역 측정법(ELISA)으로 분석하였다(R&D Systems, Minneapolis, MN). 이 분석 감도는 31.25 내지 2000 pg/mL의 범위이다. 양성 대조군을 0.01 내지 300 μM의 범위에서 시험하였다(도 1). 인도메타신 및 트로글리타존 둘 모두에 대하여 아디포넥틴 수준의 가장 큰 배수 변화가 1 μM에서 관찰되었으며, 각각 아디포넥틴 수준이 1.6 및 1.7배 증가되었다.
분석의 백그라운드에 대한 약한 신호의 비 때문에(2 미만), 상기 언급된 프로토콜은 개선될 필요가 있었다. 상기 기술된 바와 같이 지방 세포를 플레이팅하고 분화시켰다. 세포를 인슐린의 첨가와 함께, 또는 이것 없이 분화 배지 중에서 48 시간 동안 분화시켰다. 이어서, 세포를 분화 후 48 시간 동안만 대조군 화합물 또는 식물 추출물로 처리하였다. 모든 다른 변수는 상기 언급된 바와 같았다. 인도메타신(도 1) 및 트로글리타존(데이터를 나타내지 않음) 대조군을 각각 10 내지 100 μM 및 3 내지 30 μM에서 시험하였다. 아디포넥틴 수준의 가장 큰 증가는 기준선 신호의 52배였으며, 이는 100 μM의 인도메타신 처리로 성취되었고, 가장 적은 증가는 10 μM 의 인도메탄신에서 7배였다(도 1B). 트로글리타존 처리에 의한 아디포넥틴의 가장 큰 증가는 30 μM에서 49배의 증가로 성취되며, 아디포넥틴 수준의 가장 적은 증가는 3 μM에서 24배로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 두 화합물은 공지된 데이터보다 상당히 높은 아디포넥틴 수준의 증가를 나타 냈다.
실시예 4. 지방 세포에서 아디포넥틴 생성의 증진을 위한 식물 추출물의 스크리닝
식물 추출물 라이브러리를 실시예 3에 기술된 아디포넥틴 ELISA 분석법을 사용하여 스크리닝하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 분리된 유기 추출물을 대조군으로서 인도메타신 및 트로글리타존을 사용하여 3번 스크리닝하였다. 2059 개의 조 추출물로부터 이들 중 14.9%(139개의 추출물)이 대조군 수준보다 더 높은 아디포넥틴 생성을 유도하였다. 이들 양성 추출물 중에서, 37개의 추출물(전체의 1.8%)은 가장 낮은 농도(3 μM)의 트로글리타존 대조군보다 더 활성이 있었다. 이들 37개의 조 추출물을 단계 희석하여 재시험하였다. 알로에 페록스 잎 삼출물로부터의 유기 추출물, P0017-OE은 아디포넥틴 유도의 훌륭한 용량 반응 곡선을 나타내었으며(도 2), 추가의 평가를 위해 선별하였다.
실시예 5. 알로에 페록스로부터 활성 유기 추출물의 고효율 정제( HTP )
POO17-OE를 생물분석-가이드된 활성 화합물 분획을 위하여 선택하였다. P0017-OE(400 mg)를 전-패킹 정상 플래쉬 컬럼(2 cm ID x 8.2 cm, 1Og의 실리카 겔)에 로딩하였다. 5 mL/분의 유속에서 30 분에 100% A로부터 100% B의 (A) 50:50 EtOAc:헥산 및 (B) 메탄올의 구배 이동상으로 히타치 (Hitachi) 고효율 정제(HTP) 시스템을 사용하여 컬럼을 용리시켰다. 분리를 광폭 파장 UV 검출기를 사용하여 모니터하고, 분획을 길슨(Gilson) 분획 수집기를 사용하여 1.9 mL/웰로 96-딥-웰 플레이트에 수집하였다. 유사한 UV 흡광도 및 정체 시간을 갖는 분획을 8개의 하위-분획으로 결합하고, 저 진공 하에서 건조시키고 원심분리하였으며, 이를 P0017-OE-NP-Fl, F2, F3, F4, F6, F6, F7 및 F8로 명명하였다(도 3). DMSO를 사용하여 하위 분획(50 ㎍/㎕) 각각을 용해시키고, 아디포넥틴 분석을 위하여 일부분(2 ㎕)을 취하였다. P0017-OE-NP-F3은 8개의 하위-분획에서 가장 활성이 있는 것이었다.
실시예 6. P0017 - OE - NP -하위-분획의 LC - MS / PDA 탈-복제
P0017-OE-NP-F3가 아디포넥틴 분석에서 가장 활성이 있는 하위-분획인 것으로 입증되었기 때문에, LC-MS/PDA를 사용하여 HTP-분획으로부터 얻은 P0017-OE-NP-하위-분획 각각을 분석하고, P0017-OE-NP-F3에서의 독특한 화합물 피크를 찾기 위하여 서로 비교하였다. 분자량 및 문헌 검색에 기초하여 P0017-OE-NP-F3에서 394(알로에신) 및 396(알로에시놀)의 분자량을 갖는 가장 가능성이 있는 활성 화합물을 추정하였다.
실시예 7. 알로에 페록스로부터 알로에신 및 알로에시놀의 추출 및 정제
알로에 페록스 잎 삼출물(P0017)(20Og)을 메탄올을 사용하여 추출하였다(3x). 결합된 메탄올 용액을 저 진공 하에 증발시켜 메탄올 추출물을 얻었다. P0017로부터의 메탄올 추출물(5 g)을 실시예 6 P0017-OE-NP-F3에서 기술된 방법을 사용하여 분획화하였다. 활성이 있는 분획(실시예 6의 P0017-OE-NP-F3 분획과 동 등)(150 mg)을 Phenomenex Luna C18 컬럼 (250 x 30 mm 10 μ)에 로딩하고, 5 mL/분의 유속에서 40 분에 90% A로부터 100% B의 물 (A) 및 (B) 메탄올의 구배 이동상으로 히타치 고효율 정제(HTP) 시스템을 사용하여 용리한 다음, 10 분 동안 100% 메탄올로 세척하였다. 광폭 파장 UV 검출기를 사용하여 분리를 모니터하고, 분획을 길슨 분획 수집기를 사용하여 튜브에 수집하였다. 4개의 시스-컬럼 수행으로부터 수동으로 10개의 주요한 화합물 피크를 수집하였다. 10개의 분획을 건조시키고, 재결정화로 정제하고 POO17-AC1, P0017-AC2, P0017-AC3, P0017-AC4, POO17- AC5, P0017-AC6, P0017-AC7, P0017-AC8, P0017-AC9 및 P0017-AC10로 명명하였다(도 4). P0017-AC1 및 P0017-AC2는 아디포넥틴 분석에서 활성을 보유하였으며, 각각 알로에신 및 알로에시놀로 확인되었다. 나머지 8개의 화합물은 비-활성이거나 덜 활성적이었다.
실시예 8. 알로에신 및 알로에시놀의 세부적 확인
알로에신(UP394): 수율, P0017-OE-NP-F3로부터 2.4%(순도 > 98%, HPLC); UV (Max): 248.4 및 295.9 nm; MS(ESI, 음이온 검출): m/z 393(M - 1, 100%). HPLC 크로마토그램에서 동일한 정체 시간을 나타내는 샘플을 알로에신 표준으로 하였다(도 5).
알로에시놀(UP396): 수율, P0017-OE-NP-F3로부터 1.4%(순도 > 97%, HPLC); UV(Max): 248.4 및 295.9 nm; MS(ESI, 음이온 검출): m/z 395(M - 1, 100%). HPLC 크로마토그램에서 동일한 정체 시간을 나타내는 샘플을 알로에시놀 표준으로 하였다(도 6).
실시예 9. 알로에 페록스의 추출물로부터 알로에신의 제조 및 정량
알로에신(UP394)을 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되는, 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에 기술된 바와 같이, 알로에 페록스의 잎 전체 추출물로부터 추출하고, 분취 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 다음, 재결정화로 추가 정제하였다. 간단하게, 건조된 추출물을 알로에 페록스의 잎 전체로부터 수득하고, 미리 뜨거운 물에 용해하고, 여과하여 불용성 입자를 제거하였다. 그 다음, 추출물을 CG-161 수지로 채운 역상 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 탈이온수로 세척한 후 알로에신(UP394)을 20 내지 30%의 메탄올을 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 20 내지 30%의 메탄올 용리액을 합하고 증발시켰다. 고체를 다음 HPLC 방법에 따라 안트라퀴논 오염 없이 >90%의 순도에 도달할 때까지(100 ppm 이하의 알로인 A 및 B 함량) 알코올/물 용매 중에서 재결정화하였다.
알로에신(UP394), 알로에시놀(UP396) 및 알로에레신 A와 같은 크로몬을 공지된 HPLC 방법을 사용하여 안트라퀴논 오염물(즉, 알로인 A 및 B)에 대하여 정량화하였다(Zahn (2007) Phytochem. Anal. 10: 1002-1024). L-7100 펌프, L-7200 오토샘플러 및 L7300 컬럼 오븐이 장착된 히타치 L-7000 HPLC 시스템에서 분석을 수행하였다. 이 방법에서 C18 가드 카트리지와 커플링된 Phenomenex IB SIL C18 컬 럼(250 mm x 4.6 mm, 5 μ 입자 크기)을 사용하였다. 이동상은 처음 5분에 비율 66%:34%로 시작하는 물/메탄올 구배로 구성하였다. 이 비율을 15분에 24부피%의 물 76부피%의 메탄올로 변하게 하고, 이어서 이 비율을 또 다른 2분 동안 유지시켰다. 컬럼을 66%의 물 및 34%의 메탄올에서 5분 동안 평형화시킨 다음, 샘플을 주입하였다. 유속은 1.0 ml/분이었다. 297nm의 파장에서 L-7400 UV 검출기로 크로몬 및 안트라퀴논을 검출하였다. 크로몬 및 안트라퀴논을 HPLC 정체 시간에 기초하여 동정하고, 개별적인 크로몬 및 안트라퀴논 표준에 대한 피크 영역에 기초하여 정량하였다.
알로에 페록스의 조 추출물에서, 알로에신(UP394) 함량은 24.8 중량%, 안트라퀴논은 22%로 기록되었다(Zahn, (2007) Phytochem. Anal. 10: 1002-1024). 상이한 알로에 바바덴시스 잎 중에 알로에신 함량은 0.32 mg/g(즉, 0.032%), 총 크로몬은 0.1037%으로 기록되었다. 반면, 안트라퀴논 함량(알로인 A 및 B)은 알로에신 함량보다 거의 4배 더 많았다(1.14 mg/g 또는 0.114%) (Park (1998) Phytochem. Anal. 9:186-191).
탈색 방법 및 다른 생성 과정으로, 알로에신 및 안트라퀴논을 알로에 베라 잎 전체 분무 건조된 겔 분말(Lot # RM040805-02 & RM040805-05) 및 알로에 베라 겔 분말 - Qmatrix 탈수(Lot#RM120806-01)로부터 모두 제거하였다(둘 모두 HPLC 분석에 따라 50 ppm 미만). 알로에 페록스 잎 추출물로부터 분리 및 정제된 알로에신(UP394)(Lot#A-2705 & Lot#I1506AW)의 순도는 각각 93% 및 100.6%이며, 총 안트라퀴논은 50 ppm 미만이다. 다음 실시예에 나타낸 바와 같이 안트라퀴논이 없 는(<50 ppm의 총 안트라퀴논 - 알로인 A 및 B) 알로에신(UP394)을 사용하여 크로몬 농축 조성물을 생성하였다 - N931 및 UP780.
실시예 10. 알로에신( UP394 ) 및 알로에시놀(UP396)에 의한 아디포넥틴 생성 증진
순수한 두 가지 크로몬, UP394(알로에신) 및 UP396(알로에시놀)을 실시예 3에 기술된 바와 같이 30 μM에서 지방 세포의 아디포넥틴 생성 증가에 대하여 시험하였다. 알로에신 및 알로에시놀은 각각 지방 세포에 의한 아디포넥틴 생성의 2 및 3.2배의 증가를 나타내었다.
실시예 11. N931(Lot # D1205 -01)의 상세한 제조법
이 독특한 조성물(N931)을 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 분리된 순수 크로몬 알로에신(UP394)과 알로에 베라로부터 제조된 잎 전체 겔 분말과 결합하여 생성하였다. 두 종류의 알로에로부터 표준화된 크로몬 조성물은 1.4 % 이상의 크로몬, 즉 알로에신(UP394)을 함유하였다. 알로에신(UP394)을 실시예 9에 나타내고 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되는, 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에 추가로 기술된 바와 같이, 알로에 페록스의 잎 전체 삼출물로부터 추출하고, 분취 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 다음, 재결정화로 추가 정제하였다. 이 독특한 표준화된 크로몬 조성물은 N931로 확인되었다.
그 다음, 0.811 kg의 알로에신(순도가 93%이고 수분 함량이 5%인 Lot # A-2705)을 50 kg의 알로에 베라 잎 전체 분무 건조 겔 분말(Aloecorp Part No: 5020, Lot# RM-040805-02 및 RM-040805-05)에 가하고, 혼합물을 V-블렌더로 혼합하였다. 강화 바(intensifier bar)를 시작하고, 강화 바 및 쉘을 둘 다 5분 이상 및 7분 이하의 혼합 시간 동안 수행하였다. 강화 바만을 끄고, 5분 이상 10 분 이하 동안 혼합을 계속하였다. 강화 바를 다시 켜고 5분 이상 7분 이하 동안 혼합하였다. 혼합을 멈추고, 혼합된 재료를 수집하고, HPLC 방법으로 UP780 중의 알로에신 함량을 1.5%로 정량하였고, 실시예 9에 기재된 HPLC 방법으로 정량화하여 총 안트라퀴논 함량은 50 ppm 미만이었다.
실시예 12. 고지방 식이 유도된 전-당뇨병 모델
고지방 식이 유도된 동물 모델을 개발하고, 크로몬 추출물의 잠재적 치료 효과를 평가하기 위하여 사용하였다. C57BL/6J는 대사 장애, 손상된 내당력의 병태생리학 및 신규 치료제의 개발을 위한 연구에서 사용될 수 있는 임상적으로 적절한 동물 모델이다(Ahren et al. (2004) Diabetes 53 (Supplement 3):S215-S219; Laakso et al. (2004) Diabetes Care 27:2253-2259; Kahn et al. (2004) Diabetes 53:3274-3285; Scheurink et al. (1998) European J Endo. 139:461-467; Yuan et al. (2002) Diabetes 51: 1851-1858; Reitman et al. (2005) Endocrinology 145:3258-3264; Vlassara et al. (2005) Diabetes 54:2314-2319; Cawthorne et al. (2002) Molecular and Cellular Proteomics 1:509-516). 모델 유도의 방법은 서위 트(Surwit) 등이 1988년에 처음 설명하였다(Diabetes, 37:1163-1167). 간단하게, 손상된 내당력 및 대사 장애 유사 징후가 8주 동안 고지방 식이로 급식한 C57BL/6J 마우스에 성공적으로 주어졌다. 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 구매하였다. 순응 기간 1주일 후에, 동물을 그룹으로 나누고(n=5 또는 6), 급식이 3 시간 동안 보류되는 글루코오스 및 인슐린 내성 시험의 시간을 제외하고, 고지방(45% kcal) 설치류 펠렛(Research diets, Inc., New Brunswick, NJ)과 물을 12주 동안 자유롭게 제공하였다. 동물을 12 시간 명-암 사이클에서 온도가 조절되는 방(22.2 ℃)에서 유지시켰다. 이전에 기재된 바와 같이 12주 동안 매주 혈당, 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 모니터하였다. 12주 동안 한 주에 한번 체중 측정을 수행하였다.
대사 장애의 유도가 선택된 변수(글루코오스, 트리글리세리드 및 콜레스테롤)를 주마다 모니터하여 확인되면, 예를 들어 8주에, 매일 복막내 처리를 개시하고, 4주 동안 유지하였다. 각 시험 일에, 시험 화합물 및 양성 대조군 GW1929(Tocris Bioscience, Ellisville MO, batch # 2A/58705)를 0.5% 메틸셀룰로오스(Sigma, St. Louise MO, Lot# 116H0857) 중에 용해시키고, 각각 100 및 5 mg/kg의 복막내 용량으로 전달하였다. GW1929가 메틸셀룰로오스 중에서 완전하게 가용화되지 않았기 때문에, 이를 먼저 DMSO(Sigma, St. Louise MO, batch # 064K0067) 중에 용해시켰다. 그 다음, 약물 투여 전에 비히클을 포함한 각 화합물의 최종 농도가 5% DMSO를 함유하도록 조정하였다. 비히클 처리된 동물에는 0.5% 메틸셀룰로오스만을 제공하였다. 화합물 각각 또는 비히클 투여 후에 검출가능한 자극의 징후가 없었다.
사용된 양성 대조군인 GW1929, N-(2-벤조일페닐)-O-[2-(메틸-2-피리디닐아미노)에틸]-L-티로신은 뱃취 분자량이 504.59인 황색 고체 분말이다(Tocris Bioscience, Ellisville MO, batch # 2A/58705). 이 화합물은 선택적, 경구 활성이 있는 PPARγ 작용제이다. 경구 투여하면, 이는 당뇨병 동물 모델에서 글루코오스, 지방산 및 트리글리세리드 수준을 감소시킨다(Brown et al. (1999) Diabetes 48:1415; Way et al (2001) J. Biol. Chem. 276:25651-25653). 동물에는 12주 동안 고지방 식이를 제공하였다. 8주에 처리를 시작하고, 4주 동안 지속하였다.
실시예 13. 인슐린 저항성에서 UP394 및 UP396 의 효과
실시예 12에 기재된 바와 같이 C57BL/6J 마우스를 사용하여 GW1929(5 mg/kg), UP394(100 mg/kg), UP396(100 mg/kg) 및 비히클의 복막내 투여로의 처리 18일에 2 g/kg의 용량에서 복막내 내당력 시험을 수행하였다. 글루코오스 투여 전 3 시간 동안 동물을 금식시켰다. 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 6이다. 60, 90 및 120 분에 비히클에 비해 GW1929 및 UP396에 대하여 유의적인 글루코오스 사용이 관찰되었다(p < 0.05). GW1929, UP394 및 UP396에 대한 P-값은 비히클에 비하여 각각 T0에서 0.00, 0.87 및 0.43; T30에서 0.07, 0.16 및 0.23이었다. UP394에 대한 P-값은 비히클에 비하여 T60에서 0.15; T90에서 0.10 및 T120에서 0.17이었다(도 8A).
UP394 및 UP396 둘 모두는 인슐린 내성 시험에서 인슐린 감작에 효과를 나타 내었다. 복막내 인슐린 내성 시험을 실시예 13에 나타낸 바와 같이 C57BL/6J 마우스에서 GW1929(5 mg/kg), UP394(100 mg/kg), UP396(100 mg/kg) 및 비히클의 경구 투여 처리 24일에 0.5 유닛/kg의 용량으로 수행하였다. 동물을 3 시간 동안 금식시키고 인슐린을 주사하였다. 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 6이다. T30, T60 및 T90의 시간 점에 비히클과 비교했을 때 UP394 및 UP396뿐 아니라 GW1929에 대하여 유의적인 글루코오스 제거를 관찰하였다(p < 0.05). 비히클에 비한 GW1929, UP394 및 UP396의 P-값은 각각 TO에서 0.00, 0.14 및 0.67이고; T120에 0.08, 0.00 및 0.04이었다(도 8B).
실시예 14. 고지방 식이 유도된 인슐린 저항성 모델의 인슐린 감수성에서 UP394 및 UP396 의 효과
인슐린 저항성에서 UP394(100 mg/kg) 및 UP396(100 mg/kg)의 경구 투여 효과를 화합물 UP394 및 UP396로 처리한 동물에서 추가로 증명하였다. 이들 동물에서 인슐린 수준은 유의적으로 감소하였다. 인슐린용 ELISA 키트(Crystal Chem - Chicago, IL)를 사용하여 혈장 인슐린 수준을 측정하였다. 동물을 GW1929, UP394 및 UP396 및 비히클로 고지방 식이 8주 후에 2주 동안 처리하였다(도 9). 꼬리 상처로 혈액을 수집하고, 혈장을 위해 스핀 다운(spin down)시켰다. 14 일에 비히클 그룹에 비하여 GW1929, UP394 및 UP396의 처리 그룹에서 혈장 인슐린 수준의 유의적인 감소가 관찰되었다(P < 0.05).
실시예 15. db / db 마우스의 공복 글루코오스 수준에서 N931 의 효과
GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 처리한 수컷 db/db 마우스(각 그룹에서 8 마리의 마우스)의 공복 글루코오스 수준을 주마다 측정하였다. 금식 시를 제외하고, 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 동물을 밤새 굶기고 측정을 수행하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 비히클-처리 마우스에서 글루코오스 수준은 10주의 처리 도중에 시간에 따라 증가하였다. 참조 화합물인 GW1929는 예상된 바와 같이, 글루코오스 수준을 기준선 수준으로 유지시킬 수 있었다. GW1929와 유사하게, N931은 처리 5주부터 시작하여 글루코오스 수준을 상당히 감소시켰다. 6, 7, 9 및 10주에 비히클에 비해 N-931에 대하여 공복 혈당 수준이 유의적으로 낮아졌다(P < 0.05). 처리 10주에, N931로 처리한 그룹에서 글루코오스 수준의 46% 감소가 관찰되었다.
실시예 16. db / db 마우스 모델의 인슐린 저항성에서의 N931 의 효과
처리 10주 후에 db/db 마우스에서 3 g/kg의 용량으로 경구 내당력 시험을 수행하였다. 금식 시를 제외하고, 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 동물을 밤새 굶기고 글루코오스를 로딩하였다. 마우스(각 그룹에 8 마리의 마우스)를 10주 동안 GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 처리하였다. 글루코오스 로딩 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 0 및 120 분에, 비히클에 비해 GW1929 또는 N-931으로 처리된 마우스에서 순환으로부터 유의적인 글루코오스 제거가 관찰되었다[P < 0.05(도 11A)]. 결과는 N931이 내당 력을 증가시켜 db/db 마우스의 인슐린 감수성을 개선시키는 능력이 있음을 나타낸다.
복막내 인슐린 내성 시험을 처리 6주 후에 0.5 유닛/kg의 용량으로 db/db 마우스에서 수행하였다. 동물을 밤새 금식시키고, 인슐린을 주사하였다. db/db 마우스(각 그룹에 8마리)를 6주 동안 GW1929(5 mg/kg), N931(375 mg/kg) 및 비히클로 처리하였다. 인슐린 주사 후 0, 30, 60, 90 및 120 분에 혈당 수준을 측정하였다. 다시 개선된 인슐린 감수성이 GW1929 및 N931를 처리한 마우스에서 분명히 나타났다. 0, 30 및 60 분에 비히클에 비해 GW1929 및 N931에 대하여 유의적인 글루코오스 제거가 관찰되었다[p < 0.05(도 11B)].
실시예 17. db / db 마우스 모델의 트리글리세리드 수준에서 N-931의 효과
GW1929(5 mg/kg), N-931(375 mg/kg) 및 비히클로 처리한 수컷 db/db 마우스의 주별 공복 트리글리세리드 수준을 10주 동안 취하였다. 금식 시를 제외하고, 동물에 T2018 설치류 식이를 자유롭게 제공하였다. 동물을 밤새 굶기고 측정을 취하였다. 나타낸 값은 비히클의 트리글리세리드 수준 퍼센트이다, n = 8. 처리 10주 후에, 비히클에 비해 GW1929 및 N-931로 처리한 동물에서 트리글리세리드 수준의 유의적인 감소가 관찰되었다[P < 0.05(도 12)].
실시예 18. 크로몬 농축 조성물( UP780 )의 제조 및 투여
이 독특한 조성물(UP780)을 알로에 페록스의 잎 삼출물로부터 분리된 순수 크로몬 알로에신(UP394)과 알로에 베라로부터 제조된 잎 전체 겔 분말과 결합하여 생성하였다. 두 종류의 알로에로부터 표준화된 크로몬 조성물은 2 % 이상의 크로몬, 즉 알로에신(UP394)을 함유하였고 총 안트라퀴논은 50 ppm 미만이었다. 크로몬인 알로에신(UP394)을 실시예 9에 나타내고 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되는, 미국 특허 제6,451,357호[발명의 명칭: "Method of Purification of Aloesin"]에 추가로 기술된 바와 같이, 알로에 페록스의 잎 전체 삼출물로부터 추출하고, 분취 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 다음, 재결정화로 추가 정제하였다. 이 독특한 표준화된 크로몬 조성물은 UP780으로 확인되었다.
5 kg 뱃취의 알로에 크로몬 농축 알로에 베라 겔 분말, UP780을 제조하는 방법을 하기에 기술하였다. 이는 알로에 베라 겔 분말 중에 2% 이상의 알로에신으로 구성된 표준화된 알로에 겔 조성물이다. 알로에 페록스 잎 전체 삼출물로부터 분리한 순도 100.6%인 0.11 g의 알로에신(Lot # I1506AW)을 4.90 kg의 알로에 베라 겔(Qmatrix® 탈수) 분말(Aloecorp Part No: AA8010XQ80 Lot# RM-120806-01)에 가하였다. 혼합물을 혼합하여 알로에 크로몬 표준화된 조성물 UP780(Lot # L1806QMAW-01)을 얻었다. 조성물(UP780) 중의 알로에신(UP394)의 함량은 HPLC에 의해 안트라퀴논 오염이 없는 2.2%인 것으로 확인하였다.
고지방 식이 8주 후에 동물에서 질환의 유도가 선택된 변수를 모니터함으로써 확인되면, 매일 경구 처리를 개시하였다. 각 날에, 시험 항목 및 양성 대조군 GW1929(Tocris Bioscience, Ellisville, MO, Batch # 2A/58705)를 0.5%의 메틸셀룰로오스(Sigma, St. Louise MO, Lot# 116H0857)에 용해시키고, 100, 200 및 400 mg/kg의 UP780(Lot # L1806QMAW-01); 400mg/kg의 Qmatrix® 알로에 베라 겔 분말(QM400, Lot # G6319103-L3); 및 5 mg/kg의 GW1929의 경구 용량으로 전달하였다. GW1929가 메틸셀룰로오스 중에서 완전하게 용해되지 않기 때문에, 이를 먼저 DMSO(Sigma, St. Louise MO, batch # 064K0067)에 용해시켰다. 그 다음, 약물 투여 전에 비히클을 포함한 시험 화합물의 최종 농도가 5%의 DMSO를 함유하도록 조정하였다. 담체 비히클 처리된 동물에는 0.5% 메틸셀룰로오스만을 제공하였다. 약물 각각 또는 비히클 투여 후에 검출가능한 자극의 징후가 없었다.
실시예 19. 고지방 식이 유도된 C57BL /6J 마우스에서 UP780 의 용량-범위 연 구 및 효능
실시예 12에 기술된 바와 같이, 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 순응 기간 1주일 후에, 동물을 6개의 그룹(n=7)으로 나누고, 급식이 3 시간 동안 보류되는 글루코오스 및 인슐린 내성 시험 시간을 제외하고, 고지방(45% kcal) 설치류 펠렛(Research diets, Inc., New Brunswick, NJ)과 물을 자유롭게 제공하였다. 동물을 12 시간 명-암 사이클에서 온도가 조절되는 방(22.2 ℃)에서 유지시켰다.
3 또는 4마리의 수컷 C57BL/6J 마우스를 급식 및 물을 위한 섹션이 있는 마우스 케이지에 가두었다. 주어진 날에 미리 무게를 잰 고지방 펠렛 값과 남겨진 것 사이의 차이를 측정함으로써 음식물 섭취를 매일 결정하였다. 연구 중 일주에 한번 체중을 측정하였다.
공복 혈당, 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 꼬리 상처로부터 수득된 15 내지 20 ㎕의 혈액을 사용하여 측정하였다. 혈당용 프레스티지 시험 스트립(prestige test strips, Walgreen, Home Diagnostics, Inc., Ft. Lauderdale, FL) 혈당 모니터링 시스템이 있는 IQ 및 콜레스테롤 및 트리글리세리드용 PTS 패널 시험 스트립(Polymer Technology System, Inc, Indianapolis, IN)이 있는 CardioChek 분석기를 사용하여 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 총 혈액 수치를 결정하였다.
처리 시작 0일(기준선), 3주 및 9주 후에 복막내 내당력 시험을 수행하였다. 시험 일에, 동물을 3 시간 동안 금식시키고, 2 mg/g 용량의 글루코오스를 복막내 투여하였다. 혈당 수준을 시간 0(글루코오스 주사 전), 글루코오스 전달 후 30, 60, 90 및 120 분에 결정하였다. 혈액을 꼬리 상처로부터 얻었다. 복막내 인슐린 내성 시험을 10주 내에 수행하였다. 동물을 3 시간 동안 금식시키고, 인슐린(이스트 중에서 발현된 인간 재조합, Sigma, St. Louis, MO, Lot # 055K1321)을 0.5IU/kg의 용량으로 복막내 투여하였다. 혈당 수준을 시간 0(글루코오스주사 전), 글루코오스 전달 후 30, 60, 90 및 120 분에 결정하였다. 혈액을 꼬리 상처로부터 얻었다.
실시예 20. DNA 마이크로어레이 재료 및 방법
마우스를 7개의 처리 그룹으로 나누고, 그룹 별로 3 마리의 마우스를 조직 수집을 위해 선택하였다. 처리 10주 후에, 마우스를 CO2 가스로 마취시키고, 안락사 5분 내에 간, 체벽 근육 및 지방을 수집하였다. 조직을 5mm 미만의 덩어리로 자르고, 조직 수집 중에 RNALater 용액(Ambion)에 침수시켜 보관하고, 이후에 장기간 보관을 위하여 -80 ℃ 냉동고로 옮겼다. RNA 분리를 위하여, 마우스 조직을 해동시키고, RNALater 보관 용액으로부터 제거하였다. 간의 전체 RNA(total RNA) 추출을 위하여 RNEasy 전체 RNA 분리 키트를 사용하고, 근육 전체 RNA 추출을 위하여 RNEasy 섬유 조직 키트(Qiagen)를 사용하였다. 조직을 구아니딘 티오시아네이트 및 RNEasy 키트에 제공된 RLT 용액을 함유하는 β-머캅토에탄올 중에서 유리 Dunce 균질화기를 사용하여 균질화시켰다. 추출된 RNA를 260/280 nm의 파장에서의 UV 흡광도로 정량하였다. 28S 및 18S rRNA 밴드의 강도 및 게놈 DNA의 부재를 위하여 변성 글라이옥살 아가로오스 겔(1%) 전기영동을 사용하여 RNA 질을 결정하였다. 게놈 DNA가 겔로부터 관찰되는 경우, 특정 RNA 샘플에 대하여 RNEasy 키트로 두번째 과정의 추출을 수행하였다.
Affymetrix 마우스 게놈 430 2.0 어레이를 DNA 마이크로어레이 연구를 위하여 선택하였다. 어레이는 각각 혼성화를 위한 34,000개 마우스 유전자 및 대조군 서열의 45,000개의 프로브 세트, 폴리-A, 100개의 표준화 프로브 세트 및 하우스키핑(housekeeping) 유전자를 함유한다. 12개의 Affymetrix-인가 서비스 제공자의 리스트로부터 CoGenics를 선택하여, cRNA 합성, 혼성화/세척, 스캐닝 및 Affymetrix GCOS 소프트웨어를 사용하는 데이터 분석 과정을 수행하였다. CoGenics는 NanoDrop 분광광도계 및 Agilent 2100 생물분석기를 사용하여 RNA 샘플의 수령과 동시에 이들 고유의 내부 RNA 특성 대조를 수행하였다. 마이크로어레이 처리 도중, Cogenics는 또한 cRNA 및 마이크로어레이 데이터 세트에 대한 특성 대조를 수행하였다. 마우스 간의 경우, 200 mg/Kg(LUP)에서 마른-대조군(LC), 고지방 식이(LV) 및 고지방 식이+UP780의 처리 그룹을 총 9개의 어레이의 마이크로어레이 실험을 위해 선택하였다. 모든 RNA, cRNA 및 최종 마이크로어레이 데이터 세트에 특성 대조를 통과시켰다.
Affymetrix 마우스 게놈 430 2.0 어레이는 표준 Affymetrix 어레이 설계를 따른다: 프로브 세트당 11개의 프로브 쌍, 각 프로브 쌍은 하나의 완벽한 매치(PM) 및 하나의 미스 매치(MM) 25-mer 올리고뉴클레오티드를 함유한다. GCOS에 의한 데이터 분석은 백그라운드를 뺀 PM 및 MM 강도 값 모두를 사용하였다. 각 프로브 세트에 대하여, 모든 11개의 PM 값 및 11개의 MM 값을 하나의 강도 값으로 요약하였다. 그 다음, 어레이의 데이터 세트를 평균 강도 값 및 어레이-대-어레이 비교용 표적 강도 값에 기초하여 전체적으로 계산하였다. 또한, Affymetrix 소프트웨어 "발현 콘솔(Expression Console)"을 사용하여 독립적인 마이크로어레이 데이터 분석을 수행하였다. 강도 요약을 위해 GOCS에서 사용되는 MAS5 알고리즘 외에, 강도 요약을 위해 알고리즘 RMA 및 PLIER도 또한 발현 콘솔에 사용되었다.
MM 프로브의 유용성은 논쟁의 대상이다. 따라서 본 발명자들은 바이오컨덕터(Bioconductor) 소프트웨어로 백그라운드 보정된 PM 값만을 사용하여 추가의 마이크로어레이 데이터 분석을 수행하였다. 처리 그룹은 각각 3개의 어레이를 가졌다. 처리 그룹 내의 어레이 일관성의 진단을 위하여 MA 플롯을 사용하였다. R 프로그래밍 언어로 바이오컨덕터 마이크로어레이 패키지의 로에스(loess) 작용을 사용하여 불일치를 표준화하였다. 처리 그룹의 각 프로브 세트를 위하여, 33개의 PM 값을 강도 값으로 통합하고, log2 전환시켰다. 또한, 33 대 33개의 PM 값을 사용하여 각 프로브-세트에 대하여 처리 그룹 사이의 ANOVA의 통계적 시험을 수행하였다. 총 3 x 45,000에서, LUP 대 LV, LUP 대 LC 및 LV 대 LC 처리 그룹 사이의 ANOVA 시험을 수행하였다. 유의성 수준 α = 0.05에서 오류 발견률(FDR) 및 홀름스 시퀀셜 본페로니 방법(Holm's sequential Bonferroni procedure)으로 유전자 발현 변이의 유의성을 시험하였다.
전형적으로 발현 변이를 갖는 수천의 유전자 범위에 있는 마이크로어레이 데이터 세트는 생물학적 유의성을 판단하기 위하여 경로 분석 소프트웨어의 도움을 필요로 한다. PM 값으로부터 요약한 3개의 LC, LV 및 LUP 어레이 각각의 마우스 간 데이터 세트를 인져뉴어티(Ingenuity) 경로 분석 소프트웨어 IPA5 및 관련 게놈 데이터베이스로 분석하였다. ANOVA의 3개의 컷오프 기준 p < 0.0001, log2 강도 ≥ 2.5 및 log2 비율 ≥ 0.9을 적용하였다. IPA5는 40개의 정규 경로 및 70개의 작용을 생성하였으며, 각각에서 3개의 데이터 세트 중 적어도 하나가 0.05의 역치 p-값을 통과하였다. (유사 신호 및 대사 경로 데이터베이스, 이를 테면 Science STKE 및 KEGG로부터 정규 경로를 취하였다. 작용은 유전자 온톨리지(Gene Ontology, GO) 데이터베이스에 기초한다). 잘 확립된 정규 경로, 특히 영양소 대 사에 UP780의 명확한 영향을 보여주는 상부 대사 경로를 상세하게 분석하였다. IPA5에 의해 생성된 경로 분석 데이터를 표 1에 나타내었다.
실시예 21. UP780 에 의해 조절되는 유전자 발현의 QPCR 분석
마우스 조직으로부터 추출한 전체 RNA는 통상 마이크로어레이 실험에 필요한 것의 과량이었다. 따라서, 마이크로어레이를 위해 사용된 동일한 전체 RNA 샘플을 통상 수개월 후에 수행되는 마이크로어레이 결과의 QPCR 입증을 위해 보관하였다. 전체 RNA를 통상적으로 -80 ℃ 냉동고에 보관하였고, 장기간 보관 후에 분해가 관찰되지 않았다. 전체 RNA로부터의 cDNA 합성의 역 전사 반응을 위하여, 본 발명자들은 변형된 역전사효소, Superscript III와 함께, 인비트로젠(Invitrogen)에 의하여 Superscript III를 위한 시약으로 공급되는 완충제, 뉴클레오티드, 올리고(dT)7 프라이머 및 RNAse가 없는 DNAse I을 사용하였다. 각 반응을 위하여, 5 ㎍의 전체 RNA를 50 ㎕의 반응 부피에 사용하였다. 첫번째 가닥의 cDNA를 물을 사용하여 2.5x 부피로 희석하고, 50 ㎕의 QPCR 반응당 2 ㎕의 cDNA를 사용하였다. 사용 전에 각 유전자에 대한 TagMan 유전자 발현 분석의 ABI 프라이머 및 프로브 세트를 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 모든 프로브는 FAM-염료-표지된 MGB 프로브였다. ABI로부터의 2X TagMan 유니버살 PCR 마스터 믹스를 QPCR 반응을 위해 사용하였다. 열사이클 및 검출을 ABI SDS 소프트웨어를 통하여 수행된 기기 조정 및 QPCR 데이터 획득과 함께 ABI 7700 서열 검출기에 의하여 행하였다. ΔΔDt의 상대적 정량 법을 사용하였고, QPCR 96-웰 플레이트는 각각 하우스-키핑 유전자 GAPDH의 대조군 cDNA(LC) 및 대조군 프라이머 및 프로브 세트를 포함하였다.
실시예 22. UP780 의 안정성 평가
목적 사육된(Purpose bred) CD-1 마우스를 USDA 승인된 실험 동물 판매자 Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA)로부터 구입하였다. 도착에 따라 동물을 한 주간 적응시키고, 8주령에 연구에 사용하였다. 마우스를 12 시간 명-암 주기에서 온도 조절되는 방(22.2 ℃)에 가두고, 음식물과 물을 자유롭게 제공하였다.
투여하기 전 처리 첫날에 기준선 체중 측정을 수행한 다음, 검시일까지 일 주일에 2회 수행하였다. 주사기 및 18 게이지 볼이 달린 급식 바늘을 사용하여 처리 그룹(n=10, 5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷)의 모든 마우스에 연속 14일 동안 비히클로서 200 ㎕의 수 중에 UP780(Lot # L1806QMAW-01) 2.0g/kg의 용량을 경구 투여하였다. 대조군(n=10, 5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷)에는 200 ㎕의 물만을 제공하였다.
시험 전 및 연구 기간 동안 매일 전신 임상적 관찰을 수행하였다. 외피 색상, 털, 눈, 점막, 운동력, 호흡, 자세 및 다른 이상한 징후의 변화를 포함하는 독성의 징후에 대하여 동물을 모니터하였다. 임의의 약리 독성 징후, 이를 테면 떨림, 경련, 설사, 무기력, 유병률, 속상수축, 절름거림, 침분비, 분비물 및 탈수에 대하여 임상적 관찰을 수행하였다. 분석의 마지막 날에, 모든 동물을 2 L/분의 산 소 유속에서 2% 이소플루란으로 마취시키고, 혈액을 수집하고, 종합적인 포유 동물 프로파일링을 위하여 Antech Diagnostics, Inc.(Portland, OR)로 수송하였다. 혈액 평가를 위하여 전체 혈액의 샘플(라벤더 탑 마이크로테이너(lavender top microtainer) 중의)을 사용하였고, 임상 화학(분리 겔과 함께 그린 탑 마이크로테이너) 평가를 위하여 혈장을 사용하였다. 모든 동물을 사혈시키고, 육안 병리(gross pathology)에 대하여 시험하였다. 복강을 열고, 기관을 육안 시험하고, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 간, 직장, 뇌(다수의 섹션), 뇌하수체, 근육이 있는 말초 신경(궁둥 신경), 척수(3 단계), 눈, 부신, 갑상샘/부갑상샘, 이자, 폐 및 기관, 후두, 대동맥(흉부), 심장, 림프절(자궁경부 및 장간막), 비장, 가슴샘, 신장, 방광, 정소, 부고환, 정낭, 전립샘, 경부, 난소, 자궁, 쓸개 담낭, 관절과 함께 대퇴골, 피부, 침샘 및 혀의 샘플 조직을 수집하고, 10% 완충된 중성 포르말린으로 고정시키고, 조직병리적 제조 및 현미경 평가를 위하여 Research Pathology Services Inc.(New Britain, PA)에 보냈다.
임상 화학, 혈액학, 체중 및 음식물 소비로부터의 모든 비-분리 데이터를 평균 및 표준 편차와 함께 표로 만들었다. 병리학 관찰, 비정상적 물리적 징후 및 데이터의 통계적 평가에 기초하여 결과를 해석하였다.
표 1. 대사 경로에 관여하는 유전자를 위한 간 마이크로어레이로부터의 유전자 발현 변이. ANOVA에 의하여 p<0.0001인 간 유전자 발현 변이를 상향 조절에 대하여 (↑), 하향 조절에 대하여 (↓)로 나타내었다.
유전자
설명
간(유전자 발현 배수 변이)
LUP / LV LUP / LC LV / LC
지방산 생합성
ACC2 아세틸-CoA 카복실라아제 2 ↓3.01 ↓2.54 ↔
FASN 지방산 신타아제 ↓3.50 ↓2.33 ↑1.5
ASCL3 아실-CoA 합성효소 장쇄 3 ↓2.07 ↓1.49 ↑1.39
ACSS2 아실-CoA 합성효소 단쇄 2 ↓1.63 ↓2.63 ↓1.62
SCD1 스테아로일-CoA 탈포화효소 ↓4.44 ↓3.94 ↔
FADS2 지방산 탈포화효소 2 ↓3.24 ↓1.39 ↑2.34
ME1 말릭 효소 1 ↓2.27 ↓2.03 ↔
ACYL ATP 시트레이트 리아제 ↓1.85 ↓1.57 ↔
지방산 미토콘드리아 β-산화
ALDH1B1 알데히드 탈수소효소 1B1 ↓2.82 ↓1.75 ↑1.61
CPT1A 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 1A ↓1.86 ↔ ↑1.98
LCHAD β-산화를 위한 삼작용성 단백질, 알파 서브유닛 ↓1.57 ↔ ↑1.49
ACOT1 아실-CoA 티오에스테라아제 1 ↓5.87 ↓3.04 ↑1.93
스테로이드 생합성
SREBF1 스테롤 조절 요소 결합 전사 인자 1 ↓2.38 ↓1.60 ↑1.49
HMGCR 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 ↓1.54 ↓2.37 ↓1.54
MVD 메발로네이트 데포스포 탈탄산효소 ↓2.36 ↓2.06 ↔
CYP26A1 사이토크롬 P450, 레티노산, 약물 대사 ↓2.88 ↓6.53 ↓2.27
CYP7B1 사이토크롬 P450, 담즙 합성 ↑1.94 ↑1.91 ↔
글루코오스신생
PEPCK1 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제 1 ↔ ↑1.89 ↑2.06
지방 수송
CD36 트롬보스폰딘 수용체, 장쇄 지방산 수송 ↓2.67 ↓1.25 ↑2.14
FABP5 지방산 결합 단백질 5 ↑1.74 ↓1.67 ↓2.89
FABP4 지방산 결합 단백질 4 ↔ ↑2.19 ↑2.43
LDLR LDL 수용체 ↓2.89 ↓1.60 ↑1.80
PPARα 퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체-α ↓2.48 ↔ ↑2.11
생체이물 대사
CYP2B9 사이토크롬 P450 ↓20.83 ↓1.68 ↑11.88
CYP2C18 사이토크롬 P450 ↔ ↓2.98 ↓2.60
GSTA5 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 A5 ↓1.67 ↓4.08 ↓2.10
SOD3 수퍼옥사이드 디스무타제 3, 세포외 ↓2.05 ↓1.37 ↑1.50

Claims (46)

  1. 90 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 10 (중량)%의 알로에신, 알로에시놀 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 크로몬의 혼합물을 유효성분으로서 포함하는 전-당뇨병성 고혈당증, 고중성지방혈증 또는 전-당뇨병성 고혈당증 및 고중성지방혈증 치료를 위한 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 크로몬이 자연 발생 공급원에서 분리되거나 합성 방법에 의해 수득되는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 자연 발생 공급원이 아카시아(Acacia), 아디나(Adina), 알로에(Aloe), 알터나리아(Alternaria), 아무라(Amoora), 안티데스마(Antidesma), 아르테미시아(Artemisia), 배키아(Baeckia), 카시아(Cassia), 클루세아(Clusea), 크니듐(Cnidium), 콘볼불루스(Convolvulus), 에피메듐(Epimedium), 에리오세마(Eriosema), 에리오스테몬(Eriostemon), 유기니아(Eugenia), 가르시니아(Garcinia), 하이페리큠(Hypericum), 린덴베르기아(Lindenbergia), 판크라튬(Pancratium), 페니실륨(Penicillium), 폴리고눔(Polygonum), 프타에록실론(Ptaeroxylon), 륨(Rheum), 소포라(Sophora), 스테파니티스(Stephanitis), 시지기움(Syzygium), 탈라로마이세스(Talaromyces), 조나리아(Zonaria) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 식물인 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 자연 발생 공급원이 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘시나(Acacia concinna), 알로에 아르보레센스(Aloe arborescens), 알로에 바바덴시스(Aloe barbadensis), 알로에 크렘노필라(Aloe cremnophila), 알로에 페록스(Aloe ferox), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria), 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 베라 바르. 치넨시스(Aloe vera var. chinensis), 안티데스마 멤브라나슘(Antidesma membranaceum), 아르테미시아 카필라리에(Artemisia capillaries), 배키아 플루테센스(Baeckia frutescens), 에피메듐 사기타툼(Epimedium sagittatum), 가르시니아 둘시스(Garcinia dulcis), 하이페리쿰 야포니쿰(Hypericum japonicum), 폴리고눔 쿠스피다툼(Polygonum cuspidatum), 소포라 토멘토사(Sophora tomentosa), 스테파니티스 로도덴드리(Stephanitis rhododendri) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 식물인 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 자연 발생 공급원이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃, 잎 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 식물 부분인 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 조성물이 체중 ㎏당 0.01 내지 500㎎으로부터 선택된 투여량으로 투여되는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 조성물이 경구, 국소, 좌제, 정맥내, 진피내, 위내, 근육내, 복막내 또는 정맥내 경로로 투여되는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 알로에 겔이 알로에 베라로부터 분리되거나 농축된 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 크로몬이 알로에 페록스로부터 분리되거나 농축된 것인 조성물.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 크로몬이 알로에 페록스로부터 분리되거나 농축되고, 알로에 겔이 알로에 베라로부터 분리되거나 농축된 것인 조성물.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 1.4 내지 10 (중량)%의 크로몬을 포함하는 조성물.
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서, 1 내지 5 (중량)%의 크로몬과 95 내지 99 (중량)%의 알로에 겔을 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 크로몬이 알로에 페록스로부터 분리되거나 농축되고, 알로에 겔이 알로에 베라로부터 분리되거나 농축된 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 2 내지 5 (중량)%의 크로몬을 포함하는 조성물.
  20. 삭제
  21. 제1항, 제4항 내지 제11항, 제13항, 제15항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 50 ppm 미만의 안트라퀴논을 포함하는 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 90 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 10 (중량)%의 알로에신, 알로에시놀 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 크로몬의 혼합물을 유효성분으로서 포함하는 전-당뇨병 대상에서 상승된 혈당 수준의 감소를 위한 약제학적 조성물.
  25. 90 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 10 (중량)%의 알로에신, 알로에시놀 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 크로몬의 혼합물을 유효성분으로서 포함하는 전-당뇨병 대상에서 상승된 혈당 수준의 감소, 공복 혈당 수준의 감소, 내당력의 증가, 또는 상승된 혈당 수준의 감소, 공복 혈당 수준의 감소 및 내당력의 증가를 위한 약제학적 조성물.
  26. 90 내지 99 (중량)%의 알로에 겔 및 1 내지 10 (중량)%의 알로에신, 알로에시놀 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 크로몬의 혼합물을 유효성분으로서 포함하는 전-당뇨병 대상에서 인슐린 저항성 우려의 감소, 인슐린 감수성 개선 또는 인슐린 저항성 우려의 감소 및 인슐린 감수성 개선을 위한 약제학적 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 경구, 국소, 좌제, 정맥내, 진피내, 위내, 근육내, 복막내 또는 정맥내 경로로 투여되는 조성물.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6884783B2 (en) * 2002-05-03 2005-04-26 Unigen Pharmaceuticals, Inc. 7-Hydroxy chromones as potent antioxidants
TWI454261B (zh) * 2007-01-09 2014-10-01 Unigen Inc 作為治療劑之色酮類
ITTO20080047A1 (it) * 2008-01-18 2009-07-19 Euroline Srl Macchina e metodo per sminuzzare porzioni di materiale bituminoso in granuli riciclabili
US20090317341A1 (en) 2008-06-18 2009-12-24 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Compositions for Lightening Skin Color
WO2011033524A2 (en) 2009-08-04 2011-03-24 Laila Nutraceuticals Agents from ficus hispida for the amelioration of metabolic syndrome and related diseases
US9345732B2 (en) 2009-11-19 2016-05-24 Laila Nutraceuticals Agents derived from Holoptelea integrifolia and their compositions for the control of metabolic syndrome and associated diseases
DE102011117364A1 (de) * 2011-10-29 2013-05-02 Merck Patent Gmbh Hautaufheller in der Phototherapie
US9426265B1 (en) * 2015-03-24 2016-08-23 Wireless Mobi Solution, Inc. Method and apparatus for controlling a projector angle
CN106292151B (zh) * 2015-06-10 2017-12-26 钱鸿斌 采用有机反射镜管的微型投影装置
KR101865360B1 (ko) * 2015-07-15 2018-06-07 주식회사 유니베라 간 치료 및 간 건강 유지를 위한 조성물과 의학 조성물
EP3397056A1 (en) * 2015-12-30 2018-11-07 Investigaciones Biológicas en Agroquimicos Rosario S.A. Herbicidal composition comprising chromone derivatives and a method for weed control
CN107865867A (zh) * 2016-09-27 2018-04-03 全椒先奇医药科技有限公司 Fistulains A在降低血糖药物中的应用
KR102040900B1 (ko) * 2017-09-29 2019-11-06 (주)아모레퍼시픽 트리메톡시 페닐 화합물을 포함하는 지방세포 분화 또는 아디포넥틴 촉진용 조성물
US11850257B2 (en) * 2019-02-11 2023-12-26 Saganatura Ehf. Method for enhancing beta-adrenergic response
KR102269001B1 (ko) 2019-09-09 2021-06-25 동국대학교 산학협력단 신규한 부타놀리드 이량체 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 아디포넥틴 분비 촉진용 조성물
CN110851247B (zh) * 2019-10-12 2023-07-25 华东师范大学 一种带约束云工作流的成本优化调度方法
CN112415116B (zh) * 2020-11-27 2022-07-26 海南医学院 一种大鼠血浆中芦荟苦素的lc-ms/ms测定方法
CN112451516A (zh) * 2020-12-24 2021-03-09 海南医学院 芦荟苦素在制备预防或治疗肥胖相关产品中的应用

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966892A (en) * 1982-05-07 1990-10-30 Carrington Laboratories, Inc. Processes for preparation of aloe products products produced thereby and compositions thereof
US5106616A (en) 1988-01-14 1992-04-21 Carrington Laboratories, Inc. Administration of acemannan
US4851224A (en) 1986-06-05 1989-07-25 Carrington Laboratories, Inc. Process for preparation of aloe products
US5118673A (en) 1982-05-07 1992-06-02 Carrington Laboratories, Inc. Uses of aloe products
US5468737A (en) 1982-05-07 1995-11-21 Carrington Laboratories, Inc. Wound healing accelerated by systemic administration of polysaccharide from aloe
US5308838A (en) 1982-05-07 1994-05-03 Carrington Laboratories, Inc. Uses of aloe products
JPS60214741A (ja) 1984-04-05 1985-10-28 Toyo Yakushiyoku Kogyo Kk 血糖降下剤
LU85320A1 (fr) * 1984-04-17 1985-11-27 Oreal Composition cosmetique contenant de l'aloesine a titre d'agent de protection contre la lumiere solaire et son utilisation pour la protection de la peau et des cheveux
US4725438A (en) * 1986-05-29 1988-02-16 Leazer Billie S Aloe vera ointment
JPH0459773A (ja) 1990-06-26 1992-02-26 Tsumura & Co 新規クロモンおよび該クロモンの医薬としての用途
KR950001039B1 (ko) * 1990-11-30 1995-02-08 가부시끼가이샤 쓰무라 크로몬 유도체 및 이 화합물을 유효성분으로 하는 아르도스 리덕타제 저해제
JPH05331161A (ja) * 1992-05-27 1993-12-14 Tsumura & Co クロモン誘導体及び該化合物を有効成分とするアルドー スリダクターゼ阻害剤
GB9317071D0 (en) 1993-08-17 1993-09-29 Univ Strathclyde Flavonoids
US5589182A (en) * 1993-12-06 1996-12-31 Tashiro; Renki Compositions and method of treating cardio-, cerebro-vascular and alzheimer's diseases and depression
US5503825A (en) * 1994-01-10 1996-04-02 Lane; Barry Lip balm composition
WO1995023604A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Namyang Aloe Co., Ltd. Cell growth stimulating compositions containing aloesin
US5888984A (en) 1994-05-12 1999-03-30 Dermal Research Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition of complex carbohydrates and essential oils and methods of using the same
US5536506A (en) * 1995-02-24 1996-07-16 Sabinsa Corporation Use of piperine to increase the bioavailability of nutritional compounds
WO1996040182A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Identification of a potent antioxidant from aloe barbadensis
US5939395A (en) 1995-06-07 1999-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Identification of a potent antioxidant from Aloe barbadensis
JP2880434B2 (ja) 1995-09-05 1999-04-12 恒和化学工業株式会社 ギムネマ・イノドラム焙煎茶
US5708038A (en) * 1996-06-13 1998-01-13 Univera Pharmaceuticals, Inc. Method of using aloe vera as a biological vehicle
JPH10101541A (ja) 1996-06-20 1998-04-21 Tetsuya Koga シミ、クスミ、シワを除去し美肌効果をもたらす化粧料組成物
JP3608888B2 (ja) * 1996-11-14 2005-01-12 株式会社資生堂 改質沈香オイル及びその製造方法
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
WO1999034676A1 (en) 1998-01-12 1999-07-15 Univera Pharmaceuticals, Inc. Method of synthesis of derivatives of aloesin
US6123959A (en) 1998-04-24 2000-09-26 Univera Pharmaceuticals, Inc. Aqueous composition comprising active ingredients for the de-pigmentation of the skin
US6395311B2 (en) * 1998-04-29 2002-05-28 Univera Pharmaceuticals, Inc. Multicomponent biological vehicle
HRP980301A2 (en) 1998-06-09 2000-04-30 Pliva Pharm & Chem Works New polyketides, pyranone derivatives
US6306383B1 (en) * 1998-09-16 2001-10-23 Wilson T Crandall Method for topical treatment of scars with protein kinase C inhibitors
AU2298301A (en) 1999-10-20 2001-05-08 Board Of Trustees Of Southern Illinois University, The Flavones as inducible nitric oxide synthase inhibitors, cyclooxygenase-2 inhibitors and potassium channel activators
US6451357B1 (en) * 2001-02-26 2002-09-17 Unigen Pharmaceuticals, Inc. Method for purification of aloesin
KR100408928B1 (ko) 2001-04-06 2003-12-11 한국과학기술연구원 알로에신을 함유하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용조성물, 및 이를 포함하는 제제
US6780440B2 (en) 2002-01-31 2004-08-24 Yousry M. A. Naguib Herbal compositions and methods for diabetes and weight loss management
JP2003286185A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 Daily Foods Kk アロエベラ圧搾液及び該圧搾液を有効成分とする血糖値降下剤
US6884783B2 (en) * 2002-05-03 2005-04-26 Unigen Pharmaceuticals, Inc. 7-Hydroxy chromones as potent antioxidants
EP1556031A4 (en) * 2002-10-22 2009-03-25 Jenken Biosciences Inc CHROMONES AND CHROMIUM DERIVATIVES, AND USES THEREOF
CN100484555C (zh) * 2003-01-07 2009-05-06 无锡杰西医药科技有限公司 一种库拉索芦荟提取物在制备预防和治疗糖尿病方面的药物和保健品中的应用
US20060241130A1 (en) 2003-01-31 2006-10-26 Ehud Keinan Anti-inflammatory compositions and uses thereof
KR100586153B1 (ko) 2004-01-16 2006-06-07 주식회사김정문알로에 알로에 베라 생잎으로부터 안트라퀴논을 제거하는 방법
WO2006024545A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-09 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Fused bicyclic natural compounds and their use as inhibitors of parp and parp-mediated inflammatory processes
CN100379442C (zh) * 2006-04-13 2008-04-09 杨文权 一种祛痘护肤液
TWI454261B (zh) * 2007-01-09 2014-10-01 Unigen Inc 作為治療劑之色酮類

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Botanical Journal of the Linnean Society, Vol. 125, pp. 45~70(1997년)*
Phytochemistry, Vol. 45(7), pp. 1511~1513(1997년)*
Phytochemistry, Vol. 49(1), pp. 219~223(1998년)*

Also Published As

Publication number Publication date
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