KR101530408B1

KR101530408B1 - 반응 지그 및 반응 방법, 및 ｃＤＮＡ의 합성 방법

Info

Publication number: KR101530408B1
Application number: KR1020107017949A
Authority: KR
Inventors: 마사하루 이소베; 노부유키 쿠로사와
Original assignee: 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2015-06-19
Also published as: CN101939427A; AU2009205104B2; JP5244130B2; EP2246425B1; CN101939427B; CA2712572A1; WO2009091048A1; AU2009205104A1; US8993241B2; JPWO2009091048A1; KR20100112163A; EP2246425A4; CA2712572C; EP2246425A1; US20110020879A1

Abstract

조작마다 용액 등의 이동에 사용하는 기구를 세정 또는 교환하는 일 없이, 복수 종류의 반응이나 세정의 조작을 병렬적으로 실시할 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 기판의 한편의 표면에 복수의 돌기 형태 울타리가 정렬되어 설치되고 있으며, 상기 돌기 형태 울타리는, 적어도 1개의 컷아웃부를 가지고, 또한 내부에는 액체방울을 보유할 수 있는 공간을 가지며, 또한 상기 기판 표면의 적어도 전기 액체방울을 유지하는 면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위인 반응 지그. 이 반응 지그를 이용하여 자기 비즈에 고정화한 물질을 상기 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 표면장력 저하 시약을 함유하는 용액의 액체방울 중을 상기 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여 차례대로 이동시켜서 반응 및 세정을 실시하는 것을 포함한 반응 방법.

Description

반응 지그 및 반응 방법, 및 ｃＤＮＡ의 합성 방법{Reaction jig, reaction method and method of synthesizing ｃＤＮＡ}

본 발명은 반응 지그 및 반응 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 임의의 세정 공정을 포함한 복수의 연이은 반응을 병렬적으로 또한 간편하게 실시할 수 있는 반응 지그 및 반응 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 반응 지그를 이용하는 cDNA의 합성 방법에 관한 것이다.

일반적으로, mRNA로부터의 cDNA의 합성이나, DNA의 증폭 등의 유전자 관계의 반응은 소량의 용량으로, 복수 종류가 병렬적으로 실시되는 것이 많다. 이 경우, 예를 들면, 96혈 또는 384혈 등의 마이크로 웰 어레이(well array)를 이용하여 각 웰에 반응액이나 세정액을 넣은 어레이를 준비하고, 반응 또는 세정이 종료되면 피펫(pipette)에 의해 용액을 다음 웰에 이동시켜서 후속 처리에 제공하는 것이 일반적이다. 이러한 처리 조작은, 루틴하게 실시되는 경우는 로봇이 이용되는 경우도 있다.

그러나 로봇을 이용한다고 해도, 액의 이동에 사용한 피펫은 그때마다 세정 또는 교환하여 후속 처리에 사용할 필요가 있어, 조작은 매우 번잡하다.

피펫을 사용하는 대신에, 자기 비즈를 이용하여 자기 비즈에 고정화한 시료를 자석으로 낚아 올려서 이동시키는 것도 실시되고 있다(예를 들면, 일본 특표 2007－504835호 공보(특허 문헌 1)). 그러나, 상기와 같은 마이크로 웰 어레이를 이용하는 경우, 이동용 자석은 웰의 위쪽에서부터 접근하고, 경우에 따라서는 웰 중의 용액에 침지할 필요가 있다. 용액에 침지된 자석은, 다음 스텝 전에 세정이 필요하다. 또, 다음 스텝으로 이동한 후에는, 자석에서부터 자기 비즈를 개방하기 위해서, 자석은 소자(demagnetizable) 가능한 것도 필요하다.

비특허 문헌 1에는, 자기 비즈를 이용한 RT-PCR 반응법이 게재되어 있다. 이 문헌에 기재된 방법에서는, 실온에서의 반응은 용액 100에 대해 오일 1을 더하는 것으로, 액체방울을 유막으로 덮어서 증발 등을 방지하고 있다.

JP

2007-504835

A

Juergen Pipper1, Masafumi Inoue2, Lisa F-P Ng3, Pavel Neuzil1, 4, Yi Zhang1, 4 & Lukas Novak1, 4, NATURE MEDICINE VOLUME 13 NUMBER 10 OCTOBER 2007 pp1259-1263

상술한 바와 같이, 96혈 또는 384혈 등의 마이크로 웰 어레이를 이용하여, 복수 종류의 반응이나 세정의 조작을 병렬적으로 실시할 경우, 피펫을 이용하거나 자기 비즈를 이용한다고 해도, 조작에 사용하는 피펫이나 자기 비즈의 세정 또는 교환이 필요하여 조작은 번잡하다.

또한, 비특허 문헌 1에 기재된 방법과 같이, 액체방울을 유막으로 덮어서 증발 등을 방지하는 것도 조작으로서는 번잡하다. 특히, 다수의 액체방울을 이용할 경우, 이 번잡함은 무시할 수 없는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 조작마다 용액 등의 이동에 사용하는 기구를 세정 또는 교환하는 일 없이, 복수 종류의 반응이나 세정 조작을 병렬적으로 실시할 수 있는 장치 및 방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명은 액체방울을 유막으로 덮지 않고, 복수 종류의 반응이나 세정 조작을 병렬적으로 실시할 수 있는 장치 및 방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명은 이하와 같다.

(1) 기판의 일쪽 표면에 복수의 돌기 형태 울타리가 정렬되어 설치되어 있으며, 상기 돌기 형태 울타리는 적어도 1개의 컷아웃(cutout)부를 가지며, 또한, 내부에는 액체방울을 유지할 수 있는 공간이 있으며,

또한, 상기 기판 표면의 적어도 상기 액체방울을 유지하는 면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위인 것을 특징으로 하는 반응 지그.

(2) 상기 복수의 돌기 형태 울타리는, 적어도 일부 또는 전부가, 종횡으로 정렬되어 설치되어 있는 (1)에 기재된 반응 지그.

(3) 상기 돌기 형태 울타리의 액체방울 유지용 공간은, 0.5㎕∼200㎕ 범위의 양의 액체방울을 유지할 수 있는 (1) 또는 (2)에 기재된 반응 지그.

(4) 상기 돌기 형태 울타리는 2개 또는 3개의 컷아웃부를 가지며, 상기 컷아웃부의 개구 간격은 0.5∼10㎜의 범위인 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(5) 상기 기판 표면은 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지로 이루어진 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(6) 상기 기판은 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지로 이루어진 코팅층을 갖는 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(7) 각 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 동일 또는 다른 종류의 용액의 액체방울이, 다른 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간 부분에 놓인 액체방울과 섞이는 일 없이 보유되도록 이용되는 (1)∼(6)중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(8) 동일한 횡렬에 속하는 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 동일한 종류의 용액의 액체방울이 보유되도록 이용되는 (1)∼(7)중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(9) 상기 용액이 표면장력 저하 시약을 함유하는 반응액 또는 세정액인 (7) 또는 (8)에 기재된 반응 지그.

(10) 상기 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 커버하는 덮개 부재를 또한 가지며, 또한, 상기 덮개 부재가 덮인 공간에 습기를 공급하는 보습 부재를 또한 갖는 (1)∼(9)중 어느 하나에 기재된 반응 지그.

(11) (1)∼(10)중 어느 하나에 기재된 반응 지그를 이용하여 자기 비즈에 고정화한 물질을 상기 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 표면장력 저하 시약을 함유하는 용액의 액체방울 중에서, 상기 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여 차례대로 이동시킴으로써, 반응 및/또는 세정을 실시하는 것을 포함하는 반응 방법.

(12) (1)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 반응 지그에 있어서, 1개의 종렬에, 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하고,

상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 표면장력 저하 시약을 함유하는 세포 용해용 용액, 및 cDNA 합성용 용액의 액체방울을 이 순서로 각각 유지하고,

자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액에, 차례대로 기판의 돌기 형태 울타리를 가지는 표면과는 반대측의 표면으로부터 자석을 이용하여 이동시켜서 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻는 것을 포함한, cDNA의 합성 방법.

(13) 복수의 종렬에, 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하고,

각 횡렬의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액은 동일 종류의 용액이며,

종렬을 이동시키는 자기 비즈에 고정화한 mRNA는 다른 종류의 mRNA이며, 복수가 다른 종류의 cDNA를, 자기 비즈에 고정화한 cDNA로서 얻는 (12)에 기재된 방법.

(14) 상기 반응 지그는, 1개의 종렬에, 적어도 4개의 돌기 형태 울타리가 설치되며,

상기 4개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 세포 용해용 용액, mRNA 세정용 용액, cDNA 합성용 용액 및 cDNA 세정용 용액의 액체방울을 이 순서대로 각각 유지하고, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 4개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액에, 차례대로 이동시키는 (12) 또는 ( 13)에 기재된 방법.

(15) 상기 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 이용되는, (11)∼(14)중 어느 한 항에 기재된 방법.

본 발명에 의하면, 반응이나 세정 등의 조작마다 용액 등의 이동에 사용하는 기구를 세정 또는 교환하는 일 없이 복수 종류의 반응이나 세정의 조작을 병렬적으로 실시할 수 있는 장치 및 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 돌기 형태 울타리의 형상의 예를 나타낸 도면.
도 2는 본 발명의 반응 지그의 일례의 설명도.
도 3은 본 발명의 반응 지그를 이용하는 cDNA의 합성 방법의 설명도.
도 4는 항체 결합 자기 비즈를 이용한 반응예를 나타낸 도면.
도 5는 1 시료로, 복수의 항원을 검출하는 방법의 예를 나타낸 도면.
도 6은 실시예 2에서 얻은 전기 영동 사진(M: DNA 사이즈 마커, 1: 실험군과 대조군, 2: 10배 희석, 3: 백배 희석, 4: 천배 희석, 5: 1만배 희석, 6: 10만배 희석, 7: 백만배 희석, 8: 천만배 희석)
도 7은 실시예 3에서 얻은 반응 지그의 사진.

［반응 지그］

본 발명은, 기판의 일쪽 표면에 복수의 돌기 형태 울타리가 정렬되어 설치되어 있으며, 상기 돌기 형태 울타리는 적어도 1개의 컷아웃부를 가지며, 또한 내부에는 액체방울을 유지할 수 있는 공간을 갖는 반응 지그에 관한 것이다.

돌기 형태 울타리는 적어도 1개의 컷아웃 부분을 가지며, 또한 내부에는 액체방울을 유지할 수 있는 공간을 가질 수 있다. 돌기 형태 울타리의 형상은 구체적으로는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 용도에 따라, 여러 가지의 것으로 선택할 수 있다. 예를 들면, 도 1의 G에 나타낸 바와 같이, 컷아웃부가 1개인 돌기 형태 울타리일 수가 있다. 컷아웃부가 1개인 돌기 형태 울타리는, 예를 들면, 반응 개시 위치나 반응 종료 위치, 또는 최종 위치에 적절하다. 도 1의 A, C, E, F, H, I, M에 나타낸 바와 같이, 컷아웃부가 2개인 돌기 형태 울타리는 반응이나 세정 등, 공정 도중에 이용하는 것이 적합하다. 도 1의 J, K에 나타낸 바와 같이, 컷아웃부가 3개인 돌기 형태 울타리 및 도 1의 B, D, L에 나타낸 바와 같이, 컷아웃부가 4개인 돌기 형태 울타리는, 예를 들면, 반응이나 세정한 것을 2개 이상으로 분배하는 위치에 이용하는 것이 적합하다. 단, 이들 사용법으로 한정되는 의도는 아니다.

또, 1개의 반응 지그에 설치되는 돌기 형태 울타리는 1종류로 한정되지 않고, 복수가 다른 형상을 갖는 돌기 형태 울타리를 적절히 설치할 수도 있다.

돌기 형태 울타리의 내부에 형성되는 액체방울을 유지할 수 있는 공간의 용량은, 반응 지그의 용도나, 돌기 형태 울타리의 기능에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면, 0.5㎕∼200㎕의 범위일 수가 있다. 단, 이 범위로 한정되는 의도는 아니며, 액체방울을 유지할 수 있는 공간의 용량은, 용도에 따라 적절히 결정할 수 있다.

돌기 형태 울타리로서 u자 형태 돌기를 갖는 모양을 예로, 본 발명의 반응 지그에 대해서, 이하 도 2에 근거하여 다시 설명한다. u자 형태 돌기는, 도 1에는 도시하지는 않으나, 2개의 컷아웃을 가지며, 각 컷아웃이 형성하는 개구(틈새)의 치수가 다른 형상을 가진다. 개구 치수가 큰 쪽을 예를 들면, 입구로서 이용하고, 개구 치수가 작은 쪽을 예를 들면, 출구로서 이용할 수가 있다.

본 발명의 반응 지그(100)는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 기판(10)의 한쪽 표면(11)에 복수의 u자 형태 돌기(20)가 동일 방향을 향해 정렬되어 설치되어 있다. 상기 복수의 돌기는 종횡으로 정렬되어 설치되고 있다. u자 형태 돌기의 종렬을 구성하는 u자 형태 돌기의 수, 및 u자 형태 돌기의 횡렬을 구성하는 u자 형태 돌기의 수는, 반응 지그의 용도나 한 번에 처리하는 반응 조작의 수, 또, 기판(10)의 크기 및 형상, u자 형태 돌기(20)의 형상이나 크기, u자 형태 돌기(20)끼리의 간격 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있다. u자 형태 돌기의 종렬을 구성하는 u자 형태 돌기의 수는 예를 들면, 2∼10개, u자 형태 돌기의 횡렬을 구성하는 u자 형태 돌기의 수는 2∼100개일 수가 있다. 단, 이 범위로 한정되는 것은 아니다. 도 2의 반응 지그는, 가로 16열, 세로 8행의 u자 형태 돌기를 종횡으로 정렬하여 설치한 것이다.

u자 형태 돌기는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 컷아웃에 의해 형성된 틈새(21)를 통해 설치된 2개의 돌기(22, 23)로 구성된다. 또한, u자 형태 돌기의 내부에는 액체방울(40)을 유지할 수 있는 공간(30)을 가지며, 이 공간에 유지할 수 있는 액체방울의 양은, 예를 들면, 0.5㎕∼200㎕의 범위일 수가 있다. 단, 이 범위로 한정되는 것은 아니다. 돌기(22, 23)의 형상은, 공간(30)에 상기 양의 액체방울을 유지할 수 있으면 특별히 제한은 없다. 단, 공간(30)에 유지되는 액체방울을 공간 효율적으로 유지하는 관점에서, 부분 원 형태 또는 부분 타원 형태인 것이 바람직하다. 단, 한 개의 직선 모양 또는 복수의 직선으로 이루어지는 형상(예를 들면, 'V'형태)일 수도 있다. 돌기(22, 23)의 높이는, 공간(30)에 상기 양의 액체방울을 유지할 수 있으면 특별히 제한은 없다. 돌기(22, 23)의 높이는, 예를 들면, 0.1∼5㎜의 범위로 할 수 있다.

틈새(21)는, 후술하는 바와 같이, u자 형태 돌기의 내부의 공간(30)에 유지된 액체방울에서부터, 처리 조작을 완료한 자기 비즈에 고정화된 반응물을 다음 u자 형태 돌기의 내부의 공간(30)에 유지된 액체방울로 이동할 때, 자기 비즈를 고정화한 반응물과 함께 이동시키는 이동로이다. 따라서, 틈새(21)의 최단 간격은 자기 비즈가 용이하게 다음 u자 형태 돌기의 공간(30)에 이동할 수 있고, 또한, 자기 비즈와 함께 u자 형태 돌기의 공간(30)에 유지된 액체방울이, 다음 u자 형태 돌기의 공간(30)으로 이동하는 것을 방해하도록, u자 형태 돌기가 이동 방어벽으로서 기능 할 수 있다는 관점에서 결정된다. 이러한 관점에서, 틈새(21)의 최단 간격은, 예를 들면, 1∼10㎜의 범위일 수가 있다.

한편, 틈새(21)와 반대측의 돌기(22, 23) 말단은 개구 상태인 것이 자기 비즈의 이동을 용이하게 하고, 또한 액체방울 유지를 위한 공간을 형성한다는 관점에서 바람직하다.

본 발명의 반응 지그의 기판 표면의 적어도 액체방울을 유지하는 면은, 그 외의 기판 표면과 높낮이 차이가 없이, 평탄한 것이 기판의 제작이 용이하다는 점에서 바람직하다. 단, 본 발명의 반응 지그의 기판 표면의 적어도 액체방울을 유지하는 면은, 그 외의 기판 표면보다 낮게 구덩이(crater)를 형성하고 있을 수도 있다. 구덩이로 함으로써 액체방울의 유지는 평탄한 경우에 비해 쉬워진다. 그러나 유지된 액체방울로부터의 자기 비즈의 이동에 지장이 없을 정도의 구덩이의 깊이와 구덩이를 구성하는 면의 형상을 갖는 것이 적당하다. 구덩이를 구성하는 면 중, 적어도 돌기의 개구에 통하는 자기 비즈가 이동할 가능성이 있는 면에 대해서는 단차가 없는 곡면인 것이 적당하다. 또, 구덩이의 깊이는, 예를 들면, 돌기의 개구 치수의 1/2 이하인 것, 구덩이를 구성하는 면의 최대 경사는 45°이하인 것이 적당하다.

본 발명의 반응 지그의 기판 표면의 적어도 액체방울을 유지하는 면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위인 것이 공간으로의 액체방울 유지, 각 공간에 유지된 액체방울의 접촉을 막는다는 관점에서 적당하다. 돌기 형태 울타리의 내부에는, 돌기 형태 울타리에 의해 액체방울이 유지되지만, 돌기 형태 울타리만으로는, 후술하는 자기 비즈를 이용한 반응 조작으로 액체방울을 양호하게 유지할 수 없는 경우가 있다. 따라서 본 발명에서는, 돌기 형태 울타리의 내부에 액체방울이 양호하게 유지되기 위해서, 적어도 돌기 형태 울타리의 내부면은 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위인 표면으로 한다. 순수한 물에 대한 접촉각은, 표면을 형성하는 재료(재질)와 표면 상태(예를 들면, 표면 엉성함이나 표면 형상 등)에 의해 변화한다. 재질이 동일해도 표면 상태(예를 들면, 표면 거칠기나 표면 형상 등)가 다르면, 순수한 물에 대한 접촉각도 변화한다. 본 발명에서는, 표면을 형성하는 재료(재질)와 표면 상태(예를 들면, 표면 거칠기나 표면 형상 등)를 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°의 범위가 되도록 선택한다.

표면을 형성하는 재료(재질)로써는, 비교적 발수성이 높은 재료인 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지 등을 이용할 수가 있다. 기판 자체를 이들의 재료로 이루어지는 것으로 형성할 수도 있고, 기판은 다른 재료(예를 들면, 유리 기판으로 하여, 표면에 상기 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지 등의 코팅층을 형성할 수도 있다. 이들 수지는, 재료 자체의 발수성이 높고 평활한 표면에서도 상기 범위의 접촉각을 나타낼 수 있다. 그러나 필요에 따라서, 표면을 거칠게 함으로써, 접촉각을 조정할 수도 있다.

예를 들면, 파라핀 수지를 이용하는 경우, 도 2의 반응 지그에서 기판(10)의 표면에, 각 u자 형태 돌기의 u자 형태의 세로 방향과 병행인 방향으로 배향하는 미소 파형 요철(표면 조도)을 설치할 수가 있다. 이 미소 파형 요철은, u자 형태 돌기의 u자 형태의 세로 방향과 병행인 방향으로 배향하고 있으므로, 자기 비즈의 이동을 용이하게 한다는 기능이 있다.

미소 파형 요철은, 상기와 같은 기능을 발휘하는 것이라면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 높이가 1㎛∼1㎜의 범위이고, 또한 파장이 1㎛∼1㎜의 범위인 것일 수가 있다. 또한, 미소 파형 요철을 갖는 표면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위가 되도록 요철 형상을 조정한다.

각 u자 형태 돌기(20)의 공간(30)에는, 동일 또는 다른 종류의 용액 액체방울이, 다른 u자 형태의 돌기의 u자 형태 공간 부분에 놓인 액체방울과 섞이는 일없이, 유지되어 이용할 수 있다. 공간(30)에 액체방울로서 유지되는 용액은 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 반응액 또는 세정액일 수가 있다. 반응액 및 세정액의 종류는 본 발명의 반응 지그의 사용 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.

사용하는 반응액 및 세정액에는 표면장력 저하 시약을 첨가하는 것이 적당하다. 표면 장력 저하 시약에는 용액의 표면장력을 감소시켜서 소수성의 기판상에 액체방울을 안정적으로 유지시키는 효과가 있다. 또 표면장력 저하 시약에는 자기 비즈 집단이 액체방울 외에 이동할 때 방해가 되는 액체방울의 표면장력을 저하하는 효과를 가진다. 본 발명에서는, 상기와 같이 적어도 액체방울 유지 공간을 형성하는 표면의 순수한 물에 대한 접촉각은 90∼150° 범위로 하고, 비교적 발수성을 갖게 하여 그곳에 유지하는 액체방울에는, 표면장력 저하 시약을 첨가하는 것으로, 액체방울의 액체방울 유지 공간 표면 밖으로의 확대를 억제하고, 또한 액체방울의 액체방울 보유 공간 표면에 대한 부착성을 주어 유지력을 증대시키고, 그것에 의해 자기 비즈의 액체방울으로의 반입이나 반출 시에도, 액체방울의 액체방울 유지 공간 표면으로의 유지를 유지할 수 있다. 또, 인접하는 돌기 형태 울타리와 돌기 형태 울타리의 사이의 표면도 동일하게 순수한 물에 대한 접촉각은 90∼150°범위로 할 수가 있지만, 자기 비즈의 이동의 용이성 등을 고려하여 인접하는 돌기 형태 울타리와 돌기 형태 울타리의 사이의 표면은 다른 성질을 갖게 할 수도 있다.

또, 표면장력 저하 시약을 첨가함으로써 자기 비즈, 특히 입경이 비교적 작은 자기 비즈를 이용한 경우에도, 액체방울으로의 반출(침입)을 용이하게 할 수 있다는 이점이 있다.

표면장력 저하 시약은, 예를 들면, 순수한 물에서 0.1% 농도로 한 경우에서, 유리판상의 순수한 물의 접촉각(후술하는 표 1에 나타내는 측정 결과는 42°이다) 을 30°이하로 저하할 수 있는 시약인 것이 적당하다. 이와 같은 표면장력 저하 작용을 가지는 시약으로서는, 계면활성제 및 폐 서팩턴트(surfactant) 단백질 등의 리포프로테인(lipoprotein), 혈청알부민이나 리포프로테인이 많이 포함되는 혈청 등을 들 수 있다.

계면활성제에는 여러 가지의 것이 있으며, 종류에 관계없이 표면장력 저하 시약으로서 이용할 수가 있다. 이하에 예시를 하지만, 이들은 어디까지나 예시이며, 예시된 계면활성제로 한정되는 것은 아니다.

(1) 음이온계 계면활성제：지방산 나트륨, 모노알킬 황산염

(2) 양이온계 계면활성제：알킬폴리옥시에틸렌 황산염, 알킬 벤젠 설폰산염, 모노알킬린 인산염

(3) 양성 계면활성제：알킬트리메틸 암모늄염, 디알킬메틸암모늄염, 알킬 벤질 디메틸 암모늄염, 알킬디메틸아민옥시드, 알킬카르복시베타인,

(4) 비이온성 계면활성제：폴리옥시에틸렌알킬에테르, 지방산 솔비탄 에스테르, 알킬폴리글루콕시드, 지방산 디에탄올 아미드, 알킬모노글리세릴에테르

음이온계 계면활성제의 대표예로서 도데실 황산 리튬을 들 수 들고 있고, 비이온성 계면활성제의 대표예로서 TritonX100을 들 수 있다.

표면장력 저하 시약의 첨가량은, 상기 관점을 감안하여 표면장력 저하 시약의 종류와 액체방울 보유 공간 표면의 순수한 물에 대한 접촉각도 고려하여, 예를 들면, 0.001∼1%의 범위이며, 바람직하게는, 0.01∼1%의 범위이다. 단, 이 범위로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 반응 지그는, 다른 종류의 샘플에 대해 동일한 반응 처리 조작을 실시할 경우, 동일한 횡렬에 속하는 u자 형태 돌기의 공간에는 동일한 종류의 용액 액체방울이 보유되도록 이용할 수가 있다.

본 발명의 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 커버하는 덮개 부재를 또한 가지며, 또한 덮개 부재가 덮인 공간에 습기를 공급하는 보습 부재를 또한 가질 수가 있다. 예를 들면, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상자 형태 플라스틱 케이스(50)의 저부 개구부에 박층 유리판(10)을 설치하고, 그 위에 돌기 형태 울타리를 갖는 수지 필름(11)을 돌기가 플라스틱 케이스의 내부에 적합하도록 붙인다. 다시, 플라스틱 케이스의 상부 개구를 커버하는 덮개 부재(뚜껑; 60)를 설치할 수가 있다. 덮개 부재(뚜껑)(60)의 내부에는, 덮개 부재가 덮인 공간에 습기를 공급하는 보습 부재(예를 들면, 습식 여과지)(61)를 설치할 수 있다. 이러한 구성으로 함으로써, 소량의 액체방울을 취급하는 경우라도, 액체방울로부터의 수분의 휘발을 억제하여 반응이나 세정 조작 등을 양호하게 실시할 수가 있다. 자기 비즈는, 기판(10)의 돌기 형태 울타리(20)를 갖는 표면과는 반대측의 표면(도 2의 표면)으로부터 자석(예를 들면, 소형 네오디뮴 자석; 70)을 이용하여 차례대로 이동시켜서, 반응 및 세정 등의 조작을 실시할 수가 있다.

［반응 방법］

본 발명은, 상기 본 발명의 반응 지그를 이용하는 반응 방법을 포함한다. 본 발명의 반응 방법은, 자기 비즈에 고정화한 물질을 돌기 형태 울타리(예를 들면, 상기 u자 형태 돌기)의 공간에 유지된 표면장력 저하 시약을 함유하는 용액의 액체방울 중을 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여 차례대로 이동시켜서 반응 및 세정을 실시하는 것을 포함한다. 반응 및 세정을 실시하는 온도는 반응 및 세정에 적절한 온도를 고려하여 적절히 결정할 수 있으며, 공정마다 온도를 상하시켜서 조정할 수도 있다. 이 경우, 필요에 의해, 예를 들면, 상기 덮개 부재(50) 및/또는 (60)의 외측 또는 내부, 및/또는 박층 유리판(10)과 수지 필름(11)의 사이 또는 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에, 가열 및/또는 냉각 장치를 설치할 수도 있다.

상기 본 발명의 반응 방법에서, 상기 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 이용되는 것이 바람직하다. 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 이용하면, 돌기 형태 울타리에 수용된 액체방울은 행잉 드롭(hanging drop) 형태가 된다. 이러한 상태로, 반응 방법을 실시하면 증기는 가볍기 때문에 위로 증발해 가려고 하므로, 액체방울이 행잉 드롭 형태면 증발을 억제하는 것이 가능하다. 그 결과, 개방계에서의 실시에서도, 실온에서는 증발이 매우 억제된다. 또한, 반응 지그의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 덮개 부재안이 되도록 수용하는 것, 또는, 반응 지그의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 보습 부재를 수용한 덮개 부재중에 설치하는 것으로, 액체방울로부터의 물의 증발을 한층 더 방지할 수 있다. 이와 같이 함으로써 비특허 문헌 1과 같이 오일을 이용하는 일 없이, 액체방울로부터의 수분의 증발을 억제하는 것이 가능하다. 오일을 이용하지 않으면, 수 마이크로 리터라는 미량의 반응액에서도 오일이 피펫에 부착하지 않기 때문에 용액의 첨가·회수가 수시로, 용이하게 실시할 수 있다는 이점이 있다. 실온에서 바람이 불지 않는 조건이라면, 보습제를 이용하지 않고, 폐쇄계에도 하지 않은(덮개 부재(용기)에 넣지 않는다) 경우에서도, 수 마이크로 리터의 행잉 드롭을 수시간은 건조하지 않고 유지하는 것은 가능하다. 다만, 효소 반응을 실시하게 하는 온도가 실온보다 높을 경우, 예를 들면, 효소 반응을 50℃ 부근에서 실시하는 경우에는, 증발을 무시할 수 없게 된다. 이 경우에는, 보습제를 넣은 용기(덮개 부재) 내에 들어갈 수 있어, 반응 등의 조작을 실시하는 것이 바람직하다.

반응 지그의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 덮개 부재안이 되도록 수용하는 경우는, 반응 등의 조작을 실시하기 전 및 조작중, 반응 지그와 덮개 부재로 형성된 내부를, 반응 등에 영향이 없는 범위에서, 예를 들면, 30∼40℃로 가온하는 것이 바람직하다. 가온에 의해 생기는 수증기가 기판 표면상에서 응결하여 매우 작은 액체방울이 형성되어 자기 비즈의 액체방울로부터의 이동을 순조롭게 하는 작용이 있기 때문이다. 특히, 표면장력 저하능이 비교적 낮은 시약(구체적으로는 계면활성제 이외의 시약)을 이용하는 경우에는, 상기 가온에 의해, 자기 비즈의 이동이 보다 순조롭게 된다는 이점이 있다. 또, 기판 표면상에서의 수증기의 응결을 촉진한다는 관점에서, 덮개 부재로 덮인 반응 지그를 냉각하는 것, 예를 들면, 비교적 저온의 실내에서 조작을 할 수도 있다.

또, 액체방울을 행잉 드롭 형태로 하는 또 하나의 이점으로서, 액체방울 중의 자기 비즈의 교반이 촉진되는 점을 들 수 있다. 자석을 기판에서 떼어 놓으면, 자석에 흡인되고 있던 액체방울 중의 자기 비즈는 중력에 의해 행잉 드롭 형태의 액체방울 저부에 낙하하고, 다시 자석을 기판에 접촉시킴으로써, 자기 비즈가 액체방울 저부에서부터 기판 표면에 집합한다. 이 조작에 의해 자기 비즈의 세정이나 효소 반응 등의 효율을 상승시킬 수가 있다. 자석에 의한 행잉 드롭 형태의 액체방울 중의 자기 비즈의 흡인과 낙하는, 1회에서도 여러 차례 반복하여 실시할 수도 있다.

자기 비즈는, 시판의 자기 비즈를 사용할 수 있다. 자기 비즈의 입경은 예를 들면, 0.01㎛∼2㎜의 범위, 바람직하게는 0.1㎛∼0.1㎜의 범위일 수가 있다. 단, 자기 비즈의 입경이 나노 사이즈가 되어 작아지면, 액체방울으로의 침입(반입)이 곤란하게 되는 경우가 있다. 이 경우는, 보다 큰 입경을 갖는 자기 비즈를 캐리어로서 병용함으로써, 액체방울으로의 침입(반입)을 용이하게 할 수가 있다. 캐리어로서 병용하는 비즈에는, 물질을 고정화하지 않지만, 물질을 고정화한 캐리어 비즈를 병용할 수도 있다.

또한, 자기 비즈의 표면에는, 본 발명의 반응 방법에서 반응 처리하는 대상물인 물질을 고정화한다. 물질의 고정화는, 통상의 방법에 의해 실시할 수가 있다. 반응 처리하는 대상물인 물질은, 특별히 제한은 없고, 핵산(DNA, RNA등), 펩티드, 단백질, 당류, 지질, 복합 당지질, 천연저분자, 합성저분자, 고분자 화합물, 금속 등을 들 수가 있다. 본 방법은 핵산, 단백, 지질, 당질, 복합 당질, 화학물질의 대규모·미량 연속 반응에 응용 가능하며, 고정화 세포(1로부터 수십 개)의 면역 염색에도 이용 가능하다.

자기 비즈에 대한 반응 처리하는 대상물인 물질의 고정화량은, 물질의 종류나 반응의 종류 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있다.

본 발명의 반응 방법의 일례로서 cDNA의 합성 방법을 들 수 있다.

본 발명의 cDNA의 합성 방법은, 상기 본 발명의 반응 지그에서 1개의 종렬에, 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용한다. 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 표면장력 저하 시약을 함유하는 세포 용해용 용액, 및 표면장력 저하 시약을 함유하는 cDNA 합성용 용액의 액체방울을 이 순서대로 각각 유지하고, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액에, 차례대로, 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서 자석을 이용하여 이동시켜서, 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻는 것을 포함한다.

상기 본 발명의 cDNA의 합성 방법에서, 상술한 바와 같이, 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 사용하는 것이 바람직하다. 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 이용하면, 돌기 형태 울타리에 수용된 액체방울은 행잉 드롭 형태가 되어, 수분의 증발 억제와 자기 비즈의 교반촉진 효과를 얻을 수 있다.

이 본 발명의 cDNA의 합성 방법은, 바람직하게는 1개의 종렬에, 적어도 4개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용한다. 상기 4개의 돌기 형태 울타리(예를 들면, u자 형태 돌기)의 공간에는, 세포 용해용 용액, mRNA 세정용 용액, cDNA 합성용 용액 및 cDNA 세정용 용액의 액체방울을 이 순서대로 각각 유지하고(도 3 참조), 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 4개의 돌기 형태 울타리의 공간에 유지된 용액에, 차례대로 기판의 돌기를 설치한 것과는 반대측의 표면에서 자석을 이용하여 이동시킨다. 그것에 의해, 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻는다.

본 발명의 cDNA의 합성 방법에 사용하는 반응 지그의 u자 형태 돌기의 공간의 용량은, 예를 들면, 0.5∼100㎕의 범위로 하는 것이 적당하다.

제1 u자 형태 돌기의 공간에 유지되는 세포 용해용 용액은, 예를 들면, 100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 리튬 5mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol)을 포함한 전량 3㎕의 용액일 수가 있다.

제2 u자 형태 돌기의 공간에 유지되는 mRNA 세정용 용액은, 10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% 도데실 황산 리튬을 포함한 전량 3㎕의 용액일 수가 있다.

제3 u자 형태 돌기의 공간에 유지되는 역전사 반응용 세정 용액은, 50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor을 포함한 전량 3㎕의 용액일 수가 있다.

제4 u자 형태 돌기의 공간에 유지되는 역전사 반응용 용액은, 50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 10 unit SuperScript III Reverse transcriptase를 포함한 전량 3㎕의 용액일 수가 있다.

단, 이들은 예시이며, 이들 용액으로 한정되는 것은 아니다.

자기 비즈에 고정화한 mRNA를 준비한다. mRNA의 종류나 길이 등에는 특별히 제한은 없다. 여러 가지의 생물 유래의 mRNA를 이용할 수가 있다. 자기 비즈로서는, 예를 들면, 입자계 2.8㎛, oligo dT25가 표면에 공유결합된 것을 이용할 수 있다. mRNA의 자기 비즈로의 고정화는 이하와 같이 실시할 수 있다.

세포 용해용 용액에 자기 비즈를 농도 10㎎/㎖이 되도록 현탁하고, 이것에 세포 1에서 100개를 더한다. 상기의 조작에 의해, 세포내의 mRNA는 그 polyA 테일(tail)을 통해 비즈상에 고정화된 oligo dT25에 결합한다.

기판의 돌기를 설치한 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 4개의 u자 형태 돌기의 공간에 유지된 용액(액체방울)에, 차례대로 이동시킨다. 자석으로서는, 예를 들면, 소형 네오디뮴 자석을 이용할 수가 있다. 각 액체방울 중에서는, 반응 또는 세정에 필요한 시간 체류시킨다. 반응 또는 세정에 필요한 시간은, 반응 조건, 세정 조건에 따라서 다르지만, 예를 들면, 1초∼1시간의 범위일 수가 있다.

상기 반응 및 세정은, 상온(실온)에서 실시할 수 있지만, 필요에 의해, 온도 조절을 할 수도 있다. 또한, 액체방울의 양이 소량인 경우, 용액 중의 용매가 증발하는 것도 있기 때문에, 반응 지그를 밀폐 용기에 넣어 용기 중의 습도를 일정하게 유지함으로써 용매의 증발을 막는 것이 바람직하다. 용기 중의 습도를 일정하게 유지하는데는 물 또는 적당한 수용액을 포함한 용기를 상기 밀폐 용기에 공존시킬 수가 있다.

상기 4개의 u자 형태 돌기의 공간에 유지된 용액(액체방울)에, 차례대로 자기 비즈에 고정화한 mRNA를 체류 및 통과시킴으로써 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻을 수 있다. 얻어진 cDNA는 자기 비즈로부터 잘라내는 일 없이, 이후 공정에 사용할 수 있다.

상기 cDNA의 합성 방법에서는, 복수(예를 들면, 2∼50개)의 종렬에, 적어도 4개의 u자 형태 돌기가 설치된 반응 지그를 이용하여 각 횡렬의 u자 형태의 돌기에 유지된 용액은 동일하고, 종렬을 이동시키는 자기 비즈에 고정화한 mRNA는, 다른 종류의 mRNA이며, 복수의 다른 종류의 cDNA를, 자기 비즈에 고정화한 cDNA로서 얻을 수 있다.

도 4에 항체 결합 자기 비즈를 이용한 반응예를 나타낸다. 도 4는, 반응 지그를 하부에서 보았을 때의 도면이며, 액체방울은 행잉 드롭되어 있다. 이 반응에서는, 목적 항원에 대한 특이적 항체가 결합한 자기 비즈를 이용한다.

제1열에 항체 자기 비즈(0.1%Triton X-100, 150mM NaCl, 10mM 인산 나트륨-칼륨 완충액, pH7.0, 입자계 2.8㎛∼1.0㎛의 항체 결합 자기 비즈 25㎍/3㎕), 제2열에 검체 시료, 3열에 세정액(0.1%Triton X-100, 150mM NaCl, 10mM 인산 나트륨-칼륨 완충액, pH7.0), 4열에 표식 항체(목적 항원에 특이적이며, 자기 비즈에 고정화된 항체와는 다른 항원의 에피토프(epitope)를 표식하는 것, 및 알카리포스파타제 표식, 퍼옥시다제 표식, 형광 색소 표식, 또는 금 입자 등의 표식이 실시되어 있는 것), 5열에 세정액, 6열에 발색액을 스폿해 둔다. 또한, 스폿을 형성하는 각 용액의 조성은 예시이며 이들로 한정되는 것은 아니다.

소형 자석을 이용하여 제1열 액체방울내의 항체 자기 비즈를 제2열의 검체 시료 액체방울에 이동시켜서, 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 항원-항체 반응을 실시한다. 그동안, 플레이트를 반전, 또는 자석을 이용하여 액체방울 저부에 낙하한 자기 비즈를 플레이트 상부에 이동시켜서 자기 비즈의 교반을 실시한다.

자기 비즈를 제3열의 세정액에 이동시킨 후, 예를 들면, 5분간 비즈의 교반·세정한다.

자기 비즈를 제4열의 표식 항체 액체방울에 이동시킨 후, 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 항원-항체 반응을 실시한다. 그동안, 플레이트를 반전, 또는 자석을 이용하여 액체방울 저부에 낙하한 자기 비즈를 플레이트 상부에 이동시켜서 자기 비즈 교반을 실시한다.

자기 비즈를 제5열의 세정액에 이동시킨 후, 예를 들면, 5분간 자기 비즈 교반·세정한다.

자기 비즈를 제6열의 발색 액체방울에 이동시킨 후, 표식 화합물에 따른 발색 또는 화학 발광 반응을 실시한다. 자기 비즈가 검출을 방해하는 경우, 반응을 정지하는 경우에는, 자기 비즈를 제7열에 이동시켜서 제6열의 액체방울의 발색 또는 화학 발광을 측정할 수도 있다.

이와 같이 하여, 항체 결합 자기 비즈를 이용하여 반응을 실시할 수가 있다

도 5에 1 시료로, 복수의 항원을 검출하는 방법의 예를 나타낸다. 여기에서는 3종류의 항원을 1 검체로부터 동시 검출하는 예를 나타낸다.

제1열 액체방울 보유용 돌기(1, 2, 3)에 항원 A, B, C에 특이적인 항체 자기 비즈를 스폿한다.

제2열에 검체 시료, 제3열에 세정액(0.1%Triton X-100, 150mM NaCl, 10mM 인산 나트륨-칼륨 완충액, pH7.0), 제4열에 표식 항체(목적 항원에 특이적이고, 자기 비즈에 고정화된 항체와는 다른 항원의 에피토프를 인식하는 것, 및 알카리포스파타제 표식, 퍼옥시다제 표식, 형광 색소 표식, 또는 금 입자 등의 표식이 실시되고 있는 것), 제5열에 세정액, 제6열에 발색액을 스폿해 둔다. 또한, 스폿을 형성하는 각 용액의 조성은 예시이며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

제1열 액체방울 보유용 돌기(1) 항체 자기 비즈를 제2열의 검체 시료 액체방울에 이동시킨다. 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 반응을 실시하여 자기 비즈(1)에 결합시킨 후, 자기 비즈를 제3열의 세정 액체방울(1)에 이동시킨다.

제1열 액체방울 유지용 돌기(2)의 항체 자기 비즈를 제2열 검체 시료 액체방울에 이동시킨다. 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 반응을 실시하여 항원 B를 자기 비즈(2)에 결합시킨 후, 자기 비즈를 제3열 세정물방울(2)에 이동시킨다.

제1열 액체방울 보유용 돌기(3)의 항체 자기 비즈를 제2열 검사대상 물체 시료 액체방울에 이동시킨다. 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 반응을 실시하여 항원 C를 자기 비즈(3)에 결합시킨 후, 자기 비즈를 제3열 세정 물방울(3)에 이동시킨다.

자기 비즈(1,2,3)을 각각 제4열 표식 항체 액체방울(1,2,3)에 이동시킨 후, 예를 들면, 실온에서 10분부터 60분간 항원-항체 반응을 실시한다.

자기 비즈(1,2,3)를 각각 제5열 세정 액체방울(1,2,3)에 이동시킨다.

자기 비즈(1,2,3)을 각각 제6열 발색 액체방울(1,2,3)에 이동시켜서 일정시간 발색 또는 화학 발광 반응을 실시하고, 얻어진 발색 또는 발광을 검출기를 이용하여 측정한다.

이와 같이, 복수의 항원을 검출하는 방법을 실시할 수가 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 플라스틱 플레이트(127㎜×86㎜×15㎜)(50)의 저면을 잘라내고, 여기에 박층 유리판(두께 0.15㎜)(10) 또는 플라스틱판(두께 0.15 ㎜)을 끼워 넣는다. 소형 네오디뮴 자석의 자력이 불충분하기 때문에, 플레이트 저면을 박판으로 바꾸었다.

상기 박층 유리판상에, 파라핀 수지 필름(상품명 파라필름)(11)을 압착시켰다. 파라핀 수지 필름에는 신축 방향과 직교하는 방향으로 미세한 홈이 형성되고 있고, 이 홈은, 자기 비즈의 이동시에 가이드로서 도움이 된다. 파라핀 수지 필름은 튤립형의 돌기 등의 형성을 용이하게 한다.

상기 파라핀 수지 필름상에는, 미리 튤립형의 돌기를 필요 수로, 지그를 이용하여 제조해 두었다. 파라핀 수지 필름상에 제조된 상기 돌기는, 자기 비즈의 세정, 효소 반응 등에 이용하는 용액을 필름상에 안정하게 유지하기 위한 u자 형태 돌기이다. 도 2 참조. 1∼16열, A행∼H행의 튤립형의 돌기를 갖는다. 파라핀 수지 필름의 순수한 물에 대한 접촉각은, 112°였다.

또한, 파라핀 수지, 테프론 수지, 실리콘 수지, 유리판, 아크릴판 및 동판의 순수한 물에 대한 접촉각 및 0.1% TritonX100(계면활성제) 수용액에 대한 접촉각을 이하의 표 1에 나타낸다.

측정은 이하와 같다. 순수한 물 3㎕을 각종 재료 표면에 정치하여 5분 후의 액체방울의 상태를 현미경으로 관찰하였다. 액체방울의 높이 A 및 재료 표면과 접촉하고 있는 옆의 길이 B를 측정하여, 물의 접촉각 θ이하의 계산식에 의해 구하였다.

	순수한 물에 대한 접촉각	0.1% TritonX100 수용액에 대한 접촉각
파라핀 수지	112	55
테프론 수지	102	40
실리콘 수지	100	59
유리판	42	ND
아크릴판	84	ND
동판	81	ND

ND: 액체방울이 표면에 퍼져 측정 불능

자기 비즈의 이동에는, 직경 1.5㎜, 높이 2㎜의 원주상 네오디뮴 자석을 사용하였다.

실시예 1

5＇- RACE 용 cDNA 제조

이하에 기재하는 프로토콜에 따라서 5＇-RACE용 cDNA를 제조하였다.

[용액의 분주]

mRNA 결합성 자기 비즈(25㎍)를 포함한 세포 용해액 3㎕에 B 임파구 1개에서 100개를 더하여 용해시키고, 세포로부터 방출된 mRNA를 mRNA 결합성 자기 비즈상에 포착한다.

A행의 튤립형 돌기의 중심부에 상기 용액 2∼3㎕를 스폿한다(세포 용해 액체방울).

B행의 튤립형 돌기의 중심부에, 자기 비즈 세정액 2∼3㎕를 스폿한다(세포 세정 액체방울).

C행의 튤립형 돌기의 중심부에, 역전사 반응용 세정액 2∼3㎕를 스폿한다(역전사 반응용 세정 액체방울).

D행의 튤립형 돌기의 중심부에, 역전사 반응액 2∼3㎕를 스폿한다(역전사 반응용 액체방울).

E행의 튤립형 돌기의 중심부에, 3＇-테일링 반응용 세정액 2∼3㎕를 스폿한다(3＇-테이링 반응용 세정 액체방울).

F행의 튤립형 돌기의 중심부에, 3＇-테이링 반응액 2∼3㎕를 스폿한다(3＇-테이링 반응용 세정 액체방울).

G행에 반응 정지액 2∼3㎕을 스폿한다.

H행에 PCR 반응액 2∼3㎕을 스폿한다.

플레이트에 뚜껑을 씌운 후 이를 반전시켜서, 용액을 행잉 드롭으로서 필름상에 유지한다(증발 방지 및 중력에 의한 자기 비즈 교반때문). 뚜껑의 안쪽에는 물을 스며들게 한 여과지를 압착한다(증발 방지 때문).

[A행으로부터 B행으로의 이동]

플레이트 저면의 박층 유리판상으로부터 A행의 세포 용해 액체방울의 중심부를 향해 소형 네오디뮴 자석을 설치해 1초 정치시킨다.

A행의 세포 용해 액체방울로부터 B행의 mRNA 세정용 액체방울을 향해 소형 네오디뮴 자석을 2초 정도 걸쳐 천천히 슬라이드시킨다. 이때 mRNA를 결합한 자기 비즈 집단은 수십 나노 리터의 물방울로서 A행의 세포 용해 액체방울로부터 멀어져 B행의 mRNA 세정용 액체방울로 이동한다.

소형 네오디뮴 자석을 유리판으로부터 떼어 놓는다. 자력으로 수지성 필름상에 집적한 자기 비즈는, 중력에 의해 mRNA 세정 액체방울 저부를 향해 낙하한다. 이때 자기 비즈 주변에 부착한 용액의 세정이 실시된다. 필요하다면 플레이트를 전후좌우로 기울여서 자기 비즈를 액체방울 중에서 교반시키고 더욱 세정 효율을 높인다.

[B행으로부터 C행으로의 이동]

자기 비즈가 액체방울 저부에 낙하한 후, 상기의 조작과 같이 소형 네오디뮴 자석을 B행의 mRNA 세정용 액체방울의 중심부에 1 초간 정치시키고, 이어서 C행의 역전사 반응용 세정 액체방울에 이동시킨다.

[C행으로부터 D행으로의 이동]

역전사 반응

D행의 역전사 반응용 액체방울에 자기 비즈를 이동시킨 후, 플레이트는 반전시킨 채로, 37∼50℃의 보온 장치에 넣고 1시간 보온한다. 그동안 10분마다 플레이트를 반전 또는 전후좌우로 기울여서 자기 비즈를 액체방울 중에서 교반시켜서 충분한 효소 반응을 실시한다.

[D행으로부터 E행으로의 이동]

자기 비즈의 세정을 실시한다.

[E행에서 F행으로의 이동]

3＇-테일링 반응　

플레이트를 반전시켜서 37℃에서 1시간 보온한다. 역전 전사 반응과 동일한 자기 비즈 교반을 실시한다.

[F행으로부터 G행으로의 이동에 이은 G행에서 H행으로의 이동]

H행에 이동시킨 액은 그대로, 5＇-RACE법에 의한 DNA의 증폭에 이용할 수가 있다.

실시예 2

RNA 바이러스, 레토르 바이러스 함유 시약으로부터의 cDNA 합성법

성인 1명의 T세포 백혈병 바이러스-1형(HTLV-I)은 한개 사슬 RNA를 게놈으로서 갖는 인간 레토르 바이러스이다. 세포 상청액 중에 분비된 레토르 바이러스를, 본 발명을 이용해 검출하기 위해, HTLV-I를 생산하는 세포주(MT2) 1만개를, 1㎖의 RPMI-10% 소태아 혈청 배양지를 이용하여 24 well 세포 배양 접시에서 24시간 배양했다. 우선, 본세포 배양액에 DNase I를 더하여 37℃, 15분간 처리함으로써 혼입한 세포 유래의 게놈 DNA를 분해하였다. 본 용액 1㎕를, 세포 용해용 용액(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 리튬 5mM 디티오쓰레이톨)로 각각 10배에서 1000 만배로 10배 잘게 썰어 희석하여 7종류의 희석 샘플을 조제하였다. 각 희석 샘플 1㎕를, Oligo-dT자기 비즈를 농도 10mg/ml가 되도록 현탁한 세포 용해용 용액(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 리튬 5mM dithiothreitol) 2㎕에 더하여 실시예 1과 동일한 방법으로 E행의 역전사 반응까지를 7 샘플 병행하였다. 또한, 희석 샘플을 포함하지 않는 세포 용해용 용액도 실험군과 대조군(nagative control)으로서 E행의 역전사 반응까지를 7 샘플에 병행하여 실시하였다.

A행은, 100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 리튬 5mM 디티오쓰레이톨을 포함한 전량 3㎕의 용액이다.

B행은, 10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% 도데실 황산 리튬을 포함한 전량 3㎕의 용액이다.

C행은, 50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor를 포함한 전량 3㎕의 용액이다.

D행은, 50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript Ⅲ Reverse transcriptase를 포함한 전량 3㎕의 용액이다.

E행은, 10mM Tris HCl (pH 7.5), 0.1% Triton X-100, 0.1mM EDTA를 포함한 전량 3㎕ 용액이다.

E행의 용액으로부터 반응액 1㎕를 이용해 세포 배양액 중에 존재하는 HTLV-I바이러스를 PCR법에 의해 검출하였다. PCR법은 다카라 바이오의 프라임 스타 내열성 DNA 폴리메라제, 프라이머 5＇-gaggacggcttgacaaacatgggg-3＇및 5＇-acagaagtctgagaaggtcagggc-3＇를 이용해 94℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초의 반응을 40 사이클 실시하였다. PCR 반응 산물을 2% 아가로스 겔을 이용한 전기 영동법에 의해 해석한 바(도 6 참조), 세포 배양액을 10배에서 1만배 희석한 샘플에서도 특이적인 HTLV-1 게놈의 증폭이 인정되었다.

실시예 3

소혈청알부민을 포함한 액체방울로부터의 자기 비즈 이동

A행에 각각, 자기 비즈(입경 2.8㎛의 Dyanabeads) 25㎍를 포함한 PBS(10mM phosphate buffer, 120mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.6)를 3㎕, 또는 자기 비즈(입경 2.8㎛의 Dyanabeads) 25㎍를 포함한 1% 소혈청알부민-PBS 3㎕를 스폿했다. B행에는 1% 소혈청알부민-PBS를 스폿했다. 이것을 도 2에 나타내는 반응 지그에서 37℃에서로 30분 가온하고, 가온에 의해 생기는 수증기가 기판 표면상에서 응결하여 미소한 액체방울이 형성되는 것을 촉진하였다. 항상 실온은 20℃였다. 그 후 실온에서 5분간 방치하고, 소형 자석을 이용하여 A행 액체방울내의 자기 비즈의 B행으로의 이동을 시도했다. 이동 후의 반응 지그의 사진을 도 7에 나타낸다. 그 결과, 소혈청알부민을 함유하는 액체방울에 대해 자기 비즈의 이동이 인정되었지만, 소혈청알부민을 함유하지 않는 액체방울에 대해 자기 비즈의 이동이 인정되지 않았다.

(산업상의 이용가능성)

본 방법은 핵산, 단백질, 지질, 당질, 복합 당질, 화학물질의 대규모·연속 반응에 응용 가능. 고정화 세포(1에서부터 수십 개)의 면역 염색에도 이용 가능하다.

<110> National University Corporation University of Toyama <120> Reaction apparatus, reaction method and synthesis of cDNA <130> A85291H <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gaggacggct tgacaaacat gggg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 acagaagtct gagaaggtca gggc 24

Claims

기판의 일측의 표면에 복수의 돌기 형태 울타리가 정렬되어 설치되어 있으며; 상기 돌기 형태 울타리는 적어도 1개의 컷아웃부를 갖는 U자 형태 돌기로 구성되며; 상기 U자 형태 돌기는 내부의 바닥 표면상에 액체방울을 유지할 수 있는 공간을 감싸고; 상기 컷아웃부는 상기 U자 형태 돌기를 나누고, 바닥 표면을 갖는 틈새를 형성하며; 상기 공간의 바닥 표면, 상기 틈새의 바닥 표면 및 상기 공간 및 틈새 이외의 기판 표면은 높낮이 차이가 없이 평탄하고;
또한, 상기 기판 표면의 적어도 상기 액체방울을 유지하는 면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°범위인 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
상기 복수의 돌기 형태 울타리는 적어도 일부 또는 전부가 종횡으로 정렬되어 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 돌기 형태 울타리의 액체방울 유지용 공간은, 0.5㎕∼200㎕의 범위 양의 액체방울을 보유할 수 있는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
상기 돌기 형태 울타리는, 2개 또는 3개의 컷아웃부를 가지며, 상기 컷아웃부 개구 간격은 0.5∼10㎜의 범위인 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
상기 기판 표면은, 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지로 이루어진 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
상기 기판은, 파라핀 수지, 테프론 수지 또는 실리콘 수지로 이루어진 코팅층을 갖는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
각 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는 동일 또는 다른 종류의 용액의 액체방울이 다른 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간 부분에 놓여진 액체방울과 섞이는 일 없이 보유되도록 사용되는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
동일한 횡렬에 속하는 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 동일한 종류의 용액의 액체방울이 보유되도록 이용되는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 7 또는 8에 있어서,
상기 용액이, 표면 장력 저하 시약을 함유하는 반응액 또는 세정액인 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 있어서,
상기 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 커버하는 덮개 부재를 또한 가지며, 또한, 상기 덮개 부재가 덮인 공간에 습기를 공급하는 보습 부재를 또한 갖는 것을 특징으로 하는 반응 지그.
청구항 1에 기재된 반응 지그를 이용하여 자기 비즈에 고정화한 물질을 상기 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 표면장력 저하 시약을 함유하는 용액의 액체방울 중에서, 상기 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여, 차례대로 이동시키는 것으로, 반응 및/또는 세정을 실시하는 것을 포함하는 대상물인 물질을 반응 및/또는 처리하기 위한 반응 방법.
청구항 1에 기재된 반응 지그에 있어서, 1개의 종렬에, 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하고,
상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 표면장력 저하 시약을 함유하는 세포 용해용 용액, 및 cDNA 합성용 용액의 액체방울을 이 순서로 각각 유지하고,
자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액에, 차례대로 기판의 돌기 형태 울타리를 가지는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여 이동시켜서 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻는 것을 포함한, cDNA의 합성 방법.
청구항 12에 있어서,
복수의 종렬에, 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하고,
각 횡렬의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액은 동일 종류의 용액이며, 종렬을 이동시키는 자기 비즈에 고정화한 mRNA는 다른 종류의 mRNA이며, 복수의 다른 종류의 cDNA를 자기 비즈에 고정화한 cDNA로서 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 반응 지그는, 1개의 종렬에, 적어도 4개의 돌기 형태 울타리가 설치되며,
상기 4개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에는, 세포 용해용 용액, mRNA 세정용 용액, cDNA 합성용 용액 및 cDNA 세정용 용액의 액체방울을 이 순서대로 각각 유지하고,
자기 비즈에 고정화한 mRNA를 상기 4개의 돌기 형태 울타리의 액체방울 보유용 공간에 보유된 용액에, 차례대로 이동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 사용되는 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 반응 지그는 돌기 형태 울타리를 갖는 표면을 하향으로 하여 사용되는 방법.