JPWO2009091048A1 - 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有し、
かつ
前記基板表面の少なくとも前記液滴を保持する面は、純水に対する接触角が90〜150°の範囲である
ことを特徴とする反応治具。
(2)前記複数の突起状囲いは、少なくとも一部または全部が、縦横に整列して設けられている(1)に記載の反応治具。
(3)前記突起状囲いの液滴保持用空間は、0.5μl〜200μlの範囲の量の液滴を保持できる(1)または(2)に記載の反応治具。
(4)突起状囲いは、2つまたは3つの切欠き部を有し、前記切欠き部の開口の間隔は0.5〜10mmの範囲である(1)〜(3)のいずれかに記載の反応治具。
(5)前記基板表面は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなる(1)〜(4)のいずれかに記載の反応治具。
(6)前記基板は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなるコーティング層を有する(1)〜(4)のいずれかに記載の反応治具。
(7)各突起状囲いの液滴保持用空間には、同一または異なる種類の溶液の液滴が、他の突起状囲いの液滴保持用空間部分に置かれた液滴と混ざることなく、保持されるように用いられる(1)〜(6)のいずれかに記載の反応治具。
(8)同一の横列に属する突起状囲いの液滴保持用空間には、同一の種類の溶液の液滴が保持されるように用いられる(1)〜(7)のいずれかに記載の反応治具。
(9)前記溶液が、表面張力低下試薬を含有する反応液または洗浄液である(7)または(8)に記載の反応治具。
(10)前記突起状囲いを有する表面をカバーする覆い部材をさらに有し、かつ前記覆い部材が覆われた空間に湿気を供給する保湿部材をさらに有する(1)〜(9)のいずれかに記載の反応治具。
(11)(1)〜(10)のいずれかに記載の反応治具を用い、
磁気ビーズに固定化した物質を、上記突起状囲いの液滴保持用空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中で、前記基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させることにより、反応及び/または洗浄を行うことを含む、反応方法。
(12)(1)〜(10)のいずれかに記載の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及びcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、
磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む、cDNAの合成方法。
(13)複数の縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
各横列の突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液は、同一種類の溶液であり、
縦列を移動させる磁気ビーズに固定化したmRNAは、異なる種類のmRNAであり、
複数の異なる種類のcDNAを、磁気ビーズに固定化したcDNAとして得る、(12)に記載の方法。
(14)前記反応治具は、1つの縦列に、少なくとも4つの突起状囲いが設けられ、
前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間には、細胞溶解用溶液、mRNA洗浄用溶液、cDNA合成用溶液及びcDNA洗浄用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次移動させる、(12)または(13)に記載の方法。
(15)前記反応治具は、突起状囲いを有する表面を下向きにして用いられる、(11)〜(14)のいずれかに記載の方法。
本発明は、基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有する反応治具に関する。
(1)陰イオン系界面活性剤:脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩
(2)陽イオン系界面活性剤:アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩
(3)両性界面活性剤:アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、
(4)非イオン性界面活性剤:ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル
陰イオン系界面活性剤の代表例として、ドデシル硫酸リチウムをあげることができ、非イオン性界面活性剤の代表例として、TritonX100をあげることができる。
本発明は、上記本発明の反応治具を用いる反応方法を包含する。本発明の反応方法は、磁気ビーズに固定化した物質を突起状囲い(例えば、上記ハの字型突起)の空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中を、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させて、反応及び洗浄を行うことを含む。反応及び洗浄を行う温度は、反応及び洗浄に適した温度を考慮して適宜決定でき、工程ごとに、温度を上下させて調整することもできる。その場合、必要により、例えば、前記覆い部材50および/または60の外側あるいは内部、および/または薄層ガラス板(10)と樹脂フィルム(11)の間または基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面に、加熱および/または冷却装置を設けることもできる。
本発明のcDNAの合成方法は、上記本発明の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用いる。前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及び表面張力低下試薬を含有するcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む。
第1のハの字型突起の空間に保持される細胞溶解用溶液は、例えば、100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitolを含む全量3μlの溶液であることができる。
第2のハの字型突起の空間に保持されるmRNA洗浄用溶液は、10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% ドデシル硫酸リチウムを含む全量3μlの溶液であることができる。
第3のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応用洗浄溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitorを含む全量3μlの溶液であることができる。
第4のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptaseを含む全量3μlの溶液であることができる。
但し、これらは例示であって、これらの溶液に限定される意図ではない。
測定は以下のように行った。純水3μlを各種材料表面に静置し5分後の液滴の状態を顕微鏡にて観察した。液滴の高さA及び材料表面と接触している辺の長さBを測定し、水の接触角θを以下の計算式により求めた。
5'-RACE用cDNA作成
以下に記載するプロトコルに従って5'-RACE用cDNAを作成した。
mRNA結合性磁気ビーズ(25μg)を含む細胞溶解液3μlにBリンパ球1から100個を加え溶解させ、細胞から放出されたmRNAをmRNA結合性磁気ビーズ上に捕捉する。
A行のチューリップ型突起の中心部に上記溶液2〜3μlをスポットする(細胞溶解液滴)。
B行のチューリップ型突起の中心部に、mRNA洗浄用溶液2〜3μlをスポットする(細胞洗浄液滴)。
C行のチューリップ型突起の中心部に、逆転写反応用洗浄液2〜3μlをスポットする(逆転写反応用洗浄液滴)。
D行のチューリップ型突起の中心部に、逆転写反応液2〜3μlをスポットする(逆転写反応用液滴)。
E行のチューリップ型突起の中心部に、3'-テーリング反応用洗浄液2〜3μlをスポットする(3'-テーリング反応用洗浄液滴)。
F行のチューリップ型突起の中心部に、3'-テーリング反応液2〜3μlをスポットする(3'-テーリング反応用液滴)。
G行に反応停止液2〜3μlをスポットする。
H行にPCR反応溶液2〜3μlをスポットする。
プレート底面の薄層ガラス板上からA行の細胞溶解液滴の中心部に向け、小型ネオジム磁石を設置し1秒静置させる。
A行の細胞溶解液滴からB行のmRNA洗浄用液滴へ向け、小型ネオジム磁石を2秒程度かけてゆっくりスライドさせる。このときmRNAを結合した磁気ビーズ集団は数十ナノリットルの水滴として、A行の細胞溶解液滴から離れ、B行のmRNA洗浄用液滴へ移動する。
磁気ビーズが液滴底部に落下した後、上記の操作と同様に小型ネオジム磁石をB行のmRNA洗浄用液滴の中心部に1秒間静置させ、次にC行の逆転写反応用洗浄液滴へ移動させる。
逆転写反応
D行の逆転写反応用液滴に磁気ビーズを移動させた後、プレートは反転させたまま、37〜50℃の保温装置に入れ1時間保温する。この間10分ごとにプレートを反転または前後左右に傾け磁気ビーズを液滴中で撹拌させ十分な酵素反応を行わせる。
磁気ビーズの洗浄を行う。
3'-テーリング反応 プレートを反転させ37℃にて1時間保温する。逆転写反応と同様磁気ビーズの撹拌を行う。
H行に移動させた液はそのまま、5'-RACE法によるDNAの増幅に用いることができる。
RNAウイルス、レトロウイルス含有試料からのcDNA合成法
成人ヒトT細胞白血病ウイルスー1型(HTLV-I)は一本鎖RNAをゲノムとして有するヒトレトロウイルスである。細胞上澄中に分泌されたレトロウイルスを、本発明を用いて検出するため、HTLV-Iを産生する細胞株(MT2)1万個を、1mlのRPMI-10%牛胎児血清培地を用いて24well細胞培養皿にて24時間培養した。まず、本細胞培養液にDNase Iを加え37℃、15分間処理することで、混入した細胞由来のゲノムDNAを分解した。本溶液1μlを、細胞溶解用溶液(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitol)でそれぞれ10倍から1000万倍に10倍きざみで希釈して7種類の希釈サンプルを調製した。各希釈サンプル1μlを、Oligo-dT磁気ビーズを濃度10mg/mlになるように懸濁した細胞溶解用溶液(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitol)2μlに加え、実施例1と同様の方法でE行の逆転写反応までを7サンプル並行して行った。さらに、希釈サンプルを含まない細胞溶解用溶液もネガティブコントロールとしてE行の逆転写反応までを7サンプルに並行して行った。
B行は、10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% ドデシル硫酸リチウムを含む全量3μlの溶液である。
C行は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitorを含む全量3μlの溶液である。
D行は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptaseを含む全量3μlの溶液である。
E行は、10mM Tris HCl (pH 7.5), 0.1% Triton X-100, 0.1mM EDTAを含む全量3μlの溶液である。
牛血清アルブミンを含む液滴からの磁気ビーズ移動
A行にそれぞれ、磁気ビーズ(粒径2.8μmのDyanabeads)25μgを含むPBS(10mM phosphate buffer, 120mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.6)を3μl、もしくは磁気ビーズ(粒径2.8μmのDyanabeads)25μgを含む1%牛血清アルブミン-PBS 3μlをスポットした。B行には1%牛血清アルブミン-PBSをスポットした。これを図2に示す反応治具にて37℃で30分加温し、加温により生じる水蒸気が基板表面上で凝結して微小な液滴が形成されることを促進した。尚室温は20℃であった。その後室温にて5分間放置し、小型磁石を用いてA行液滴内の磁気ビーズのB行への移動を試みた。移動後の反応治具の写真を図7に示す。この結果、牛血清アルブミンを含有する液滴においては磁気ビーズの移動が認められたが、牛血清アルブミンを含有しない液滴においては磁気ビーズの移動が認められなかった。
Claims (15)
- 基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有し、
かつ
前記基板表面の少なくとも前記液滴を保持する面は、純水に対する接触角が90〜150°の範囲である
ことを特徴とする反応治具。 - 前記複数の突起状囲いは、少なくとも一部または全部が、縦横に整列して設けられている請求項1に記載の反応治具。
- 前記突起状囲いの液滴保持用空間は、0.5μL〜200μLの範囲の量の液滴を保持できる請求項1または2に記載の反応治具。
- 突起状囲いは、2つまたは3つの切欠き部を有し、前記切欠き部の開口の間隔は0.5〜10mmの範囲である請求項1〜3のいずれかに記載の反応治具。
- 前記基板表面は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなる請求項1〜4のいずれかに記載の反応治具。
- 前記基板は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなるコーティング層を有する請求項1〜4のいずれかに記載の反応治具。
- 各突起状囲いの液滴保持用空間には、同一または異なる種類の溶液の液滴が、他の突起状囲いの液滴保持用空間部分に置かれた液滴と混ざることなく、保持されるように用いられる請求項1〜6のいずれかに記載の反応治具。
- 同一の横列に属する突起状囲いの液滴保持用空間には、同一の種類の溶液の液滴が保持されるように用いられる請求項1〜7のいずれかに記載の反応治具。
- 前記溶液が、表面張力低下試薬を含有する反応液または洗浄液である請求項7または8に記載の反応治具。
- 前記突起状囲いを有する表面をカバーする覆い部材をさらに有し、かつ前記覆い部材が覆われた空間に湿気を供給する保湿部材をさらに有する請求項1〜9のいずれかに記載の反応治具。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の反応治具を用い、
磁気ビーズに固定化した物質を、上記突起状囲いの液滴保持用空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中で、前記基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させることにより、反応及び/または洗浄を行うことを含む、反応方法。 - 請求項1〜10のいずれかに記載の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及びcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、
磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む、cDNAの合成方法。 - 複数の縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
各横列の突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液は、同一種類の溶液であり、
縦列を移動させる磁気ビーズに固定化したmRNAは、異なる種類のmRNAであり、
複数の異なる種類のcDNAを、磁気ビーズに固定化したcDNAとして得る、請求項12に記載の方法。 - 前記反応治具は、1つの縦列に、少なくとも4つの突起状囲いが設けられ、
前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間には、細胞溶解用溶液、mRNA洗浄用溶液、cDNA合成用溶液及びcDNA洗浄用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次移動させる、請求項12または13に記載の方法。 - 前記反応治具は、突起状囲いを有する表面を下向きにして用いられる、請求項11〜14のいずれかに記載の方法。
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