JP4769026B2 - 反応容器及びこれを用いた物質の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、例えば抗原抗体反応による抗原の検出及びＤＮＡの検出等に用いられる反応容器及びこれを用いた物質の検出方法に関するものである。
近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などをチップ上にて行うμ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が研究され実現して
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
このようなチップ上には、通常、ウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いられており、半導体やガラスにエッチングで設けたり、穴のあいた板を積層することでウェルが形成されていた。
ウェルタイプのものとしては、例えば、基板表面に多数のウェルが設けられている検出用基板が開示されている（特許文献１参照）。
このようなウェル型の検出チップは、ウェル内にスポイトなどの分注器により、試薬を分注し、反応を行う。しかし、試薬を分注する際、気泡を巻き込んでしまうという問題がある。また、ウェル内に試薬を入れたとき、ウェル表面の凹凸の隙間に気泡が残こってしまうという問題がある。これは溶液との界面の状態、水においては内壁と水との接触角によっては顕著に起こってくる。例えば、直径２ｍｍ〜３ｍｍで内壁と水との接触角が７０°程度の垂直穴に試薬の充填を試みると、気泡と試薬との入れ替わりが起きず、気泡を含んだ状態になる。また、うまく気泡と入れ替わりがおき、試薬を充填できたとしても、底面の凹凸の隙間に気泡が残ることもある。
この状態において、熱による反応を利用する場合、反応のための熱をかけると気泡の膨張により試薬があふれるなどの不具合が生じる。
この状態において、熱による反応を利用する場合、反応のための熱をかけると気泡の膨張により試薬があふれるなどの不具合が生じる。
本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、ウェル状反応部を有する反応チップにおいて、試薬充填時に気泡の混入のない、また反応時に気泡影響を受けることのない反応容器及びこれを用いた物質の検出方法を提供することを目的とする。
請求項１の発明は、光透過性を有する基板と、前記基板に成形され、底部側が光透過性を有し底部側から蛍光検出可能なウェル状反応部と、を有し、前記ウェル状反応部の内面における全ての面に対して、純水との接触角が１００°以上となる表面処理が施されていることを特徴とする反応容器である。
請求項２の発明は、前記ウェル状反応部の直径が０．０１〜５ｍｍの範囲内であり、かつ深さが０．０１〜５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の反応容器である。
請求項３の発明は、前記表面処理がフッ素を含むガスを用いたプラズマ処理であることを特徴とする請求項１または２に記載の反応容器である。
請求項４の発明は、前記ウェル状反応部の内面に撥水性被膜を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応容器である。
請求項５の発明は、さらに試薬収容部及び／またはＰＣＲ反応部を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器である。
請求項６の発明は、純水との接触角が１００°以上となる表面処理が内面における全ての面に施されたウェル状反応部が成形された光透過性の基板を備える反応容器のウェル状反応部内に、認識物質を注入する工程と、ウェル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、前記認識物質又は前記検出物質のいずれかが蛍光標識されており、前記認識物質と前記検出物質との反応の有無を前記ウェル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする物質の検出方法である。
請求項７の発明は、前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項６記載の物質の検出方法である。
本発明によれば、ウェル状反応部を有する反応容器の反応部に、容易に気泡の混入なく試薬を充填することができる。また、内壁の凹凸の隙間に残った気泡が存在しても反応時に影響のないものとなる。
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図１に、本発明における一実施形態を示す図を示す。図１は、略長方形の板状の基板に、試料及び試薬を反応させるためのウェル状反応部が複数形成されている。
図１に、本発明における一実施形態を示す図を示す。図１は、略長方形の板状の基板に、試料及び試薬を反応させるためのウェル状反応部が複数形成されている。
本発明に用いる基板は、反応系に悪影響を与えないものであればよい。また、反応を検出する際、基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が好ましい。
このようなものとして、例えば、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からシクロオレフィン系樹脂（ゼオノア（日本ゼオン株式会社製））やメチルペンテン系樹脂（ＴＰＸ（三井化学株式会社製））を用いることが好ましい。
また、後述ように、本発明では、基板に設けるウェル反応部の内面の純水との接触角は１００°以上であることが好ましいため、基板自体の接触角は１００°以上であるものを用いても良い。このようなものとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦ）などのフッ素ポリマーやシリコーン樹脂、メチルペンテン系樹脂などが挙げられる。
このようなものとして、例えば、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からシクロオレフィン系樹脂（ゼオノア（日本ゼオン株式会社製））やメチルペンテン系樹脂（ＴＰＸ（三井化学株式会社製））を用いることが好ましい。
また、後述ように、本発明では、基板に設けるウェル反応部の内面の純水との接触角は１００°以上であることが好ましいため、基板自体の接触角は１００°以上であるものを用いても良い。このようなものとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦ）などのフッ素ポリマーやシリコーン樹脂、メチルペンテン系樹脂などが挙げられる。
このような合成樹脂を用いて基板を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。また、後述の試薬収容部やＰＣＲ反応部など部分ごとに材料を分けることもできる。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
そして、基板には、ウェル状の反応部を備える。
ウェル状反応部は、基材がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。
また、ウェル状反応部は複数有することができる。
ウェル状反応部は、基材がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。
また、ウェル状反応部は複数有することができる。
ウェルの形状は、底部が平坦であり、またウェル開口部から底面まで壁面が傾斜している円錐台形状であることが好ましい。
また、ウェルの大きさは、特に限定はしないが、ライフサイエンス分野では極微量での反応、検出が行われることが多く、開口部の直径及び深さが５ｍｍ以下、特に０．０１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であればよい。また、本発明ではこの大きさの範囲内のときに特に効果を発揮するものである。
また、ウェルの大きさは、特に限定はしないが、ライフサイエンス分野では極微量での反応、検出が行われることが多く、開口部の直径及び深さが５ｍｍ以下、特に０．０１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であればよい。また、本発明ではこの大きさの範囲内のときに特に効果を発揮するものである。
本発明では、ウェル状反応部内面の純水との接触角が１００°以上、好ましくは１０５°以上であることが好ましい。
濡れ性が高いと、試薬充填時に側面に液が引きずられる。ウェル状反応部内面の純水との接触角がが上記範囲であると、試薬を充填する際、ウェル内の側壁との濡れの影響をあまり受けず滑るように試薬が充填され、気泡の混入の影響も少ない（図２参照）。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗いが、底部との接触部が少ないため、表面凹凸と試薬の隙間に残った試薬の量も少なく、その影響をあまり受けないものとなる（図４参照）。
接触角が１００°より小さい場合、例えば７０°以上１００°未満の場合、試薬充填の際、ウェル内の側壁との濡れの影響を受けながら試薬が落ちていくため、最終的にウェルの底部まで充填されたときに側壁に引きずられ、気泡が混入した状態になることがある（図３参照）。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗く、表面凹凸の内部まで試薬が充填されず、表面凹凸と試薬の隙間に気泡が残る（図５参照）。
濡れ性が高いと、試薬充填時に側面に液が引きずられる。ウェル状反応部内面の純水との接触角がが上記範囲であると、試薬を充填する際、ウェル内の側壁との濡れの影響をあまり受けず滑るように試薬が充填され、気泡の混入の影響も少ない（図２参照）。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗いが、底部との接触部が少ないため、表面凹凸と試薬の隙間に残った試薬の量も少なく、その影響をあまり受けないものとなる（図４参照）。
接触角が１００°より小さい場合、例えば７０°以上１００°未満の場合、試薬充填の際、ウェル内の側壁との濡れの影響を受けながら試薬が落ちていくため、最終的にウェルの底部まで充填されたときに側壁に引きずられ、気泡が混入した状態になることがある（図３参照）。また、ウェルの底部はミクロ的に見ると表面が粗く、表面凹凸の内部まで試薬が充填されず、表面凹凸と試薬の隙間に気泡が残る（図５参照）。
ウェル状反応部内面の純水との接触角が１００°以上、好ましくは１０５°以上とするためには、もともと純水との接触角がその範囲内である基材を用いて反応容器を形成してもよい。このような基材としては、前述したようにポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦ、純水との接触角：約１０５°〜１１５°）などのフッ素ポリマーやシリコーン樹脂、ＴＰＸ（純水との接触角：約１００°）メチルペンテン系樹脂などが挙げられる。
また、プラズマ処理、コロナ処理、洗浄やコーティングなどの表面処理を施すことにより、接触角をあげてもよい。プラズマ処理の中でも特に大気圧近傍下で行う大気圧プラズマ処理であることが、生産性などの点から好ましい。
また、フッ素を含むガスを用いてプラズマ処理を施しても良い。特に大気圧近傍下でのプラズマ処理を施すことが、生産性などの点から好ましい。
フッ素系ガスを用いてプラズマ処理を施す場合、基材表面になんらかの被膜または官能基を導入すると考えられるが、この場合、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
フッ素系ガスを用いてプラズマ処理を施す場合、基材表面になんらかの被膜または官能基を導入すると考えられるが、この場合、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
フッ素を含むガスとしては四フッ化炭素、四フッ化ケイ素などのフッ化炭素、フッ化珪素化合物やこれらのハロゲン化物などが挙げられる。
また、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどの有機フッ化化合物を含むガスや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーを含むガスが挙げられる。
また、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＲＳｉＸ３（Ｘ：ハロゲンまたはＲ、Ｒ：有機官能基、なおＲはそれぞれ異なっていてもよい）で表されるフッ素含有珪素化合物を含むガスを用いても良い。このようなものとして、例えば、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
また、珪素ガスを用いてプラズマ処理を施しても良い。珪素ガスとしてはヘキサメチルジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）、テトラメチルシロキサン（ＴＭＳＯ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）などが挙げられる。
また、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどの有機フッ化化合物を含むガスや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーを含むガスが挙げられる。
また、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＲＳｉＸ３（Ｘ：ハロゲンまたはＲ、Ｒ：有機官能基、なおＲはそれぞれ異なっていてもよい）で表されるフッ素含有珪素化合物を含むガスを用いても良い。このようなものとして、例えば、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
また、珪素ガスを用いてプラズマ処理を施しても良い。珪素ガスとしてはヘキサメチルジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）、テトラメチルシロキサン（ＴＭＳＯ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）などが挙げられる。
また、表面エネルギーの低い物質を、蒸着法、スプレー塗工やスピンコートなどのコーティング法やディッピング法によりウェル内に導入し撥水性被膜を形成しても良い。
表面エネルギーの低い物質は、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
表面エネルギーの低い物質としては、フッ素系またはフッ素含有珪素化合物やシリコーン樹脂などが挙げられる。
フッ素系化合物としては、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーが挙げられる。
また、フッ素含有珪素化合物としては、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＲＳｉＸ３（Ｘ：ハロゲンまたはＲ、Ｒ：有機官能基、なおＲはそれぞれ異なっていてもよい）で表されるフッ素含有珪素化合物が挙げられ、例えば、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
表面エネルギーの低い物質は、反応系に悪影響を与えず、また耐熱性、耐薬品性があることが好ましい。
表面エネルギーの低い物質としては、フッ素系またはフッ素含有珪素化合物やシリコーン樹脂などが挙げられる。
フッ素系化合物としては、フッ化メタン、フッ化エタン、テトラフルオロメタン、ヘキサフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロパン、トリフルオロアセテート、ヘキサフルオロアセトンなどや、フッ化エチレン、フッ化塩化エチレン、フッ化ビニール、フッ化ビニリデンなどフッ素含有モノマーが挙げられる。
また、フッ素含有珪素化合物としては、ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＲＳｉＸ３（Ｘ：ハロゲンまたはＲ、Ｒ：有機官能基、なおＲはそれぞれ異なっていてもよい）で表されるフッ素含有珪素化合物が挙げられ、例えば、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリエトキシシラン、ヘプタデカフルオロデシルトリクロロシラン、トリフルオロプロピルメトキシシランなどが挙げられる。
撥水性被膜の膜厚は、特に限定はしないが、薄膜であることが好ましく、具体的には１００ｎｍ以下であることが好ましい。
なお、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基材の表面を用いて測定しても良い。
また、同一基板上に、試薬収容部を設けても良い（図６、７、８参照）。試薬収容部はウェル状に形成することができ、大きさなどに特に制限はない。試薬収容部は用いる試薬の種類などに応じて複数設けることができる。例えば、試薬収容部には検出物質を含む溶液や、認識物質が複数あり、多段階反応を行う場合は、1種の認識物質を含む溶液、またはその他バッファー、希釈液などを入れておくことができる。
また、ＤＮＡの検出反応に用いる場合、同一チップ上にＰＣＲ反応部を設けても良い（図7参照）。
ＰＣＲ反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調整、ＤＮＡの検出を行うことができる。
ＰＣＲ反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。
また、その他の反応部を設けても良い。
ＰＣＲ反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調整、ＤＮＡの検出を行うことができる。
ＰＣＲ反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。
また、その他の反応部を設けても良い。
また、ウェル状反応部同士を接続する流路を設けてもよい（図8参照）。またウェル状反応部と試薬収容穴部、ＰＣＲ反応部、その他の反応部を接続する流路を設けてもよい。これら流路を形成することにより、連続した反応を行わせることが可能となる。
本発明の反応容器は、様々な生化学系の反応用として用いることができ、例えば抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
本発明でいう検出物質とは、検出をしようとする対象物質のことで、認識物質とは、検出物質を特定するために用いる物質のことを言う。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応部内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
本発明でいう検出物質とは、検出をしようとする対象物質のことで、認識物質とは、検出物質を特定するために用いる物質のことを言う。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応部内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
ＤＮＡの検出の場合、例えば、予めウェル状反応検出部内に認識物質として核酸プローブを用意しておく。その後、検出物質として検体ＤＮＡをウェル状反応検出部に供給し、核酸プローブと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーションさ反応により、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検出物質に標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、検体ＤＮＡは、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調整しておいたものを用いることができる。また、認識物質である核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検出物質としての検体ＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
また、基板上にＰＣＲ反応部を設けておき、チップ上で連続して、血液などから抽出したＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅させ、それを検体とし、反応部で認識物質との反応の有無を検出してもよい。具体的には、例えばウェル状試薬収容部に検出物質として血液などから抽出したＤＮＡを収容しておき、分注動作により、ＰＣＲ反応部へ分注し、ＰＣＲ反応により調整した検出物質をウェル状の反応検出部へ分注すればよい。ウェル状試薬収容部からＰＣＲ反応部、ウェル状反応検出部へは流路を用いて送液しても良い。
また、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、認識物質は複数あってもよく、検出物質が蛍光標識されていない場合には、認識物質のひとつが標識されていればよい。
また、標識物質は、反応した認識物質と検出物質に特有に作用するものを、認識物質と検出物質の反応後に加えることもできる。このようなものとしては、ＤＮＡの検出におけるインターカレーターなどがある。また、ここでいう標識物質とは間接的なものも含む。すなわち、蛍光物質などに結合する物質を標識物質として認識物質または検出物質に結合させておき、後から蛍光物質を加えても良い。
また、多段階反応を行ってＳＮＰまたはＤＮＡを検出してもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。
この場合、認識物質が複数種でもよく、予めウェル状反応部内に少なくとも１種の認識物質を入れておき、その後、検出物質と認識物質を同時または順次注入し、反応をおこなっても良い。
また、ウェル状反応部、ＰＣＲ反応部には、反応用液の乾燥を防ぐ目的でミネラルオイルなどの反応用液より比重の軽い溶液を加えても良い。
また、認識物質はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
また、認識物質はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
また、前記ウェル状反応部、試薬収容部、ＰＣＲ反応部には、フィルムなどのフタ材で被覆しても良い。
＜実施例１＞
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ネオフロン Ｎ−２０Ｐ（ダイキン工業株式会社製）を用いて成形品を作成した。成形温度は３５０℃、型締め力は５０ｔｏｎＦ、金型温度は１００℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は１１１°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ネオフロン Ｎ−２０Ｐ（ダイキン工業株式会社製）を用いて成形品を作成した。成形温度は３５０℃、型締め力は５０ｔｏｎＦ、金型温度は１００℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は１１１°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（インベーダー反応）
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、ＦＲＥＴ、Ｃｌｅｖａｓｅは認識物質である。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、ＦＲＥＴ、Ｃｌｅｖａｓｅは認識物質である。
＜実施例２＞
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ゼオノア １４２０Ｒ（日本ゼオン株式会社製を）用いて成形品を作成した。成形温度は２８０℃、型締め力は１００ｔｏｎＦ、金型温度は９０℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
（表面処理）
フッ素を含むガスとして、ＣＦ４を３％含むＨｅガスを用い、大気圧近傍下でプラズマ処理を施した。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は１０８°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ゼオノア １４２０Ｒ（日本ゼオン株式会社製を）用いて成形品を作成した。成形温度は２８０℃、型締め力は１００ｔｏｎＦ、金型温度は９０℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
（表面処理）
フッ素を含むガスとして、ＣＦ４を３％含むＨｅガスを用い、大気圧近傍下でプラズマ処理を施した。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は１０８°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（インベーダー反応）
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、ＦＲＥＴ、Ｃｌｅｖａｓｅは認識物質である。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時には気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。測定した結果、蛍光が検出され、反応が起こったことが確認された。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、ＦＲＥＴ、Ｃｌｅｖａｓｅは認識物質である。
＜比較例＞
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ノバテック ＰＰＭＡ０４（日本ポリプロ株式会社製）を用いて成形品を作成した。成形温度は２１０℃、型締め力は５０ｔｏｎＦ、金型温度は２０℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は９１°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（チップ作成（成形））
図１のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ノバテック ＰＰＭＡ０４（日本ポリプロ株式会社製）を用いて成形品を作成した。成形温度は２１０℃、型締め力は５０ｔｏｎＦ、金型温度は２０℃、計量値２４ｍｍで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップＭ３で成形を行い、スクリュー系はφ３５ｍｍである。検出部底厚は０．３ｍｍで成形を行った。
ウェル内の接触角の測定は困難であったため、ウェル内の表面状態と同様の表面状態であるウェルの表面を用いて測定した値をウェル内の接触角とした。
３箇所測定した結果、得られた値の平均値は９１°であった。なお、用いた測定装置はＦＡＣＥ自動固体エナジー解析装置ＣＡ−ＶＥ型である。
（インベーダー反応）
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時に、気泡の上昇による反応液の噴出しにより、その後の蛍光検出による反応の有無が確認できなかった。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
ウェル状反応部にインベーダープローブ０．１５μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
検出物質としてＰＣＲ反応により調整済みのＰＣＲ産物１μｌに対して、インベーダー試薬３．６４４μｌ、蛍光物質としてＦＡＭが結合しているＦＲＥＴ ０．７５μｌ、Ｃｌｅｖａｓｅ ０．７５μｌを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応部に２μｌずつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えた。次にミネラルオイルを４μｌを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、６１℃、４０分間インベーダー反応を行った。反応時に、気泡の上昇による反応液の噴出しにより、その後の蛍光検出による反応の有無が確認できなかった。
１ 反応容器
２ 基板
４ 反応溶液
３ ウェル状反応部
５ 試薬収納部
６ ＰＣＲ反応部（流路タイプ）
７ 流路
８ ウェル底面の微細な凹凸
２ 基板
４ 反応溶液
３ ウェル状反応部
５ 試薬収納部
６ ＰＣＲ反応部（流路タイプ）
７ 流路
８ ウェル底面の微細な凹凸
Claims (7)
- 光透過性を有する基板と、
前記基板に成形され、底部側が光透過性を有し底部側から蛍光検出可能なウェル状反応部と、
を有し、
前記ウェル状反応部の内面における全ての面に対して、純水との接触角が１００°以上となる表面処理が施されていることを特徴とする反応容器。 - 前記ウェル状反応部の直径が０．０１〜５ｍｍの範囲内であり、かつ深さが０．０１〜５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の反応容器。
- 前記表面処理がフッ素を含むガスを用いたプラズマ処理であることを特徴とする請求項１または２に記載の反応容器。
- 前記ウェル状反応部の内面に撥水性被膜を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応容器。
- さらに試薬収容部及び／またはＰＣＲ反応部を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応容器。
- 純水との接触角が１００°以上となる表面処理が内面における全ての面に施されたウェル状反応部が成形された光透過性の基板を備える反応容器のウェル状反応部内に、認識物質を注入する工程と、ウェル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、前記認識物質又は前記検出物質のいずれかが蛍光標識されており、前記認識物質と前記検出物質との反応の有無を前記ウェル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする物質の検出方法。
- 前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項６記載の物質の検出方法。
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