KR101501660B1 - Ｉｌ―31 단클론 항체의 가변 영역 서열 및 사용 방법 - Google Patents

Ｉｌ―31 단클론 항체의 가변 영역 서열 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

IL-31에 친화도를 지닌 면역글로블린의 항원-결합 부위에서 유도된 신규의 조성물을 제공한다. 조성물은 특히 인간 IL-31에 결합가능한 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타낸다. 동일하거나 또는 다른 면역글로블린 모이어티에서 유도된 CDR 서열을 제공한다. 또한 단일 사슬 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에 VH 및 VL 도메인이 부착된다. sFv 분자는 보조적 폴리펩타이드 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 생체활성이거나 또는 다른 유용한 모이어티에 부착하기 위한 부위를 제공한다. 조성물은 특이적 결합 분석, 친화도 분리정제법, 약물 또는 독소 표적화, 영상화, 및 염증 질환의 유전적 또는 면역학적 치료제에 유용하다. 따라서 본 발명은 신규의 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA, 이러한 DNA를 포함하는 발현 카세트, 및 폴리펩타이드의 생산을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 단클론 항체의 가변 영역의 아미노산 서열 및, 인간 IgG4 Fc 분자와 결합된 이러한 단클론 항체 또는 항체 절편의 용도를 제공한다.
Figure 112009014492227-pct00003
IL-31, 단클론 항체, 가변 영역, 면역학적 치료제.

Description

ＩＬ―31 단클론 항체의 가변 영역 서열 및 사용 방법{VARIABLE REGION SEQUENCES OF IL-31 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
피부는 면역계에 중요한 역할을 하며, 층상 구조를 이룬다. 표피는 표면층이다. 표피의 아래는 진피로서, 연결 조직의 층이다. 진피의 아래는, 피하조직으로서, 다량의 지방 조직의 층이다. T 림프구 순환은 정상 상태와 염증 상태의 피부로 이동한다. 피부 림프구 항원(CLA)은 T 세포의 귀소 수용체를 피부에 친화성인 것으로 간주한다(Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14:13-18, 2004).
수종의 피부 질환은 CLA+ T 세포를 높은 수준으로 발현하는 것으로 알려져 있으며, 여기에는 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 포함한다. 이러한 피부 T 세포 매개 질환을 치료할 필요가 있다.
사이토카인 패밀리의 예시적인 생체 내 활성은, 다른 사이토카인, 사이토카인 작용제, 및 사이토카인 길항제의 상당한 임상적 가능성, 및 필요성을 나타낸다. IL-31, 신규로 동정된 사이토카인. IL-31, 마우스 내에서 과다발현되는 경우, 피부염-유사 증상을 나타낸다. 피부-귀소 T 세포 및 표피 케라토사이트 모두는 인간 내에서의 피부 질환의 병리학이 밝혀져 있다. 본 발명은 전염증 사이토카인 IL-31에 대한 길항제를 제공함으로써 이러한 요구를 해결하게 된다. 본 발명의 이러한 길항제는, IL-31의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항작용 또는 중화할 수 있으며, 가용성 IL-31RA 수용체 및 중화 항-IL-31 항체를 포함한다. 본 발명은 추가적으로 염증 질환에서의 사용, 및 유관 조성물 및 방법을 제공한다.
단클론 항체 기술은 질환의 확인 및 치료에 사용하는 다양한 유형의 치료제 및 진단제를 제공한다. 다양한 임상적 응용은 마우스 세포 내에서 생육되나, 특히 인간 항원에 결합하는 뮤린 항인간 단클론 항체에 집중되어 있다. 이와 함께, 인간 및 비인간 아미노산 서열로 구성된 키메라 항체가 개발되었다. 특히, 예를 들어, 인간 면역글로블린에서 유도된 불변 영역에 융합된 뮤린 면역글로블린으로부터 유도된 가변 영역을 보유한 하이브리드 항체 분자가 설명되었다. 예컨대, 미국 특허 제4,816,567호; Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; 및 Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224를 참조한다. 추가적으로, 불변 영역은 항체 절편 예컨대 F(ab), F(ab')2 의 항원 인식 또는 결합에 필요로 하지 않기 때문에, Fc 부분을 포함하지 않는 Fv는 임상적 치료의 유용한 후보 물질로 지적되어 왔다.
설치류 항원-결합 부위를 포함하는 다수의 재조합 또는 생체합성 분자가 공지되어 있다. 특히, 인간 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 도메인 내로, 전체 가변 도메인가 아닌 설치류 결합 부위를 이식함으로써, 인간 항체 상에서 직접 제조된 설치류 항원-결합 부위를 보유한 분자가 공지되었다. 예컨대, 문헌 [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 및 Verhoeyen et al.(1988) Science 239: 1534-1536]를 참조한다. 가변 도메인의 최소한 하나의 상보성 결정 영역(CDRS)은 뮤린 단클론 항체로부터 유도되며, 분자의 잔존 면역글로블린-유도 부분은 인간 면역글로블린으로부터 유도된, 항원-결합 부위를 보유한 분자가 영국 특허 공개 번호 제GB 2,276,169호(Sep. 21, 1994)에 개시되어 있다. 다수의 단일 사슬 항원-결합 부위 폴리펩타이드 및 단일 사슬 Fv (sFv) 분자가 공지되었다. 예컨대, 미국 특허 제5,132,405호 및 제5,091,513호(Huston et al.); 및 미국 특허 제4,946,778호(Ladner et al.)를 참조한다.
항체의 Fc 도메인의 효과기 기능(들)은 포식작용, 염증 매개체의 방출, 항체 생산의 조절, 및 가장 중요한 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함한다. 이러한 효과기 기능이 유도되는 정도는 Fc 도메인과 유관 단백질 매개체, Fcγ 수용체 및 Clq 등의 상호작용에 달려있으며, IgG 서브클래스 불변 영역 (Fc)과 이러한 단백질과의 이들의 상호작용에 따라 달라진다.
IgG1의 Fc 도메인은 면역계 효과기 세포 상에서 FcγRI, FcγRIIa, 및 FcγRIII와 상호작용한다. 다른 Fcγ 수용체의 정확한 역할은 아직 알려진바 없으나 FcγRIIIA는 1차적으로 NK 세포 및 단핵구 및 대식세포 상에서 발현되는 수용체를 매개하는 가장 중요한 ADCC라 생각된다. IgG1는 Clq에 결합할 수도 있으며, FcγRIII를 발현하는 NK 세포에 의하여 주로 매개되는 CDC를 유발시킬 수 있다. IgG4 Fc 도메인은 감소된 ADCC 및 CDC에 대응하는 다른 Fcγ 수용체 및 Clq에 대한 결합 친화도를 크게 감소시켰다. IgG1가 일반적으로 ADCC 및 CDC 모두에 대한 고 활성을 나 타내는 반면, IgG4는 ADCC 또는 CDC 활성이 낮은 것으로 평가된다.
효과기 음성 IgG4 mAb의 결합 친화도는 다른 IgG 아이소타입 mAbs와 비교하는 경우 파과되지 않았다면, 급격히 감소한다. 그러나, Brambell 수용체 (FcRn)와 상호작용하는 능력은 IgG4 내에 보유되며, 따라서 증가된 반감기를 통하여 IgG4 아이소타입 mAb의 약물동태학에 영향을 미치게 된다.
따라서, IL-31 매개 염증을 치료하기 위한 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 항-인간 IL-31의 아미노산 서열을 제공하는 분자에 대한 수요가 존재한다.
도 1은 클론 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 및 294.144.3.5의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열의 정렬이다.
도 2는 클론 292.12.3.1 및 292.84.1.6의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열의 정렬이다.
도 3 및 4는 마우스 항-인간 IL-31 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 정렬이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 앞서, 다음의 용어를 정의하는 것이 이해에 도움이 될 것이다:
본원에서 사용되는, 용어 "항체"는 다클론 항체, 친화도-정제 다클론 항체, 단클론 항체, 및 항원-결합 절편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 단백질분해 절편을 포함한다. 유전자 조작된 무손상 항체 또는 절편, 예컨대 키메라 항체, Fv 절편, 단일 사슬 항체 등, 및 합성 항원-결합 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함한다. 비인간 항체는 비인간 CDR을 인간 프레임워크 및 불변 영역상에 이식함으로써, 또는 전체 비-인간 가변 도메인을 통합(선택적으로 노출된 잔기의 대체에 의하여 이들을 인간-유사 표면으로 "은폐," 여기서, 결과는 "피복(veneered)" 항체)함으로써 인간화될 수 있다. 일 예로써, 인간화된 항체는 인간 가변 영역 프레임워크 도메인 내에 비인간 잔기를 보유하여 알맞은 결합 특성을 강화하게 된다. 인간화 항체를 통하여, 생물학적 반감기가 증가될 수 있으며, 인간 투여시 유해 면역 반응의 가능성이 감소된다.
용어 "키메라 항체" 또는 "키메라 항체"는 경쇄 및 중쇄 사슬 유전자는 일반적으로 다른 종의 면역글로블린 가변 및 불변 영역 유전자로부터, 유전자 조작에 의하여 구축된 항체를 나타낸다. 예를 들어, 마우스 단클론 항체의 유전자의 가변 영역은 인간 불변 영역, 예컨대 감마 1 및 감마 3에 결합할 수 있다. 전형적인 치료적 키메라 항체는 따라서 마우스 항체의 가변 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체의 불변 도메인으로 구성된 하이브리드 단백질이며, 다른 포유류 종이 사용될 수도 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "면역글로블린"은 면역글로블린 유전자에 의하여 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성된 단백질을 의미한다. 일 형태의 면역글로블린은 항체의 기본 구조 유닛을 구성한다. 이러한 형태는 테트라머이며, 면역글로블린 사슬의 두개의 일치하는 짝으로 구성되고, 각 짝은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 보유한다. 각각의 짝에서, 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역은 함께 항원에 결합하도록 하며, 불변 영역은 항체 효과기 기능을 하도록 한다.
전장 면역글로블린 "경쇄"(약 25 Kd 또는 214 아미노산)는 NH2-말단(약 110 아미노산)의 가변 영역 유전자 및 COOH-말단의 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의하여 암호화되었다. 전장 면역글로블린 "중쇄"(약 50 Kd 또는 446 아미노산)는 가변 영역 유전자(약 116 아미노산) 및 전술한 다른 불변 영역 유전자(약 330 아미노산) 중의 하나에 의하여 이와 유사하게 암호화된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실론으로 분류되며, 항체의 아이소타입으로서 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄 사슬 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12 이상 아미노산의 "J" 영역에 의하여 약 10 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함하는 중쇄와 연결된다. (일반적으로, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch.7 (일체성을 지니고 참고자료로서 포함).
면역글로블린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 3개의 고가변 영역에 의하여 중단되는 "프레임워크" 영역으로 구성되어 있다. 따라서, 용어 "고가변 영역"은 항원 결합을 가능하게 하는 항체의 아미노산 잔기이다. 고가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "고가변 루프"의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk, 1987, J. MoI. Biol. 196: 901-917) (둘 모두는 일체성을 지니고 참고자료로서 포함)를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 고가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다. 다른 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 따라서, "인간 프레임워크 영역"은 자연 발생 인간 면역글로블린의 프레임워크 영역과 실질적으로 일치(약 85% 이상, 일반적으로 90-95% 이상) 하는 프레임워크 영역이다. 항체의 프레임워크 영역은, 구성 경쇄 및 중쇄 사슬의 결합된 프레임워크 영역이며, CDR을 위치시키거나 정렬시키기 위하여 사용된다. CDR은 우선적으로 항원의 에피토프에 결합시키게 된다.
따라서, 용어 "인간화된" 면역글로블린은 인간 프레임워크 영역 및 비인간 (일반적으로 마우스 또는 레트) 면역글로블린의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로블린이다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로블린을 "공여자"라 하며 및 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로블린을 "수용체"라 한다. 불변 영역이 제공될 필요는 없으나, 존재한다면, 이들은 인간 면역글로블린 불변 영역과 실질적으로 일치, 즉, 최소한 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 이상 일치 하여야 한다. 그러므로, 인간화된 면역글로블린의 모든 부분은, 가능하다면 CDR을 제외하고는, 천연 인간 면역글로블린 영역의 대응하는 부분과 실질적으로 일치한다. "인간화된 항체"는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄 면역글로블린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 인간화된 항체는 예컨대, 본원에서 정의한 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않으며, 이는 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비인간이기 때문이다.
용어 "유전적으로 변형된 항체"는 항체를 의미하며, 여기서, 아미노산 서열은 자연 항체의 것과 다르다. 항체를 생산하는 재조합 DNA 기법의 관련성 때문에, 천연 항체 내에서 발견되는 아미노산 서열에 한정될 필요는 없으며; 항체를 재설계하여 원하는 특성을 확보할 수 있다. 가능한 변이는 다수, 및 하나의 또는 소수의 아미노산 만을 변화시키는 범위가 되어, 예를 들어, 가변 또는 불변 영역의 재설계를 수행하게 된다. 불변 영역의 변화는, 일반적으로, 특성, 예컨대 보체 고정화, 막과의 상호작용 및 다른 효과기 기능을 향상 또는 변화시키기 위하여 사용된다. 가변 영역의 변화는 항원 결합 특성을 향상시키기 위하여 사용된다.
항체와 함께, 면역글로블린은, 예를 들어, 단일-사슬 또는 Fv, Fab, 및 (Fab')2, 및 이량체, 선형 항체, 다가 또는 다특이적 하이브리드 항체를 포함하는 다양한 다른 형태(전술한 바와 같으며 자세한 사항은: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987) 참조) 및 단일 사슬 (예컨대, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) 및 Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), 이들은 참고자료로서 본원에 포함)로 존재할 수 있다. (일반적으로, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed.(1984), 및 Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), 이들은 참고자료로서 본원에 포함).
본원에서 사용되는, 용어 "단일-사슬 Fv," "단일-사슬 항체," "Fv" 또는 "scFv"는 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 포함하나, 불변 영역이 부재하며, 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 존재하는 항체 절편이다. 일반적으로, 단일-사슬 항체 추가적으로 항원 결합을 가능케 하는 원하는 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 단일 사슬 항체는 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]에서 상세하게 논의되어 있으며; 또한 국제특허출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조하며, 이들의 개시 내용은 어떠한 목적으로든 포함되어 있다. 특정 실시 상태에서, 단일-사슬 항체는 이-특이적 및/또는 인간화될 수 있다.
"Fab 절편"은 일 경쇄 및 CH1 및 일 중쇄의 가변 영역으로 구성되어 있다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 있다.
"Fab' 절편"은 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역 이상을 함유하는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 함유하여, 사슬내 이황화 결합이 두 중쇄 사이에서 F(ab')2 분자를 형성할 수 있게 된다.
"F(ab') 2 절편" CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 두개의 경쇄 및 두개의 중쇄를 함유하여, 사슬내 이황화 결합이 두 중쇄 사이에 형성 된다.
볼명확한 분석법(예컨대, 겔 전기영동)에 의하여 측정된 분자량 및 고분자 길이는 대략적인 값으로 이해하여야 한다. 이러한 값은 "약" X 또는 "대략" X으로 표현되며, 언급된 X 값은 ±10%의 정확성으로 이해할 수 있다.
본원에서 언급된 모든 참고자료는 참고자료로서 일체성을 지니고 포함되어 있다.
본 발명은 공유 미국 특허출원 번호 제11/430,066호(May 8, 2006 출원, December 7, 2006 공개, 미국 특허 공개 번호 제2006-0275296호, 참고자료로서 본원에 포함)에 개시된 단클론 항체의 아미노산 서열의 결정에 부분적으로 기초한다. 전술한 인간 IL-31에 대한 중화 단클론 항체를 발현하는 하이브리도마를 부다페스트 조약에 의거하여 원 기탁기관으로서 아메리칸 타입 조직 컬쳐 컬렉션 (ATCC; 10801 University Blvd, Manassas VA 20110-2209)에 기탁하였으며, 다음의 ATCC 인증 번호를 부여받았다: 클론 292.12.3.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6815, June 29, 2005); 클론 292.72.3.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6816, June 29, 2005); 클론 292.63.5.3(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6829, July 6, 2005); 클론 292.118.6.4(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6830, July 6, 2005); 클론 294.163.2.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6831, July 6, 2005); 클론 292.84.1.6(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6871, July 19, 2005); 클론 294.35.2.6.3(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6872, July 19, 2005); 클론 294.154.5.6(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6875, July 19, 2005); 및 클론 294.144.3.5 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6873, July 19, 2005).
본 발명은 IL-31 리간드에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 융합 단백질로서 발현시켜 인간 IgG4 Fc 분자와의 결합에 사용되어, IL-31에 길항작용을 함으로써 일반 적으로 염증, 및 피부염 및 소양성 질환의 증상을 억제, 차단, 감소 또는 중화하는 항체 및 항체 절편 생산시 사용되는 이러한 하이브리도마에 의하여 생산되는 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 제공한다. 이러한 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 이들로 구성된 항체 또는 항체 절편을 포함할 수 있고, 이의 수용체 상에서 IL-31의 효과를 중화, 억제, 감소, 예방 또는 최소화하는 키메라, 인간화된, 또는 항체 절편이 될 수 있다. 항체 또는 항체 절편의 임상적 결과는 전술한 바와 같이 염증 질환, 예컨대 피부염 및 소양성 질환의 감소가 될 수 있으며. 일 실시 상태에서, 피부염은 아토피성 피부염이다. 또 다른 실시 상태에서, 피부염은 결절성 양진이다. 또 다른 실시 상태에서, 피부염은 습진이다.
IL-31은 최근 발견된 T 세포 사이토카인이며, 마우스에서 과다발현되는 경우, 피부염-유사 증상을 유발한다. 문헌 [Dillon, et al., Nature Immunol. 5:752-760, 2004] 참조. 피부-귀소 T 세포 및 표피 케라토사이트 모두는 인간 내의 피부 질환의 병리학에 관련되어 있다. IL-31 mRNA 및 단백질 발현은 아토피성 피부염(AD) 환자 및 정상 개체 모두에서 피부-귀소 CLA+ T 세포 집단으로 제한되고, 반면에 면역조직화학(IHC)에 의한 IL-31, IL-31RA의 수용체 분석에 의하면 급성 및 만성 AD 질환자의 피부 생검에서 피부 각질세포 상의 IL-31 RA 발현 수준은 정상 개체에 비하여 약간 높은 것으로 알려졌다.
IL-31는 공개 미국 특허 출원(공개 번호 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003, 참고자료로서 본원에 포함)에서 Zcytol7rlig로 설명되어 있는 사이토카인의 HUGO 명이다. 문헌 [Dillon, et al., Nature Immunol., 전게서] 참조. IL-31에 대한 이종이량체 수용체는 20030224487에서 zcytorl7(HUGO명, IL-31RA)로 설명하였으며, 이는 온코스타틴M 수용체 베타(OSMR베타)와 이종이량체를 형성한다. IL-31은 활성화된 인간 말초 혈액 세포(hPBCs)로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 분리되며, 이는 CD3에 대하여 선별된다. CD3는 림프계 기원 세포, 특히 T 세포에 독특한 세포 표면 마커이다. 인간 IL-31의 폴리펩타이드 서열은 SEQ ID NO:2로 나타낸다. 뮤린 IL-31의 폴리펩타이드 서열은 SEQ ID NO:4로 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어, IL-31은 상기 미국 특허 공개 번호 제20030224487호에서 사용하는 바와 같이 IL-31을 의미한다. IL-31의 분비 신호 서열은 아미노산 잔기 1(Met) 내지 23(Ala)를 포함하고 있으며, 성숙 폴리펩타이드는 아미노산 잔기 24(Ser) 내지 164(Thr)를 포함한다(SEQ ID NO:2). 추가적으로 293T 세포의 정제 IL-31의 N-말단 서열 분석에서는 아미노산 잔기 27(Leu) 내지 164(Thr)을 포함하는 성숙 폴리펩타이드와 함께, SEQ ID NO:2 내의 잔기 27(Leu)의 N-말단을 나타낸다(SEQ ID NO:2).
IL-31는 공개 미국 특허 출원(공개 번호 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003, 참고자료로서 본원에 포함)에서 Zcytol7rlig로 설명되어 있는 사이토카인의 HUGO 명이다. 문헌 [Dillon, et al., Nature Immunol., 전게서] 참조. IL-31에 대한 이종이량체 수용체는 20030224487에서 zcytorl7(HUGO명, IL-31RA)로 설명하였으며, 이는 온코스타틴M 수용체 베타(OSMR베타)와 이종이량체를 형성한다. IL-31은 활성화된 인간 말초 혈액 세포(hPBCs)로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 분리되며, 이는 CD3에 대하여 선별된다. CD3는 림프계 기원 세포, 특히 T 세포에 독특한 세포 표면 마커이다. 인간 IL-31의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 2 이다. 뮤린 IL-31의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 각각 SEQ ID NO:3 및 4 이다. 본원에서 사용되는 용어, IL-31은 상기 미국 특허 공개 번호 제20030224487호에서 사용하는 바와 같이 IL-31을 의미한다. IL-31의 분비 신호 서열은 아미노산 잔기 1(Met) 내지 23(Ala)를 포함하고 있으며, 성숙 폴리펩타이드는 아미노산 잔기 24(Ser) 내지 164(Thr)를 포함한다(SEQ ID NO:2). 추가적으로 293T 세포의 정제 IL-31의 N-말단 서열 분석에서는 아미노산 잔기 27(Leu) 내지 164(Thr)을 포함하는 성숙 폴리펩타이드와 함께, SEQ ID NO:2 내의 잔기 27(Leu)의 N-말단을 나타낸다(SEQ ID NO:2).
IL-31RA (IL-31 수용체)의 폴리펩타이드 서열은 SEQ ID NO:5로 나타내며, 온코스타틴M 수용체 베타 (OSMR베타)의 폴리펩타이드 서열은 SEQ ID NO:6로 나타낸다.
IL-31RA 및 OSMR베타 수용체는 클래스 I 사이토카인 수용체 아과(subfamily)에 속하며, 이에 한정되는 것은 아니나, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF 및 G-CSFdml 수용체를 포함한다(Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" in Cytokine 5(2): 95-106, 1993). IL-31RA 서브유닛은 공유 PCT 특허 출원 제US01/20484호 (WIPO 공개 WO 02/00721)에 상세히 설명되어 있다. IL-31RA 서브유닛의 mRNA의 조직 분포 분석에 의하면 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트, CD14+ 단핵구 내에서의 발현, 및 CD19+ B-세포 내의 약한 발현을 나타낸다. 더욱이, mRNA는 휴지상태 또는 활성화된 단핵성 세포주 THP-1 (ATCC No. TIB-202), U937 (ATCC No. CRL-1593.2) 및 HL60 (ATCC No. CCL-240) 모두에 존재한다.
경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 분자, 즉 "IL-31 결합 분자" 또는 "IL-31 길항제"에 의한 신호 전달의 억제, 중화, 또는 차단은 당해 기술 분야에 공지된 다수의 분석법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 증식 감소를 측정하는 분석은 염료 예컨대 Alamarblue™ (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3,(4,5 디메틸티아졸-2일)-5-3-카르복시메톡시페닐-2H-테트라졸륨; 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨 하이드록사이드; 및 시아노디톨일-테트라졸륨 클로라이드(Polysciences, Inc., Warrington, PA로부터 구득 가능)의 감소 분석; 세포분열 분석, 예컨대 3H-티미딘 통합의 측정; 예를 들어, 나프탈렌 블랙 또는 트리판 블루를 사용하는 염료 배제 분석; 디아세틸 플루오레세인을 사용하는 염료 흡수; 및 크롬방출을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Freshney, Culture of Animal Cell: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994]를 참고하며, 이는 참고자료로서 본원에 포함되어 있다. 상기와 함께, BaF3 세포 발현 IL-31RA 및 전장 OSMR베타의 예시로서 미국 특허 공개 번호 제20030224487호(Sprecher, Cindy et al., 2003)를 참조한다.
본원의 (DNA 및 RNA를 포함하는) 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 전체 RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 단계과 후속적인 CsCl 구배에 의한 원심분리에 의한 분리 단계에 의하여 제조될 수 있다(Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). 폴리 (A)+ RNA는 문헌[Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972)]의 방법을 사용하여 전체 RNA로부터 제조된다. 상보적 DNA(cDNA)는 공지의 방법을 사용하여 폴리(A)+ RNA로부터 제조된다. 대안적 실시 상태에 있어서, 게놈 DNA는 분리될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 또는 PCR에 의하여 IL-31 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 동정하고 분리하였다.
본 발명은 또한 IL-31 폴리펩타이드의 기능성 절편 및 이러한 기능성 절편을 암호화하는 핵산 분자에 결합하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함한다. 본원에서 정의한 바와 같이 "기능성" IL-31 또는 이들의 절편은 이의 증식성 또는 분화 활성, 이의 특화된 세포 기능을 유도 또는 억제능, 또는 특히 이의 항-IL-31 항체 또는 IL-31RA 또는 항체 또는 이러한 수용체의 IL-31 RA/OSMR베타 이종이량체(가용성 또는 고정된)와의 결합능에 의하여 특정된다. 전술한 바와 같이, IL-31는 SEQ ID NO:2에 나타낸 바와 같이 나선 A(아미노산 잔기 38-52), 나선 B(아미노산 잔기 83-98), 나선 C(아미노산 잔기 104-117) 및 나선 D(아미노산 잔기 137-152)를 포함하는 4-나선-번들 구조로 특정된다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 다음을 포괄하는 융합 단백질을 제공한다: (a) 하나 이상의 상기 나선을 포함하는 폴리펩타이드 분자; 및 (b) 하나 이상의 이러한 나선을 포함하는 기능성 절편. 융합 단백질의 다른 폴리펩타이드 부분은 또 다른 4-나선-번들 사이토카인, 예컨대 IL-15, IL-2, IL-4 및 GM-CSF, 또는 융합 단백질의 분비를 촉진하는 비-자연 및/또는 무관 분비 신호 펩타이드에 의하여 구축된다.
본 발명은 또한 본원의 IL-31 폴리펩타이드의 에피토프-함유 부분을 포함하는 폴리펩타이드 절편 또는 펩타이드에 결합하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 제공한다. 이러한 절편 또는 펩타이드는 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있으며, 이는 전체 단백질이 면역원으로 사용된 경우 항체 반응을 유발하는 단백질의 일부이다. 면역원성 에피토프-함유 펩타이드는 표준 방법을 사용하여 동정할 수 있다(예를 들어, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983) 참조). 항체와 이러한 기능성 절편의 결합에 의하여 이의 인지 수용체 상의 IL-31의 신호 전달이 억제, 차단, 중화, 및/또는 감소된다.
이에 비하여, 폴리펩타이드 절편 또는 펩타이드는 "항원성 에피토프"를 포함할 수 있으며, 이는 특히 항체와 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역이다. 특정 에피토프는 아미노산의 선형 또는 인접한 신장으로 구성되며, 및 이러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의하여 파괴된다. 단백질의 에피토프를 모사할 수 있는 상대적으로 짧은 합성 펩타이드가 단백질에 대한 항체의 생산을 자극하기 위하여 사용될 수 있다는 사실은 공지되어 있다(예를 들어, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). 따라서, 항원성 에피토프-함유 펩타이드 및 본 발명의 폴리펩타이드는 본원의 폴리펩타이드와 결합하는 항체 (예컨대, 중화 항체)를 생육하기에 유용하다. Hopp/Woods 친수성 특성은 가장 잠재적인 항원성을 보유한 영역을 결정하기 위하여 사용될 수 있다(Hopp et al., 1981, ibid, and Hopp, 1986, ibid.). 예를 들어, 인간 IL-31에 있어서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 54-59, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 129-134, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 53-58, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 35-40, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 33-38를 포함한다. 예를 들어, 마우스 IL-31에 있어서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 34-39, SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 46-51, SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 131-136, SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 158-163, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 157-162를 포함한다.
항원성 에피토프-함유 펩타이드 및 폴리펩타이드 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 최소한 4 내지 10 아미노산, 최소한 10 내지 14 아미노산, 또는 약 14 내지 약 30 아미노산을 함유한다. 이러한 에피토프-함유 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본원에서 설명한 바와 같이 IL-31 폴리펩타이드의 절편화, 또는 화학적 펩타이드 합성을 통하여 생산될 수 있다. 더욱이, 에피토프는 무작위 펩타이드 라이브러리의 파지 디스플레이에 의하여 선택될 수 있다(예를 들어, Lane and Stephen. Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); 및 Cortese et al, Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). 에피토프를 동정하고, 에피토프를 포함하는 작은 펩타이드로부터 항체를 생산하는 표준 방법은, 예를 들어, Mole, "Epitope Mapping," in Methods in Molecular Biology. Vol. 10, Manson (ed.), pages 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), 및 Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)에 설명되어 있다.
본원에서 설명한 항체의 활성은 IL-31RA 수용체를 발현하는 세포의 증식 및/또는 결합을 측정하는 다양한 분석을 사용하여 증식을 억제 또는 감소시키는 이들의 능력으로 측정될 수 있다. 특히 IL-31-의존성 세포 내의 결합이 관심 대상이다. IL-31-의존성이 되도록 조작된 적합한 세포주는 IL-3-의존성 BaF3 세포주(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1(Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), 및 MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993)를 포함한다. 성장 인자-의존성 세포주는 공지된 방법에 따라 확립될 수 있다(예컨대, Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., in Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today. 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).
본원에서 설명한 항-IL-31 항체의 활성은 실리콘계 생체센서 마이크로생리검출기에 의하여 측정될 수 있으며, 이는 세포외 산성화율 또는 수용체 결합에 관련된 양자 배출 및 후속적인 생리학적 세포 반응을 측정하게 된다. 예시적인 기구는 Cytosensor™ Microphysiometer(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)이다. 다양한 세포성 반응, 예컨대 세포 증식, 이온 수송, 에너지 생산, 염증 반응, 조절 및 수용체 활성화, 등을 이 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [McConnell, H.M. et al., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzvmol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998]를 참조한다.
길항제는 리간드-수용체 상호작용의 부위를 특성화하기 위한 연구 시약으로서 유용하다. 길항제는 조혈을 조절하는 세포의 억제, 확장, 증식, 활성화, 및/또는 분화에 유용하다. IL-31 활성의 억제제(IL-31 길항제)는 항-IL-31 항체 및 가용성 IL-31 수용체, 및 기타 펩타이드 및 비-펩타이드제(리보자임 포함)를 포함한다.
IL-31의 활성의 억제는 다수의 분석법에 의하여 측정할 수 있다. 이러한 본원에서 설명한 분석과 함께, 수용체 결합, IL-31-의존성 세포성 반응의 자극/억제 또는 IL-31RA 수용체-발현 세포의 증식을 측정하기 위하여 설계된 다양한 분석에서 시료로 IL-31 활성의 억제를 시험할 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 IL-31-결합 폴리펩타이드는 리간드의 분리정제에 사용될 수 있다. 폴리펩타이드는 고체 지지체 상에 고정되며, 예컨대 아가로스의 비드, 가교결합된 아가로스, 유리, 셀룰로오스 수지, 실리카계 수지, 폴리스티렌, 가교결합된 폴리아크릴아미드, 또는 사용 상태에서 안정적인 유사 물질 등이 있다. 폴리펩타이드와 고체 지지체를 연결하는 방법이 공지되어 있으며, 및 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성화, N-하이드록시석신이미드 활성화, 에폭사이드 활성화, 설프하이드릴 활성화, 및 히드라지드 활성화를 포함한다. 결과 배지는 일반적으로 컬럼의 형태로 배치되며, 리간드 함유 유체는 1회 이상 컬럼을 통과하여 리간드가 수용체 폴리펩타이드에 결합하도록 한다. 리간드는 리간드-수용체 결합을 파괴하기 위한 염 농도, 무질서 유발제(구아니딘 HCl), 또는 pH의 변화를 이용하여 용출된다.
리간드-결합 수용체 (또는 항체, 보체/항-보체 짝의 일 구성원) 또는 이들의 결합 절편를 사용하는 분석 시스템, 및 구득가능한 생체센서 기구(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항-보체 짝의 구성원 또는 절편은 수용체 칩의 표면상에 고정된다. 이러한 기구의 사용은 문헌 [Karlsson, J1 Immunol. Methods 145:229-40. 1991 및 Cunningham and Wells. J. MoI. Biol. 234:554-63. 1993]에 설명되어 있다. 수용체, 항체, 구성원 또는 절편은 아민 또는 설프하이드릴 화학을 사용하여, 유동 세포 내에서 금막(gold film)에 부착된 덱스트란 섬유에 공유 결합된다. 시험 시료는 세포를 통과하게 된다. 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 짝의 상대 구성원이 시료 내에 존재한다면, 이는 고정된 수용체, 항체 또는 구성원에, 각각 결합하게 되고, 이는 배지의 굴절율의 변화를 유발하여, 금막의 표면 플라즈몬 공명의 변화로서 검출될 것이다. 이 시스템은 온-및 오프율을 결정할 수 있으며, 이로써 결합 친화도 및 결합의 화학양론의 평가를 계산할 수 있다. 대안적으로, 리간드/수용체 결합은 SELDI(TM) 기술(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)을 사용하여 분석할 수 있다.
[47] IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 전염증 IL-31의 생물학적 활성을 차단하기 위하여 사용될 수 있으며, 본원에 설명한 다양한 질환에 있어서 항-염증 치료제로서 유용하다. 당해 기술 분야의 숙련자라면 항원성, 에피토프-함유 폴리펩타이드가 IL-31 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO:2)의 최소한 6, 바람직하게는 최소한 9, 및 더욱 바람직하게는 최소한 15 내지 약 30 개의 인접한 아미노산 잔기의 서열을 포함한다는 것을 인식하고 있다. IL-31 폴리펩타이드의 큰 부분, 즉, 아미노산 서열의 30 내지 100 잔기에서 전장에 이르는 부분을 포함하는 폴리펩타이드가 포함된다. 항원 또는 면역원성 에피토프는 본원에서 설명한 부착된 태그, 보조제, 비히클 및 담체를 포함할 수 있다. 적합한 항원은 아미노산 번호 24 내지 아미노산 번호 164, 또는 인접한 9 내지 141 아미노산 이들의 절편의 SEQ ID NO:2에 의하여 암호화된 IL-31 폴리펩타이드를 포함한다. 기타 적합한 항원은 전장 및 성숙 IL-31, 나선 A-D, 및 IL-31 4-나선-번들 구조의 각각 또는 다중 나선 A, B, C, 및 D를 포함한다. 항원으로 사용되는 양호한 펩타이드는 예컨대 소수성 플롯으로부터 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 예측된 친수성 펩타이드이며, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 114-119, 101-105, 126-131, 113-118, 및 158-162; 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 및 157-162이다. 더욱이, 예컨대, DNASTAR 프로테언 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여, Jameson-Wolf 플롯에 의하여 예측되는 IL-31 항원성 에피토프는 양호한 항원으로서 제공되며, 당해 기술분야의 숙련자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는: 1) 이들은 결합 활성의 트레드홀드 수준을 나타내며, 및 2) 이들이 유관 폴리펩타이드 분자와 현저하게 상호-반응하지 않는 경우 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 결합의 트레드홀드 수준은 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제가 IL-31 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 대조구(비-IL-31) 폴리펩타이드에 대한 결합 친화도보다 친화도가 최소한 10-배 이상 큰 에피토프에 결합하는지 여부에 대하여 결정된다. 항체가 106 M-1 또는 그 이상, 바람직하게는 107 M-1 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 108 M-1 또는 그 이상, 및 가장 바람직하게는 109 M-1 또는 그 이상의 결합 친화도(Ka)를 나타내는 것이 바람직하다. IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 결합 친화도는 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여, 예를 들어, Scatchard 분석을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다 (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 5J_: 660-672, 1949).
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제가 유관 폴리펩타이드 분자와 현저하게 상호-반응하지 않는지 여부를, 예를 들어, 표준 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 미지의 유관 폴리펩타이드가 아닌 IL-31 폴리펩타이드를 검출하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의하여 나타내었다(Ausubel et al., ibid.). 공지의 유관 폴리펩타이드의 예는 선행 기술에 공지되어 있으며, 예컨대 공지의 오르소로그(orthologs), 및 파라로그(paralogs), 및 단백질 과(family)의 유사한 공지의 구성원이다. 또한 선별은 비-인간 IL-31, 및 IL-31 돌연변이 폴리펩타이드를 사용하여 수행된다. 더욱이, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 IL-31 폴리펩타이드에 특정적으로 결합하는 집단을 분리하기 위하여 공지의 유관 폴리펩타이드에 "대하여 선별" 될 수 있다. 예를 들어, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 불용성 매트릭스에 부착된 유관 폴리펩타이드에 흡수되며; IL-31 결합 분자 또는 IL-31에 특이적인 IL-31 길항제는 적절한 완충 상태 하에서 매트릭스를 통하여 유동하게 된다. [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995.]
조직 배양 배지로부터 정제된 단클론 항체는 BaF3/MPL-IL-31 세포 상의 정제된 재조합 huIL-31의 수용체 결합 활성("중화 분석")을 차단 또는 감소하는 이들의 능력에 의하여 특정된다.
IL-31 결합 분자와 IL-31 길항제의 결합 친화도를 측정할 수 있다. 염소-항-레트 IgG-Fc 감마 특이적 항체(Jackson)는 CM5 Biacore 칩 상에 고정된다. 분석은 각각의 mAb가 항-레트 포획 표면 상에 결합하도록 최적화되고, 그 다음 IL-31의 일련의 농도가 mAb를 통하여 주입되어 결합(Ka) 및 해리(Kd)를 관찰하게 된다. 각각의 실행 후, 표면은 2OmM HCl를 2회 주입하여 항-레트 항체로 회귀하여 재생된다. 데이터는 각각에서 생성되며 평가 소프트웨어(BIAevaluation software version 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Sweden)를 사용하여 IL-31 단백질에 대한 항-IL-31 항체의 동역학을 평가한다.
클론 번호 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 292.72.3.1.의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 실시예 1에서 나타낸 바와 같이 결정된다. 클론 번호의 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역의 아미노 말단의 폴리펩타이드 서열은 실시예 2에 나타낸 바와 같이 결정된다.
조직 배양 배지 내의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는, 정제된 재조합 단백질 인간 IL-31의 존재 하에서 성장하는 경우, 수용체 결합을 차단, 억제, 예방 또는 감소하는 이들의 능력으로 특정된다. 예를 들어, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 비닝(binning) (즉, 각 항체가 다른 결합의 결합을 억제하는지 여부를 결정), 상대적 친화도, 및 중화를 포함하는 다양한 방법으로 특정될 수 있다.
본원에서 설명한 방법으로 생성된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 다양한 방법에 의하여 중화 시험될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 (공개 번호 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003)에 설명된 루시페라아제 분석이 사용될 수 있다. 이와 함께, 중화는 전-염증 케모카인 예컨대 리간드 및 단클론 항체의 존재 하에서 각질세포 배양물의 TARC 및 MDC 등의 생산 감소를 측정하여 시험될 수 있다. 중화는 본원의 생체 내 모델에 의하여 측정될 수 있다.
일 실시 상태에서, 본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 본 발명의 인간 항원-결합 항체 절편이며, 이에 한정되는 것은 아니나, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs(scFv), 단일-사슬 항체, 이황화-결합 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 절편을 포함한다. 단일-사슬 항체를 포함하는 항원-결합 항체 절편은 가변 영역(들)(즉, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 또는 4 )을 단독으로 또는 다음의 전체 또는 부분과 함께 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 본 발명은 가변 영역(s)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 어떠한 조합을 포함하는 항원-결합 절편이다.
또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 일특이적, 이특이적, 삼특이적 또는 그 이상의 다특이성이 될 수 있다. 다특이적 항체는 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 에피토프에 특이적일 수 있거나 또는 본 발명의 폴리펩타이드 모두 및 이종유래 에피토프, 예컨대 이종유래 폴리펩타이드 또는 고체 지지 물질에 특이적일 수 있다. 예컨대, 문헌 [PCT 공개번호 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); 미국 특허 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]를 참조한다.
본 발명은 전술한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제와 기능적으로 동등한 유전적으로 변형된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함할 수 있다. 개선된 안정성 및/또는 치료적 효능을 제공하는 변형된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제가 양호하다. 변형된 항체의 예는 항원 결합 효용을 현저하게 유해하게 변형되지 않은 아미노산 잔기의 보존적 치환을 지닌 것들, 및 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가를 포함한다. 치료적 효용이 유지되는 한도에서 영역을 재설계하기 위하여 치환은 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화 또는 변형시키는 범위가 될 수 있다. 본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 전사-후 변형되거나 (예컨대, 아세틸화, 및 포스포릴화) 또는 합성적으로 변형될 수 있다 (예컨대, 표지 기의 부착).
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 본원에서 설명한 가변 영역 및 인간으로부터 유도된 불변 영역을 포함하는 키메라 항체 또는 키메라 절편을 포함하므로써 인간 대상체에 투여시 키메라 항체 또는 키메라 절편이 보다 긴 반감기와 낮은 면역원성을 지니게 된다. 키메라 항체 및 키메라 절편의 제조 방법은 공지되어 있다. 이러한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 가변 영역은 인간 IgG의 불변 영역에 연결되어 소망하는 키메라 항체를 형성하게 된다. IgG Fc 분자는 IL-31 결합 분자와 융합될 수 있다. 효과기 기능의 유도를 회피하기 위하여, IgG Fc 분자는 IgG4 Fc 분자의 것이 될 수 있다. 따라서, 본원에서 설명한 가변 영역 및 가변 영역의 아미노산 서열은 키메라 항체를 생성하기 위하여 사용할 수 있으며, 여기서, 불변 영역은 인간 IgG 분자이며, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 클론 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 및 292.72.3.1에서 선택될 수 있다. 이러한 키메라 항체는: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 j) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 보유하며, 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다.
이러한 가변 영역은 신호 영역과 함께 또는 이들 없이 생성될 수 있다. 따라서, 본원의 가변 영역 및 가변 영역의 아미노산 서열은 키메라 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있으며, 여기서, 불변 영역은 인간 IgG 분자이고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 신호 영역을 보유하며, 클론 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 및 292.72.3.1에서 선택될 수 있다. 이러한 키메라 항체는: a)
SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 j) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 보유하며, 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 이러한 가변 영역은 신호 영역과 함께 또는 이들 없이 생성될 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 인간화된 버전의 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함한다. 인간화된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 마우스 공여자 면역글로블린의 CDR 및 인간 수용체 면역글로블린의 중쇄와 경쇄 프레임워크을 포함한다. 인간화된 항체를 제조하는 방법은 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 및 6,180,370 (이들 각각은 일체성을 지니고 참고자료로서 포함되어 있다)에 개시되어 있다. 이러한 항체의 CDR은 기술 분야에 공지되어 있는 모든 선택된 인간 프레임워크에도 접합될 수 있으며, 소망하는 인간화된 항체를 생산할 수 있게 된다.
본 발명은 단클론 항체와 본 발명의 폴리펩타이드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 폴리펩타이드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 제공한다. 경쟁적 억제는 공지의 모든 방법, 예를 들어, 본원에서 설명한 경쟁적 결합 분석 등을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 실시 상태에서, 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 폴리펩타이드와 본 발명의 단클론 항체의 결합을 최소한 90%, 최소한 80%, 최소한 70%, 최소한 60%, 또는 최소한 50% 경쟁적으로 억제한다.
본 발명은 경쟁적 결합을 결정하기 위한 공지의 방법, 예를 들어, 본원에서 설명한 면역분석 등에 의하여 결정되는, 항체와 본 발명의 에피토프의 결합을 경쟁적으로 억제하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 제공한다. 바람직한 실시 상태에서, 항체는 에피토프와의 결합을 최소한 90%, 최소한 80%, 최소한 70%, 최소한 60%, 또는 최소한 50% 경쟁적으로 억제한다.
본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 변형된 유도체를 포함하며, 예를 들어, 제한되는 것은 아니나, 유도체는, 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단기에 의한 유도화, 단백질분해, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 연결, 등에 의하여 변형된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함한다. 다양한 화학적 변형은 이에 한정되는 것은 아니나 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성, 등을 포함하는 공지의 기법에 의하여 수행될 수 있다. 부언하자면, 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 포유류, 바람직하게는 인간 내에서의 반감기(예컨대, 혈청 반감기)가 15 일 이상, 바람직하게는 20 일 이상, 25 일 이상, 30 일 이상, 35 일 이상, 40 일 이상, 45 일 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 또는 5 개월 이상인 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함한다. 포유류, 바람직하게는 인간 내의 본 발명의 항체 또는 이들의 절편의 반감기가 증가함으로써, 포유류 내의 상기 항체 또는 항체 절편의 혈청 역가가 높아지고, 따라서, 상기 항체 또는 항체 절편의 투여 빈도가 줄어들고 및/또는 투여하는 상기 항체 또는 항체 절편의 농도도 감소한다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 생체 내 반감기는 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형(예컨대, 치환, 결실 또는 첨가) 시키므로써(예컨대, 국제 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 02/060919, 이들은 참고자료로서 일체성을 지니고 본원에 포함) 또는 고분자 분자 예컨대 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등을 부착함으로써 증가시킬 수 있다. PEG는 상기 항체 또는 항체 절편의 N-또는 C-말단과 부위-특이적 접합하는 PEG를 통하거나 또는 라이신 잔기 상에 제공된 입실론-아미노 기를 통한 다기능성 링커를 사용하거나 또는 사용하지 않고 부착될 수 있다. 생물학적 활성 손실을 최소화하는 선형 또는 가지형 고분자 유도가 사용될 것이다. 접합의 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의하여 면밀하게 모니터링되어 PEG 분자와 항체의 적절한 접합을 확보하게 된다. 미반응 PEG는, 예컨대, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다.
본 방법에 의하여 설계된 인간화된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 항원 결합 또는 다른 면역글로블린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가적인 보존적 아미노산 치환을 보유할 수 있다고 이해할 수 있다. 보존적 치환은 의도하는 조합 예컨대 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr 이다.
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체를 포함하는 인간화된 면역글로블린은 유전자 조작에 의하여 구축된다. 전술한 가장 인간화된 면역글로블린(Jones et al., op. cit; Verhoeyen et al., op. cit; Riechmann et al., op. cit.)은 특정 인간 면역글로블린 사슬, 수용체, 및 비인간 공여자 면역글로블린 사슬의 3 CDR's의 프레임워크와 일치하는 프레임워크포함한다. 특히, 인간화된 항체는 비인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로블린 분자의 프레임워크 영역을 보유하는 소망하는 항원에 결합하는 비인간 종 항체의 항체 분자이다.
본 발명은 인간화된 면역글로블린 사슬을 포함하는 항체의 친화도를 증가시키기 위하여, 인간화된 면역글로블린 사슬의 프레임워크 내의 아미노산의 제한된 숫자는 수용체가 아닌 공여자 내의 그들의 위치에서의 아미노산과 동일한 것으로 선택된다는 기준을 포함한다.
본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 인간화된 항체를 생산하는 수단(CDR's의 공급원으로서 예시적인 마우스 항체를 사용) 이전에 친화도 손실의 두 원인이 다음과 같은 모델에 부분적으로 기초하여 생산된다:
(1) 마우스 CDR에 인간 프레임워크와 결합하는 경우, CDR에 근접한 프레임워크 내의 아미노산이 마우스가 아닌 인간이 된다. 이론에 합치하는 것은 아니나, 이러한 변화된 아미노산은 CDR을 약간씩 비틀게되고, 이는 공여자 마우스 항체에서와 다른 정전기력 또는 소수성 힘이 생성되기 때문이며, 비틀린 CDR은 공여자 항체 내의 CDR 처럼 항원과 효과적으로 접촉하지 못한다; 및
(2) CDR에 인접하나, 그 일부가 아닌(즉, 여전히 프레임워크의 부분) 원 마우스 항체 내의 아미노산이 친화도에 기여하는 항원과 접촉할 수 있다. 이러한 아미노산은 항체가 인간화된 경우 상실되며, 이는 모든 프레임워크 아미노산이 인간의 것으로 제조되었기 때문이다.
이러한 문제점을 회피하고, 소망하는 항원에 대한 매우 강한 친화도를 지닌 인간화된 항체를 생성하기 위하여, 본 발명은 인간화된 면역글로블린을 설계하기 위한 하나 이상의 다음의 원리를 사용한다. 또한, 기준을 단독으로 또는 필요시 조합하여 사용하여 소망하는 친화도 또는 다른 특성을 달성하게 된다.
원칙은 일반적으로 인간화된 공여자 면역글로블린에 상동이거나, 또는 다수의 인간 항체의 컨센서스 프레임워크를 사용하는 특정 인간 면역글로블린의 수용체, 프레임워크를 사용한다는 것이다. 예를 들어, 데이터 뱅크(예를 들어, the National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource) 내의 인간 중쇄(또는 경쇄) 가변 영역에 대한 마우스 중쇄(또는 경쇄) 가변 영역의 서열을 비교하면 다른 인간 영역에 대한 상동성의 정도는 매우 다르며, 일반적으로 약 40% 내지 약 60-70% 이라는 것을 보여준다. 수용체 면역글로블린으로써, 공여자 면역글로블린의 중쇄(각각 경쇄) 가변 영역에 가장 상동인 인간 중쇄 (각각 경쇄) 가변 영역 중의 하나를 선택함으로써, 공여자 면역글로블린에서 인간화된 면역글로블린까지에서 소수의 아미노산만이 변화될 것이다. 따라서, 이론에 합치하는 것은 아니나, 이들의 입체구조가 비틀린 CDR 부근의 아미노산 변화의 기회가 적다고 알려져 있다. 더욱이, 인간화된 면역글로블린 사슬을 포함하는 인간화된 항체의 정확한 전체 형상은 공여자 항체의 형상과 매우 유사할 수 있으며, CDR의 비틀림의 기회를 감소시킨다.
일반적으로, 최소한 약 10 내지 20 개의 별개의 인간 중쇄의 대표적인 집단에서 3-5 개의 가장 상동인 중쇄 가변 영역 서열 중의 하나가 수용체로서 선택되어 중쇄 프레임워크를 제공하게 되며, 이는 경쇄에서도 유사하다. 바람직하게는, 1-3 개의 가장 상동인 가변 영역 중의 하나가 사용된다. 선택된 수용체 면역글로블린 사슬은, 가장 바람직하게는 프레임워크 영역 내에서 공여자 면역글로블린과 최소한 약 65% 상동이 된다.
많은 경우에 있어서, 수용체 서열로서 동일한 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 사슬을 사용하는 것이 바람직하며, 인간화된 경쇄 및 중쇄 사슬이 서로 바람직한 접촉을 할수 있도록 하기 위함이다. 이 경우에서, 공여자 경쇄 및 중쇄 사슬은 완전한 서열이 알려진 인간 항체, 예컨대, Eu, Lay, Pom, Wol, Sie, Gal, Ou 및 WEA 항체 (Kabat et al., op. cit; 경우에 따라, 인간 사슬의 마지막 몇개의 아미노산이 알려져 있지 않으며, 다른 인간 항체와의 상동성에 의하여 추론하여야 한다)의 사슬과 비교될 것이다. 인간 항체는 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역 서열, 모두를 고려하여, 공여자 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역 서열과 전체적으로 가장 상동인 것이 선택될 것이다. 때로는 더 많은 중량이 중쇄 영역에 주어질 것이다. 선택된 인간 항체는 경쇄 및 중쇄 사슬 수용체 영역 모두를 제공하게 된다. 실제로, 종종 인간 Eu 항체가 이러한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.
"베스트-핏" 법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 선별되었다. 설치류의 것과 근사한 인간 서열이 인간화된 항체용 인간 프레임워크(FR)로 허용된다(Sims et al., J. Immunol., 151 : 2296 (1993); Chothia et al., J. MoI. Biol., 196: 901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 항체의 컨센서스 영역으로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 다른 인간화된 항체에 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151 : 2623 (1993)).
수용체 면역글로블린가 어떻게 선택된지 고려하지 않는다면, 고 친화도는 수용체가 아닌 공여자 내의 그러한 위치에서의 아미노산과 동일한 인간화된 면역글로블린 사슬의 프레임워크 내의 소수의 아미노산을 선택함으로써 달성될 수 있다. 종종, 인간 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 CDR 공여자 항체의 대응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 바람직하게는 향상시키게 될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 공지의 방법, 예컨대, 항원 결합 및 특정 위치에서 일반적인 프레임워크 잔기와 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링에 의하여 확인할 수 있다(예컨대, Queen et al., 미국 특허 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이들은 참고자료로서 본원에 일체성을 지니고 포함). 항체는 공지의 다양한 기법, 예를 들어, CDR-접합(EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 피복(veneering) 또는 박피(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91 :969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(미국 특허 5,565,332)에 의하여 인간화될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체(미국 특허 4,816,567) 이며, 여기서 실질적으로 모든 무손상 인간 가변 도메인은 비인간 종의 대응하는 영역에 의하여 치환되었다.
인간화된 항체는 일반적으로 마우스에 대하여 또는 키메라 항체의 경우 인간 치료에 사용시 최소한 3 가지의 잠재적인 이점이 있다:
(1) 효과기 부분이 인간이기 때문에, 인간 면역계의 다른 일부와 상호작용을 더 잘하게 된다(예컨대, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 의하여 표적 세포가 더 효율적으로 파괴됨).
(2) 인간 면역계는 외래 항체로서 인간화된 항체의 프레임워크 또는 불변 영역을 인식할 수 없으며, 따라서 이러한 주입 항체에 대한 항체 반응은 전체적인 외래 마우스 항체 또는 부분적인 외래 키메라 항체에 대한 것보다 덜하게 된다.
(3) 주입된 마우스 항체는 인간 순환의 반감기가 정상 항체의 반감기보다 짧다고 보고되었다(D. Shaw et al., J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)). 주입된 인간화된 항체는 자연 발생 인간 항체와 더 유사한 반감기를 지니는 것으로 추정되며, 이로써 보다 작고 덜 빈번한 투여용량을 투여할 수 있다.
일 특징으로서, 본 발명은 수용체 인간 프레임워크 영역을 암호화하는 DNA 구획에 부착된, 소망하는 항원, 예컨대 IL-31과 결합가능한 공여자 면역글로블린의 중쇄 및 경쇄 CDR을 암호화하는 재조합 DNA 구획을 발현함으로써 생산되는 인간화된 항체에 관한 것이다.
DNA 구획은 일반적으로 추가로 천연 또는 이종유래 프로모터 영역을 포함하는, 인간화된 면역글로블린 암호화 영역에 작동가능하게 연결되는 발현 조절 DNA 서열을 포함한다. 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포의 형질전환 또는 전달감염을 가능하게 하는 벡터 내에서 진핵 프로모터 시스템이 되나, 원핵세포 숙주용 조절 영역을 사용할 수도 있다. 벡터가 일단 적절한 숙주 내로 통합되는 경우, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현에 적합한 상태로 유지되며, 소망하는 바 대로, 인간화된 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 결합 절편 또는 다른 면역글로블린 형태의 수집 및 분리정제가 따르게 된다(S. Beychok, Cells of Immunogloblin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979), 이는 참고자료로서 본원에 포함되어 있다). 항-IL_31 분자는 예를 들어, 포유류 숙주 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난자 세포, 및 HEK 293F 세포 내에서 발현됨으로써 제조될 수 있다.
인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포, 바람직하게는 무한증식 B-세포에 의한 공지의 절차를 따라 분리될 수 있다(Kabat op. cit. 및 WP87/02671). 본 발명의 면역글로블린 생산용 CDR은 선정 항원, 예컨대 IL-31과 결합가능한 단클론 항체로부터 그와 유사하게 유도되며, 항체를 생산할 수 있는 마우스, 레트, 레빗, 또는 다른 척추동물을 포함하는 모든 편리한 포유류 공급원으로부터 공지의 방법에 의하여 생산된다. 불변 영역 및 프레임워크 DNA 서열의 적합한 공급원 세포, 및 면역글로블린 발현 및 분비용 숙주 세포는 다양한 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션("Catalogue of Cell Lines and Hybridoma," sixth edition (1988) Rockville, Md. U.S.A., 이는 참고자료로서 본원에 포함되어 있다) 등에서 확보할 수 있다.
본원의 인간화된 면역글로블린과 함께, 자연 서열과 다른 "실질적으로 상동"으로 변형된 면역글로블린은 당해 기술 분야의 숙련자에 공지된 다양한 재조합 DNA 기법을 사용하여 용이하게 설계되거나 제조될 수 있다. 다양한 다른 인간 프레임워크 영역은 본 발명의 인간화된 면역글로블린에 기초하여 단독으로 또는 조합이 될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 다양한 공지의 기법, 예컨대 부위-지향 돌연변이발생에 의하여 쉽게 달성될 수 있다(Gillman and Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) 및 S. Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987), 둘 모두는 일체성을 지니고 참고자료로서 포함).
본 발명의 인간화된 항체는 절편 및 무손상 항체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 절편은 항원 결합을 위하여 유도된 무손상 항체와 경쟁한다. 절편은 일반적으로 최소한 107 M-1, 보다 일반적으로 108 또는 109 M-1 의 친화도로 결합한다(즉, 무손상 항체와 동일한 범위 내). 인간화된 항체 절편은 분리된 중쇄, 경쇄 Fab, Fab' F(ab')2, 및 Fv를 포함한다. 절편은 재조합 DNA 기법, 또는 무손상 면역글로블린의 효소적 또는 화학적 분리에 의하여 생산된다.
인간화 항체에 관한 자세한 설명을 위하여, 다음의 문헌을 참조한다. [유럽 특허 EP 239,400, EP 592,106, 및 EP 519,596; 국제 공개 번호 WO 91/09967 및 WO 93/17105; 미국 특허 5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886, 및 6,407,213; 및 Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805 814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969 973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119 25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13: 353 60; Morea et al., 2000, Methods 20: 267 79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678 84; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9: 895 904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s 5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55: 1717 22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen et al., 1994, J. MoI. Biol. 235: 959 73; Jones et al., 1986, Nature 321 : 522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596].
항체 절편을 생산하는 다양한 기법이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 절편은 무손상 항체의 단백질분해를 통하여 유도되었다(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이러한 절편은 현재 재조합 숙주 세포에서 직접 생산된다. 예를 들어, 항체 절편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편은 E. coli로부터 직접 회수되거나 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 절편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 다른 접근 방법에 따르면, F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 절편을 생산하는 다른 기법은 기술 분야의 숙련자에게 자명하다. 추가적으로, 단일-사슬 Fvs 및 항체를 생산하는 기법의 예는 문헌 [미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988)]에 설명되어 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 (또는 이들의 부분, 바람직하게는 폴리펩타이드의 최소한 10, 20 또는 50 아미노산)에 재조합 융합 또는 화학적으로 접합(공유 및 비공유 결합을 모두 포함)하여 융합 단백질을 생성하는 항체를 포괄한다. 따라서, 본 발명은 세포독성제 예컨대 화학치료제, 독소(예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원, 또는 이들의 절편의 효소적 활성 독소), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)에 접합된 본원의 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 (또는 이들의 부분, 바람직하게는 폴리펩타이드의 최소한 10, 20 또는 50 아미노산)에 재조합 융합 또는 화학적으로 접합(공유 및 비공유 결합을 모두 포함)하여 융합 단백질을 생성하는 항체를 포괄한다. 융합은 반드시 직접적일 필요가 없으며, 링커 서열을 통하여 발생할 수 있다. 항체는 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이들의 부분, 바람직하게는 폴리펩타이드의 최소한 10, 20 또는 50 아미노산)이 아닌 항원에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩타이드를 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 융합 또는 접합시키므로써 시험관 내 또는 생체 내에서 특정 세포 유형에 대하여 본 발명의 폴리펩타이드를 표적화하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합 또는 접합된 항체는 공지의 방법을 사용하는 시험관 내 면역분석 및 분리정제법에 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Harbor et al., 전게서, 및 PCT 공개 WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); 미국 특허 5,474,981; Gillies et al., PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991)]를 참조하며, 이는 참고자료로서 본원에 일체성을 지니고 포함되어 있다.
본 발명은 추가적으로 이종유래 폴리펩타이드 서열(예컨대, 가변 영역이 아닌 항체 도메인)에 융합 또는 접합된 본 발명의 폴리펩타이드(예컨대, 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 것)를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체 Fc 영역, 또는 이들의 부분에 융합 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드(절편 또는 이들의 변이를 포함)는 면역글로블린(IgA, IgE, IgG, IgM)의 불변 도메인, 또는 이들의 부분(CH1, CH2, CH3, 또는 이들의 어떠한 조합 및 이들의 부분)과 융합되어, 키메라 폴리펩타이드가 될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 항체 부분은 불변 영역, 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인의 일정 조합 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 상기 항체 부분과 융합 또는 접합되어 다량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분 사이에서 이황화 결합을 통하여 이량체를 형성할 수 있다. 고도의 다량체 형태는 IgA 및 IgM의 부분에 폴리펩타이드를 융합시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 항체 부분을 융합 또는 접합시키는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT 공개 WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); 및 ViI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11337-11341(1992)를 참조한다(상기 참고자료는 일체성을 지니고 본원에 포함된다). 또 다른 비제한적 실시예에 의하면, 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 항체(절편 또는 이들의 변이체를 포함)는 알부민과 융합될 수 있다(재조합 인간 혈청 알부민 또는 절편 또는 이들의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않음(예컨대, 미국 특허 5,876,969(Mar. 2, 1999), EP Patent 0 413 622, 및 미국 특허 5,766,883(Jun. 16, 1998), 이는 참고자료로서 본원에 일체성을 지니고 포함되어 있다)). 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 항체(절편 또는 이들의 변이체를 포함)는 이종유래 단백질(예컨대, 면역글로블린 Fc 폴리펩타이드 또는 인간 혈청 알부민 폴리펩타이드)의 N- 또는 C-말단부에 융합될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 포함된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 항체 부분에 융합 또는 접합되어 폴리펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시키거나 또는 공지된 방법을 사용하는 면역분석에 사용된다. 추가적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 항체 부분에 융합 또는 접합되어 분리정제를 촉진한다. 보고된 일 예에서는 인간 CD4-폴리펩타이드의 최초 2 도메인 및 포유류 면역글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 도메인으로 구성된 키메라 단백질을 설명한다(예컨대, EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331 :84-86 (1988)). 상피 경계를 통한 면역계로의 강화된 항원 전달은 FcRn 결합 파트너, 예컨대 IgG 또는 Fc 절편에 접합된 항원(예컨대, 인슐린)에서 입증되었다(예컨대, PCT 공개 WO 96/22024 및 WO 99/04813). 이황화-결합 이량체 구조(IgG에 기인)를 지닌 항체에 융합 또는 접합된 본 발명의 폴리펩타이드는, 단량체 분비 단백질 또는 단백질 절편 단독으로 보다, 다른 분자와의 결합 및 중화에 더 효율적이 될 수 있다(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). 많은 경우에 있어서, 융합 단백질에 있어서 Fc 부분은 치료 및 진단에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 향상된 약물동태학적 특성을 나타낼 수 있다(EP A 232,262). 대안적으로, 융합 단백질이 발현, 검출, 및 정제된 후 Fc 부분을 결실시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 융합 단백질이 면역화용 항원으로 사용되는 경우 Fc 부분은 치료 및 진단에 방해가 될 수 있다. 약물 전달에 있어서, 예를 들어, 인간 단백질, 예컨대 hIL-5는, hIL-5의 길항제를 동정하기 위한 고성능 선별 분석을 위하여 Fc 부분과 융합되었다. (D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)). 이러한 기법은, 이에 한정되는 것은 아니나, 이기능성 접합제의 사용을 포함한다(예컨대, 미국 특허 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; 및 5,808,003; 각각의 내용은 침고자료로서 일체성을 지니고 본원에 포함).
더욱이, 본 발명의 폴리펩타이드(예컨대, 항체 또는 이들의 절편)는 마커 영역, 예컨대 펩타이드와 융합되어 이들의 분리정제를 촉진할 수 있다. 추가적인 실시상태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(한정되는 것은 아니나 면역원성 및/또는 항원성 에피토프를 암호화하는 핵산을 포함)은 에피토프 태그 (예컨대, 적혈구응집소 태그("HA") 또는 플래그 태그)로서 대상 유전자와 재조합되어 발현된 폴리펩타이드의 검출 및 분리정제를 보조할 수 있다. 바람직한 실시 상태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드이며, 예컨대 이 태그는 다른 것 보다는 pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)에서 제공되며, 이들 대부분은 구득가능하다. 문헌 [Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에서 설명한 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 용이한 융합 단백질의 분리정제를 제공한다. 분리정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는, 이에 한정되는 것은 아니나, "HA" 태그이며, 이는 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프 (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "플래그" 태그에 상응한다.
본 발명은 추가적으로 진단제 또는 치료제에 접합된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포괄한다. IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 진단적으로 사용될 수 있으며, 예컨대, 주어진 치료, 진단, 검출, 및/또는 예방 요법의 효능을 결정하기 위한 임상적 시험 절차의 일부로서 종양의 발달 또는 진행을 모니터링할 수 있다. 검출은 항체와 검출가능한 물질을 커플링함으로서 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 배합군, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사능활성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영에 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사능활성 상자성 금속 이온을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 4,741,900은 금속 이온에 관한 것이며, 이들은 본 발명의 진단제로 사용되어 항체에 접합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 홍당무 퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함한다; 적합한 배합군 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함한다; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리스린을 포함한다; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함한다; 생체발광 물질의 예는 루시페라아제, 루시페린, 및 아쿠오린을 포함하고; 및 적합한 방사능활성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.
추가적으로, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 치료적 모이어티 예컨대 사이토톡신, 예컨대, 세포독성제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사능활성 금속 이온에 접합될 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성제는 세포에 유해한 약제를 포함한다. 그 예는 파크리탁솔, 사이토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크라스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제는, 이에 한정되는 것은 아니나, 항대사체 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로테아민, 티오에파 클로람부칠, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로도스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플레티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예컨대, 다우노루비신(다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신(악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제 (예컨대, 빈크레스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
본 발명의 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변화시키기 위하여 사용될 수 있으며, 치료제 또는 치료약 모이어티는 전통적 화학 치료제에 한정 되는 것으로 해석해서는 아니된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 소망하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드가 될 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 독소 예컨대 애브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도성 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예컨대, 혈관생성억제인자 또는 엔도스타틴(endostatin); 또는, 생물학적 반응 변형제 예컨대, 예를 들어, 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 그 밖의 성장 인자를 포함할 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이는 특히 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 유용하다. 이러한 고체 지지체는, 이에 한정되는 것은 아니나, 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리바이닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
이러한 치료적 모이어티에 항체를 접합하는 기법은 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Application, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Terapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]를 참조한다.
대안적으로, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 제2 항체와 접합하여 항체 이종접합체를 형성할 수 있다(Segal, 미국 특허 4,676,980, 이는 참고자료로서 본원에 일체성을 지니고 포함).
접합된 치료적 모이어티를 지니거나 지니지 않는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 단독으로 투여되거나 또는 세포독성 인자(들)과 조합하여 투여될 수 있으며, 및/또는 사이토카인(들)은 치료제로 사용될 수 있다.
당해 기술 분야에 공지된 다양한 분석을 사용하여 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제와 IL-31 단백질 또는 폴리펩타이드의 결합을 검출할 수 있다. 예시적인 분석법은 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]에 상세하게 설명되어 있다. 분석법의 대표적인 예는: 병행 면역전기영동, 방사성면역분석법, 방사성면역-침전, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 및 샌드위치 분석를 포함한다. 이와 함께, 항체는 야생형 대 돌연변이 IL-31 단백질 또는 폴리펩타이드의 결합으로 선별될 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31에 대한 IL-31 길항제는 IL-31를 발현하는 세포에 태그를 부착; 친화도 정제에 의한 IL-31의 분리; IL-31 폴리펩타이드의 순환 수준을 결정하기 위한 진단적 분석; 잠재적인 병리학 또는 질환의 마커로서 가용성 IL-31의 검출 또는 정량화; FACS를 사용하는 분석법; 발현 라이브러리의 선별; 항-이디오타입 항체의 생성; 및 항체 중화 또는 시험관 내 및 생체 내에서 IL-31 활성을 차단하기 위한 길항제로서 사용될 수 있다. 적합한 직접 태그 또는 라벨은 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기 입자 등을 포함한다; 간접 태그 또는 라벨은 바이오틴-아비딘 또는 중간체로서 다른 보체/항-보체짝을 사용할 수 있다. 본원의 항체는 약제, 독소, 방사선핵종 등, 및 생체 내 진단적 또는 치료적 응용에 사용되는 이러한 접합체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 더욱이, IL-31에 대한 항체 또는 이들의 절편은 분석법, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 기타 공지의 분석법에서 시험관 내에서 변성된 IL-31 또는 이들의 절편을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
Fc 도메인의 선택은 (i) 항체의 효과기 기능(FcγR 결합(ADCC)/Clq 결합(CDC)) 및 잠재적으로 관련된 부작용, (ii) 반감기를 포함하는, 이들의 약물동태학적 특성(FcRn 결합), 및 (iii) 가능하다면 면역 복합체 제거에 영향을 미칠 수 있다. Fc 도메인의 효과기 기능(들)은 포식작용, 염증 매개체의 방출, 항체 생산의 조절, 및 가장 중요한 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함한다. 이러한 효과기 기능이 Fc 도메인과 유관 단백질 매개체, Fcγ 수용체 및 Clq의 상호작용에 의존하여 유도되는 정도는 IgG 서브클래스 불변 영역(Fc) 및 이들의 이러한 단백질과의 상호작용에 따라 달라진다.
IgG1의 Fc 도메인은 면역계 효과기 세포 상에서 FcγRI, FcγRIIa, 및 FcγRIII와 상호작용한다. 다른 Fcγ 수용체의 정확한 역할은 설명이 필요하겠지만, FcγRIIIA는 1차적으로 NK 세포상에서 발현되나 단핵구 및 대식세포에서도 발현되는 가장 중요한 ADCC 매개 수용체로 간주된다. IgG1은 Clq와 결합하며, NK 세포 발현 FcγRIII에 의하여 주로 매개되는 CDC를 촉발할 수도 있다. 문헌 [Gessner, J.E., et al., The IgG Fc Receptor Family, Ann. Hematol. 1998 Jun:76(6): 231-248]을 참조한다. IgG4 Fc 도메인은 감소된 ADCC 및 CDC에 대응하는 다른 Fcγ 수용체 및 Clq에 대한 결합 친화도가 크게 감소하였다. 예를 들어, 문헌 [Sharma et al.]에서는 IgG1 mAb 및 이의 IgG4 유도체의 직접 비교를 조사하였으며, 각각은 CD4를 표적화한 일치하는 가변 영역을 지닌다. 두 mAbs는 동일한 복용량 수준에서 CD4 발현이 감소되었으며, 동등한 약물동태학적 특성을 보유하나, IgG1 형태가 보다 강력한 ADCC 효과를 나타내었다. 문헌 [Sharma A., et al., Comparative pharmacodynamics of keliximab and clenoliximab in Transgenic Mouse bearing Human CD4. J Pharmacol Exp Ther. 2000 Apr;293(l):33-41]를 참조한다.
다른 IgG 아이소타입 mAbs와 비교하는 경우 파괴되지 않는다면, 효과기 음성 IgG4 mAb의 결합 친화도는 크게 감소한다. 그러나, Brambell 수용체(FcRn)와의 상호작용 능력은 IgG4 내에 보유되고 따라서 증가된 반감기를 통하여 IgG4 아이소타입 mAb의 약물동태학에 영향을 미친다. IgG1은 일반적으로 ADCC 및 CDC 모두에 대한 고활성을 나타내나, IgG4는 ADCC 또는 CDC 활성이 낮거나 없는 것으로 간주된다.
IgG4 아이소타입 mAbs의 몇몇 예는 시판 중이거나, 임상적 또는 다양한 단계의 연구 개발 중이다. 이러한 치료적 mAbs는 종양학, 자가면역 & 염증 및 항-바이러스 치료에 있어서 다양한 지표로서 개발되었다.
문헌 [Aalberse et al. (Aalberse RC, Schuurman, J. IgG4 breaking the rules, Immunology 2002, 105: 9-19)]에서 보고된 바와 같이, 인간 (IgG4)는 2 분자 형태로 존재하며, 이는 분비된 인간 IgG4의 부분 내의 힌지 영역 내의 내부-중쇄 이황화 다리의 이질성에 기인한다. 이 이질성은 HL "반 항체(half antibody)"가 검출되는 변성, 비-환원 조건 하에서만 발현되며, 이 현상은 다른 인간 IgG 아이소타입에서는 관찰되지 않는다. [Taylor]는 시료 조작시 인공적 현상 예컨대 환원제에 노출시 급속한 이황화 스크램블링 및 산화환원반응은 존재하는 반-항체의 양에 기인한다고 보고하였다(Taylor FR, et al., Suppression of Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid Gel Electrophoresis Sample Preparation Artifacts for Analysis of IgG4 Half-Antibody. Analytical Biochemistry 2006, 353: 204-208). 자연 상태에서, 비공유 상호작용은 항체가 H2L2 사합체로서 함께 고정되도록 한다. IgG4가 순환시 다른 IgG4 분자와 이종-이량체를 형성하는 것으로 보고되었다. 인간 IgG 중쇄의 항체의 F[ab] 및 Fc 부분에 연결된 힌지 영역의 분석을 통하여 잔기 241에서의 세린의 존재가 이러한 이질성의 원인이 될 수 있다는 것을 알아내었으며: IgG4 힌지 영역은 IgG1에서와 같은 Cys-Pro-Pro-Cys 영역이 아닌 Cys-Pro-Ser-Cys 영역을 함유한다. 마우스/인간 키메라 중쇄 내에서 241에서 세린이 프롤린(IgG1 및 IgG2에서 그 위치에 존재)으로 변화하면 동종 항체의 생산을 유도하며 이질성을 제거하게 된다. 추가적으로, 변이 IgG4는 혈청 반감기를 현저하게 연장시키고, 원 키메라 IgG4에 비하여 조직 분포를 향상시키는 것으로 나타났다.
적합한 검출가능한 분자는 폴리펩타이드 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기 입자 등을 포함한다. 적합한 세포독성 분자는 폴리펩타이드 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 박테리아 또는 식물 독소(예를 들어, 디프테리아, 독소, 사포린, 슈도모나스 외독소, 리신, 애브린 등), 및 치료적 방사선핵종, 예컨대 요오드-131, 레늄-188 또는 이트륨-90 (각각은 폴리펩타이드 또는 항체에 직접 부착되거나, 또는 킬레이팅 모이어티의 수단을 통하여 간접적으로 부착된다, 예를 들어)을 포함한다. 폴리펩타이드 또는 항체는 세포독성 약물, 예컨대 애드리마이신에 접합될 수도 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접 부착을 위하여, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 상보적/반상보적 짝의 구성원과 접합될 수 있으며, 여기서 다른 구성원은 폴리펩타이드 또는 항체 부분에 결합할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 바이오틴/스트렙타비딘이 예시적인 상보적/반상보적 짝이다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 시험관 내 및 생체 내 IL-31 결합 및 신호 전달을 차단하는 IL-31 "길항제"로서 작용할 수 있다. 이러한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 IL-31 활성 또는 단백질-결합을 억제하는데 유용하다.
폴리펩타이드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적 세포 또는 조직 억제 또는 제거(예를 들어, 암 세포 또는 조직의 치료용)에 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드가 다기능성 도메인 (즉, 활성화 도메인 또는 수용체 결합 도메인, 표적화 도메인)을 보유하는 경우, 표적화 도메인만을 포함하는 융합 단백질은 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 대상 세포 또는 조직 유형에 상보적 분자를 검출하기에 적합하다. 예를 들어 도메인 만의 융합 단백질을 상보적 분자를 포함하는 경우, 항-상보적 분자가 검출가능한 또는 세포독성 분자에 접합할 수 있다. 이러한 도메인-상보적 분자 융합 단백질은 따라서 일반적인 항-상보적-검출가능한/세포독성 분자 접합체의 세포/조직-특이적 전달을 위한 일반적인 표적화 담체 또는 비히클을 제공한다.
추가적으로 본 발명의 대상은 전술하거나 또는 하기한 모든 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자, 또는 상보적 가닥 또는 이들의 퇴화 영역이다. 이러한 관점에서, 용어 "핵산 분자"는 모든 다른 유형의 핵산을 포괄하고, 제한 없이 데옥시리보핵산 (예컨대, DNA, cDNA, gDNA, 합성 DNA, 등.), 리보핵산 (예컨대, RNA, mRNA, 등.) 및 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다. 양호한 실시 상태에서, 핵산 분자는 DNA 분자, 예컨대 이중-가닥 DNA 분자 또는 cDNA 분자이다. 용어 "분리된"은 최소한 하나의 오염 핵산 분자에서 동정 및 분리된 핵산 분자를 의미하고, 이들은 일반적으로 천연 공급원과 결합되어 있다. 분리된 핵산 분자는 자연상의 형태 또는 세팅이 아니다. 분리된 핵산 분자는 따라서 천연 세포 내에서 존재하는 특이적 핵산 분자와 구별된다. 퇴화 영역은 참조 뉴클레오타이드 서열로서 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열로 지정되나, 유전자 코드 퇴화의 결과로서 구별되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적 대상은 전술하는 또는 하기의 모든 항체를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터이다. 벡터는 모든 원핵 또는 진핵 세포 내의 통합 또는 자가 복제, 기능성인 클로닝 또는 발현 벡터가 될 수 있다. 특히, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 에피솜, 인공 염색체, 등이 될 수 있다. 벡터는 조절 요소, 예컨대 프로모터, 터미네이터, 인헨서, 선택 마커, 복제 원점, 등을 포함할 수 있다. 이러한 벡터의 예는 원핵 플라스미드, 예컨대 pBR, pUC 또는 pcDNA 플라스미드; 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 벡터; 박테리오파지; 바큘로바이러스; BAC 또는 YAC, 등과 하기할 것들을 포함한다. 적절한 핵산 영역은 다양한 절차에 의하여 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 공지의 기법을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 하나 이상의 이러한 성분을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 공지의 표준 결찰 기법을 사용한다.
본 발명의 추가적으로 특징은 재조합 숙주 세포이며, 여기서 상기 세포는 전술한 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포가 될 수 있다. 원핵 세포의 예는 박테리아, 예컨대 E.coli가 포함된다. 진핵 세포의 예는 모든 1차 세포 배양물 또는 확립된 세포주 (예컨대, 3T3, Vero, HEK293, TN5, 등.)을 포함하는 효모 세포, 식물 세포, 포유류 세포 및 곤충 세포이다. 글리코실화 단백질 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체에서 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9, 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난자(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더 특이적인 예는 SV40에 의하여 형질전환된 원숭이 신장 CVl 주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양시 성장을 위한 서브클론 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 차이니즈 햄스터 난자 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 서토리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 특히 본 발명의 양호한 포유류 세포는 CHO 세포이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 공지의 기법, 예컨대 재조합 기술, 화학적 합성, 클로닝, 결찰, 또는 이들의 조합으로 생산될 수 있다. 특정 실시 상태에서, 항체는 재조합 기법, 예컨대, 적합한 숙주 세포 내에서 대응하는 핵산을 발현시켜 생산된다. 따라서 본 발명의 다른 방법은 본 발명의 항체를 생산하는 방법으로서, 이 방법은 핵산 분자를 발현시키는 조건 하에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 생산된 폴리펩타이드는 글리코실화되거나 또는 되지 않을 수 있으며, 또는 사용된 숙주 세포 유형에 따라 다른 전사-후 변형을 함유할 수 있다. 다수의 문헌 및 논문에서 벡터 및 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용하여 클론 및 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다, 예컨대 문헌 "A Practical Approach"(Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001))이다.
본 발명에 의한 항체 생산 방법에 사용되는 벡터는 에피솜 또는 비-/상동성 통합 벡터가 될 수 있으며, 적합한 수단(형질전환, 전달감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 칼슘 포스페이트-침전, 직접 마이크로주입, 등)에 의하여 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 특정 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 선택하는데 중요한 인자는: 벡터를 함유한 수용자 세포가 벡터를 함유하지 않은 이러한 수용자 세포로부터 인식되고 선택된 용이함; 특정 숙주 내에서 바람직한 벡터의 카피 수; 및 다른 종의 숙주 세포 사이에서 벡터가 "왕복"할 수 있는 것이 바람직한지 여부 등을 포함한다. 벡터는 적절한 전사 개시/종결 조절 서열의 조절하에 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 발현을 허용하며, 이는 상기 세포 내에서 구조적으로 활성이거나 또는 유도가능한 것으로 선택된다. 이러한 세포 내에서 실질적으로 강화된 세포주는 분리되어 안정적인 세포주를 제공할 수 있게 된다.
숙주 세포는 본원에서 설명한 단백질 생산용 발현 또는 클로닝 벡터로 전달감염 또는 형질전환되며, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선택하거나, 또는 소망하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하도록 적절하게 변형된 종래의 영양 배지 내에서 배양된다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험 없이도 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하는 원리, 절차, 및 사용 기법은 문헌[Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 전게서]에서 확인할 수 있다.
본 발명에 양호한 세포는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유류 세포, 예컨대 인간, 원숭이, 마우스, 및 차이니즈 햄스터 난자(CHO) 세포 등이며, 이들은 단백질 분자에 전사-후 변형을 제공하기 때문이고, 여기에는 정정 폴딩 또는 정정 부위의 글리코실화를 포함한다. 적합한 포유류 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포 (293-HEK; ATCC CRL 1573), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개과 신장 세포 (MDCK; ATCC CCL 34), 차이니즈 햄스터 난자 세포 (CHO-Kl; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), 레트 뇌하수체 세포 (GHl; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 레트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환 원숭이 신장 세포 (COS-I; ATCC CRL 1650), 보우씨 흑색세포종 및 인간 간세포 암종 (예를 들어 Hep G2), 뮤린 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) 및 다수의 기타 세포주를 포함한다. 대안적인 진핵 숙주 세포는 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포(예컨대, Saccharomyces, Kluyveromyces, 등.) 이다. 또는 효모 세포는 글리코실화를 포함하는 전사-후 펩타이드 변형을 수행할 수 있다. 다수의 재조합 DNA 전략은 효모 내에서 소망하는 단백질을 생산할 수 있는 강력한 프로모터 서열 및 고 카피수의 플라스미드를 사용한다. 효모 세포는 클론된 포유류 유전자 산물 내의 리더 서열을 인식하고, 폴리펩타이드 함유 리더 서열(즉, 선-펩타이드)을 분비한다.
장기간, 재조합 폴리펩타이드의 고수율 생산을 위하여, 안정적인 발현이 양호하다. 예를 들어, 대상 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 기원의 복제 및/또는 내부 발현 요소 및 동일 또는 분리된 벡터 상의 선택가능 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입에 따라서, 세포는 선택배지로 교환되기 전에 강화된 배지 내에서 1-2 일간 성장할 수 있다. 선택가능 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 이들의 존재에 의하여 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수가 가능하게 된다. 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 유형에 적절한 조직 배양 기법을 사용하여 증식될 수 있다. 이러한 세포 내에서 실질적으로 강화된 세포주는 분리되어 안정적인 세포주를 제공하게 된다.
특히 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 고수율 생산의 양호한 방법은 DHFR-결핍 CHO 세포 내의 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 증폭을 사용하며, 연속적인 증가 수준의 메토트렉세이트의 사용(US 4,889,803)이다. 확보한 폴리펩타이드는 글리코실화 형태가 될 수 있다.
본원의 항체는 기타 진핵 세포, 예컨대 조류, 진균, 곤충, 효모, 또는 식물 세포 내에서 발현될 수 있다. 바큘로바이러스 시스템은 클론된 유전자를 곤충 세포에 도입하는 효율적인 수단을 제공한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질은 키트의 형태로, 그 중에서도, Invitrogen사로부터 구득할 수 있다.
재조합 DNA 기술과 함께, 본 발명의 항체는 화학적 합성 기술로 제조될 수 있다. 화학적 합성 기술의 예는 고체상 합성 및 액체상 합성이다. 고체상 합성에 있어서, 예를 들어, 합성되는 폴리펩타이드의 카르복시-말단에 대응하는 아미노산은 반응의 교차 반복에 의하여 (예컨대, 아미노산과 이들의 아미노기 및 적절한 보호기로 보호된 측쇄 기능성기의 순차 축합에 의한) 유기용매에 불용성인 지지체에 부착되며, 폴리펩타이드 사슬이 확장된다. 고체상 합성법은 사용되는 보호기에 따라 크게 tBoc 법 및 Fmoc 법으로 분류된다. 전체 합성 단백질은 문헌에 개시되어 있다(Brown A et al., 1996).
본 발명의 항체는 생산, 제형화, 투여되거나, 또는 소망하는 사용 및/또는 생산 방법에 따라서 양호한 다른 대안 형태에 일반적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 전사-후 변형이 될 수 있으며, 예를 들어 글리코실화이다. 본원의 폴리펩타이드 또는 단백질은 분리 (또는 정제)된 생물학적 활성 형태, 또는 이들의 전구체, 유도체 및/또는 염으로 제공될 수 있다.
또 다른 실시 상태에서, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제 융합 단백질은 IL-31 수용체가 발현되는 표적 조직의 생체 내 살상에 사용될 수 있다(일반적으로, Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997). 전술한 융합 단백질은 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 소망하는 활성 부위에 표적화할 수 있도록 하며, 따라서 바람직스럽지 않은 세포 또는 조직 (즉, 종양 또는 백혈병)을 표적화하는 증가된 국부 농도의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 제공하고, 융합된 사이토카인은 효과기 세포에 의한 향상된 표적 세포 용해를 매개한다. 이러한 목적에 적합한 사이토카인은 예를 들어, 인터류킨 2 및 그래뉼로사이트-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.
본 발명의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 NC/Nga 모델, Ova 피부내 모델, 만성 고민감도 모델, 및 만성 헵탄 모델을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지의 다양한 생체 내 모델에 의하여 결정된 바와 같이, IL-31 리간드를 억제, 차단 또는 중화하는 이들의 능력을 측정할 수 있다.
피부-귀소 T 세포 및 표피 각질세포 모두는 인간 피부 질환의 생리학에 영향을 미친다. IL-31 mRNA 및 단백질 발현은 인체 내에서 피부-귀소 CLA+ T 세포 집단에 제한된다. 미국 특허 출원 11/353,427(February 14, 2006, 참고자료로서 본원에 포함)를 참고한다. 이와 같이, 항체 또는 수용체 길항제을 포함하는 IL-31에 대한 길항제는 CLA+ T 세포를 발현하는 피부 및 표피 질환을 치료하기에 유용하다. 이러한 질환은, 예를 들어, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 포함한다. 케모카인 마커 예컨대 TARC 및 MDC는 IL-31에 대한 단클론 항체를 중화의 효과를 측정하기에 유용하다. 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 치료의 억제 효과는 TARC 및 MDC의 수준을 모니터링하면서 측정할 수 있다.
접촉성 피부염
알러지성 접촉성 피부염은 피부 접촉에서 유래한 항원에 대한 T 세포 매개 면역 반응으로서 정의된다. CLA+ T 세포 집단은 피부염의 개시에 관여하는 것으로 간주되며, 알러지원 의존성 T 세포 반응은 세포의 CLA+ 집단에 크게 한정된다(Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med:181, 1935, (1995)). 최근의 데이터에 의하면 CD8+ T 세포가 아닌 메모리(CD45RO+) CD4+ CLA+ 만이, 일반적인 접촉성 고민감도 알러지원인 니켈에 대한 반응에서 타입-1 (IFN-) 및 타입-2 (IL-5) 사이토카인 모두를 증식 및 생산하는 것으로 나타났다. 추가적으로, CD4, CD45RO (메모리) 또는 CD69와 조합한 세포 발현 CLA는 니켈-특이적 자극 후 증가하며, 케모카인 수용체 CXCR3, CCR4, CCR10을 발현하나 CCR6는 발현하지 않는다. 문헌 [Moed H., et al., Br J Dermatol:51, 32, (2004)]를 참조한다.
동물 모델에서, 알러지성 접촉성 피부염이 T-세포 의존성이며, 알러지-반응성 T 세포가 알러지원 도포 부위로 이동한다는 것이 입증되었다. 일반적으로: Engeman T.M., et al., J Immunol: 164, 5207, (2000); Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993); 및 Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001)를 참조한다. CLA+ T 세포가 IL-31를 생산하고, 피부 각질세포의 IL-31 자극은 전염증성 케모카인, 예컨대 TARC 및 MDC을 유도할 수 있기 때문에, IL-31은 접촉성 피부염의 병태생리학에 관여할 수 있다. 접촉 고민감성 마우스 모델 내에서 IL-31 항체 중화를 사용하였다. 실시예 5를 참조한다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환에 관련된 가려움을 억제, 감소, 중화, 예방 또는 차단함으로써 접촉 고민감성의 임상적 결과를 향상시키기 위하여 사용될 수 있다.
아토피성 피부염
아토피성 피부염(AD)은 지난 10년간 발병율이 급격히 증가한 만성적으로 재발하는 염증 피부 질환이다. 임상적인 AD는 고도로 소양성이며, 종종 찰상성 플라크 및 만성 재발 경로를 보이는 플라크로 특정된다. AD의 진단은 대부분 주요 및 부차적인 임상적 관찰에 기초한다. 문헌 [Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999)]를 참조한다. 조직병리학에 의하면 해면화, 급성 병변의 과다 및 집중 이상각화증을 나타내며, 여기서 과다 및 이상각화증, 가시세포증/과과립구증을 나타내는 표지된 표피 과다증식 및 림프구 및 풍부한 마스트 세포에 의한 진피의 혈관주위 침윤은 만성 병변의 특징이다.
T 세포는 조직 내의 국부 면역 반응의 개시에 있어서 중추적 역할을 하며, 증거에 의하면 제어불능의 피부의 면역 반응을 개시 및 유지시키는데 중요한 역할을 할 수 있다고 한다. 피부 염증 부위 내의 대략 90%의 침윤 T 세포는 내피상의 유도성 점착 분자인, E-셀렉틴에 결합하는 피부 림프구-유관 Ag(CLA+)를 발현한다(Santamaria-Babi L.F., et al., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004)). 대조 개체에 비하여 AD 환자의 CLA+ T 세포의 순환의 현저한 증가가 보고되었으며(Teraki Y., et al., Br J Dermatol: 143, 373 (2000), 다른 문헌에서는 AD 환자의 메모리 CLA+ T 세포가 CLA-집단에 비하여 알러지원 추출물에 우선적으로 반응한다는 것을 입증하였다(Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med:181, 1935, (1995)). 인간에 있어서, 피부의 아토피 질환의 발병기전은 증가된 수준의 Th-2-타입 사이토카인(IL-5 및 IL-13 9, 10)를 발현하는 CLA+ T 세포의 증가와 관련되어 있다. [Akdis M., et al., Eur J Immunol: 30, 3533 (2000); 및 Hamid Q., et al. J Allergy Clin Immunol: 98, 225 (1996)].
약 6 내지 8주령에서 비특이적 무 병원체(비-SPF) 상태로 사육된 경우, NC/Nga 마우스는 임상적 경로 및 징후, 조직병리학 및 면역병리학을 포함하는 많은 면에서 인간 AD와 유사한 AD-유사 병변을 자발적으로 발달시킨다. 이에 비하여, NC/Nga 마우스는 SPF 조건 하에서는 피부 병변을 발달시키지 않았다. 그러나, 자발적 피부 병변의 발병 및 긁는 행위는 매주 미정제 먼지 진드기 항원의 피하 주입한 SPF 설비에서 사육된 NC/Nga 마우스에서 동시에 관찰될 수 있다. 문헌 [Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003)]를 참조한다. 따라서, NC/Nga에 있어서 AD의 발달은 AD 치료를 위한 신규의 치료제의 평가에 유용한 모델이다.
자발적 AD의 NC/Nga 모델과 함께, OVA를 사용하는 마우스의 피내 민감화는 민감화 마우스의 피부 내에서 단핵성 침윤물에 의한 피부 비후를 유도하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 이는 전체 및 특이적 IgE의 증가된 혈청 수준과 대체로 일치한다. 그러나 이 모델에서는 일반적으로 피부 장벽 이상 또는 가려움이 발생하지 않는다. 문헌 [Spergel J.M., et al., J Clin Invest, 101: 1614, (1998)]을 참조한다. 이 프로토콜은 DO 11.10 OVA TCR 유전자삽입 마우스를 OVA로 민감화함으로써 피부 장벽 이상 및 가려움증을 유도시키도록 변형될 수 있다. 민감화 항원을 인식할 수 있는 항원-특이적 T 세포의 수를 증가시키므로써 피부 내의 염증의 수준을 증가시키게 되어 가시적인 긁는 행위 및 피부의 태선화/스케일링을 유도하게 된다.
NC/Nga 자발적 AD 모델 및 OVA 피내 DOl 1.10 모델 모두는 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제가 IL-31의 효과를 억제, 감소 또는 중화하는 능력을 평가하기위하여 사용할 수 있다. IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 투여에 의하여 아토피성 피부염, 결절성 양진, 및 습진 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 소양성 질환의 치료에 효과적일 수 있는, 가려움이 감소 될 수 있으며, 이는 가려움의 중단은 발달이 가려움에 의존적인 피부염의 진행의 중단이 될 수 있기 때문이다.
본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 억제 효과를 측정하는 부가적인 모델은 문헌 [Umeuchi, H. et al., European Journal of Pharmacology, 518: 133-139, 2005; 및 Yoo, J. et al., J. Experimental Medicine, 202:541-549, 2005]에 설명되어 있다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 아토피성 피부염, 결절성 양진, 및 습진을 포함하는 피부염 및 소양성 질환의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
약물 유도성 지연형 피부 알러지 반응
약물 유도성 지연형 피부 알러지 반응은 매우 이종유래성이며, 많은 별개의 병태생리학적 증상을 반영할 수 있다. 문헌 [Brockow K., et al., Allergy: 57, 45 (2002)]를 참조한다. 이러한 반응에 관여하는 면역학적 기작은 매개된 항체 또는 세포로서 나타난다. 즉발 약물 알러지에 있어서, IgE-매개 항체 반응은 양성 피부 자통 및/또는 20분 후 피내 시험으로 입증할 수 있으며, 여기서 약물에 대한 비-즉발 반응은 최후 약물 흡입 후 1 시간 이후에 발생할 수 있으며, 대체로 T-세포로 매개된다. 비-즉발 T-세포 매개 지연형 반응은 환자 내에서 예를 들어, 페니실린에 대한 유해한 약물 반응을 발생시킬 수 있다. 페니실린에 대한 증식성 T 세포 반응은 페니실린 알러지성 환자로부터 T 세포의 메모리(CD45RO+) CLA+ 아집단에 제한되는 것으로 나타났으며, 반면에 CD45RO+ CLA- 세브세트는 증식성 반응을 나타내지 않았다. 문헌[ Blanca M., Leyva L., et al., Blood Cells Mol Dis:31, 75 (2003)]를 참조. 지연형 고민감도(DTH) 반응은 마우스 내에서 인공적으로 재생될 수 있으며, 이로써 DTH 반응의 개시 및 영속화에 관련된 인자를 평가하게된다. IL-31를 중화하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 지연형 고민감도 반응에 효과적일 수 있다.
독성 표피 괴사용해(TEN)는 광범위한 수포를 지닌 표피의 넓게퍼진 세포자멸로 특정되는 매우 드물지만 극심한 약물 반응이다. 연구에서는 수포로 침윤하는 림프구는 CLA+ T 세포이며, 표피 각질세포에 대해 세포독성을 나타낼 수 있다는 것을 보여주었다. 문헌 [Leyva L., et al.,. J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000); 및 Nassif A., Bensussan A., et al., J Allergy Clin Immunoh WA, 1209 (2004)]를 참조한다. 유전자삽입 마우스 시스템은, OVA가 마우스의 표피 및 모낭 각질세포 내에서 케라틴-5 (K5) 프로모터의 조절하에 발현되고, TEN 용 동물 모델을 확립하기 위하여 생성되었다. OVA 특이적 CD8+ T 세포는, K5-OVA 마우스 내로 이전되는 피부-배출 림프절 내에서 활성화 및 증식을 하며, K5-OVA 마우스의 피부를 표적화하여, TEN을 연상시키는 피부 병변을 발달시키게된다. 문헌 [Azukizawa H., et al., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003)]를 참조한다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 TEN의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
수포성 유천포창
수포성 유천포창은 호중구 및 호산구의 피부 침윤을 보이는 표피하 수포로 특정되는 표피하 질환이다. 진단은 표피 및 피부-표피 경계의 특이적 접착 단백질에 대한 항원-특이적 항체의 존재로 특정된다. 문헌 [Jordon R.E., et al., JAMA: 200, 751 (1967)]를 참조. PBL 및 피부 수포 T 세포의 분석에 의한 수포성 유천포창의 발병기전에서의 T 세포 분석 연구에서 증가된 수준의 Th2-사이토카인(IL-4 및 IL-13)를 발현하는 CLA+ T 세포의 선점을 밝혀내었다. 문헌 [Teraki Y., et al., J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001)]. 전신성 코르티코스테로이드로 치료한 수포성 유천포창 환자에서, CLA-가 아닌 CLA+의 빈도, 인터류킨-13-생산 세포는 현저하게 감소되었다. 코르티코스테로이드 치료 후 CLA+ 세포의 감소는 임상적 개발과 관련되어 있다. 문헌 [Teraki, ibid] 참조.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 수포성 유천포창의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
원형탈모증
원형탈모증(AA)는 모낭의 조직-한정 자가면역 질환으로 간주되며, 여기서 림프성 침윤물의 계속적 활성에 기인하여 소포 활성이 정지된다. AA에 의하여 신체상 어느 부위의 완전한 모발 상실의 패치가 되며, 모낭의 실제 상실이 아닌, 무모증 병변도 가능하다. 염증의 임상적 징후가 부재하여도, 활성 질환 부위의 피부 생검은 CD8+ 소포내 침윤물과 함께 1차적인 CD4+ 세포의 소포주위 림프성 염증을 나타낸다. 문헌 [Kalish R. S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)]를 참조.
연구를 통하여 두피 침윤 CD4+ 또는 CD8+ 림프구는 CLA를 발현하며, AA 환자의 말초 혈액에는, CLA+ CD4+ 또는 CD8+ 림프구의 비율이 정상 대조구에 비하여 현저하게 높다는 것을 밝혀내었다. 추가적으로, 극심한 또는 진행성 AA 환자는 질환에서 회복한 환자에 비하여 고도의 CLA-양성을 나타내며, CLA+ 세포 비율의 감소는 양호한 임상적 경로와 일치하게된다. 문헌 [Yano S., et al., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002)]를 참조. 따라서 이러한 연구에 의하여 CLA+ 림프구가 AA에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이종이식 모델은 활성화 T 세포가 AA의 발병기전에 어떠한 역할을 하는 것으로 입증하였다. 누드 마우스에 이식된 AA 환자의 병소 두피는 이식편으로부터의 침윤 림프구의 손실과 함께 모발을 재성장시켰으며, 활성화된 병소 T 세포를 SCID 마우스로 전이시키면 SCID 마우스상의 인간 두피 외식편에 모발 상실을 전이할 수 있다. 문헌 [Kalish R. S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003)]를 참조.
다양한 면역조절 치료는 이러한 질환의 일상적 치료의 일부이나, 이러한 치료가 효능이 일치하지는 않는다. 문헌 [Tang L., et al., J Invest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L., et al., (2004); 및 Tang L., et al., JAm Acad Dermatol: 49, 1013 (2003)] 참조. 그럼에도, 유효한 동물 모델에 이들의 사용은 치료 효과의 분자 기작을 분석하는 수단을 제공한다. 문헌 [Shapiro J., et al., J Investig Dermatol Symp Proc: 4, 239 (1999); Tang L., et al., Old wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models (2003); 및 Verma D.D., et al., Eur J Dermatol H, 332 (2004)]를 참조.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 원형탈모증의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
장미 여드름/일반 여드름
일반 여드름, 모지기 질환은 청소년기의 가장 일반적인 피부 질환이다. 소포 케라틴화의 이상이 여드름 병변을 생산하는 것으로 간주된다. 장미 여드름은 붉은 구진, 농포, 낭 및 광범위한 모세관확장증의 존재, 및 면포(흰머리)의 부재에 의하여 일반 여드름으로부터 분화되었다. 피지샘으로 부터 분비된 피지의 증가가 일반 여드름의 생태병리학의 주요 원인이다. 다른 피지샘 기능도, 피지 전염증 지질; 국부적으로 생산된 다른 사이토카인; 선주위 펩타이드 및 신경펩타이드, 예컨대 피지선세포에 의하여 생산된, 코르티코트로핀-방출 호르몬; 및 여드름 환자의 건강해보이는 선의 주변의 신경 말단에서 발현되는 물질 P 등을 포함하는 여드름의 발달과 관련되어 있다. 문헌 [Zouboulis CC. Clin Dermatol: 22, 360 (2004)]를 참조.
일반 여드름 및 장미 여드름의 병태생리학은 밝혀지지 않았으나, 임상적 관찰 및 조직병리학적 연구에 의하여 모발피지낭의 염증이 장미 및 일반 여드름의 발병기전의 중추인 것으로 밝혀졌다. T 세포 서브세트 침윤 장미 여드름 병소를 분석한 초기의 연구에서는 T 세포의 대다수가 CD4를 발현하는 것으로 나타났다. 문헌 [Rufli T. & Buchner S.A. Dermatologica: 169, 1 (1984)]를 참조.
CD4+ T 세포 생산 IL-31 및 IL-31 발현을 위한 피부의 IHC 분석에 의하여 IL-31는 피지 및 땀샘에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. 표피 각질세포의 IL-31 자극은 케모카인의 발현을 유도하고, 이에 의하여 세포성 침윤이 되며, 이는 IL-31가 피부의 전염증 반응에 기여한다는 것을 의미한다. 문헌 [Dillon S.R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004)]를 참조한다. IL-31는 따라서 장미 여드름 및 일반 여드름의 병태생리학에 기여한다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 일반 여드름의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
결절성 양진
결절성 양진 치료가 어려운 가려움에 의한 태선화된 또는 찰상성 결절의 발진이다. 만성적인 마찰에 의하여 태선화가 되고, 가려움에 의하여 선형 표피박리가 되나, 이들의 가려움, 염증성 피부에 피크와 홈이 있는 개체는 결절성 양진으로 알려진 상당히 후박한 구진을 발생시키기 쉽다. 결절성 양진이 아토피성 피부염에 특이적인 것은 아니나, 이러한 결절을 지닌 다수의 환자가 아토피 반응을 보이며, 이는 알러지성 비염, 천식, 또는 식품 알러지로 나타났다. T 세포는 양진 병변 내에서의 대다수의 침윤 세포를 제공하며, 이러한 병변은 대부분의 아토피 환자 내의 소양성 피부 병변에 제공된다.
소양증의 인지 및 소 감각 피부 신경 내의 물질 P 등의 신경펩타이드의 고갈에 의한 통증을 차단하는 항-소양성 알카로이드인 캡사이신에 의한 결절성 양진의 국소 치료는 효과적인 것으로 입증되었으며, 안전 처방에 의하여 피부 병변이 제거되었다. 문헌 [Stander S., et al., J Am Acad Dermatol: 44, 471 (2001)]를 참조. NC/Nga 마우스에서의 캡사이신 치료에 의한 가려움 반응의 연구에서 피부염 병변의 자발적 발달을 가장 완전하게 예방하였음을 보여주었다. 추가적으로, 혈청 IgE 수준의 증가가 상당히 억제되었으며, 캡사이신 치료 마우스의 병소 피부 내의 침윤 호산구 및 마스트 세포의 수는 감소되었다. 문헌 [Mihara K., et al., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)]를 참조. 이 그룹의 관찰에서 긁는 행동이 다양한 면역학적 반응의 강화에 의하여 피부염의 발달에 기여할 수 있다는 것을 알수 있으며, 따라서, 가려움 감각 및/또는 가려움-관련 긁는 행동의 예방이 AD의 효과적인 치료가 될 수 있다는 것을 암시한다. 문헌 [Mihara K., et al., Br J Dermatol: 151, 335 (2004)]을 참조. 따라서, 본원의 항-IL-31 항체는 NC/Nga 마우스에서 긁는 양이 감소하는 것을 보여준 만큼 AD, 결절성 양진, 및 기타 소양성 질환의 영향을 최소화하는 것에 유용하게 될 것이다.
IL-31의 만성적 전달은 마우스의 가려움증 및 탈모를 유도하고, 이어서 피부염과 유사한 피부 병변을 발달시키며, 이는 IL-31가 가려움을 유발한다는 것을 의미한다. 문헌 [Dillon S.R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004)]을 참조. 가려움 반응을 유도하는 IL-31의 관여에는 두 방식이 있으며, 이들은 실시예 10에서 시험되었다. (i) IL-31 -치료 마우스의 캡사이신 치료 및 (ii) Tac 1 넉아웃 마우스의 IL-31 치료이며, 이는 신경펩타이드의 발현 결핍에 의하여 통각수용기 통증 반응을 현저하게 감소시켰다. 이와 함께, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31 치료 마우스에서의 IL-31의 중화가 가려움증 및 탈모를 예방하는지 여부는 실시예 12에서 시험되었다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 염증 및/또는 질환 관련 가려움을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 결절성 양진의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증
말초 혈액 내의 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스(HSV)-특이적 CD8+ T 세포 및 헤르페스 병변에서 회복된 HSV-특이적 CD8+ T 세포는 높은 수준의 CLA를 발현하며, 여기서, 비-피부 영양성 헤르페스 바이러스-특이적 CD8+ T 세포는 CLA 발현을 결핍시킨다. 문헌 [Koelle D.M., et al., J Clin Invest: 110, 537 (2002)]을 참조한다. HSV-2 반응성 CD4+ T 림프구는 CLA도 발현하나, CD8+ T 림프구에서 관찰된 것보다는 낮은 수준이다. 문헌 [Gonzalez J.C., et al., J Infect Dis: 191, 243 (2005)]를 참조. 가려움증은 헤르페스 바이러스 감염과 관련되어 있다(Hung K.Y., et al., Blood Purif: 16, 147 (1998). though HIV 등의 다른 바이러스 질환이 소양성 피부 병변과 관련있다. 대체로 홍반성구진 피부 병변 및 호산구과도증식증과 관련되어 있는, 극심하고, 치료되지 않는 가려움은 비아토피성, HIV-감염 환자 36의 관찰 상태이다. 문헌 [Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol; 4, 177 (2003); 및 Milazzo F., Piconi S., et al., Allergy: 54, 266 (1999)]를 참조한다.
피부 영양성 바이러스와 가려움증 및 CLA+ T 세포의 관련성은 IL-31 생산 T 세포가 바이러스 감염의 병태생리학에 관련되어 있음을 의미한다.
따라서, 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 피부 영양성 바이러스와 관련된 가려움증을 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 결절성 양진의 임상적 결과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
가려움 반응 유도에 대한 IL-31 관여, 및 본원의 IL-31 결합 분자에 의한 이의 감소, 차단, 억제 또는 중화는 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
방법 I (IL-31 치료 마우스의 캡사이신 치료):
10 주령 BALB/c 동물(CRL)을 마취시키고, 목덜미 피하에 4 mg/ml 용액의 캡사이신의 10% 에탄올 + 10% 트윈-80의 식염수 용액의 0.25 ml 주사전에 지속형 진통제, 부프라노르핀 하이드로클로라이드, 0.1 mg/kg을 피하 주사하였다. 동물은 최소한 30 분간 마취되었으며, 이후 신경독소 치료를 하였다. 48시간 후, 14-일 상투압 펌프를 피하에 이식하여, 14 일간 IL-31를 20 ug/day로 지속적으로 전달하였다. 마우스는 매일 6일간 탈모 및 가려움증에 대하여 모니터링하였으며, 다음의 기준을 사용하였다: 0 = 가려움 없음, 정상으로 보임, 1 = 소영역의 박막형성, 가려움 관찰, 2 = 근소한 탈모(작은 패치), 가려움, 3 = 완만한 탈모, 가려움, 및 4 = 중증 탈모, 과도한 가려움. 이 실험을 수행하는 경우, 결과는 비-캡사이신-치료 마우스의 경우 IL-31 투여 3일에 가려움/탈모의 평균스코어가 2.625인데 반하여, 캡사이신-치료 마우스는 상당히 낮은 스코어인 1을 나타내었다. 따라서 IL-31 전달 전에 캡사이신으로 치료한 마우스는 가려움 및 탈모 발병의 지연 및 실험 6일 후 가려움 및 탈모의 강도에서 낮은 스코어를 모두 나타낸다. 이러한 데이터는 IL-31가 IL-31에 의하여 유도된 탈모 및 가려움증에 기여하는 일부 신경 성분을 유도한다는 것을 의미한다. 따라서, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 가려움이 있는 피부질환을 겪는 환자에 있어서 가려움, 따라서 피부염의 발생 및 강도를 감소시킬 수 있다.
방법 II:
Tacl 유전자에 대한 동종접합 무효화 마우스는 검출가능한 물질 P 또는 뉴로킨닌 A을 발현하지 않는다. 이러한 마우스는 통각수용기 통증 반응이 상당히 감소하여 강한 자극을 완화하게되고, 따라서 통증/가려움 진행 및 염증 질환 상태에 대한 타키키닌 펩타이드의 기여에 대한 연구에 유용한 수단이 된다. 12주령의, Tacl 넉아웃 마우스에 14-일 상투압 펌프를 피하에 이식하여, IL-31 단백질을 1ug/day로 지속적으로 전달하였으며, 매일 탈모 및 가려움증에 대하여 모니터링하였으며, 다음의 기준을 사용하였다: 0 = 가려움 없음, 정상으로 보임, 1 = 소영역의 박막형성, 가려움 관찰, 2 = 근소한 탈모(작은 패치), 가려움, 3 = 완만한 탈모, 가려움, 및 4 = 중증 탈모, 과도한 가려움.
이 연구의 결과는 Tacl 결핍 마우스가 야생형 대조구 마우스에 비하여 IL-31 유도성 가려움/탈모에 덜 민감하다는 것을 나타낸다. 100% (10/10)의 야생형 마우스가 IL-31 치료 6일에 가려움 및 탈모의 징후를 발달시켰으나, 33.3%(2/6)의 Tacl 결핍 마우스가 동일한 시점에서 가려움 및 탈모의 징후를 나타내었다. 이러한 데이터는 IL-31가 IL-31-치료 마우스 내의 가려움/탈모 표현형에 기여하는 신경 성분을 유도하며, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화는 피부염의 개념으로서 가려움의 발생 및 강도를 감소시킨다는 것을 보여준다.
방법 III (IL-31 중화 항체의 투여):
대략 8 내지 12 주령의 정상의 암컷 BALB/c 마우스(CRL)에 1ug/day mIL-31를 전달하는 14-일 삼투압 펌프(Alzet, #2002)를 피하 이식하였다. 마우스 그룹에 IL-31 전달 1 주 전에 레트 항-마우스 IL-31 단클론 항체 10mg/kg (200ug/마우스)를 주 2회 복막내(i.p.) 주사하였다. 마우스 대조구 그룹은 동일한 투약 계획으로 비히클(PBS/0.1%BSA)을 i.p. 주사 하였다. 마우스를 다음의 기준을 사용하여 매일 탈모 및 가려움증을 점수화하였다: 0 = 가려움 없음, 정상으로 보임, 1 = 소영역의 박막형성, 가려움 관찰, 2 = 근소한 탈모(작은 패치), 가려움, 3 = 완만한 탈모, 가려움, 및 4 = 중증 탈모, 과도한 가려움.
모든 실험에서, 레트 항-mIL-31 mAb로 처리된 마우스는 증상의 발병이 대략 5 내지 7 일 지연되었으며, 탈모 및 가려움증의 전체 스코어가 낮았다. mAb 처리 마우스(투약 빈도 또는 농도 불문)의 모든 그룹은 13일 간의 연구에서 대조구 마우스와 유사하게 탈모 및 가려움증을 발달시켰다. 이러한 데이터는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제에 의한 IL-31의 중화가 IL-31에 의하여 유도된 가려움/탈모 반응의 발생을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다. IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 효과는 가려움, 소양증, 피부염의 억제, 각질형성세포 내의 IL-31RA 발현의 감소, 및/또는 탈모 및 가려움증의 스코어의 감소로 측정된다.
염증은 침입 약제에 대항하기 위한 유기체의 보호 반응이다. 염증은 다수의 세포성 및 체액성 매개체가 관여하는 캐스케이드형 반응이다. 한편으로는, 염증 반응의 억제는 숙주가 면역손상이 되도록 한다; 그러나, 검진 받지 않는 경우, 염증은 심각한 합병증 예컨대, 만성 염증 질환 (예컨대, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 보웰씨 병 등), 패혈 쇼크 및 다중 장기 손상 등을 유도하게 된다. 중요한 것은, 이러한 다양한 질병 상태가 일반적인 염증 매개체를 공유한다는 것이다. 염증으로 특정되는 집합적 질환은 인간 이환율 및 사망률에 크게 영향을 미친다. 따라서, 항-염증 항체 및 결합 폴리펩타이드, 예컨대 본원의 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩타이드가 천식 및 알러지에서 자가면역 및 패혈 쇼크에 이르는 다양한 인간 및 동물 질환에 대한 결정적인 치료 가능성을 보유한다는 것이 명확하다. 이와 같이, 본원의 항-염증 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩타이드를 본원의 IL-31 길항제로서 특히 예컨대 관절염, 내독소혈증, 염증성 보웰씨 병, 건선, 유관 질환 등에 치료적으로 사용할 수 있다.
1. 관절염
관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 상해에 기인한 관절염성 관절, 등을 포함하며, 항-염증 항체 및 결합 폴리펩타이드, 예컨대 항-IL-31 항체 및 결합 본 발명의 폴리펩타이드의 치료적 용도에 의하여 호전되는 일반적인 염증 상태이다. 예를 들어, 류마티스 관절염(RA)는 전신에 영향을 미치는 전신성 질환이며, 가장 일반적인 형태의 관절염 중의 하나이다. 이는 관절을 감싼 막의 염증으로 특정되며, 이에 의하여 통증, 경직성, 발열, 발적 및 종창이 유발된다. 염증 세포는 뼈 및 연골을 분해하는 효소를 분비한다. 류마티스 관절염의 결과로서, 염증성 관절 내막, 윤활막은 뼈 및 연골에 침입하여 손상을 입혀 다른 생리학적 효과 중에서도 관절 약화 및 격렬한 통증을 유발시킬 수 있다. 이에 관련된 관절은 이들의 모양 및 중심을 잃고, 통증 및 운동능력 상실을 유발시킨다.
류마티스 관절염(RA)은 면역-매개 질환이며 특히 심각한 장애와 사망률을 증가시키게 되는 염증 및 후속적인 조직 손상으로 특정된다. 다양한 사이토카인은 류머티스 관절 내에서 국부적으로 생산된다. 다양한 연구를 통하여 두 종의 원형 전염증 사이토카인인, IL-1 및 TNF-알파가 윤활막 염증 및 진행성 관절 파괴의 기작에 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다. 물론, RA 환자에 TNF-알파 및 IL-1 억제제 투여함으로써 염증의 임상적 및 생물학적 징후의 급격한 개선 및 뼈 마모 및 연골 파괴의 방사선학적 징후의 감소를 유도할 수 있다. 그러나, 이러한 고무적인 결과에도 불구하고, 상당한 비율의 환자가 이러한 약제에 반응하지 않으며, 다른 매개체가 관절염의 병태생리학에 관여한다는 것을 의미한다(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149. 2002). 이러한 매개체 중의 하나가 IL-31가 될 수 있으며, 이와 같이 IL-31를 결합하거나 또는 억제하는 분자, 예컨대 항 IL-31 항체 또는 결합 파트너는, 소중한 치료제로서 제공되어 류마티스 관절염, 및 다른 관절염성 질환의 염증을 감소시킬 수 있다.
류머티스 관절염에 대한 수종의 동물 모델이 공지되어 있다. 예를 들어, 콜라겐-유도성 관절염(CIA) 모델에 있어서, 마우스는 인간 류마티스 관절염과 매우 유사한 만성 염증 관절염을 발달시킨다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특징을 공유하기 때문에, 이는 잠재적인 인간 항염증 화합물을 선별하기 위한 이상적인 모델로 만들 수 있다. CIA 모델은 면역 반응, 및 염증 반응 모두에 의존하는 마우스의 공지의 모델이다. 면역 반응은 항원으로 제공된 콜라겐과의 반응에서 B-세포와 CD4+ T-세포의 상호작용을 포함하며, 항-콜라겐 항체를 생산하게 된다. 염증 상은 염증의 매개체에 의한 조직 반응의 결과이며, 마우스의 자연 콜라겐과 상호 반응하고, 보체 케스케이드를 활성화하는 이러한 항체의 일부의 결과이다. CIA 모델을 사용하는 장점은 발병기전의 기초적 기작이 공지되었다는 점이다. 타입 II 콜라겐 상의 유관 T-세포 및 B-세포 에피토프는 동정되었으며, 면역-매개 관절염과 유관된 다양한 면역학적(예컨대, 지연형 고민감도 및 항-콜라겐 항체) 및 염증(예컨대, 사이토카인, 케모카인, 및 매트릭스-분해 효소) 변수도 결정되었다. 따라서 CIA 모델에서 시험 화합물 효능을 평가하기 위하여 사용할 수 있다(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sri. 61:1861-78, 1997; 및 Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).
폴리펩타이드(본원의 이종이량체 및 다량체 수용체 포함), 예컨대 IL-31RA-Fc4 또는 다른 IL-31RA 가용성 및 융합 단백질을 포함하는 가용성 IL-31RA를 이러한 CIA 모델 마우스에 투여함으로써 증상의 완화 및 질환 경로 변화를 하도록 IL-31RA의 용도를 평가하기 위하여 사용할 수 있다. 면역 및 염증 반응을 조절하는 분자로서, IL-31는 SAA의 생산을 유도할 수 있으며, 이는 류마티스 관절염의 발병기전에 관여하며, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 시험관 내 및 생체 내에서 SAA 활성을 감소시킬 수 있고, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제 전신적 또는 국부적 투여는 RA의 염증 반응을 상당히 억제할 수 있다.
2. 내독소혈증
내독소혈증는 일반적으로 감염성 약제 예컨대 박테리아 및 다른 감염성 질환 약제, 패혈증, 독소 충격 증후군에 의하거나, 또는 면역 손상 환자에게 기회 감염, 등을 하게하는 심각한 상태이다. 치료적으로 유용한 항염증 항체 및 결합 폴리펩타이드, 예컨대 본 발명의 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩타이드는, 인간 및 동물에서 내독소혈증을 예방 및 치료를 보조할 수 있다. 다른 잠재적인 치료제는 IL-31RA 폴리펩타이드, 가용성 이종이량체 및 다량체 수용체 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 항 IL-31 항체 또는 결합 파트너 등은 내독소혈증의 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 귀중한 치료제로서 제공될 수 있다
리포폴리사카라이드(LPS) 유도성 내독소혈증은 감염성 질환의 생리학적 효과를 생성하는 다양한 전염증 매개체를 사용하며, 설치류의 LPS 유도성 내독소혈증은 잠재적인 전염증 또는 면역조절제의 약물동태학적 효과를 연구하기 위하여 널리 사용되는 허용가능한 모델이다. 그람-음성 박테리아에서 생산된 LPS는 패혈 쇼크의 발병기전의 주요 요인 약제이다(Glausner et al., Lancet 338:732. 1991). 쇼크-유사 상태는 LPS를 동물에 단일 투여하여 실험적으로 유도할 수도 있다. LPS에 반응하는 세포에 의하여 생산된 분자는 직접 또는 간접적으로 병원체를 표적화할 수 있다. 이러한 생물학적 반응이 침입한 병원체로부터 숙주를 보호하지만, 이들에 의하여 상해를 입을 수 있다. 따라서, 극심한 그람-음성 박테리아 감염의 결과로 발생하는, 선천적 면역성에 의한 대규모 자극은 사이토카인 및 다른 분자의 과도한 생산 및 치명적 증후군, 패혈 쇼크 증후군의 발달을 유도하며, 이는 발열, 고혈압, 파종성 혈관내 응고, 및 다중 장기 손상으로 특정된다(Dumitru et al. Cell 103: 1071-1083, 2000).
LPS의 이러한 독성 효과는 다중 염증 매개체의 방출을 유도하는 대식세포 활성화에 대체로 관련되어 있다. 이러한 매개체 중에서, TNF는 중화된 항-TNF 항체의 투여에 의하여 LPS 독성의 예방에 결정적 역할을 하는 것으로 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). E. coli LPS 1ug을 C57B1/6 마우스에 주사하면 주사 후 대략 2 시간 후, IL-6, TNF-알파, IL-1, 및 급성기 단백질(예를 들어, SAA)의 순환을 상당히 증가시키게 된다는 사실은 확립되어 있다. 이러한 매개체에 대한 수동적 면역화가 사망률을 감소시킬 수 있기 때문에 LPS의 독성은 이러한 사이토카인에 의하여 매개되는 것으로 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 패혈 쇼크의 예방 및/또는 치료에 대한 잠재적인 면역개입 전략은 항-TNF mAb, IL-1 수용체 길항제, LIF, IL-10, 및 G-CSF를 포함한다. LPS는 내독소혈증의 병리학에 기여할 가능성이 있는 전염증 인자의 생산을 유도하기 때문에, IL-31 활성의 중화, SAA 또는 IL-31 폴리펩타이드에 길항작용하는 기타 전염증 인자를, 예컨대 내독소 쇼크로 나타나는 내독소혈증의 증상을 감소시키기 위하여 사용할 수 있다. 다른 잠재적인 치료적제는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함한다.
3 염증성 보웰씨 병. IBD
미국 내에서 많은 사람들이 염증성 보웰씨 병(IBD)을 앓고 있으며, 이는 직장 및 결장(궤양성 대장염) 또는 둘 모두, 소장 및 대장관(크론씨병)에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 질환의 발병기전은 불분명하나, 이들은 영향받은 조직의 만성 염증에 관여한다. 잠재적인 치료제는 IL-31RA 폴리펩타이드, 가용성 이종이량체 및 다량체 수용체 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함하며, IBD 및 유관 질환의 염증 및 병리학적 효과를 감소시키기 위한 귀중한 치료제로서 제공될 수 있다.
궤양성 대장염(UC)은 일반적으로 결장으로 명명된 대장관의 염증 질환이며, 점막 또는 결장의 내막의 염증 및 궤양으로 특정된다. 이 염증은 결장을 빈번하게 비우게되어 설사를 유발한다. 증상은 무른 대변 및 유관 복부 경련, 발열 및 체중 감소를 포함한다. UC의 정확한 원인은 알려져 있지 않으나, 최근 연구에서 인체의 천연 방어가 외래의 것으로 오인한 인체 내의 단백질에 대해서 작용하는 것("자가면역 반응")으로 알려졌다. 창자 내에서 이들이 박테리아 단백질과 유사하기 때문에, 이러한 단백질은 결장 막을 파괴시키기 시작하는 염증 과정을 유발 또는 자극할 수 있다. 결장 막이 파괴되면, 궤양이 형성되어 점액, 농양 및 혈액을 방출한다. 질환은 일반적으로 직장 영역에서 시작되며, 결국 전체 대장으로 확장된다. 반복되는 염증 발생은 장관 및 상처난 조직의 직장의 벽을 비후하게한다. 결장 조직의 사멸 또는 패혈증이 심각한 질환에서 발생할 수 있다. 궤양성 대장염의 증상은 중증도에 따라 다르며, 이들의 발병은 점진적이거나 급성일 수 있다. 발병은 다수의 인자에 의하여 유발될 수 있으며, 호흡기 감염 또는 스트레스를 포함한다.
현재 사용가능한 UC 치료제는 없으나, 치료는 결장막의 복부 염증 과정을 억제하는 것에 초점을 맞추고 있다. 코르티코스테로이드 면역억제제(예컨대, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 및 메토트렉세이트) 및 아미노살리실레이트를 포함하는 치료가 이 질환의 치료에 사용할 수 있다. 그러나, 면역억제제 예컨대 코르티코스테로이드 및 아자티오프린 등의 장기간의 사용은 뼈의 감쇄, 백내장, 감염, 및 간 및 골수 효과를 포함하는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 현재의 치료가 성공적이지 않은 환자라면, 외과적 수술이 선택적이다. 외과적 수술은 전체 결장 및 직장의 절제를 의미한다.
만성 궤양성 대장염을 부분적으로 모사한 수종의 동물 모델이 있다. 가장 널리 사용되는 모델은 2,4,6-트리니트로베네설폰산/에탄올(TNBS) 유도성 대장염 모델이며, 이는 결장 내에서 만성 염증 및 궤양을 유도한다. TNBS가 직장내 기구를 통하여 민감성 마우스의 결장에 도입되는 경우, 이는 결장 점막 내의 T-세포 매개 면역 반응을 유도하며, 이 경우, 대장 전체벽을 통한 T-세포 및 대식세포의 고밀도 침윤으로 특정되는 대규모 점막 염증을 유발한다. 더욱이, 이 조직병리학적 현상은 진행성 체중 감소(wasting), 혈변, 직장탈출증, 및 대장벽 후박화의 임상적 현상과 동반된다(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).
또 다른 대장염 모델은 덱스트란 나트륨 설페이트(DSS)를 사용하며, 이는 혈변, 체중 감소, 결장의 축소 및 호중구 침윤성 점막성 궤양으로 입증되는 급성 대장염을 유도한다. DSS-유도성 대장염은 림프계 과다증식과 함께, 고유판으로의 염증 세포의 침윤, 국소 창자샘 손상, 및 상피 궤양등으로 조직학적으로 특정된다. 이러한 변화는 상피 상의 DSS의 독성 효과 및 고유판 세포의 포식작용 및 TNF-알파 및 IFN-감마의 생산에 기인하여 발달한다. 이의 일반적인 용도에도 불구하고, 인간 질환에 관련된 DSS의 기작에 관한 몇몇 사항은 미제로 남아 있다. DSS는 T 세포-비의존성 모델로 간주되며, 이는 T 세포-결핍 동물 예컨대 SCID 마우스에서 관찰되기 때문이다.
항-IL-31 항체 또는 결합 파트너, 폴리펩타이드(이종이량체 및 다량체 수용체 포함), 예컨대 IL-31RA-Fc4 또는 다른 IL-31RA 가용성 및 융합 단백질을 포함하는 가용성 IL-31RA를 이러한 TNBS 또는 DSS 모델에 투여하여 증상을 완화하고, 위장관 질환의 경로를 변화시키는 IL-31 길항제의 용도를 평가할 수 있다. IL-31는 대장염의 염증 반응에 일정 역할을 할 수 있으며, IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제 투여에 의한 IL-31 활성의 중화는 IBD의 잠재적인 치료적 접근법이다.
4. 건선
건선은 700만 이상의 미국인이 겪고 있는 만성 피부 질환이다. 건선은 신규의 피부 세포가 비정상적으로 성장하는 경우 발생하며, 염증, 부종, 및 노화된 피부를 충분히 빨리 제거하지 않는 경우 비늘 패치의 피부를 유발한다. 플라크 건선은, 가장 일반적인 형태이며, 이는 은백색 비늘로 덮인 피부의 염증 패치("병변")으로 특정된다. 건선은 소수의 플라크로 제한될 수 있거나 또는 피부의 적당한 범위에서 광범위한 영역에 미칠 수 있으며, 가장 일반적으로는 두피, 무릎, 팔꿈치 및 몸체에 나타난다. 고도로 가시적이라도, 건선은 접촉성 질환은 아니다. 질환의 발병기전은 감염 조직의 만성 염증을 일으키는 것이다. IL-31RA 폴리펩타이드, 가용성 이종이량체 및 다량체 수용체 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등은 건선, 다른 염증 피부 질환, 피부 및 점막 알러지, 및 유관 질환의 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 소중한 치료제로서 제공될 수 있다.
건선은 상당한 불편을 유발하는 피부의 T-세포 매개 염증 질환이다. 이는 치료제가 없으며, 모든 연령의 사람에게 발병하는 질환이다. 건선은 대략 2%의 유럽 및 북아메리카 인구에서 발병한다. 경증 건선 환자는 종종 국소 제제 만으로 질환을 제어할 수 있으나, 전세계의 100 만명 이상의 환자가 자외선 또는 전신성 면역억제 치료를 요한다. 불행하게도, 자외선 조사의 불편함과 위험 및 다른 치료법의 독성은 장기간의 치료를 제한하도록 한다. 더욱이, 환자는 일반적으로 건선이 재발한다.
IL-31은 중요한 면역학적 기능을 하는 것으로 알려진 조직으로부터 분리되며, 이는 면역계에서 일정 역할을 하는 세포를 함유한다. IL-31는 CD3+ 선택된, 활성화된 말초 혈액 세포에서 발현되며, IL-31 발현은 T 세포 활성화 후 증가되는 것으로 알려졌다. 더욱이, 본원의 실시예 부분에 설명된 실험의 결과는 본 발명의 폴리펩타이드가 단핵구/대식세포, T-세포, B-세포, NK 세포의 성장/확장 및/또는 단핵구/대식세포, T-세포, B-세포, NK 세포 또는 이러한 세포의 전구체의 분화된 상태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다. 조혈 전구체의 증식을 자극하고, 성숙 세포를 활성화하는 인자는 일반적으로 공지되어 있으나, 증식 및 활성화는 추가적인 성장 인자를 요한다. 예를 들어, IL-7 및 스틸 인자(c-kit 리간드)가 NK 전구체의 콜로니 형성에 요구된다는 것이 알려졌다. IL-7과 조합한 IL-15 + IL-2 및 스틸 인자가 더 효과적이다(Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). 그러나, 미확인 사이토카인이 NK 세포 및/또는 NK 전구체의 특이적 서브세트의 증식에 필요할 수도 있다(Robertson et. al., Blood 76:2451-2438, 1990). 이와 유사하게, IL-31는 단독으로 또는 합동으로 또는 다른 사이토카인과 시너지적으로 작용하여, 단핵구/대식세포, T-세포, B-세포 또는 NK 세포의 성장, 증식 확장 및 분화의 변화를 강화할 수 있다.
본 발명은 단핵구/대식세포의 활성화 또는 분화를 억제하는 방법을 제공한다. 단핵구는 이들이 성숙하고 대식세포가 되는 다양한 조직으로 이동하는, 불완전하게 분화된 세포이다. 대식세포는 항원을 림프구에 제시함으로써 면역 반응에 중추적 역할을 하며, 다양한 사이토카인을 분비함으로써 림프구에 대한 악세서리 세포로서 지지적 역할을 한다. 대식세포는 세포외 분자를 내재화할 수 있으며, 활성화시 세포내 미생물 및 종양 세포를 살상하는 능력을 보유하게 된다. 활성화된 대식세포는 급성 또는 국부 염증을 자극할 수 있다.
제공된 사이토카인에 대한 수용체의 조직 분포는 그 사이토카인의 잠재적인 활성 부위의 강력한 표시를 제공한다. IL-31RA의 발현은 단핵구 및 B-세포 내에서 나타나며, CD3+, CD4+, 및 CD8+ T-세포의 활성화시 발현이 급격하게 증가한다. 이와 함께, 두 단핵구 세포주, THP-1(Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26: 171-176. 1980) 및 U937(Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17:565-577. 1976)는 IL-31RA 발현에 양성이다.
OSMR의 발현은 매우 광범위한 것으로 알려졌다(Mosley et al, JBC 271 :32635-32643, 1996). IL-31RA 및 OSM 수용체의 이 분포는 면역 반응에서의 IL-31의 역할, 특히 활성화시, T-세포의 확장을 지지하거나 또는 면역계의 단핵구/대식세포 팔(arm)의 역할을 지지한다.
따라서, 본 발명의 특정 실시 상태는 염증 및 면역 질환 또는 상태 예컨대 췌장염, 타입 I 당뇨병(IDDM), 췌장암, 그레이브스병, 염증성 보웰씨 병(IBD), 크론씨 병, 결장 및 위장관암, 게실증, 자가면역 질환, 패혈증, 장기 또는 골수 이식; 외상, 수술 또는 감염에 의한 염증; 아밀로이드증; 비장비대증; 이식 대 숙주 질환; 및 염증 억제시, 면역 억제, 조혈, 면역, 염증 또는 림프계 세포, 대식세포, T-세포 (Th1 및 Th2 세포, CD4+ 및 CD8+ 세포 포함) 증식의 감소, 병원체 또는 항원에 대한 면역 반응의 억제에 있어서 길항제로서의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 용도에 관한 것이다. 더욱이 활성화된 면역 세포 예컨대 활성화된 CD4+ 및 CD19+ 세포 내에서 IL-31 RA 발현의 존재는 IL-31RA 수용체가 외래 침입자: 예컨대 미생물 및 세포 잔해에 대한 신체의 면역 방어 반응에 관여하며, 염증 및 암 형성시 면역 반응에 일정 역할을 하는 것으로 알려졌다. 이와 같이, IL-31RA 수용체 기능, 예컨대 IL-31에 대한 작용제 또는 길항제인 본 발명의 항체 및 결합 파트너는 면역 반응 및 염증을 변화시키기 위하여 사용될 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 IL-31의 순환 수준을 검출하기 위한 진단적 시스템에 사용될 수 있다. 관련된 실시상태에서, 특히 IL-31 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 다른 약제는 IL-31 폴리펩타이드 순환을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 증가 또는 감소된 수준의 리간드 폴리펩타이드는 암을 포함하는 병리학적 상태의 지표가 될 수 있다. IL-31 폴리펩타이드는 병리학적 과정에 기여할 수 있으며, 잠재 질환의 간접 마커가 될 수 있다.
죽상경화증 병변에서, 제1 이상 중의 하나는 단핵구/대식세포의 내피 세포 국부화이다. 이러한 병변은 IL-31의 길항제를 사용하여 예방할 수 있다. IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 IL-31의 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 단핵모구성 백혈병은 대식세포의 생물학적 산물의 분비를 반영하는 다양한 임상적 이상에 관련되어 있으며, 그 예는 혈청 및 소면 내의 높은 수준의 라이소자임 및 고열을 포함한다. 더욱이, 이러한 백혈병은 단핵구 세포의 비정상적 증가를 나타낸다. 이러한 효과는 IL-31의 길항제, 예컨대 본원에 설명된 것들에 의하여 예방하는 것이 가능하다. 더욱이, 항-IL-31는 본원에 설명한 바와 같이 백혈병 단핵구 세포의 살상을 위하여 분자 예컨대 독성 모이어티 및 사이토카인에 접합할 수 있다.
IL-31은 T-세포, 대식세포 및 단핵구-특이적 방식으로 발현되고, 이러한 질환이 단핵구 세포, 예컨대 세포 증식, 기능, 국부화, 및 활성화의 이상과 관련되어 있기 때문에, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 항체를 단핵구 세포 이상을 검출하고, 질환의 존재를 나타내도록, 진단적으로 사용할 수 있다. 이러한 방법은 환자로부터 생물학적 시료, 예컨대 혈액, 타액, 또는 생검을 수집하는 단계, 및 이를 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함한다. 조직학적, 세포학적, 유동 세포측정, 생화학적 및 다른 방법을 사용하여 환자 시료를 정상 대조구 시료와 비교하여 IL-31, 또는 IL-31를 발현하는 세포, 즉, 단핵구의 상대적 수준 또는 국부화를 결정할 수 있다. 배조구와 비교한 IL-31 발현 수준의 변화(증가 또는 감소), 또는 단핵구의 숫자 또는 국부화의 변화(예컨대, 이들이 정상적으로는 존재하지 않는 조직 내에서 단핵구 세포의 증가 또는 침윤)는 질환의 지표가 될 수 있다. 이러한 진단적 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 항체에 부착한 방사선, 형광, 및 발색 태그를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 당해 기술분야 및 본원에 공지되어 있다.
IL-31는 활성화된 단핵 세포에서 발현되는 것으로 알려졌으며, 염증 조절에 관여한다. 이와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 염증 조절능을 분석하고, 사용하거나, 또는 염증 마커로서 사용할 수 있다. IL-31의 전염증 및 항염증 능력을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 본원에서 논의되었다. 더욱이, 이는 급성기 반응물, 예컨대 혈청 아밀로이드 A(SAA), α1-항키모트립신, 및 헵토글로빈의 생산을 상향조절하는 것에 관여하며, IL-31RA 수용체 리간드의 발현은 염증 반응에 관여하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 생체 내 주사시 증가된다 (Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). 급성기 단백질, 예컨대 SAA의 생산은 염증이 유용한 단기 생존 기작으로 간주된다; 그러나, 장기간의 급성기 단백질의 유지는 만성 염증에 기여하며, 인간 건강에도 해롭다. 연구를 위하여 문헌 [Uhlar, CM and Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, 및 Baumann H. and Gauldie, J. Immunology Today J_5:74-80, 1994]를 참조한다. 더욱이, 급성기 단백질 SAA는 다수의 만성 염증 질환의 발병기전에 관여하며, 죽상경화증 및 류마티스 관절염에 관여하고, 아밀로이드증에 부착된 아밀로이드 A 단백질의 전구체이다(Uhlar, CM and Whitehead, 전게서). 따라서, 전염증 분자로 작용하고, SAA 생산을 유도하는 리간드 예컨대 IL-31의 경우, 길항제는 염증 질환 및 리간드에 의하여 유도된 급성기 반응 단백질 관련 다른 질환을 치료하는데 유용하다. 이러한 길항제는 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 염증을 감소시키는 방법은 염증을 감소시키기 충분한 IL-31, 또는 항-IL-31 항체 (예컨대, 중화 항체)의 조성물의 양을 염증이 있는 포유류에 투여하는 단계를 포함함다. 더욱이, 염증이 있는 포유류에서 염증 반응을 억제하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 결정하는 단계; (2) 약학적으로 허용되는 담체 내에서 본원의 IL-31 폴리펩타이드 또는 항-IL-31 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 결정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계, 여기서, 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준의 증가 또는 감소의 결핍은 염증 반응 억제의 지표이다.
이들의 IL-31RA 수용체 cDNA 대응하는 mRNA의 조직 분포는 mRNA 수준은 단핵구 및 전립선 세포에서 최고치였으며, 활성화된 단핵구, 및 활성화된 CD4+, 활성화된 CD8+, 및 활성화된 CD3+ 세포에서 증가되었음을 보여주었다. 그러므로, IL-31RA 수용체는 염증 및 면역 반응의 감소에 관여한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시 상태는 염증 및 면역 질환 또는 상태 예컨대, 췌장염, 타입 I 당뇨병(IDDM), 췌장암, 그레이브스병, 염증성 보웰씨 병(IBD), 크론씨 병, 결장 및 장암, 게실증, 자가면역 질환, 패혈증, 장기 또는 골수 이식; 외상, 수술 또는 감염에 의한 염증; 아밀로이드증; 비장비대증; 이식 대 숙주 질환; 및 염증 억제시, 면역 억제, 조혈, 면역, 염증 또는 림프계 세포, 대식세포, T-세포 (Th1 및 Th2 세포, CD4+ 및 CD8+ 세포 포함) 증식의 감소, 병원체 또는 항원에 대한 면역 반응의 억제에 있어서 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 사용에 관한 것이다. 더욱이 활성화된 면역 세포 예컨대 활성화된 CD4+ 및 CD19+ 세포 내에서 IL-31RA 수용체 및 IL-31 발현의 존재는 IL-31RA 수용체가 외래 침입자: 예컨대 미생물 및 세포 잔해에 대한 신체의 면역 방어 반응에 관여하며, 염증 및 암 형성시 면역 반응에 일정 역할을 하는 것으로 알려졌다. 이와 같이, IL-31RA 수용체 기능에 대한 작용제 또는 길항제인 본 발명의 IL-31 및 IL-31-항체는 면역 반응 및 염증을 변화시키기 위하여 사용될 수 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 다음에 유용하다:
1) 급성 염증, 외상, 조직 상해, 수술, 패혈증 또는 감염에 의한 염증, 및 만성 염증 질환 예컨대, 천식, 염증성 보웰씨 병(IBD), 만성 대장염, 비장비대증, 류마티스 관절염, 재발성 급성 염증 에피소드(예컨대, 결핵), 및 아밀로이드증, 및 죽상경화증, 게텔만씨병, 천식, 및 급성기 반응의 유도와 관련된 다른 질병의 치료시 IL-31RA-포함 수용체를 통한 신호의 길항작용 또는 차단.
2) IL-31RA 수용체를 통하여 면역 세포 (예컨대 림프구, 단핵구, 백혈구) 내의 신호를 예방 또는 억제하기 위하여 자가면역 질환 예컨대 IDDM, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 중증근무력증, 류마티스 관절염, 및 IBD의 치료에 IL-31RA 수용체 수용체를 통한 신호의 길항작용 또는 차단(Hughes C et al., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). 대안적으로 IL-31에 대한 항체, 예컨대 단클론 항체 (MAb)를 길항제로 사용하여 원치않는 면역 세포를 고갈시켜 자가면역 질환을 치료하게 된다. 천식, 알러지 및 다른 아토피 질환은, 예를 들어, 항-IL-31 항체, 가용성 IL-31RA 수용체 가용성 수용체 또는 IL-31RA/CRF2-4 이종이량체에 대한 MAb로 치료하여 면역 반응을 억제하거나 또는 방어 세포를 고갈시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체를 사용하는 IL-31RA를 통한 신호의 차단 또는 억제는 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 유익하다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장 암종에 유익하다. IL-31RA는 MAb 암 요법의 표적으로 제공될 수 있으며, 여기서 길항작용 MAb는 암 성장을 억제하고, 면역-매개 살상을 표적화한다(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). 가용성 IL-31RA 수용체 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체에 대한 Mab는 신장병 예컨대 사구체경화증, 막성신병증, 아밀로이드증(이는 다른 조직보다 신장에 영향을 미친다), 신장 동맥경화증, 다양한 기원의 사구체신염, 신장의 섬유증식성 질환, 및 SLE, IDDM, 타입 II 당뇨병(NIDDM), 신장 종양 및 다른 질환에 관련된 신장 이상의 치료에 유용하다.
3) 자가면역 질환 예컨대 IDDM, MS, SLE, 중증근무력증, 류마티스 관절염, 및 IBD의 치료에서 IL-31RA 수용체를 통한 신호의 작용제화 또는 개시. IL-31는 자가면역 증상을 완화하는 사이토카인 또는 세포 표면 단백질의 분화, 증식의 변화 또는 생산의 변화를 하도록 림프구 또는 다른 면역 세포에 신호를 보낼 수 있다. 특히, 사이토카인 분비의 패턴을 변화시키는 T-헬퍼 세포 반응의 조절은 질환을 완화하도록 자가면역 반응을 일탈시킬 수 있다(Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849. 1998). 이와 유사하게, IL-31은 천식, 알러지 및 아토피 질환에 관계된 면역 세포에 신호, 고갈 및 일탈시키기 위하여 사용할 수 있다. IL-31RA 수용체를 통한 신호는 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포 질환에 유익하다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장 암종에 유용하다. IL-31RA는 신호 MAb가 암 성장을 억제하고, 면역-매개 살상을 표적화하는 경우 췌장암의 MAb 치료법에 대한 표적으로서 제공된다 (Tutt, AL et al., J Immunol. 161 : 3175-3185, 1998). 이와 유사하게 T-세포 특이적 백혈병, 림프종, 형질세포 질환(예컨대, 다발성 골수종), 및 암종은 본 발명의 IL-31RA-포함 가용성 수용체에 단클론 항체(예컨대, 중화 항체)로 치료할 수 있다.
일반적으로, 투여되는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 투약용량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의학적 상태 및 병력 등의 인자에 달려있다. 일반적으로, 약 1 pg/kg 내지 10 mg/kg(약제의 양/환자의 체중)의 범위 내의 IL-31 폴리펩타이드의 투약량으로 제공되는 것이 바람직하며, 환경에 따라 투양량이 가감될 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자라면 공지의 방법에 따라 이러한 투약량, 및 이들의 조절을 쉽게 결정할 수 있다.
대상체에 대한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 투여는 국소, 흡입, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 흉막내, 경막내, 국부 카데터를 통한 관류, 또는 병변내 직접 주사가 될 수 있다. 주사에 의한 치료적 단백질의 투여시, 투여는 계속적 주입 또는 단일 또는 수회 볼루스가 될 수 있다.
추가적인 투여 경로는 경구, 점막, 폐, 경피가 될 수 있다. 경구 전달은 폴리에스테르 마이크로스피어, 제인(zein) 마이크로스피어, 유단백질 마이크로스피어, 폴리시아노아크릴레이트 마이크로스피어, 및 지질계 시스템이 적합하다(예를 들어, DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)). 비강내 전달의 가능성은 인슐린 투여 방식으로 예시되었다(예를 들어, Hinchcliffe and Ilium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35.: 199 (1999)). IL-31를 포함하는 건조 또는 액체 입자로 제조될 수 있으며, 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 생성기 또는 분무기의 보조를 받아 흡입할 수 도 있다(예컨대, Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). 이러한 접근법은 AERX 당뇨 관리 시스템에 설명되어 있으며, 이는 에어로졸화된 인슐린을 폐로 전달하는 휴대용 전자식 흡입기이다. 연구에 의하여 48,000 kDa 크기의 단백질은 저주파 초음파에 의하여 치료적 농도로 피부에 전달된다는 것을 알아내었으며, 이는 경피 투여 가능성을 나타낸다(Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). 전기천공을 사용하는 경피전달은 IL-31 결합 활성을 지닌 분자를 투여하는 또다른 수단을 제공한다(Potts et al, Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
IL-31 결합 활성을 보유한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지의 방법에 의하여 제형화될 수 있으며, 여기서, 치료적 단백질은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 제조된다. 이들의 투여가 수여 환자가 용인할만한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 허용가능한 담체"라 한다. 멸균 포스페이트-완충 식염수는 약학적으로 허용가능한 담체의 일 예이다. 기타 적합한 담체는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995).
치료의 목적을 위하여, IL-31 결합 활성 및 약학적으로 허용가능한 담체를 보유한 분자는 치료적 유효량으로 환자에 투여된다. IL-31 결합 활성을 지닌 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체의 조합은 투여량이 생리학적으로 유의미하면 "치료적 유효량"을 투여하였다고 한다. 약제는 수여 환자의 생리학에 검출가능한 변화를 나타내는 경우 생리학적으로 유의미하다고 한다. 예를 들어, 염증 치료에 사용되는 약제는 최소한 염증 반응의 부분이 완화되는 경우 생리학적으로 유의미하다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 약학적 조성물 액상, 에어로졸, 또는 고형으로 제형화될 수 있다. 액상은 주사용액, 에어로졸, 액적, 국소 용액 및 경구용 현탁액으로 설명된다. 예시적인 고체 형태는 캡슐, 타블렛, 및 제어-방출형을 포함한다. 후자의 형태는 소형삼투압 펌프 및 이식물로 예시된다(Bremer et al, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al, "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)). 다른 고체형태는 크림, 페이스트, 다른 국부도포제, 등을 포함한다.
본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제는 면역리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 함유한 리포좀을 공지의 방법으로 제조하였으며, 예컨대, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545이다. 강화된 순환 시간을 지닌 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 설명되어 있다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 치료적 제형은 소망하는 순도의 항체와 선택적으로 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합하여 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 저장을 위하여 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에 무독성이며, 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 리소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 고분자 예컨대 폴리바이닐파이롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당(sugars) 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 짝-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 Tween™, Pluronics™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.
본원의 제형은 치료되는 특정 질환에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 효과를 주지 않는 상보적 활성을 지닌 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 하나의 제형 내에 IL-31에 결합하는 항체를 추가적으로 제공하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 또는 이와 함께, 조성물은 화학치료제 또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 제공되는 것이 적합하다.
활성 성분은 제조된 미소캡슐 내에 함유될 수 있으며, 예를 들어, 액적형성 기법 또는 계면 고분자화, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐에 의하여 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내에 함유될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 설명되어 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막으로 통한 여과에 의하여 용이하게 수행할 수 있다.
지속방출 제품으로 제조할 수 있다. 적합한 지속-방출 제제의 예는 항체를 함유한 고체 소수성 고분자의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 형태화된 물품, 예컨대 막, 또는 미소캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 수화겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(바이닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 3,773,919), L-글루탐산와 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-바이닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 Lupron Depot™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드로부티르산을 포함한다. 고분자 예컨대 에틸렌-바이닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100 일 이상 분자를 방출할 수 있으나, 특정 수화겔방출 단백질은 단기간 방출만이 가능하다. 캡슐화 항체가 장기간 체내에 체류하는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출되어 변성되거나 또는 응집될 수 있으며, 이에 따라 생물학적 활성을 상실하고, 면역원성에 변화가 발생할 수도 있다. 합리적인 전략은 관련된 기작에 따른 안정화를 위하여 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-이황화 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 밝혀진 경우, 안정화는 적절한 첨가제를 사용하고, 및 특이적 고분자 매트릭스 조성물을 개발하여 설프하이드릴 잔기를 변형하거나, 산성 용액을 동결건조하거나, 수분 함량을 조절하여 달성할 수 있다.
IL-31 결합 활성을 지닌 폴리펩타이드는 단백질 미소캡슐화의 표준 기법을 사용하여 리포좀으로 캡슐화할 수 있다(예를 들어, Anderson et al, Infect. Immun. 3J_: 1099 (1981), Anderson et al, Cancer Res. 50: 1853 (1990), 및 Cohen et al, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of liposomes in Immunological Studies," in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. Ill, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993), Wassef et al, Meth. Enzymol 149: 124 (1987)). 전술한 바와 같이, 치료적으로 유용한 리포좀은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 리포좀은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
분해성 고분자 마이크로스피어는 치료적 단백질의 높은 전신 수준을 유지하도록 설계되었다. 마이크로스피어는 분해성 고분자 예컨대 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르도에스테르), 비생분해성 에틸바이닐 아세테이트 고분자로 제조되며, 단백질이 고분자 내에 포획된다 (Gombotz and Pettit, Bioconiugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymer in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al, Science 281 : 1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-피복 나노스피어는 치료적 단백질의 정맥 투여용 담체로 제공된다(예를 들어, Gref et al, Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)).
다른 투약 형태를 당해 기술 분야의 숙련자가 고안할 수 있으며, 예를 들어, Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)를 참조한다.
예시한 바와 같이, 약학적 조성물은 IL-31 폴리펩타이드 또는 IL-31 길항제 (예컨대, IL-31 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항체 절편)을 포함하는 용기를 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 치료적 폴리펩타이드는 단일 또는 다회 투여용 주사용 용액의 형태, 또는 주사전 재구성되는 멸균 분말로 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 키트는 치료적 폴리펩타이드의 투여용 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 생성기, 또는 분무기를 포함한다.
본 발명의 특징은 인간 IL-31에 결합하는 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체는 다음에서 선택된 ATCC 특허 기탁 번호의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산된 단클론 항체로부터 유도된 인간화된 항체이다: a) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6815; b) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6816; c) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6829; d) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6830; e) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6831; f) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6871; g) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6872; h) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6875; 및 i) ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6873; 및 여기서 상기 항체는 인간 IgG4인 중쇄 면역글로블린 불변 도메인을 포함한다. 일 실시 상태에서, 인간 IgG4 불변 도메인은 보체 활성화 활성이 없거나 매우 적은 용액에서 안정적인 돌연변이 형태이다. 특정 실시 상태에서, 중쇄 면역글로블린 불변 영역 도메인은 위치 241(Kabat 계수)에서 Ser이 Pro로 돌연변이된 인간 IgG4 불변 도메인이다.
또 다른 특징으로서 이러한 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서, 면역글로블린 경쇄 불변 영역 도메인은 카파 또는 람다 인간 면역글로블린 경쇄의 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 면역글로블린 경쇄 불변 영역 도메인은 카파 인간 면역글로블린 경쇄의 불변 영역이다.
일 특징으로서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 클론 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 및 292.72.3.1의 CDR 서열을 포함한다. CDR 서열은 도면 및 하기 표 3에 열거하였다.
일 특징으로서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, a) 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:51으로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:52 또는 SEQ ID NO:57로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:53으로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하며; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:54으로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:55로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:56로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명된 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, TARC 또는 MDC 등의 이러한 케모카인이 측정되었다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서 a) 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:51로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:58로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:59로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하고; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:61로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:62로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물-유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, TARC 또는 MDC 등의 이러한 케모카인이 측정되었다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서 a) 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:63로 구성된 제1 CDR 서열, 아미노산 서열 SEQ ID NO:64로 구성된 제2 CDR 서열, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:65로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하며; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:66로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:67로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:68로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물-유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, TARC 또는 MDC 등의 이러한 케모카인이 측정되었다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서 a) 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:69로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:70 또는 SEQ ID NO:79로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:71로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하며; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:72로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:73로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:74로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, 이러한 케모카인은 TARC이거나 또는 MDC가 측정된다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서 a) 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:75로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:76로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:65로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하며; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:77로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:78로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:68로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, TARC 또는 MDC 등의 이러한 케모카인이 측정되었다.
일 실시 상태에서, 본 발명은 본원의 분리된 항체에 관한 것이며, 여기서 a) 중쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:80으로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:81로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:82로 구성된 제3 CDR 서열을 포함하며; 및 b) 경쇄 가변 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO:83으로 구성된 제1 CDR 서열, SEQ ID NO:84로 구성된 제2 CDR 서열, 및 SEQ ID NO:85로 구성된 제3 CDR 서열을 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 본원에서 설명한 질환, 예컨대 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 약물 유도성 알러지 반응, 피부 영양성 바이러스 및 바이러스 유관 가려움증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형 탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 치료하기 위하여 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, TARC 또는 MDC 등의 이러한 케모카인이 측정되었다.
일 특징으로서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편을 제공하며, 여기서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 i) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 일 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 IL-31(SEQ ID NO:2)와 IL-31RA(SEQ ID NO:5)의 상호작용을 억제, 차단 또는 중화한다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: (a) 뮤린 단클론 항체 또는 항체 절편; (b) 인간화된 항체 또는 항체 절편 또는 항체 절편; 및 (c) 인간 단클론 항체. 또 다른 실시 상태에서, 항체는 PEG화를 추가로 포함한다.
다른 특징으로서, 본 발명은, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 항체 절편을 제공하며, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: a) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: i) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 ii) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: i) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; ii) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; iii) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; iv) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; v) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; vi) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; vii) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 vii) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 일 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 IL-31(SEQ ID NO:2)와 IL-31RA(SEQ ID NO:5)의 상호작용을 억제, 차단 또는 중화한다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: (a) 뮤린 단클론 항체 또는 항체 절편; (b) 인간화된 항체 또는 항체 절편 또는 항체 절편; 및 (c) 인간 단클론 항체. 또 다른 실시 상태에서, 항체는 PEG화를 추가로 포함한다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁하며, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 h) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: (a) 뮤린 단클론 항체 또는 항체 절편; (b) 인간화된 항체 또는 항체 절편 또는 항체 절편; 및 (c) 인간 단클론 항체. 또 다른 실시 상태에서, 항체는 PEG화를 추가로 포함한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 내에서 염증을 감소, 차단 또는 억제하는 방법을 제공하며, 여기서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 i) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 일 실시 상태에서, 포유류에 항체를 투여하는 단계는 전염증성 케모카인의 생산을 감쇄, 차단, 억제 또는 중화를 시킨다. 또 다른 실시 상태에서, 전염증성 케모카인은 TARC 또는 MDC이다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 h) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 포유류에 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편을 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 가려움증을 감소, 차단, 억제, 또는 중화하는 방법을 제공한다. 여기서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 i) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 일 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 또 다른 실시 상태에서 단클론 항체 또는 항체 절편 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 h) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편의 투여에 의하여 피부염이 감소, 차단, 억제 또는 중화된다. 또 다른 실시 상태에서, 피부염은 아토피성 피부염 또는 결절성 양진이다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 포유류에 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합을 하기 위하여 경쟁하는 단클론 항체 또는 항체 절편을 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내의 가려움(scratching)을 감소, 차단, 억제, 또는 중화하는 방법을 제공한다. 여기서, 단클론 항체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; h) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; i) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 j) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 또 다른 실시 상태에서 단클론 항체 또는 항체 절편 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이고, 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 인간 IgG4 Fc 분자와 함께 사용된다. 또 다른 실시 상태에서, 단클론 항체 또는 항체 절편 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적 결합하도록 경쟁한다. 여기서, 단클론 항체 또는 항체 절편은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다: a) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; c) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; d) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; e) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; f) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; g) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 h) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법으로서, 가용성 사이토카인 수용체의 부재하에 배양된 골수 또는 말초 혈액 세포에 비하여 골수 또는 말초 혈액 세포 내의 조혈 세포의 증식 또는 분화를 충분하게 감소시키는 양의 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 조성물로 골수 또는 말초 혈액 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시 상태에서, 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 조혈 세포 및 조혈 전구 세포는 림프계 세포이다. 또 다른 실시 상태에서, 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 림프계 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 염증을 감소시키기 충분한 양으로 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 조성물을 염증이 있는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 IL-31-유도성 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 염증이 있는 포유류에서 염증 반응을 억제하는 방법을 제공하며: (1) 염증 분자의 수준을 결정하는 단계; (2) 약학적으로 허용되는 비히클 내의 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 염증 분자의 투여 후 수준을 결정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 염증 분자의 수준과 단계 (3)에서의 염증 분자의 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 염증 분자 수준의 증가 또는 감소의 부재는 염증 반응 억제의 지표가 되는 단계를 포함한다. 일 실시 상태에서, 항체는 전술한 바와 같으며, 여기서, 항체 추가적으로 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩타이드 태그, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 포함한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법으로서, 가용성 사이토카인 수용체의 부재하에 배양된 골수 또는 말초 혈액 세포에 비하여 골수 또는 말초 혈액 세포 내의 조혈 세포의 증식 또는 분화를 충분하게 감소시키는 양의 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 조성물로 골수 또는 말초 혈액 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시 상태에서, 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 조혈 세포 및 조혈 전구 세포는 림프계 세포이다. 또 다른 실시 상태에서, 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체의 IL-31-유도성 증식 또는 분화를 억제하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 림프계 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 염증을 감소시키기 충분한 양으로 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 조성물을 염증이 있는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 IL-31-유도성 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 염증이 있는 포유류에서 염증 반응을 억제하는 방법을 제공하며: (1) 염증 분자의 수준을 결정하는 단계; (2) 약학적으로 허용되는 비히클 내의 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 염증 분자의 투여 후 수준을 결정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 염증 분자의 수준과 단계 (3)에서의 염증 분자의 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 염증 분자 수준의 증가 또는 감소의 부재는 염증 반응 억제의 지표가 되는 단계를 포함한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 IL-31가 일정 역할을 다고 다음의 단계를 포함한다: IL-31의 길항제를 포유류에 투여하여 염증이 감소되는 단계로서, 여기서, 길항제는 IL-31의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 절편(SEQ ID NO:2)에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일 실시 상태에서, 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법은 상기 개시한바와 같으며, 여기서, 질환은 만성 염증 질환이다. 또 다른 실시 상태에서, 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법은 상기 개시한 바와 같으며, 여기서, 질환은 염증성 보웰씨 병; 궤양성 대장염; 크론씨 병; 아토피성 피부염; 습진; 및 건선으로 구성되는 군으로부터 선택된 만성 염증 질환이다. 또 다른 실시 상태에서, 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법은 상기 개시한 바와 같으며, 여기서, 질환은 급성 염증 질환이다. 또 다른 실시 상태에서, 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법은 상기 개시한 바와 같으며, 여기서, 질환은 내독소혈증; 패혈증; 독소 충격 증후군; 및 감염성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 급성 염증 질환이다. 또 다른 실시 상태에서, 염증 질환을 겪고 있는 포유류를 치료하는 방법은 상기 개시한 바와 같으며, 여기서, 항체는 추가적으로 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩타이드 태그, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 포함한다.
또 다른 특징으로서, 본 발명은 환자 내에서 염증을 검출하는 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함한다: 환자로부터 조직 또는 생물학적 시료를 확보하는 단계; 조직 또는 생물학적 시료 내에서 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제가 이의 상보적 폴리펩타이드에 결합하는 조건하에서 조직 또는 생물학적 시료를 본원의 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제와 함께 배양하는 단계; 조직 또는 생물학적 시료 내에서 결합된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 시각화하는 단계; 및 환자의 조직 또는 생물학적 시료 내에서 결합한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 수준과 정상 대조구 조직 또는 생물학적 시료를 비교하는 단계로서, 여기서, 정상 대조구 조직 또는 생물학적 시료에 비하여 환자의 조직 또는 생물학적 시료에 결합한 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 수준의 증가가 환자내의 염증의 지표인 단계.
다음의 비-제한적 실시예에 의하여 본 발명을 추가적으로 설명한다.
실시예 1
가변 영역의 결정
경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열을 하기 방식으로 결정하였다:
RNA 추출/5' RACE 준비 cDNA 생산:
하이브리도마 세포주 (약 4.5 x 106 세포)를 1X PBS에서 세정한 후 원심분리에 의해 수집하였다. 제조자의 지시에 따라 Qiagen's RNeasy 소형 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제하였다. 검증을 위해서 얻어진 RNA를 1.2% E-GeI에 디스플레이하였다. BD Biosciences BD SMART RACE cDNA 증폭 키트을 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 행하였으며, 이것은 5' RACE 준비 cDNA를 제공하였다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 증폭:
BD Biosciences BD SMART RACE cDNA 증폭 키트에 설명한 바와 같이 PCR을 위한 주형으로서 5' RACE 준비 cDNA를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 PCR 증폭 모두 5' PCR 올리고뉴클레오티드로서 키트에 의해 제공된 1OX UPM (Universal Primer Mix)을 사용하였다. 3' PCR 올리고뉴클레오티드는 다음과 같았다;
마우스 카파 (zc54289:5'-CGACTGAGCCACCTCCAGATGTTAACTGCTCAC-3' SEQ ID NO:28)
마우스 IgG1 (zc54983:5'-CAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGG -3' SEQ ID NO:29)
마우스 IgG2a (zc55640: 5'-CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGG -3' SEQ ID NO:30)
GE Healthcare illustra GFX tm PCR DNA 및 Gel Band Purification Kit를 사용하여 경쇄 및 중쇄 사슬 가변 영역 서열 PCR 생성물을 겔 정제하고, Invitrogen TOPO TA 클로닝 키트를 통해 복제하였다. M13R 및 M13F 키트 프라이머를 갖는 콜로 니 PCR에 의해 가변 영역 마다 하이브리도마 당 8개의 개별 콜로니를 스크린하고 시퀀싱을 위해 제시하였다. ABI PRISM BigDye Terminator v3.0 사이클 시퀀싱 키트(Biosystems, Foster City, CA 제품)를 사용하여 시퀀싱을 행하였다. EdgeBioSystems Centriflex 겔 여과 카트리지(Gaithersburg, MD)를 사용하여 시퀀싱 반응물을 정제하고 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Biosystems, Foster City, CA 제품)에서 조작하였다. 시퀀서 v4.1 소프트웨어(GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI.)를 사용하여 얻어진 서열 데이터를 조합 및 편집하였다.
표 1은 가변 영역의 서열에 대한 SEQ ID NO:s을 나타내며, 이것은 도 1-4에서 더 기재된다.
가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에 대한 서열 목록 번호
클론 번호 경쇄 사슬
가변 영역
SEQ ID NO:		 신호 서열을 갖는
경쇄 가변 영역
SEQ ID NO:		 중쇄 가변 영역
SEQ ID NO:		 신호 서열을 갖는
중쇄 가변 영역
SEQ ID NO:
292.12.3.1 8 31 9 32
292.84.1.6 42 위치에 치환된 Arg를 갖는 8 62 위치에 치환된 Arg를 갖는 31 -50 위치에 Thr;
-69 위치에 Ser;
-77 위치에 Asn; 및
-95 위치에 Phe 치환을 갖는 9
 -50 위치에 Thr;
-88 위치에 Ser;
-95 위치에 Asn; 및
-114 위치에 Phe
치환을 갖는 32
292.63.5.3 10 33 11 34
294.144.3.5 12 35 13 36
292.39.5.3 14 37 15 38
292.51.5.2 16 39 17 40
292.64.6.5.5 18 41 19 42
292.105.4.1 20 43 21 44
292.109.4.4 22 45 23 46
292.118.6.4 24 47 25 48
292.72.3.1 26 49 27 50
표 2는 가변 영역의 서열에 대한 SEQ ID NO:s을 나타내며, 이것은 도 1-4에서 더 기재된다.
Figure 112009014492227-pct00001
Figure 112009014492227-pct00002
하이브리도마, 292.12.3.1 및 292.84.1.6은 서로 광범위한 서열 일치성을 공유하는 경쇄 및 중쇄를 발현한다. 292.12.3.1 및 292.84.1.6 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 배열을 도 2에 나타낸다. 높은 정도의 공유된 서열 일치성은 경쇄 가변 영역이 동일한 경쇄 가변 영역 생식세포 유전자로부터 유도되면서 중쇄 가변 영역도 동일한 중쇄 가변 영역 생식세포 유전자로부터 유도된다는 것을 시사한다. 추가적으로, 경쇄 및 중쇄 CDR3 및 FR4 모두를 통틀어 일치성은 경쇄에서 동일한 JL의 이용, 및 중쇄 CDR3에서 동일한 JH 및 D 영역과 N 및 P 뉴클레오티드 첨가를 나타낸다. 하이브리도마 292.12.3.1와 292.84.1.6 모두는 카파 경쇄를 발현하지만, 292.12.3.1는 IgGl 중쇄를 발현하면서 292.84.1.6는 IgG2a 중쇄를 발현한다. 이것은 이러한 하이브리도마 모두 동일한 초기 B 세포 면역글로블린 유전자 좌위 재배열 현상의 유도체이고 292.84.1.6가 IgG2a 중쇄 사슬에 대하여 이어지는 클래스 스위치의 결과라는 것을 나타낸다. 클래스 스위치 이전 또는 이후에, 292.12.3.1 및 292.84.1.6는 다른 체세포 돌연변이의 조합에 의해 분리되었고, 이것은 경쇄에서 단일의 아미노산 상이 및 중쇄에서 4개의 아미노산 상이를 유도하였다.
실시예 2
아미노 말단 단백질 서열 결정
중쇄 및 경쇄 항체 서열을 결정하기 위해서 N-말단 단백질 시퀀싱을 사용하였다. 피로글루타메이트 아미노 펩티다아제(PGAP) 처리와 함께 또는 의의 없이 항체를 가공하였다. 미처리된 시료는 100 피코몰(pmol) 단백질 및 물의 첨가에 의해 가공하였다. PGAP 처리된 시료는 1X PGAP 버퍼 내의 100 pmol 단백질, 물, 0.03% SDS, 5X PGAP 버퍼 (Takara Bio Inc., Japan) 및 PGAP 효소 (1 mU)의 첨가에 의해 가공하였다. 95℃에서 10분 동안 PGAP 반응을 행하였다. 이 효소 처리는 N-말단 차단 피로글루탐산기를 제거하였다. 미처리 및 PGAP 처리된 시료 모두에 환원 SDS PAGE 버퍼를 첨가한 후 시료를 비등수조에서 5분 동안 가열하였다. 시료를 SDS PAGE 구배 겔 상에서 조작하였다. 겔을 PVDF 멤브레인으로 이동시키고 쿠마시 블루로 착색시켰다. 50 kDa 및 25 kDa의 외관 SDS PAGE 분자량을 갖는 각 시료에 대하여 2개의 식별가능한 밴드가 관찰되었다. 각 밴드를 제거하고 N-말단 단백질 시퀀싱을 실시하였다. 20회 서열 사이클을 행하여 서열을 결정하였다.
실시예 3
아데노바이러스 STAT/SRE 리포터 유전자와의 일시 감염을 통한 인간
형질변환된 상피 세포주의 루시페라아제 분석
루시페라아제 분석에 의해 IL-31 활성의 억제, 감소, 및/또는 중화를 측정할 수 있다. 예를 들어, 인간 형질변환된 세포주를 각 세포 타입에 대하여 특정된 정규 성장 배지에서 10,000 세포/웰로 96-웰 평탄-저면 플레이트에 파종할 수 있다. 다음날, 세포를 5000의 감염 다중도로 아데노바이러스 리포터 구조체, KZ136로 감염시킨다. KZ136 리포터는 혈청 반응 요소에 더해서 STAT 요소를 함유한다. 총체적은 2 mM L-글루타민 (GibcoBRL), 1 mM 소듐 피루베이트 (GibcoBRL) 및 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충액 (GibcoBRL)으로 보충된 DMEM을 사용하여 100 ul/웰이다(이하 혈청-프리 배지라고 함). 세포를 밤새 배양한다.
다음날, 배지를 제거하고 100 μl의 유도배지로 대체한다. 유도 배지는 혈청-프리 배지에 100ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.125 ng/ml 및 1.56 ng/ml으로 희석된 인간 IL-31이다. 20% FBS의 양성 대조군을 사용하여 분석을 입증하고 아데노바이러스에 의한 감염이 성공적인 것을 확인한다. 세포는 배지가 흡입되는 5시간 동안 유도된다. 그 다음 세포를 PBS의 50μl/웰에서 세정하고, 이어서 1X 세포 용해 버퍼(Promega) 30μl/웰에 용해시킨다. 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 용해물 25μl/웰을 불투명한 흰색 96-웰 플레이트로 이동시킨다. 그 다음 루시페라아제 기질 (Promega)의 40μl/웰 주입과 함께 5-초 인테그레이션을 사용하는 루미노미터 상에서 플레이트를 판독한다.
실시예 4
IL-31 바이오분석
hzCYTOR17 (IL-31RA), hOSMRB, 및 KZ134으로 트랜스펙션된 BAF3 세포를 5x105 및 1x106 세포/mL으로 성장시킨다. 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 10% FBS, L-글루타민, 피루베이트 나트륨, 및 Pen/Strep (모두 Gibco))로 세정하고 분석 배지에 3x105 세포/mL로 재현탁한다. 96-웰 불투명 플레이트에서, 100 μL/웰을 통해 분석 배지에 hIL-31 표준물질을 600 pg/mL에서 9.38 pg/mL으로 중복 적정하고, 1:2 연속 희석한다. 품질 대조 표준물질을 100 μL 내의 350 pg/mL 및 35 pg/mL로 플레이트에 중복 첨가한다. 테스트 시료는 1:2 또는 1:4로 희석하여 시료 웰에 중복 첨가하기도 한다. 3x1O4 세포/웰의 최종 농도를 위해서 각 웰에 100 μL의 세정된 BAF3 세포를 첨가한다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 +37℃에서 16-24시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 5분 동안 1200RPM에서 원심분리하고, 배지를 가볍게 치고, 각 웰에 25 μL/웰의 용해 버퍼(Promega)를 첨가한다. 10분 후 플레이트를 루미노미터(Berthold) 상에서 판독한다. 루미노미터를 40 μL/웰의 루시페라아제 기질 믹스(Promega)에 더하고 4초의 시간 동안 루미네선스를 인테그레이션한다. 루미네선스값을 이들이 분석되는 스프레스시트로 보내고 mL 체적 당 106개 세포 당 IL-31의 피코그램으로 전환한다.
실시예 5
생체 내 접촉 과민성의 개시 및 존속에 대한 IL-31 연관
방법 I
BALB/c 마우스들을 아세톤:올리브 오일 (4:1) 용액에 용해된 25 ul의 0.5% DNFB(2,4, 디니트로-플루오로-벤젠, Sigma, St. Louis MO)으로 쉐이빙된 허리부분을 피펫터를 사용하여 채색하였다. 비히클 대조군은 25 ul의 아세톤:올리브 오일만으로 처리하였다. 5일 후, 흡입 챔버에서 이소플루오랜으로 마우스들을 마취시키고 실험 동물들과 대조 동물들의 양 귓바퀴를 엔지니어의 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 기준 측정값을 얻는다. 그 다음 모든 마우스들의 각 귀의 양측에 아세톤:올리브 오일(4:1) 중의 10ul 0.25% DNFB을 적용함으로써 마우스들을 자극(challenge)한다. 24 h 및 48 h 후에 오른쪽 귀(자극됨)와 왼쪽 귀(자극되지 않음) 사이의 차이로서 접촉 과민성을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어의 마이크로미터로 행한다. 본래 마우스들의 자극된 귀와 자극되지 않은 귀 사이의 귀 팽창 차이로 배경값을 결정한다.
희생시키기 전에 FACS 및/또는 ELISA 분석을 위한 모든 혈액 및 혈청을 수집하고 조직연구를 위해 귀들을 수집한다.
방법 II (Th2 반응 유도)
BALB/c 마우스들을 아세톤/디부틸 프탈레이트의 1:1 용액 중의 0.5% FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트) 1OOul로 쉐이빙된 허리부분을 채색한다 (1일, 2일 및 8일 째에 피페터를 사용하여 이용가능한 MSDS). 13일 째에, 흡입 챔버에서 이소플루오랜으로 마우스들을 마취시키고 실험 동물들과 대조 동물들의 양 귓바퀴를 엔지니어의 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 기준 측정값을 얻는다. (1:1 아세톤/디부틸 프탈레이트 중의) 0.5% FITC 25ul을 각 귀의 등 표면에 적용함으로써 자극한다. 24 h 및 48 h 후에 오른쪽 귀(자극됨)와 왼쪽 귀(자극되지 않음) 사이의 차이로서 접촉 과민성을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어의 마이크로미터로 행한다. 본래 마우스들의 자극된 귀와 자극되지 않은 귀 사이의 귀 팽창 차이로 배경값을 결정한다. 희생시키기 전에 FACS 및/또는 ELISA 분석을 위한 모든 혈액 및 혈청을 수집하고 조직연구를 위해 귀들을 수집한다.
방법 III (Th1 반응 유도)
BALB/c 마우스들을 피페터를 사용하여 25ul의 2% 옥사잘론 (4:1 아세톤/올리브 오일)으로 쉐이빙된 허리부분에 채색한다. 7일 째에, 흡입 챔버에서 이소플루오랜으로 마우스들을 마취시키고 실험 동물들과 대조 동물들의 양 귓바퀴를 엔지니어의 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 기준 측정값을 얻는다. 각 귀의 등 표면에 옥사잘론 8ul을 적용함으로써 마우스들을 자극한다. 24 h 및 48 h 후에 오른쪽 귀(자극됨)와 왼쪽 귀(자극되지 않음) 사이의 차이로서 접촉 과민성을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어의 마이크로미터로 행한다. 본래 마우스들의 자극된 귀와 자극되지 않은 귀 사이의 귀 팽창 차이로 배경값을 결정한다. 희생시키기 전에 FACS 및/또는 ELISA 분석을 위한 모든 혈액 및 혈청을 수집하고 조직연구를 위해 귀들을 수집한다.
접촉 과민성의 개시 및 존속에 대한 IL-31의 연관을 감작 및 실험의 자극 단계에서 IL-31에 대하여 본원에 기재된 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제를 사용하여 테스트한다.
실시예 6
생체 내 아토피성 피부염에 대한 IL-31 연관
방법 I (NC/Nga 마우스들의 감작)
4 주령 수컷 NC/Nga 마우스들(CRL, Japan)을 SPF 검역 조건에서 4주 동안 수용하여 순응시킨다. 마우스들은 항원 감작의 시작시에 약 10-11 주령이다. 마우스들을 이소플루오랜으로 마취시키고 전기 클리퍼로 등을 쉐이빙한다. 마우스들의 피부 손상이 나타날 때까지 5 내지 6주 동안 일주일에 3회 목덜미에 약 10 ug의 Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) (Indoor Biotechnologies, special order) 추출물을 피내 주사한다. 대조 동물은 일주일에 3회 10ul PBS 피내 주사한다. Dp 추출물은 Matsuoka와 동료들에 의한 방법에 따라 제조한다. Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003). 간단히 말하면, 595mg Dp 동결건조된 사용한 배양액 추출물을 12mL 멸균 PBS (Gibco)에 용해한다. Dp을 30분 동안 진탕기 위에서 5OmL Falcon 튜브에 혼합한다. 추출물을 2000rpm에서 10분 동안 회전시키고 상청액을 수집하고 1mL 냉동용기 튜브로 나누어 -20℃에 저장한다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 효과를 상처, 가려움, 및/또는 피부염의 억제에 의해 측정한다.
방법 II (DO 11.10 마우스들의 감작)
DO11.10 형질전환 마우스들을 조직 내의 콜로니로부터 사육하고 항원 감작의 시작시 9.5 내지 14주 된다. 경피 감작 24시간 이전에 이소플루오랜으로 마우스들을 마취시키고 마우스들의 전체 몸통(등 및 배)을 전기 클리퍼로 쉐이빙한다. 그 다음 마우스들을 등 위에 Elastin 외과용 테이프(Johnson and Johnson)로 테이프 스트립한다. 1cm2 멸균 거즈 패치를 500ug 난백 알부민 (Calbiochem 32467) 또는 멸균 PBS (Gibco)으로 적시고 DuoDerm Extra Thin Dressing (ConvaTec 187932)으로 마우스들의 왼쪽 등면에 부착시킨다. 그 다음 패치 및 드레싱을 Elastin 외과용 테이프의 보디 랩에 덮어서 마우스들이 움직이거나 패치를 손상시킬 수 없게 한다. 패치가 7일 동안 소모되어 제거한다. 또 다른 경피 감작의 라운드 전에 마우스들을 2주 동안 안정시킨다. 마우스들은 1주일에 총 3회 감작된다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 효과를 상처, 가려움 및/또는 피부염의 억제 및/또는 케로티노사이트에서 IL-31RA 발현의 감소에 의해 측정한다.
실시예 7
AD 마우스 모델에서 항-I1-31 항체에 반응하는 TARC 및 MDC의 감소
방법 I
6주된 수컷 NC/Nga 마우스들 (CRL Japan)을 등 위에 일주일에 3회 50μg 먼지 진드기 추출물(D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies)로 내피 감작시키고 AD-유사 손상에 대하여 점수화한다. 감작 5주 후 마우스들을 안락사시키고 오른쪽 귀를 제거하여 RPMI+2%FBS (GIBCO Invitrogen)가 보충된 48-웰 배양 접시(Corning)의 단일 웰에 놓는다. 5% CO2 습도 조절된 인큐베이터에 플레이트를 놓는다. 24시간 후 상청액을 수집하고 다음 분석까지 -20℃에서 냉동한다.
방법 II
12주된 암컷 NC/Nga 마우스들 (CRL Japan)을 일주일에 3회 귀 및 등에 1Oμg SEB (Toxin Technology)으로 내피 감작시킨다. 마우스들을 AD-유사 손상에 대하여 점수화한다. 감작 5주 후 마우스들을 안락사시키고 각 마우스의 주사된 귀로부터 6mm 생검 펀치를 취하여 RPMI+2%FBS가 보충된 48-웰 배양 접시의 단일 웰에 놓는다. 5% CO2 습도 조절된 인큐베이터에 플레이트를 놓는다. 24시간 후 상청액을 수집하고 다음 분석까지 -20℃에서 냉동한다.
두 연구에서 마우스들의 군을 감작 1 내지 2주 후 시작하여 각 주에 2회 IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제로 복강내 처리한다.
24-시간 상청액 시료에서 TARC 및 MDC 농도를 종래의 ELISA (R&D Systems)으로 측정한다.
실시예 8
IL-31 중화 항체의 투여
약 8 내지 12주된 정상 암컷 BALB/c 마우스(CRL)를 1ug/day mIL-31을 운반하는 14-일 삼투압 펌프(Alzet, #2002)로 피하 이식한다. 마우스들의 군은 IL-31 운반 1주 전에 시작하여 일주일에 2회 래트 항-마우스 IL-31 단클론 항체 10mg/kg (200ug/마우스)의 복강투여 (i.p.) 주사된다. 마우스들의 대조군은 동일한 투여 계획으로 비히클 (PBS/0.1%BSA)의 i.p. 주사된다. 하기 기준: 0 = 상처 없음, 동물은 정상으로 보임, 1 = 적은 지역에서 외피 얇아짐, 상처가 발견됨, 2 = 경미한 탈모(작은 패치), 상처, 3 = 중간정도의 탈모, 상처, 및 4 = 심한 탈모, 과도한 상처-을 사용하여 탈모 및 소양감에 대하여 매일 점수화한다.
IL-31 결합 분자 또는 IL-31 길항제의 효과를 약 5 내지 7일의 징후 개시 지연 및 탈모 및 소양감에 대한 낮은 총점수에 의해 측정한다.
실시예 9
재조합 키메라 항-인간 IL-31 단클론 항체의 발현
2개의 별도의 마우스 항-인간 IL31 단클론 항체, 292.12.3.1 및 292.63.5.3로부터의 중쇄 및 경쇄 사슬 가변 영역 서열을 PCR에 의해 얻었다. DNA 영역을 결정하고 발현 구조체를 인간 불변 영역 DNA 서열을 사용하여 발생시켰다.
키메라 마우스 항-인간 IL31 가변 영역의 발현을 지시하는 하이브리드 MPSV/CMV 프로모터/인헨서로 이루어진 경쇄 사슬 발현 구조체를 인간 면역글로블린 카파 불변 영역에 융합하였다.
키메라 마우스 항-인간 IL31 가변 영역의 발현을 지시하는 하이브리드 MPSV/CMV 프로모터/인헨서로 이루어진 중쇄 사슬 발현 구조체를 힌지 영역에 아미노산 치환을 갖는 인간 면역글로블린 IgG4 불변 영역에 융합하였고, 세린 228은 프롤린으로 변하였다.
각 하이브리도마로부터 키메라 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 경쇄 및 중쇄 발현 구조체를 HEK 293F 세포로 공동-전달감염시켰다. 4일 후에 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. 웨스턴 블롯 분석은 비환원 SDS-PAGE 상에서 기대한 크기의 완전한 키메라 항체를 입증하였다.
ELISA 기반 프로토콜에 의해 키메라 항체의 항원 결합 능력을 결정하여 외관 EC50 (고정된 농도에서 항원의 50%를 결합하기 위한 효과적인 농도)을 측정하였다. 분석 포맷은 미가공된 세포 배양액 컨디셔닝 배지로부터 인간 단클론 항체의 포획을 위한 고트 항-인간 Fc 고정화를 사용하였다. 바이오티닐화된 IL31의 희석 계열을 IL31의 ng/mL 또는 nM에서 외관 Kd (또는 EC50)을 가져오는 4-파라미터 피트의 "C" 파라미터를 테스트하였다. 분석 감도는 희석한 단클론 항체 또는 키메라 항체 세포 배양액 컨디셔닝 배지를 평가할 수 있도록 충분히 높다. 일반적으로 이 방법에 의해 결정된 Kd는 Biacore를 사용하여 측정한 정제된, 동종의 단클론 항체에 대하여 측정한 Kd에 근접한다. 표 3에 나타낸 바와 같이 두 키메라 항-IL31 항체는 대조 "모체" 마우스 하이브리도마 단클론 항체 292.63.5.3와 비교하여 유사한 EC50값을 나타내었다.
HEK 293F 임시 전달감염으로부터 컨디셔닝된 배지의 EC50 결정
시료 EC50 (ng/mL)a EC50 (nM)a
키메라 292.63.5.3 1.3 0.08
키메라 292.12.3.1 2.0 0.12
비-트랜스펙션된 HEK 293F
대조 배지		 결합 안함 결합 안함
292.63.5.3 (Lot E9289)
대조 단클론 항체		 4.3
 0.26
a중복 측정값으로부터의 평균
상기로부터, 본 발명의 특정 구체예를 예시 목적으로 본원에 설명하였지만, 본 발명의 본질 및 범위에서 벗어남 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부한 청구항에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.
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SEQUENCE LISTING <110> Siadak, Anthony W. Bilsborough, Janine Rene, Shirley <120> VARIABLE REGION SEQUENCES OF IL-31 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 06-38PC <150> 60/824,403 <151> 2006-09-01 <150> 60/890,792 <151> 2007-02-20 <160> 85 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 904 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (28)...(519) <400> 1 ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54 Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr 1 5 tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102 Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His 10 15 20 25 acg ttg ccc gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150 Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile 30 35 40 gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag 198 Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu 45 50 55 gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246 Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu 60 65 70 agc cct gac gcc cag ccg cca aac aac atc cac agc cca gcc atc cgg 294 Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg 75 80 85 gca tat ctc aag aca atc aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat 342 Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp 90 95 100 105 gag atc ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gca cca gaa 390 Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu 110 115 120 aca aac att tct gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc atc 438 Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile 125 130 135 ctg act att tct caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gca cta aaa 486 Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys 140 145 150 tca ttg acc tct gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539 Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr 155 160 ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599 gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659 agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719 tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779 ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839 ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc 899 tcata 904 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys 1 5 10 15 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu 20 25 30 Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val 50 55 60 Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro 65 70 75 80 Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg 85 90 95 Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp 100 105 110 Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr 115 120 125 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe 130 135 140 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln 145 150 155 160 Gln Ala Thr Thr <210> 3 <211> 755 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(489) <400> 3 atg atc ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48 Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc agc ttg tcc ttc ggt gcc cca 96 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu 35 40 45 tct cag gat ctt tat aac aac tat agc ata aag cag gca tct ggg atg 192 Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met 50 55 60 tca gca gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc agc ctg gac cgg gaa 240 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 gca tta acc aac atc tcg gtc atc ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa 288 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 gtg ttg agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta 336 Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu 100 105 110 aca aac atc agc tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct 384 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro 115 120 125 gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val 130 135 140 tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat 480 Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529 Thr Thr Cys gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589 cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649 tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709 catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755 <210> 4 <211> 163 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu 35 40 45 Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met 50 55 60 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu 100 105 110 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro 115 120 125 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val 130 135 140 Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 Thr Thr Cys <210> 5 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp 1 5 10 15 Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45 Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60 Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80 Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95 Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu 100 105 110 Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125 Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys 130 135 140 Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro 145 150 155 160 Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175 Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190 Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr 195 200 205 Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220 Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240 Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255 Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285 Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu 290 295 300 His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu 325 330 335 Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350 Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380 Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys 385 390 395 400 Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415 Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys 435 440 445 Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480 Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495 Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510 Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525 Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu 530 535 540 Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn 545 550 555 560 Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser 565 570 575 Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu 580 585 590 Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro 595 600 605 Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn 610 615 620 Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly 625 630 635 640 Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser 645 650 655 Ser Cys Pro Thr Ser Ile 660 <210> 6 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu 35 40 45 His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr 130 135 140 Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn 165 170 175 Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp 180 185 190 Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val 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Phe Trp Lys Trp Ser 405 410 415 Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr 435 440 445 Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys 450 455 460 Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile 485 490 495 Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val 500 505 510 Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn 515 520 525 Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser 530 535 540 Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn 565 570 575 Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser 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Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 40 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 40 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe His Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 41 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 41 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 42 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 42 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 43 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 43 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 44 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 44 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 45 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 45 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 46 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 46 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 47 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 47 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Met Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 48 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 48 Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Lys Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Ile Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 49 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 49 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser 35 40 45 Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ile Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 50 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 50 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Thr Arg Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Tyr Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Pro Asn Gly Met 115 120 125 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Arg Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Ala Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Pro Asn Gly Met Glu Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Asn Ala Glu Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Thr Phe Ile Met Ser 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Phe His Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65 Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 66 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Phe Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 68 Gln Gln His Tyr Asp Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Thr Tyr Ile Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Ser Phe Val Met Ser 1 5 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe His Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Thr Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Glu Ser Lys Leu Gly Asp Asp Asp Tyr 1 5 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Asp Thr Thr Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Phe Gln Gly Ser Glu His Pro Leu Thr 1 5

Claims (26)

  1. SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 27-164 로 이루어진 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체로서, 상기 단클론 항체는 상보성 결정 영역(CDRs) LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역과 상보성 결정 영역(CDRs) HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고,
    LCDR1은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가지고;
    LCDR2는 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 가지고;
    LCDR3은 SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 가지고;
    HCDR1은 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 가지고;
    HCDR2는 SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 가지고; 및
    HCDR3는 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 가지고;
    상기 단클론 항체는 인간 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 가지고, 및
    상기 인간 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인은 Kabat 위치 241에서 세린이 프롤린으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 분리된 단클론 항체.
  2. SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 27-164 로 이루어진 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체로서, 상기 단클론 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 특허 기탁 번호 PTA-6815로 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체로부터 유래된 인간화된 항체이고, 상기 단클론 항체는 인간 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 가지고, 상기 인간 IgG4 중쇄 면역글로불린 불변 도메인은 Kabat 위치 241에서 세린이 프롤린으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 분리된 단클론 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  4. 하기 작동가능하게 연결된 요소를 포함하는 발현 벡터:
    전사 프로모터;
    제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체를 암호화 하는 DNA 세그먼트; 및
    전사 터미네이터.
  5. 제 4 항의 발현 벡터를 포함하는 배양된 세포로서, 상기 세포는 상기 DNA 세그먼트에 의해 암호화된 단클론 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양된 세포.
  6. 제 5 항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    발현된 단클론 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체를 포함하는, 소양증 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체를 포함하는, 아토피성 피부염 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체를 포함하는, 결절성 양진 치료용 약학적 조성물.
  10. 삭제
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